CN111458507A - 评估肝内胆管癌吉西他滨化疗敏感性的标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种评估肝内胆管癌吉西他滨化疗敏感性和/或预后的标志物及其应用。评估肝内胆管细胞癌吉西他滨化疗敏感性和/或预后的标志物为肝内胆管癌患者外周血白细胞或胆管癌组织中免疫细胞表面所表达的CXCR3。评估肝内胆管细胞癌吉西他滨化疗敏感性和/或预后的试剂盒包括CXCR3蛋白表达量的检测相关试剂。评估肝内胆管癌吉西他滨化疗敏感性和/或预后的方法包括以下步骤：1)检测肝内胆管癌患者外周血白细胞或胆管癌组织中免疫细胞表面CXCR3的表达量；2)与预先设定的CXCR3蛋白表达量阈值做比较，高于阈值评定为患者对吉西他滨化疗敏感和/或吉西他滨化疗治疗预后良好，否则评定为对吉西他滨化疗不敏感和/或吉西他滨化疗治疗预后不佳。

Description

评估肝内胆管癌吉西他滨化疗敏感性的标志物及其应用
技术领域
本发明属于医学生物检测技术领域，涉及一种评估肝内胆管癌吉西他滨化疗敏感性及预后的标志物、试剂盒以及方法。
背景技术
肝内胆管癌(ICC)发生于二级胆管近端，是第二常见的原发性肝癌，其发病率呈稳步上升趋势。ICC来源于肝内胆管上皮细胞，手术切除是唯一有效的治疗方法，作为一种高度恶性的疾病，只有接受完全R0手术切除的病人才能有更好的生存率。有研究证实放疗和辅助化疗对晚期或侵袭性胆管肿瘤的生存有好处，对于不能切除和转移性ICC的首选治疗方式是吉西他滨和顺铂联合治疗。然而由于复杂的肿瘤异质性，ICC患者对化疗的反应不同。研究表明患者的免疫状态会影响他们的化疗敏感性。因此，通过检测ICC患者免疫功能状态来预测化疗的反应性从而指导临床治疗方案，对于提高患者治疗效果改善生存质量意义重大。
CXC亚族趋化因子受体3(CXCR3)高度表达于活化的T淋巴细胞上，属于Thl细胞趋化因子受体，最初被认为是专门协调白细胞转运的趋化因子，现在因其在调节细胞增殖、分化和存活中的多种作用而被公认。它们的正常功能失调会导致各种病理，包括炎症疾病和癌症。CXCR3及其同源的趋化因子(CXCL11、CXCL10、CXCL9、CXCL4和CXCL4L1)参与了许多肿瘤的控制和发展[8]，并被认为是提示患者预后的潜在指示分子。关于吉西他滨化疗方案与CXCR3功能水平之间相互关联的研究尚且十分有限，目前尚未有关于通过CXCR3表达量评估吉西他滨对肝内胆管癌治疗效果的研究。
发明内容
本发明旨在提供一种CXCR3的新应用，特别是在评估肝内胆管癌吉西他滨化疗敏感性和预后中的应用。
本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现ICC患者肿瘤组织CXCR3的表达与对吉西他滨化疗的敏感性相关，进一步发现患者外周血白细胞中CXCR3表达水平与肿瘤组织内CXCR3表达水平有良好的一致性，能够用于判断肝内胆管癌患者对吉西他滨化疗的敏感性。
本发明的第一方面，提供了一种评估肝内胆管细胞癌吉西他滨化疗敏感性和/或预后的标志物，所述标志物为肝内胆管癌患者外周血白细胞或胆管癌组织中免疫细胞表面所表达的CXCR3。
优选地，所述CXCR3表达于T细胞表面。
进一步优选地，所述CXCR3表达于CD4+T细胞表面。
本发明第二个方面，提供了所述评估ICC吉西他滨化疗敏感性和/或预后标志物在制备评估ICC对吉西他滨化疗敏感性及预后的试剂或试剂盒中的应用。
进一步，本发明提供了一种评估肝内胆管细胞癌吉西他滨化疗敏感性和/或预后的试剂盒，所述试剂盒包括CXCR3蛋白表达量的检测相关试剂。
