WO2020138260A1 - 全身性エリテマトーデスの検出方法 - Google Patents

全身性エリテマトーデスの検出方法 Download PDF

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WO2020138260A1
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didehydro
deoxycytidine
lupus erythematosus
systemic lupus
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明由 平山
朋義 曽我
彰一 丸山
秋山　真一
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学校法人慶應義塾
国立大学法人東海国立大学機構
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    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting or prognosing systemic lupus erythematosus, a biomarker for detecting or prognosing systemic lupus erythematosus, a kit for detecting or prognosing systemic lupus erythematosus, and the like.
  • SLE Systemic lupus erythematosus
  • systemic inflammation such as fever and general malaise and damage to various organs including joints, nervous system, blood, skin, kidneys, digestive tract and lung occur at one time or with progress. SLE often undergoes a chronic course with remissions and exacerbations. Since the type, course, and degree of SLE symptoms vary from patient to patient, diagnosis is more difficult than with other diseases.
  • the nephropathy caused by SLE is called lupus nephritis, and whether or not lupus nephritis develops and the severity of lupus nephritis at the start of treatment are factors that influence the prognosis of SLE patients. Delayed diagnosis of SLE leads to a worse prognosis, so that SLE is an important disease for which early diagnosis and early treatment are important.
  • diagnosis of SLE is made by comprehensively judging a number of factors including the presence or absence of symptoms related to SLE, the presence or absence of antinuclear antibody in blood, etc., and a single definitive index is currently It doesn't exist. Therefore, there is still a need for new detection methods leading to early diagnosis of SLE.
  • nephrotic syndrome is a general term for kidney diseases characterized by large amounts of urinary protein and hypoproteinemia, and its causative diseases include primary glomerular disease, collagen disease, and metabolic diseases. Moreover, the affected age of the disease ranges widely from children to the elderly. The mechanism leading to the onset of nephrotic syndrome is various, and once it occurs, it often prolongs, and many are resistant to treatment.
  • nephrotic syndrome As diagnostic criteria for adult nephrotic syndrome, (i) protein in urine is 3.5 g or more per day, and (ii) albumin concentration in serum is 3.0 g/dL or less. Two points are defined as essential conditions, and (iii) edema and (iv) dyslipidemia are widely used as additional reference conditions.
  • MCNS minimal change nephrotic syndrome
  • MN membranous nephropathy
  • DN diabetic nephropathy
  • focal segmental segmentation focal segmental segmentation.
  • FSGS glomerulosclerosis
  • LN lupus nephritis
  • IgA IgA nephropathy
  • RA amyloid nephropathy
  • renal biopsy is required for definitive diagnosis of nephrotic syndrome and other renal diseases such as nephritis and nephrotic syndrome.
  • renal biopsy is a highly invasive test with a risk of bleeding, it is often not possible to perform renal biopsy in patients whose general condition has deteriorated or elderly patients.
  • a renal biopsy is usually not performed and diagnosis is often made by clinical presumption.
  • a renal biopsy cannot be performed, there is a problem that it is difficult to diagnose a disease, grasp a pathological condition, and select an appropriate treatment method.
  • Patent Document 1 discloses a method of using human megalin in urine as a renal disorder marker
  • Patent Document 2 discloses a combination of specific metabolites such as creatinine and aspartic acid in blood in diabetic kidney. A method for use as a marker for disease discrimination is disclosed.
  • systemic lupus erythematosus preferably lupus nephritis
  • concentration of 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine in urine was not known.
  • An object of the present invention is to detect whether systemic lupus erythematosus (preferably lupus nephritis) can be detected with high accuracy without performing a renal biopsy, or to detect systemic lupus erythematosus (preferably lupus nephritis). To provide biomarkers and the like.
  • deoxycytidine also called ddh-Cytidine or ddh-C
  • ddh-C deoxycytidine
  • the present inventors found that the urine concentration of 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine in healthy subjects was extremely low, and that the urinary concentration of 3',4' in patients with systemic lupus erythematosus without lupus nephritis was high. It has also been confirmed that 4'-didehydro-3'-deoxycytidine is included. From the above, the present inventor has completed the present invention.
  • the present invention is (1) (a) measuring the concentration of 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine in urine collected from a subject; and (b) 3'measured in step (a), Comparing the concentration of 4'-didehydro-3'-deoxycytidine to a reference concentration for control; Including, When the concentration of 3′,4′-didehydro-3′-deoxycytidine measured in the step (a) is higher than the reference concentration for control, it is highly possible that the subject has systemic lupus erythematosus.
  • the concentration of 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine measured in step (a) is 1.2 times or more the reference concentration for control, the subject is systemic
  • the reference concentration for control should be the concentration of 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine in urine collected from a patient with nephrotic syndrome or a healthy person who has a disease type other than lupus nephritis.
  • the detection method according to (1) or (2) above which is characterized by: (4) The detection method according to any one of (1) to (3) above, wherein the subject is a nephrotic syndrome patient and the systemic lupus erythematosus is lupus nephritis; (5) A biomarker consisting of 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine, for detecting systemic lupus erythematosus; (6) The concentration of the biomarker in urine collected from the subject is higher than the concentration of the biomarker in urine collected from a nephrotic syndrome patient with a disease type other than lupus nephritis or a healthy person.
  • systemic lupus erythematosus preferably nephrotic syndrome
  • systemic lupus erythematosus preferably nephrotic syndrome
  • MN membranous nephropathy
  • DN diabetic nephropathy
  • MCNS minimal change nephrotic syndrome
  • LN lupus nephritis
  • RA amyloid nephropathy
  • FSGS focal segmental glomerulosclerosis
  • IgA stands for IgA nephropathy.
  • the bottom of the whiskers represents the 5th percentile of the group's measurements
  • the bottom of the box represents the 25th percentile
  • the divider in the box represents the 50th percentile
  • the top of the box is the 75th percentile.
  • Values, with the top of the whiskers representing the 95th percentile value.
  • the measured value of the sample having a concentration higher than the 95th percentile value and the measured value of the sample having a concentration lower than the 5th percentile value are shown by dots in the graph of FIG. It is a figure which shows the ROC curve created based on the result of FIG.
  • the vertical axis represents "sensitivity" (true positive rate), and the horizontal axis represents "1-specificity" (false positive rate).
  • FIG. 1 It is a figure which shows the tandem mass spectrum by a nuclear magnetic resonance.
  • the left side of the figure shows the spectrum of the synthetic product of 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine ("KAH51-57”), and the right side of the figure shows the spectrum of CU040.
  • the vertical axis represents the CU040 concentration in urine (mg/g Cr), the peak intensity of CU040, and the horizontal axis represents each group.
  • MN membranous nephropathy
  • DN diabetic nephropathy
  • MCNS minimal change nephrotic syndrome
  • RA amyloid nephropathy
  • FSGS focal segmental glomerulosclerosis
  • IgA IgA nephropathy.
  • Health represents a healthy person
  • LN represents lupus nephritis.
  • the bottom of the whiskers represents the 5th percentile of the group's measurements
  • the bottom of the box represents the 25th percentile
  • the divider in the box represents the 50th percentile
  • the top of the box is the 75th percentile. Values, with the top of the whiskers representing the 95th percentile value.
  • /G Cr section "30 ⁇ , ⁇ 40” is 30-40 mg/g Cr section, "40 ⁇ , ⁇ 50” is 40-50 mg/g Cr section, "50 ⁇ , ⁇ 60” Is for 50 to 60 mg/g Cr, “60 ⁇ , ⁇ 70” is for 60 to 70 mg/g Cr, and “70 ⁇ , ⁇ 80” is for 70 to 80 mg/g Cr.
  • ⁇ 90 indicates a group of 80 to 90 mg/g Cr
  • 90 ⁇ , ⁇ 100 indicates a group of 90 to 100 mg/g Cr.
  • ⁇ 10 indicates a group where the CU040 concentration is less than 10 mg/g Cr
  • 10 ⁇ , ⁇ 20 indicates a group of 10 to 20 mg/g Cr
  • 20 ⁇ , ⁇ 30 indicates 20.
  • Sections up to 30 mg/g Cr, and "30 ⁇ ” indicate sections of 30 mg/g Cr or more.
  • the vertical axis represents the proportion (%) of the number of patients who correspond to the ARC standard item among the patients belonging to the CU040 concentration category
  • the horizontal axis represents each item of the ARC standard.
  • the graphs for each item of the ARC standard on the horizontal axis show the results of “ ⁇ 10”, “10 ⁇ ⁇ 20”, “20 ⁇ ⁇ 30”, and “30 ⁇ ” from the left. Show. It is a figure which shows the relationship between CU040 density
  • the vertical axis represents the proportion (%) of the number of patients who belong to the ARC standard item among the patients belonging to the CU040 concentration category, and the horizontal axis represents each item of SLEDAI.
  • the graph in each item of SLEDAI on the horizontal axis shows the result of “ ⁇ 10”, the result of “10 ⁇ ⁇ 20”, the result of “20 ⁇ ⁇ 30”, and the result of “30 ⁇ ” from the left. ..
  • the present invention is [1] (a) measuring the concentration of 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine in urine collected from the subject; and (b) 3'measured in step (a), Comparing the concentration of 4'-didehydro-3'-deoxycytidine to a reference concentration for control; Including, When the concentration of 3′,4′-didehydro-3′-deoxycytidine measured in the step (a) is higher than the reference concentration for control, it is highly possible that the subject has systemic lupus erythematosus.
  • a method for detecting systemic lupus erythematosus (hereinafter, also referred to as “the detection method of the present invention”); [2] A biomarker comprising 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine for detecting systemic lupus erythematosus (hereinafter also referred to as “biomarker for detection of the present invention”); [3] (A) comprising the step of measuring the concentration of 3′,4′-didehydro-3′-deoxycytidine in urine collected from a patient with systemic lupus erythematosus, 3′ measured in the step (A), When the concentration of 4'-didehydro-3'-deoxycytidine is high, a prognosis prediction method for systemic lupus erythematosus that predicts that the prognosis of the systemic lupus erythematosus patient is good (hereinafter also referred to as "prognosis
  • a biomarker consisting of 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine, for predicting the prognosis of patients with systemic lupus erythematosus (hereinafter, also referred to as "biomarker for prognosis of the present invention”).
  • a kit for detecting or prognosing systemic lupus erythematosus which comprises 3′,4′-didehydro-3′-deoxycytidine as an internal standard substance of a mass spectrometer (hereinafter, also referred to as “the kit of the present invention”). indicate.); Etc. are included.
  • concentration means the concentration of 3′,4′-didehydro-3′-deoxycytidine in urine.
