CN113549688B - 一组诊断冠状动脉疾病的分子标志物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术、生物医药领域,具体涉及分子标志物组合在诊断冠状动脉疾病中的应用。本发明提供了一种诊断标志物组合,所述标志物组合包括ZNF33B和PRKX;优选地,所述标志物组合还包括LEF1或FKBP1A;更优选地,所述标志物选自以下任意一种组合:ZNF33B+PRKX、ZNF33B+PRKX+LEF1、ZNF33B+PRKX+FKBP1A、ZNF33B+PRKX+LEF1+SERPINB8、ZNF33B+PRKX+SULT1B1+LEF1。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术、生物医药领域,具体涉及一组诊断冠状动脉疾病的分子标志物。
背景技术
冠状动脉疾病(CAD)是一种包含稳定型心绞痛、非稳定型心绞痛、心肌梗塞和猝死的疾病。冠状动脉疾病是最常见的心脏血管疾病。常见的症状包括胸痛或不适,有时会转移到肩膀、手臂、背部、颈部或下颚。有些人可能会有胸口灼热的感觉。通常症状在运动或情绪压力下出现,持续时间不超过数分钟且休息会缓解。有时会伴随呼吸困难,有时则是毫无症状。少数人以心肌梗塞为最初的表现。其他可能的并发症包含心脏衰竭或心律不整。目前,冠心病的临床因素有很多,如性别、年龄、胸痛类型、吸烟史、糖尿病等。
现有技术中,临床上冠心病常用的检测方法有:心电图,超声心动图,负荷试验,CT冠状动脉造影,冠状动脉造影(CAG)等。心电图,超声心动图,负荷试验由于敏感性和特异性有限,因此,其阴性的检查结果并不能排除冠心病。所以冠状动脉造影仍然是诊断冠心病的“金标准”,但由于技术相对复杂、有创、费用高,而且存在一定风险,致使很多患者难以接受。而CT冠状动脉造影(CTA)拥有结果准确、创伤小、费用相对低廉的优点,已较好地用于临床。但是由于CT冠状动脉造影的阴性预测值高,因此CT冠状动脉造影的阴性诊断价值较大,而阳性诊断价值有限,特别是对于狭窄程度的判断,所以CT冠状动脉造影主要用于筛选。
近两年,高通量测序技术在生物技术领域有重要突破,高通量测序技术的出现使得许多的极有前景的生物医药应用成为可能。而转录组是指特定组织或细胞在某一环境或生理条件下所转录表达的所有RNA的总和,通常感兴趣的是编码蛋白的mRNA,所以高通量测序技术与转录组学结合为研究基因表达及调控提供了重要的手段和方法。
发明内容
发明人通过对数据库信息进行生物信息学分析,筛选到了可以诊断心血管疾病的标志物,进一步对标志物进行组合得到了更高效的诊断标志物组合,所述标志物或标志物组合在临床应用中有重要的意义。
一方面,本发明提供了一种诊断心血管疾病的标志物组合,所述标志物组合包括ZNF33B和PRKX。
本发明中,“诊断”心血管疾病包括判断受试者是否已经患有心血管疾病、判断受试者是否存在患有心血管疾病的风险、或者判断心血管疾病患者复发。
优选地,所述标志物组合还包括LEF1或FKBP1A。
更优选地,所述标志物选自以下任意一种组合:
(1)ZNF33B+PRKX;
(2)ZNF33B+PRKX+LEF1;
(3)ZNF33B+PRKX+FKBP1A;
(4)ZNF33B+PRKX+LEF1+SERPINB8;
(5)ZNF33B+PRKX+SULT1B1+LEF1。
本发明中“+”表示组合使用。
优选地,所述心血管疾病包括动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、外周动脉疾病、动脉瘤、血栓症、栓塞、心肌梗塞、局部缺血。
更优选地,所述心血管疾病是冠状动脉疾病。
本发明中,术语“冠状动脉疾病(CAD)”,也称为“冠状心脏疾病(CHD)”、“冠心病(IHD)”,是指包括稳定型心绞痛,不稳定型心绞痛,心肌梗塞和冠心病猝死等症状的一组疾病。
优选地,所述ZNF33B在患者中高表达。本发明中,ZNF33B基因具有如NC_000010.11(42574169..42638570,complement)所示的核苷酸序列,或与其具有至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%同源性的核苷酸序列。
优选地,所述PRKX在患者中低表达。本发明中,PRKX基因具有如NC_000023.11(3604340..3713649,complement)所示的核苷酸序列,或与其具有至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%同源性的核苷酸序列。
优选地,所述LEF1在患者中低表达。本发明中,LEF1基因具有如NC_000004.12(108047548..108168932,complement)所示的核苷酸序列,或与其具有至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%同源性的核苷酸序列。