优选地，所述评估肝内胆管细胞癌吉西他滨化疗敏感性和/或预后的试剂盒检测肝内胆管癌患者外周血白细胞或胆管癌组织中免疫细胞表面所表达的CXCR3。
优选地，所述试剂盒检测T细胞表面的CXCR3。
进一步优选地，所述试剂或试剂盒检测CD4+T细胞表面的CXCR3。
优选地，所述评估肝内胆管细胞癌吉西他滨化疗敏感性和/或预后的试剂盒包括CXCR3的单克隆抗体或多克隆抗体。
可选地，所述CXCR3多克隆抗体为Proteintech公司的产品。
优选地，所述评估肝内胆管癌吉西他滨化疗敏感性和/或预后的试剂盒包括免疫组化试剂；所述免疫组化试剂包括二甲苯、乙醇、3％H2O2溶液、1％BSA封闭液、DAB显色剂、苏木素和辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG。
优选地，所述评估肝内胆管癌吉西他滨化疗敏感性和/或预后的试剂盒包括外周血白细胞提取试剂。
优选地，所述评估肝内胆管癌吉西他滨化疗敏感性和/或预后的试剂盒还包括与CXCR3蛋白表达量相关的阈值；进一步优选地，CXCR3蛋白表达量高于阈值则评定为对吉西他滨化疗敏感和/或吉西他滨化疗治疗预后良好，否则评定为对吉西他滨化疗不敏感和/或吉西他滨化疗治疗预后不佳。
本发明第三个方面，提供了一种评估肝内胆管癌吉西他滨化疗敏感性和/或预后的方法，该方法包括以下步骤：
1)检测肝内胆管癌患者外周血白细胞或胆管癌组织中免疫细胞表面CXCR3的表达量；
2)与预先设定的CXCR3蛋白表达量阈值做比较，高于阈值评定为患者对吉西他滨化疗敏感和/或吉西他滨化疗治疗预后良好，否则评定为对吉西他滨化疗不敏感和/或吉西他滨化疗治疗预后不佳。
优选地，当检测的是外周血白细胞中免疫细胞时，步骤1)包括以下具体操作流程：
A)从新鲜的外周血中分离出白细胞，优选为单个核细胞；
B)对白细胞进行CyTOF分析。
优选地，当检测的是胆管癌组织中免疫细胞时，步骤1)包括以下具体操作流程：
a)利用免疫组化试剂对胆管癌组织切片进行免疫组化染色；
b)利用显微镜和成像装置拍摄为数码照片；
c)利用生物图像处理软件分析染色阳性信号强度，给出评分。
在本发明的一个优选实施例中，采用Image Scope(Aperio公司)软件对整张组织芯片进行扫描，扫描后采用该软件的Algorithms(Positive Pixel Count)程序对每个芯片点进行“阳性Pixel”计算，每个组织芯片点的组化评分计算方法为Log10[255/Iavg]，其中Iavg为平均强度，计算方法：
平均强度＝(弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度)/(弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量)；
所述CXCR3蛋白表达量阈值为0.25，高于0.25为高表达，等于或低于0.25为低表达。
本发明首次提出CXCR3的表达水平与吉西他滨疗效具有相关性，并同时提出了外周血白细胞中CXCR3表达水平与肿瘤组织内CXCR3表达水平的一致性，且有良好吉西他滨化疗反应性的患者外周血所高表达的CXCR3主要表达于CD4+T细胞，从而提供了一种通过检测CXCR3的表达水平来判断肝内胆管癌患者吉西他滨疗效和预后的方法和试剂盒，对于肝内胆管癌病人术后监控和序贯治疗具有重要的指导意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是从样本中分离白细胞进行CyTOF分析的工作流程图：提取ICC患者外周血中的免疫细胞，用金属标记的抗体处理，然后用飞行时间质谱细胞仪检测；降维后获得的数据可视化，通过手动门控策略和聚类算法识别细胞簇；
