CN116269830A - 一种肺动脉高压标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学领域，特别是指一种肺动脉高压标志物及其应用。本发明的研究结果发现次黄嘌呤与肺动脉高压的发生密切相关，因此首次提出将次黄嘌呤作为标志物，应用到制备鉴别、诊断、以及筛查肺动脉高压的相关产品中。利用该化合物作为预测肺动脉高压发生的标志物，可以准确、灵敏地预测和鉴别肺动脉高压的早期发病情况、以及恶性程度，从而降低目前在肺动脉高压的诊断过程中必须采用右心导管检查这种侵入性操作的风险性、以及降低诊断肺动脉高压的技术难度，进而为肺动脉高压的鉴别、诊断、筛查或药物疗效评估提供一种全新的客观指标。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，特别是指一种肺动脉高压标志物及其应用。
背景技术
肺动脉高压是一种由于肺血管重塑和进行性狭窄导致肺动脉阻力持续增高的恶性心血管疾病，也是指肺动脉压力升高超过一定界限的一种血流动力学和病理生理学状态。一般以海平面静息状态下，右心导管检测肺动脉平均压≥25 mm Hg为诊断标准。肺动脉高压异质性强、病因不明、症状隐匿、预后恶劣，堪称为心血管系统的“癌症”。肺动脉高压血流动力学特点是静息状态下平均肺动脉压力≥25 mmHg。
右心导管检查能够直接反映肺动脉及右心室的血流动力学特征，被认为是诊断肺动脉高压的金标准。而右心导管检查属于侵入性操作，具有一定的操作风险。同时，由于技术和设备的原因，一些基层医院并无法有效开展右心导管检查。寻找和发现新颖的生物标志物可协助临床医师诊断肺动脉高压，评估肺动脉高压的严重性、治疗效果及判断预后，也是目前肺动脉高压诊治领域亟待解决的问题。专利CN 106460059 A公开了肺动脉高压生物标记物为CCL21，专利CN 109663128 A公开了一种肺动脉高压标志物为NOC4L；现有技术中公开的肺动脉高压多是与CXCL家族、IL类因子、NOC4L基因、CCL家族基因相关，而基因的检测时间长，操作复杂，本课题组致力于寻找一种小分子化合物，以实现快速鉴定肺动脉高压的目的。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出一种肺动脉高压标志物及其应用。
技术方案如下：
一种肺动脉高压标志物，所述标志物为次黄嘌呤。
次黄嘌呤作为标志物在制备鉴别、诊断和/或辅助诊断肺动脉高压的产品中的应用。将次黄嘌呤作为肺动脉高压疾病相关的生物标志物，为肺动脉高压疾病的鉴别、诊断和/或辅助诊断提供一个便于检测的客观指标，具有高靶向性、稳定性和灵敏性的特点。
次黄嘌呤作为标志物在制备筛查和/或辅助筛查肺动脉高压的产品中的应用。将次黄嘌呤作为肺动脉高压疾病相关的生物标志物，应用在筛查和/或辅助筛查肺动脉高压中，可以相对准确的预测肺动脉高压是否发生以及病程发展情况，为肺动脉高压提供便捷、无创的筛查方法。
进一步的，所述产品为诊断试剂。
优选的，所述诊断试剂的检测样本为血浆。
进一步的，所述诊断试剂包括诊断试纸、试剂盒、诊断芯片。
检测血浆中次黄嘌呤含量的产品在制备鉴别、诊断和/或辅助诊断肺动脉高压的产品中的应用。
检测血浆中次黄嘌呤含量的产品在制备筛查和/或辅助筛查肺动脉高压的产品中的应用。
次黄嘌呤作为标志物在制备肺动脉高压疗效评估的医疗器械中的应用。
一种用于肺动脉高压的鉴别、诊断、筛查或疗效评估的医疗器械，所述医疗器械的工作原理为以次黄嘌呤为标志物，检测样本中的次黄嘌呤的水平，进而对肺动脉高压进行鉴别、诊断、筛查或疗效评估。使用该医疗器械能够便捷、无创的对肺动脉高压疾病进行诊断或疗效评估，灵敏度高。
本发明具有以下有益效果：
