CN109557310B - 一种判断癌症预后的标志物及其应用 - Google Patents
一种判断癌症预后的标志物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109557310B CN109557310B CN201811234458.8A CN201811234458A CN109557310B CN 109557310 B CN109557310 B CN 109557310B CN 201811234458 A CN201811234458 A CN 201811234458A CN 109557310 B CN109557310 B CN 109557310B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cancer
- nudt5
- expression
- protein
- mth1
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明涉及一种判断癌症预后的标志物及其应用,属于医学生物技术和医学检验技术领域。MutT相关蛋白作为癌症患者预后的生物标志物的应用。本发明的MutT相关蛋白可以有效区分癌症病人术后生存期,从而为癌症预后诊断提供了新途径,为临床医生对于癌症病情分析提供了参考依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种判断癌症预后的标志物及其应用,属于医学生物技术和医学检验技术领域。
背景技术
MTH1(MutT homolog 1)又称为NUDT1(nudix hydrolase 1),MTH2(MutT homolog2)又称为NUDT15(nudix hydrolase 15),MTH3(MutT homolog 3)又称为NUDT18 (nudixhydrolase 18),NUDT5(nudix hydrolase 5),这四种蛋白均属于哺乳动物Nudix水解酶超家族。这些蛋白与大肠杆菌MutT蛋白具有结构和功能上相似性,又被称为MutT相关蛋白。
在本发明中,我们检测多种肿瘤的癌组织和癌旁组织中MutT相关蛋白—— MTH1,MTH2,MTH3,NUDT5的表达,分析这几种蛋白表达量与临床病理资料(如性别、年龄、位置、肿瘤大小、临床分期、分化程度等)之间的相关性,探究这些蛋白对癌症患者的总体生存预后判断价值。
发明内容
本发明是基于本发明人的以下发现作出的:
无论在正常代谢活动中还是在外源性刺激下,细胞会产生大量的ROS,可以损伤DNA,RNA和游离核苷酸。鸟嘌呤因具有最低氧化电势,其氧化产物8-oxoG 是细胞内含量最丰富的氧化碱基。含有8-oxoG的核苷酸可以掺入DNA或RNA中,由于8-oxoG以同等效率与A和C配对,故引起复制水平和转录水平错配。
在大肠杆菌(E.coli)中发现的MutT蛋白具有水解8-oxodGTP和8-oxoGTP 为单磷酸的能力。哺乳动物细胞中拥有更为精密的参与核苷酸前体池中氧化核苷酸的清除机制,在哺乳动物细胞中发现的MTH1,MTH2,NUDT5和MTH3等均为MutT 的同源蛋白。这些蛋白的底物特异性存在差异,MTH1可以降解8-oxodGTP和 8-oxoGTP,但是不能作用于8-oxodGDP和8-oxoGDP;MTH2可以降解8-oxodGTP, 8-oxoGTP,8-oxodGDP和8-oxoGDP,但是活性很弱;MTH3可以降解8-oxodGDP和 8-oxoGDP,但是不能作用于8-oxodGTP和8-oxoGTP;NUDT5除了具有水解 8-oxo-dGDP的活性以外,还拥有更广的底物特异性,它还能水解8-oxo-dADP、 2-oxo-dADP、5-CH0-dUDP。
我们首次发现MTH2,MTH3和NUDT5蛋白在CRC组织中表达量增高,并与CRC 进展和预后有关。
MTHl,MTH2,MTH3和NUDT5蛋白表达量与结直肠癌AJCC分期和淋巴结转移有关。MTH1,MTH2,NUDT5高表达组的CRC患者进行手术治疗后总的生存率更低,这四种蛋白均高表达的患者术后生存率最差。因此,MutT相关蛋白可以作为判断结直肠癌患者预后的新型标志物。同时,多因素分析表明NUDT5蛋白是影响CRC 患者预后的独立因素。
本发明的一个方面,提供MutT相关蛋白作为癌症患者预后的生物标志物的应用,所述癌症为结直肠癌、胃癌、食管癌、肝癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌。
所述MutT相关蛋白为MTH1蛋白、MTH2蛋白,MTH3蛋白和NUDT5蛋白中的一种或几种。
优选的,所述MutT相关蛋白为MTH2蛋白,MTH3蛋白和NUDT5蛋白中的一种或几种。
上述任一种蛋白的表达量均能用于检测癌症的存在,优选测定多种蛋白的表达量。
本发明的第二个方面,提供MutT相关蛋白在制备检测、预测或诊断癌症的进展和/或预后产品中的应用,所述癌症为结直肠癌、胃癌、食管癌、肝癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌。
所述的产品是指诊断或预测癌症转移、癌症临床分期、癌症患者预后的产品。所述产品包括但不限于化学试剂、生物试剂、诊断试剂盒、胶体金试纸、蛋白质芯片、单克隆抗体、多克隆抗体等。
所述MutT相关蛋白为MTH1蛋白、MTH2蛋白,MTH3蛋白和NUDT5蛋白中的一种或几种。
所述MutT相关蛋白为MTH2蛋白,MTH3蛋白和NUDT5蛋白中的一种或几种。
作为检验主体的“个体”可以是任何的人类或非人类哺乳动物。非人类哺乳动物包括灵长类、家畜动物(例如马、牛、羊、猪)、实验室试验动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)、伴侣动物(例如犬、猫)和圈养野生动物(例如鹿)。
优选地,哺乳动物是人。
本发明的检测产品以及使用这些产品的检测方法,可以对任何适合的生物样品进行。为此目的,样品可以是生物材料的任何样品,其源自动物,如但不限于细胞材料、生物流体(例如血液)、粪便、组织活组织检查标本、手术标本或已经导入动物身体中并且随后取出的流体(例如,从灌肠洗液抽回的溶液)。根据本发明方法检验的样品可以直接进行检验或可能在检验之前需要某种形式的处理。例如,活组织检查样品或手术样品可能在检验之前需要匀浆或它可能需要切片用于原位检验各个基因的定性表达水平。另外,如果生物样品不处于液体形式,可能需要添加试剂,如缓冲液,以便使样品移动。
