CN113897446A - 类风湿关节炎的诊断及预后标志物 - Google Patents

类风湿关节炎的诊断及预后标志物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了类风湿关节炎的诊断及预后标志物。本发明的第一方面，提供定量检测肠道菌群的标志物的试剂在制备用于类风湿关节炎的诊断和/或预后的产品中的应用，标志物选自以下至少一种：9,12‑十八碳二炔酸、10Z壬烯酸、疣微菌门、阿克曼菌属。根据本发明实施例的应用，至少具有如下有益效果：申请人在实验中发现，类风湿关节炎患者的肠道中9,12‑十八碳二炔酸、10Z壬烯酸的代谢水平以及疣微菌门和阿克曼菌属的微生物含量相比于正常人相比存在显著的上调，通过对这些代谢物中的至少一种的水平的定量检测，可以有效地区分类风湿关节炎患者和健康的正常人群，具有良好的诊断和预后价值。

Description

类风湿关节炎的诊断及预后标志物
技术领域
本申请涉及类风湿关节炎诊断技术领域，尤其是涉及类风湿关节炎的诊断及预后标志物。
背景技术
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以周身多关节疼痛、肿胀及进行性侵蚀病变为特点的全身自身免疫性疾病，治疗不及时可致关节畸形、功能丧失，最终会导致残疾、生活质量降低甚至死亡，时常还伴有包括心血管和肺等组织器官受累病变。类风湿关节炎的治疗措施包括一般性治疗、药物治疗和外科手术等。但是，目前的治疗措施通常仅能控制病情而无法治愈，因此需要患者进行定期随访，及时评估以根据实际情况考虑是否改变治疗方案。然而，现有的评估手段是基于观察和问卷评分的ACR标准(如ACR70)，相对于生理学改变，无法及时准确反映患者的状态，所以有必要从RA的发病机制出发，寻找合适的诊断或预后的标志物。
关于RA的发病机制目前尚不明确，目前的主流观点认为是遗传、环境与免疫之间相互作用的结果。RA在遗传因素方面的研究已经取得了一定的进展，但仅仅依靠遗传因素仍不足以解释RA的发病机制。部分研究结果显示，RA患者在关节炎症状发生前就能在血液中检测到类风湿因子和抗环胍氨酸肽抗体等自身免疫性抗体。该结果表明自身免疫的发生部位可能起源于关节外，也提示研究人员有必要关注遗传学指标以外的生物标志物。
随着微生物DNA测序技术的不断发展，微生物与自身免疫性疾病的研究得到了广泛的关注和重视，肠道菌群的稳定是维持机体正常新陈代谢和免疫防御体系的重要保证，研究发现肠道菌群失调与疾病发生有着密切的关系。肠道菌群失调会改变上皮和粘膜通透性，使机体丧失免疫耐受功能，致敏免疫细胞和抗原在关节处聚集，导致类风湿关节炎等疾病的发生。但肠道菌群失调与RA疾病发生之间的因果关系仍不清楚，在疾病发生发展过程中起关键作用的肠道菌群的筛选、鉴定及功能作用有待进一步研究。因此，有必要从微生物组学出发，寻找具有良好诊断价值的RA代谢标志物。
发明内容
本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种具有良好的诊断价值的类风湿关节炎的代谢相关的标志物，定量检测这些标志物的试剂能够用于类风湿关节炎的诊断或预后判断。
本申请的第一方面，提供定量检测肠道菌群的标志物的试剂在制备用于类风湿关节炎的诊断和/或预后的产品中的应用，标志物选自以下a和b中四种中的至少一种：
a.代谢物：9,12-十八碳二炔酸、10Z壬烯酸；
b.微生物：疣微菌门(Verrucomicrobia)、阿克曼菌属(Akkermansia)。
根据本申请实施例的应用，至少具有如下有益效果：
申请人在实验中发现，类风湿关节炎患者肠道中9,12-十八碳二炔酸、10Z壬烯酸的代谢水平以及疣微菌门(Verrucomicrobia)和阿克曼菌属(Akkermansia)的微生物含量相比于正常人相比存在显著的上调，通过对这些代谢物或微生物中的至少一种的水平的定量检测，可以有效地区分类风湿关节炎患者和健康的正常人群，具有良好的诊断和预后价值。
在本申请的一些实施方式中，标志物来源于粪便样本。