图2是来自化疗敏感患者(R)和化疗不敏感者(NR)外周血白细胞(PBMC)的CyTOF数据的tSNE图，确定了免疫谱系；
图3是利用FlowSOM聚类方法描绘R和NR外周血T细胞免疫亚群情况，亚群1、16、22(CXCR3+T)在R和NR患者之间表达差异较为明显；
图4是29个T细胞簇在总T细胞中占比的柱状图，其中簇1、16、22的差异具有显著性，R与NR两组患者中占比差异明显；
图5是在化疗前、化疗中和化疗后三个时间点，外周血T细胞免疫亚群1、16、22的FlowSOM聚类分析图，R和NR患者在化疗前差异最大；
图6是化疗前、中、后三个时间点，R和NR患者中CXCR3+CD4+T细胞在T细胞总量中百分占比的统计图；
图7是化疗前、中、后三个时间点，R和NR患者中CXCR3+CD8+T细胞在T细胞总量中百分占比的统计图；
图8是化疗前、中、后三个时间点，R和NR患者中CXCR3+CD4+T细胞在CXCR3+CD4+T细胞和CXCR3+CD8+T细胞总量中百分占比的统计图；
图9是化疗前、中、后三个时间点，R和NR患者中CXCR3+CD8+T细胞在CXCR3+CD4+T细胞和CXCR3+CD8+T细胞总量中百分占比的统计图；
图10是同一患者胆管癌组织中CD4、CD8、CXCR3表达情况和外周血CXCR3表达情况的比较图，可以看出CXCR3主要与CD4分子融合在一起，且肿瘤组织中CXCR3表达情况和外周血CXCR3具有一致性；
图11是临床胆管癌组织样本中，CXCR3表达量分别为低、中、高的典型样本的染色情况；
图12是CD4和CXCR3表达水平与总生存率(OS)之间相关性的分析图；
图13是CD4和CXCR3表达水平与无复发生存率(RFS)之间相关性的分析图。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果，但本发明的实施不仅限于此。
实施例1：外周血样本处理
1、样本的处理
外周血取自东方肝胆外科医院的20例ICC患者(其中8例对化疗敏感，12例对化疗不敏感)，这些患者接受吉西他滨化学治疗。
从外周血中分离白细胞进行CyTOF分析的工作总流程如图1所示。在化疗前、中、后三个时间点分别取2mL外周血，共获得49个样本用于本实验。所有样本都按照当地的道德准则进行了匿名编码。
2、从外周血中分离白细胞
从新鲜的上述外周血中分离出白细胞从而获得20组外周血单个核细胞(PBMC)。
具体步骤为：
PBS将全血样本1:1稀释
↓
加入等体积Ficoll液(倾斜离心管贴壁加液缓慢操作避免晃动，使Ficoll液加在样本上层)
↓
室温400g(RCF)离心30分钟(刹车速度DECEL为5)
↓
吸出中层白色PBMC(不要吸到上层血浆及下层红细胞)
↓
向PBMC中加PBS至总体积5mL，室温300g(RCF)离心5分钟
↓
弃掉上清，PBS重悬细胞至1mL体系
3、CyTOF分析
对20个患者化疗前、中、后共49例PBMC进行CyTOF分析，步骤概括如下：
加入顺铂(终浓度为0.5μM)，混匀后室温放置2分钟
↓
加入2mL Cell Staining Buffer终止反应，室温500g(RCF)离心5分钟(同时准备Blocking Mix：单个PBMC样本为Fc Receptor Blocking Solution 5μL+Cell StainingBuffer 50μL)
↓
