CN111487338B - 一种与肾功能相关的无创生物标记物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种与肾功能相关的无创生物标记物及其应用，涉及生物标记物及其应用技术领域，所述生物标记物包括壬二酸，其浓度与糖尿病急慢性肾功能恶化呈负相关，通过一定方法和评价标准，利用本发明提供的生物标记物评价检测目标人群的肾功能水平，与现有的肾功能检测方法相比，具有无创、成本低、操作简单、准确率高、受疾病以外因素影响小等优点，适宜用于临床检测。

Description

一种与肾功能相关的无创生物标记物及其应用

技术领域

本发明涉及生物标记物及其应用，具体涉及一种与肾功能相关的无创生物标记物在糖尿病患者肾功能检测方面的应用。

背景技术

急性肾损伤(AKI)是冠状动脉旁路移植术(CABG)等心脏手术后最重要的并发症之一，特别是糖尿病患者。AKI导致肾脏滤过功能受损伤，代谢废物在循环中累积增加。AKI的定义肾功能在短期内出现损害，时间不超过三个月。包括可以通过血液的肾功能、尿常规、影像学改变等，进行诊断或者判断。目前定义为AKI的血肌酐升高绝对值，大于26.5mmol/L或者是0.3mg/dl或者是血肌酐值升高，较以前大于基础值的50％，或者尿量明显减少，尿量每小时每公斤体重少于0.5ml，而且时间超过6小时。肾功能的最准确的评估方式是测量的肾小球滤过率(GFR)，但测量肾小球滤过率需要使用菊粉、碘酞酸酯、碘海醇等理想的滤过标记物，该检测整体成本过高、操作过于复杂，会增加患者和检测人员的负担，不适宜大范围临床应用。因此，目前血清肌酐的检测被用于估算GFR，然而，该指标的使用存在缺陷：现有的生物标记通过方程预测GFR，结果往往偏高或偏低；一些血液提取物生物标签属于有创检测，对患者造成伤害，同时对样本保藏、检测要求偏高；现有生物标记例如血清肌酐对GFR的检测，收到过多因素的影响，如饮食、药物等，或受到个体之间参数可变性，导致预测结果不准确；现有生物标记例如尿白蛋白等不够灵敏，不能做到早发现、早干预、早治疗；实践表明，在现有的检测方法下，患者个体在一些情况下会出现检测假阴性或假阳性，从而造成误诊，贻误治疗时机或被错误治疗，造成不必要的损失和伤害。

截至2017年，全球约有4.51亿成年人患有糖尿病。44.4％的2型糖尿病(T2DM)将在30年内发展为糖尿病肾病(DN)。DN是目前最常见的终末期肾病(ESRD)。微量白蛋白尿作为DN目前重要诊断指标和疾病进展的危险因素，其敏感性和特异性存在一定限制，同时，还存在上述检测mGFR的其他生物标记的一些缺点。

发明内容

为解决上述的，现有与肾功能相关的生物标记用于检测肾功能时普遍存在的有创、成本过高、过高的假阴性/假阳性率等问题，本发明提供了一种无创的、灵敏性高的与肾功能相关的生物标记物及其使用方法。

首先，本发明提供一种与肾功能相关的无创生物标记，所述无创生物标记为壬二酸(Azelaic acid)，其浓度与糖尿病急慢性肾功能恶化呈负相关。

第二，本发明提供上述与肾功能相关的无创生物标记物在制备用于评价监测对象肾功能的试剂或试剂盒中的应用。

上述应用具体为：1)从检测对象尿液样品中分离出所述无创生物标记物；2)计算检测对象尿液样品中所述无创生物标记物的浓度；3)将该浓度与检测对象肾功能参考水平进行比较，来评价检测对象肾功能的水平。