在本申请的一些实施方式中，试剂盒还包括标志物的提取试剂。通过提取试剂将肠道菌群代谢物或微生物从粪便样本中富集出来，提取试剂可以是本领域任选的能够有效提取标志物的试剂。可以理解的是，为了不影响后续检测试剂的测定，对提取试剂的成分做一定调节。优选的，代谢物的提取试剂包括乙腈、甲醇和水，进一步三者体积比例优选为(1～5)：(1～5)：(1～3)，优选为2：2：1。微生物的提取试剂包括微生物核酸的抽提试剂。
在本申请的一些实施方式中，试剂通过核磁共振法、色谱法、光谱法、质谱法、PCR、测序、抗体-抗原反应中的至少一种对标志物进行定量检测。
在本申请的一些实施方式中，试剂通过核磁共振法、色谱法、光谱法、质谱法、抗体-抗原反应中的至少一种对代谢物进行定量检测。
在本申请的一些实施方式中，试剂通过PCR、测序、抗体-抗原反应中的至少一种对微生物进行定量检测。
其中，核磁共振法包括但不限于一维核磁共振法、二维核磁共振法等，色谱法包括但不限于气相色谱法、液相色谱法、高效液相色谱法、超高效液相色谱法等，光谱法包括但不限于紫外可见吸收光谱法、红外吸收光谱法、近红外光谱法等，质谱法包括但不限于串联质谱法、飞行时间质谱法等。而上述多种方法的组合包括但不限于液相色谱-质谱联用法。
PCR或测序的试剂包括扩增肠道微生物群16S rRNA的试剂，优选的，扩增其V3～V4区。优选的，试剂包括疣微菌门和/或阿克曼菌属细菌特异性保守区序列的特异性扩增引物、特异性识别探针等。
抗体-抗原反应的试剂通过特异性抗体检测样本中代谢物或微生物的含量。
本申请的第二方面，提供类风湿关节炎的诊断和/或预后的试剂盒，该试剂盒包括定量检测肠道菌群的标志物的试剂，标志物选自以下a和b中四种中的至少一种：
a.代谢物：9,12-十八碳二炔酸、10Z壬烯酸；
b.微生物：疣微菌门(Verrucomicrobia)、阿克曼菌属(Akkermansia)。
在本申请的一些实施方式中，试剂盒为粪便检测试剂盒。
在本申请的一些实施方式中，试剂盒还包括标志物的提取试剂。
本申请的第三方面，提供计算机可读存储介质，计算机可读存储介质存储有计算机可执行指令，计算机可执行指令用于使计算机执行以下操作：
步骤1：获取来自受试者的样本中的标志物的水平，标志物选自以下a和b中四种中的至少一种：
a.代谢物：9,12-十八碳二炔酸、10Z壬烯酸；
b.微生物：疣微菌门(Verrucomicrobia)、阿克曼菌属(Akkermansia)；
步骤2：将标志物的水平与设定值比较，根据比较结果对受试者进行类风湿关节炎的诊断或预后判断。
在本申请的一些实施方式中，步骤1还包括将标志物的水平进行标准化。通过标准化处理以进一步避免可能引起的诊断结果误差。
在本申请的一些实施方式中，可以获取至少两种标志物的水平，将这些水平进行数学关联以获得评分，将评分与设定的阈值评分进行比较，根据比较结果对受试者进行类风湿关节炎的诊断或预后判断。数学关联的方法可以是对每一种标志物赋予一个参数向量，得到评分与标志物水平的线性回归模型。可以理解的是，线性回归模型中各个参数向量可以通过训练以获得更好的取值以达到更准确的诊断或预后作用。
在本申请的一些实施方式中，设定值为用作对照的健康人的对应标志物的水平。
在本申请的一些实施方式中，当受试者的9,12-十八碳二炔酸和/或10Z壬烯酸和/或疣微菌门(Verrucomicrobia)和/或阿克曼菌属(Akkermansia)的水平为健康人的相应水平的2倍以上时，受试者可以被诊断为患有类风湿关节炎，或预后不良；优选的，在2.5倍、3倍、4倍、5倍以上时，受试者可以被诊断为患有类风湿关节炎，或预后不良。
本申请的第四方面，提供电子设备，该电子设备包括处理器和存储器，存储器上存储有可在处理器上运行的计算机程序，处理器在运行计算机程序时实现以下操作：
步骤1：获取来自受试者的样本中的标志物的水平，标志物选自以下a和b中四种中的至少一种：
a.代谢物：9,12-十八碳二炔酸、10Z壬烯酸；
b.微生物：疣微菌门(Verrucomicrobia)、阿克曼菌属(Akkermansia)；
步骤2：将标志物的水平与设定值比较，根据比较结果对受试者进行类风湿关节炎的诊断或预后判断。