弃去上清，加入50μL Blocking Mix，混匀后室温放置10分钟(同时配制一抗cocktail：单个PBMC样本用量为每种抗体1.1μL，总体积为55μL，其余用Cell StainingBuffer补齐)
↓
加入50μL cocktail，混匀后室温放置30分钟
↓
加入2mL Cell Staining Buffer，室温500g(RCF)离心5分钟，弃去上清，并重复该步骤一次
(同时配制Cell intercalation：在fix and perm buffer里加入终浓度为125nM的Iridium，每个样本用量为1mL)
↓
弃去上清后，加入100μL不含Ca2+、Mg2+的PBS，涡旋振荡5秒使细胞沉淀充分悬起
↓
一边涡旋振荡，一边逐滴加入Cell intercalation(1mL)，室温放置1小时或者4度过夜
↓
加入2mL Cell Staining Buffer，室温800g(RCF)离心5分钟，弃去上清，并重复该步骤两次
↓
加入1mL去离子水重悬
↓
Helios质谱仪(Fludigm，美国)上样并分析
根据制造商的说明，使用了EQ四元素校准珠以对信号进行归一化。每个样品收集了250,000～500,000个细胞事件。文件(.fcs)已上传到Cytobank，手动设置了感兴趣的种群，并将感兴趣的事件以.fcs文件形式导出。为了进一步分析，使用R软件包上的CyTOFkit程序从每个fcs文件中随机抽取了6000个细胞样本。然后，在这些细胞上执行了基于tSNE的可视化和基于FlowSOM算法的聚类，CyTOF分析流程如图1所示。
实施例2肝内胆管癌的外周血免疫微环境空间异质性分析
本实施例从近20,000,000个白细胞(每个样品平均约450,000个细胞)中收集了高维度单细胞蛋白质组学概况。免疫谱系的分布可视化tSNE图如图2所示：ICC的R(化疗敏感)与NR(化疗不敏感)患者外周血中，T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、mDC数量存在明显差异。这表明，不同ICC患者间外周血免疫微环境有较大异质性。
实施例3化疗前T细胞簇个体差异性及CXCR3+T细胞的分布特征
为了研究R与NR患者T细胞亚群组成，我们可视化并重新分析了T细胞亚群。通过应用FlowSOM算法，可以将T细胞划分为29个簇(cluster)(包括来自20个患者三个时间点样本的所有T细胞放在一起进行分析)(图3和图4)。不同个体间T细胞簇差异明显(簇1、16、22较为显著)，R与NR患者不能很好地聚类分开。
为了进一步寻找R与NR之间的共性与差异，我们将三个时间点样本的T细胞分别与上述显著差异T细胞簇(簇1、16、22)聚类(图5)。在给予吉西他滨治疗前，化疗敏感性不同的两组患者簇1、16、22差异显著而R或NR内部不同个体间簇1、16、22有很强相似性(R与NR患者能够各自分别聚类在一起，而R组和NR组相对分开，详见图5敏感性聚类情况)。以上结果初步提示可以根据化疗前患者外周血T细胞特殊簇群的特征对患者的化疗敏感性进行预判。
通过分析T细胞簇的分子表达特征，我们发现簇16、22分子表达相似，均为CXCR3+CD45RO+T。比较R与NR组中三个不同时间点CXCR3+T细胞数量，化疗前CXCR3+CD4+T细胞在R患者中占总T细胞比例高于NR患者(图6)，提示化疗前ICC患者外周血CXCR3+CD4+T细胞占比可用于评估化疗疗效，占比多的患者可能对吉西他滨化疗有较好的反应性；化疗前CXCR3+CD8+T细胞在R患者中占总T细胞比例也高于NR患者(图7)，提示化疗前ICC患者外周血CXCR3+CD8+T细胞占比也可用于评估化疗疗效，占比多的患者可能对吉西他滨化疗有较好的反应性；将图6与图7比较分析可得知CXCR3主要表达于CD4+T细胞(CXCR3+CD4+T细胞比例高于CXCR3+CD8+T细胞)。