优选地,所述FKBP1A在患者中高表达。本发明中,FKBP1A基因具有如NC_000020.11(1368977..1393172,complement)所示的核苷酸序列,或与其具有至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%同源性的核苷酸序列。
优选地,所述SERPINB8在患者中高表达。本发明中,SERPINB8基因具有如NC_000018.10(63970081..64019779)所示的核苷酸序列,或与其具有至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%同源性的核苷酸序列。
优选地,所述SULT1B1在患者中高表达。本发明中,SULT1B1基因具有如NC_000004.12(69721167..69760644,complement)所示的核苷酸序列,或与其具有至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%同源性的核苷酸序列。
优选地,所述受试者为哺乳动物,例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物。
优选地,所述受试者为人。
另一方面,本发明提供了检测前述标志物组合或前述标志物组合中任意一个标志物的表达量的试剂在制备诊断受试者是否患有心血管疾病的产品中的应用。
本发明中,“表达”包括mRNA从基因或基因部分的产生,并且包括由RNA或基因部分所编码的蛋白质的产生,还包括与表达相关的检测物质的出现。例如,cDNA结合配体(如抗体)与基因或其它寡核苷酸、蛋白质或蛋白质片段的结合以及结合配体的显色部分都包括在术语“表达”的范围内;在免疫印迹如western印迹上半点密度的增加也处于以生物学分子为基础的术语“表达”的范围内。
优选地,所述试剂为能够检测所述标志物的mRNA水平的试剂。这类试剂是本领域公知的,包括但不限于特异性结合目标序列的核酸探针、扩增目标序列的引物、非特异性荧光染料(例如,SYBR Green I)或其组合。
优选地,所述核酸探针可以为单标记的核酸探针,例如放射性核素(如32P、3H、35S等)标记探针、生物素标记探针、辣根过氧化物酶标记探针、地高辛标记探针或荧光基团(如FITC、FAM、TET、HEX、TAMRA、Cy3、Cy5等)标记探针;所述核酸探针也可以为双标记的核酸探针,例如Taqman探针、分子信标、置换探针、蝎子引物探针、QUAL探针、FRET探针等。
优选地,所述试剂为能够检测所述标志物的蛋白水平的试剂。优选地,所述标志物的蛋白水平的试剂包括免疫学检测所需的试剂;所述免疫学检测选自ELISA检测、Elispot检测、Western印迹或表面等离子共振法。
免疫学检测所需要的的试剂是本领域熟知的,包括但不限于能够和ZNF33B、PRKX、LEF1、FKBP1A、SERPINB8、SULT1B1中至少一种蛋白特异性结合的抗体、靶向多肽。
优选地,这类试剂带有可检测的标记,例如酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、放射性核素(如3H、125I、35S、14C、32P等)、荧光染料(如FITC、TRITC、PE、Texas Red、量子点、Cy7、Alexa 750等)、吖啶酯类化合物、磁珠、胶体金或有色玻璃或塑料(例如,聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶,等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如,链霉亲和素)的生物素。
优选地,本发明的试剂盒还包含用于预处理样品的试剂,具体地,所述试剂包括以下试剂:用于稀释样品的稀释剂(例如,磷酸盐缓冲液或生理盐水);用于阻止血液凝固的抗凝剂(例如,肝素)。
另一方面,本发明提供了一种诊断受试者是否患有心血管疾病试剂盒,所述试剂盒包括检测前述标志物组合或前述标志物组合中任意一个标志物的试剂。
优选地,所述试剂盒还包括前述检测受试者的表达量所使用的仪器。
优选地,所述试剂盒还包括检测其他疾病标志物的试剂和/或仪器。
另一方面,本发明还提供了前述试剂盒在制备诊断心血管疾病的产品中的应用。
另一方面,本发明提供诊断受试者是否患有心血管疾病的方法,所述方法包括检测受试者的前述标志物组合或前述标志物组合中任意一个标志物的表达量。
进一步,所述方法包括:
(1)收集受试者样本;
(2)提取受试者样本中的RNA或蛋白,检测前述标志物组合或前述标志物组合中任意一个标志物的表达水平;
(3)与正常人相比,受试者样本中ZNF33B、FKBP1A、SERPINB8、SULT1B1中的至少一个表达显著升高,或,PRKX和/或LEF1表达显著降低,则该受试者被诊断为心血管疾病患者。
本文中“样本”可以包括但不限于组织活检物、切除的组织、组织提取物、呼出的气体、外周血、腹水液、组织间液、骨髓、脑脊液、胸腔积液、肿瘤浸润物、唾液、黏液、痰、精液、汗水、尿。
优选地,本发明所收集的样品是来自受试者的外周血。
优选地,所述方法包括:
(1)收集受试者外周血样本;
(2)提取受试者样本中的RNA,检测前述标志物组合或前述标志物组合中任意一个标志物的表达水平;