其中，存储器作为一种非暂态计算机可读存储介质，可用于存储非暂态软件程序以及非暂态性计算机可执行程序，如前述的对受试者进行类风湿关节炎的诊断或预后判断。处理器通过运行存储在存储器中的非暂态软件程序以及指令，从而实现上述对受试者进行类风湿关节炎的诊断或预后判断。
存储器可以包括存储程序区和存储数据区，其中，存储程序区可存储操作系统、至少一个功能所需要的应用程序；存储数据区可存储执行上述步骤。此外，存储器可以包括高速随机存取存储器，还可以包括非暂态存储器，比如至少一个磁盘存储器件、闪存器件、或其他非暂态固态存储器件。例如，存储器可选包括相对于处理器远程设置的存储器，这些远程存储器可以通过网络连接至该处理器。上述网络的实例包括但不限于互联网、企业内部网、局域网、移动通信网及其组合。
实现上述步骤所需的非暂态软件程序以及指令存储在存储器中，当被一个或者多个处理器执行时，执行上述步骤。
以上所描述的装置实施例仅仅是示意性的，其中作为分离部件说明的单元可以是或者也可以不是物理上分开的，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部模块来实现本实施例方案的目的。
另外，上文中所公开的系统可以被实施为软件、固件、硬件及其适当的组合。某些物理组件或所有物理组件可以被实施为由处理器，如中央处理器、数字信号处理器或微处理器执行的软件，或者被实施为硬件，或者被实施为集成电路，如专用集成电路。这样的软件可以分布在计算机可读介质上，计算机可读介质可以包括计算机存储介质(或非暂时性介质)和通信介质(或暂时性介质)。如本领域普通技术人员公知的，术语计算机存储介质包括在用于存储信息(诸如计算机可读指令、数据结构、程序模块或其他数据)的任何方法或技术中实施的易失性和非易失性、可移除和不可移除介质。计算机存储介质包括但不限于RAM、ROM、EEPROM、闪存或其他存储器技术、CD-ROM、数字多功能盘(DVD)或其他光盘存储、磁盒、磁带、磁盘存储或其他磁存储装置、或者可以用于存储期望的信息并且可以被计算机访问的任何其他的介质。此外，通信介质通常包含计算机可读指令、数据结构、程序模块或者诸如载波或其他传输机制之类的调制数据信号中的其他数据，并且可包括任何信息递送介质。
申请人在实验中发现，类风湿关节炎患者的肠道中9,12-十八碳二炔酸、10Z壬烯酸的代谢水平以及疣微菌门(Verrucomicrobia)、阿克曼菌属(Akkermansia)的微生物的含量相比于正常人相比存在显著的上调，通过对这些标志物中的至少一种的水平的定量检测，可以有效地区分类风湿关节炎患者和健康的正常人群，具有良好的诊断和预后价值。
本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。
附图说明
图1是本申请的实施例1中16S rRNA测序在门分类水平下的比较结果。其中，A是HF组和RA组的不同个体所检出的不同肠道微生物的堆积柱形图；B是A中各个菌门的肠道微生物在两组样本中检出的比例；C是B中各个菌门在两组样本中检出的比例的堆积柱形图；D是在门分类水平下，HF组和RA组样本中存在显著差异的四个菌门的检验结果。
图2是本申请的实施例1中16S rRNA测序在属分类水平下的比较结果。其中，A是HF组和RA组的不同个体所检出的不同肠道微生物的堆积柱形图；B是A中各个菌门的肠道微生物在两组样本中检出的比例；C是B中各个菌门在两组样本中检出的比例的堆积柱形图。
图3是本申请的实施例1中采用LEfSe方法筛选得到的不同分类水平下的差异表达的生物标志物，其中，A是筛选结果的分支图，从内侧到外侧的圆圈表示从门到种的分类水平，每个小圆圈的直径与肠道微生物群的相对丰度成正比；B是筛选出的显著差异的肠道菌群成分的柱状图。
图4是本申请的实施例1中采用LC-MS方法筛选得到的在HF组和RA组中存在显著差异的代谢物。
图5是本申请的实施例1中差异代谢通路富集以及差异代谢物诊断价值的结果。其中，A是代谢通路富集的气泡图；B是差异代谢物与不同分类水平的差异微生物的Spearman相关分析结果；C和D分别是9,12-十八碳二炔酸和10Z壬烯酸的ROC曲线；E和F分别是HF组和RA组样本中9,12-十八碳二炔酸和10Z壬烯酸的差异表达情况。