  • detecting whether a subject has systemic lupus erythematosus preferably includes “detecting whether the subject has lupus nephritis", and more preferably “Detecting whether the subject has lupus nephritis when the subject is a nephrotic syndrome patient" is included.
  • possibility that the subject has systemic lupus erythematosus preferably includes “possibility that the subject has lupus nephritis”, and more preferably "subject is nephrotic Syndrome patient may have lupus nephritis”.
  • the detection method of the present invention is a method for detecting whether a subject has systemic lupus erythematosus.
  • the detection method of the present invention (A) measuring the concentration of 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine in urine collected from the subject; and (b) 3',4'-measured in step (a). Comparing the concentration of didehydro-3'-deoxycytidine with a reference concentration for control; Including, When the concentration of 3′,4′-didehydro-3′-deoxycytidine measured in step (a) is higher than the reference concentration for control, it is highly possible that the subject has systemic lupus erythematosus.
  • the detection method of the present invention is a method for assisting a doctor in diagnosing a possibility that a subject has systemic lupus erythematosus, and does not include a diagnostic action by the doctor.
  • the biomarker of the present invention is a biomarker for detecting whether a subject has systemic lupus erythematosus.
  • the biomarker of the present invention is not particularly limited as long as it is composed of 3′,4′-didehydro-3′-deoxycytidine and is a biomarker for detecting systemic lupus erythematosus.
  • Such a biomarker has a higher concentration in urine collected from a patient with nephrotic syndrome having lupus nephritis than that in urine collected from a patient with nephrotic syndrome having a disease type other than lupus nephritis.
  • the prognosis prediction method of the present invention is a method of predicting the possibility of remission of a target systemic lupus erythematosus patient after immunosuppressive treatment.
  • the prognostic method of the present invention includes (A) a step of measuring the concentration of 3′,4′-didehydro-3′-deoxycytidine in urine collected from a patient with systemic lupus erythematosus, and the step (A) When the concentration of 3′,4′-didehydro-3′-deoxycytidine measured in 1.
  • the prognosis prediction method of the present invention is a method for assisting a doctor in predicting the likelihood of remission in a patient with systemic lupus erythematosus, and does not include a diagnostic action by the doctor.
  • the biomarker for prognosis of the present invention is a biomarker for predicting the prognosis of patients with systemic lupus erythematosus.
  • the biomarker of the present invention is not particularly limited as long as it is composed of 3′,4′-didehydro-3′-deoxycytidine and is a biomarker for predicting the prognosis of systemic lupus erythematosus patients.
  • Such a prognostic biomarker is present at a higher concentration in urine collected from a patient with systemic lupus erythematosus having a favorable prognosis.
  • systemic lupus erythematosus means a condition corresponding to the diagnostic criteria revised by 1997 by American College of Rheumatology (ACR) or 2012 by systemic lupus international collaborating clinics (SLICC). To do.
  • the SLE diagnostic criteria by ACR described above classify SLE as a state in which four or more of the following items ⁇ 1> to ⁇ 11> are satisfied. However, the appearance times of the symptoms of four or more items do not have to match.
  • the diagnostic criteria by SLICC above are 4 or more items (however, such 4 items are included in the following 17 items (that is, 11 items of clinical criteria and 6 items of immunological criteria below)).
  • the above items include at least one of the immunological criteria); or, if antinuclear antibody or anti-double-stranded DNA antibody is positive and biopsy-proven lupus nephritis is present Is classified as SLE.
  • lupus nephritis refers to a renal disorder associated with systemic lupus erythematosus (SLE).
  • SLE is an autoimmune disease that can affect the entire body, resulting in the formation of immune complexes and tissue damage by complement. The location of tissue damage varies depending on individual cases, and damage may occur to various organs such as the kidney, skin, lungs, and brain.
  • diagnostic criteria for SLE for example, Updating the American College of Rheumatology revised criteria (1997) and The systemic lupus international collaborating clinics classification criteria for systemic lupus erythematosus (2012) are known.
  • ⁇ Lupus nephritis mainly causes glomerulonephritis, but vasculitis and interstitial nephritis may also occur.
  • Lupus nephritis includes micromesangial lupus nephritis, mesangial proliferative lupus nephritis, focal lupus nephritis, diffuse lupus nephritis, membranous lupus nephritis and advanced sclerosing lupus nephritis, especially diffuse lupus nephritis.
  • Symptoms of lupus nephritis include, for example, proteinuria and edema. As lupus nephritis progresses, renal function may decline, leading to renal failure. Diagnosis or classification of lupus nephritis can be based on, for example, the 2003 classification of lupus nephritis by the International Nephrology Society (ISN), or the ACR (American Society for Rheumatology) practice guideline (2012) of lupus nephritis.
  • ISN International Nephrology Society
  • ACR American Society for Rheumatology
  • nephrotic syndrome means that in adults (15 years old or older), (i) urinary protein is 3.5 g or more per day, and (ii) serum albumin concentration is 3 or more. It means a condition of 0.0 g/dL or less, and in children (under 15 years old), (i) 40 mg/hour/m 2 or more in night urine, or urinary protein/creatinine ratio in the first urine when waking up early in the morning. It means 2.0 g/gCr or more, and (ii) the albumin concentration in serum is 2.5 g/dL or less. As nephrotic syndrome in children, the following criteria may be used instead of the above criteria.
  • the amount of protein in urine is 3.5 g or more per day or 0.1 g/kg or more for 3 days or more, or the amount of urine protein in the first urine at early morning is 300 mg/mL or more For more than 3 days, and (ii) Serum total protein amount is 6.0 g/100 mL or less when the age is 1 year or older and less than 15 years old and is 5.5 g/100 mL or less when the age is 1 year or less, and serum albumin amount is 1 year or more but less than 15 years old. It is 3.0 g/100 mL or less, and is 2.5 g/100 mL or less for a person under one year old.
  • the term “subject” is not particularly limited as long as it is a human, such as age, sex, presence or absence of a disease, but it is highly significant to apply the detection method of the present invention, and therefore, the determination of systemic lupus erythematosus is established.
  • Preferable examples include humans who have not been diagnosed and humans who have not been definitely diagnosed with lupus nephritis.
  • the above-mentioned human who does not have a definitive diagnosis of systemic lupus erythematosus is not particularly limited as long as it is a person who does not have a definitive diagnosis of systemic lupus erythematosus.
  • the above-mentioned human who does not have a definite diagnosis of lupus nephritis is not particularly limited as long as it is not a person who does not have a definite diagnosis of lupus nephritis.
  • the step (a) in the detection method of the present invention is not particularly limited as long as it is a step of measuring the concentration of 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine in urine collected from the subject.
  • the concentration of 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine was determined by preparing a urine sample for analysis from urine (that is, a urine sample) collected from a subject.
  • the deoxycytidine can be measured using a known method capable of specifically detecting it, for example, mass spectrometry.
  • Such mass spectrometry is a method in which a urine sample is converted into gaseous ions using an ion source (ionization), and the urine sample is ionized by moving it in a vacuum in an analysis unit by using electromagnetic force or by a flight time difference. It refers to a measurement method that uses a mass spectrometer that can separate and detect according to the charge ratio.
  • methods for ionizing using an ion source include electron ionization (EI) method, chemical ionization (CI) method, and electric field desorption.
  • the desorption ionization (FD) method, the fast atom bombardment (FAB) method, the matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) method, the electrospray ionization (ESI) method and the like can be appropriately selected, and in the analysis unit,
  • a separation method such as a magnetic field deflection type, a quadrupole type, an ion trap type, a time of flight (TOF) type, a Fourier transform ion cyclotron resonance type, or the like can be appropriately selected.
  • tandem mass spectrometry (MS/MS) in which two or more mass spectrometry methods are combined can be used. Separate and purify 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine from contaminants by gas chromatography (GC), liquid chromatography (LC) or high performance liquid chromatography (HPLC) for analysis. You can
  • the concentration of 3′,4′-didehydro-3′-deoxycytidine in urine may be an absolute value or a relative value.
  • the concentration is Examples include relative values based on the known 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine (internal standard) and relative values based on the creatinine content in urine (eg mg/g Cr). ..
  • Step (b) in the detection method of the present invention is not particularly limited as long as it is a step of comparing the concentration of 3′,4′-didehydro-3′-deoxycytidine measured in the step (a) with a reference concentration for control.
  • the “reference concentration for control” is 3′,4′-didehydro-3′-deoxy in urine collected from a person who does not have systemic lupus erythematosus (hereinafter also referred to as “control person”).
  • control person systemic lupus erythematosus
  • a concentration of cytidine can be used.
  • the above-mentioned control person may be any person who is not systemic lupus erythematosus, for example, those who do not have lupus nephritis, healthy people, etc., among them, nephrotic syndrome patients, whose type is not lupus nephritis Patients and healthy persons are preferably mentioned, and among them, patients with nephrotic syndrome and whose type is not lupus nephritis are more preferable.
  • nephrotic syndrome patient the patient whose disease type is not lupus nephritis
  • a nephrotic syndrome patient is a nephrotic syndrome patient, and is not particularly limited as long as it is a patient whose disease type is not lupus nephritis, but of nephrotic syndrome
  • the types are minimal change nephrotic syndrome (MCNS), membranous nephropathy (MN), diabetic nephropathy (DN), focal segmental glomerulosclerosis (FSGS), IgA nephropathy (IgA)
  • Preferable examples include patients having one or two or more types (for example, three or more types, four or more types, five or more types or six types) selected from the group consisting of amyloid nephropathy (RA).
  • the “concentration of 3′,4′-didehydro-3′-deoxycytidine measured in step (a)” and the “reference concentration for control” are: , It is preferable to use a corresponding concentration. Specifically, except that the origin of urine is different, substantially the same measurement method (preparation of urine sample from urine, 3', 4'-didehydro in urine sample) -3′-deoxycytidine concentration measuring method) is preferably used. Further, when using an absolute value as one of the two concentrations, it is preferable to use an absolute value as the other concentration, and when using a relative value as one of the two concentrations, the other is used.
  • a relative value is, when performing the detection method of the present invention, a urine sample for analysis is prepared from urine collected from a control person, and may be measured each time, but the concentration measured in advance is You may use.
  • concentration of 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine in urine collected from a subject eg, 3',4'-didehydro-3'-in urine measured in step (a)
  • concentration in subject concentration of deoxycytidine
  • concentration in the subject is higher than the reference concentration for control, it indicates that the subject is likely to have systemic lupus erythematosus.
  • concentration in the subject is the same as or lower (preferably lower) than the reference concentration for control, it indicates that the subject is unlikely to have systemic lupus erythematosus.