进一步比较R与NR两组患者CXCR3+CD4+T和CXCR3+CD8+T的比例，化疗前CXCR3+CD4+T/(CXCR3+CD4+T+CXCR3+CD8+T)的比例在R患者中高于NR患者(图8)，化疗前CXCR3+CD8+T/(CXCR3+CD4+T+CXCR3+CD8+T)的比例在R患者中低于NR患者(图9)，进一步证实具有良好吉西他滨化疗反应性的患者外周血所高表达的CXCR3主要表达于CD4+T细胞而不是CD8+T细胞。以上结果进一步提示化疗前外周血中高比例的CXCR3+T预示患者对吉西他滨有更好的敏感性。
实施例4外周血CXCR3表达水平与肝内胆管癌组织中CXCR3表达水平有良好一致性
为了检查CXCR3+T细胞的潜在预后价值，本实施例分析了吉西他滨化疗前5组匹配的ICC外周血白细胞与肿瘤组织浸润淋巴细胞CXCR3表达情况，可以看出肿瘤组织CXCR3主要表达于CD4+T细胞(CXCR3主要和CD4分子融合)，证明同外周血一样，ICC肿瘤组织中的CXCR3也主要表达于CD4+T细胞，与同一患者外周血CXCR3+CD4+T细胞含量作比较(肿瘤组织与外周血CXCR3都主要表达于CD4+T细胞，且R患者CXCR3水平高于NR患者)，说明外周血与胆管癌组织CXCR3表达水平相一致(图10)。
本实施例的组织样本取自上述东方肝胆外科医院的20例ICC患者中的5例(其中2例对化疗敏感，3例对化疗不敏感)手术切除的肿瘤组织。使用了OpalTM7ImmunologyDiscovery Kit试剂盒(Perkin-Elmer)对石蜡组织切片进行多标免疫荧光染色。具体步骤如下：
(1)去石蜡：在干燥的烤箱中于55-60℃加热载玻片加热四小时，其位置应允许排出熔化的石蜡。用二甲苯洗涤玻片10分钟，共3次。通过乙醇梯度水合，最后用蒸馏水洗涤。
(2)切片固定：在10％中性福尔马林缓冲液中固定组织20分钟，然后用蒸馏水洗涤。
(3)3种抗体标记的多重染色：
循环一：
C1.1：抗原修复/微波法。用AR9试剂冲洗切片。将切片放入Opal切片处理罐中浸满AR9试剂到顶部。在先前确定的最佳条件下执行微波处理，随后让切片在工作台上冷却至少15分钟至室温。
C1.2：封闭。用TBST冲洗幻灯片。用疏水性笔将要染色的组织区域圈起来。在室温(RT)下用抗体稀释液孵育组织10分钟。
C1.3：一抗孵育。除去封闭液，然后将最佳浓度的CD4抗体加入到组织中。用1XTBST冲洗切片3次，每次2分钟。
C1.4：二抗孵育。将Opal多聚物HRP二抗溶液加入组织并在室温下孵育10分钟。用1X TBST洗涤切片3次，每次2分钟。
C1.5：Opal荧光基团孵育。将Opal-520工作溶液涂到组织上并室温孵育10分钟。用TBST清洗切片3次，每次2分钟。
C1.6：微波处理。用AR9冲洗切片。将切片放入装有AR9的Opal切片处理罐中，溶液装到顶部。使用微波处理，然后让切片冷却15分钟以上至室温。
循环二：
C1.1：封闭。用TBST冲洗幻灯片。用疏水性笔将要染色的组织区域圈起来。在室温(RT)下用抗体稀释液孵育组织10分钟。
C1.2：一抗孵育。除去封闭液，然后将最佳浓度的CXCR3抗体加入到组织中。用1XTBST冲洗切片3次，每次2分钟。
C1.3：二抗孵育。将Opal多聚物HRP二抗溶液加入组织并在室温下孵育10分钟。用1X TBST洗涤切片3次，每次2分钟。