上述步骤1)、步骤2)中所述对象尿液样品，包括时间点b采集自检测对象的样品b。

优选地，上述步骤1)、步骤2)中所述检测对象尿液样品，还可以包括时间点a采集自检测对象的样品a。

上述步骤3)中所述比较，具体为：设时间点b采集的样品b为待评价样品，得到的样品b中所述无创生物标记的浓度为浓度b；样品a中所述无创生物标记的浓度为浓度a；另外设无创生物标记的肾功能参考范围为水平m，设无创生物标记的AKI阳性参考水平为水平y，设无创生物标记的AKI阴性参考水平为水平n；所述无创生物标记的肾功能参考水平包括上述浓度a、水平m、水平y、水平n中的一种以上。

优选地，上述时间点a在时间点b之前，为时间点b的检测对象肾功能自身对比时间点，即检测对象肾功能参考水平之一。

优选地，上述与肾功能相关的无创生物标记，还包括反式4-羟基-L-脯氨酸(Trans-4-Hydroxy-L-Proline)。

优选地，上述与肾功能相关的无创生物标记，还包括尿苷三磷酸(Uridinetriphosphate)、对氨基苯甲酸酯(P-Aminobenzoate)、咖啡酸(Caffeic acid)、肾上腺素红(Adrenochrome)中的一种以上。

优选地，上述与肾功能相关的无创生物标记，还包括δ-戊内酰胺(δ-Valerolactam)、L-正亮氨酸(L-Norleucine)、5-脱氧-5-甲硫腺苷(5'-Deoxy-5'-(Methylthio)Adenosine)中的一种以上。

有益效果

现有与肾功能相关的生物标记物用于检测肾功能的效果相比，本发明提供的无创生物标记及其应用，全程无创，对患者伤害小、生物标记分离简单、成本低、假阳性/假阴性率低、灵敏性高，并且可以通过多项对比综合评价检测对象的肾功能，结果客观真实。并且，通过对比水平的选取，可直接评价检测对象的肾功能，或选择患者自身不同时间点水平对比，实现对患者肾功能的动态监控，从而判断疾病进展。糖尿病肾病(DN)是目前最常见的终末期肾病病因，而其现有检测手段均存在一定限制。糖尿病患者肾脏对缺血缺氧敏感，易感AKI，我们以此作为观察糖尿病患者肾脏损伤动态进展的切入点，从代谢组学角度发现糖尿病患者急、慢性肾脏损伤的标志物，并且将糖尿病肾病急性及慢性进展相联系，从而从更微观、动态的角度监测甚至干预糖尿病肾病的早期进展。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书、权利要求书中所特别指出的配方和制备方法来实现和获得。

下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为实施例1所述标准曲线；

图2为实施例2所述标准曲线；

图3为各组患者尿Azelaic acid浓度水平；

图4为尿Azelaic acid与eGFR相关性分析；

图5为尿Azelaic acid的ROC分析；

图6为各组患者尿Trans-4-Hydroxy-L-Proline浓度水平；

图7为尿Trans-4-Hydroxy-L-Proline的ROC分析。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

缩写：

2型糖尿病(T2DM)；

糖尿病肾病(DN)；

终末期肾病(ESRD)；

冠状动脉旁路移植术(CABG)；

慢性肾脏病(CKD)；

急性肾损伤(AKI)；

肾小球滤过率估算值(eGFR)。

检测对象的选择和取样：

以下叙述中，n代表样本数。

2018年1月至2019年8月在中南大学湘雅二医院行CABG手术的T2DM患者被纳入研究，并根据纳入及排除标准进行筛选。纳入标准如下：(1)T2DM合并正常白蛋白尿；(2)年龄介于30-75岁；(3)eGFR>60mL/min/1.73m²；排除标准：(1)1型糖尿病(WHO标准)；(2)其他病因引起的CKD；(3)术前即存在AKI；(4)泌尿系统或者其他系统的急慢性炎症；(5)合并可能影响生存的疾病或合并其他全身性疾病(包括但不限于恶性肿瘤、严重心力衰竭、血液系统疾病、自身免疫性疾病、癌症、艾滋病等)；(6)临床资料不足的患者。