  • a threshold value can be set to determine whether the concentration in the subject is higher than the reference concentration for control.
  • Examples of the threshold include “average value”, “average value+standard deviation (SD)”, “average value+2SD”, “average value+3SD” of concentration in control person; “median value” of concentration in control person, “Median+SD”, “median+2SD”, “median+3SD” and the like can be mentioned.
  • the threshold value is the sensitivity (the rate at which a person with systemic lupus erythematosus (preferably lupus nephritis) can be correctly determined as a positive, preferably the rate at which a person with nephrotic syndrome is lupus nephritis can be correctly determined) and To increase the specificity (the rate at which people who do not have systemic lupus erythematosus (preferably lupus nephritis) can be correctly diagnosed as negative, preferably the rate at which people who do not have lupus nephritis as the nephrotic syndrome type can be correctly diagnosed) In addition, it can also be calculated using a ROC (Receiver Operating Characteristic) curve using statistical analysis software based on the data of “concentration in subject” and the data of “concentration in control person”.
  • ROC Receiveiver Operating Characteristic
  • the subject may have systemic lupus erythematosus (preferably lupus nephritis) (preferably the subject may have lupus nephritis).
  • systemic lupus erythematosus preferably lupus nephritis
  • the concentration in the subject is the reference concentration for control.
  • 1.2 times or more preferably 1.6 times or more, more preferably 2 times or more, further preferably 2.5 times or more, more preferably 3 times or more, further preferably 3.5 times or more. There are some cases.
  • the subject may have systemic lupus erythematosus (preferably lupus nephritis) (preferably the subject's disease type may be lupus nephritis).
  • concentration in the subject is 1.9 mg/g Cr or higher, preferably 2.5 mg/g Cr or higher, more preferably 3 mg/g Cr or higher, and even more preferably 3.
  • the case is 5 mg/g Cr or more, more preferably 4 mg/g Cr or more, and further preferably 5 mg/g Cr or more.
  • the reference concentration for control was 1.9 mg/g Cr, preferably 2.5 mg/g Cr, more preferably 3 mg/g Cr, even more preferably 3.5 mg/g Cr, more preferably 4 mg. /G Cr, and more preferably 5 mg/g Cr is used.
  • the step (A) is not particularly limited as long as it is a step of measuring the concentration of 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine in urine collected from a patient who has already been diagnosed with systemic lupus erythematosus. Although not provided, urine used herein is preferably taken from a patient prior to immunosuppressive therapy. Further, in this step, the concentration of 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine can be measured by a known method similar to the above-mentioned step (a).
  • the concentration of 3′,4′-didehydro-3′-deoxycytidine obtained in the above step (A) is high, it can be predicted that the prognosis is good.
  • “good prognosis” means that systemic symptoms or at least some organ lesions are in remission or in a low disease active state by treatment.
  • the 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine concentration in urine of a patient with systemic lupus erythematosus is 20 mg/g Cr or more, 20 mg/g Cr It can be expected that complete remission is more likely 6 to 24 months after immunosuppressive treatment compared to the following cases.
  • the term “mg/g Cr” means the weight (mg) of the substance (3′,4′-didehydro-3′-deoxycytidine in the present invention) with respect to 1 g of creatinine.
  • the kit of the present invention is not particularly limited as long as it is a kit for detection or prognosis of systemic lupus erythematosus, which comprises 3′,4′-didehydro-3′-deoxycytidine as an internal standard substance of a mass spectrometer, but 3′. ,4'-Didehydro-3'-deoxycytidine is preferably isotopically labeled.
  • isotope labeling include labeling with radioactive isotopes and labeling with elements such as carbon, nitrogen, oxygen and deuterium, with labeling with deuterium being preferred.
  • the kit of the present invention may further include other test reagents, diluents, instructions for use, and the like.
  • the present invention also includes the following embodiments. (A) measuring the concentration of 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine in urine collected from the subject; and (b) 3',4'-measured in step (a).
  • Comparing the concentration of didehydro-3'-deoxycytidine with a reference concentration for control A method of collecting data for detecting (or diagnosing) whether the subject has systemic lupus erythematosus (preferably lupus nephritis); (A) measuring the concentration of 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine in urine collected from the subject; and (b) 3',4'-measured in step (a).
  • Comparing the concentration of didehydro-3'-deoxycytidine with a reference concentration for control A method for assisting the diagnosis of whether the subject has systemic lupus erythematosus (preferably lupus nephritis), wherein the method does not include a diagnostic action by a doctor; (A) measuring the concentration of 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine in urine collected from the subject; and (b) 3',4'-measured in step (a).
  • systemic lupus erythematosus preferably lupus nephritis
  • the concentration of urine samples differs relatively greatly due to the timing of collection and individual differences. Therefore, in order to search biomarkers in urine more accurately, the concentration of each urine sample was corrected by the concentration of creatinine in urine. Specifically, the amount of creatinine in each urine sample was quantified by a known enzyme method, and based on the result, each urine sample was treated with water so that the final concentration of creatinine in each urine sample was 10 mg/dL. Diluted. The diluted urine sample was subjected to mass spectrometry described below.
  • Table 2 shows the minimum relative concentration of CU040 in each of the seven types of nephrotic syndrome, 5th percentile, 25th percentile, 50th percentile (median), 75th percentile, 95th percentile, and maximum.
  • FIG. 1 is a box-and-whisker diagram showing these values.
  • the relative concentration of peak ID “CU040” (3′,4′-didehydro-3′-deoxycytidine) was found to be lupus nephritis (LN) among seven types of nephrotic syndrome. It showed a high value only in. For example, when compared at the 50th percentile value, the relative concentration in the lupus nephritis disease type was at least 3.56 times or more that of the other disease types.
  • the cutoff value of the relative concentration of CU040 was set to 18.398 to distinguish the lupus nephritis group, which is one of the nephrotic syndrome types, from the other 6 types of nephrotic syndrome groups, .
  • the cutoff value of the relative concentration of CU040 was set to 18.398 to distinguish the lupus nephritis group, which is one of the nephrotic syndrome types, from the other 6 types of nephrotic syndrome groups, Among the patients with nephrotic syndrome, those who are patients with lupus nephritis, sensitivity (that is, the proportion of those who test positive among patients with lupus nephritis) and specificity (those with nephrotic syndrome who are not patients with lupus nephritis) The percentage of those who tested negative) were 0.7037 (70.37%) and 0.9717 (97.17%), respectively.
  • lupus nephritis is a renal disorder caused by systemic lupus erythematosus
  • the subject may have lupus nephritis depending on the above-mentioned 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine concentration. It was also shown that the possibility of sexual lupus erythematosus can be detected with high accuracy.
  • the peak ID “CU040” was an unknown peak because there was no corresponding standard reagent at the beginning of the measurement.
  • To identify the substance at this peak several liters of urine was collected from a patient with systemic lupus erythematosus without lupus nephritis by collecting urine, and metabolites were collected by preparative liquid chromatography, and the substance was identified by nuclear magnetic resonance. I decided to try.
  • Table 4 shows the minimum concentration of CU040 in each of the seven types of disease types and healthy controls, the 10th percentile, 25th percentile, 50th percentile (median), 75th percentile, 90th percentile, and maximum.
  • FIG. 4 shows a diagram in which those values are represented by a dot blot and a box plot.
  • the concentration of CU040 (3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine) in urine samples in lupus nephritis group and the concentration of CU040 in urine samples in 6 types of disease groups other than lupus nephritis and healthy controls When the ROC curve was created based on this, the AUC value was 0.927, which was a high value (FIG. 5).
  • FIG. 4 and FIG. 5 show the concentration of 3′,4′-didehydro-3′-deoxycytidine in urine collected from subjects (whether or not they have nephrotic syndrome).
  • Table 4 and FIG. 5 show the concentration of 3′,4′-didehydro-3′-deoxycytidine in urine collected from subjects (whether or not they have nephrotic syndrome).
  • lupus nephritis is the disease type of the subject who collected the urine sample, using the 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine concentration as an index.
  • lupus nephritis is a renal disorder caused by systemic lupus erythematosus
  • 19 patients had a concentration of less than 10 mg/g Cr, and The number of patients with 20 mg/g Cr was 16, the number of patients with 20 to 30 mg/g Cr was 17, and the number of patients with 30 mg/g Cr or more was 11 (lower graph in FIG. 6).
  • a urine sample was collected from a patient with systemic lupus erythematosus who underwent renal biopsy at the Department of Nephrology, Nagoya University, and the CU040 (3′,4′-didehydro-3′-deoxycytidine) concentration in the urine sample was measured.
  • the CU040 concentration was calculated by measuring the concentration in the urine sample by CE-MS and then correcting it with the creatinine concentration in the urine sample.
  • urinary 3',4'-didehydro-3'-deoxycytidine concentrations of 20 mg/g Cr or more at 6, 12, and 24 months after immunosuppressive treatment.
  • a significantly higher complete remission rate was observed compared with the group of less than 20 mg/g Cr.
  • a method that can detect systemic lupus erythematosus with high accuracy, or whether the nephrotic syndrome type is lupus nephritis a method that can be detected with high accuracy without performing a renal biopsy, and the like.
  • a biomarker or the like for detection can be provided.

