CN107475376A - 预测小细胞肺癌对化疗药物敏感性的标记物及试剂盒 - Google Patents

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CN107475376A CN201710651617.3A CN201710651617A CN107475376A CN 107475376 A CN107475376 A CN 107475376A CN 201710651617 A CN201710651617 A CN 201710651617A CN 107475376 A CN107475376 A CN 107475376A
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dll1
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郭琳珽
王琼瑶
张健
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方舜
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Abstract

本发明公开了预测小细胞肺癌对化疗药物敏感性的标记物及试剂盒。本发明利用基因芯片筛选获得小细胞肺癌耐药相关基因包含NOTCH通路中NOTCH1、Jagged1及DLL1，然后RT‑qPCR法验证芯片结果。本发明通过ROC曲线分析，发现联合NOTCH1、Jagged1及DLL1三种标志物对于预测小细胞肺癌化疗药物敏感性具有较高的灵敏度和特异性。利用本发明来预测小细胞肺癌化疗药物敏感性，方法简单、时间短、效率高，可对SCLC患者进行分层，为小细胞肺癌的精准治疗提供依据。

Description

预测小细胞肺癌对化疗药物敏感性的标记物及试剂盒
技术领域
本发明涉及预测小细胞肺癌对化疗药物敏感性的标记物及试剂盒。
背景技术
最新统计资料显示肺癌在我国城市恶性肿瘤的发病中已居于首位，且其发病率仍呈明显上升趋势，每年增长率高达百分之二十六点九，预估到2025年中国将成为世界第一肺癌大国。小细胞肺癌的发病率约占全部肺癌患者的20％，发病人数也将达到相当数量。小细胞肺癌(SCLC)是肺癌中侵袭性最强的亚型，约占全部肺癌的15-20％，SCLC临床预后差，未接受治疗者常在确诊后2-4个月内死亡。化疗仍是SCLC的标准治疗模式，尽管大部分患者在治疗初期对化疗敏感，但短时间内极易产生耐药性而复发，5年生存期不足10％。目前SCLC的治疗原则是建立在传统组织病理学基础上，无法为临床治疗提供准确和系统的指导，难以获得有效的治疗、治疗不当或过度是当前SCLC治疗的突出临床问题。
Notch信号通路是一条在物种进化上十分保守的信号转导系统。哺乳动物中有4个同源Notch受体和5个同源配体,其中同源受体是Notch1-4，同源配体有两类：Delta样配体,分别为DLL1、DLL3、DLL4；Serrate样配体，分别为Jagged1和Jagged2。Notch受体通过与配体的相互作用转导细胞信号，在细胞增殖、分化、凋亡中发挥重要的调控作用。Notch1受体作为最常被关注也是最常被检测到的Notch受体家族成员，在许多人类肿瘤中如胶质瘤、头颈肿瘤、甲状腺髓样癌、胸膜间皮瘤、乳腺癌、肺癌、食管癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、宫颈癌等检出Notchl受体表达量的异常，Notch1受体及其配体Jagged-1的异常高表达被认为是乳腺癌预后不良的标志物。Notch1与多种肿瘤的耐药有关，在顺铂耐药的头颈部鳞状细胞癌、卵巢癌、宫颈癌及胃癌中Notch-l高表达。通过siRNA干扰技术或γ分泌酶抑制剂下调Notchl活性能增强乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性，同时导致乳腺癌曲妥珠单抗耐药细胞株凋亡增加，恢复对曲妥珠单抗的敏感性。另外抑制Notch活性还能增加乳腺癌细胞对多西他赛和多柔比星的药物敏感性。研究还发现Notch1在结肠癌细胞系HCTll6和Sw620中表达上调，抑制Notch1活性能增加肿瘤细胞对奥沙利铂、5-氟尿嘧啶及伊立替康的化疗敏感性，促进肿瘤细胞凋亡。
如何较好地预测小细胞肺癌患者对化疗药物的敏感性，为临床医生快速准确了解小细胞肺癌患者对化疗药物的疗效，及时采取更具个体化的防治方案提供支持，目前尚未存在有效的解决方法。
发明内容
本发明的目的在于提供外周血RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1作为预测小细胞肺癌对化疗药物敏感性的检测靶标的应用。
本发明的另一目的在于提供一种预测小细胞肺癌对化疗药物敏感性的试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
外周血RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1作为预测小细胞肺癌对化疗药物敏感性的检测靶标的应用。
定量检测RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1的试剂在制备预测小细胞肺癌对化疗药物敏感性的试剂或试剂盒的应用。
进一步的，所述化疗药物选自顺铂、足叶乙甙、阿霉素。