本发明的第三个方面,提供了一种人癌症的新型生物标志物MutT相关蛋白用于制备诊断、预测、检测或筛查人癌症的制剂;特别是用于制备诊断、预测、检测或筛查人癌症的试剂盒。本发明的癌症蛋白质标志物MutT相关蛋白还可以用于制备诊断、预测、检测或筛查人结直肠癌、胃癌、食管癌、肝癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌的癌细胞扩散、淋巴结转移、临床分期、患者预后的制剂;特别是用于制备诊断、预测、检测或筛查人结直肠、癌癌细胞扩散、结直肠癌淋已结转移、结直肠癌临床分期、结直肠癌患者预后的诊断试剂。
一种检测癌症的进展/和或预后的试剂盒,所述的试剂盒中含有检测MutT相关蛋白表达量的试剂。
所述MutT相关蛋白为MTH1蛋白、MTH2蛋白、MTH3蛋白和NUDT5蛋白中的一种或多种。其中任意一种蛋白的表达量均可以用于诊断人结直肠癌、胃癌、食管癌、肝癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌的的存在。
所述MutT相关蛋白为MTH1蛋白、MTH2蛋白和NUDT5蛋白。该组蛋白的表达量可用于预测癌症的预后。所述癌症包括但不限于结直肠癌、胃癌、食管癌、肝癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌。
所述MutT相关蛋白为MTH1蛋白、MTH2蛋白、MTH3蛋白和NUDT5。该组蛋白的表达量可用于预测癌症的预后,所述癌症包括但不限于结直肠癌、胃癌、食管癌、肝癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌的
所述试剂为抗体,选自单克隆抗体和/或多克隆抗体。所述蛋白抗体可以是商业来源的抗体或依照本领域常规操作制备得到的相应蛋白的抗体。
有益效果:本发明的MutT相关蛋白可以有效区分癌症病人术后生存期,从而为癌症预后诊断提供了新途径,为临床医生对于癌症病情分析提供了参考依据。本发明产品和使用该产品的检测方法可以用于疾病风险的诊断、预后、分类、预测、检测疾病复发、选择疗法和疗程监测。
下面结合附图和具体实施方式进一步详细说明,以使本发明公开的各个方面及其优势显而易见,从而更容易被理解,并非对本发明的限制。凡依照本公开内容进行的本领域的等同替换,均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1为结直肠癌组织和配对癌旁组织中MutT相关蛋白的表达,图1A是6对 结直肠癌组织和配对癌旁组织中4种MutT相关蛋白表达的代表性Western blotting条带,图1B-图1E是分别为20对结直肠癌组织和配对癌旁组织中MTH1、 MTH2、MTH3和NUDT5蛋白表达的定量结果,统计方法为Student’s t-test。
图2为结直肠癌组织和配对癌旁组织中MutT相关蛋白免疫组化代表图;图 A-D分别代表正常癌旁组织中MTH1、MTH2、MTH3、NUDT5蛋白的表达,E-H分别代表结直肠癌组织中MTH1、MTH2、MTH3、NUDT5蛋白的低表达I-L分别代表结直肠癌组织中MTH1、MTH2、MTH3、NUDT5蛋白的高表达。
图3为Kaplan-Meier生存曲线;图3A是MTH1蛋白表达量高低与结直肠癌患者预后的生存曲线,图3B是MTH2蛋白表达量高低与结直肠癌患者预后的生存曲线,图3C是MTH3蛋白表达量高低与结直肠癌患者预后的生存曲线,图3D是 NUDT5蛋白表达量高低与结直肠癌患者预后的生存曲线,图3E是联合四种蛋白表达量高低与结直肠癌患者预后的生存曲线。
图4为实施例2中乳腺癌组织和配对癌旁组织中NUDT5表达量结果。A-C 分别代表正常癌旁组织中NUDT5蛋白的表达,D代表乳腺癌组织中NUDT5蛋白的低表达,E代表乳腺癌组织中NUDT5蛋白的中等表达,F代表乳腺癌组织中NUDT5 蛋白的高表达,G为30对乳腺癌组织和配对癌旁组织中NUDT5蛋白表达的定量结果,统计方法为Student’s t-test。
图5为实施例2中NUDT5表达对乳腺癌患者预后影响结果。图5A代表乳腺癌组织中NUDT5蛋白阴性对照(上)、低表达(中)和高表达(下);图5B为 140例乳腺癌组织中NUDT5蛋白表达的定量结果分布图;图5C为NUDT5蛋白表达量高低与乳腺癌患者预后的Kaplan-Meier生存曲线。
图6A 23对人肺癌组织和配对癌旁正常组织中MTH1和NUDT5蛋白表达。图 6B肺癌组织中MTH1和NUDT5两种蛋白表达均显著高于正常组织(Student’s t-test)
图7肺鳞癌及肺腺癌组织芯片中癌和癌旁MTH1、NUDT5蛋白表达,癌旁正常组织这两种蛋白免疫染色弱,癌组织这两种蛋白染色程度不同,有弱,中,强,图示中、强两组代表。
图8A肺癌组织中高表达MTH1组生存率更低,图8B肺癌组织中高表达NUDT5 组生存率更低
图9是实施例5的食管鳞癌组织中MutT相关蛋白表达量增加结果。(A-D) 相邻的正常组织及肿瘤组织中MTH1表达情况。A,C为相邻的正常组织,B,D为肿瘤组织。(E-H)相邻的正常组织及肿瘤组织中NUDT5的表达情况。E,G为相邻的正常组织,F,H为肿瘤组织。
图10为食管鳞癌患者总生存率Kaplan-Meier曲线。通过TMA免疫组织化学染色来评估MTH1(A),NUDT5(B)表达与食管鳞癌患者的总生存率间相关性,评估食管鳞癌患者MTH1,NUDT5蛋白与总生存期间关系。
图11为MTH1和NUDT5敲除后,细胞增殖减慢的结果。图11A为蛋白印迹检测敲低组合对照组中MTH1和NUDT5表达情况。图11B为通过CCK-8测定检测敲低MTH1,NUDT5蛋白对细胞增殖的影响。P值由Student-t检验计算,*P<0.05。
图12A和图12B分别为Transwell检测MTH1和NUDT5敲减对细胞侵袭,迁移能力影响。图12C、图12D为Transwell细胞计数统计结果。
图13A:蛋白印迹检测MTH1和NUDT5敲除后,细胞EMT标志分子。图13B:蛋白印迹检测MTH1和NUDT5敲除后,EMT相关信号通路分子。
具体实施方式
除非另外限定,否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1
一.材料与方法
1.实验材料
(1)44对结直肠癌组织与对应的癌旁正常组织(佳木斯大学附属第一医院提供)
(2)结肠癌组织芯片——87例癌组织和对应的癌旁正常组织(上海芯超生物科技有限公司)病人在结直肠癌根治术前未经过放疗和化疗
(3)抗-MTH1抗体(Abcam)、抗-MTH3抗体(Abcam)、抗-NUDT5抗体 (Abcam),抗-MTH2抗体(Abclonal)、抗-GAPDH抗体(Abcam)
2.实验方法
