CN114624344A - 一种类固醇激素联合生物标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种类固醇激素联合生物标志物及其应用，所述类固醇激素联合生物标志物包括皮质醇、17‑羟孕酮和可的松中的至少2种。所述类固醇激素联合生物标志物不是单一标志物或一组单一标志物，更好地反映生物体的实际生理环境，有利于检测准确性。
Description
技术领域
本申请涉及一种类固醇激素联合生物标志物及其应用，属于分析化学及临床检验领域。
背景技术
抑郁症(major depressive disorder，抑郁症)是当今社会一种常见的精神系统疾病。据世界卫生组织统计，该病已成为世界第四大疾患，预计到2020年，将成为仅次于冠心病的第二大疾病负担源。抑郁症是以情绪低落、兴趣减退、愉悦感缺失为核心症状的一系列综合征，具有患病率高、复发率高、自杀风险高、临床识别率低的特点。在我国，抑郁症的患病率约为3～5％，呈现逐年增加的趋势，且抑郁症的发病已开始出现低龄化趋势，波及大学生及中小学生群体，15％的患者最终走向自杀的结局，给患者家人和社会带来巨大的损失。
与抑郁症的高发病率形成鲜明对比的是抑郁症患者从未就医率高达60％，医疗机构对抑郁症的识别率不到20％。这主要是因为抑郁症的临床诊断主要根据病史、临床症状观察和家族病史和非特异性的实验室检查。临床症状包括心境低落、快感消失、睡眠及食欲异常、精神运动性激越或迟滞、疲乏、无价值感或过度内疚、集中注意的能力受损、自杀意念等，而这些表现缺乏一致性和特异性，在一般人群中也非常常见，却不总是与抑郁症相关。目前，没有客观的、非侵入性的方法来测量与抑郁症发病机理相关的生物学标志物。因此，亟待开发一种能够准确区分抑郁症的生物标志物。
下丘脑-垂体-肾上腺轴(The hypothalamic–pituitary–adrenal axis，HPA)亢进是抑郁症患者常见的神经生物学异常表现之一。HPA轴是重要的应激反馈系统，当应激信号沿中枢神经达到下丘脑，会引起促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)的分泌，CRH激活来自垂体的促肾上腺皮质激素(ACTH)的分泌，ACTH转而刺激肾上腺分泌糖皮质激素(皮质醇)，同时皮质醇负反馈调节CRH的分泌。皮质醇释放到循环中提升血压和血糖，促使机体各组织发生应激防御反应。一旦HPA轴的动态平衡被破坏，HPA轴被连续激活，并释放过量皮质醇。但皮质醇升高并非抑郁症的特异性特征，在内分泌相关疾病中均有皮质醇的显著升高，如库欣综合症，并且皮质醇的分泌存在明显的昼夜节律，一般于凌晨4时分泌开始增加，至早6～8时分泌最多，之后分泌量逐渐降低，午夜或清晨1点左右分泌最少，血浆含量最低。因此，很难通过单独测定生物样品中皮质醇的含量诊断抑郁症。
发明内容
根据本申请的一个方面，提供一种类固醇激素联合生物标志物，所述类固醇激素联合生物标志物不是单一标志物或一组单一标志物，更好地反映生物体的实际生理环境，有利于检测准确性。
一种类固醇激素联合生物标志物，所述类固醇激素联合生物标志物包括皮质醇、17-羟孕酮和可的松中的至少2种。
可选地，所述类固醇激素联合生物标志物包括：
皮质醇、17-羟孕酮和可的松；或
皮质醇和17-羟孕酮；或
皮质醇和可的松。
根据本申请的另一个方面，提供上述任一项所述的类固醇激素联合生物标志物在制备用于区分抑郁症和非抑郁症的试剂盒中的应用。
可选地，所述检测为通过检测受试者生物样品中的类固醇激素联合生物标志物水平，并与预定阈值比较，以区分抑郁症和非抑郁症。
可选地，所述样品包括全血、血清、血浆中的至少一种。
可选地，所述受试生物为人。
可选地，所述预定阈值是二元逻辑回归分类预测值。
可选地，所述检测包括：
(a)从受试生物样品中获取类固醇激素联合生物标志物中每一种生物标志物数值；
(b)通过预定函数获得所述每一种生物标志物数值的加权值；
(c)获得上述加权值的总和，得到所述类固醇激素联合生物标志物评分；