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Abstract

本発明の課題は、全身性エリテマトーデス（好ましくはネフローゼ症候群）であるかを、腎生検を行わなくとも高精度で検出することができる方法や、かかる検出をするためのバイオマーカー等を提供することにある。被検者から採取された尿中の３'，４'－ジデヒドロ－３'－デオキシシチジンの濃度を測定し、かかる濃度をコントロール用の参照濃度と比較することにより、前述の被検者が全身性エリテマトーデス（好ましくはループス腎炎）であるかを高精度で検出することができる。

Description

全身性エリテマトーデスの検出方法
　本発明は、全身性エリテマトーデスの検出又は予後予測方法や、全身性エリテマトーデスを検出又は予後予測するためのバイオマーカーや、全身性エリテマトーデスの検出又は予後予測用キット等に関する。
　全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus：ＳＬＥ）は、ＤＮＡ－抗ＤＮＡ抗体などの免疫複合体の組織沈着により起こる全身性炎症性病変を特徴とする自己免疫疾患である。ＳＬＥでは、発熱、全身倦怠感などの全身的な炎症と、関節、神経系、血液、皮膚、腎臓、消化管及び肺を含む様々な臓器の障害とが、一度にあるいは経過と共に生じる。ＳＬＥは寛解と増悪を繰り返し、慢性の経過を取ることが多い。ＳＬＥの症状の種類、経過及び程度は患者によって異なるため、他の疾患と比較して診断が行いにくい。ＳＬＥによって引き起こされる腎障害はループス腎炎と呼ばれ、ループス腎炎を発症するか否か、及び、治療開始時点でのループス腎炎の症状の軽重は、ＳＬＥ患者の生命予後を左右する因子である。ＳＬＥの診断の遅れは予後の悪化を招くため、ＳＬＥは早期診断、早期治療が重要な疾患である。現在、ＳＬＥの診断は、ＳＬＥに関連する症状の有無や、血液中の抗核抗体の有無等を含む多数の要素を総合判断することによりなされており、単一の決定的な指標は現在、存在していない。したがって、ＳＬＥの早期診断につながる新たな検出法は依然として求められている。
　一方、ネフローゼ症候群は、大量の尿蛋白と低蛋白血症を特徴とする腎臓疾患の総称であり、その原因疾患は原発性糸球体疾患のほか、膠原病、代謝性疾患など、多岐に渡る。また、その罹患年齢も、小児から高齢者まで広範囲に及ぶ。ネフローゼ症候群の発症に至る機序は様々であり、一旦発症すると長期化することが多く、治療に抵抗性を示すものも少なくない。
　現在、成人ネフローゼ症候群の診断基準として、(i)尿中のタンパク質が１日３．５ｇ以上であること、及び、(ii)血清中のアルブミン濃度が３．０ｇ／ｄＬ以下であること、という２点が必須条件と規定され、付加的な参考条件として、(iii)浮腫があること、(iv)脂質異常症であること、も広く使用されている。一方で、ネフローゼ症候群には様々な病型が存在し、代表的なものとして、微小変化型ネフローゼ症候群（ＭＣＮＳ）、膜性腎症（ＭＮ）、糖尿病性腎症（ＤＮ）、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、ループス腎炎（ＬＮ）、ＩｇＡ腎症（ＩｇＡ）、アミロイド腎症（ＲＡ）などが挙げられる。ネフローゼ症候群の病型の違いによって、施す治療方法が異なるため、ネフローゼ症候群の病型を的確に診断することは臨床的に非常に重要である。
　現在、ネフローゼ症候群の病型の確定診断はもとより、腎炎やネフローゼ症候群などの腎疾患の確定診断には、腎生検が必要である。しかし、腎生検は出血のリスクを伴う侵襲性の高い検査であるため、全身状態が悪化した患者や高齢の患者などにおいては腎生検を施行できない場合も多い。例えば、糖尿病性腎症や腎硬化症においては、通常、腎生検は施行されずに臨床的な推測によって診断されることが多い。このように、腎生検を施行できない場合には、疾患の診断、病態の把握、及び、適切な治療法の選択が困難になるという問題があった。したがって、高侵襲な腎生検を行わなくとも、腎疾患やその病型を高精度かつより低侵襲で判定することができる方法は、臨床的価値が非常に高い。例えば特許文献１には、尿中のヒトメガリンを腎障害マーカーとして使用する方法が開示されており、特許文献２には、血液中のクレアチニン、アスパラギン酸等の特定の代謝物の組合せを糖尿病性腎症鑑別用マーカーとして使用する方法が開示されている。
　しかし、尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン濃度を指標として、全身性エリテマトーデス（好ましくはループス腎炎）であるかを、高精度で検出することができることは、これまでに知られていなかった。
特許第５６９４１４５号公報 特許第６１２８６３１号公報
　本発明の課題は、全身性エリテマトーデス（好ましくはループス腎炎）であるかを、腎生検を行わなくとも高精度で検出することができる方法や、全身性エリテマトーデス（好ましくはループス腎炎）を検出するためのバイオマーカー等を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、健常者及びネフローゼ症候群の７種類の病型の患者の尿サンプルを用いてメタボローム解析を行ったところ、３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン（ｄｄｈ－Ｃｙｔｉｄｉｎｅ又はｄｄｈ－Ｃとも呼ばれる）が、ネフローゼ症候群の病型がループス腎炎であるかを高精度で検出することができるバイオマーカーであることを見いだした。ループス腎炎は全身性エリテマトーデスによって引き起こされる腎障害であるので、ループス腎炎を検出することは、同時に全身性エリテマトーデスを検出することでもある。また、本発明者らは、健常者の尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン濃度がきわめて低いこと、及び、ループス腎炎を伴わない全身性エリテマトーデス患者の尿中に３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンが含まれていることも確認している。以上のことから、本発明者は本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、
（１）（ａ）被検者から採取された尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を測定する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で測定した３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を、コントロール用の参照濃度と比較する工程；
　を含み、
　前記工程（ａ）で測定した３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度が、コントロール用の参照濃度と比べて高いとき、前記被検者が全身性エリテマトーデスである可能性が高いことを示す、
　全身性エリテマトーデスの検出方法；
（２）工程（ａ）で測定した３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度が、コントロール用の参照濃度に対して１．２倍以上であるとき、被検者が全身性エリテマトーデスである可能性が高いことを示す、上記（１）に記載の検出方法；
（３）コントロール用の参照濃度が、ループス腎炎以外の病型であるネフローゼ症候群患者又は健常者から採取された尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の検出方法；
（４）被検者がネフローゼ症候群患者であり、全身性エリテマトーデスがループス腎炎であることを特徴とする上記（１）～（３）のいずれかに記載の検出方法；
（５）３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンからなり、全身性エリテマトーデスを検出するためのバイオマーカー；
（６）被検者から採取された尿中のバイオマーカーの濃度が、ループス腎炎以外の病型のネフローゼ症候群患者又は健常者から採取された尿中のバイオマーカーの濃度と比べて高い、上記（５）に記載のバイオマーカー；
（７）被検者がネフローゼ症候群患者であり、全身性エリテマトーデスがループス腎炎であることを特徴とする上記（５）又は（６）に記載のバイオマーカー；
（８）（Ａ）全身性エリテマトーデス患者から採取された尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を測定する工程を含み、前記工程（Ａ）で測定した３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度が高いとき、前記全身性エリテマトーデス患者の予後が良好であると予測する、全身性エリテマトーデスの予後予測方法；
（９）３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンからなり、全身性エリテマトーデスの予後を予測するためのバイオマーカー；
（１０）質量分析計の内部標準物質としての３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンを備える、全身性エリテマトーデスの検出又は予後予測用キット；
に関する。
　本発明によれば、全身性エリテマトーデス（好ましくはネフローゼ症候群）であるかを、腎生検を行わなくとも高精度で検出することができる方法や、全身性エリテマトーデス（好ましくはネフローゼ症候群）を検出するためのバイオマーカー等を提供することができる。
ネフローゼ症候群の各病型の群における尿中のＣＵ０４０（３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン）の濃度を測定した結果を示す図である。縦軸はＣＵ０４０のピーク強度を表し、横軸はネフローゼ症候群の各病型の群を表す。ＭＮは膜性腎症を、ＤＮは糖尿病性腎症を、ＭＣＮＳは微小変化型ネフローゼ症候群を、ＬＮはループス腎炎を、ＲＡはアミロイド腎症を、ＦＳＧＳは巣状分節性糸球体硬化症を、ＩｇＡはＩｇＡ腎症を表す。各箱ひげ図において、ひげの下端はその群の測定値の５パーセンタイル値を表し、箱の下端は２５パーセンタイル値を表し、箱内の仕切り線は５０パーセンタイル値を表し、箱の上端は７５パーセンタイル値を表し、ひげの上端は９５パーセンタイル値を表す。　なお、各群において、９５パーセンタイル値より高い濃度であったサンプルの測定値や、５パーセンタイル値より低い濃度であったサンプルの測定値は、図１のグラフにドットで示した。 図１の結果をもとに作成したＲＯＣ曲線を示す図である。縦軸は「感度」（真陽性率）を表し、横軸は「１－特異度」（偽陽性率）を表す。 核磁気共鳴によるタンデムマススペクトルを示す図である。図の左側は、３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの合成品（「ＫＡＨ５１－５７」）のスペクトルを表し、図の右側は、ＣＵ０４０のスペクトルを表す。 ネフローゼ症候群の各病型の群、及び、健常者の群における尿中のＣＵ０４０（３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン）の濃度を測定した結果を示す図である。縦軸は尿中のＣＵ０４０濃度（ｍｇ／ｇ　Ｃｒ）を表し、ＣＵ０４０のピーク強度を表し、横軸は各群を表す。ＭＮは膜性腎症を、ＤＮは糖尿病性腎症を、ＭＣＮＳは微小変化型ネフローゼ症候群を、ＲＡはアミロイド腎症を、ＦＳＧＳは巣状分節性糸球体硬化症を、ＩｇＡはＩｇＡ腎症を表し、Ｈｅａｌｔｈｙは健常者を表し、ＬＮはループス腎炎を表す。各箱ひげ図において、ひげの下端はその群の測定値の５パーセンタイル値を表し、箱の下端は２５パーセンタイル値を表し、箱内の仕切り線は５０パーセンタイル値を表し、箱の上端は７５パーセンタイル値を表し、ひげの上端は９５パーセンタイル値を表す。 図４の結果をもとに作成したＲＯＣ曲線を示す図である。縦軸は「感度」（真陽性率）を表し、横軸は「１－特異度」（偽陽性率）を表す。 ネフローゼ症候群患者の尿中ＣＵ０４０濃度分布を示す図である。上グラフは９段階のＣＵ０４０濃度におけるネフローゼ症候群患者数を示し、下グラフは４段階のＣＵ０４０濃度におけるネフローゼ症候群患者数を示す。上グラフ中、「≦１０」はＣＵ０４０濃度が１０ｍｇ／ｇ　Ｃｒ未満の区を、「１０＜，≦２０」は１０～２０ｍｇ／ｇ　Ｃｒの区を、「２０＜，≦３０」は２０～３０ｍｇ／ｇ　Ｃｒの区を、「３０＜，≦４０」は３０～４０ｍｇ／ｇ　Ｃｒの区を、「４０＜，≦５０」は４０～５０ｍｇ／ｇ　Ｃｒの区を、「５０＜，≦６０」は５０～６０ｍｇ／ｇ　Ｃｒの区を、「６０＜，≦７０」は６０～７０ｍｇ／ｇ　Ｃｒの区を、「７０＜，≦８０」は７０～８０ｍｇ／ｇ　Ｃｒの区を、「８０＜，≦９０」は８０～９０ｍｇ／ｇ　Ｃｒの区を、「９０＜，≦１００」は９０～１００ｍｇ／ｇ　Ｃｒの区をそれぞれ示す。また、下グラフ中、「≦１０」はＣＵ０４０濃度が１０ｍｇ／ｇ　Ｃｒ未満の区を、「１０＜，≦２０」は１０～２０ｍｇ／ｇ　Ｃｒの区を、「２０＜，≦３０」は２０～３０ｍｇ／ｇ　Ｃｒの区を、「３０＜」は３０ｍｇ／ｇ　Ｃｒ以上の区をそれぞれ示す。 尿中ＣＵ０４０濃度と米国リウマチ学会（ＡＲＣ）基準項目の関係を示す図である。縦軸はそのＣＵ０４０濃度区分に属する患者のうち、そのＡＲＣ基準項目に該当する患者の人数の割合（％）を示し、横軸はＡＲＣ基準の各項目を示す。なお、横軸のＡＲＣ基準の各項目におけるグラフは、左から、「≦１０」の結果、「１０＜ ≦２０」の結果、「２０＜ ≦３０」の結果、「３０＜」の結果をそれぞれ示す。 尿中ＣＵ０４０濃度とSLE disease activity index（ＳＬＥＤＡＩ）との関係を示す図である。縦軸はそのＣＵ０４０濃度区分に属する患者のうち、そのＡＲＣ基準項目に該当する患者の人数の割合（％）を示し、横軸はＳＬＥＤＡＩの各項目を示す。なお、横軸のＳＬＥＤＡＩの各項目におけるグラフは、左から、「≦１０」の結果、「１０＜ ≦２０」の結果、「２０＜ ≦３０」の結果、「３０＜」の結果をそれぞれ示す。 ネフローゼ症候群患者における、尿中ＣＵ０４０濃度と予後との関係を示す図である。なお、図９中の２つのグラフの内、累積初回完全寛解達成率が全般的に高いグラフが「ＣＵ０４０　２０＝＜」の結果を表し、全般的に低いグラフが「ＣＵ０４０　＜２０」の結果を表す。