(1)通过Western Blotting检测44对结直肠癌组织与对应的癌旁正常组织中MTH1、MTH2、MTH3、NUDT5的表达量,分析这几种蛋白表达量与临床病理资料(如性别、年龄、位置、肿瘤大小、临床分期、分化程度等)之间的相关性。具体步骤如下:
①液氮研磨组织后加入RIPA裂解液(北京索莱宝科技有限公司),其中RIPA 裂解液中含有1X PMSF(索莱宝)和1X蛋白酶和磷酸酶抑制剂(CST, USA),冰上放置30min,4℃12000g离心20min,取上清转移到新的 1.5mlEP管中。
②BCA法(Thermo fisher,USA)测定总蛋白浓度。
③12%SDS-PAGE电泳,检测GAPDH表达的上样量为10ug,检测MTH1 和NUDT5表达的上样量为20ug,检测MTH2和MTH3表达的上样量为 40ug。
④转膜,将PAGE中的蛋白电转移到PVDF膜上(Millipore,USA)。
⑤免疫封闭,使用5%脱脂牛奶封闭2h。
⑥一抗孵育,抗-MTH1抗体、抗-MTH3抗体、抗-NUDT5抗体和抗-MTH2 抗体的稀释比例为1∶1000,抗-GAPDH抗体稀释比例为1∶2000,4℃过夜,TBST洗5次,每次5min。
⑦二抗孵育,山羊抗兔IgG-HRP(碧云天生物技术有限公司,1∶2000)或山羊抗鼠IgG-HRP(碧云天,1∶2000),室温孵育2h,TBST洗5次,每次 5min。
⑧曝光,将显示液(Millipore,USA)1∶1混合后均匀滴加到条带上,进行曝光显色。
⑨使用Image J对结果进行定量,使用Student’s t-test对结直肠癌组织和癌旁组织中这四种蛋白的表达进行统计学分析。
(2)通过免疫组化检测87例癌组织和对应的癌旁正常组织(组织芯片)中 MTH1、MTH2、MTH3、NUDT5的表达量,根据染色的程度和染色面积,将癌组织分为高表达组和低表达组,分析这几种蛋白表达量与临床病理资料(如性别、年龄、位置、肿瘤大小、临床分期、分化程度等)之间的相关性,探究这些蛋白对结直肠癌根治术后患者的总体生存预后判断价值。具体步骤如下:
①组织芯片使用二甲苯脱蜡2d,100%、95%、85%、75%乙醇梯度水化各 2min,PBS水化10min。
②抗原修复(pH6.0柠檬酸修复液)微波修复30min,冷却至室温。
③山羊血清(北京中衫金桥生物科技有限公司)封闭30min。
④一抗孵育,抗-MTH1抗体、抗-MTH2抗体、抗-MTH3抗体和抗-NUDT5 抗体的稀释比例分别为1∶300、1∶100、1∶500和1∶1000,4℃过夜, PBS洗5min X 3次。
⑤二抗孵育,使用PV-6001山羊抗兔IgG/HRP聚合物或PV-6002山羊抗鼠 IgG/HRP聚合物(中衫金桥),室温孵育20分钟,PBS洗5minX 3次。
⑥DAB(中衫金桥)显色
⑦苏木素复染、梯度脱水、透明封片。
3.组织芯片中MutT相关蛋白表达高低评分标准:
(1)染色强度:0(无);1(弱);2(中);3(强)
(2)染色面积:0(0%);1(1-25%);2(26-50%);3(51-75%);4(76-100%);
(3)最终得分是染色强度X染色面积:低表达(0-6);高表达(7-12)
4.统计方法
软件SPSS statistics version 19.
(1)Student's t-test比较两组均值;
(2)Pearson’X2或者Fisher's exact test比较MutT相关蛋白与CRC临床病理资料相关性;
(3)Kaplan-Meier analysis计算总的生存率(OS),the log-rank test比较两组OS;
(4)Cox proportional hazards models明确CRC临床病理参数和MutT相关蛋白表达对CRC病人生存率和预后的影响,所有参数先进行单因素分析,具有显著意义的参数再进行多因素分析。
二.实验结果
1.结直肠癌组织中MutT相关蛋白表达量增加
(1)我们首先进行Western blotting检测人结直肠癌组织和配对癌旁正常组织中MTH1,MTH2,MTH3和NUDT5蛋白表达,结果表明癌组织中这四种蛋白表达均显著高于正常组织(Student's t-test,P<0.001,图1)。
(2)我们然后进行免疫组化检测组织芯片(87对人结直肠癌组织和配对癌旁组织)中MTH1,MTH2,MTH3和NUDT5蛋白表达,再次证明癌组织中这四种蛋白表达上调(图2)。癌旁正常组织这四种蛋白免疫染色很弱,癌组织这四种蛋白染色程度不同,有弱,中,强。根据癌组织免疫染色的强度和范围,87个癌组织中MTH1,MTH2,MTH3和NUDT5蛋白高表达分别有54,49,45和42 个。
2.MutT相关蛋白表达与结直肠癌临床病理参数的相关性
(1)根据MTH1,MTH2,MTH3和NUDT5蛋白免疫组化染色结果,分别将组织芯片中87个人结直肠癌组织分为高表达组和低表达组,应用Pearson'X2 or Fisher's exact test分析这些蛋白表达与年龄,性别,位置,肿瘤大小,AJCC分期,T分期,N分期,M分期,分化程度,脉管转移的相关性,结果表明这些蛋白表达量与AJCC分期和N分期(淋巴结转移)显著相关(P<0.05,表1)。
表1.MutT相关蛋白表达与结直肠癌临床病理参数的相关性(免疫组化,n=87)
aChi-square test
bFisher's exact test
*P<0.05
(2)Western blotting检测44例人结直肠组织中MTH1,MTH2,MTH3和 NUDT5蛋白的相对表达,应用Student's t-test分析这些蛋白表达与CRC临床病理相关性,结果表明这些蛋白表达量与AJCC分期,T分期(肿瘤浸润程度)和 N分期(淋巴结转移)显著相关(P<0.05,表2)。
表2.MutT相关蛋白表达与结直肠癌临床病理参数的相关性(Western Blotting,n=44)
*P<0.05
3.MutT相关蛋白表达对结直肠癌患者预后影响
(1)根据MTH1,MTH2,MTH3和NUDT5蛋白免疫组化染色结果,分别将组织芯片中87个人结直肠癌组织分为高表达组和低表达组,应用Kaplan-Meier analysis计算CRC患者进行手术治疗后总的生存率(OS),同时使用log-rank test 比较高表达组和低表达组的OS,结果表明MTH1、MTH2、NUDT5高表达组生存率更低(P=0.005,0.021,0.003),MTH3高表达组和低表达组生存率无显著性差异(P=0.089)。另外,考虑到癌组织中这四种蛋白共表达,将87个癌组织分为三组:第一组,四种蛋白均低表达;第二组,一种或二种或三种蛋白高表达;第三组,四种蛋白均高表达。第三组生存率最低,其次是第二组(P=0.005)。(图 3A-图3E)