进一步的，所述定量检测RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1的试剂为荧光定量PCR检测RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1的引物。
进一步的，所述荧光定量PCR检测RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1的引物分别为SEQ ID NO:1～2、SEQ ID NO:3～4、SEQ ID NO:5～6。
一种预测小细胞肺癌对化疗药物敏感性的试剂盒，该试剂盒含有定量检测RNANOTCH1、Jagged1和/或DLL1的试剂。
进一步的，所述定量检测RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1的试剂为荧光定量PCR检测RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1的引物。
进一步的，所述荧光定量PCR检测RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1的引物分别为SEQ ID NO:1～2、SEQ ID NO:3～4、SEQ ID NO:5～6。
进一步的，该试剂盒还含有SEQ ID NO:7～8所示的内参引物。
一种检测小细胞肺癌对化疗药物敏感性的方法，对外周血RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1进行定量检测，该方法用于非疾病的诊断和治疗。
本发明的有益效果是：
(1)NOTCH1、Jagged-1及DLL1作为组合分子标记物，经过临床样本验证，能较好预测小细胞肺癌患者对化疗药物的敏感性，三个分子标记物首次应用于化疗药物的敏感性检测试剂盒开发，可用于指导临床个体化治疗，并提高治疗的精准性。
(2)本发明提供了相应的试剂盒运用实时荧光定量PCR方法，检测快速方便、检测灵敏度、成本低。
附图说明
图1是基因芯片结果图，A是激光扫描仪扫描芯片采集杂交图象；B是差异基因的分布图，其中样品A、样品B分别指H69AR和H69细胞；
图2是采用本发明的试剂盒检测样本的NOTCH1和内参对照GAPDH的熔解曲线图；
图3是采用本发明的试剂盒检测样本的Jagged-1和内参对照GAPDH的熔解曲线图；
图4是采用本发明的试剂盒检测样本的DLL1和内参对照GAPDH的熔解曲线图；
图5是采用本发明的试剂盒分别进行NOTCH1、Jagged-1及DLL1单指标检测及三指标联合检测的ROC曲线图。
具体实施方式
外周血RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1作为预测小细胞肺癌对化疗药物敏感性的检测靶标的应用。
定量检测RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1的试剂在制备预测小细胞肺癌对化疗药物敏感性的试剂或试剂盒的应用。
优选的，所述化疗药物选自顺铂、足叶乙甙、阿霉素。
优选的，所述定量检测RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1的试剂为荧光定量PCR检测RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1的引物。
优选的，所述荧光定量PCR检测RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1的引物分别为SEQID NO:1～2、SEQ ID NO:3～4、SEQ ID NO:5～6。
一种预测小细胞肺癌对化疗药物敏感性的试剂盒，该试剂盒含有定量检测RNANOTCH1、Jagged1和/或DLL1的试剂。
优选的，所述定量检测RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1的试剂为荧光定量PCR检测RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1的引物。
优选的，所述荧光定量PCR检测RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1的引物分别为SEQID NO:1～2、SEQ ID NO:3～4、SEQ ID NO:5～6。
优选的，该试剂盒还含有SEQ ID NO:7～8所示的内参引物。
优选的，该试剂盒还含Taq DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs、饱和荧光染料、逆转录酶、Random primers、Oligo dT Primer、无核酸酶纯水。
一种检测小细胞肺癌对化疗药物敏感性的方法，对外周血RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1进行定量检测，该方法用于非疾病的诊断和治疗。
优选的，所述化疗药物选自顺铂、足叶乙甙、阿霉素。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