具体实施方式
以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。
下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。
在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
实施例1
实验方法
1.肠道微生物的16S rRNA测序
分别收集30例健康人和29例初发未治疗的RA患者的粪便标本分别作为对照组(HF)和疾病组(RA)，使用
Figure BDA0003269994600000061
DNA Isolation Kit提取试剂盒提取肠道菌群的总基因组D NA。用正向引物5'-ACTCCTACGGAGGCAGCA-3'(SEQ ID No.1)和反向引物5'-GGACTACHGGGGTWTCTAAT-3'(SEQ ID No.2)进行PCR扩增肠道微生物群16S rRNA基因的V3-V4区。用VAHTSTM DNA磁珠纯化PCR产物，然后将得到的PCR产物作为DNA模板进行Solexa PCR扩增。纯化后，用nanodrop 2000测定DNA浓度，用1.8％琼脂糖凝胶电泳(120v，40min)回收DNA片段。基于Illumina-HiSeq-2500测序平台，采用双端法构建小片段文库并测序。
使用FLASH软件对每个样本的reads进行拼接，得到原始Tags数据。然后用trimmomatic软件对原始Tags数据进行过滤，得到高质量的Tags数据。利用UCHIME软件去除嵌合体序列，得到有效的数据。然后用QIIME软件对数据进行聚类，相似度大于97％的OTU被认为是同一个OTU。然后，将每个OTU序列的物种与微生物参考数据库获取每个OTU分类的物种信息。α多样性分析用于分析肠道微生物群落的物种丰富度(Chao1和ACE)和多样性(Shannon和Simpson指数)，采用β多样性分析法，包括主坐标分析法(PCoA)，用R语言分析不同样品肠道菌群组成的差异。用LEfSe(linear discriminant analysis effect size)法分析两组之间存在显著差异的生物标志物。
2.非靶标代谢组学检测
称取50mg粪便样品于EP管中，加入1000μL提取溶剂(乙腈-甲醇-水，2:2:1，含内标物1μg/mL)后，涡旋混匀30s，加入钢珠，在45Hz下研磨处理4min，在冰水浴中超声5min。将匀浆和超声循环重复3次，然后在-20℃下静置1小时，并在12000rpm和4℃条件下离心15分钟。所得上清液转移到进样瓶中进行检测。质控品由所有样品中混合等量的上清液制得。
LC-MS/MS分析使用UHPLC系统(1290，Agilent Technologies)，UPLC HSS T3柱(2.1mm×100mm，1.8μm)与Q Exactive(Orbitrap MS，Thermo)耦合。流动相A为0.1％甲酸+5mmol/L醋酸铵的水溶液，流动相B为乙腈。洗脱梯度为：0min，1％B；1分钟，1％B；8min，99％B；10min，99％B；10.1分钟，1％B；12分钟，1％B。流速为0.5ml/min，进样量为2μL。在LC/MS实验中，QE质谱仪能够在信息依赖的基础上获得MS/MS光谱。在这种模式下，采集软件(Xcalibur 4.0.27，Thermo)在根据预选标准采集和触发MS/MS光谱采集时，不断评估全扫描测量MS数据。ESI源条件设定为：鞘层气体流量为45Arb，辅助气体流量为15Arb，毛细管温度为400℃，全ms分辨率为70000，ms/ms分辨率为17500，碰撞能量为20/40/60eV，喷射电压为4.0kV(正)或-3.6kV(负)。
使用ProteoWizard软件将质谱原始数据转成mzXML格式，再使用MAPS软件(XCMS内核)做保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等工作。使用R程序包和二级质谱数据库对峰进行物质鉴定。利用SIMCA软件对隐结构判别分析(OPLS-DA)进行正交投影。对照组和疾病组之间的差异代谢产物根据VIP得分的变量重要性和Student’t检验分析的p值进行选择。通过内部MS2数据库和以及HMDB和Pubchem在线数据库的比较，根据准确的分子量和片段模式鉴定代谢物。
