JP6128631B2 - 糖尿病性腎症鑑別用マーカー及びその用途 - Google Patents
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Description
[1]クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、シトルリン、シンメトリックジメチルアルギニン、キヌレニン、アゼライン酸及びガラクタル酸からなる群より選択される、一の化合物又は二以上の化合物の組合せからなる、糖尿病性腎症鑑別用マーカー。
[2][1]に記載のマーカーの量を指標とした糖尿病性腎症鑑別法。
[3]以下のステップ(1)及び(2)を含む、[2]に記載の鑑別法:
(1)血液サンプル中の前記マーカーを測定するステップ;
(2)測定結果に基づき、糖尿病性腎症の発症の有無及び/又は糖尿病性腎症の病期を判定するステップ。
[4]ステップ(1)の測定にキャピラリー電気泳動−質量分析装置を用いる、[3]に記載の鑑別法。
[5]以下の(a)〜(c)のいずれかの鑑別に用いる、[2]に記載の鑑別法:
(a)糖尿病性腎症無発症と、糖尿病性腎症との鑑別;
(b)糖尿病性腎症無発症と、ミクロアルブミン尿を認める糖尿病性腎症との鑑別;
(c)糖尿病性腎症無発症と、ミクロアルブミン尿を認める糖尿病性腎症と、マクロアルブミン尿を認める糖尿病性腎症との鑑別。
本発明の第1の局面は糖尿病性腎症鑑別用マーカー(以下、「鑑別用マーカー」と略称することがある)に関する。「糖尿病性腎症鑑別用マーカー」とは、糖尿病性腎症を発症している者又は発症し得る者の、病態/病期を反映した識別・特定の指標となる生体分子である。糖尿病性腎症鑑別用マーカーは、糖尿病患者における腎症の発症の有無や病期の判定などに有用である。
m/zが129.067(組成式C5H8N2O2)である血中代謝物(便宜上、「ID17」と呼ぶ)
m/zが156.139(組成式C9H17NO)である血中代謝物(便宜上、「ID51」と呼ぶ)
m/zが158.154(組成式C9H19NO)である血中代謝物(便宜上、「ID52」と呼ぶ)
m/zが243.184である血中代謝物(便宜上、「ID96」と呼ぶ)
m/zが244.106である血中代謝物(便宜上、「ID97」と呼ぶ)
m/zが276.128である血中代謝物(便宜上、「ID114」と呼ぶ)
m/zが302.197である血中代謝物(便宜上、「ID127」と呼ぶ)
m/zが316.213である血中代謝物(便宜上、「ID134」と呼ぶ)
m/zが96.960(組成式H2SO4)である血中代謝物(便宜上、「ID152」と呼ぶ)
m/zが103.014(組成式C2H4N2O3)である血中代謝物(便宜上、「ID158」と呼ぶ)
m/zが149.049(組成式C6H6N4O)である血中代謝物(便宜上、「ID202」と呼ぶ)
(1)クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、シトルリン、SDMA、キヌレニン、アゼライン酸及びガラクタル酸
(2)クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、シトルリン、SDMA、キヌレニン、アゼライン酸、ガラクタル酸
(3)アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、シトルリン、SDMA、キヌレニン、アゼライン酸、ガラクタル酸
(4)クレアチニン、γ−ブチロベタイン、シトルリン、SDMA、キヌレニン、アゼライン酸、ガラクタル酸
(5)クレアチニン、アスパラギン酸、シトルリン、SDMA、キヌレニン、アゼライン酸、ガラクタル酸
(6)クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、SDMA、キヌレニン、アゼライン酸、ガラクタル酸
(7)クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、シトルリン、キヌレニン、アゼライン酸、ガラクタル酸
(8)クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、シトルリン、SDMA、アゼライン酸、ガラクタル酸
(9)クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、シトルリン、SDMA、キヌレニン、ガラクタル酸
(10)クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、シトルリン、SDMA、キヌレニン、アゼライン酸
(11)クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、SDMA、アゼライン酸、ガラクタル酸
(12)クレアチニン、アスパラギン酸、シトルリン、キヌレニン、アゼライン酸、ガラクタル酸
(13)クレアチニン、γ−ブチロベタイン、シトルリン、SDMA、キヌレニン、アゼライン酸
(14)γ−ブチロベタイン、シトルリン、SDMA、キヌレニン、アゼライン酸、ガラクタル酸
(15)クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、SDMA、アゼライン酸