本发明的研究结果发现次黄嘌呤与肺动脉高压的发生密切相关，以健康对照组与肺动脉高压组两组对次黄嘌呤进行检测，发现肺动脉高压患者体内次黄嘌呤的含量发生了显著的升高；因此首次提出将次黄嘌呤作为标志物，应用到制备鉴别、诊断、以及筛查肺动脉高压的相关产品中。利用该化合物作为预测肺动脉高压发生的标志物，可以准确、灵敏地预测和鉴别肺动脉高压的早期发病情况、以及恶性程度，从而降低目前在肺动脉高压的诊断过程中必须采用右心导管检查这种侵入性操作的风险性，以及降低诊断肺动脉高压的技术难度，进而为肺动脉高压的鉴别、诊断、筛查或药物疗效评估提供一种全新的客观指标，为评估肺动脉高压的严重性、治疗效果及判断预后提供了一种新的思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例中3个独立临床研究队列肺动脉高压患者与同组健康人群血浆中次黄嘌呤含量比较图（*** P<0.001）。
图2为实施例中探索队列血浆次黄嘌呤水平诊断肺动脉高压的ROC曲线图（AUC=0.7659，且*** P=0.003）。
图3为实施例中验证队列1血浆次黄嘌呤水平诊断肺动脉高压的ROC曲线图（AUC=0.7033，且*** P=0.004）。
图4为实施例中验证队列2血浆次黄嘌呤水平诊断肺动脉高压的ROC曲线图（AUC=0.7058，且*** P<0.001）。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明提供的次黄嘌呤作为标志物在制备下述产品中的应用进行具体说明。
该产品包括：
a．用于鉴别、诊断和/或辅助诊断肺动脉高压的产品。
b．用于筛查和/或辅助筛查肺动脉高压的产品。
c．用于肺动脉高压的药物疗效评估的产品。
其中，鉴别、诊断和/或辅助诊断肺动脉高压是指：通过血浆中的次黄嘌呤水平的高低鉴别、诊断和/或辅助诊断肺动脉高压是否发生、处于早期还是进展期。
本发明的发明人为了寻找肺动脉高压的小分子生物标志物，以特发性肺动脉高压患者和年龄性别匹配的健康对照组为对象，运用液相色谱-质谱联用技术，分析了两组人群的血浆中次黄嘌呤的含量，从中发现肺动脉高压患者体内次黄嘌呤的含量发生了显著的升高。为了确证这一结果，发明人又建立了2个独立的临床验证队列，采用同样的技术方法在独立的人群中进行了检测分析，发现次黄嘌呤的含量在验证队列1和验证队列2中的肺动脉高压患者人群中均是显著升高的，与前面探索队列结论相吻合。3个独立研究队列研究均显示，用次黄嘌呤诊断肺动脉高压的ROC曲线图，其AUC均大于0.5、P值均小于0.05，由此提示次黄嘌呤与肺动脉高压的发生有着密切的联系，可以作为生物标志物用于鉴别、诊断、辅助诊断、以及筛查和/或辅助肺动脉高压。
次黄嘌呤，分子式为C5H4N4O，分子量为136.11，可以由腺嘌呤脱去一个氨基得到（鸟嘌呤脱氨基成为黄嘌呤，胞嘧啶脱氨基成为尿嘧啶）。近年来，人们发现血浆次黄嘌呤水平的升高与多种肿瘤的发生发展密切相关。然而到目前为止，次黄嘌呤水平和肺动脉高压的相关性并没有文献公开报道。次黄嘌呤的结构式如下：
基于此，一方面，本实施方式提供一种次黄嘌呤作为标志物在制备鉴别、诊断和/或辅助诊断肺动脉高压的产品中的应用；以及，提供一种次黄嘌呤作为标志物在制备筛查和/或辅助筛查肺动脉高压的产品中的应用。
本实施方式首次提出将次黄嘌呤作为标志物应用到肺动脉高压的诊断等相关领域中，例如将次黄嘌呤作为标志物用于制备诊断肺动脉高压的产品中，从而降低在诊断肺动脉高压中采用右心导管检查这种侵入性操作的风险性、以及降低诊断难度。且采用次黄嘌呤作为肺动脉高压疾病的相关标志物，为肺动脉高压疾病的鉴别、诊断、筛查提供一个便于检测的客观指标，且具有高靶向性、稳定性、灵敏性的特点。
进一步的，上述用于肺动脉高压疾病的鉴别、诊断、筛查的产品为诊断试剂，该诊断试剂可以包括诊断试纸、试剂盒、诊断芯片。
进一步的，上述诊断试剂的检测样本为血浆，该诊断试剂用于检测血浆中的次黄嘌呤水平。
在研究中发现，血浆次黄嘌呤水平越高的肺动脉高压患者，其疾病表型（症状）越恶劣。由此，也可根据血浆次黄嘌呤水平来预测疾病发展情况、以及来评估治疗效果、判断预后等。
容易理解，检测血浆中次黄嘌呤含量的产品，均可以用于制备鉴别、诊断和/或辅助诊断肺动脉高压的产品；或者，均可以用于制备筛查和/或辅助筛查肺动脉高压的产品。因此，将检测血浆中次黄嘌呤含量的产品应用于鉴别、诊断、筛选肺动脉高压的产品中的这方面应用，也属于本发明的保护范围。