(2)如表3所示,应用Cox proportional hazards model对CRC临床病理资料和MTH1,MTH2,MTH3和NUDT5蛋白水平进行单因素分析,结果表明以下因素影响CRC病人的生存率:AJCC分期(P<0.001),N分期(P=0.001), M分期(P=0.006),分化程度(P=0.003),MTH1表达量(P=0.008),MTH2 表达量(P=0.026),NUDT5表达量(P=0.005)。然后,进行多因素分析发现NUDT5 表达量是影响CRC患者预后的独立因素(HR 2.282;95%CI 1.152-4.517, P=0.018)。
三.结论
本研究,我们首次发现MTH2,MTH3和NUDT5蛋白在CRC组织中表达量增高,并与CRC进展和预后有关。
MTH1,MTH2,MTH3和NUDT5蛋白表达量与结直肠癌AJCC分期和淋巴结转移有关。MTH1,MTH2,NUDT5高表达组的CRC患者进行手术治疗后总的生存率更低,这四种蛋白均高表达的患者术后生存率最差。因此,MutT相关蛋白可以作为判断结直肠癌患者预后的新型标志物。同时,多因素分析表明NUDT5蛋白是影响CRC 患者预后的独立因素。
表3.Cox单因素分析和多因素分析
*P<0.05
实施例2
一.材料与方法
1.实验材料
(1)乳腺癌组织芯片——30例癌组织和对应的癌旁正常组织(上海芯超生物科技有限公司)病人在结直肠癌根治术前未经过放疗和化疗
(2)乳腺癌组织芯片——140例癌组织和对应的癌旁正常组织(上海芯超生物科技有限公司)病人在结直肠癌根治术前未经过放疗和化疗
(3)抗-NUDT5抗体(Abcam)
2.实验方法
通过免疫组化检测30例癌组织及对应的癌旁正常组织和140例癌组织(组织芯片)中NUDT5的表达量,根据染色的程度和染色面积,将癌组织分为高表达组和低表达组,分析这几种蛋白表达量与临床病理资料(如性别、年龄、位置、肿瘤大小、临床分期、分化程度等)之间的相关性,探究这些蛋白对乳腺癌根治术后患者的总体生存预后判断价值。具体步骤如下:
⑧组织芯片使用二甲苯脱蜡2d,100%、95%、85%、75%乙醇梯度水化各 2min,PBS水化10min。
⑨抗原修复(pH6.0柠檬酸修复液)微波修复45min,冷却至室温。
⑩山羊血清(北京中衫金桥生物科技有限公司)封闭30min。
3.组织芯片中MutT相关蛋白表达高低评分标准:
(1)染色强度:0(无);1(弱);2(中);3(强)
(2)染色面积:0(0%);1(1-25%);2(26-50%);3(51-75%);4(76-100%);
(3)最终得分是染色强度X染色面积:低表达(0-6);高表达(7-12)
4.统计方法
软件SPSS statistics version 22.
(1)Student's t-test比较两组均值;
(2)Pearson’X2比较NUDT5与乳腺癌临床病理资料相关性;
(3)Kaplan-Meier analysis计算总的生存率(OS),the log-rank test比较两组OS;
(4)Cox proportional hazards models明确乳腺癌患者临床病理参数和 NUDT5对乳腺癌患者生存率和预后的影响,所有参数先进行单因素分析,具有显著意义的参数再进行多因素分析。
二.实验结果
1.乳腺癌组织中NUDT5表达量增加
(1)我们进行免疫组化检测组织芯片(30对人乳腺癌组织和配对癌旁组织) 中NUDT5蛋白表达,证明癌组织中这蛋白表达上调(图4)。癌旁正常组织蛋白免疫染色很弱,癌组织蛋白染色程度不同,有弱,中,强。根据癌组织免疫染色的强度和范围,30个癌组织中NUDT5蛋白高表达分别有23个;结果表明癌组织中表达显著高于正常组织。
2.NUDT5与乳腺癌临床病理参数的相关性
(1)根据NUDT5蛋白免疫组化染色结果,分别将组织芯片中140个人乳腺癌组织分为高表达组和低表达组,应用Pearson'X2分析这些蛋白表达与年龄,性别,位置,肿瘤大小,AJCC分期,T分期,N分期,M分期,分化程度,脉管转移等的相关性,结果表明NUDT5表达量与年龄、AJCC分期、淋巴结转移、病情复发和ER受体表达显著相关,P<0.05,表4。
表4.NUDT5表达与乳腺癌临床病理参数的相关性(免疫组化,n=140)
3.NUDT5表达对乳腺癌患者预后影响
(1)根据NUDT5蛋白免疫组化染色结果,分别将组织芯片中140个人乳腺癌组织分为高表达组和低表达组,应用Kaplan-Meier analysis计算乳腺癌患者进行手术治疗后总的生存率(OS),同时使用log-rank test比较高表达组和低表达组的OS,结果表明NUDT5高表达组生存率更低(P<0.0001)。(图5)
(2)如表5所示,应用Cox proportional hazards model对乳腺癌临床病理资料和NUDT5蛋白水平进行单因素分析,结果表明以下因素影响乳腺癌病人的生存率:NUDT5表达(P<0.0001=、AJCC分期(P=0.0005)、淋巴结转移(P=0.0043)、病情复发(P<0.0001=、P53基因突变(P=0.0232)和ER受体(P=0.0012);然后,进行多因素分析发现NUDT5表达量是影响乳腺癌患者预后的危险因素(HR 0.114;95%CI0.021-0.612,P=0.0113)。
三.结论
本研究,我们发现NUDT5蛋白在乳腺组织中表达量增高,并与乳腺癌进展和预后有关。
NUDT5蛋白表达量与结直肠癌AJCC分期、淋巴结转移、病情复发、P53基因突变和ER受体有关。NUDT5高表达组的乳腺癌患者进行手术治疗后总的生存率更低,因此,NUDT5可以作为判断乳腺癌患者预后的新型标志物。同时,多因素分析也表明NUDT5蛋白是影响CRC患者预后的因素之一。
实施例3
一.材料与方法
1.实验材料
(1)44对结直肠癌组织与对应的癌旁正常组织(佳木斯大学附属第一医院提供)
(2)癌组织芯片——胃癌、食管癌、肝癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌癌组织和对应的癌旁正常组织(上海芯超生物科技有限公司)病人在术前未经过放疗和化疗
(3)抗-MTH1抗体(Abcam)、抗-MTH3抗体(Abcam)、抗-NUDT5抗体 (Abcam),抗-MTH2抗体(Abclonal)、抗-GAPDH抗体(Abcam)
2.实验方法
同实施例1。
二.实验结果
1.癌组织中MutT相关蛋白表达量增加
(1)我们首先进行Western blotting检测人胃癌、食管癌、肝癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌癌组织和配对癌旁正常组织中MTH1,MTH2,MTH3和NUDT5 蛋白表达,结果表明癌组织中这四种蛋白表达均显著高于正常组织(Student’s t-test,P<0.001)。