(16)アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、SDMA、アゼライン酸、ガラクタル酸
(17)クレアチニン、シトルリン、SDMA、アゼライン酸、ガラクタル酸
(18)γ−ブチロベタイン、シトルリン、キヌレニン、アゼライン酸、ガラクタル酸
(19)クレアチニン、シトルリン、アゼライン酸、ガラクタル酸
(20)クレアチニン、アスパラギン酸、SDMA、ガラクタル酸
(21)アスパラギン酸、SDMA、アゼライン酸、ガラクタル酸
(22)クレアチニン、アゼライン酸、ガラクタル酸
(23)SDMA、ガラクタル酸
本発明の第2の局面は、本発明の鑑別用マーカーの典型的な用途として、糖尿病性腎症の鑑別法を提供する。本発明の鑑別法は、糖尿病性腎症を発症していない者と発症している者の識別(発症していない者又は発症している者の特定・抽出)、糖尿病性腎症の病態/病期毎の識別(例えば、特定の病態/病期にある者の特定・抽出)等に利用できる。本発明の鑑別法は、例えば、以下の(a)〜(c)のいずれかの鑑別に用いられる。
(a)糖尿病性腎症無発症と、糖尿病性腎症との鑑別
(b)糖尿病性腎症無発症と、ミクロアルブミン尿を認める糖尿病性腎症との鑑別
(c)糖尿病性腎症無発症と、ミクロアルブミン尿を認める糖尿病性腎症と、マクロアルブミン尿を認める糖尿病性腎症との鑑別
(1)血液サンプル中の鑑別用マーカーを測定するステップ
(2)測定結果に基づき、糖尿病性腎症の発症の有無及び/又は糖尿病性腎症の病期を判定するステップ
ステップ(1)では被検者由来の血液サンプルを用意し、その中に存在する鑑別用マーカーを測定する。本明細書において「鑑別用マーカーを測定する」とはサンプル中の鑑別用マーカーの含有量(濃度)を明らかにすることと同義である。被検者は典型的には糖尿病患者又は潜在的糖尿病患者(糖尿病を罹患している可能性のある者)である。但し、それ以外の者を被検者にすることも可能である。
ステップ(2)では、測定結果に基づき、糖尿病性腎症の発症の有無及び/又は糖尿病性腎症の病期を判定する。判定に用いる基準値やカットオフ値は、使用するサンプルの種類や状態、鑑別の対象、要求される精度(信頼度)などを考慮して決定すればよい。例えば、糖尿病性腎症の発症の有無を判定する場合には、糖尿病性腎症を発症していない者(無症状患者)の血中の鑑別用マーカー量(基準値)を予め測定し、決定しておく。そして、被検者の血中の鑑別用マーカー量が当該基準値と有意な差を示したとき、糖尿病性腎症を発症していると判定できる。糖尿病性腎症の病期(ステージ)についても同様に判定することができる。尚、基準値は特定の量又は特定の量の範囲として設定される。
測定値<a:糖尿病性腎症を発症している可能性は80%より大きい
a≦測定値<b:糖尿病性腎症を発症している可能性は20%〜80%
b<測定値:糖尿病性腎症を発症している可能性は20%未満
この例では3段階に区分したが、区分数は任意に設定できる。区分数の例は2〜10、好ましくは2〜5である。
(1)γ−ブチロベタイン、SDMA、ID114、ID127及びアゼライン酸の組合せを鑑別マーカーとした場合の罹患確率の算出
5個の血中代謝物(γ−ブチロベタイン、SDMA、ID114、ID127及びアゼライン酸)についての多重ロジスティック回帰分析の結果を図7に示した。糖尿病性腎症を発症していない(DM)確率をpとすると、糖尿病性腎症(DN)である確率は1-pとなり、ROC計算式は以下の通りである。
log(p/(1-p))=0.309-92.3×γ−ブチロベタイン-6.12×102×SDMA+8.79×102×ID114+44.0×ID 127-2.4×102×アゼライン酸
4個の血中代謝物(アスパラギン酸、SDMA、アゼライン酸及びガラクタル酸)についての多重ロジスティック回帰分析の結果を図9に示した。これらの代謝物を鑑別用マーカーとした場合、糖尿病性腎症を発症していない(DM)確率pと糖尿病性腎症(DN)である確率1-pは、(1)の場合と同様に以下のROC計算式によって算出できる。
log(p/(1-p))=1.58-22.4×アスパラギン酸-3.07×102×SDMA+39.7×アゼライン酸+74.9×ガラクタル酸
1.方法
(1)サンプルの採取
中部ろうさい病院(愛知県)に通院もしくは入院している患者の内、同意の得られた糖尿病性腎症の病期(ステージ)の異なるサンプル(無発症患者20名、ミクロアルブミン尿期32名、およびマクロアルブミン尿期26名)、計78名の血清を採取した。患者の背景を図1に示す。
血漿サンプル50μLに内部標準入りのメタノールを450μL加え攪拌後、さらにクロロホルム500μL、純水200μLを加えよく攪拌した。攪拌後、4℃、5,000 rpmで5分間遠心分離し、分離した水相600μLを分画分子量5 kDaの限外ろ過フィルターを用いて除タンパクした。ろ液を遠心乾固した後、純水50μLで再溶解し、CE-MS分析に供した。
CE-TOFMSを用いて、糖尿病性腎症無発症患者、ミクロアルブミン尿期の患者、およびマクロアルブミン尿期の患者の血清サンプル中の代謝物質を網羅的に測定した。
(a)キャピラリー電気泳動(CE)の分析条件
