CN113640420B - 血清代谢物组合在胰腺癌早期诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了血清代谢物组合在胰腺癌早期诊断中的应用，具体是血清代谢物组合在制备早期诊断胰腺癌的检测试剂或检测物中的用途，该血清代谢物组合由L‑天冬氨酸、L‑丙氨酸、3alpha,17alpha‑雄烯二醇单硫酸酯和N‑甘胺酰‑L‑缬氨酸组成，通过液相色谱质谱联用获取胰腺癌患者和对照受试者的血清代谢轮廓谱，经统计分析及生物信息学分析首次筛选上述血清代谢物组合作为联合标志物用于胰腺癌早期筛查和临床辅助诊断，仅需血样即可，检测成本低，重复性好，与传统临床诊断标志物CA19‑9相比灵敏度高且可早期判别胰腺癌，具有良好的临床应用价值。

Description

血清代谢物组合在胰腺癌早期诊断中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及血清代谢物组合在胰腺癌早期诊断中的应用。

背景技术

胰腺癌是一种恶性程度高、死亡率高、诊断和治疗困难的消化道恶性肿瘤，据统计胰腺癌是第七大致死性恶性肿瘤，从1990年到2017年全球胰腺癌的死亡人数增长了2.3倍。由于胰腺癌早期症状不明显难以被发现，大多数患者确诊时已经是中晚期，治愈率低，预后较差，提高胰腺癌的早期诊断率可显著提高患者的生存率。然而，目前临床尚无有效的早期诊断标志物，开发具有临床早期诊断潜力的诊断方法对于降低胰腺癌死亡率具有重要意义。

代谢重编程是机体对外源性和内源性刺激以及生长需要所产生的应答，是恶性肿瘤的一个重要标志，代谢重编程产物的生化变化与表型终点关系最为密切，患者体液中的内源性代谢物具有潜在的疾病早期诊断价值；代谢组学技术致力于生物体内小分子代谢物的全面定性和定量分析，已广泛用于胰腺癌研究；色谱质谱联用技术是代谢组学主要研究手段之一，具高分辨、高分离、高灵敏的化学信息表征能力，已成功用于新生儿疾病筛查等疾病诊断。但是目前还没有采用液相色谱-质谱联用的代谢组学分析技术筛选L-天冬氨酸、L-丙氨酸、3alpha,17alpha-雄烯二醇单硫酸酯和N-甘胺酰-L-缬氨酸四种小分子血清代谢物或代谢物比值联合用于胰腺癌诊断的报道。

发明内容

针对现有技术中患者胰腺癌早期诊断困难的问题，本发明的目的是提供血清代谢物组合在胰腺癌早期诊断中的应用，具体为血清代谢物组合在制备早期诊断胰腺癌的检测试剂或检测物中的用途，该血清代谢物组合是一种新的小分子代谢物组合，作为标志物用于胰腺癌的早期诊断。

本发明提供血清代谢物组合在制备早期诊断胰腺癌的检测试剂或检测物中的用途，该血清代谢物组合由L-天冬氨酸、L-丙氨酸、3alpha,17alpha-雄烯二醇单硫酸酯和N-甘胺酰-L-缬氨酸组成。

优选地，所述检测试剂为血液检测试剂。

更优选地，通过液相色谱质谱联用检测受试者血清样本中所述血清代谢物组合浓度水平，并进行受试者工作特征曲线(ROC)统计分析，得到表示受试者诊断为胰腺癌概率的变量P，选取灵敏度与特异性之和最大的P值作为所述血清代谢物组合对胰腺癌早期诊断的最佳截点值，当P值大于所述最佳截点值时，提示所述受试者患有胰腺癌。

更优选地，所述最佳截点值为0.280。

更优选地，所述变量P通过包含以下步骤的方法得到：

(1)用血清样本提取液处理来自受试者的血清样本，得到血清提取物；

(2)通过超高效液相色谱串联四级杆静电场轨道阱质谱仪检测上述血清提取物中所述血清代谢物组合的浓度；

(3)将L-天冬氨酸的响应强度与L-丙氨酸比较，得到L-天冬氨酸/L-丙氨酸的相对值；

(4)通过二元逻辑回归，将L-天冬氨酸/L-丙氨酸、3alpha,17alpha-雄烯二醇单硫酸酯和N-甘胺酰-L-缬氨酸回归为变量P，回归方程如下：

P＝1/(1+e^{-(1.596x-0.592y+0.077z+0.032c-2.390)})

其中，x为血清中L-天冬氨酸/L-丙氨酸的相对含量，y为血清中3alpha,17alpha-雄烯二醇单硫酸酯的相对含量，z为血清中N-甘胺酰-L-缬氨酸的相对含量，c为血清中CA19-9的含量。

优选地，所述检测物为试剂盒。

更优选地，所述试剂盒包含L-天冬氨酸、L-丙氨酸、3alpha,17alpha-雄烯二醇单硫酸酯和N-甘胺酰-L-缬氨酸四种小分子代谢物的标准化学品，分别对受试者血清中所述小分子代谢物进行定性。

本发明筛选用于胰腺癌早期诊断的联合标志物由L-天冬氨酸、L-丙氨酸、3alpha,17alpha-雄烯二醇单硫酸酯和N-甘胺酰-L-缬氨酸四种小分子血清代谢物构成，其技术路线如下：

(1)利用液相色谱-质谱联用的代谢组学分析技术，对胰腺癌患者与健康对照的血清样本进行代谢轮廓分析，获得代谢物定性定量分析结果；

(2)基于统计分析及生物信息学分析进行标志物筛选，具体为：

a)代谢物挑选：剔除外源性代谢物，筛选在病例组检出率超过80％的代谢物，依据两组样本组间方差和组内方差的比值筛选排名前10％的代谢物；

b)单变量分析：采用条件逻辑回归分析挑选具有显著性的代谢物(p<0.05)；

c)假阳性率(FDR)评价，保留FDR<0.1的代谢物；

d)条件逻辑回归模型中进一步校正肿瘤家族史，保留校正后依然有显著性的代谢物(p<0.05)；

e)对于以上方法获得的代谢物，依据代谢通路选择最显著的代谢物作为联合标志物，其由L-天冬氨酸、L-丙氨酸、3alpha,17alpha-雄烯二醇单硫酸酯和N-甘胺酰-L-缬氨酸四种小分子血清代谢物组成。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明通过液相色谱质谱联用获取胰腺癌患者以及对照组受试者的血清代谢轮廓谱，经统计分析及生物信息学分析首次筛选L-天冬氨酸、L-丙氨酸、3alpha,17alpha-雄烯二醇单硫酸酯和N-甘胺酰-L-缬氨酸四种小分子血清代谢物作为联合标志物，该组代谢物是体内参与生理过程的重要代谢物，L-天冬氨酸和L-丙氨酸参与胰腺癌细胞能量代谢过程，3alpha,17alpha-雄烯二醇单硫酸酯具有抗炎作用有助于维持机体免疫平衡，N-甘胺酰-L-缬氨酸与胰腺癌发生时间变化显著相关，通过ROC曲线统计分析对胰腺癌患者与健康人进行判别，用于胰腺癌早期筛查以及临床辅助诊断，具有良好的临床应用价值。

(2)本发明L-天冬氨酸、L-丙氨酸、3alpha,17alpha-雄烯二醇单硫酸酯和N-甘胺酰-L-缬氨酸四种小分子血清代谢物作为联合标志物，用于辅助处于临床“诊断灰区”的胰腺癌早期诊断，仅需使用血样即可进行，无需其他组织样本，与传统临床诊断标志物CA19-9相比具有灵敏度高、检测成本低、重复性好和成本低的特点。

参考以下详细说明更易于理解本发明的上述以及其他特征、方面和优点。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更显著：

图1是实施例中血清代谢物组合用于诊断早期胰腺癌的ROC曲线图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1、血清样本收集

所有纳入研究的志愿者在血清样本采集前均签署了知情同意书。在相同条件下收集研究对象的血液标本，采集后静置60分钟后直接取血清，储存于-80℃冰箱保存备用。

2、研究对象

采用病例对照研究方法从中国心血管与恶性肿瘤研究(4C)人群中纳入。胰腺癌病例组纳入标准：1)研究对象年龄≥40岁；2)随访时自爆为胰腺癌或随访期间因胰腺癌死亡，对照组采用倾向性评分算法按照1：2的比例与病例组匹配，匹配信息包括采集中心、性别、年龄、吸烟状态和饮酒状态。排除标准：1)基线时已患有恶性肿瘤；2)基线血清样本缺失或溶血。最终纳入基线受试者192例，其中包括64例病例组和128例对照组。

表1：胰腺癌病例及匹配对照的基线特征

^*数据显示为平均值±SD(连续变量)或受试者人数(分类变量)，P值使用曼-惠特尼检验(连续变量)或卡方检验(分类变量)计算；TC：总胆固醇，TG：甘油三酯。

表1结果表明，胰腺癌病例组基线时与对照组无显著差异。

3、血清样本预处理

血清样本在4℃条件下解冻，使用甲醇沉淀蛋白同时提取血清中的小分子代谢物，涡旋2分钟并离心获得代谢物提取液，提取液使用氮气吹干备用。

4、代谢组学分析

基于UPLC-MS/MS高覆盖非靶向代谢组学方法检测血清代谢轮廓谱，其中液相色谱分离使用Waters ACQUITYUPLC仪器，质谱检测使用配备HESI离子源的Thermo ScientificQ-Exactive高分辨质谱仪。血清样本进行LC-MS分析时采取随机化顺序上机，并在样本之间插入质量控制样本，以确保代谢物的质谱信号在整个分析过程中保持相对标准偏差的中值在10％以内。

上述分析共鉴定998种代谢物，代谢物筛选过程如下：剔除275种外源性代谢物及在病例组中检出率小于80％的代谢物；对于剩余的723种代谢物，依据KEGG代谢通路计算156组生化反应产物与反应物的比值；723种代谢物与156组比值合并后产生879种变量；依据组间偏差与组内偏差的比值，筛选排名前10％的88个变量进行后续统计分析。

用条件逻辑回归方程对筛选的88个变量进行与胰腺癌的风险评估，共有46个变量与胰腺癌的发生风险显著相关(p<0.05且FDR<0.1)。在进一步校正肿瘤家族史后，共有11个变量仍与胰腺癌的发生风险显著相关：L-天冬氨酸、L-丙氨酸、谷氨酸、L-天冬氨酸/L-丙氨酸、富马酸/L-天冬氨酸、天冬酰胺/L-天冬氨酸、谷氨酰胺/谷氨酸、3alpha,17alpha-雄烯二醇单硫酸酯、5alpha-孕烷-3beta，20alpha-二醇单硫酸盐、N-甘胺酰-L-缬氨酸、纤维蛋白肽B(1-9)。选择每条代谢通路中最显著的代谢物作为联合标志物，即L-天冬氨酸/L-丙氨酸、3alpha,17alpha-雄烯二醇单硫酸酯和N-甘胺酰-L-缬氨酸。使用逻辑回归进一步将L-天冬氨酸/L-丙氨酸、3alpha,17alpha-雄烯二醇单硫酸酯和N-甘胺酰-L-缬氨酸回归为联合标志物变量P，回归方程如下：

P＝1/(1+e^{-(1.596x-0.592y+0.077z+0.032c-2.390)})

其中，x为血清中L-天冬氨酸/L-丙氨酸的相对含量，y为血清中3alpha,17alpha-雄烯二醇单硫酸酯的相对含量，z为血清中N-甘胺酰-L-缬氨酸的相对含量，c为血清中CA19-9的含量。变量P在胰腺癌患者中增高，该变量值可用于辅助判断胰腺癌。

通过ROC曲线判断其对胰腺癌的诊断效果，如图1所示，与CA19-9用于诊断胰腺癌的曲线下面积0.572相比，当该联合标志物用于胰腺癌的诊断时，得到ROC曲线的曲线下面积增高到0.721，具有较高的灵敏度和特异性；当灵敏度和特异性之和最大时，可获得当前最佳截点值，即0.280；当使用该截点值时，模型对于胰腺癌和对照的正确诊断率为79.7％(51/64)，表明该联合标志物对胰腺癌具有较好的诊断潜力。

Claims (5)

1.血清代谢物组合在制备早期诊断胰腺癌的检测试剂或试剂盒中的用途，该血清代谢物组合由L-天冬氨酸、L-丙氨酸、3alpha,17alpha-雄烯二醇单硫酸酯和N-甘胺酰-L-缬氨酸组成，所述检测试剂为血液检测试剂。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，通过液相色谱质谱联用检测受试者的血清样本中所述血清代谢物组合的浓度水平，并进行受试者工作特征曲线统计分析，得到表示受试者诊断为胰腺癌概率的变量P，取灵敏度与特异性之和最大的P值作为所述血清代谢物组合对胰腺癌早期诊断的最佳截点值，当P值大于所述最佳截点值时，提示所述受试者患有胰腺癌。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述最佳截点值为0.280。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述变量P通过包含以下步骤的方法得到：

（1）用血清样本提取液处理来自受试者的血清样本，得到血清提取物；

（2）通过超高效液相色谱串联四级杆静电场轨道阱质谱仪检测步骤（1）中所述血清提取物中L-天冬氨酸、L-丙氨酸、3alpha,17alpha-雄烯二醇单硫酸酯和N-甘胺酰-L-缬氨酸的浓度；

（3）将L-天冬氨酸的响应强度与L-丙氨酸比较，得到L-天冬氨酸/L-丙氨酸的相对值；

（4）通过二元逻辑回归，将L-天冬氨酸/L-丙氨酸、3alpha,17alpha-雄烯二醇单硫酸酯和N-甘胺酰-L-缬氨酸回归为变量P，回归方程如下：

P=1/（1+e^{-（1.596x-0.592y+0.077z+0.032c-2.390）}）；

其中，x为血清中L-天冬氨酸/L-丙氨酸的相对含量，y为血清中3alpha,17alpha-雄烯二醇单硫酸酯的相对含量，z为血清中N-甘胺酰-L-缬氨酸的相对含量，c为血清中CA19-9的含量。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒包含L-天冬氨酸、L-丙氨酸、3alpha,17alpha-雄烯二醇单硫酸酯和N-甘胺酰-L-缬氨酸的血清代谢物组合标准化学品，分别对受试者血清中所述血清代谢物组合进行定性。

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