于2019年2月至2019年8月，尿液标本也收集于早期DN患者(DN-micro组，n＝46)和显性DN患者(DN-macro组，n＝34)，并同上述部分NAKI组及AKI组患者一同纳入验证队列。入选标准如下：(1)年龄介于30～75岁；(2)eGFR>30mL/min/1.73m²；(3)T2DM病程>5年。排除标准为：(1)其他病因引起的CKD；(2)三个月内AKI病史；(3)泌尿系统或者其他系统的急慢性炎症；(4)合并可能影响生存的其他疾病或者合并其他全身性疾病；(5)临床资料不足的患者。

CAGB术前1天收集的T2DM患者尿液样本命名为A组，术后24小时在ICU收集患者导尿管中的尿液标本命名为B组。根据术后是否发生AKI，将患者分为AKI组(命名为AKI组，n＝44)和非AKI组(命名为NAKI组，n＝44)。各组患者均有术前及术后尿液标本，故AKI组可进一步分为AKI-A组和AKI-B组，NAKI组可分为NAKI-A组和NAKI-B组。所有AKI和NAKI组患者均无需透析，也未发生死亡事件。此处术前采集样本时间为时间点a，术后采集样本时间为时间点b。所有尿液样本均收集于无菌试管中，收集后立即置于冰上。通过离心(2000rpm，4℃，12分钟)除去样品中的细胞碎片。将上清液冷冻保存于-80℃冰箱，并集中提取分析。本研究采用的所有方法均经中南大学湘雅二医院伦理委员会批准。研究对象在研究前均签署书面知情同意。在CABG术前和术后24小时内分别采集患者的尿液样本。选取其中38例NAKI患者(AKI组)和38例非AKI患者(NAKI组)的CABG术前后尿液样本，46例DN-micro组患者和34例DN-macro患者的尿液样本被用于评价目标生物标记物与肾功能水平的关系。

记录每个研究对象的性别、年龄、身体质量指数(BMI)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、糖尿病病程、空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、血清肌酐(Scr)、尿酸(UA)、血尿素氮(BUN)、尿NGAL和UAER。所有研究对象的临床特征总结于表1。年龄、性别、糖尿病病程、BMI、空腹血糖、糖化血红蛋白在四组间无明显差异。DN-macro组SBP、TG、UAER明显高于其他三组(p<0.001)。AKI组肾功能(BUN、Scr、eGFR)最差，其次为DN-macro组、DN micro组、NAKI组(p<0.001)。

表1研究对象临床特征表

上述相关诊断标准为：

T2DM根据世卫组织标准诊断。尿白蛋白排泄率(UAER)<30mg/天为正常白蛋白尿，UAER介于30-300mg/天为微量白蛋白尿，大量白蛋白尿为UAER>300mg/天。T2DM合并微量白蛋白尿(DN-micro)为早期糖尿病肾病，T2DM合并大量白蛋白尿(DN-macro)被定义为显性糖尿病肾病。术后48小时内血清肌酐绝对值较基线水平增加大于0.3mg/dL(26μmol/L)或术后7天内血清肌酐增加大于基线值50％，则认为术后AKI发生。慢性肾脏疾病(CKD)的定义遵循K/DOQI指南，CKD根据肾小球滤过率(eGFR)进行分期。eGFR利用MDRD公式进行计算。

数据分析方法：

所有结果均使用SPSS 23.0软件系统进行统计处理，用Graphpad Prim 7.0软件系统进行图表绘制。连续变量用均数±标准差表示，采用独立样本T检验，wilcox秩和检验，单因素方差分析或受试者工作曲线(ROC)进行比较分析。分类变量用百分数(％)表示，采用方差分析或Fish精确检验进行比较分析。P<0.05认为差异具有统计学意义。