(d)通过比较所述评分与预定阈值的大小，如果所述评分大于所述预定阈值，则将受试生物归为抑郁症，如果所述评分不大于所述预定阈值，则将受试生物归为非抑郁症。
可选地，(a)中，所述样品经过如下前处理：先采用盐析辅助液液萃取法处理所述样品，再提取所述样品中的非极性代谢物。
可选地，所述提取为采用弱极性有机溶剂萃取。
本申请的目的是针对抑郁症尚缺乏临床诊断生物标志物的实际问题，提供一组用于区分抑郁症和非抑郁症的类固醇激素联合生物标志物。
作为一种实施方案，所述类固醇选自：皮质醇、17-羟孕酮、可的松。所述组合标志物可选自下组：
皮质醇、17-羟孕酮、可的松；或
皮质醇、17-羟孕酮；或
皮质醇、可的松。
利用上述类固醇激素联合生物标志物进行区分抑郁症和非抑郁症的方法如下：a高效液相色谱-质谱分析获取受检者的生物样品中生物标志物的数值；
b通过预定函数对这些类固醇数值中的每个单独进行加权，每个回归系数为每个类固醇所专用；
c确定这些加权值的总和，得到组合标志物评分；
d如果所述评分高于预定阈值，则将所述受检者分类成抑郁症，或者如果所述评分与预定阈值无差异或小于预定阈值，则将所述受检者分类为非抑郁症。
可选地，所述数值来自所述受检者皮质醇、17-羟孕酮、可的松水平。
可选地所述生物样品是全血、血清、血浆中的一种或多种。
可选地所述受检者皮质醇、17-羟孕酮、可的松水平，用液相色谱-质谱对经除蛋白预处理的样本进行分离、定量获得。
可选地，所述受检者为人。
可选地，所述评分是二元逻辑回归分类预测值。
除非另有定义，否则本发明文件中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通专业人员所通常理解的意义相同。
本申请能产生的有益效果包括：
1)本申请所提供的类固醇激素联合生物标志物，通过检测受试者血浆中各生物标志物的含量，提供包括预先确定为与抑郁症相关的类固醇激素标志物的组合，以及基于临床抑郁症患者数据获得的各种组合中各类固醇激素的加权系数；可产生用于诊断该受检者是否为抑郁症的评分。
2)本申请所提供的生物标志物为类固醇激素联合生物标志物，即，不是单一标志物或一组单一标志物，更好地反映生物体的实际生理环境，有利于检测准确性。
附图说明
图1示出实施例3种联合生物标志物用于诊断抑郁症和健康对照的ROC曲线，其中A为联合生物标志物1，其中B为联合生物标志物2，其中C为联合生物标志物3；
图2示出实施例3种联合生物标志物对抑郁症和健康对照的预测分值分布，其中A为联合生物标志物1，其中B为联合生物标志物2，其中C为联合生物标志物3。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。
实施例1使用高效液相色谱-质谱分析获取生物标志物的数值
1.样品采集
所有志愿者均于上午7:00～8:00空腹采血，志愿者包括健康对照和抑郁症患者。用含酶抑制剂及抗凝剂的真空采血管收集全血，3000rpm离心十分钟(4℃)，取上层血浆分装后置-80℃保存备用。抑郁症患者的临床诊断根据汉密尔顿抑郁量表(HAMD)进行评估。样本数及年龄分布见表1。
表1
2.分析方法
采用盐析辅助液液萃取法(SALLE)对血浆样本进行预处理：
1)解吸附：取分装好的血浆500μL置于10mL离心管，涡旋30s，加入200μL 5％磷酸(v/v)，涡旋30s；
2)萃取与除杂：加4mL 4M磷酸氢二钾，涡旋30s，加入4mL异丙醇，涡旋1min，3000rpm离心10min，将上清液4.5mL转移至5mL离心管，40℃下氮气吹干；
3)除盐：将2)所得样品中加入1mL异丙醇，超声30s，涡旋30s，7000rpm离心20min，将上清液950μL转移至1.5mL离心管；
4)质控样本：吸取各样本上述上清液90μL混合后分装成6份，作为质控样本；
5)萃取：将3)和4)所得上清液在40℃下氮气吹干，加入45μL 15％乙腈(v/v)(含0.2％甲酸(v/v))和30μL二氯甲烷，超声30s，涡旋30s，15000rpm离心1h，取下层溶液15μL干燥，45μL 60％乙腈(v/v)(含0.2％甲酸(v/v))超声30s，涡旋30s，15000rpm离心10min，取上清待分析。
标准曲线绘制：
1)标准品溶液：用甲醇分别配置皮质醇、可的松、17-羟孕酮的储备液1mg/mL，用50％甲醇将上述储备液稀释为系列混合标准品溶液，共5个浓度点，每个点类固醇激素浓度如下：皮质醇50、100、500、100、2500ng/mL；可的松10、20、100、200、500ng/mL；17-羟孕酮1、2、5、10、50ng/mL。在180μL空白基质中加入20μL系列混合标准品溶液，再加入20μL同位素内标工作液，加入1mL SALLE试剂或1mL叔丁基甲醚，涡旋1分钟、15000rpm离心5分钟后取上清液40℃氮气吹干，加入体积分数为60％的乙腈(含体积分数为0.2％的甲酸)溶液100μL进行复溶，涡旋1分钟，15000rpm离心5分钟后取上清液得待测样品；
2)同位素内标工作液：用甲醇分别配置d4-皮质醇、d8-可的松13C3-17-羟孕酮的储备液1mg/mL，用50％甲醇将上述储备液稀释为同位素内标的混合溶液，其浓度为100ng/mL。
采用高效液相色谱质谱分析：
流动相A为0.1～2mM氟化铵溶液；
流动相B为含体积分数为0.02～0.2％甲酸的甲醇；
色谱柱为联苯柱，具体型号为：
2.6μm Biphenyl
LC Column 50x2.1mm；
流速为0.3～0.5mL/min，柱温为35～45℃，进样体积为5～20μL；
洗脱梯度为0～0.5min，65％～75％B；5.5～10min，75％～100％B；10～11min，100％B；11～13min，65％B；
所述质谱条件为：电喷雾电离源，正离子模式，采用多反应监测(MRM)的扫描模式；气帘气(CUR)为20～30kPa；碰撞气(CAD)为Medium；喷雾电压(IS)为5000～6000V；加热气温度为500～550℃；
3.血浆测试结果
定量分析生物标志物，表2列出的3种类固醇激素在抑郁症患者组和健康对照组中的血浆含量，结果如图1所示。与健康对照组相比，抑郁症患者血浆皮质醇含量显著升高(p<0.0001)，17-羟孕酮含量显著降低(p<0.05)，可的松含量在健康对照和抑郁症患者中无显著差异(p>0.5)。
表2
利用准确定量结果比值法和数据统计软件SPSS，二元logistic回归模型进一步将生物标志物回归为联合生物标志物，如表3所示。
表3
实施例2对表3中联合生物标志物1进行评估
高效液相色谱-质谱准确定量皮质醇、17-羟孕酮和可的松，与健康对照组相比，在抑郁症患者血浆中皮质醇与17-羟孕酮的准确含量比值和皮质醇与可的松的准确含量比值均显著升高。使用数据统计软件SPSS进一步将血浆中皮质醇与17-羟孕酮的绝对含量比值和皮质醇与可的松的绝对含量比值回归为联合生物标志物。回归函数如下：
P＝1/(1+e-(-5+0.006a+0.721b))
其中，a和b分别为皮质醇与17-羟孕酮的绝对含量比值和皮质醇与可的松的绝对含量比值。所得评分可用于辅助判断抑郁症，如果所述评分大于预定阈值，则将所述受检者分类成抑郁症，或者如果所述评分小于预定阈值，则将所述受检者分类为非抑郁症。
如图1A所示，该联合生物标志物通过评分用于诊断抑郁症与健康对照时，得到ROC曲线下面积AUC值分别为0.83，具有较高的灵敏度和特异性(0.77和0.79)。当使用该预定阈值0.5时，联合生物标志物1在健康对照和抑郁症组中准确率分别是85.7％和81.0％。图2A和表4表明了当使用该预定阈值时，联合生物标志物1在健康对照和抑郁症组中的预测分值及准确率结果。
表4
实施例3对表3中联合生物标志物2进行评估
高效液相色谱-质谱准确定量血浆皮质醇和17-羟孕酮，联合生物标志物2(表3)列出的2种生物标志物在抑郁症患者组和健康对照组中的血浆准确含量，计算皮质醇与17-羟孕酮的准确含量比值，如表2所示。与健康对照组相比，在抑郁症患者中皮质醇与17-羟孕酮的比值显著升高。使用数据统计软件SPSS进一步将皮质醇与17-羟孕酮的比值回归为联合生物标志物。回归函数如下：
P＝1/(1+e-(-2.3+0.009a))