(2)我们然后进行免疫组化检测组织芯片(人癌组织和配对癌旁组织)中 MTH1,MTH2,MTH3和NUDT5蛋白表达,再次证明癌组织中这四种蛋白表达上调。癌旁正常组织这四种蛋白免疫染色很弱,癌组织这四种蛋白染色程度不同,有弱,中,强。
2.MutT相关蛋白表达与结直肠癌临床病理参数的相关性
(1)根据MTH1,MTH2,MTH3和NUDT5蛋白免疫组化染色结果,分别将组织芯片中癌组织分为高表达组和低表达组,应用Pearson’X2 or Fisher’s exact test分析这些蛋白表达与年龄,性别,位置,肿瘤大小,AJCC分期,T分期,N 分期,M分期,分化程度,脉管转移的相关性,结果表明这些蛋白表达量与AJCC 分期和N分期(淋巴结转移)显著相关(P<0.05)。
(2)Western blotting检测44例人结直肠组织中MTH1,MTH2,MTH3和 NUDT5蛋白的相对表达,应用Student’s t-test分析这些蛋白表达与CRC临床病理相关性,结果表明这些蛋白表达量与AJCC分期,T分期(肿瘤浸润程度)和 N分期(淋巴结转移)显著相关(P<0.05)。
3.MutT相关蛋白表达对结直肠癌患者预后影响
(1)根据MTH1,MTH2,MTH3和NUDT5蛋白免疫组化染色结果,分别将组织芯片中人癌组织分为高表达组和低表达组,应用Kaplan-Meier analysis计算CRC患者进行手术治疗后总的生存率(OS),同时使用log-rank test比较高表达组和低表达组的OS,结果表明MTH1、MTH2、NUDT5高表达组生存率更低 (P=0.005,0.021,0.003),MTH3高表达组和低表达组生存率无显著性差异 (P=0.089)。另外,考虑到癌组织中这四种蛋白共表达,将87个癌组织分为三组:第一组,四种蛋白均低表达;第二组,一种或二种或三种蛋白高表达;第三组,四种蛋白均高表达。第三组生存率最低,其次是第二组(P=0.005)。
(2)如表3所示,应用Cox proportional hazards model对CRC临床病理资料和MTH1,MTH2,MTH3和NUDT5蛋白水平进行单因素分析,结果表明以下因素影响CRC病人的生存率:AJCC分期(P<0.001),N分期(P=0.001), M分期(P=0.006),分化程度(P=0.003),MTH1表达量(P=0.008),MTH2 表达量(P=0.026),NUDT5表达量(P=0.005)。然后,进行多因素分析发现NUDT5 表达量是影响癌症患者预后的独立因素。
三.结论
本研究,我们首次发现MTH2,MTH3和NUDT5蛋白在多种癌组织中表达量增高,并与癌症进展和预后有关。
MTH1,MTH2,MTH3和NUDT5蛋白表达量与癌症分期和淋巴结转移有关。 MTH1,MTH2,NUDT5高表达组的癌症患者进行手术治疗后总的生存率更低,这四种蛋白均高表达的患者术后生存率最差。因此,MutT相关蛋白可以作为判断癌症患者预后的新型标志物。同时,多因素分析表明NUDT5蛋白是影响癌症患者预后的独立因素。
实施例4.
一.材料与方法
1.实验材料
(1)肺鳞癌组织芯片——90例癌组织和对应的癌旁正常组织(上海芯超生物科技有限公司)病人在肺鳞癌根治术前未经过放疗和化疗
(2)肺腺癌组织芯片——94例癌组织和对应的癌旁正常组织(上海芯超生物科技有限公司)病人在肺腺癌根治术前未经过放疗和化疗
(3)抗-MTH1抗体(Abcam)、抗-NUDT5抗体(Abcam)、抗-Tublin抗体 (Abcam)
2.实验方法
(1)通过Western Blotting检测23对肺癌组织与对应的癌旁正常组织中 MTH1、NUDT5的表达量,具体步骤如下:
①液氮研磨组织后加入RIPA裂解液(北京索莱宝科技有限公司),其中RIPA 裂解液中含有1X PMSF(索莱宝)和1X蛋白酶和磷酸酶抑制剂(CST,USA),冰上放置30min,4℃12000g离心20min,取上清转移到新的1.5mlEP管中。
②BCA法(Thermo fisher,USA)测定总蛋白浓度。
③12%SDS-PAGE电泳,检测检测MTH1、NUDT5和Tublin表达的上样量为20μg。
④转膜,将PAGE中的蛋白电转移到PVDF膜上(Millipore,USA)。
⑤免疫封闭,使用5%脱脂牛奶封闭2h。
⑥一抗孵育,抗-MTH1抗体、抗-NUDT5抗体和抗-Tublin抗体稀释比例为1∶ 1000,4℃过夜,TBST洗5次,每次5min。
⑦二抗孵育,山羊抗兔IgG-HRP(碧云天生物技术有限公司,1∶2000)或山羊抗鼠IgG-HRP(碧云天,1∶2000),室温孵育2h,TBST洗5次,每次5min。
⑧曝光,将显示液(Millipore,USA)1∶1混合后均匀滴加到条带上,进行曝光显色。
⑨使用Image J对结果进行定量,使用Student's t-test对肺癌组织和癌旁组织中这两种蛋白的表达进行统计学分析。
(2)通过免疫组化检测90例肺鳞癌组织和对应的癌旁正常组织(组织芯片) 及中94例肺腺癌组织和对应的癌旁正常组织(组织芯片)MTH1、NUDT5的表达量,根据染色的程度和染色面积,将癌组织分为高表达组和低表达组,分析这几种蛋白表达量与临床病理资料(如性别、年龄、位置、肿瘤大小、临床分期、分化程度等)之间的相关性,探究这些蛋白对肺癌根治术后患者的总体生存预后判断价值。具体步骤如下:
①组织芯片使用二甲苯脱蜡2d,100%、95%、85%、75%乙醇梯度水化各 2min,PBS水化10min。
②抗原修复(pH6.0柠檬酸修复液)微波修复30min,冷却至室温。
③山羊血清(北京中衫金桥生物科技有限公司)封闭30min。
④一抗孵育,抗-MTH1抗体和抗-NUDT5抗体的稀释比例分别为1∶600、和1∶800,4℃过夜,PBS洗5min X 3次。
⑤二抗孵育,使用PV-6001山羊抗兔IgG/HRP聚合物或PV-6002山羊抗鼠 IgG/HRP聚合物(中衫金桥),室温孵育20分钟,PBS洗5min X 3次。
⑥DAB(中衫金桥)显色
⑦苏木素复染、梯度脱水、透明封片。
3.组织芯片中MutT相关蛋白表达高低评分标准:
(1)染色强度:0(无);1(弱);2(中);3(强)
(2)染色面积:0(0%);1(1-25%);2(26-50%);3(51-75%);4(76-100%);
(3)最终得分是染色强度X染色面积:低表达(0-6);高表达(7-12)
4.统计方法
软件SPSS statistics version 19.