我们利用主成分分析(PCA)，偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)，正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)，载荷图，T检验和单因素方差分析判断组间代谢物(生物标记)的显著差异。模型变量的变量权重值(VIP)可以衡量各代谢物(生物标记)积累差异对各组样本分类判别的影响强度和解释能力。我们结合多元统计分析OPLS-DA的VIP值和单变量统计分析T检验P值来判断不同比较组间代谢物(生物标记)的显著差异。显著差异的阈值为：VIP≥1且T-test P<0.05。在找到代谢物之后，对差异代谢物通过KEGG进行代谢物通路富集分析，可比较分析比较组间差异代谢物参与的最主要生化代谢通路和信号转导通路，有助于通路功能的研究。KEGG是有关Pathway的主要公共数据库，不仅包含基因信息，还包含了代谢物信息。对计算出的p值进行FDR校正，以FDR≤0.05为阈值。

实施例1与肾功能相关的无创生物标记Azelaic acid在评价检测对象肾功能中的应用：

1)从检测对象尿液样品中分离出所述无创生物标记：

(1)首先按照如下方案处理尿液标本：样本于冰上缓慢解冻；取100μL样本于1.5mL离心管中，加300μL甲醇，涡旋30s混匀；-40℃静置1h，涡旋30s，4℃静置0.5h；于4℃，12000rpm下离心15min；取全部上清于离心管中，-40℃静置1h；于4℃，12000rpm下离心15min；移取200μL上清，转入进样小瓶中。(2)仪器参数参照如下：仪器：液相色谱WatersAcquity UPLC；质谱：AB API5500 QQQ–MS；色谱柱：ACQUITY UPLC BEH T3(100*2.1mm 1.7μm)；UPLC-QQQ MS方法：色谱分离条件(柱温：40℃，流速：0.35mL/min)，流动相组成(A-0.02％甲酸溶液(20mM甲酸铵)，B-乙腈)，Post Time(5min)，进样量(4μL)，进入样本梯度洗脱程序；质谱条件：气帘气(Curtain Gas，35arb)，碰撞气(Collision GAS，7arb)，离子喷雾电压(IonSpray voltage，负离子5500V)，离子源温度(Temperature，550℃)，离子源气体(IonSource Gas1，55arb)，离子源气体(IonSource Gas2，55arb)；MRM采集参数：按照上述色谱及质谱条件，将配制好的标准品溶液加入进样瓶中，进样，确定Rt＝2.53(min)处的峰为Azelaic acid；

2)计算检测对象尿液样品中所述无创生物标记的浓度：

(1)建立标准曲线：将Azelaic acid标准品溶液分别稀释得到浓度为2000ng/mL，1000ng/mL，500ng/mL，200ng/mL，100ng/mL，50ng/mL，20ng/mL的工作液。以Azelaic acid标准品的浓度ng/mL为横坐标，面积为纵坐标，进行线性回归并绘制标准曲线。线性方程：y＝6888.3x+311038，R²＝0.9967(2)将步骤1)中得到的峰面积带入标准曲线方程，得到进样中Azelaic acid浓度，根据分离步骤中的处理方式，进一步计算得到尿液样品中的Azelaicacid浓度。

3)将该浓度与所述无创生物标记的肾功能参考水平进行比较，来评价检测对象肾功能：

评价标准：将检测对象的术后样本B分别与其术前样本A和DN-micro组、DN-macro组样本中的Azelaic acid浓度做对比，尿液样品中Azelaic acid浓度越低，该样品采样时间点当前，该患者的肾功能越差/越恶化。

验证：将判定结果对应到检测对象实际情况(用现有诊断标准确定的情况)，准确率为100％。说明：Azelaic acid在NAKI组和DN-micro表达最高,其次是DN-macro组，而AKI组浓度最低(p<0.0001,图3)。验证队列中Azelaic acid浓度与eGFR水平呈正相关(p<0.0001)，Pearson相关系数为0.699(图4)。NAKI组与AKI组间Azelaic acid的AUC为0.860(P<0.0001,95％CI 0.770-0.949)，DN-micro组和DN-macro组间的Azelaic acid的AUC为0.754(P＝0.0001,95％CI0.648-0.860)(图5)。这些数据提示尿Azelaic acid的丰度随糖尿病患者急性或慢性肾功能恶化而下降。