实验结果
下面关于肠道菌群拉丁名的命名中，部分命名前端出现的单一字母用以区分其分类水平，其中，p、c、o、f、g和s分别代表门、纲、目、科、属和种的不同分类水平。
16S rRNA测序结果如图1所示，其中，A是在门分类水平下，HF组和RA组的不同个体所检出的肠道微生物的具体成分和比例结果；B是A中各个菌门的肠道微生物在两组样本中检出的比例；C是B中各个菌门在两组样本中检出的比例的堆积柱形图；D是在门分类水平下，HF组和RA组样本中存在显著差异的四个菌门的检验结果。从A中可以看出，对照组和实验组中一共检测出10个门分类水平的肠道微生物菌群，其中，厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)是HF和RA组的主要成分。从B和C中可以看出，Firmicutes是最主要的门分类水平的菌，分别占HF组和RA组物种的59.4％和59.1％。HF组中Bacteroidetes的含量高于RA组(分别为23.0％和15.2％)，而Proteobacteria(HF组和RA组的含量分别为8.6％和12.4％)和Verrucomicrobia的含量低于RA组(8.6％/12.4％及6.7％/7.2％)。为了评估HF组和RA组的微生物群之间的差异，对其进行Wilcoxon检验，结果如D所示，发现HF组和RA组的Bacteroidetes(p＝0.0132)、Cyanobacteria(p＝2.63E-08)、Synergistetes(p＝0.0102)和Verrucomicrobia(p＝0.0075)存在显著差异。
而在属分类水平下对HF组和RA组的肠道菌群进行筛选，共得到159个细菌属，参考图2，其中，A是在属分类水平下，HF组和RA组的不同个体所检出的不同肠道微生物的堆积柱形图；B是A中各个菌属的肠道微生物在两组样本中检出的比例；C是B中各个菌属在两组样本中检出的比例的堆积柱形图。如图2所示，Faecalibacterium、Bacteroides、Escherichia-Shigella、Blautia、Prevotella_9、Bifidobacterium、Subdoligranulum、Agathobacter、Akke rmansia、Streptococcus是HF组和RA组的主要成分。在159个细菌属中，其中有62个细菌属在RA组中含量减少，包括g_uncultured_bacterium_f_Prevotellaceae、g_Prevotella、g_Faec alibacterium、g_Bifidobacterium、g_Bacteroides、g_Ruminococcus_1、g_Ruminococcaceae_UC G-002、g_Lachnospiraceae_UCG-001和g_Fusobacterium等；而97个细菌属在RA组的含量增加，包括g_Lactobacillus、g_Streptococcus、g_Akkermansia、g_Blautia和g_Eggerthella等。另外，筛选到43个细菌属在HF组与RA组的含量存在显著差异(p＜0.05)。
采用LEfSe方法，以LDA评分>4为筛选标准，筛选出HF组与RA组间差异显著的生物标志物，结果如图3所示。其中，A是分支图，从内侧到外侧的圆圈代表了从门到种的分类水平，每个小圆圈的直径与肠道微生物群的相对丰度成正比；B是从中筛选的显著差异的肠道菌群成分丰度的柱状图。从图中可以看出，从门到种分类水平，HF组和RA组共检测出20种显著不同的肠道菌群成分。