キャピラリーにはフューズドシリカキャピラリー(内径50μm、外径350μm、全長100 cm)を用いた。緩衝液には1 Mギ酸(pH約1.8)を用いた。印加電圧は+30 kV、キャピラリー温度は20℃で測定した。試料は、加圧法を用いて50 mbarで3秒間注入した。
正イオンモードを用い、イオン化電圧は4 kV、フラグメンター電圧は75 V、スキマー電圧は50 V、OctRFV電圧は125 Vに設定した。乾燥ガスには窒素を使用し、温度300℃、圧力10 psigに設定した。シース液は50%メタノール溶液を用い、質量較正用にヘキサキス(2,2-ジフルオロトキシ)フォスファゼンを0.1μMとなるよう混入し10μL/minで送液した。ヘキサキス(2,2-ジフルオロトキシ)フォスファゼン(m/z 622.0290)とメタノールの二量体のアイソトープ(m/z 66.0632)の質量数を用いて、得られた全てのデータを自動較正した。
(a)キャピラリー電気泳動(CE)の分析条件
キャピラリーにはCOSMO(+)キャピラリー(内径50μm、外径350μm、全長100cm)を用いた。緩衝液には50 mM酢酸アンモニウム(pH 8.5)を用いた。印加電圧は-30kV、キャピラリー温度は20℃で測定した。試料は、加圧法を用いて50mbarで30秒間注入した。
負イオンモードを用い、イオン化電圧は3.5 kV、フラグメンター電圧は100 V、スキマー電圧は50 V、OctRFV電圧は200 Vに設定した。乾燥ガスには窒素を使用し、温度300℃、圧力10 psigに設定した。シース液は5 mM酢酸アンモニウムを含む50%メタノール溶液を用い、質量較正用にヘキサキス(2,2-ジフルオロトキシ)フォスファゼンを0.1μMとなるよう混入し10 μL/minで送液した。レゼルピンの酢酸付加イオン(m/z 680.0355)と酢酸の二量体のアイソトープ(m/z 120.0384)の質量数を用いて、得られた全てのデータを自動較正した。
バイアスを除くために、内部標準に対する相対ピークエリア(Relエリア)を統計処理に用いた。データ解析にはGraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA)を使用した。Kruskal-Wallis検定及びダン検定(Dunn's post test)によって、糖尿病性腎症無発症患者、ミクロアルブミン尿期の患者、およびマクロアルブミン尿期の患者の間の統計的有意差を評価した。また、スピアマンの順位相関検定(Spearman’s rank correlation test)を用いてUACR、eGFR及び各代謝物の相対ピークエリア(Relエリア)の相関を調べた。多重ロジスティック回帰モデル(MLRモデル)を作成するために二種類の方法を用いた。まず、正規化データを、SIMCA-Pソフトウエア(Version 12.0, Umetrics, Umea, Sweden)を用いたOPLS-DA(orthogonal partial least-squares discriminant analysis)に供してモデルを構築し、糖尿病性腎症無発症患者とマクロアルブミン尿期の患者との鑑別に有効な代謝物を同定することにした。一方、閾値をp<0.25に設定してステップワイズ変数選択法(順方向及び逆方向)を実行した。構築されたMLRモデルの汎化能力はクロスバリデーション法で評価した。ブートストラップ法で楽観的バイアスを排除した。
CE-TOFMSを用いたメタボローム解析によって、糖尿病性腎症患者の血清中から289種の代謝物由来と思われるピークを得た。これらのピークを用いて統計解析を行った結果、糖尿病性腎症の病期の異なるグループ(無症状、ミクロアルブミン尿期、マクロアルブミン尿期)間で有意な差が見られた化合物を19種特定することができた(図2)。これらの内8物質については、標準試薬との比較によって同定することができた。同定された物質はクレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、シトルリン、SDMA、キヌレニン、アゼライン酸、ガラクタル酸であった。
Claims (6)
- 以下の(1)の組合せ、(3)の組合せ、(4)の組合せ、(5)の組合せ、(6)の組合せ、(7)の組合せ、(8)の組合せ、(9)の組合せ、(10)の組合せ、(11)の組合せ、(12)の組合せ、(13)の組合せ、(14)の組合せ、(15)の組合せ、(16)の組合せ、(17)の組合せ、(18)の組合せ、(19)の組合せ、(20)の組合せ、(21)の組合せ、(22)の組合せ、又は(23)の組合せからなる、糖尿病性腎症鑑別用マーカー、
(1)クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、シトルリン、SDMA、キヌレニン、アゼライン酸及びガラクタル酸
(3)アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、シトルリン、SDMA、キヌレニン、アゼライン酸及びガラクタル酸
(4)クレアチニン、γ−ブチロベタイン、シトルリン、SDMA、キヌレニン、アゼライン酸及びガラクタル酸
(5)クレアチニン、アスパラギン酸、シトルリン、SDMA、キヌレニン、アゼライン酸及びガラクタル酸
(6)クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、SDMA、キヌレニン、アゼライン酸及びガラクタル酸