(3)与正常人相比,受试者样本中ZNF33B、FKBP1A、SERPINB8、SULT1B1中的至少一个表达显著升高,或,PRKX和/或LEF1表达显著降低,则该受试者被诊断为心血管疾病患者。
附图说明
图1为在数据库GSE12288中差异基因的差异箱线图,A是SERPINB8、B是ZNF33B、C是FKBP1A、D是MBD5、E是LEF1、F是SULT1B1、G是PRKX。
图2为在数据库GSE20680中差异基因的差异箱线图,A是SERPINB8、B是ZNF33B、C是FKBP1A、D是MBD5、E是LEF1、F是SULT1B1、G是PRKX。
图3是ZNF33B+MBD5在数据库GSE20680中诊断的ROC曲线;纵坐标是敏感度,横坐标是特异性。
图4是ZNF33B+PRKX在数据库GSE20680中诊断的ROC曲线;纵坐标是敏感度,横坐标是特异性。
图5是ZNF33B+PRKX+FKBP1A在数据库GSE20680中诊断的ROC曲线;纵坐标是敏感度,横坐标是特异性。
图6是ZNF33B+PRKX+LEF1在数据库GSE20680中诊断的ROC曲线;纵坐标是敏感度,横坐标是特异性。
图7是ZNF33B+PRKX+SULT1B1+LEF1在数据库GSE20680中诊断的ROC曲线;纵坐标是敏感度,横坐标是特异性。
图8是ZNF33B+PRKX+LEF1+SERPINB8在数据库GSE20680中诊断的ROC曲线;纵坐标是敏感度,横坐标是特异性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明,以下所述,仅是对本发明的较佳实施例而已,并非对本发明做其他形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容,依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化,均落在本发明的保护范围内。
实施例1、筛选并验证标志物组合的诊断效果
下载数据库GSE12288(110患者+112对照)、GSE20680(143患者+52对照)的数据,使用R包进行差异表达分析,筛选在患者和对照中差异表达(p<0.05)的基因。对比对两个数据库的筛选结果,筛选在两个数据库中表达量变化一致的标志物,分析结果表明ZNF33B、PRKX、LEF1、FKBP1A、SERPINB8、SULT1B1在两个数据库中的变化一致,差异分析如图1所示。
为提高诊断的准确性,对ZNF33B、PRKX、LEF1、FKBP1A、SERPINB8、SULT1B1进行组合,各组合的ROC值及附图如下表1所示:
表1、标志物组合及其AUC值
标志物、标志物组合 | AUC | 附图 | 最佳阈值(特异度,灵敏度) |
SERPINB8 | 0.586337 | ||
ZNF33B | 0.590775 | ||
FKBP1A | 0.594002 | ||
MBD5 | 0.595616 | ||
LEF1 | 0.60624 | ||
SULT1B1 | 0.60745 | ||
PRKX | 0.61014 | ||
ZNF33B+MBD5 | 0.614847 | 3 | 0.224(0.350,0.904) |
ZNF33B+PRKX | 0.711404 | 4 | 0.274(0.650,0.692) |
ZNF33B+PRKX+FKBP1A | 0.727811 | 5 | 0.270(0.685,0.712) |
ZNF33B+PRKX+LEF1 | 0.72808 | 6 | 0.318(0.776,0.615) |
ZNF33B+PRKX+SULT1B1+LEF1 | 0.735476 | 7 | 0.303(0.720,0.673) |
ZNF33B+PRKX+LEF1+SERPINB8 | 0.735745 | 8 | 0.292(0.713,0.673) |
由表1的数据可知,单独的标志物作为诊断标志物是AUC值较低,很难准确诊断疾病。当ZNF33B和PRKX组合时,AUC值到达0.7,达到准确诊断的标准。继续增加标志物的个数,AUC值继续升高,诊断结果准确,可以应用于临床诊断。
Claims (2)
1.检测以下任意一种标志物组合的表达水平的试剂在制备诊断受试者是否患有冠状动脉疾病的产品中的应用;
(1)ZNF33B+PRKX;
(2)ZNF33B+PRKX+LEF1;
(3)ZNF33B+PRKX+FKBP1A;
(4)ZNF33B+PRKX+LEF1+SERPINB8;
(5)ZNF33B+PRKX+SULT1B1+LEF1;
所述表达水平包括mRNA表达水平。
2.如权利要求1所述的应用,所述检测以下任意一种标志物组合的表达水平的试剂包括检测mRNA表达水平的试剂,所述检测mRNA表达水平的试剂包括特异性结合目标序列的核酸探针、扩增目标序列的引物、非特异性荧光染料。
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GR01 | Patent grant | ||
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