(1)Student's t-test比较两组均值;
(2)Pearson’X2或者Fisher's exact test比较MutT相关蛋白与NSCLC临床病理资料相关性;
(3)Kaplan-Meier analysis计算总的生存率(OS),the log-rank test比较两组OS;
(4)Cox proportional hazards models明确NSCLC临床病理参数和MutT相关蛋白表达对NSCLC病人生存率和预后的影响,所有参数先进行单因素分析,具有显著意义的参数再进行多因素分析。
二.实验结果
1.肺癌组织中MutT相关蛋白表达量增加
(1)我们首先进行Western blotting检测23对人肺癌组织和配对癌旁正常组织中MTH1和NUDT5蛋白表达,结果表明癌组织中这两种蛋白表达均显著高于正常组织(Student's t-test,图6)。
(2)我们然后进行免疫组化检测组织芯片(90对人肺鳞癌组织和配对癌旁组织)及94对人肺腺癌组织和配对癌旁组织)中MTH1和NUDT5蛋白表达(图 7)。癌旁正常组织这四种蛋白免疫染色很弱,癌组织这四种蛋白染色程度不同,有弱,中,强。根据癌组织免疫染色的强度和范围,184个癌组织中MTH1和 NUDT5蛋白高表达分别有93和85个。
2.MutT相关蛋白表达与肺癌临床病理参数的相关性
根据MTH1和NUDT5蛋白免疫组化染色结果,分别将组织芯片中184个人肺癌组织分为高表达组和低表达组,应用Pearson'X2 or Fisher's exact test分析这些蛋白表达与年龄,性别,位置,肿瘤大小,AJCC分期,T分期,N分期,M 分期,分化程度,脉管转移,EGFR的相关性,结果表明这些蛋白表达量与AJCC 分期和N分期(淋巴结转移)显著相关(P<0.05,表6。)
3.MutT相关蛋白表达对结直肠癌患者预后影响
(1)根据MTH1和NUDT5蛋白免疫组化染色结果,分别将组织芯片中184 个人肺癌组织分为高表达组和低表达组,应用Kaplan-Meier analysis计算NSCLC 患者进行手术治疗后总的生存率(OS),同时使用log-rank test比较高表达组和低表达组的OS,结果表明MTH1、NUDT5高表达组生存率更低(P=0.006, P=0.000029)。(图8)
(2)如表7所示,应用Cox proportional hazards model对NSCLC临床病理资料和MTH1和NUDT5蛋白水平进行单因素分析,结果表明以下因素影响 NSCLC病人的生存率:病理分型(P<0.000),AJCC分期(P<0.000),N分期(P<0.000),MTH1表达量(P=0.005),NUDT5表达量(P<0.000)。然后,进行多因素分析发现NUDT5表达量(HR 1.582;95%CI 1.011-2.476,P=0.045)、病理分型是影响NSCLC患者预后的因素。
表6.MTH1及NUDT5蛋白表达与肺癌临床病理参数相关性(免疫组化,n=184)
*P≤0.05
表7.Cox单因素分析和多因素分析
三.结论
本研究我们首次发现和NUDT5蛋白在NSCL组织中表达量增高,并与 NSCLC进展和预后有关。
MTH1和NUDT5蛋白表达量与肺癌AJCC分期和淋巴结转移有关。MTH1, NUDT5高表达组的NSCLC患者进行手术治疗后总的生存率更低。因此,MutT 相关蛋白可以作为判断肺癌患者预后的新型标志物。同时,多因素分析表明NUDT5蛋白是影响NSCLC患者预后的因素。
实施例5
一.材料与方法
1.实验材料
(1)食管鳞癌组织芯片——95例癌组织和对应的癌旁正常组织(上海芯超生物科技有限公司)病人在食管鳞癌根治术前未经过放疗和化疗
(2)抗-MTH1抗体(Abcam)、抗-NUDT5抗体(Abcam),抗-Tubullin抗体(Abcam)
2.实验方法
(1)通过Western Blotting检测6种食管鳞癌细胞系种MTH1、NUDT5的表达量,并进一步检测其对细胞稳定性的影响。具体步骤如下:
①收集细胞加入RIPA裂解液(北京索莱宝科技有限公司),其中RIPA裂解液中含有1X PMSF(索莱宝)和1X蛋白酶和磷酸酶抑制剂(CST,USA),冰上放置30min,4℃12000g离心20min,取上清转移到新的1.5mlEP管中。
②BCA法(Thermo fisher,USA)测定总蛋白浓度。
③12%SDS-PAGE电泳,检测MTH1和NUDT5表达的上样量为20ug。
④转膜,将PAGE中的蛋白电转移到PVDF膜上(Millipore,USA)。
⑤免疫封闭,使用5%脱脂牛奶封闭2h。
⑥一抗孵育,抗-MTH1抗体、抗-NUDT5抗体的释比例为1∶1000,抗-GAPDH 抗体稀释比例为1∶2000,4℃过夜,TBST洗5次,每次5min。
⑦二抗孵育,山羊抗兔IgG-HRP(碧云天生物技术有限公司,1∶2000)或山羊抗鼠IgG-HRP(碧云天,1∶2000),室温孵育2h,TBST洗5次,每次5min。
⑧曝光,将显示液(Millipore,USA)1∶1混合后均匀滴加到条带上,进行曝光显色。
⑨使用Image J对结果进行定量,使用Student’s t-test对蛋白的表达进行统计学分析。
(2)通过免疫组化检测95例癌组织和对应的癌旁正常组织(组织芯片)中MTH1、NUDT5的表达量,根据染色的程度和染色面积,将癌组织分为高表达组和低表达组,分析这几种蛋白表达量与临床病理资料(如性别、年龄、位置、肿瘤大小、临床分期、分化程度等)之间的相关性,探究这些蛋白对食管鳞癌根治术后患者的总体生存预后判断价值。具体步骤如下:
①组织芯片使用二甲苯脱蜡2d,100%、95%、85%、75%乙醇梯度水化各 2min,PBS水化10min。
②抗原修复(pH6.0柠檬酸修复液)微波修复30min,冷却至室温。
③山羊血清(北京中衫金桥生物科技有限公司)封闭30min。
④一抗孵育,抗-MTH1抗体和抗-NUDT5抗体的稀释比例分别为1∶300和 1∶1000,4℃过夜,PBS洗5min X 3次。
⑤二抗孵育,使用PV-6001山羊抗兔IgG/HRP聚合物或PV-6002山羊抗鼠 IgG/HRP聚合物(中衫金桥),室温孵育20分钟,PBS洗5min X 3次。
⑥DAB(中衫金桥)显色
⑦苏木素复染、梯度脱水、透明封片。
3.组织芯片中MutT相关蛋白表达高低评分标准:
(1)染色强度:0(无);1(弱);2(中);3(强)
(2)染色面积:0(0%);1(1-25%);2(26-50%);3(51-75%);4(76-100%);
(3)最终得分是染色强度X染色面积:低表达(0-6);高表达(7-12)
4.食管鳞癌细胞侵袭迁移能力检测
(1)无基质胶Transwell小室制备
①包被基底膜:用50mg/L Matrigel 1∶8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,4℃风干;
②水化基底膜:吸出培养板中残余液体,每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液,37℃,30min。
(2)有基质胶的Transwell小室制备
Chemicon公司的列说明书要求,将小室放入培养板中,在上室加入300ul 预温的无血清培养基,室温下静置15-30min,使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。
制备细胞悬液:
①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。
②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1-2遍,用含BSA的无血清培养基重悬。
(3)、接种细胞
①取细胞悬液200μl加入Transwell小室,每孔细胞1X105/孔。
②24孔板下室一般加入500μl含20%FBS的培养基。
③培养细胞:常规培养12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。
(4)、结果统计
①用棉签擦去基质胶和上室内的细胞,甲醇固定;
②染色:0.1%结晶紫染色。
③细胞计数:我们使用的是正置显微镜进行观察和拍照。
5.细胞周期检测
①细胞培养:取对数生长期的细胞,按2×105cells/mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内.