同样的，以次黄嘌呤作为标志物不仅可以在制备鉴别、诊断、筛选肺动脉高压的产品中应用，也可以用于肺动脉高压的疗效评估等领域中，用于评价相关药物的治疗效果。因此，将次黄嘌呤作为标志物在这方面的应用也属于本发明的保护范围。
此外，本实施方式还一种用于肺动脉高压的鉴别、诊断、筛查或疗效评估的医疗器械，其以次黄嘌呤为标志物，检测样本中的次黄嘌呤的水平。
进一步的，上述用于肺动脉高压鉴别、诊断、筛查或疗效评估的医疗器械包括诊断试纸、试剂盒、诊断芯片、以及相关检测设备。
进一步的，上述医疗器械的检测样本为血浆。
本发明首次提出了将次黄嘌呤作为标志物在制备鉴别、诊断、筛选或疗效评估肺动脉高压的产品中应用，容易理解，相应的可检测次黄嘌呤浓度或水平的相关试剂均可以用于制备鉴别、诊断、筛选、疗效评估肺动脉高压的产品，其也属于本发明的保护范围。
首次提出了将次黄嘌呤作为标志物在制备鉴别、诊断、筛选或疗效评估肺动脉高压的产品中应用。因此，只要是基于该应用，所有的用于肺动脉高压的鉴别、诊断、筛选或疗效评估的产品，只要其以次黄嘌呤为标志物，检测样本中的次黄嘌呤的水平，即属于本发明的保护范围。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：
实施例
本实施例以健康人群为对照，以肺动脉高压患者为研究对象，验证血浆次黄嘌呤水平与肺动脉高压之间的密切关系。
1.受试对象：
受试群体：受试对象来自郑州大学第一附属医院诊治的患者和招募的健康人。
肺动脉高压患者入选和排除标准：海平面静息状态下，右心导管检测肺动脉平均压≥25 mm Hg），肺小动脉楔压≤ 15 mm Hg；排除先天性心脏病、体肺分流、药物诱导、病毒感染、肺栓塞、自身免疫性疾病等因素，同时无肿瘤、感染、肝肾功能异常等合并症状。
一共建立了3个独立的肺动脉高压患者临床研究队列。第1个研究队列即探索队列（discovery cohort 1），一共选取肺动脉高压组31例，健康对照组31例。第2个研究队列即验证队列1（validation cohort 1），一共选取肺动脉高压组60例，健康对照组45例。第3个研究队列即验证队列2（validation cohort 2），一共选取肺动脉高压组45例，健康对照组65例。3个独立研究队列中所有健康对照的年龄性别与其疾病组相匹配，且均通过常规体格检查），所有受试者均签署知情同意书。
2. 血液样本的制备
(1) 血液样本的收集与储存：采集空腹患者、健康对照静脉血，乙二胺四乙酸抗凝，立即置于冰浴上暂存，并于血液离体后30分钟内以5000 r/min，4℃离心10分钟。转移上清至冻存管，迅速置于液氮中速冻，转存-80℃冰箱储存。样品的转运均在干冰上进行，以保证样品在检测前无反复冻融。
(2) 将待测样品置于冰浴上融化，取100 μL转移至1.5 mL管，添加20 μL内标化合物（苯基丙氨酸）。震荡10秒进行混匀，添加400 μL乙腈，再次震荡5分钟进行混匀。将样品置于4℃，13500 r/min条件下离心10分钟，移除蛋白沉淀。将上清液转移至10 mL玻璃管，采用容器蒸发器室温下进行蒸干。将残留物用100 μL复溶液（乙腈与甲醇以体积3比1的比例进行混合所得的液体）进行溶解，再次置于4℃，13500 r/min条件下离心10分钟，取上清，采用液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）法进行次黄嘌呤的测定和分析。
3. 液相色谱-质谱联用分析条件：
(1) 色谱条件：
色谱柱：Waters XBridge Amide（2.1×100 mm，3.5 μm）；流动相：A相为50%乙腈（含15mM乙酸铵和0.2%氢氧化铵）；B相为95%乙腈（含15 mM乙酸铵和0.2% 氢氧化铵）；梯度洗脱程序0-10 min，100%B；10-23min，100-0%B；23-24 min，0-100%B；24-30min，100%B。流速： 0.3 mL/min；柱温：35℃，进样量：5 μL，进样器温度：4℃。
1 mol/L乙酸铵配制：精密称取乙酸铵3.854 g置于50 mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。