本发明人利用基因表达谱芯片对小细胞肺癌耐药细胞H69AR和非耐药细胞H69中21,522个基因进行分析，结果发现H69AR细胞中Notch信号通路相关基因NOTCH1和Jagged-1的mRNA表达明显增加，而DLL1的表达水平明显降低，并用实时定量PCR技术对芯片结果进行验证。本发明进一步验证SCLC患者外周血中NOTCH1、Jagged1及DLL1的mRNA表达的临床意义，发现NOTCH1、Jagged-1及DLL1的mRNA表达水平与患者对小细胞肺癌的一线化疗药物的敏感性有关，本发明可为小细胞肺癌的精准治疗提供依据。
实施例1
1、利用基因芯片筛选小细胞肺癌细胞耐药相关的mRNA
(1)细胞培养小细胞肺癌细胞H69和耐药细胞H69AR购自美国The American TypeCulture Collection(ATCC)，使用RPMI-1640培养液，细胞置于37℃，5％CO2的培养箱中培养。
(2)RNA抽提按Trizol说明抽提总RNA，主要步骤如下：取H69和H69AR细胞(1X107)，加入1ml Trizol，以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒；将上层水相移于一新的离心管，按每ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，离心10分钟(12000g/分钟)。弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75％乙醇，涡旋混匀，4℃下离心5分钟(7500g/分钟)。
(3)荧光标记样品RNA。①反转录合成1st-strand cDNA以Total RNA或mRNA起始，含有T7启动子序列的T7Oligo(dT)Primer为引物，使用CbcScript酶合成1st-strand cDNA。②合成2nd-strand cDNA。用RNase H将杂合链中的RNA切成短片段，DNA Polymerase以RNA短片段为引物延伸，合成2nd-strand cDNA，并纯化双链cDNA。③体外转录合成cRNA。以cDNA为模板，利用T7Enzyme Mix合成cRNA；然后用RNA Clean-up Kit(MN)纯化。④随机引物反转录。取2ug cRNA，用CbcScriptⅡ酶，Random Primer进行反转录，反转录产物用PCRNucleoSpin Extract II Kit(MN)化。⑤cDNA用KLENOW酶标记。取上述反转录产物，以Random Primer为引物进行KLENOW酶标记，标记产物用PCR NucleoSpin Extract II Kit(MN)纯化，纯化后抽干。Cy5-dCTP、Cy3-dCTP(GE Healthcare Cat.No.PA 55021/PA53021)。
(4)芯片杂交。芯片为北京博奥生物有限公司产品(22K Human Genome Array)，共有21522条70mer长度的Oligo DNA，每条Oligo DNA代表了人的一个基因转录本。为保证结果的重复性和可靠性，每个样本用两张芯片重复进行实验。标记的DNA溶于80μl杂交液中(3×SSC,0.2％SDS,5×Denhart’s,25％甲酰胺)，于42℃杂交过夜。杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS和2×SSC的液体中洗5min，而后在0.2×SSC中室温洗5min。玻片甩干后即可用于扫描。
(5)芯片扫描及数据处理。芯片用LuxScan 10KA双通道激光扫描仪(CapitalBio公司)进行扫描。采用LuxScan 3.0图像分析软件(CapitalBio公司)对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号；根据cy5和cy3总体信号的global mean对各芯片进行片间线性校正，删除了荧光信号弱的基因以及芯片上的阴性对照、内标、外标等冗余的数据，然后进行比值(ratio)整合，ratio＝(ratio1*ratio2)0.5，再以2倍标准筛选差异表达基因。
结果：芯片检测结果如图1所示，耐药细胞H69AR中NOTCH信号通路相关基因包括NOTCH1、Jagged-1的表达水平明显高于非耐药细胞H69(P<0.01)，而DLL1的表达水平明显低于非耐药细胞H69(P<0.01)。
2、实时定量PCR验证基因芯片结果
(1)引物
检测NOTCH1的引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，检测Jagged1的引物序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，检测DLL1的引物序列如SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6所示，内参引物序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，具体序列如下。
NOTCH1-F：5’-GTGACTGCTCCCTCAACTTCAAT-3’(SEQ ID NO：1)，
NOTCH1-R：5’-CTGTCACAGTGGCCGTCACT-3’(SEQ ID NO：2)，
Jagged 1-F：5’-CGGGATTTGGTTAATGGTTATC-3’(SEQ ID NO：3)，
Jagged 1-R：5’-ATAGTCACTGGCACGGTTGTAGCAC-3’(SEQ ID NO：4)，
DLL1-F：5’-CCTACTGCACAGAGCCGATCT-3’(SEQ ID NO：5)，
DLL1-R：5’-GCAGGTGGCTCCATTCTTGC-3’(SEQ ID NO：6)，