②.细胞固定:胰酶消化细胞(不含EDTA),1000rpm离心5min,收集细胞沉淀,弃上清,用预冷PBS洗涤两次,加入预冷75%乙醇,于4℃固定4h以上。
③.细胞染色:1500rpm离心5min,弃上清,以3mL的PBS洗涤一次,加入 400uL溴化乙锭(PI,50ug/mL),100ul RNaseA(100ug/mL),4℃避光孵育30min。
④.流式分析:以标准程序用流式细胞仪检测。
6.统计方法
软件SPSS statistics version 19.
(1)Student’s t-test比较两组均值;
(2)Pearson’X2或者Fisher’s exact test比较MutT相关蛋白与ESCC临床病理资料相关性;
(3)Kaplan-Meier analysis计算总的生存率(OS),the log-rank test比较两组OS;
(4)Cox proportional hazards models明确ESCC临床病理参数和MutT相关蛋白表达对ESCC病人生存率和预后的影响,所有参数先进行单因素分析,具有显著意义的参数再进行多因素分析。
二.实验结果
1.食管鳞癌组织中MutT相关蛋白表达量增加
我们首先进行免疫组化检测95对食管鳞癌组织和配对癌旁组织芯片中 MTH1和NUDT5蛋白表达,结果表明癌组织中蛋白表达均显著高于正常组织,证明癌组织中这四种蛋白表达上调(图9)。癌旁正常组织这四种蛋白免疫染色很弱,癌组织这四种蛋白染色程度不同,有弱,中,强。
图9(A-D)相邻的正常组织及肿瘤组织中MTH1表达情况。A,C为相邻的正常组织,B,D为肿瘤组织。(E-H)相邻的正常组织及肿瘤组织中NUDT5 的表达情况。E,G为相邻的正常组织,F,H为肿瘤组织。
实验结果:免疫组织化学分析配对的食管鳞癌癌样品组成的组织微阵列 (TMA),证实在肿瘤组织中MTH1,NUDT5蛋白过表达,而在MTH1,NUDT5 在相邻的正常组织中表达较弱。肿瘤组织呈现不同程度的阳性染色。
2.MutT相关蛋白表达与食管鳞癌临床病理参数的相关性
(1)根据MTH1和NUDT5蛋白免疫组化染色结果,分别将组织芯片中95 个食管鳞癌组织分为高表达组和低表达组,应用Pearson’X2 or Fisher’s exact test 分析这些蛋白表达与年龄,性别,位置,肿瘤大小,AJCC分期,T分期,N分期,M分期,分化程度,脉管转移的相关性,结果表明MTH1蛋白表达量与AJCC 分期和T分期(淋巴结转移)显著相关,NUDT5蛋白表达量与AJCC分期和N分期(淋巴结转移)显著相关,(P<0.05,表8-1,8-2。)
表8.MutT相关蛋白表达与食管鳞癌临床病理参数的相关性(免疫组化,n=95)
表8-1 MTH1表达量与临床相关因素的关系
表8-2 NUDT5表达量与临床相关因素的关系
MTH1表达与AJCC分期和T分期(Fisher’s检验)呈正相关(P<0.05)。
NUDT5表达与AJCC分期和淋巴结侵犯(Fisher’s检验)呈正相关(P<0.05)。
(2)Cox回归模型分析显示,食管鳞癌低生存期与以下因素显著相关:AJCC 分期(P<0.001或<0.001),T分期(P=0.001),N分期(P=0.002),MTH1 表达(P=0.014)和NUDT5表达(P=0.003)。此外,多变量分析表明,AJCC 分期和NUDT5高表达是食管鳞癌患者生存期的独立和重要预后因素(危险比率 [HR]分别为1.940,1.751;95%置信区间[CI]1.076-3.496,1.056-2.903; P=0.027,0.030)。
表9-1:MTH1分子Cox单因素分析和多因素分析
*P<0.05
表9-2:NUDT5分子Cox单因素分析和多因素分析
*P<0.05
3.MutT相关蛋白表达对食管鳞癌患者生存期的影响
图10为食管鳞癌患者总生存率Kaplan-Meier曲线。通过TMA免疫组织化学染色来评估MTH1(A),NUDT5(B)表达与食管鳞癌患者的总生存率间相关性,评估食管鳞癌患者MTH1,NUDT5蛋白与总生存期间关系。P值通过log-rank检验计算。
结果:高表达MTH1或NUDT5的食管鳞癌患者总生存期低于低表达者。
4.MTH1和NUDT5敲除,细胞稳定性变差,细胞增殖受抑制,细胞增值减慢
图11为MTH1和NUDT5敲除后,细胞增殖减慢的结果。图11A为蛋白印迹检测敲低组合对照组中MTH1和NUDT5表达情况。图11B为通过CCK-8测定检测敲低MTH1,NUDT5蛋白对细胞增殖的影响。P值由Student-t检验计算, *P<0.05。
5.MTH1和NUDT5敲除,细胞侵袭和迁移能力减弱
图12A和图12B分别为Transwell检测MTH1和NUDT5敲减对细胞侵袭,迁移能力影响。图12C、图12D为Transwell细胞计数统计结果。P值由Student-t 检验计算,*P<0.05。
6.MTH1和NUDT5可促进细胞EMT,其可能机制是MEK/ERK信号通路激活实现
图13A:蛋白印迹检测MTH1和NUDT5敲除后,细胞EMT标志分子。图 13B:蛋白印迹检测MTH1和NUDT5敲除后,EMT相关信号通路分子。
三.结论
本研究,我们首次发现MTH1和NUDT5蛋白在ESCC组织中表达量增高,并与ESCC进展和预后有关。
MTH1和NUDT5蛋白表达量与食管鳞癌AJCC分期和T分期,N分期有关。 MTH1,NUDT5高表达组的ESCC者进行手术治疗后总的生存率更低,因此, MutT相关蛋白可以作为判断食管鳞癌患者预后的新型标志物。同时,多因素分析表明NUDT5蛋白是影响ESCC患者预后的独立因素。
MTH1,NUDT5敲除,细胞稳定性明显下降,增值减慢。
MTH1和NUDT5可能通过激活MEK/ERK信号通路实现可促进细胞EMT,从而促进细胞侵袭和迁移。
实施例6.检测癌症进展和预后的试剂盒
一.试剂盒组成
1.抗-MTH1抗体(Abcam)
2.抗-MTH2抗体(Abclonal)
3.抗-MTH3抗体(Abcam)
4.抗-NUDT5抗体(Abcam)
二.使用方法
参见实施例1“通过免疫组化检测87例癌组织和对应的癌旁正常组织(组织芯片)中MTH1、MTH2、MTH3、NUDT5的表达量”或“通过Western Blotting 检测44对结直肠癌组织与对应的癌旁正常组织中MTH1、MTH2、MTH3、NUDT5 的表达量”。
本试剂盒可应用于胃癌、食管癌、肝癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌的预后检测。
实施例7.检测癌症预后的试剂盒
一.试剂盒组成
1.抗-MTH1抗体(Abcam)
2.抗-MTH2抗体(Abclonal)
3.抗-NUDT5抗体(Abcam)
二.使用方法
参见实施例1“通过免疫组化检测87例癌组织和对应的癌旁正常组织(组织芯片)中MTH1、MTH2、MTH3、NUDT5的表达量”或“通过Western Blotting 检测44对结直肠癌组织与对应的癌旁正常组织中MTH1、MTH2、MTH3、NUDT5 的表达量”。
本试剂盒可应用于胃癌、食管癌、肝癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌的预后检测。
Claims (2)
1.MutT相关蛋白在制备癌症预后判断的产品中的应用,其特征在于:NUDT5与乳腺癌预后相关;NUDT5、MTH1与肺癌预后相关;MTH1、NUDT5与食管癌预后相关。
2.根据权利要求1所述的MutT相关蛋白在制备癌症预后判断的产品中的应用,其特征在于:所述产品为单克隆抗体或多克隆抗体。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2017109994001 | 2017-10-23 | ||
CN201710999400 | 2017-10-23 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109557310A CN109557310A (zh) | 2019-04-02 |
CN109557310B true CN109557310B (zh) | 2022-08-16 |
Family
ID=65865188
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811234458.8A Active CN109557310B (zh) | 2017-10-23 | 2018-10-22 | 一种判断癌症预后的标志物及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109557310B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111118187A (zh) * | 2020-02-25 | 2020-05-08 | 福建医科大学 | 一种检测食管鳞癌癌组织与癌旁组织差异菌群的引物组、试剂盒和检测方法 |