流动相B配制：430 mL乙腈 + 7.5 mL1mol/L乙酸铵 + 61.5 ml水 + 1 mL氢氧化铵。
流动相A配制：250 mL乙腈 + 7.5 mL1mol/L乙酸铵 + 241.5 mL水 + 1 mL氢氧化铵。
（2）质谱条件
AJS ESI正/负离子检测模式：干燥气：氮气，流速14 L/min，干燥气温度：200℃；雾化气：氮气，spi；鞘气：氮气，流速11 L/min，鞘气温度：250℃；毛细管压：±3.0 kv，喷嘴电压：±1.5 kv，碰撞气：氩气；扫描模式：多反应监测（MRM）； 离子对及CE电压参数设定见表1。
表1. 离子对及CE电压参数设定
4.统计分析：
利用步骤3中LC-MS检测结果，采用软件分析绘制肺动脉高压患者与健康对照组（HC）血浆次黄嘌呤水平比较图（图1）、以及血浆次黄嘌呤水平诊断肺动脉高压的ROC曲线（图2、图3、图4）。
图1的散点图展示了健康对照组（HC）及肺动脉高压患者组（IPAH）血浆次黄嘌呤浓度对数组及分布差异，每个点代表一个样本。由图可见，无论是探索队列、还是2个验证队列，患者血浆样本中次黄嘌呤浓度均显著高于同组健康人群。***代表统计学P值小于0.001（一般认为小于0.05说明差异具有统计学意义），进一步说明结果可靠、重现性高。
图2探索队列中血浆次黄嘌呤水平诊断肺动脉高压的ROC曲线图，为反映敏感度和特异度连续变量的综合指标。以敏感度（真阳性率）为Y轴，1-特异度（假阳性率）为X轴，ROC曲线下面积（AUC）为0.7659，大于0.5，具有良好诊断效能；P值=0.0003，小于0.05，具有良好的统计学意义。探索队列研究结果说明血浆次黄嘌呤水平可以作为一个生物标志物用于临床上肺动脉高压的诊断。
图3验证队列1中血浆次黄嘌呤水平诊断肺动脉高压的ROC曲线图，其ROC曲线下面积（AUC）为0.7033，同样的大于0.5；P值=0.0003，同样的小于0.05。
图4验证队列2中血浆次黄嘌呤水平诊断肺动脉高压的ROC曲线图，其ROC曲线下面积（AUC）为0.7758，同样的大于0.5；P值<0.0001，同样的小于0.05。
图3与图4的结果，从独立的研究队列角度验证了“次黄嘌呤在肺动脉高压患者人群显著升高且具有良好诊断效能”的结论。
综上，本发明的研究结果发现次黄嘌呤与肺动脉高压的发生密切相关，首次提出将次黄嘌呤作为标志物，应用到制备鉴别、诊断、以及筛查肺动脉高压的相关产品中，为肺动脉高压的鉴别、诊断、筛查或药物疗效评估提供一种全新的客观指标，为评估肺动脉高压的严重性、治疗效果及判断预后提供了一种新的思路。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种肺动脉高压标志物，其特征在于：所述标志物为次黄嘌呤。
2.权利要求1所述的标志物在制备鉴别、诊断和/或辅助诊断肺动脉高压的产品中的应用。
3.权利要求1所述的标志物在制备肺动脉高压疗效评估的产品中的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述产品为诊断试剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述诊断试剂的检测样本为血浆。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述诊断试剂包括诊断试纸、试剂盒、诊断芯片。
7.检测血浆中次黄嘌呤含量的产品在制备鉴别、诊断和/或辅助诊断肺动脉高压的医疗器械中的应用。
8.检测血浆中次黄嘌呤含量的产品在制备筛查和/或辅助筛查肺动脉高压的医疗器械中的应用。
9.用于肺动脉高压的鉴别、诊断、筛查或疗效评估的医疗器械。
10.根据权利要求9所述的医疗器械，其特征在于：所述医疗器械的工作原理为以次黄嘌呤为标志物，检测样本中的次黄嘌呤的水平，进而对肺动脉高压进行鉴别、诊断、筛查或疗效评估。
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