　本発明は、
［１］（ａ）被検者から採取された尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を測定する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で測定した３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を、コントロール用の参照濃度と比較する工程；
　を含み、
　前記工程（ａ）で測定した３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度が、コントロール用の参照濃度と比べて高いとき、前記被検者が全身性エリテマトーデスである可能性が高いことを示す、全身性エリテマトーデスの検出方法（以下、「本発明の検出方法」とも表示する。）；
［２］３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンからなり、全身性エリテマトーデスを検出するためのバイオマーカー（以下、「本発明の検出用バイオマーカー」とも表示する。）；
［３］（Ａ）全身性エリテマトーデス患者から採取された尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を測定する工程を含み、前記工程（Ａ）で測定した３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度が高いとき、前記全身性エリテマトーデス患者の予後が良好であると予測する、全身性エリテマトーデスの予後予測方法（以下、「本発明の予後予測方法」とも表示する。）；
［３］３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンからなり、全身性エリテマトーデス患者の予後を予測するためのバイオマーカー（以下、「本発明の予後予測用バイオマーカー」とも表示する。）；や
［４］質量分析計の内部標準物質としての３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンを備える、全身性エリテマトーデスの検出又は予後予測用キット（以下、「本発明のキット」とも表示する。）；
などの実施形態を含んでいる。なお、本明細書において、特に断りがない限り、「濃度」とは、尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を意味する。また、本明細書において、「被検者が全身性エリテマトーデスであるかを検出する」ことには、好ましくは「被検者がループス腎炎であるかを検出する」ことが含まれ、より好ましくは「被検者がネフローゼ症候群患者である場合にその病型がループス腎炎であるかを検出する」ことが含まれる。また、本明細書において、「被検者が全身性エリテマトーデスである可能性」には、好ましくは「被検者がループス腎炎である可能性」が含まれ、より好ましくは「被検者がネフローゼ症候群患者である場合にその病型がループス腎炎である可能性」が含まれる。
（本発明の検出方法）
　本発明の検出方法は、被検者が全身性エリテマトーデスであるかを検出する方法である。本発明の検出方法としては、
（ａ）被検者から採取された尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を測定する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で測定した３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を、コントロール用の参照濃度と比較する工程；
　を含み、
　工程（ａ）で測定した３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度が、コントロール用の参照濃度と比べて高いとき、前記被検者が全身性エリテマトーデスである可能性が高いことを示す、
方法である限り特に制限されない。本発明の検出方法は、被検者が全身性エリテマトーデスである可能性を医師が診断することを補助する方法であって、医師による診断行為を含まない。
（本発明のバイオマーカー）
　本発明のバイオマーカーは、被検者が全身性エリテマトーデスであるかを検出するため、のバイオマーカーである。本発明のバイオマーカーとしては、３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンからなり、全身性エリテマトーデスを検出するためのバイオマーカーである限り特に制限されない。かかるバイオマーカーは、ループス腎炎であるネフローゼ症候群患者から採取された尿中の濃度が、ループス腎炎以外の病型のネフローゼ症候群患者から採取された尿中のバイオマーカーの濃度と比べて高い。
　３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの構造式を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
（本発明の予後予測方法）
　本発明の予後予測方法は、対象となる全身性エリテマトーデス患者が免疫抑制治療後に寛解する可能性を予測する方法である。本発明の予後予測方法としては、（Ａ）全身性エリテマトーデス患者から採取された尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を測定する工程を含み、前記工程（Ａ）で測定した３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度が高いとき、前記全身性エリテマトーデス患者の予後が良好であると予測する方法である限り特に制限されない。本発明の予後予測方法は、全身性エリテマトーデス患者の寛解の可能性を医師が予測することを補助する方法であって、医師による診断行為を含まない。
（本発明の予後予測用バイオマーカー）
　本発明の予後予測用バイオマーカーは、全身性エリテマトーデス患者の予後を予測するためのバイオマーカーである。本発明のバイオマーカーとしては、３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンからなり、全身性エリテマトーデス患者の予後を予測するためのバイオマーカーである限り特に制限されない。かかる予後予測用バイオマーカーは、予後が良好な全身性エリテマトーデス患者から採取された尿中において、より高い濃度で存在する。
（全身性エリテマトーデス）
　本明細書において、「全身性エリテマトーデス」とは、American College of Rheumatology（ＡＣＲ）による１９９７年改訂の診断基準、又は、systemic lupus international collaborating clinics（ＳＬＩＣＣ）による２０１２年の診断基準に該当する状態を意味する。
　上記のＡＣＲによるＳＬＥの診断基準は、以下の＜１＞～＜１１＞の項目のうち、４項目以上を満たす状態をＳＬＥと分類する。ただし、かかる４項目以上の項目の症状の出現時期は一致していなくてもよい。
＜１＞顔面紅斑
＜２＞円板状皮疹
＜３＞光線過敏症
＜４＞口腔内潰瘍（無痛性で口腔あるいは鼻咽腔に出現）
＜５＞関節炎（２関節以上で非破壊性）
＜６＞漿膜炎（胸膜炎あるいは心膜炎）
＜７＞腎病変（０．５ｇ／日以上の持続的蛋白尿か、細胞性円柱の出現）
＜８＞神経学的病変（痙攣発作あるいは精神障害）
＜９＞血液学的異常（溶血性貧血、４０００／ｍｍ３以下の白血球減少、１５００／ｍｍ３以下のリンパ球減少又は１０万／ｍｍ３以下の血小板減少）
＜１０＞免疫学的異常（抗２本鎖ＤＮＡ抗体陽性、抗Ｓｍ抗体陽性又は抗リン脂質抗体陽性（抗カルジオリピン抗体、ループスアンチコアグラント、梅毒反応偽陽性）
＜１１＞抗核抗体陽性
　上記のＳＬＩＣＣによる診断基準は、以下の１７項の基準（すなわち、以下の１１項目の臨床的基準及び以下の６項目の免疫学的基準）のうち、４項目以上の項目（ただし、かかる４項目以上の項目は、少なくとも１項目の免疫学的基準を含む）を満たす場合；か、あるいは、抗核抗体若しくは抗二本鎖ＤＮＡ抗体が陽性で、生検で証明されたループス腎炎が存在する場合；にＳＬＥと分類する。
臨床的基準
<１>急性皮膚型ループス
<２>慢性皮膚型ループス
<３>口腔潰瘍
<４>非瘢痕性脱毛
<５>滑膜炎
<６>漿膜炎（胸膜炎、心膜炎のいずれか）
<７>腎病変（尿蛋白０．５ｇ／日以上、赤血球円柱のいずれか）
<８>神経学的病変（痙攣発作、精神病、多発性単神経炎、脊髄炎、末梢・中枢神経障害，急性錯乱状態）
<９>溶血性貧血
<１０>白血球減少（＜４，０００／ｍｍ３、もしくはリンパ球減少（＜４，０００／ｍｍ３）
<１１>血小板減少（＜１０万／ｍｍ３）
免疫学的基準
<１>抗核抗体陽性
<２>抗二本鎖ＤＮＡ抗体陽性（ＥＬＩＳＡ法では基準値の２倍を超える）
<３>抗Ｓｍ抗体陽性
<４>抗リン脂質抗体陽性
<５>低補体（Ｃ３、Ｃ４、ＣＨ５０）
<６>直接クームス試験陽性（溶血性貧血なし）
（ループス腎炎）
　本明細書において、「ループス腎炎」とは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に伴う腎障害を意味する。ＳＬＥは、全身が侵され得る自己免疫疾患であり、免疫複合体の形成と補体による組織障害をもたらす。組織障害の発生場所は個々の症例によって異なり、腎臓、皮膚、肺、脳など多様な臓器に障害が発生し得る。ＳＬＥの診断基準として、例えば、Updating the American College of Rheumatology revised criteria (1997)、及び、The systemic lupus international collaborating clinics classification criteria for systemic lupus erythematosus (2012) が知られている。
　ループス腎炎では、主に糸球体腎炎が生じるが、血管炎や間質性腎炎なども生じ得る。ループス腎炎には、微小メサンギウムループス腎炎、メサンギウム増殖性ループス腎炎、巣状ループス腎炎、びまん性ループス腎炎、膜性ループス腎炎および進行した硬化性ループス腎炎、特にびまん性ループス腎炎が含まれる。ループス腎炎の症状には、例えば、蛋白尿およびむくみが含まれる。ループス腎炎が進行すると腎機能が低下し、腎不全に至る場合がある。ループス腎炎の診断または分類は、例えば、国際腎臓学会（ＩＳＮ）によるループス腎炎の２００３年分類、または、ループス腎炎のＡＣＲ（米国リウマチ学会）診療ガイドライン（２０１２）を基準とし得る。
（ネフローゼ症候群）
　本明細書において、「ネフローゼ症候群」とは、成人（１５歳以上）においては、(i)尿中のタンパク質が１日３．５ｇ以上であり、かつ、(ii)血清中のアルブミン濃度が３．０ｇ／ｄＬ以下である状態を意味し、小児（１５歳未満）においては、(i)夜間畜尿で４０ｍｇ／時／ｍ２以上、又は、早朝起床時第１尿で尿タンパク質／クレアチニン比２．０ｇ／ｇＣｒ以上であり、かつ、(ii)血清中のアルブミン濃度が２．５ｇ／ｄＬ以下である状態を意味する。小児におけるネフローゼ症候群としては、前述の基準に代えて、以下の基準を用いてもよい。
(i)尿中のタンパク質が１日３．５ｇ以上又は０．１ｇ／ｋｇ以上であることが３日以上持続するか、あるいは、早朝起床時第１尿の尿タンパク質が３００ｍｇ／ｍＬ以上であることが３日以上持続し、かつ、