GAPDH-F：5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’(SEQ ID NO：7)，
GAPDH-R：5’-CATGGGTGGAATCATATTGGA-3’(SEQ ID NO：8)。
(2)实时定量PCR
RNA提取方法同上，将0.5mg的RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增：
逆转录(从RAN-cDNA)
逆转录体系(10μl)
逆转录反应条件：37℃，15min；85℃，5s，即得到所需的cDNA。
PCR反应体系(25μl)
PCR反应条件：95℃15m，1个循环；95℃10s，60℃30s，40个循环；95℃15s，55℃，45s，95℃15s，1个循环。
结果分析：待PCR反应全部结束后，观察所得PCR扩增曲线及融解曲线，实时荧光定量PCR检测NOTCH1、Jagged-1、DLL1的融解曲线分别如图2、图3和图4的所示；根据PCR定量检测结果制作标准曲线。用基因的表达量计算公式F＝2-△△Ct来计算基因的表达数值。每组进行3次重复试验，记录3次可用的数值。△△ct＝(待测样品的目的基因的Ct值的平均值－待测样本的管家基因的Ct值的平均值)-(对照样品的目的基因的Ct值的平均值一对照样本的看家基因的Ct值的平均值)。
结果：实时定量PCR分析显示相对于敏感细胞H69，耐药细胞H69AR中NOTCH1和Jagged-1的表达水平分别上调约27.28和34.66倍，而DLL1的表达水平下调约99倍，检测结果与芯片检测结果一致。
3、NOTCH1、Jagged-1及DLL1预测小细胞肺癌对化疗药物敏感性的效能
(1)临床样本采集
研究对象为29名初诊的住院接受化疗的小细胞肺癌患者。入组标准：病理学诊断明确，以往未接受针对小细胞肺癌的化疗、手术和放疗；身体一般状况评分PS0-2；无主要脏器的功能障碍，血常规、肝肾功能及心脏功能基本正常；所有研究对象均为无血缘关系的汉族人群，均是首次接受铂类(顺铂)为基础的一线治疗方案。化疗前使用EDTA抗凝的采血管收集研究对象的外周静脉血3ml，完成6个月化疗后再次抽取静脉血3ml，分别检测化疗前后外周静脉血中NOTCH1、Jagged-1及DLL1的含量情况。
(2)血液总RNA提取(Trizol法)
①将血液置于37℃环境静置30min，至观察到明显分层。②将上清液转移至新的离心管，注意尽量不要吸到下层红细胞。③2500rpm离心30min，可见液体分为两层，上层为血清，离心管底部沉淀即为单核细胞。④将血清转移至新的离心管以作其他实验，单核细胞中加入1ml Trizol，反复吹打以充分裂解。⑤室温放置5分钟，然后以Trizol:氯仿＝5:1的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒(氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开)；待溶液充分乳化(无分相现象)后，再室温静置5分钟。⑥12000g 4℃离心15分钟，从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中(切忌吸出白色中间层)。⑦向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃静置10分钟。⑧12000g 4℃离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。⑨RNA沉淀的清洗：小心弃去上清液，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇l ml(切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12000g 4℃离心5分钟后小心弃去乙醇(为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇)。⑩RNA的溶解：室温干燥沉淀2～5分钟(不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解)，加入适量的RNase-free水溶解沉淀，必要时可用移液器轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。
(3)实时荧光定量PCR检测NOTCH1、Jagged-1及DLL1的mRNA水平。操作过程和反应程序同上述(2)，对实时荧光定量PCR检测结果进行ROC曲线分析，评估这三种基因对SCLC化疗敏感性的判断效能。
上述29例SCLC患者化疗前后血液样本中，发现17例患者化疗6个月后出现临床耐药现象。以化疗前NOTCH1、Jagged-1及DLL1的血液mRNA水平为对照，化疗后6个月3个基因(NOTCH1、Jagged-1及DLL1)的表达量为标准，绘制ROC曲线来评估这三种基因对SCLC化疗敏感的判断能力。结果如表1和图5所示，就单个基因而言，NOTCH1以89.1％的AUC将化疗药物敏感组和非敏感组分开；Jagged-1以80.3％的AUC将药物敏感组和非敏感组分开；DLL1以83.8％的AUC将药物敏感组和非敏感组分开。对3个标志物的联合分析发现，这3种基因组合以93.5％的AUC将药物敏感组和非敏感组分开，各个变量预测药物敏感性的ROC曲线下面积(见表1、图5)。上述结果说明本发明采用NOTCH1、Jagged-1及DLL1的组合能够很好地预测小细胞肺癌患者对一线化疗药物的敏感性。