(7)クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、シトルリン、キヌレニン、アゼライン酸及びガラクタル酸
(8)クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、シトルリン、SDMA、アゼライン酸及びガラクタル酸
(9)クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、シトルリン、SDMA、キヌレニン及びガラクタル酸
(10)クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、シトルリン、SDMA、キヌレニン及びアゼライン酸
(11)クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、SDMA、アゼライン酸及びガラクタル酸
(12)クレアチニン、アスパラギン酸、シトルリン、キヌレニン、アゼライン酸及びガラクタル酸
(13)クレアチニン、γ−ブチロベタイン、シトルリン、SDMA、キヌレニン及びアゼライン酸
(14)γ−ブチロベタイン、シトルリン、SDMA、キヌレニン、アゼライン酸及びガラクタル酸
(15)クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、SDMA及びアゼライン酸
(16)アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、SDMA、アゼライン酸及びガラクタル酸
(17)クレアチニン、シトルリン、SDMA、アゼライン酸及びガラクタル酸
(18)γ−ブチロベタイン、シトルリン、キヌレニン、アゼライン酸及びガラクタル酸
(19)クレアチニン、シトルリン、アゼライン酸及びガラクタル酸
(20)クレアチニン、アスパラギン酸、SDMA及びガラクタル酸
(21)アスパラギン酸、SDMA、アゼライン酸及びガラクタル酸
(22)クレアチニン、アゼライン酸及びガラクタル酸
(23)SDMA及びガラクタル酸。 - 以下の(1)の組合せ、(4)の組合せ、(5)の組合せ、(6)の組合せ、(7)の組合せ、(10)の組合せ、(11)の組合せ、(12)の組合せ、又は(16)の組合せからなる、糖尿病性腎症鑑別用マーカー、
(1)クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、シトルリン、SDMA、キヌレニン、アゼライン酸及びガラクタル酸
(4)クレアチニン、γ−ブチロベタイン、シトルリン、SDMA、キヌレニン、アゼライン酸及びガラクタル酸
(5)クレアチニン、アスパラギン酸、シトルリン、SDMA、キヌレニン、アゼライン酸及びガラクタル酸
(6)クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、SDMA、キヌレニン、アゼライン酸及びガラクタル酸
(7)クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、シトルリン、キヌレニン、アゼライン酸及びガラクタル酸
(10)クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、シトルリン、SDMA、キヌレニン及びアゼライン酸
(11)クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、SDMA、アゼライン酸及びガラクタル酸
(12)クレアチニン、アスパラギン酸、シトルリン、キヌレニン、アゼライン酸及びガラクタル酸
(16)アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、SDMA、アゼライン酸及びガラクタル酸。 - 以下の(1)の組合せからなる、糖尿病性腎症鑑別用マーカー、
(1)クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、シトルリン、SDMA、キヌレニン、アゼライン酸及びガラクタル酸。 - 請求項1〜3のいずれか一項に記載のマーカーの量を指標とした、糖尿病性腎症の鑑別を補助する方法であって、以下のステップ(1)及び(2)を含む、方法:
(1)血液サンプル中の前記マーカーを測定するステップ;
(2)クレアチニン、アスパラギン酸、γ−ブチロベタイン、シトルリン、SDMA及びキヌレニンでは血中での量の増加が糖尿病性腎症の発症及び病期の進行の指標となり、アゼライン酸及びガラクタル酸では血中での量の減少が糖尿病性腎症の発症及び病期の進行の指標となるステップ。 - ステップ(1)の測定にキャピラリー電気泳動−質量分析装置を用いる、請求項4に記載の方法。
- 以下の(a)〜(c)のいずれかの鑑別の補助に用いる、請求項4又は5に記載の方法:
(a)糖尿病性腎症無発症と、糖尿病性腎症との鑑別;
(b)糖尿病性腎症無発症と、ミクロアルブミン尿を認める糖尿病性腎症との鑑別;
(c)糖尿病性腎症無発症と、ミクロアルブミン尿を認める糖尿病性腎症と、マクロアルブミン尿を認める糖尿病性腎症との鑑別。
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