(ii)血清総タンパク質量が、１歳以上１５歳未満では６．０ｇ／１００ｍＬ 以下、１歳未満では５．５ｇ／１００ｍＬ 以下であり、かつ、血清アルブミン量が、１歳以上１５歳未満では３．０ｇ／１００ｍＬ 以下、１歳未満では２．５ｇ／１００ｍＬ 以下である。
（被検者）
　本明細書において、「被検者」とは、ヒトである限り、年齢、性別、疾患の有無など特に制限されないが、本発明の検出方法を適用する意義が高いことから、全身性エリテマトーデスの確定診断を受けてないヒト、ループス腎炎の確定診断を受けてないヒト等が好ましく挙げられる。前述の全身性エリテマトーデスの確定診断を受けていないヒトとしては、全身性エリテマトーデスの確定診断を受けていないヒトである限り特に制限されず、全身性エリテマトーデスの疑いのあるヒト、全身性エリテマトーデスの疑いが特に認められないヒト、ネフローゼ症候群の確定診断を受けているヒト、ネフローゼ症候群の確定診断を受けていないヒト、ネフローゼ症候群の疑いのあるヒト、ネフローゼ症候群の疑いが特に認められないヒトなどが挙げられる。また、前述のループス腎炎の確定診断を受けていないヒトとしては、ループス腎炎の確定診断を受けていないヒトである限り特に制限されず、ループス腎炎の疑いのあるヒト、ループス腎炎の疑いが特に認められないヒト、ネフローゼ症候群の確定診断を受けているヒト、ネフローゼ症候群の確定診断を受けていないヒト、ネフローゼ症候群の疑いのあるヒト、ネフローゼ症候群の疑いが特に認められないヒトなどが挙げられる。
（本発明の検出方法における工程（ａ））
　上記工程（ａ）としては、被検者から採取された尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を測定する工程である限り特に制限されない。３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度は、被検者から採取された尿（すなわち、尿サンプル）から分析用尿サンプルを調製し３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンを特異的に検出できる公知の方法、例えば、質量分析法を用いて測定することができる。かかる質量分析法とは、尿サンプルを、イオン源を用いて気体状のイオンとし（イオン化）、分析部において、真空中で運動させ電磁気力を用いて、或いは飛行時間差によりイオン化した尿サンプルを質量電荷比に応じて分離し、検出できる質量分析計を用いた測定方法のことをいい、イオン源を用いてイオン化する方法としては、電子イオン化（ＥＩ）法、化学イオン化（ＣＩ）法、電界脱離イオン化（ＦＤ）法、高速原子衝撃（ＦＡＢ）法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法等の方法を適宜選択することができ、また、分析部において、イオン化した尿サンプルを分離する方法としては、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間（ＴＯＦ）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型等の分離方法を適宜選択することができる。また、２以上の質量分析法を組み合わせたタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を利用することができる。また、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）や液体クロマトグラフィー（ＬＣ）や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンを夾雑物から分離・精製して分析することができる。
　本明細書において、尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度は、絶対値であっても、相対値であってもよく、相対値とする場合、例えば、濃度が既知の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン（内部標準）を基準とした相対値や、尿中のクレアチニン含量を基準とした相対値（例えばｍｇ／ｇ　Ｃｒ）を挙げることができる。
（本発明の検出方法における工程（ｂ））
　上記工程（ｂ）としては、工程（ａ）で測定した３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を、コントロール用の参照濃度と比較する工程である限り特に制限されない。本明細書において「コントロール用の参照濃度」は、全身性エリテマトーデスではない者（以下、「コントロール者」とも表示する。）から採取された尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を用いることができる。上記のコントロール者としては、全身性エリテマトーデスではない者であればよく、例えば、ループス腎炎ではない者、健常者などが挙げられ、中でも、ネフローゼ症候群患者であって、その病型がループス腎炎ではない患者や、健常者が好ましく挙げられ、中でも、ネフローゼ症候群患者であって、その病型がループス腎炎ではない患者がより好ましく挙げられる。上記の「ネフローゼ症候群患者であって、その病型がループス腎炎ではない患者」としては、ネフローゼ症候群患者であって、その病型がループス腎炎ではない患者である限り特に制限されないが、ネフローゼ症候群のうち、病型が、微小変化型ネフローゼ症候群（ＭＣＮＳ）、膜性腎症（ＭＮ）、糖尿病性腎症（ＤＮ）、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、ＩｇＡ腎症（ＩｇＡ）及びアミロイド腎症（ＲＡ）からなる群から選択される１種又は２種以上（例えば３種以上、４種以上、５種以上又は６種）である患者が好ましく挙げられる。また、「工程（ａ）で測定した３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度」と、「コントロール用の参照濃度」（以下、併せて「両濃度」とも表示する。）は、対応する濃度を用いることが好ましく、具体的には、尿の由来が異なる以外は、実質的に同じ測定方法（尿から尿サンプルの調製法や、尿サンプル中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度の測定法など）で測定した濃度を用いることが好ましい。また、両濃度のうち、一方の濃度として絶対値を用いる場合は、他方の濃度として絶対値を用いることが好ましく、また、両濃度のうち、一方の濃度として相対値を用いる場合は、他方の濃度として相対値を用いることが好ましい。上記「コントロール用の参照濃度」は、本発明の検出方法を実施する際、コントロール者から採取された尿から分析用尿サンプルを調製し、その都度測定してもよいが、予め測定した濃度を用いてもよい。
　ある被検者から採取された尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度（例えば、工程（ａ）で測定した尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度）（以下、「被検者における濃度」とも表示する。）が、コントロール用の参照濃度と比べて高いとき、前記被検者が全身性エリテマトーデスである可能性が高いことを示し、被検者における濃度がコントロール用の参照濃度と比べて同じ又は低いとき（好ましくは低いとき）、前記被検者が全身性エリテマトーデスである可能性が低いことを示す。
　被検者における濃度が、コントロール用の参照濃度と比べて高いか否かを判定するために、閾値（カットオフ値）を設定することができる。かかる閾値としては、例えば、コントロール者における濃度の「平均値」、「平均値＋標準偏差（ＳＤ）」、「平均値＋２ＳＤ」、「平均値＋３ＳＤ」；コントロール者における濃度の「中央値」、「中央値＋ＳＤ」、「中央値＋２ＳＤ」、「中央値＋３ＳＤ」等を挙げることができる。また、閾値は、感度（全身性エリテマトーデス（好ましくはループス腎炎）である者を正しく陽性と判定できる割合、好ましくは、ネフローゼ症候群の病型がループス腎炎である者を正しく陽性と判定できる割合）及び特異度（全身性エリテマトーデス（好ましくはループス腎炎）ではない者を正しく陰性と判定できる割合、好ましくは、ネフローゼ症候群の病型がループス腎炎ではない者を、正しく陰性と判定できる割合）が高くなるように、「被検者における濃度」のデータと、「コントロール者における濃度」のデータを基に、統計解析ソフトウェアを用いたＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線を用いて算出することもできる。
　本発明の検出方法及び本発明の検出用バイオマーカーにおいて、被検者が全身性エリテマトーデス（好ましくはループス腎炎）である可能性（好ましくは被検者の病型がループス腎炎である可能性）が高いことを示す場合としては、前述したとおり、被検者における濃度がコントロール用の参照濃度と比べて高い場合である限り特に制限されないが、好ましくは、被検者における濃度がコントロール用の参照濃度に対して例えば１．２倍以上、好ましくは１．６倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは２．５倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは３．５倍以上である場合が挙げられる。
　また、本発明の検出方法及び本発明の検出用バイオマーカーにおいて、被検者が全身性エリテマトーデス（好ましくはループス腎炎）である可能性（好ましくは被検者の病型がループス腎炎である可能性）が高いことを示す、他の場合としては、被験者における濃度が、１．９ｍｇ／ｇ　Ｃｒ以上、好ましくは２．５ｍｇ／ｇ　Ｃｒ以上、より好ましくは３ｍｇ／ｇ　Ｃｒ以上、さらに好ましくは３．５ｍｇ／ｇ　Ｃｒ以上、より好ましくは４ｍｇ／ｇ　Ｃｒ以上、さらに好ましくは５ｍｇ／ｇ　Ｃｒ以上である場合が挙げられる。これらの場合は、コントロール用の参照濃度として、１．９ｍｇ／ｇ　Ｃｒ、好ましくは２．５ｍｇ／ｇ　Ｃｒ、より好ましくは３ｍｇ／ｇ　Ｃｒ、さらに好ましくは３．５ｍｇ／ｇ　Ｃｒ、より好ましくは４ｍｇ／ｇ　Ｃｒ、さらに好ましくは５ｍｇ／ｇ　Ｃｒを用いることを意味する。
（本発明の予後予測方法における工程（Ａ））
　上記工程（Ａ）としては、既に全身性エリテマトーデスであると診断された患者から採取された尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を測定する工程である限り特に制限されないが、ここで使用される尿は免疫抑制治療を行う前の患者から採取されたものであることが好ましい。また、かかる工程においては、上述の工程（ａ）と同様の公知の方法によって３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を測定することができる。
　本発明の予後予測方法においては、上記工程（Ａ）により得られた３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度が高いとき、予後が良好であると予測することができる。ここで「予後が良好」とは、治療によって全身症状又は少なくとも一部の臓器病変が寛解又は低疾患活動性状態となることを意味する。例えば、以下の実施例に記載のように、全身性エリテマトーデス患者の尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン濃度が、２０ｍｇ／ｇ　Ｃｒ以上の場合には、２０ｍｇ／ｇ　Ｃｒ以下の場合と比較して、免疫抑制治療から６～２４ヶ月後に完全寛解する可能性が高いと予測することができる。
　なお、「ｍｇ／ｇ　Ｃｒ」とは、１ｇのクレアチニンに対するその物質（本発明では３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン）の重量（ｍｇ）を表す。
（本発明のキット）
　本発明のキットは、質量分析計の内部標準物質として３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンを備える、全身性エリテマトーデスの検出又は予後予測用キットであれば特に制限されないが、３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンが同位体標識されていることが好ましい。同位体標識の例としては、放射性同位体による標識や、炭素、窒素、酸素、重水素などの元素による標識が挙げられるが、重水素による標識が好ましい。また、本発明のキットは、さらに他の検査試薬、希釈液、使用説明書などを備えていてもよい。
（本発明のその他の実施態様）
　本発明には、以下の実施態様も含まれる。