在这些成分中，p_Verrucomicrobia、c_Verrucomicrobiae、c_Bacilli、o_Verrucomicrobiales、o_Lactobacillales、f_Streptococcaceae、f_Akkermansiaceae、g_Blautia、g_Akkermansia、g_Streptococcus、s_uncultured_bacterium_g_Blautia、s_uncultured_bacterium_g_Akkermansia和s_uncultured_bacterium_g_Streptococcus在RA组的含量较丰富，而p_Bacteroidetes、c_Bacteroidia、o_Bacteroidales、f_Ruminococcaceae、f_Prevotellaceae、g_Faecalibacterium和s_uncultured_bacterium_g_Faecalibacterium在HF组中的含量较丰富。因此，以上筛选出的组间的差异菌群有可能成为RA疾病潜在的生物标志物。
16S rRNA测序结果表明HF组和RA组的肠道菌群存在显著差异，推测肠道微生物的改变可能引起粪便代谢物的改变。进一步采用LC-MS分析，在负离子模式和正离子模式下分别获得279个和1045个代谢物。根据VIP(正交偏最小二乘判别分析OPLS-DA的第一主成分的变量权重)>1和P<0.05筛选条件，负离子模式中获得29个HF组和RA组的差异代谢物，其中3种代谢产物含量减少，26种代谢产物含量增加。在正离子模式下，HF组和RA组共获得45个差异代谢物，其中12种代谢产物含量减少，33种代谢产物含量增加。另外，RA组与HF组相比，部分肽类物质(如Val-Thr-Ile、Ile-Gly-Gly-Ile、Val-Asn-Ile等)、氨基酸类物质(如赖氨酸lysine、蛋氨酸methionine)和核苷酸(如胸腺嘧啶核苷thymidine、脱氧尿苷deoxyuridine、脱氧核苷deoxyinosine、脱氧鸟苷deoxyguanosine等)含量增加；而一些脂质(如LPA(0:0/16:0)、16,16-dimethyl-PGA、1,5-HETE、12(R)-HEPE等)含量减少，如图4所示。
通过MetaboAnalyst网站分析上述差异代谢物富集的途径，结果如图5中的A所示。从图中可以看出，有两条代谢产物显著富集的途径：嘌呤代谢(purine metabolism，p＝0.01，impact value＝0.02)和组氨酸代谢(histidine metabolism，p＝0.02，impactvalue＝0.12)途径。结合图4，代谢产物黄嘌呤(xanthine)、脱氧核苷(deoxyinosine)、脱氧鸟苷(deoxyguanosine)和尿酸(uric acid)在嘌呤代谢通路中被富集出来，而代谢产物尿酸盐(urocanate)和4-咪唑乙酸(4-imidazolaetic acid)在组氨酸代谢通路中被富集出来。该结果表明，肠道微生物的改变可能引起了代谢途径的改变，尤其是核酸代谢和氨基酸代谢。
根据VIP>1.5和FC(RA/HF)>2的筛选标准，得到38种丰度在HF组和RA组之间存在显著差异的代谢物。对显著差异的代谢物与显著差异的肠道菌群进行Spearman相关分析，结果如图5的B所示，从图中可以看出，疣微菌门(p_Verrucomicrobia)和阿克曼菌属(g_Akkermansia)与9,12-十八碳二炔酸(r＝0.54，corrected p-value＝0.01)和10Z壬烯酸(r＝0.54，corrected p-value＝0.03)显著正相关。值得注意的是，其中的两种差异代谢产物都是长链脂肪酸，该结果表明肠道微生物群的改变可能导致长链脂肪酸代谢紊乱，影响RA疾病的发生和发展。
根据上述两种代谢物的水平分别绘制ROC曲线，结果如图5的C和D所示，从图中可以看出，9,12-十八碳二炔酸的ROC曲线的下面积AUC为0.718(p＝0.0043)，10Z壬烯酸的ROC曲线的下面积AUC为0.739(p＝0.0064)，该结果表明采用这两个代谢物预测受试者是否患有类风湿关节炎具有良好的特异性和和灵敏度。另外，HF组和RA组中这两个代谢物的相对丰度的结果见图5的E和F，从图中可以看出，这两个代谢物在RA组的含量显著高于H F组。另外，由于疣微菌门(Verrucomicrobia)和阿克曼菌属(Akkermansia)的微生物于上述两种代谢物存在显著的正相关，因而也可以通过对这两种微生物的含量来间接对受试者的类风湿关节炎的诊断或预后做出有效的判断。