实施例2与肾功能相关的无创生物标记Trans-4-hydroxy-L-proline在评价检测对象肾功能中的应用：

1)从检测对象尿液样品中分离出所述无创生物标记：

(1)首先按照如下方案处理尿液标本：样本于冰上缓慢解冻；取100μL样本于1.5mL离心管中，加300μL甲醇，涡旋30s混匀；-40℃静置1h，涡旋30s，4℃静置0.5h；于4℃，12000rpm下离心15min；取全部上清于离心管中，-40℃静置1h；于4℃，12000rpm下离心15min；移取200μL上清，转入进样小瓶中。(2)仪器参数参照如下：仪器：液相色谱WatersAcquity UPLC；质谱：AB API5500 QQQ–MS；色谱柱：ACQUITY UPLC BEH T3(100*2.1mm 1.7μm)；UPLC-QQQ MS方法：色谱分离条件(柱温：40℃，流速：0.35mL/min)，流动相组成(A-0.02％甲酸溶液(20mM甲酸铵)，B-乙腈)，Post Time(5min)，进样量(4μL)，进入样本梯度洗脱程序；质谱条件：气帘气(Curtain Gas，35arb)，碰撞气(Collision GAS，7arb)，离子喷雾电压(IonSpray voltage，负离子5500V)，离子源温度(Temperature，550℃)，离子源气体(IonSource Gas1，55arb)，离子源气体(IonSource Gas2，55arb)；MRM采集参数：按照上述色谱及质谱条件，将配制好的标准品溶液加入进样瓶中，进样，确定Rt＝0.68(min)处的峰为Trans-4-hydroxy-L-proline；

2)计算检测对象尿液样品中所述无创生物标记的浓度：

(1)建立标准曲线：将Trans-4-hydroxy-L-proline标准品溶液分别稀释得到浓度为500ng/mL，200ng/mL，100ng/mL，50ng/mL，20ng/mL,10ng/mL的工作液。以Trans-4-hydroxy-L-proline对照品的浓度ng/mL为横坐标，面积为纵坐标，进行线性回归并绘制标准曲线。线性方程：y＝136.32x-686.72R²＝0.9997；(2)将步骤1)中得到的峰面积带入标准曲线方程，得到进样中Trans-4-hydroxy-L-proline浓度，根据分离步骤中的处理方式，进一步计算得到尿液样品中的Trans-4-hydroxy-L-proline浓度。

3)将该浓度与所述无创生物标记的肾功能参考水平进行比较，来评价检测对象肾功能：

评价标准：将检测对象的术后样本B分别与DN-micro组、DN-macro组样本中的Trans-4-hydroxy-L-proline浓度做对比，尿液样品中Trans-4-hydroxy-L-proline浓度越高，该样品采样时间点当前，该患者糖尿病肾病进展程度越快。

验证：将判定结果对应到检测对象实际情况(用现有诊断标准确定的情况)，准确率为100％。说明：结果如图6所示，Trans-4-Hydroxy-L-Proline的绝对浓度从NAKI组到AKI组、DN-micro组和DN-macro组呈逐渐增加状态(p<0.0001)。在定量分析结果的基础上，应用ROC曲线探讨这些代谢物的临床诊断潜力。AUC值越接近1.0表明诊断效果越好。如图7所示，AKI与DN-micro组间Trans-4-Hydroxy-L-Proline的AUC为0.722(P＝0.0005,95％CI0.612-0.833)。AKI与DN-macro组间Trans-4-Hydroxy-L-Proline的AUC为0.783(P<0.0001,95％CI 0.669-0.898)。这些数据表明,尿Trans-4-Hydroxy-L-Proline的丰度在T2DM患者急性肾损伤后可升高，且随着肾损伤的进展和DN的发生逐渐增加。