a为皮质醇与17-羟孕酮的准确含量比值。所得评分可用于辅助判断抑郁症，如果所述评分大于预定阈值，则将所述受检者分类成抑郁症，或者如果所述评分小于预定阈值，则将所述受检者分类为非抑郁症。
如图1B所示，该联合生物标志物通过预测分值用于诊断抑郁症与健康对照时，得到ROC曲线下面积AUC值分别为0.76，具有较高的灵敏度和特异性(0.88、0.53)。当使用预定阈值0.5时，联合生物标志物2在健康对照和抑郁症组中准确率分别是78.7％和57.1％。图2B和表5表明了当使用该预定阈值时，联合生物标志物2在健康对照和抑郁症组中的预测分值及准确率结果。
表5
实施例4对表3中联合生物标志物3进行评估
高效液相色谱-质谱准确定量血浆皮质醇和可的松，联合生物标志物3(表3)列出的2种生物标志物在抑郁症患者组和健康对照组中的血浆准确含量，计算皮质醇与可的松的准确含量比值，如表2所示。与健康对照组相比，在抑郁症患者中皮质醇与可的松准确含量比值显著升高。使用数据统计软件SPSS进一步将皮质醇与可的松的准确含量比值回归为联合生物标志物。回归方程如下：
P＝1/(1+e-(-4.6+0.908a))
a为皮质醇与可的松准确含量比值。所得评分可用于辅助判断抑郁症，如果所述评分大于预定阈值，则将所述受检者分类成抑郁症，或者如果所述评分小于预定阈值，则将所述受检者分类为非抑郁症。
如图1C所示，该联合生物标志物通过预测分值用于诊断抑郁症与健康对照时，得到ROC曲线下面积AUC值分别为0.81，具有较高的灵敏度和特异性(0.71、0.79)。当使用该预定阈值0.5时，联合生物标志物3在健康对照和抑郁症组中准确率分别是80.9％和66.7％。图2C和表6表明，当使用该预定阈值时，联合生物标志物3预测分值及准确率结果。
表6
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
Claims (10)
1.一种类固醇激素联合生物标志物，其特征在于，所述类固醇激素联合生物标志物包括皮质醇、17-羟孕酮和可的松中的至少2种。
2.根据权利要求1所述的类固醇激素联合生物标志物，其特征在于，所述类固醇激素联合生物标志物包括：
皮质醇、17-羟孕酮和可的松；或
皮质醇和17-羟孕酮；或
皮质醇和可的松。
3.根据权利要求1～2任一项所述的类固醇激素联合生物标志物在制备用于检测抑郁症和非抑郁症的试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测为通过检测受试者生物样品中的类固醇激素联合生物标志物水平，并与预定阈值比较，以区分抑郁症和非抑郁症。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述受试生物为人。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述预定阈值是二元逻辑回归分类预测值。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述样品包括全血、血清、血浆中的至少一种。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测包括：
(a)从受试生物样品中获取类固醇激素联合生物标志物中每一种生物标志物数值；
(b)通过预定函数获得所述每一种生物标志物数值的加权值；
(c)获得上述加权值的总和，得到所述类固醇激素联合生物标志物评分；
(d)通过比较所述评分与预定阈值大小，如果所述评分大于所述预定阈值，则将受试生物归为抑郁症，如果所述评分不大于所述预定阈值，则将受试生物归为非抑郁症。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，(a)中，所述样品经过如下前处理：先采用盐析辅助液液萃取法处理所述样品，再提取所述样品中的非极性代谢物。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述提取为采用弱极性有机溶剂萃取。
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