表1NOTCH1、Jagged-1及DLL1预测SCLC对化疗药物敏感性的ROC曲线下面积
AUC SE 95％CI
NOTCH1 0.891 0.056 0.781-1.000
Jagged-1 0.803 0.073 0.660-0.946
DLL1 0.838 0.066 0.709-0.967
NOTCH1+Jagged-1+DLL1 0.935 0.040 0.857-1.000
综上所述，NOTCH1、Jagged-1及DLL1与小细胞肺癌对化疗药物敏感性有关，因此，可制作用于预测小细胞肺癌化疗药物敏感性的试剂或试剂盒，使该试剂或试剂盒中含有能够检测NOTCH1、Jagged-1及DLL1表达水平的试剂。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学珠江医院
<120> 预测小细胞肺癌对化疗药物敏感性的标记物及试剂盒
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtgactgctc cctcaacttc aat 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctgtcacagt ggccgtcact 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgggatttgg ttaatggtta tc 22
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atagtcactg gcacggttgt agcac 25
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cctactgcac agagccgatc t 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcaggtggct ccattcttgc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gagtcaacgg atttggtcgt 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
catgggtgga atcatattgg a 21

Claims (10)

1.外周血RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1作为预测小细胞肺癌对化疗药物敏感性的检测靶标的应用。
2.定量检测RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1的试剂在制备预测小细胞肺癌对化疗药物敏感性的试剂或试剂盒的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述化疗药物选自顺铂、足叶乙甙、阿霉素。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述定量检测RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1的试剂为荧光定量PCR检测RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1的引物。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述荧光定量PCR检测RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1的引物分别为SEQ ID NO:1～2、SEQ ID NO:3～4、SEQ ID NO:5～6。
6.一种预测小细胞肺癌对化疗药物敏感性的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有定量检测RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1的试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述定量检测RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1的试剂为荧光定量PCR检测RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1的引物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR检测RNA NOTCH1、Jagged1和/或DLL1的引物分别为SEQ ID NO:1～2、SEQ ID NO:3～4、SEQ ID NO:5～6。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还含有SEQ ID NO:7～8所示的内参引物。
10.一种预测小细胞肺癌对化疗药物敏感性的方法，其特征在于，对外周血RNANOTCH1、Jagged1和/或DLL1进行定量检测，该方法用于非疾病的诊断和治疗。
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