实施例2
本实施例提供一种对受试者风湿性关节炎进行诊断的设备，该设备包括处理器和存储器，存储器上存储有可被处理器运行的计算机程序。运用该设备对受试者进行风湿性关节炎诊断的方法如下：
步骤1：获取受试者的粪便样本中9,12-十八碳二炔酸、10Z壬烯酸、疣微菌门、阿克曼菌属中至少一种标志物的含量。
步骤2：将受试者的含量水平与健康人的设定值比较，如果高出3倍，判定受试者患有类风湿关节炎。
上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (9)

1.定量检测肠道菌群的标志物的试剂在制备用于类风湿关节炎的诊断和/或预后的产品中的应用，其特征在于，所述标志物选自以下a和b中四种中的至少一种：
a.代谢物：9,12-十八碳二炔酸、10Z壬烯酸；
b.微生物：疣微菌门(Verrucomicrobia)、阿克曼菌属(Akkermansia)。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述标志物来源于粪便样本。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括所述标志物的提取试剂。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂通过核磁共振法、色谱法、光谱法、质谱法、PCR、测序、抗体-抗原反应对所述标志物进行定量检测。
5.类风湿关节炎的诊断和/或预后的试剂盒，其特征在于，包括定量检测肠道菌群的标志物的试剂，所述标志物选自以下a和b中四种中的至少一种：
a.代谢物：9,12-十八碳二炔酸、10Z壬烯酸；
b.微生物：疣微菌门(Verrucomicrobia)、阿克曼菌属(Akkermansia)。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为粪便检测试剂盒。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括所述标志物的提取试剂。
8.计算机可读存储介质，其特征在于，所述计算机可读存储介质存储有计算机可执行指令，所述计算机可执行指令用于使计算机执行以下操作：
步骤1：获取来自受试者的样本中的标志物的水平，所述标志物选自以下a和b中四种中的至少一种：
a.代谢物：9,12-十八碳二炔酸、10Z壬烯酸；
b.微生物：疣微菌门(Verrucomicrobia)、阿克曼菌属(Akkermansia)；
步骤2：将所述标志物的水平与设定值比较，根据比较结果对所述受试者进行类风湿关节炎的诊断或预后判断。
9.电子设备，其特征在于，包括处理器和存储器，所述存储器上存储有可在处理器上运行的计算机程序，所述处理器在运行所述计算机程序时实现以下操作：
步骤1：获取来自受试者的样本中的标志物的水平，所述标志物选自以下a和b中四种中的至少一种：
a.代谢物：9,12-十八碳二炔酸、10Z壬烯酸；
b.微生物：疣微菌门(Verrucomicrobia)、阿克曼菌属(Akkermansia)；
步骤2：将所述标志物的水平与设定值比较，根据比较结果对所述受试者进行类风湿关节炎的诊断或预后判断。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN115097044A (zh) * 2022-06-30 2022-09-23 山西中医药大学 粪菌移植通过肠道菌群干预类风湿关节炎模型的构建方法

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CN112080561A (zh) * 2020-08-18 2020-12-15 安徽农业大学 一种牛子宫内膜炎的微生物标志物及其应用

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