C1.4：Opal荧光基团孵育。将Opal-570工作溶液涂到组织上并室温孵育10分钟。用TBST清洗切片3次，每次2分钟。
C1.5：微波处理。用AR9冲洗切片。将切片放入装有AR9的Opal切片处理罐中，溶液装到顶部。使用微波处理，然后让切片冷却15分钟以上至室温。
(4)DAPI染色：先用蒸馏水冲洗玻片，再用TBST冲洗。在DAPI溶液中将切片室温孵育5分钟。用TBST将切片洗两分钟，然后用蒸馏水洗两分钟。
(5)封片：用中性树脂作为封片试剂
多重荧光标记过的切片使用Vectra 3.0Pathology Imaging System Microscope(Perkin-Elmer)进行了扫描，后续分析在HaloTM Image Analysis software(indica labs)平台上进行，使用了Highplex FL模块。
多标结果(ICC组织中CXCR3表达情况，图10左)与流式结果(外周血液循环中CXCR3表达情况，图10右)相匹配，可以看出肿瘤组织CXCR3主要表达于CD4+T，比较同一患者外周血CXCR3+CD4+T含量，证实多标和流式具有良好的一致性。
实施例5：CXCR3的表达与吉西他滨化疗预后
免疫组化实验试剂：
1.CXCR3多克隆抗体(自行制备或购买商业化抗体)；
2.辣根过氧化物酶标记兔IgG抗体(购自DAKO公司，丹麦)
3.其他免疫组化试剂：
二甲苯、乙醇、3％H2O2甲醇液、抗原修复液、封闭液、DAB显色试剂、甲基绿、0.01MPBS、中性树脂、苏木精-伊红等。
具体实验步骤：
1.组织芯片的构建：
75例原发性肝内胆管癌癌组织样本和配对的癌旁正常组织样本随机取自于2011年11月17日至2013年7月22日在第二军医大学东方肝胆外科医院接受切除手术的肝内胆管癌病人。书面知情同意书均于术前获得。所有病人术后病理均证实为肝内胆管癌。首先对上述75例ICC病人的每一个供体蜡块进行切片和苏木素-伊红(HE)染色。显微镜下对所需穿取的目标组织进行定位，分别选取有代表性的癌组织各3个位点，利用组织芯片制作仪依次从供体蜡块上穿取直径为1mm的组织芯，插入有240个点阵的受体蜡块中，以4μm的厚度连续切片，所得的组织芯片的每个点都经过病理诊断。
2.免疫组化(DAB法)步骤：
-20℃取组织块，石蜡包埋，切片
↓
石蜡切片60℃烤箱过夜
↓
切片脱腊、水合
(二甲苯①10分钟→二甲苯②10分钟→二甲苯③10分钟→100％乙醇5分钟→95％乙醇5分→85％乙醇5分钟→75％乙醇5分钟→双蒸水5分钟)
↓
3％H2O2甲醇液，室温放置20分钟，去除内源性过氧化物酶
↓
双蒸水洗5分钟×3次
↓
抗原修复
(切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液中煮沸5分钟，停火10分钟，再煮沸5分钟)
↓
自然冷却至室温，双蒸水洗5分钟×3次
↓
1％BSA封闭30分钟，37℃
↓
甩去封闭液，不洗，直接加一抗，置入湿盒中30分钟，37℃，后4℃冰箱过夜
↓
4℃取出，室温下复温15分钟，0.01M PBS洗5分钟×4次
↓
滴加DAKO二抗(抗兔)，湿盒中45分钟，37℃
↓
0.01M PBS洗5分钟×4次，DAB显色2-10分钟，镜下观察
↓
双蒸水终止显色，0.01M PBS洗5分钟×1次
↓
苏木精-伊红或甲基绿复染2分钟，无水乙醇脱色5-10秒
↓
二甲苯脱水透明，滴中性树脂后盖玻片覆盖封片
↓
显微镜下观察阳性染色
3.免疫组化结果判定方法：
组织芯片免疫组织化学评分方法：