（ａ）被検者から採取された尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を測定する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で測定した３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を、コントロール用の参照濃度と比較する工程；
を含む、前記被検者が全身性エリテマトーデス（好ましくはループス腎炎）であるかを検出（又は診断）するためのデータの収集方法；や、
（ａ）被検者から採取された尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を測定する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で測定した３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を、コントロール用の参照濃度と比較する工程；
を含む、前記被検者が全身性エリテマトーデス（好ましくはループス腎炎）であるかの診断を補助する方法（なお、該方法は、医師による診断行為を含まない）；や、
（ａ）被検者から採取された尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を測定する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で測定した３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を、コントロール用の参照濃度と比較する工程；
を含む、前記被検者が全身性エリテマトーデス（好ましくはループス腎炎）であるかを診断する方法；や、
（ａ）被検者から採取された尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を測定する工程；
（ｂ）工程（ａ）で測定した３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を、コントロール用の参照濃度と比較する工程；及び、
（ｃ）工程（ａ）で測定した３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度が、コントロール用の参照濃度と比べて高いとき、前記被検者が全身性エリテマトーデス（好ましくはループス腎炎）である可能性が高いことを示し、かかる可能性が高い場合に前記被検者に全身性エリテマトーデス（好ましくはループス腎炎）の治療を施す工程；
を含む、前記被検者が全身性エリテマトーデス（好ましくはループス腎炎）であるかを診断する方法；や、
全身性エリテマトーデスであるか（好ましくはネフローゼ症候群であるか、より好ましくはネフローゼ症候群の病型がループス腎炎であるか）の診断における使用のための３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン；
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
１．方法
　ネフローゼ症候群の中から、ループス腎炎を高精度で鑑別し得るバイオマーカーを探索するために、以下の実験を行った。
［尿サンプル］
　バイオマーカーの探索には、名古屋大学医学部付属病院に保管されているネフローゼ症候群患者２７４名の尿サンプルを使用した。これらのネフローゼ症候群患者の患者情報を以下の表１に示す。なお、前述の２７４名の全ての患者は腎生検を行っており、病型が確定している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［尿サンプルの前処理］
　尿サンプルは、採取するタイミングや個人差に起因して濃度が比較的大きく異なる。そのため、尿中のバイオマーカーをより正確に探索するために、各尿サンプルの濃度を尿中のクレアチニン濃度で補正した。具体的には、各尿サンプル中のクレアチニン量を公知の酵素法によって定量し、その結果に基づいて、各尿サンプルのクレアチニンの最終濃度が１０ｍｇ／ｄＬとなるように、各尿サンプルを水で希釈した。かかる希釈した尿サンプルを、後述の質量分析に供した。
［質量分析計による尿中代謝物の解析］
各尿サンプルにおける尿中代謝物の解析を、キャピラリー電気泳動－飛行時間型質量分析計（ＣＥ－ＴＯＦＭＳ）を用いて行った。陽イオン性代謝物質の測定条件を以下の（１）に示し、陰イオン性代謝物質の測定条件を以下の（２）に示す。
（１）陽イオン性代謝物質の測定条件
　陽イオン性代謝物質の測定条件は、以下の（ｓ）や（ｔ）の文献に記載の測定条件を参照した。
（ｓ）Soga, T., Ohashi, Y., Ueno, Y., Naraoka, H., Tomita, M., and Nishioka, T., “Quantitative Metabolome Analysis Using Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry”, J. Proteome Res. 2. 488-494, 2003.
（ｔ）Soga, T., Baran, R., *Suematsu M., Ueno, Y., Ikeda, S., Sakurakawa T., Kakazu, Y., Ishikawa, T., Robert, M., Nishioka, T., Tomita, M., “Differential Metabolomics Reveals Ophthalmic Acid As An Oxidative Stress Biomarker Indicating Hepatic Glutathione Consumption”, J. Biol. Chem. 281, 16768-16776, 2006.
陽イオン性代謝物質の具体的な測定条件は以下のとおりである。
（１－１）キャピラリー電気泳動（ＣＥ）の分析条件
　キャピラリーには、フューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、外径３６０μｍ、全長１００ｃｍ）を用いた。緩衝液には、１Ｍのギ酸水溶液（ｐＨ約１．８）を用いた。印加電圧は＋３０ｋＶとし、キャピラリー温度は２０℃で電気泳動を行った。キャピラリーの一端への分析用尿サンプルの注入は、加圧法を用いて５０ｍｂａｒで３秒間行った。
（１－２）飛行時間型質量分析計（ＴＯＦＭＳ）の分析条件
　正イオンモードを用い、イオン化電圧は４ｋＶ、フラグメンター電圧は７５Ｖ、スキマー電圧は５０Ｖ、ＯｃｔＲＦＶ電圧は１２５Ｖに設定した。乾燥ガスには窒素を使用し、乾燥ガスの温度は３００℃、圧力は１０ｐｓｉｇに設定した。シース液には５０％メタノール溶液を用い、質量較正用にヘキサキス（２，２－ジフルオロトキシ）フォスファゼンを０．１μＭとなるよう混入した。シース液は１０μＬ／ｍｉｎで送液した。正イオンモードで得られた全てのデータは、ヘキサキス（２，２－ジフルオロトキシ）フォスファゼン（ｍ／ｚ ６２２．０２９０）と、メタノールの二量体のアイソトープ（ｍ／ｚ ６６．０６３２）の質量数を用いて自動較正した。
（２）陰イオン性代謝物質の測定条件
　陰イオン性代謝物質の測定条件は、以下の（ｕ）の文献に記載の測定条件を参照した。（ｕ）Soga, T., Igarashi, K., Ito, T., Mizobuchi, K., Zimmermann, H., Tomita, M., “Metabolomic Profiling of Anionic Metabolites by Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry”, Anal. Chem. 81, 6165-6174, 2009.
（２－１）キャピラリー電気泳動（ＣＥ）の分析条件
　キャピラリーには、ＣＯＳＭＯ（＋）キャピラリー（内径５０μｍ、外径３６０μｍ、全長１００ｃｍ）を用いた。緩衝液には、５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ８．５）を用いた。印加電圧は－３０ｋＶ、キャピラリー温度は２０℃で電気泳動を行った。キャピラリーの一端への分析用尿サンプルの注入は、加圧法を用いて５０ｍｂａｒで３０秒間行った。
（２－２）飛行時間型質量分析計（ＴＯＦＭＳ）の分析条件
　負イオンモードを用い、イオン化電圧は３．５ｋＶ、フラグメンター電圧は１００Ｖ、スキマー電圧は５０Ｖ、ＯｃｔＲＦＶ電圧は２００Ｖに設定した。乾燥ガスには窒素を使用し、温度３００℃、圧力１０ｐｓｉｇに設定した。シース液には５ｍＭ酢酸アンモニウムを含む５０％メタノール溶液を用い、質量較正用にヘキサキス（２，２－ジフルオロトキシ）フォスファゼンを０．１Ｍとなるよう混入した。シース液は１０μＬ／ｍｉｎで送液した。負イオンモードで得られた全てのデータは、ヘキサキス（２，２－ジフルオロトキシ）フォスファゼンの酢酸付加イオン（ｍ／ｚ ６８０．０３５５）と、酢酸の二量体のアイソトープ（ｍ／ｚ １２０．０３８４）の質量数を用いて自動較正した。
２．結果
［バイオマーカーの探索］
　前述のネフローゼ症候群患者２７４名の尿サンプルについて、前述の方法でＣＥ－ＴＯＦＭＳを行い、メタボローム解析を行った。その結果、これらネフローゼ症候群患者の尿中から、合計２２０種の代謝物ピークが検出された。これらの尿中代謝物の全てのピークに対して統計学的な解析を行い、ネフローゼ症候群の７種の病型から１つの病型の罹患可能性が高いことを検出することができるマーカー候補の探索を実施した。その結果、ネフローゼ症候群の７種の病型のうち、特定の１種の病型であるループス腎炎である可能性が高いと検出することができるマーカー候補ピーク（ピークＩＤ「ＣＵ０４０」（後に、３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンと同定））を見いだした。ネフローゼ症候群の７種の各病型群におけるＣＵ０４０の相対濃度の最小値、５パーセンタイル値、２５パーセンタイル値、５０パーセンタイル値（中央値）、７５パーセンタイル値、９５パーセンタイル値、最大値をそれぞれ表２に示し、それらの値を箱ひげ図で表した図を図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　図１の結果から分かるように、ピークＩＤ「ＣＵ０４０」（３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン）の相対濃度は、ネフローゼ症候群の７種の病型のうち、ループス腎炎（ＬＮ）でのみ、高い値を示した。例えば５０パーセンタイル値で比較すると、ループス腎炎の病型における相対濃度は、他の病型の相対濃度に対して、少なくとも３．５６倍以上であった。
　ループス腎炎群における尿サンプル中のＣＵ０４０（３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン）の相対濃度と、ループス腎炎以外の６種の病型群における尿サンプル中のＣＵ０４０の相対濃度に基づいて、ＲＯＣ曲線を作成したところ、ＡＵＣ値は０．８２１８と高い値を示した（図２）。また、ネフローゼ症候群の病型の１種であるループス腎炎群と、ネフローゼ症候群の他の６種の病型群とを区別するためのＣＵ０４０の相対濃度のカットオフ値として１８．３９８を設定したところ、ネフローゼ症候群の患者のうち、ループス腎炎の患者である者の感度（すなわち、ループス腎炎の患者の中で検査陽性者の割合）及び特異度（ネフローゼ症候群の患者のうち、ループス腎炎の患者でない者の中で検査陰性者の割合）は、それぞれ０．７０３７（７０．３７％）及び０．９７１７（９７．１７％）であった。
　これらの結果は、ネフローゼ症候群の患者から採取された尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの相対濃度を測定し、適切なカットオフ値を設定すると、３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン濃度を指標として、ネフローゼ症候群の病型がループス腎炎である可能性を高精度で検出できることを示している。また、ループス腎炎は全身性エリテマトーデスによって引き起こされる腎障害であることから、前述の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン濃度により、被検者がループス腎炎である可能性、さらには全身性エリテマトーデスである可能性を高精度で検出できることも示された。
［ＣＵ０４０の同定］
　前述したように、ピークＩＤ「ＣＵ０４０」は測定当初、該当する標準試薬が無かったために未知のピークであった。このピークの物質を同定するために、ループス腎炎のない全身性エリテマトーデス患者から蓄尿により尿を数リットル採取して、分取液体クロマトグラフィーによる代謝物の回収、及び、核磁気共鳴による物質の同定を試みることとした。なお、過去の文献（Tritten, L., Keiser, J., Godejohann, M., Utzinger, J., Vargas, M., Beckonert, O., Holmes, E., Saric, J., “Metabolic Profiling Framework for Discovery of Candidate Diagnostic Markers of Malaria”, Scientific Rep. 3, 2769, 2013.）でマウス尿中から検出されたと報告されていた代謝物（３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン）の組成式が、ＣＵ０４０の組成式と同一であったため、その代謝物の合成を行い、その合成代謝物（「ＫＡＨ５１－５７」）のピークとＣＵ０４０のピークを比較した。その結果を図３に示す。
　図３の結果から分かるように、合成代謝物とＣＵ０４０とは、ピークの保持時間が一致し、及び、主要なＭＳ／ＭＳ（タンデムマス）スペクトルが一致した。このことから、ＣＵ０４０は、３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンであると同定された。また、この結果は、腎炎を伴わない全身性エリテマトーデス患者の尿にもＣＵ０４０が含まれていることを示した。
　［全身性エリテマトーデス及びループス腎炎を診断するカットオフ値の算出］
　表３に示した、患者前述のネフローゼ症候群患者２７４名の一部を含む前述の７種の病型から構成されるネフローゼ症候群患者及び非ネフローゼ症候群患者５３１名および健常者１５名の尿サンプルを加えた合計５４６名の尿サンプルについて、前述の方法でＣＥ－ＴＯＦＭＳを行い、メタボローム解析を行った。その結果、７種の病型及び健常コントロールの各群におけるＣＵ０４０の濃度分布を明らかにした。７種の各病型群及び健常コントロールにおけるＣＵ０４０の濃度の最小値、１０パーセンタイル値、２５パーセンタイル値、５０パーセンタイル値（中央値）、７５パーセンタイル値、９０パーセンタイル値、最大値をそれぞれ表４に示し、それらの値をドットブロット及び箱ひげ図で表した図を図４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ループス腎炎群における尿サンプル中のＣＵ０４０（３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン）の濃度と、ループス腎炎以外の６種の病型群および健常コントロールにおける尿サンプル中のＣＵ０４０の濃度に基づいて、ＲＯＣ曲線を作成したところ、ＡＵＣ値は０．９２７と高い値を示した（図５）。また、ループス腎炎群と、他の６種の病型群および健常コントロールとを区別するためのＣＵ０４０の濃度のカットオフ値として１．９ｍｇ／ｇ　Ｃｒを設定したところ、ネフローゼ症候群患者及び非ネフローゼ症候群患者５３１名及び健常者１５名の尿サンプルを加えた合計５４６名のうち、ループス腎炎の患者である者の感度（すなわち、ループス腎炎の患者の中で検査陽性者の割合）及び特異度（ネフローゼ症候群の患者のうち、ループス腎炎の患者でない者の中で検査陰性者の割合）は、それぞれ０．８５７１（８５．７１％）及び０．９６１２（９６．１２％）であった。
　表４、図４及び図５の結果は、被検者（ネフローゼ症候群の患者であるかどうかは問わない）から採取された尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を測定し、適切なカットオフ値を設定すると、３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン濃度を指標として、尿検体を採取した被験者がループス腎炎である可能性を高精度で検出できることを示している。また、前述の表４、図４及び図５の結果は、ネフローゼ症候群の患者から採取された尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を測定し、適切なカットオフ値を設定すると、３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン濃度を指標として、尿検体を採取した被検者の病型がループス腎炎である可能性を高精度で検出できることも示している。また、ループス腎炎は全身性エリテマトーデスによって引き起こされる腎障害であることから、前述の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン濃度により、被検者がループス腎炎である可能性、さらには全身性エリテマトーデスである可能性を高精度で検出できることも示された。
［尿中ＣＵ０４０濃度と、臨床パラメータとの相関性解析］
　ネフローゼ症候群患者の尿中ＣＵ０４０（３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン）濃度と、各種臨床パラメータとの相関を調べた。具体的には、ネフローゼ症候群患者から採取した尿サンプル（ｎ＝６３）における、３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン濃度を、実施例１に記載された方法により定量した。得られた尿中３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン濃度に基づき、患者分布数を解析した。まず、９区分の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン濃度における患者分布数を検討した結果、濃度が１０ｍｇ／ｇ　Ｃｒ未満の患者数は１９例であり、１０～２０ｍｇ／ｇ　Ｃｒの患者数は１６例であり、２０～３０ｍｇ／ｇ　Ｃｒの患者数は１７例であり、３０～４０ｍｇ／ｇ　Ｃｒの患者数は７例であり、４０～５０ｍｇ／ｇ　Ｃｒの患者数は３例であり、９０～１００ｍｇ／ｇ　Ｃｒの患者数は１例であった（図６の上グラフ）。かかる結果に基づき、さらに４区分の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン濃度における患者分布数を検討した結果、濃度が１０ｍｇ／ｇ　Ｃｒ未満の患者数は１９例であり、１０～２０ｍｇ／ｇ　Ｃｒの患者数は１６例であり、２０～３０ｍｇ／ｇ　Ｃｒの患者数は１７例であり、３０ｍｇ／ｇ　Ｃｒ以上の患者数は１１例であった（図６の下グラフ）。
　次に、上記の４区分に分類された患者グループのそれぞれの臨床パラメータを解析してグラフ化した。臨床パラメータとしては、米国リウマチ学会（ＡＲＣ）基準及びSLE disease activity index（ＳＬＥＤＡＩ）を用いた。それぞれのパラメータと尿中３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン濃度との相関を図７及び８に示す。図７及び８に示されるように、３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン高濃度区分において、いくつかの臨床パラメータとの相関が認められた。３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度が増加するのに従って、円板状エリテマトーデス、光線過敏症、脱毛併発のスコアは上昇傾向を示し、逆に、尿円柱および溶血性貧血のスコアは低下傾向を示した。
［尿中ＣＵ０４０濃度と全身性エリテマトーデスの予後との関連］
　名古屋大学腎臓内科で腎生検を施工した全身性エリテマトーデス患者から尿サンプルを採取し、その尿サンプル中のＣＵ０４０（３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン）濃度を測定した。なお、かかるＣＵ０４０濃度は、ＣＥ－ＭＳで尿サンプル中の濃度を測定してから、尿サンプル中のクレアチニン濃度で補正して算出した。
　これらの全身性エリテマトーデス患者を、尿中３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン濃度が２０ｍｇ／ｇ　Ｃｒ未満（ｎ＝３０）又は２０ｍｇ／ｇ　Ｃｒ以上（ｎ＝２７）の２つのグループに分け、免疫抑制治療から３、６、１２、及び２４か月後の完全寛解率を比較した。尿蛋白量が０．２ｇ／ｄａｙ以下になった時点を完全寛解と評価した。完全寛解率を比較した結果を表５と図９に示す。なお、図９中の２つのグラフの内、累積初回完全寛解達成率が全般的に高いグラフが「ＣＵ０４０　２０＝＜」の結果を表し、全般的に低いグラフが「ＣＵ０４０　＜２０」の結果を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表５と図９に示すように、免疫抑制治療後６、１２、及び２４か月の時点において、尿中３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン濃度が２０ｍｇ／ｇ　Ｃｒ以上のグループにおいて、２０ｍｇ／ｇ　Ｃｒ未満のグループと比較して、有意に高い完全寛解率が認められた。これらの結果から、尿中３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジン濃度が予後推定バイオマーカーとして利用できることが示唆された。
　本発明によれば、全身性エリテマトーデスを高精度で検出できる方法や、ネフローゼ症候群の病型がループス腎炎であるかを、腎生検を行わなくとも高精度で検出することができる方法や、かかる検出をするためのバイオマーカー等を提供することができる。

Claims (10)

  1. （ａ）被検者から採取された尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を測定する工程；及び
    （ｂ）工程（ａ）で測定した３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を、コントロール用の参照濃度と比較する工程；
    　を含み、
    　前記工程（ａ）で測定した３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度が、コントロール用の参照濃度と比べて高いとき、前記被検者が全身性エリテマトーデスである可能性が高いことを示す、
    　全身性エリテマトーデスの検出方法。
  2. 　工程（ａ）で測定した３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度が、コントロール用の参照濃度に対して１．２倍以上であるとき、被検者が全身性エリテマトーデスである可能性が高いことを示す、請求項１に記載の検出方法。
  3. 　コントロール用の参照濃度が、ループス腎炎以外の病型であるネフローゼ症候群患者又は健常者から採取された尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度であることを特徴とする請求項１又は２に記載の検出方法。
  4. 　被検者がネフローゼ症候群患者であり、全身性エリテマトーデスがループス腎炎であることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の検出方法。
  5. 　３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンからなり、全身性エリテマトーデスを検出するためのバイオマーカー。
  6. 　被検者から採取された尿中のバイオマーカーの濃度が、ループス腎炎以外の病型のネフローゼ症候群患者又は健常者から採取された尿中のバイオマーカーの濃度と比べて高い、請求項５に記載のバイオマーカー。
  7. 　被検者がネフローゼ症候群患者であり、全身性エリテマトーデスがループス腎炎であることを特徴とする請求項５又は６に記載のバイオマーカー。
  8. （Ａ）全身性エリテマトーデス患者から採取された尿中の３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度を測定する工程を含み、
    　前記工程（Ａ）で測定した３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンの濃度が高いとき、前記全身性エリテマトーデス患者の予後が良好であると予測する、全身性エリテマトーデスの予後予測方法。
  9. 　３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンからなり、全身性エリテマトーデスの予後を予測するためのバイオマーカー。
  10. 　質量分析計の内部標準物質としての３’，４’－ジデヒドロ－３’－デオキシシチジンを備える、全身性エリテマトーデスの検出又は予後予測用キット。
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