其他实施例：本发明提供的其他与肾功能相关的无创生物标记在评价检测对象肾功能中的应用：

Uridine triphosphate、P-Aminobenzoate,、Caffeic acid、Adrenochrome、δ-Valerolactam、L-Norleucine、5'-Deoxy-5'-(Methylthio)Adenosine分别作为无创生物标记，按实施例1、2方法进行实验，区别在于分别采用适用于自身的不同的色谱保留时间、标准溶液梯度浓度，得到不同的标准曲线。

验证：按实施例1、2相同标准判定检测对象肾功能水平，将判定结果一一对应到相应检测对象实际情况(用现有诊断标准确定的情况)，准确率均为100％。

经实施例验证，本发明提供的与肾功能相关的无创生物标记，可以通过无创的尿液样品分析比对，实现对受检测对象肾功能的评价，准确率高，并且取样前，并未对检测对象的饮食、饮水进行统一规定，因此，检测对象的饮食、饮水情况差异并不会对评价结果的准确性造成影响，方法简单、成本低，可应用于临床。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动在内。

Claims (8)

1.一种与肾功能相关的无创生物标记物在制备用于评价糖尿病患者肾功能的试剂或试剂盒中的应用；

所述无创生物标记物为壬二酸（Azelaicacid），还包括尿苷三磷酸（Uridinetriphosphate）、对氨基苯甲酸酯（P-Aminobenzoate）、咖啡酸（Caffeicacid）、肾上腺素红（Adrenochrome）中的一种以上。

2.根据权利要求1所述的与肾功能相关的无创生物标记物在制备用于评价糖尿病患者肾功能的试剂或试剂盒中的应用，其特征在于：该应用，方法具体为：1）从糖尿病患者尿液样品中分离出所述无创生物标记物；2）计算糖尿病患者尿液样品中所述无创生物标记物的浓度；3）将该浓度与糖尿病患者肾功能参考水平进行比较，来评价糖尿病患者肾功能的水平。

3.根据权利要求2所述的与肾功能相关的无创生物标记物在制备用于评价糖尿病患者肾功能的试剂或试剂盒中的应用，其特征在于：所述步骤1）、步骤2）中所述糖尿病患者尿液样品，包括时间点b采集自糖尿病患者的样品b。

4.根据权利要求3所述与肾功能相关的无创生物标记物在制备用于评价糖尿病患者肾功能的试剂或试剂盒中的应用，其特征在于：所述步骤1）、步骤2）中所述糖尿病患者尿液样品，还包括时间点a采集自糖尿病患者的样品a。

5.根据权利要求4所述的与肾功能相关的无创生物标记物在制备用于评价糖尿病患者肾功能的试剂或试剂盒中的应用，其特征在于：所述步骤3）中的比较，具体为：设时间点b采集的样品b为待评价样品，得到的样品b中所述无创生物标记物的浓度为浓度b；样品a中所述无创生物标记物的浓度为浓度a；另外设无创生物标记物的肾功能参考范围为水平m，设无创生物标记物的AKI阳性参考水平为水平y，设无创生物标记物的AKI阴性参考水平为水平n；所述无创生物标记物的肾功能参考水平包括上述浓度a、水平m、水平y、水平n中的一种以上。

6.根据权利要求5所述的与肾功能相关的无创生物标记物在制备用于评价糖尿病患者肾功能的试剂或试剂盒中的应用，其特征在于：所述时间点a在时间点b之前，为时间点b的糖尿病患者肾功能自身对比时间点。

7.根据权利要求6所述的与肾功能相关的无创生物标记物在制备用于评价糖尿病患者肾功能的试剂或试剂盒中的应用，其特征在于：所述与肾功能相关的无创生物标记物，还包括反式4-羟基-L-脯氨酸。

8.根据权利要求6所述的与肾功能相关的无创生物标记物在制备用于评价糖尿病患者肾功能的试剂或试剂盒中的应用，其特征在于：所述与肾功能相关的无创生物标记物，还包括δ-戊内酰胺（δ-Valerolactam）、L-正亮氨酸（L-Norleucine）、5-脱氧-5-甲硫腺苷（5'-Deoxy-5'-(Methylthio)Adenosine）中的一种以上。

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