采用Image Scope(Aperio公司)软件对整张组织芯片进行扫描，扫描后采用该软件的Algorithms(Positive Pixel Count)程序对每个芯片点进行“阳性Pixel”计算，每个组织芯片点的组化评分计算方法为Log10[255/Iavg]，其中Iavg为平均强度，计算方法：
平均强度＝(弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度)/(弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量)。
CXCR3高低表达标准以75例肝癌组织中CXCR3表达评分的中位数(0.25)为界，高于0.25为高表达，等于或低于0.25为低表达。
图11显示了较典型的三例样本中CXCR3的染色情况。
结合CXCR3表达水平，预测吉西他滨治疗ICC患者的预后。发现肿瘤样本中CXCR3表达水平较高的患者明显具有更好的预后。生存率分析结果表明，CXCR3高表达的患者，相应的总生存率OS和无复发生存率RFS均较高，CXCR3表达量与OS(HR＝0.27，P＝0.001)和RFS(HR＝0.36，P＝0.035)显著相关(图12和图13)。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种评估肝内胆管细胞癌吉西他滨化疗敏感性和/或预后的标志物，其特征在于，所述标志物为肝内胆管癌患者外周血白细胞或胆管癌组织中免疫细胞表面所表达的CXCR3。
2.如权利要求1所述的评估肝内胆管细胞癌吉西他滨化疗敏感性和/或预后的标志物在制备评估肝内胆管癌对吉西他滨化疗敏感性及预后的试剂或试剂盒中的应用。
3.一种评估肝内胆管细胞癌吉西他滨化疗敏感性和/或预后的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括CXCR3蛋白表达量的检测相关试剂。
4.如权利要求3所述的评估肝内胆管细胞癌吉西他滨化疗敏感性和/或预后的试剂盒，其特征在于，检测肝内胆管癌患者外周血白细胞或胆管癌组织中免疫细胞表面所表达的CXCR3。
5.如权利要求3所述的评估肝内胆管细胞癌吉西他滨化疗敏感性和/或预后试剂盒，其特征在于，包括免疫组化试剂。
6.如权利要求3所述的评估肝内胆管细胞癌吉西他滨化疗敏感性和/或预后试剂盒，其特征在于，包括外周血白细胞提取试剂。
7.如权利要求3所述的评估肝内胆管细胞癌吉西他滨化疗敏感性和/或预后试剂盒，其特征在于，包括与CXCR3蛋白表达量相关的阈值。
8.一种评估肝内胆管癌吉西他滨化疗敏感性和/或预后的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)检测肝内胆管癌患者外周血白细胞或胆管癌组织中免疫细胞表面CXCR3的表达量；
2)与预先设定的CXCR3蛋白表达量阈值做比较，高于阈值评定为患者对吉西他滨化疗敏感和/或吉西他滨化疗治疗预后良好，否则评定为对吉西他滨化疗不敏感和/或吉西他滨化疗治疗预后不佳。
9.如权利要求8所述的评估肝内胆管癌吉西他滨化疗敏感性和/或预后的方法，其特征在于，步骤1)包括以下具体操作流程：
A)从新鲜的外周血中分离出白细胞；
B)对白细胞进行CyTOF分析。
10.如权利要求8所述的评估肝内胆管癌吉西他滨化疗敏感性和/或预后的方法，其特征在于，步骤1)包括以下具体操作流程：
a)利用免疫组化试剂对胆管癌组织切片进行免疫组化染色；
b)利用显微镜和成像装置拍摄为数码照片；
c)利用生物图像处理软件分析染色阳性信号强度，给出评分。
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