CN111579787B (zh) * | 2020-05-27 | 2020-12-08 | 郑州大学第一附属医院 | 一种用于早期食管鳞癌筛查的试纸条 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105021540A (zh) * | 2015-06-24 | 2015-11-04 | 郑州大学 | Mth1体外活性测定方法及其在药物筛选模型建立中的应用 |
-
2018
- 2018-10-22 CN CN201811234458.8A patent/CN109557310B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105021540A (zh) * | 2015-06-24 | 2015-11-04 | 郑州大学 | Mth1体外活性测定方法及其在药物筛选模型建立中的应用 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
Association of MTH1 expression with the tumor malignant potential and poor prognosis in patients with resected lung cancer;Takatoshi Fujishita等;《Lung Cancer》;20170731;第56页结论部分 * |
NUDT expression is predictive of prognosis in patients with clear cell renal cell carcinoma;YUE WANG等;《ONCOLOGY LETTERS》;20170918;第6121页摘要部分 * |
Overexpression of human mutt homologue gene messenger oxidative stress in cancer rna in renal-cell carcinoma: evidence of persistent;Keisei OKAMO等;《International Journal of Cancer》;19960208;第437页摘要部分 * |
Prognostic impact of MutT homolog- 1 expression on esophageal squamous cell carcinoma;Shingo Akiyama等;《Cancer Medicine》;20161205;第258页摘要部分 * |
晚期胃癌组织MTH1表达及临床意义相关分析;杨慧敏等;《中华肿瘤防治杂志》;20160430;第514页讨论部分最后一段 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN109557310A (zh) | 2019-04-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Mota et al. | Molecular characterization of breast cancer cell lines by clinical immunohistochemical markers | |
Murakami et al. | Tenascin C in colorectal cancer stroma is a predictive marker for liver metastasis and is a potent target of miR-198 as identified by microRNA analysis | |
Zhou et al. | Quantification of carbonic anhydrase IX expression in serum and tissue of renal cell carcinoma patients using enzyme-linked immunosorbent assay: prognostic and diagnostic potentials | |
CN108179134B (zh) | 基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片及其制备方法和应用 | |
JP2011526693A (ja) | 転移に関連する徴候および決定因子、ならびにそれらの使用方法 | |
Zhang et al. | Advances in liquid biopsy using circulating tumor cells and circulating cell-free tumor DNA for detection and monitoring of breast cancer | |
Cheng et al. | Enumeration and characterization of circulating tumor cells and its application in advanced gastric cancer | |
CN105861692A (zh) | 研究前列腺癌复发和转移的方法 | |
CN109557310B (zh) | 一种判断癌症预后的标志物及其应用 | |
CN116482347A (zh) | 基于微流控芯片免疫富集CTC基础的泛癌dMMR鉴定试剂盒及其鉴定方法 | |
Zhu et al. | Six stroma-based RNA markers diagnostic for prostate cancer in European-Americans validated at the RNA and protein levels in patients in China | |
Daly et al. | Extracellular vesicles in blood: are they viable as diagnostic and predictive tools in breast cancer? | |
Kusuhara et al. | Low expression of toll-like receptor 4 is associated with poor prognosis in bladder cancer | |
Litviakov et al. | Breast tumour cell subpopulations with expression of the MYC and OCT4 proteins | |
CN108957004B (zh) | 检测H3K9me2和H3K36me3表达量的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用 | |
CN115449555B (zh) | Adgra2作为乳腺癌化疗疗效和预后评价生物标志物的应用 | |
CN110846414A (zh) | 一种卵巢癌的预后诊断标志物组合及其应用 | |
CN116559462A (zh) | 用于肿瘤患者预后的生物标志物组及其用途 | |
CN110441523A (zh) | Atad2蛋白作为标志物在判断卵巢癌增殖状态中的应用 | |
CN107807243B (zh) | 一种食管癌的生物标志物及其应用 | |
CN113755594B (zh) | 一种预测小细胞肺癌辅助化疗获益和识别化疗耐药治疗靶点的系统和应用 | |
CN109696547B (zh) | 一种判断结直肠癌预后的标志物及其应用 | |
Wu et al. | Expression, clinical significance and correlation of RUNX3 and HER2 in colorectal cancer | |
Huai et al. | Evaluation of liquid biopsy in patients with HER2-Positive breast cancer | |
CN114990218A (zh) | 一种预测肺癌脑转移的试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |