CN104870012A - 用于炎性疾病的抗-cxcl9、抗-cxcl10、抗-cxcl11、抗-cxcl13、抗-cxcr3和抗-cxcr5试剂 - Google Patents

Abstract

公开了一种用于检测受试者中的炎性疾病的方法。所述方法包括如下步骤：(a)检测获自所述受试者的生物样品中的一种或者多种炎性疾病标记物的表达水平；和(b)比较所述生物样品中的所述一种或者多种炎性疾病标记物的表达水平和所述一种或者多种炎性疾病标记物的正常表达水平，其中，所述一种或者多种炎性疾病标记物包括选自由CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5组成的组中的一种或者多种标记物。还公开了一种用于监测受试者中的炎性疾病治疗过程的方法和一种用于检测受试者中的炎性疾病的试剂盒。

Description

用于炎性疾病的抗-CXCL9、抗-CXCL10、抗-CXCL11、抗-CXCL13、抗-CXCR3和抗-CXCR5试剂

技术领域

本申请主要涉及炎性疾病的检测。更具体地说，本申请涉及用于使用抗-趋化因子和/或抗-趋化因子受体检测试剂检测炎性疾病的方法。

背景技术

尽管近来在与炎症过程相关的研究中取得进展，但是用于诊断和治疗慢性炎性疾病的方法仍然还有很多没有弄清楚。这可能是因为在宿主中引发并且维持炎症状态的因子有很多并且是复杂的。目前治疗具有与它们相关的缺点，包括免疫系统的抑制可能导致宿主更容易受到细菌、病毒和寄生虫感染。例如，使用类固醇是慢性炎症治疗的一种传统方法。这种治疗可能导致保护性免疫的抑制和体重的变化。生物技术中的进展已经促进了具有很少副作用的靶向生物制品的发展。为了改善炎性疾病治疗，需要发展改变和控制由先天性和适应性免疫系统两者的细胞生成的因子的技术。

宿主细胞具有与配体关联的表面受体以转导信号并且调节宿主细胞活性。施用抗TNF-α抗体或者可溶性TNF-α受体已经显示抑制炎性疾病。不幸的是，与这种治疗相关联的副作用可能通过没有充分了解的机制导致感染(例如肺结核)和其他不良反应的风险增加。类似的，针对膜结合分子样CD40的抗体治疗具有抑制炎症和移植物-宿主病的特性。虽然一直在研究用于预防炎性疾病的其他靶向宿主细胞治疗，但是仍然没有能阻止所有炎性疾病的已知单独表面或分泌因子。因此，需要开发采用新鉴定的特异性宿主细胞目标的治疗。

在进入粘膜之后不久，各种不同的病原体或毒素激活巨噬细胞、嗜中性粒细胞、T细胞、B细胞、单核细胞、NK细胞、潘氏和隐窝细胞以及上皮细胞。趋化因子是耐受水解的、促进新血管形成或内皮细胞生长抑制、诱导细胞骨架重排、使淋巴细胞激活或者失活以及通过与G蛋白偶联受体相互作用而介导趋药性的小的细胞因子样蛋白的超级家族。趋化因子可以介导表达它们的受体的宿主细胞的迁移和生长。负责趋化因子的这些功能的细胞机制一般是但是不是全部是Ca²⁺流依赖性的并且是百日咳毒素敏感的。然而，趋化因子介导事件的准确机制仍未清楚。

发明内容

本申请的一个方面涉及分离的抗-CXCL9、抗-CXCL10、抗-CXCL11、抗-CXCL13、抗-CXCR3或抗-CXCR5试剂，所述试剂对炎性疾病具有结合亲和力，Kd值范围为0.01pM至1μM。在一个实施方式中，本申请涉及一种用于检测受试者中的炎性疾病的方法。所述方法包括如下步骤：(a)检测获自所述受试者的生物样品中的一种或者多种炎性疾病标记物的表达水平；和(b)比较所述生物样品中的所述一种或者多种炎性疾病标记物的表达水平和所述一种或者多种炎性疾病标记物的正常表达水平，其中，高于所述多个炎性疾病标记物中的一种或者多种在所述生物样品中的正常表达水平指示所述受试者中存在炎性疾病，其中所述多个炎性疾病标记物的所述正常表达水平是预定值，并且其中所述一种或者多种炎性疾病标记物包括选自由CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5组成的组中的一种或者多种标记物。

本申请的另一个方面涉及一种用于监测受试者中炎性疾病治疗过程的方法。所述方法包括如下步骤：测定在治疗过程中或者治疗之后获自所述受试者的一种或者多种生物样品中的一种或者多种炎性疾病标记物的表达水平；和比较所述一种或者多种生物样品中的所述一种或者多种炎性疾病标记物的表达水平和所述一种或者多种炎性疾病标记物的对照表达水平，其中，所述一种或者多种炎性疾病标记物的所述对照表达水平是预定参考水平或者所述受试者中的所述一种或者多种炎性疾病标记物的治疗前水平，其中，如果在所述治疗过程中或者所述治疗之后获自所述受试者的所述一种或者多种生物样品中的所述一种或者多种炎性疾病标记物的表达水平类似于或者低于所述对照表达水平，那么认为所述治疗是有效的，其中，所述一种或者多种炎症标记物包括选自由CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物。

本申请的另一个方面涉及一种用于检测受试者中的炎性疾病的试剂盒。所述试剂盒包括用于测定选自由CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物的表达的试剂；用于测定生物样品中的选自由致轻素、肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素-γ(IF-γ)、白介素-1α(IL-1α)、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17和IL-23组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物的表达的试剂；和关于如何使用所述试剂的说明书。

附图说明

图1显示了IFN-γ，IP-10，MIG，I-TAC和CXCR3mRNA在小鼠结肠炎过程中的表达。

图2显示了通过过继性转移而接受CD45RB^HI或CXCR3⁺CD4⁺T细胞的TCRβxδ^-/-小鼠中的IBD的组织学分析。

图3显示了IL-10^-/-小鼠的结肠炎的发展和SAA水平。大于200μg/ml的SAA浓度与第0周无症状性结肠炎的发作相关联。

图4显示了IL-10^-/-小鼠的体重变化。

图5显示了血清IL-6和SAA水平与小鼠结肠炎的关联。

图6显示了IL-10^-/-小鼠中的总的粪便和血清Ab(抗体)水平。

图7显示了患有IBD的IL-10^-/-小鼠中的血清IL-12，IFN-γ，IL-2，TNF-α，IL-1α和IL-1β水平。

图8显示了由IL-10^-/-小鼠所呈现的结肠炎的组织学特性。

图9显示了抗-CXCL10抗体消除了严重结肠炎。

图10显示了粘膜组织在严重结肠炎过程中的Th1细胞因子、CXCL10和CXCR3mRNA表达。

图11显示了严重结肠炎进展过程中血清中的Th1和炎性细胞因子水平。

图12显示了抗-CXCL10抗体对结肠炎病理学的影响。

图13显示了CD患者的结肠中的CXCL9、CXCL10、CXCL11和TNF-α的组织学和免疫荧光定位。

图14显示了自发性结肠炎过程中IL-10^-/-小鼠中的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种(M.avium subsp.paratuberculosis(MAP))特异性血清Ab反应。

图15显示了使用副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种(MAP)挑战的IL-10^-/-小鼠中的组织学特性。

图16显示了MAP挑战之后IL-10^-/-小鼠的体重变化

图17显示了MAP挑战之后IL-10^-/-小鼠的血清细胞因子水平。

图18显示了来自IL-10^-/-小鼠的CD4⁺T细胞的抗-肽#25Ag(来自MPT59)诱导的增殖和IL-2生成。

图19显示了IBD患者中的血清CXCR3配体和分枝杆菌特异性Ab反应。

图20显示了分枝杆菌挑战后IL-10^-/-小鼠和IBD患者中的SAA水平变化

图21显示了使用分枝杆菌挑战的IL-10^-/-小鼠的肠组织学特性。

图22显示了IC患者中的血清CXCL9、CXCL10和CXCL11浓度。

图23显示了CYP诱导膀胱炎之后的组织学变化。

图24显示了CYP处理的小鼠中的CXCR3、CXCL9、CXCL10和CXCL11mRNA表达。

图25显示了活动性CD过程中的上调的CXCL10表达。

图26显示了活动性CD过程中CXCL11和CXCL9的上调表达。

图27显示了CD患者中的血清淀粉样蛋白A(SAA)和IL-6的上调的血清浓度。

图28显示了CD过程中血清IL-12p40和IFN-γ水平相关。

图29显示了活动性CD过程中炎性细胞因子水平。

图30显示了正常和具有高血清CXCR3配体浓度的CD患者中的结肠炎的组织学特性。

图31显示了通过组织学检查得到的正常和CD患者的结肠中的CXCR3配体和TNFα表达。

具体实施方式

提供如下详细说明以使本领域技术人员能够实施和使用本申请。为了解释目的，给出具体术语以充分地理解本申请。但是，本领域技术人员应当清楚的是，实施本申请不需要这些具体细节。具体申请的描述仅仅作为代表实施例提供。没有将本申请限于所示实施方式的目的，本申请应当根据本文所公开的原理和特征赋予尽可能宽的范围。

除非另有说明，否则结合本申请使用的科学和技术术语将具有本领域技术人员通常理解的意思。此外，除非上下文需要，否则单数形式的术语应当包括多个，并且复数形式的术语应当包括单数形式。

定义

本文使用的如下术语将具有如下含义：

术语“生物样品”是指生物来源的材料，所述材料可以是体液或身体产物例如血液、血浆、尿液、唾液、脑脊液、滑液、脊髓液、粪便(stool)、淋巴、汗液、乳头抽吸物或呼气。生物样品可包括组织样品、细胞样品或它们的组合。“组织样品”包括从受试者优选是人类受试者的完整组织获得或者取得的一部分、一块、部分、一段或一些组织。生物样品可以是如本文所述的从任何身体组织获得的以组织活检术形式获得。活检术可以是吸引术活检(aspiration biopsy)、刷取活检术、表面活检术、针刺活检术、穿刺活检术、切除活检术、开放性活检术、切取活检术、内窥镜活检术或者本领域技术人员已知的其他形式的活检术。

术语“炎症标记物水平”和“表达水平”可以相互交换地使用，指炎症标记物(例如mRNA、蛋白)的量、炎症标记物的活性或者其组合的定量度量。

本文使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即，含有特异性地与抗原结合(免疫反应)的抗原结合位点或抗原决定基结合域的分子。本文使用的术语“抗体”以最宽含义使用，并且明确涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段(例如Fc片段和单链FC(scFc)片段)，只要它们显示出对目标抗原的特异性结合。“特异性结合”或者“与……免疫反应”是指抗体与希望的抗原的一种或者多种抗原决定簇反应并且没有与其他多肽反应(即，结合)或者以低得多的亲和性与其他多肽结合。

本文使用的术语“单克隆抗体”是指从具有基本同源的抗体的群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能的天然存在的突变之外，组成所述群体的各个抗体是相同的。本文的单克隆抗体明确包括“嵌合”抗体以及这种抗体的片段，只要它们显示出所希望的生物活性，在这种嵌合抗体中，重链和/或轻链中的一部分与衍生自特定物种或者属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而所述链的其他部分与衍生自另一种物种或者属于另一种抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源。

“人源化”形式的非人类抗体是包含衍生自非人类免疫球蛋白的少量序列的嵌合抗体。对于大多数部分，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高度可变区的残基被来自非人类物种(供体抗体)的具有所期望的特异性、亲和性和/或能力的高度可变区的残基所取代，所述非人类物种例如为小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物。制备人源化和其他嵌合抗体的方法在本领域中是已知的。

“双特异性抗体”是对至少两种不同抗原具有结合特异性的抗体。

“异源偶联抗体”、“适体”和“合成抗体(synbody)”的使用也处在本申请的范围内。

异源偶联抗体由两种共价结合的抗体组成。可以想到的是，所述抗体能够使用合成蛋白化学中已知的方法，包括涉及使用交联试剂的那些方法进行体外制备。作为替代方式，它们可以通过本领域技术人员已知的重组DNA技术使两种抗体或者其片段融合来制备。

适体是结合特异性目标分子的寡核苷酸或肽分子。适体一般通过从大的随机序列池中选择它们而建立，但是天然的适体也存在于核糖体开关中。适体可以与核糖体组合而在它们的目标分子存在的情况下自切割。适体包括DNA或RNA适体以及肽适体。

合成抗体是使用小亲和力的肽模拟单克隆抗体的功能的合成蛋白分子。合成抗体可以从由针对与感兴趣的目标蛋白的结合而筛选的多条随机肽组成的文库中产生。在一些实施方式中，合成抗体由两个或者更多个肽组成，所述两个或者更多个肽通过组成和长度可变的骨架连接，从而形成多价结合试剂。

本文使用的术语“核酸”是指由至少两个并且优先由十个或者更多个通过骨架结构连接的碱基组成的聚脱氧核糖核酸(DNA或其类似物)或聚核糖核酸(RNA或其类似物)。在DNA中，常见的碱基是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)，而在RNA中，常见的碱基是A、G、C和尿嘧啶(U，代替T)，不过核酸可以包括碱基类似物(例如，肌苷)和非碱基位置(即，在一个或多个位置缺少核苷酸的磷酸二酯骨架)。例示性的核酸包括DNA和RNA的单链(ss)、双链(ds)、或三链的多核苷酸或寡核苷酸。

术语“多核苷酸”是指包含多于10个核苷酸的核酸。

术语“寡核苷酸”是指含有约5个至约100个核苷酸的单链核酸。

术语“炎性肠病”或者“IBD”是指导致肠道发生炎症的一类疾病，一般表现为包括腹部绞痛和疼痛、腹泻、体重损失和肠道出血等症状。IBD的主要形式是溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩氏症。

术语“溃疡性结肠炎”或“UC”是大肠和直肠的以出血性腹泻为特征的一种慢性阵发性炎性疾病。溃疡性结肠炎的特征是结肠粘膜的慢性炎症，并且可以根据位置分类如下：直肠炎只涉及直肠，“直肠乙状结肠炎”影响直肠和乙状结肠，“左侧结肠炎”包括大肠的整个左侧，“全结肠炎”使整个结肠发炎。

术语“克罗恩氏症”，也称为“局限性肠炎”，是可能影响胃肠道任何部分但是一般发生在回肠(小肠和大肠相遇的区域)的一种慢性自体免疫性疾病。克罗恩氏症与溃疡性结肠炎相反，其特征是贯穿肠壁的所有层延伸并且影响肠系膜以及局部淋巴结的慢性炎症。不管涉及的是小肠还是结肠，基本病理学过程是相同的。

溃疡性结肠炎和克罗恩氏症在超过90％的病例中在临床学、内窥镜学、病理学和血清学上是彼此不同的；其余被认为是不确定IBD。

术语“粘膜组织”是指发现其中有粘膜细胞的任何组织，这种组织包括诸如胃肠道组织(例如胃、小肠、大肠、直肠)、泌尿生殖组织(例如阴道组织、阴茎组织、尿道)、鼻喉组织(例如鼻组织、喉组织)、嘴(口腔组织)之类的组织，仅举几例。其他粘膜组织是已知的并且可以由本领域技术人员容易地加以鉴定。

术语“结合试剂”、“结合配体”、“捕获结合配体”、“捕获探针”或者文法等同词可以相互交换地使用，指用于检测目标分析物、目标物种或与炎症标记物对应的目标序列(所有都可以相互交换地使用)的存在或者相对数量或绝对数量的化合物或大分子。一般来说，结合试剂或捕获探针允许目标物种或目标序列连接至固体支持物以实现本文将进一步描述的检测的目的。目标物种与结合试剂的连接可以是直接的也可以是间接的。在一些例示性的实施方式中，目标物种是炎症标记物。如本领域技术人员将认识到的那样，结合试剂的组成将依赖于炎症标记物的组成。

术语“宿主蛋白”是指在宿主中内源性地表达的蛋白。

术语炎性标记物的“正常表达水平”是指没有与所述炎性标记物相关联的炎性疾病的一个或者多个受试者中的炎性标记物的一种或者多种表达水平。

术语“增加的水平”是指高于在相关领域中一般限定的或者使用的正常或对照水平的水平。例如，组织中免疫染色的增加的水平是将被本领域技术人员认为高于对照组织中的免疫染色的水平的免疫染色的水平。

范围在本文中可以表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表示这样的范围时，另一个实施方式包括从一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，使用先行词“约”表示数值为近似值时，应当理解的是，该特定值形成另一个实施方式。还应当理解的是，每个范围的端点不仅在与另一个端点的关系上是重要的，而且也独立于另一个端点。

还应当理解的是，本文公开有很多数值，并且每个数值在本文中除了数值本身之外，还被公开为“约”该特定值。例如，如果公开了数值“10”，那么也公开了“约10”。还应当理解的是，当一个数值被公开为“小于或者等于”该数值时，也公开了“大于或者等于该数值”以及数值之间的可能范围，如本领域技术人员适当地理解的那样。例如，如果公开了数值“10”，也公开了“小于或者等于”10以及“大于或者等于10”。

炎性疾病的检测

CXCL9、CXCL10和CXCL11趋化因子是CXCR3趋化因子受体的配体。CXCL1趋化因子是CXCR5趋化因子受体的配体。这些趋化因子配体及其受体中的每一个在包括炎性肠病在内的各种炎性疾病中都局部上调并且发挥作用。另外，CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCL13趋化因子在体内和体外都增强炎症。CXCR3和CXCR5是G蛋白偶联受体(GPCR)的趋化因子受体家族的成员。CXCR3与CXCL9、CXCL10和CXCL11的相互作用以及CXCR5与CXCL13的相互作用激活炎症。

本申请的一个方面涉及一种用于检测受试者中的炎性疾病的方法。所述方法包括如下步骤：(a)检测获自所述受试者的生物样品中的一种或者多种炎性疾病标记物的表达水平；和(b)比较所述生物样品中的所述一种或者多种炎性疾病标记物的表达水平和所述一种或者多种炎性疾病标记物的正常表达水平，其中，高于所述多个炎性疾病标记物中的一种或者多种在所述生物样品中的正常表达水平指示所述受试者中存在炎性疾病，其中所述多个炎性疾病标记物的所述正常表达水平是预定值，并且其中所述一种或者多种炎性疾病标记物包括选自由CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5组成的组中的一种或者多种标记物。

在一些实施方式中，所述一种或者多种炎性疾病标记物进一步包括选自由CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL9、CCL11、CCL12、CCL13、CCL17、CCL20、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、XCL1、CX3CL1、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR4、XCR1组成的组中的一种或者多种标记物。

在其他一些实施方式中，所述一种或者多种炎性疾病标记物进一步包括选自由致轻素(leptin)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素-γ(IF-γ)、白介素-1α(IL-1α)、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17和IL-23组成的组中的一种或者多种标记物。

在另外一些实施方式中，所述一种或者多种炎性疾病标记物进一步包括抗如下炎症相关微生物的一种或者多种抗体和/或衍生自所述炎症相关微生物的一种或者多种抗原：分枝杆菌(Mycobacterium)、拟杆菌(Bacteroides)、布鲁氏菌(Brucela)、弯曲菌(Campylobacter)、大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、克氏杆菌(Klebsiela)、假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)、梭状芽孢杆菌(Clostridium)、肠球菌(Enterococcus)、真细菌(Eubacterium)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、消化链球菌(Peptostreptococcus)、螺杆菌(Helicobacter)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、荧光假单胞菌(Pseudomanasfluorescens)、沙门氏菌(Salmonela)、衣原体(Chlamydia)、人类肝炎病毒、人类鼻病毒。

在某些实施方式中，所述一种或者多种炎性疾病标记物使用特异性地结合所述一种或者多种炎性疾病标记物的一种或者多种结合试剂进行检测。在一些实施方式中，所述结合试剂是这样的抗体，该抗体以10^-8M至10^-14M的Kd结合目标分子，并且以大于10^-7M的Kd结合非目标分子。

炎性疾病

使用本申请的方法可以检测到的炎性疾病包括但不限于过敏性反应、脓毒性休克、脓毒性关节炎、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、哮喘、迟发型超敏反应、皮炎、糖尿病(diabetes mellitus)、青少年型糖尿病、移植物排斥反应、炎性肠病、克罗恩氏症、溃疡性结肠炎、肠炎(enteritis)、间质性膀胱炎、多发性硬化症、重症肌无力(myasthemia gravis)、格雷夫氏症、桥本氏甲状腺炎、肺炎、肾炎、肺炎、慢性阻塞性肺病、慢性支气管炎、慢性支气管炎性鼻炎、脊柱关节病、硬皮病以及系统性红斑狼疮和慢性肝炎。

结合试剂

用于炎症标记物的结合试剂是已知的或者能够容易地使用已知技术找到。例如，在炎性标记物是蛋白的情况下，结合配体包括蛋白(特别是包括下文进一步讨论的抗体或者其片段(Fab等)或者小分子。结合试剂还具有与其他物种的蛋白的交叉反应活性。抗原-抗体对、受体-配体以及糖类物质和它们的结合伴侣分子也是适合的分析物-结合配体对。在其他一些实施方式中，结合试剂可以是核酸结合试剂。还发现核酸结合试剂在核酸是结合靶标时特别有用。适体可以开发用于结合几乎所有的炎症标记物。

所述结合试剂可以被改造成以10^-5至10^-14M的Kd结合目标炎症标记。在一些实施方式中，结合试剂以小于10^-5M、小于10^-6M、小于10^-7M、小于10^-8M、小于10^-9M、小于10^-10M或小于10^-12M的Kd结合目标分子。在一个实施方式中，结合试剂以10^-6M至10^-14M的Kd结合目标分子。在一个实施方式中，结合试剂以10^-7M至10^-14M的Kd结合目标分子。在其他一些实施方式中，结合试剂以10^-8M至10^-14M的Kd结合目标分子。在其他一些实施方式中，结合试剂以10^-8M至10^-14M的Kd结合目标分子，并且以大于10^-7M的Kd结合非目标分子。在其他一些实施方式中，在其他一些实施方式中，结合试剂是具有上述Kd范围的抗体。在一些实施方式中，所述抗体具有0.01pM至10μM、0.01pM至1μM、0.01pM至100nM、0.01pM至10nM、0.01pM至1nM、0.1pM至10μM、0.1pM至1μM、0.1pM至100nM、0.1pM至10nM、0.1pM至1nM、1pM至10μM、1pM至1μM、1pM至100nM、1pM至10nM、1pM至1nM、10pM至10μM、10pM至1μM、10pM至100nM、10pM至10nM、10pM至1nM、100pM至10μM、100pM至1μM以及100pM至100nM范围的Kd值。

在各种例示性的实施方式中，所述结合试剂是抗体。这些实施方式对于检测蛋白形式的炎症标记物特别有用。相反，在其他一些实施方式中，结合试剂是抗原，其可能对于检测抗体形式的炎症标记物特别有用。

炎性疾病标记物

炎性疾病标记物可以源自于流行病学研究、动物研究、病理生理学考虑和终末器官实验。理想的是，炎性疾病标记物将具有用于有意义的结果度量的高预测价值，在或者可以在适当设计的前瞻性试验中进行验证，通过替代标记物结果的相应变化来反映治疗成功，并且应当容易地在临床实践中进行评价。炎性疾病标记物可以单独使用或者结合其他诊断工具使用。

在一些不同的实施方式中，可以使用炎性疾病标记物来评价病理学状态。可以单独使用或者结合所获得的关于受试者的其他数据使用炎性疾病标记物的测量结果以确定受试者的状态。在一些实施方式中，炎性疾病标记物允许检测无症状风险。

通常，在本申请中使用的炎性疾病标记物将在患有炎性疾病的受试者中过表达(过于丰富)。然而，在一些实施方式中，炎性疾病标记物相对于对照可以表达不足(低丰度)。炎性疾病标记物可以被确定为例如在不同表型状况之间的“差异存在”，只要在不同表型状况中的炎性疾病标记物的平均值或者平均水平(特别是如下文所述的相关mRNA的表达水平)具有统计学显著性。用于统计学显著性的常规检验包括t-检验、方差分析(ANOVA)、秩和检验(Kruskal-Wallis)、符号秩和检验(Wilcoxon)、曼惠特尼U检验(Mann-Whitney)和优势比(odds ratio)等。

在一些不同的实施方式中，在本申请中使用的炎性疾病标记物可以以任意组合作为蛋白(例如趋化因子)或者作为核酸(例如mRNA或cDNA转录本)进行检测。在一些不同的实施方式中，测量蛋白形式的炎性疾病标记物。如本领域技术人员将理解的那样，使用标准技术如ELISA分子可以进行蛋白分析。在一些不同的实施方式中，测量核酸形式的炎性疾病标记物(例如对应的mRNA)。在一些不同的例示性实施方式中，来自特定组的一种或者多种炎性疾病标记物使用蛋白分析法进行测量，而来自同一组中的一种或者多种炎性疾病标记物使用核酸分析法进行测量。

如本领域技术人员将理解的那样，有大量的可能蛋白和/或核酸炎性疾病标记物可以使用本申请进行检测。在其他一些实施方式中，本文描述的炎性标记物的变体包括蛋白、核酸、剪切变体、包含缺失、增加和/或取代的变体、蛋白或核酸的片段、前原蛋白、加工的前原蛋白(例如没有信号转导肽)、加工的前蛋白(例如得到活性形式)。非人类蛋白、非人类核酸以及它们的变体也可以用作炎性疾病标记物。

在一些实施方式中，炎性疾病标记物包括但不限于CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCR3、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL9、CCL11、CCL12、CCL13、CCL17、CCL20、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCL13、XCL1、CX3CL1、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR5、XCR1；致轻素、肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素-γ(IF-γ)、白介素-1α(IL-1α)、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17和IL-23，以及抗选自由如下炎症相关微生物组成的组的炎症相关微生物的抗体和/或衍生自选自由如下炎症相关微生物组成的组的所述炎症相关微生物的抗原：分枝杆菌(Mycobacterium)、拟杆菌(Bacteroides)、布鲁氏菌(Brucela)、弯曲菌(Campylobacter)、大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、克氏杆菌(Klebsiela)、假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)、梭状芽孢杆菌(Clostridium)、肠球菌(Enterococcus)、真细菌(Eubacterium)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、消化链球菌(Peptostreptococcus)、螺杆菌(Helicobacter)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、荧光假单胞菌(Pseudomanasfluorescens)、沙门氏菌(Salmonela)、衣原体(Chlamydia)、人类肝炎病毒和人类鼻病毒。

在其他一些实施方式中，炎性疾病标记物是编码如下物质的核酸：CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCR3、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL9、CCL11、CCL12、CCL13、CCL17、CCL20、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCL13、XCL1、CX3CL1、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR5、XCR1；致轻素、肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素-γ(IF-γ)、白介素-1α(IL-1α)、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17或IL-23。

分别来自NIH-NCBI Genbank的蛋白和cDNA序列在表1中描述。

表1

趋化因子/受体	蛋白登录号	SEQ ID NO：	cDNA登录号	SEQ ID NO：
					CXCL9	NP_002407	1	NM_002416	72
CXCL10	NP_001556	2	NM_001565	73
					CXCL11	NP_005400	3	NM_005409	74
CXCL12	NP_000600	4	NM_000609	75
					CXCL13	NP_006410	5	NM_006419	76
CXCR3-1	NP_001495	6	NM_001504	77
					CXCR3-2	NP_001136269	7	NM_001142797	78
CXCR5-1	NP_001707	8	NM_001716	79
					CXCR5-2	NP_116743	9	NM_032966	80
CXCL1	NP_001502	10	NM_001511	81
					CXCL2	NP_002080	11	NM_002089	82

趋化因子/受体	蛋白登录号	SEQ ID NO：	cDNA登录号	SEQ ID NO：
					CXCL3	NP_002081	12	NM_002090	83
CXCL4	NP_002610	13	NM_002619	84
					CXCL5	NP_002985	14	NM_002994	85
CXCL6	NP_002984	15	NM_002993	86
					CXCL7	NP_002695	16	NM_002704	87
CXCL8	NP_000575	17	NM_000584	88
					CXCL16	NP_071342	18	NM_022059	89
CXCR1	NP_000625	19	NM_000634	90
					CXCR2	NP_001548	20	NM_001557	91
CXCR4a	NP_001008540	21	NM_001008540	92
					CXCR4b	NP_003458	22	NM_003467	93
CXCR6	NP_006555	23	NM_006564	94
					CCL1	NP_002972	24	NM_002981	95
CCL2	NP_002973	25	NM 002982	96
					CCL3	NP_002974	26	NM 002983	97
CCL4	NP_002975	27	NM 002984	98
					CCL4L1	NP_001001435	28	AY079147	99
CCL5	NP_002976	29	NM 002985	100
					CCL7	NP_006264	30	NM 006273	101
CCL8	NP_005614	31	NM 005623	102
					CCL11	CAG33702	32	NM_002986	103
CCL13	NP_005399	33	NM_005408	104
					CCL14-1	NP_116739	34	NM 032963	105
CCL14-2	NP_116738	35	NM 032962	106
					CCL15	NP_116741	36	NM_032965	107
CCL16	NP 004581	37	NM 004590	108

趋化因子/受体	蛋白登录号	SEQ ID NO：	cDNA登录号	SEQ ID NO：
					CCL17	NP_002978	38	NM_002987	109
CCL18	NP_002979	39	NM_002988	110
					CCL19	NP_006265	40	NM 006274	111
CCL20-1	NP_004582	41	NM 004591	112
					CCL20-2	NP_001123518	42	NM_001130046	113
CCL22	NP_002981	43	NM_002990	114
					CCL23-1	NP_665905	44	NM_145898	115
CCL23-2	NP_005055	45	NM_005064	116
					CCL24	NP_002982	46	NM 002991	117
CCL25-1	NP 005615	47	NM 005624	118
					CCL25-2	NP 683686	48	NM_001201359	119
CCL25-3	EAW68951	49
					CCL26	NP_006063	50	NM 006072	120
CCL27	NP_006655	51	NM_006664	121
					CCR2-A	NP_001116513	52	NM_001123041	122
CCR2-B	NP_001116868	53	NM_001123396	123
					CCR3-1	NP_847899	54	NM_001837	124
CCR3-2	NP_847898	55	NM_178328	125
					CCR3-3	NP_001158152	56	NM_001164680	126
CCR4	NP_005499	57	NM_005508	127
					CCR5	AAB57793	58	NM 000579	128
CCR6	NP_004358	59	U45984	129
					CCR8	NP_005192	60	NM_005201	130
CCR9A	NP_112477	61	AF145439	131
					CCR9B	NP_006632	62	AF145440	132
CCR10	NP_057686	63	AF215981	133

趋化因子/受体	蛋白登录号	SEQ ID NO：	cDNA登录号	SEQ ID NO：
					CCRL1	NP 057641	64	NM 016557	134
CCRL2-1	NP_003956	65	NM 003965	135
					CCRL2-2	NP_001124382	66	NM_001130910	136
XCL1	AAH69817	67	NM_002995	137
					XCR1	NP_005274	68	NM_005283	138
CX3CR1a	NP_001164645	69	NM_001171174	139
					CX3CR1b	NP 001328	70	NM 001337	140
CX3CL1	NP 002987	71	NM 002996	141

本申请的炎性疾病标记物在炎性疾病诊断中显示出统计学显著性差异。在一些不同的实施方式中，单独使用或者组合使用这些炎性疾病标记物的检测试验显示至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％以及约100％的灵敏度和特异性。

炎性疾病标记物组

在一些实施方式中，步骤(a)中的所述一种或者多种炎性疾病标记物包括一组炎性疾病标记物。本文描述的结合试剂的任何组合都可以用来集合(assemble)为用于测量如本文所述的炎性疾病标记物水平的炎性疾病标记物组。如本领域通常理解的那样，组合可以指整个组或者其任何亚组或亚组合。术语“炎性疾病标记物组”、“炎性疾病标记物谱”或“炎性疾病标记物指纹”是指一套炎性疾病标记物。本文使用的这些术语还可以指被测量的任何形式的炎性疾病标记物。因此，如果CXCL10是炎性疾病标记物组的一部分，那么不管是CXCL10mRNA还是CXCL10蛋白都可以被视为该组的一部分。

虽然单个炎性疾病标记物可以用作诊断方法，但是炎性疾病标记物的组合可能有时候在确定特定状态时比单个单独的炎性疾病标记物更加具有价值。特别是，样品中多个炎性疾病标记物的检测可以提高测试的灵敏度和/或特异性。因此，在一些不同的实施方式中，炎性疾病标记物组可以包括1、2、3、4、5、5至10、10至20、10至50、10至100、100至1,000或者更多的炎性疾病标记物。在一些不同的例示性实施方式中，炎性疾病标记物组由最少数量的炎性疾病标记物组成以生成最大数量的信息。因此，在一些不同的实施方式中，炎性疾病标记物组由至少1个、至少2个、至少3个、至少5个、至少8个、至少10个、至少20个、至少50个、至少100个、至少500个以及至少1000个组成。在炎性疾病标记物组“由一套炎性疾病标记物组成”的情况下，除了所述一套炎性疾病标记物中的那些炎性疾病标记物之外不存在其他的炎性疾病标记物。

在一些例示性的实施方式中，炎性疾病标记物组包括：(1)选自由CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5组成的组的2、3、4、5或6种炎性疾病标记物；和选自由如下物质组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物：CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL9、CCL11、CCL12、CCL13、CCL17、CCL20、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、XCL1、CX3CL1、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR4、XCR1；致轻素、肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素-γ(IF-γ)、白介素-1α(IL-1α)、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17和IL-23。

使用本文描述的任何方法和组合物可以分析样品以确定炎性疾病标记物组中的多个炎性疾病标记物的表达水平或相对活性。因此，在一个方面，本申请提供了分析来自患者的样品以确定该样品中炎性疾病标记物组的浓度的方法。在一些实施方式中，所述方法包括使所述样品与包含固体载体的组合物接触，所述固体载体包含用于炎性疾病标记物组中的每一个炎性疾病标记物的结合试剂或捕获探针。

可以将炎性疾病标记物组的定量或活性测量结果与从来源或类型和生物样品相同的已知正常的非炎性细胞的对照样品获得的参考值或对照值比较。于是鉴定出受试者样品中炎性疾病标记物的测量结果相对于参考值的差异。在一些例示性的实施方式中，参考值按照如下进一步描述的风险分类法(risk category)给出。

在一些不同的实施方式中，参考值是基线值。基线值是具有来自不患有疾病、对于疾病没有症状或者具有一定水平的疾病的一种或者多种受试者的有效量的炎性疾病标记物的复合样品。基线值还可以包括样品中来源于作为处理或治疗的结果已经表现出疾病风险因子的改善的受试者的炎性疾病标记物的量。在这些实施方式中，为了对受试者来源的样品进行比较，按类似的方式计算炎性疾病标记物的量。参考值还包括来自通过介入或者非介入技术证实患有疾病或者具有存在高度风险患上疾病的受试者的炎性疾病标记物的量。可选的是，被鉴定为患有疾病或者患上疾病风险正在增加的受试者被选择来接受治疗方案以减缓疾病的进展(progression)或者降低或预防患上疾病的风险。如果炎性疾病标记物的量相对于参考值随时间增加，则疾病被认为进展(或者，作为替代方式，所述治疗没有防止进展)，但是如果炎性疾病标记物的量随时间下降或者保持恒定(相对于参考群体，或者如本文使用的“恒定”)，则认为疾病没有进展。所使用的术语“恒定”在本申请的语境中被解释为包括随时间相对于参考值的变化。

本申请的炎性疾病标记物可以被用来生成根据一定阈值不患有疾病、没有患上疾病的风险或者预期不会患上疾病的那些受试者的“参考炎性疾病标记物谱”。本文公开的炎性疾病标记物还可以被用来生成从具有疾病或具有患上疾病的风险的受试者获得的“受试者炎性疾病标记物谱”。受试者炎性疾病标记物谱可以被用来与参考炎性疾病标记物谱比较以诊断或者鉴定具有患上疾病风险的受试者、监测疾病的进展以及疾病进展的速度以及监测疾病治疗模式的效果。本申请的参考和受试者炎性疾病标记物谱可以被包含在机器可读的介质中，例如但不限于模拟磁带(像可由VCR读取的那些)；光学介质(如CD-ROM，DVD-ROM等)；以及固态存储器等。

本申请的炎性疾病标记物组的测量结果可以指导从业者考虑受试者来选择疗法。炎性疾病标记物水平的测量结果进一步允许监测疾病的治疗过程，如本文进一步描述的那样。疾病治疗方案的效果可以通过随时间检测来自从受试者获得的样品的有效量的一种或者多种炎性疾病标记物并比较所检测的炎性疾病标记物的所述量进行监测。例如，第一样品可以在受试者接受治疗之前获得，并且一种或者多种随后的样品在受试者治疗之前、过程中和/或之后获取，其中，炎性疾病标记物水平在样品之间的变化可以提供关于治疗效果的指示。

炎性疾病标记物的选择取决于待检测的炎性疾病。表1显示了与炎性疾病相关联的一些趋化因子。通过将患者组织样品暴露于抗每一种趋化因子的抗体并且评价抗体/趋化因子结合的量，可以评价每一种趋化因子的表达水平，从而能够诊断和监测炎性疾病。

表2

在一个实施方式中，用于克罗恩氏症、溃疡性结肠炎、肠炎、炎性肠病和/或间质性膀胱炎的炎性疾病标记物组包括：(1)来自由CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5组成的组的一种或者多种成员；和(2)选自由CCL3、CCL4、CCL5和CCR5组成的组的一种或者多种成员。

在另一个实施方式中，关节炎标记物组包括：(1)来自由CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5组成的组的一种或者多种成员；和(2)选自由CXCL12、CCL20、XCL1、CX3CL1、CXCR4、CCR6、XCR1、CX3CR1组成的组的一种或者多种炎性疾病标记物。

在另一个实施方式中，哮喘标记物组包括：(1)来自由CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5组成的组中的一种或者多种成员；和(2)选自由CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCR3、CCR4、CCR5、CCL11、CCL15、CCL17、CCL22、CCL24和CCL26组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物。

在另一个实施方式中，脓毒性休克或过敏性反应标记物组包括：(1)来自由CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5组成的组中的一种或者多种成员；和(2)选自由CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CCL5、CXCR1和CXCR2组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物。

在另一个实施方式中，糖尿病标记物组包括：(1)来自由CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5组成的组中的一种或者多种成员；和(2)选自由CCL2、CCL9、CX3CL1、CCR2、CCR4和CX3CR1组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物。

在另一个实施方式中，皮炎或迟发型超敏反应标记物组包括：(1)来自由CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5组成的组中的一种或者多种成员；和(2)选自由CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL17、CCL29、CCL22、CCL27、CCR4、CCR5、CCR6和CCR10组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物。

在另一个实施方式中，移植物排斥反应标记物组包括：(1)来自由CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5组成的组中的一种或者多种成员；和(2)一种或者多种炎性疾病标记物进一步包括选自由CCL3、CCL4、CCL5、XCL1、CCR5和XCR1组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物。

在另一个实施方式中，间质性膀胱炎标记物组包括：(1)来自由CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5组成的组中的一种或者多种成员；和(2)一种或者多种炎性疾病标记物进一步包括选自由CCL3、CCL4、CCL5和CCR5组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物。

在另一个实施方式中，多发性硬化症标记物组包括：(1)来自由CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5组成的组中的一种或者多种成员；和(2)一种或者多种炎性疾病标记物进一步包括选自由CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL14、CCL15、CCL23、CCR1和CCR5组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物。

在另一个实施方式中，重症肌无力、格雷夫氏症或桥本氏甲状腺炎标记物组包括：(1)来自由CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5组成的组中的一种或者多种成员；和(2)选自由CCL3、CCL4、CCL5、XCL1、CCR5和XCR1组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物。

在另一个实施方式中，肾炎或系统性红斑狼疮标记物组包括：(1)来自由CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5组成的组中的一种或者多种成员；和(2)选自由CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL8、CCL12、CCL13、CX3CL1、CCR2、CCR4和CX3CR1组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物。

在另一个实施方式中，肺炎、慢性阻塞性肺病(COPD)或慢性支气管炎标记物组包括：(1)来自由CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5组成的组中的一种或者多种成员；和(2)选自由CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL7、CXCL8、CCL3、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL24、CCL26、CXCR2、CCR3组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物。

在一些实施方式中，以上描述的标记物组可以进一步包括选自由致轻素、肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素-γ(IF-γ)、白介素-1α(IL-1α)、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17和IL-23组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物。

检测方法

炎性疾病标记物的表达水平可以在转录水平(即mRNA的量)或者翻译水平(即蛋白或抗体的量)上进行确定。本文使用的术语“炎性疾病标记物水平”和“表达水平”在涉及产物量、产物活性或者其组合的定量度量时可以相互交换地使用。在某些实施方式中，炎性疾病标记物的表达通过定量RT-PCR、Northern印迹或者本领域技术人员已知的其他方法在mRNA水平上进行确定。在其他一些实施方式中，炎性疾病标记物的表达使用抗炎性疾病标记物抗体例如抗-CXCL9、抗-CXCL10、抗-CXCL11、抗-CXCL13、抗-CXCR3和抗-CXCR5抗体等通过ELISA、Western印迹或其他类型的免疫检测方法在蛋白水平上进行测定。在还有一些实施方式中，表达水平在炎性疾病标记物活性水平上进行测定。

炎性疾病标记物一般可以通过本领域技术人员已知的各种分析、方法和检测系统进行测量和检测。术语“测量”、“检测”或“进行测量”是指对实体(entity)的性能进行定量或定性测定，例如对分子的量或浓度或者分子的活性水平进行定量。术语“浓度”或“水平”可以指绝对或者相对的量。测量分子还可以包括确定分子的存在或者不存在。

除了上述之外，检测方法可以进一步包括但不限于折射率光谱法(RI)、紫外光谱法(UV)、荧光分析、电化学分析、辐射化学分析、近红外光谱法(近IR)、红外(IR)光谱法、核磁共振光谱法(NMR)、光散射分析(IS)、质谱法、热解质谱法、浊度测定法、分散拉曼光谱法、气相色谱法、液相色谱法、与质谱法结合的气相色谱法、与质谱法结合的液相色谱法、与质谱法结合的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)法、与质谱法结合的离子喷雾光谱法、毛细管电泳、比色法和表面等离子体共振法。在这方面，炎性疾病标记物可以使用上述检测方法或者本领域技术人员已知的其他方法进行测量。其他炎性疾病标记物可以使用专门设计或者定制的试剂进行类似检测来检测它们。

分析可以以溶液形式进行或者在固体支持物上进行。术语“固体支持物”或者“基底”是指能够改性成含有适合用于结合或者关联结合试剂的离散的各个位点的任何材料。适当的基底包括金属表面(如金)、电极、玻璃和改性的或者功能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚碳酸酯、聚氨酯、特氟龙(Teflon)以及它们的衍生物等)、多糖、尼龙或硝化纤维素、树脂、云母、石英或硅基材料，包括硅和改性硅、碳、金属、无机玻璃、纤维玻璃、陶瓷、GETEK(聚氧化丙烯和纤维玻璃的共混物)和各种其他聚合物。

不同类型的炎性疾病标记物和它们的测量可以结合到本申请的组合物和方法中。在一些实施方式中，测量蛋白形式的炎性疾病标记物。在其他一些实施方式中，测量核酸形式的炎性疾病标记物，例如DNA或mRNA。在一些实施方式中，蛋白炎性疾病标记物的测量结果被用来与核酸炎性疾病标记物的测量结果结合。

在一些实施方式中，目标物种的检测需要能够以各种方式引入的“标签”或“可检测标记”(如下文所述)。于是，在一些不同实施方式中，组合物包括“标签”或“可检测标记”。在一个实施方式中，目标物种(或者目标分析物或目标序列)被标记；因此目标物种的结合提供了在固体支持物的表面上的标签。

在本文中具有特定用途的实施方式中，使用夹心形式，其中目标物种没有被标记。在这些实施方式中，“捕获”或“锚定”结合配体结合至本文所述的检测表面，并且可溶性结合配体(本文经常称为“信号转导探针”、“标签探针”或“可溶性捕获配体”)独立地结合至目标物种，并且直接或者间接地包含至少一种标签或可检测标记物。

本文的“标签”或“标记的”是指化合物具有结合有至少一种分子、元素、同位素或化合物以能够检测该化合物。一般来说，标签分为四类：a)同位素标签，其可以是放射性同位素或者是重同位素；b)磁性的、电的、热的；c)染色或发光染料；和d)酶；不过标签也包括颗粒如磁性颗粒。染料可以是生色团或磷光体但是优选是荧光染料，荧光染料由于它们的信号强，因此为解码提供了良好的信噪比。适合于本申请使用的染料包括但不限于：荧光镧系复合物，包括铕和铽的那些染料、荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、赤藓红、香豆素、甲基-香豆素、芘、固绿(Malacite green)、芪、荧光黄、级联蓝、德克萨斯红和Alexa染料等。

在一些不同的实施方式中，使用次级可检测标签。次级标签是进行间接检测的标签；例如，次级标签可以与初级标签结合或反应以进行检测，能够作用于其他的产物以生成初级标签(例如酶)，或者可以允许包含次级标签的化合物与没有被标记的材料分离等。次级标签包括但不限于结合伴侣分子对；可化学改性的部分；核酸酶抑制剂、诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶等酶中的一种。次级标签还可以包括额外的标签。

在一些不同的实施方式中，次级标签是结合伴侣分子对。例如，所述标签可以是半抗原或者抗原，它们结合其结合伴侣分子。例如，适当的结合伴侣分子对包括但不限于：抗原(例如蛋白(包括肽))和抗体(包括其片段(Fab等))；蛋白和小分子，包括生物素/链霉亲和素；酶和底物或者抑制剂；其他蛋白-蛋白相互作用对；受体-配体对；和碳水化合物和它们的结合伴侣分子。核酸-核酸结合蛋白对也是可用的。一般而言，较小的对结合至NTP以引入到引物中。优选的结合伴侣分子对包括例如生物素(或者亚氨基-生物素)和链霉亲和素。

在本申请的夹心式形式中，酶用作次级标签，结合至可溶性捕获配体。在一些实施方式中特别有用的是使用辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶在与3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)组合时形成显色的沉淀物，然后可以对该沉淀物进行检测。在一些情况中，可溶性捕获配体包含生物素，然后其结合至酶-链霉亲和素复合物并且添加TMB后形成显色的沉淀物。

在一些不同的实施方式中，标签或者可检测标记物是偶联酶(例如辣根过氧化物酶)。在一些不同的实施方式中，所述系统依靠对反应产物的沉淀进行的检测或者依靠例如用于检测的电特性的变化进行的检测。在一些不同的实施方式中，化合物不包含标签。

本文使用的术语“荧光信号生成部分”或者“荧光团”是指在一个波长吸收能量而在另一个波长重新发射能量的分子或者分子的一部分。能够被测量的荧光性质包括荧光强度、荧光寿命、发射光谱特性和能量传递等。

可以通过很多检测系统来生成并检测来自单个分子的信号，这样的系统包括但不限于扫描电子显微术、近场扫描光学显微术(NSOM)、全内反射荧光显微术(TIRFM)，等等。应用这些技术分析和检测表面上的纳米级结构对于本领域技术人员而言是已知的。

用于荧光团的检测系统可以包括能够被用来测量上述讨论的荧光性能的任何设备。在一些不同的实施方式中，所述检测系统包括激发源、荧光团、用于将发射光子和激发光子分离的波长滤波器和寄存发射光子并产生可记录输出的检测器(在一些实施方式中，所述可记录输出是电信号或照片图像)。检测设备的例子包括但不限于荧光分光光度计和微板读板仪、荧光显微镜、荧光扫描仪(包括例如微阵列读头)和流式细胞仪。

在一些不同的例示性的实施方式中，炎性疾病标记物与结合配体的结合具有特异性或者选择性，并且结合配体是结合对的一部分。本文的“特异性结合”或者“选择性结合”炎性疾病标记物或者对炎性疾病标记物“具有选择性”是指配体结合炎性疾病标记物，这种结合具有足以区分受检样品中的炎性疾病标记物和其他组分或者污染物的特异性。

核酸检测

用于检测mRNA的方法例如RT-PCR、实时PCT、分支DNA、NASBA和其他方法在本领域中是已知的。使用与用于炎性疾病标记物序列的数据库条目(database entry)相对应的序列信息，可以使用本领域技术人员已知的技术检测和测量炎性疾病标记物序列(例如存在的话)的表达。例如，序列数据库条目中的序列在例如Northern印迹杂交分析或者特异性扩增优选定量地扩增核酸序列的方法中可以被用来构建用于检测炎性疾病标记物RNA序列的探针。作为另一个例子，所述序列可以在例如基于扩增的检测方法如基于反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)中被用来构建用于特异性地扩增炎性疾病标记物序列的引物。当基因表达中的变化与基因扩增、缺失、多态性和突变相关时，可以通过比较受检细胞群和参考细胞群中所测定的DNA序列的相对量来对受检细胞群和参考细胞群进行序列比较。除了Northern印迹和RT-PCR之外，还可以使用例如其他靶向扩增方法(例如TMA、SDA，NASBA)、信号扩增方法(例如bDNA)、核酸酶保护分析和原位杂交等来测量RNA。

检测或者测量炎性疾病标记物的水平(例如转录水平)涉及当准备在固体支持物上检测炎性疾病标记物的mRNA时使炎性疾病标记物与用作“捕获探针”的结合试剂相结合。在这种情况下，炎性疾病标记物是目标序列。本文中的术语“目标序列”或“目标核酸”或语法上等效的术语是指这样的核酸序列，其可以是基因、调控序列、基因组DNA、cDNA、RNA(包括mRNA和rRNA)等的一部分。如在本文中所概述的那样，目标序列可以是来自于样品的目标序列或者次级目标序列，如扩增反应如PCR等的产物。因此，在一些实施方式中，测量核酸可以指测量核酸的互补序列。其可以具有任意长度，可以理解的是，序列越长，特异性越高。

目标序列还可以包含不同的目标域；例如，样品目标序列的第一目标域可以与第一捕获探针杂交，第二目标域可以与标签探针(例如“夹心分析”形式)杂交等。目标域可以如所示的那样是相邻的或者是分开的。除非另有说明，否则术语“第一”和“第二”不是指对于目标序列的5'-3'方向赋予序列一个方向。例如，假设目标序列为5'-3'方向，第一目标域可以定位在第二域的5'，或者第二域的3'。

当使用核酸作为目标分析物时，本申请的分析可以在很多实施方式中进行。在一个实施方式中，分析可以使用任意数量的基于溶液的形式以溶液形式进行。在一个实施方式中，使用端点或实时PCR形式，如本领域已知的那样。这些分析可以作为一组、微阵列或者多重分析或者使用位于单个管或孔中的引物组和不同的标签在单个管或孔中进行。除了基于PCR溶液形式之外，可以使用其他形式，包括但不限于例如使用FRET染料对的基于连接的分析。在该实施方式中，只有两个(或者更多个)与目标序列杂交的探针连接后才会生成信号。

在一个实施方式中，目标序列包含可检测标签，所述可检测标签可以采用如下两种方式中的任一种方式在靶标扩增的过程中例如添加至目标序列：在扩增步骤的过程中使用被标记的引物或者使用被标记的dNTP，在本领域中这两种方式都是已知的。标签可以是本文所讨论的初级标签或次级标签。例如，在一个实施方式中，在引物和/或dNTP上的标签是诸如荧光团之类的初级标签。作为替代方式，所述标签可以是诸如生物素或酶之类的次级标签；例如，在一个实施方式中，引物或dNTP使用生物素进行标记，然后添加链霉亲和素/标签复合物。在一个实施方式中，链霉亲和素/标签复合物含有诸如荧光团之类的标签。在一个替代实施方式中，链霉亲和素/标签复合物包含酶标签。例如，该复合物包含辣根过氧化物酶，并且在添加TMB之后，辣根过氧化物酶的作用导致TMB沉淀，导致光学可检测的事件。这是特别有利的，因为用于检测的光学器件不需要使用荧光计。

对于本领域技术人员而言，对于核酸的标记特别是DNA或RNA的标记，有很多已知的各种方法。例如，通过引物延伸、体外转录、生物素-链霉亲和素标记、基于等温Klenow片段(isothermal Klenowfragment)的标记或者直接核酸扩增标记，优选通过直接PCR标记来进行核酸的标记。一个优选的标记方法包括使用荧光染料特别是Cy5。

扩增得到的被标记核酸在核酸扩增反应之后可以经过或者未经过纯化或洗涤步骤的情况下应用于微阵列。在一个实施方式中，对DNA或RNA进行多重PCR，利用引物延伸进行的荧光标记(Cy5-dCTP)然后进行微阵列杂交。

在一些实施方式中，当目标分析物是核酸时，固相分析依赖于使用被标记的可溶性捕获配体，有时称为“标签探针”或“信号转导探针”。在该形式中，分析是“夹心式”分析，其中所述捕获探针结合至目标序列的第一域，并且标签探针结合至第二域。在这个实施方式中，标签探针还可以是初级标签(例如荧光团)或次级标签(生物素或酶)。在一个实施方式中，标签探针包含生物素，并且使用链霉亲和素/酶复合物，如本文所讨论的那样。如上所述，例如，所述复合物可以包含辣根过氧化物酶，并且在添加TMB后，辣根过氧化物酶的作用导致TMB沉淀，从而导致光学可检测的事件。

在其他一些实施方式中，在固体支持物上使用与表面相连的捕获探针进行分析。如本文所讨论的那样，例如使用官能团例如氨基末端修饰的捕获探针可以使捕获探针(或者结合试剂，如有时它们所被称呼的那样)共价结合至所述表面，该官能团被结合至经修饰表面如硅烷化玻璃)。作为替代方式，可以利用非共价结合如静电、疏水/亲水粘附。如本领域技术人员所认识到以及本文所讨论的那样，在各种不同的表面上实现大量的结合是可能的。

免疫检测

本领域技术人员熟悉对检测蛋白或抗体有用的很多其他的免疫分析形式及其变化方式。适当的免疫分析的例子包括免疫印迹、免疫荧光法、免疫沉淀、化学发光法、电化学发光法(ECL)或酶联免疫分析。一般而言，根据本申请进行的免疫分析可以是同相分析(homogeneous assay)或异相分析(heterogeneous assay)。

在同相分析中，免疫学反应常常涉及特异性抗体(例如抗炎性疾病标记物蛋白抗体)、被标记的分析物和感兴趣的样品。在抗体与被标记的分析物结合后，直接或者间接改变(modify)从标签产生的信号。可以在同相溶液中进行免疫学反应及其程度检测。可以利用的免疫学标签包括自由基、放射性同位素、荧光染料、酶、噬菌体或辅酶。

在异相分析方法中，试剂一般是样品、抗体，还有用于产生可检测信号的装置(mean)。可以使用上述样品。抗体可以偶联至适合用于诊断分析的固体支持物(例如诸如蛋白A或蛋白G琼脂糖之类的珠子、由诸如胶乳或聚苯乙烯之类的材料形成的孔、载玻片、板或微球)，并与怀疑含有抗原的试样在液相中接触。然后将支持物与液相分离，并采用用于产生可检测信号的装置检测支持物相或液相的所述信号。所述信号与样品中分析物的存在相关。用于产生可检测信号的装置包括使用放射活性标签、荧光标签或酶标签。按照本领域已知的技术，本文描述的抗体可以被偶联至可检测标签或基团，如放射性标签(例如³⁵S、¹²⁵I、¹³¹I)、酶标签(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)和荧光标签(例如荧光素、Alexa、绿色荧光蛋白、罗丹明)。如果待检测抗原含有第二结合位点，可以在分离步骤之前使结合至该位点的抗体偶联至可检测基团并且添加至液相反应溶液中。可检测基团在固体支持物上的存在指示抗原在受检样品中的存在。

在某些实施方式中，使用酶联免疫吸附分析(ELISA)检测炎性疾病标记物，所述酶联免疫吸附分析一般使用抗体包被分析板或孔来进行。常用的ELISA分析采用夹心式免疫分析或竞争性结合免疫分析。

简而言之，夹心式免疫分析是使用两种抗体的方法，所述抗体结合至抗原或配体上的不同位点。对抗原具有高度特异性的初级抗体附接至固体表面。然后添加抗原，再添加被称为检测抗体的次级抗体。检测抗体将抗原结合至与初级抗体不同的表位。结果，抗原被“夹持”在两个抗体之间。抗原的抗体结合亲和力一般是免疫分析灵敏性的主要决定因素。随着抗原浓度的增加，检测抗体的量也增加，导致产生更多的被测量的反应。夹心式结合分析的标准曲线具有正斜率。为了对结合程度进行定量，可以使用不同的报告子。典型的是，酶附接至次级抗体，所述次级抗体必须在与初级抗体不同的物种中产生(即，如果初级抗体是兔抗体，次级抗体将是来自羊、鸡等但不能是来自兔的抗兔抗体)。将酶的底物添加至反应中，形成作为检测信号的比色读出数。所产生的信号与样品中存在的目标抗原的量成比例。

用于测量结合事件的抗体连接报告子确定检测模式。可以使用分光光度板读板器来进行比色检测。目前已经开发出若干类型的报告子来提高免疫分析的灵敏性。例如，已经开发出化学发光底物，该底物进一步增强信号并且能够在发光板读板器上读取。此外，使用带有荧光体标签的抗体代替分析的酶步骤的荧光读出数变得非常受欢迎。然后使用荧光板读板器测量这种读出数。

竞争性结合分析是基于被标记和未被标记的配体对数量有限的抗体结合位点的竞争。竞争抑制分析经常被用来测量小的分析物。在不存在与分析物配对的抗体的时候也使用这些分析。在竞争性结合ELISA中只使用一种抗体。这是因为两种抗体都想要结合非常小的分子的话会发生的空间位阻的缘故。将固定量的被标记的配体(痕量)和可变量的未被标记的配体与抗体一起温育。根据质量作用定律，被标记的配体的量是被标记的和未被标记的配体的总浓度的函数。随着未被标记的配体的浓度的增加，较少的被标记的配体能够结合至抗体，并且测得的反应下降。因此，信号越低，样品中存在的未被标记的分析物越多。竞争性结合分析的标准曲线具有负斜率。

在某些实施方式中，使用抗体包被的微珠来检测炎性疾病标记物。在一些实施方式中，所述微珠是磁珠。在其他一些实施方式中，所述珠子是使用荧光染料进行内部颜色编码，并且珠子的表面标记有抗炎性疾病标记物抗体(例如抗-CXCL9、抗-CXCL10、抗-CXCL11、抗-CXCL13、抗-CXCR3或抗-CXCR5抗体)，这些抗体能够结合受检样品中的炎性疾病标记物。炎性疾病标记物反过来又或者被荧光标签直接标记，或者被偶联至荧光标签的抗-标记物抗体间接标记。因此有两种颜色来源，一种来自珠子，另一种来自荧光标签。作为替代方式，珠子可以通过不同尺寸进行内部编码。

通过使用来自两种染料的具有不同荧光强度的混合物以及具有不同尺寸的珠子，所述分析可以测量多达数百种不同的炎性疾病标记物。在分析过程中，将含有颜色/尺寸编码珠子的混合物、荧光标记抗-标记物抗体和样品合并并注射到使用精确射流技术来对准珠子的仪器中。然后使珠子通过激光器，并且基于它们的颜色或尺寸，对颜色强度进行分类或测量，针对每个反应将所述颜色强度处理为量化数据。

当使用荧光团直接标记样品时，所述系统可以读取并只定量珠子上的荧光而无需移除溶液中没有结合的荧光团。所述分析可以通过区分各种不同的经显色或尺寸设计的珠子而多重化。当样品直接要求是未被标记的样品时，可以实现实时测量。标准分析步骤包括将样品与抗-标记物抗体包被的珠子温育、与生物素或荧光团标记的次级抗体一起温育、和检测荧光信号。荧光信号可以在珠子上显色(对于生物素化的次级抗体，通过添加链霉亲和素-荧光团偶联物)并且利用珠子分析仪读出。根据固定在珠子表面上的抗-标记物，基于珠子的免疫分析可以是夹心型或者竞争型免疫分析。

生物芯片和微阵列

在一个实施方式中，所述方法使用一种或者多种生物芯片或微阵列分析来进行。术语“生物芯片”、“芯片”和“微阵列”可以相互交换使用，针对包含固体支持物或基底的组合物，结合试剂(或者当测量核酸时是捕获探针)附接至所述固体支持物或基底上以结合蛋白、核酸或其组合。一般来说，在使用生物芯片来测量蛋白和核酸炎性疾病标记物的情况下，蛋白炎性疾病标记物在与用于测量核酸炎性疾病标记物使用的芯片分开的不同芯片上进行测量。作为用于测量核酸的其他平台和方法的非限制性例子，参见专利公报US/2006/0275782和US/2005/0064469。在一些不同的实施方式中，在同一平台上例如一个芯片上测量炎性疾病标记物。在一些不同的实施方式中，使用不同的平台和/或不同的试验轮次测量炎性疾病标记物。

生物芯片表面经常包括多个可寻址的位置，每个位置包含结合试剂。本文的“阵列位置”、“可寻址位置”、“阵点(pad)”或“位点”是指基底上包含共价连接的结合试剂的位置。本文的“阵列”是指规则有序形式例如矩阵的多个结合试剂。阵列的尺寸取决于阵列的组成和最终的用途。可以制作含有约两种或者更多种不同的结合试剂至数千种结合试剂的阵列。所述阵列可以包括对照、标记物的重复等。例示性范围为约3至10、10至约100、约100至约1000、以及约1000至约10000或者更多。

在一些实施方式中，可以在使用一种或者多种以前所述的抗体(Antimicrob.Agents Chemother.12：3288-3297，2000)处理之后通过使用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)来展示16S rRNA转录本在细菌感染细胞中的存在，从而鉴定体内持续性感染。例如，在一实施方式中，可以通过16S rRNA图谱分析来检测和/或量化与微生物体对应的组III微生物炎性疾病标记物。

在一个实施方式中，这种方法包括如下额外的步骤：(a)从生物样品扩增DNA或RNA；(b)从与所述生物样品的来源或类型相同的已知正常的非炎性细胞的对照样品扩增DNA或RNA；(c)使步骤(a)和(b)中扩增得到的核酸与微阵列接触，所述微阵列包含位于微阵列表面上的限定区域上的用于微生物DNA的固定探针，所述微生物DNA编码微生物病原体的16S或18S rRNA；(d)通过检测与微阵列特异性结合的扩增核酸来检测一个物种或多个物种的被标记的扩增核酸与探针的结合；和(e)鉴定样品中与患有炎性疾病的受试者相关联的一种或者多种微生物体。

可以通过已知的方法例如PCR方法来扩增DNA。在PCR中，优选引物针对保守区域以确保最大群的微菌群DNA得到扩增，同时所扩增的区域包括较少保守的区域，从而能够进行广泛的多态性分析。适当的例子例如可以包括16S rRNA基因、23S rRNA基因或16S和23S rRNA基因之间的区域。任何形式的多态性分析都是适合的。能够被检测到的产物越具有可变性，分析将越确定。例如，可以在16SrRNA基因的可变区上进行限制性片段长度多态性分析。

在一个优选的实施方式中，以DNA生物芯片形式的微阵列中进行16S rRNA图谱分析，所述生物芯片包括有关微生物靶标的寡核苷酸捕获探针，所述靶标可以代表属组或个体物种。因此，微阵列可以包括例如25种不同的微生物，包括大范围的各种革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物。这种微阵列能够使得在较短的时间框例如6小时内进行微生物的检测和/或相对定量，从而能够在属和/或种水平上对来自生物样品的病原体进行快速诊断并且为治疗性处理提供重要的结论。

优选的是，通过PCR反应在编码16S或18S rRNA的微生物DNA上进行核酸扩增反应。可以通过例如多重PCR进行扩增反应，然而，根据本申请，已经证明减少用于核酸扩增的引物数量是有利的。因此，在根据本申请的方法中，在编码16S或18S rRNA的微生物DNA上进行核酸扩增反应优选使用编码16S或18S rRNA的微生物DNA的通用引物进行，优选使用不超过8个(例如4个正向，4个反向)引物，更优选使用不超过6个(例如3个正向，3个反向)引物，优选使用不超过4个(例如2个正向，2个反向)引物进行。

在一些实施方式中，扩增得到的经标记的核酸在核酸扩增反应之后直接应用于微阵列而无需进行纯化或洗涤步骤。

在一些实施方式中，所述微阵列包括用于编码来自至少10种、优选至少15种、特别是至少20种如下微生物病原体的16S或18SrRNA的微生物DNA的固定探针：分支杆菌(Mycobacterium)(结核分枝杆菌(tuberculosis)、鸟副结核分枝杆菌(aviumparatuberculosis))、拟杆菌(Bacteroides)、布鲁氏菌(Brucela)、弯曲杆菌(Campylobacter)(简明弯曲杆菌(concisus)、霍尼努斯弯曲杆菌(hominus)、乌普萨拉弯曲杆菌(upsaliensis)和尤里奥莱提卡斯弯曲杆菌(C.ureolyticus))、大肠杆菌(Escherichia coli)(包括黏附侵袭性大肠杆菌(adhesive-invasive E.coli(AIEC)))、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、克雷白氏杆菌(Klebsiela)、假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)、梭状杆菌(艰难)(Clostridium(dificile))、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、真细菌(Eubacterium)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、消化链球菌(Peptostreptococcus)、螺杆菌(肝)(Helicobacter(hepaticus))、荧光假单胞菌(Pseudomanas fluorescens)、沙门氏菌(Salmonela)和衣原体(Chlamydia)等。

所述微阵列可以包括至少10种不同的物种和/或属，优选至少15种不同的种/属，特别优选20种不同的种/属。

在一些实施方式中，所述微阵列包括具有多特异性的固定探针。本文使用的术语“多特异性”是指对一个属中的多种不同的微生物物种或者对横跨多个微生物属的多个不同的微生物物种的结合特异性。

所述微阵列可以包括探针作为表面上的菌斑，优选的是在所述菌斑中的每一个菌斑中只存在一个物种的探针。本申请的探针是核酸分子，尤其是DNA分子，所述分子结合至根据本申请扩增的核酸，即，对与16S或18S rRNA对应的微生物DNA具有特异性的核酸分子。

优选的是，根据本申请的所述微阵列包括至少5个，优选至少10、15、20、30、40或更多的特异性和/或多特异性固定探针。在一些具体的实施方式中，所述微阵列可以包括微阵列上固定的全部数量的探针的至少5％、10％、20％、30％、40％或50％多特异性探针的一部分。

在一些其他的实施方式中，炎性疾病标记物通过含有固定在其表面上的炎性疾病标记物特异性抗体的蛋白微阵列来检测。所述微阵列可以以“夹心式”分析使用，其中，微阵列上的抗体捕获受检样品中的炎性疾病标记物，并且通过特异性地结合被捕获的标记物的被标记的次级抗体来检测所捕获的标记物。在一个优选的实施方式中，所述次级抗体是生物素化的或被酶标记的。通过随后与链霉亲和素-荧光团偶联物(对于荧光素检测)或酶底物(对于比色检测)一起温育来实现检测。

典型地，微阵列分析含有多个温育步骤，包括与样品的温育、与各种试剂(例如初级抗体、次级抗体、报告试剂等)的温育。在各温育步骤之间还需要重复洗涤。在一个实施方式中，微阵列分析以快速分析模式进行，该快速分析模式只要求一次或两次温育。还可以考虑的是，可以在单次温育步骤中通过将蛋白微阵列暴露于样品和所有必要试剂的混合物来实现可检测的免疫复合物(例如被捕获的炎性疾病标记物/抗-标记物抗体/标签复合物)的形成。在一个实施方式中，初级抗体和次级抗体是相同的抗体。

在另一个实施方式中，蛋白微阵列提供了竞争性免疫分析。简而言之，将包括固定的抗-标记物抗体的微阵列与受检样品在经标记的炎性疾病标记物标准物存在的情况下温育。经标记的炎性疾病标记物与受检样品中未被标记的炎性疾病标记物竞争地结合至固定的抗原特异性抗体。在这种竞争环境中，受检样品中的特异性炎性疾病标记物的浓度的增加将导致经标记的炎性疾病标记物标准物与固定抗体的结合减少，因此来自该标签的信号强度降低。

所述微阵列可以采用手动、半自动或自动模式进行。手动模式是指手动操作所有的分析步骤，包括将试剂和样品递送至微阵列上、样品温育和微阵列洗涤。半自动模式是指手动操作将样品和试剂递送至微阵列上，但是自动操作温育和洗涤步骤。在自动模式中，三个步骤(样品/试剂递送、温育和洗涤)都可以由计算机或带有键盘的集成实验电路板单元(breadboard unit)来控制。例如，微阵列可以使用ProteinArray Workstation(PerkinElmer Life Sciences，Boston，Mass.)或Assay 1200^TM.Workstation(Zyomyx，Hayward，Calif.)进行。可以使用采用荧光、比色和化学发光的扫描仪来检测微阵列信号并捕获微阵列图像。还可以通过其他方式例如质谱或表面等离子体共振来实现基于微阵列的分析的定量。可以通过独立的图像分析软件或使用图像采集和分析软件包来分析所捕获的微阵列图像。例如，可以使用基于荧光PMT扫描仪——ScanArray 3000(GeneralScanning，Watertown，Mass.)或基于比色CCD的扫描仪--VisionSpot(Allied Biotech，Ijamsville，Md.)来实现抗原微阵列的定量。典型的是，图像分析将包括使用独立的软件包进行的数据采集和分析报告的准备。为了加快从捕获图像到产生分析报告的整个分析过程，可以将所有的分析步骤，包括图像捕获、图像分析和报告生成都限于一个软件包和/或可以由一个软件包控制。这种一体化的控制系统将以用户友好的方式提供图像分析和分析报告的生成。

因此，在一个方面，本申请提供了包含固体支持物的组合物，所述固体支持物包含用于在炎性疾病标记物组中的炎性疾病标记物的多种结合试剂。在一些实施方式中，捕获配体是核酸探针。在其他一些实施方式中，结合试剂是抗体或抗体结合蛋白。在又一些实施方式中，所述组合物进一步包含用于炎性疾病标记物组中的每一种炎性疾病标记物的可溶性结合配体。

可以使用本领域已知的很多不同的生物芯片阵列平台。例如，本申请的组合物和方法可以采用诸如(Affymetrix)、CodeLink^TMBioarray(Amersham)、Expression Array System(Applied Biosystems)、SurePrint microarrays(Agilent)、LD BeadChip或Array Matrix(Illumina)、Verigene(Nanosphere)和ClonDiag ArrayTube(AT)(Alere TechnologiesGmbH，Jena，Germany)之类的阵列平台来实现。

在一些实施方式中，炎性疾病标记物的检测和测量利用比色法和系统以提供目标分析物或目标物种的结合的指示。在比色法中，结合的诸如炎性疾病标记物等的目标物种的存在将导致样品或底物在一个或者多个波长的吸光度或透光度的变化。因此在所述波长的吸光度或透光度的检测提供了目标物种存在的指示。

用于比色法的检测系统包括能够用来测量上文所讨论的比色特性的任何设备。一般来说，所述设备是分光光度计、比色计或测量一种或者多种波长的吸光度或透光度的任何设备。在一些不同的实施方式中，所述检测系统包括光源；波长滤波器或单色器；诸如比色皿或反应瓶之类的样品容器；寄存透射的光的检测器如光敏电阻器；和显示器或成像元件。

测试棒

在一些其他的实施方式中，使用测试棒检测液体样品中的炎性疾病标记物。测试棒一般包含流体不可渗透的外壳和具有一种或多种检测区的流体可渗透的“棒”。在一个实施方式中，每个检测区含有结合至生物样品中的炎性疾病标记物的干燥结合试剂。在另一个实施方式中，所述干燥结合试剂是经标记的结合试剂。在另一个实施方式中，测试棒可以进一步包括用于指示分析测试已经满意进行，即试剂存在于测试棒中并且它们在进行测试的过程中已经被移动并且已经沿着流动路径运输的对照区。对照区还可以指示设备中的试剂能够发生免疫化学相互作用，证实设备的化学完整性。当考虑在干燥条件下在一定温度范围内保存和运输所述设备时，这是重要的。对照区一般定位在反应区的下游并且可以例如包括用于经标记的结合试剂的固定结合试剂。经标记的结合试剂可以以可移动形式存在于对照区和检测区的上游。经标记的结合试剂可以与用于炎性疾病标记物的经标记的结合试剂相同或不同。

在一个实施方式中，测试棒包括多孔性样品接收器，所述接收器与一种或多种流动路径流体连接并且位于所述一种或多种流动路径的上游。多孔性样品接收器对于所有分析可以是公共的。于是，施加至设备的公共样品施加区域的流体样品能够沿着一个或者多个流动路径行进到相应的检测区。多孔性样品接收器可以设置在壳体中或者可以至少部分地从所述壳体延伸出来并且可以起到例如收集体液用于样品的作用。多孔性样品接收器还可以用作流体存储器。多孔性样品接受构件可以由能够快速吸收液体的任何吸水的多孔性或纤维质材料制得。材料的空隙度可以是单向的(即，空隙或纤维全部或者绝大多数平行于所述构件的轴线延伸)或多向的(全向的，使得所述构件具有无定型海绵状结构)。可以使用如聚丙烯、聚乙烯(优选具有非常高的分子量)、聚偏二氟乙烯、乙烯乙酸乙烯酯、丙腈和聚四氟乙烯等多孔性塑性材料。其他适当的材料包括玻璃纤维。

如果需要，可以在载体材料的远端设置吸附“槽”。所述吸附槽可以包括例如Whatman 3MM层析纸，并且应当提供足够的吸附能力以允许任何没有结合的被标记的结合试剂从检测区洗出。作为所述吸附槽的一个替代方式，具有一段延伸超过检测区的多孔性固相材料可能是足够的。

在将结合试剂施加至检测区之后，可以处理余下的多孔性固相材料以包封任何余留的结合位点。包封可以通过例如使用蛋白(例如牛血清白蛋白或乳蛋白)或者使用聚乙烯醇或乙醇胺或者它们的组合进行处理来实现。为了帮助被标记的结合试剂在多孔性载体被样品润湿时的自由迁移，多孔性载体可以进一步包括糖，如蔗糖或乳糖和/或其他物质，如聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。可以将这种材料例如作为水溶液沉积在将施加被标记的结合试剂的区域中。这些材料可以施加至多孔性载体作为第一次施加，然后施加标签；作为替代方式，可以将这些材料与标签混合并且施加在多孔性载体或者其组合。这种材料可以沉积在被标记的结合试剂的上游或者沉积在被标记的结合试剂处。

作为替代方式，多孔性载体可以在制造时没有被包封；相反，将用于包封多孔性材料的包封物(means)包括在多孔性载体的上游的材料中。在润湿测试条时，用于包封多孔性载体的包封物被移动并且包封用的包封物流动进入并经过多孔性载体，从而随着流动的进行而包封。包封用的包封物包括蛋白如BSA和酪蛋白以及聚合物如PVP、PVA以及糖和去污剂如Triton-X100。包封用的包封物可以存在于大孔型载体材料中。

可以将干燥的结合试剂提供在在多孔性载体材料上游提供的包括检测区的多孔性载体材料上。上游的多孔性载体材料可以为大孔型。大孔型载体材料应当是低蛋白结合或非蛋白结合，或者应当能够容易地通过试剂如BSA或PVA进行包封，以使非特异性结合最小化以及促进被标记的试剂在使用液体样品弄湿大孔型主体之后自由移动。如果需要，可以使用表面活性剂或溶剂对大孔型载体材料进行预处理以使其更加具有亲水性并且促进液体样品的快速吸收。用于大孔型载体的适当材料包括塑性材料如聚乙烯和聚丙烯或者诸如纸或玻璃纤维之类的其他材料。在被标记的结合试剂使用可检测颗粒标记的情况中，大孔型主体可以具有比颗粒标签的最大颗粒尺寸大的至少10倍的孔隙尺寸。较大的空隙尺寸使被标记的试剂更好地释放。作为大孔型载体的替代方式，可以将被标记的结合试剂提供在在检测区的上游提供的非孔隙性基底上，所述非孔隙性基底形成流动路径的一部分。

在另一个实施方式中，测试棒可以进一步包括用于接收流体样品的样品接收构件。所述样品接收构件可以从所述壳体延伸。

所述壳体可以由流体不可渗透的材料构建。所述壳体还将有利地排除环境的光。只要少于10％，优选少于5％，最优选少于1％的入射在设备的外部的可见光穿透到设备的内部，就将认为所述壳体基本排除周围的光。包含适当的阻光颜料的诸如聚碳酸酯、ABS、聚苯乙烯(polystyrene)、聚苯乙烯(polystyrol)、高密度聚乙烯或聚丙烯之类的光不可透过合成塑性材料是在制造所述壳体中使用的适合选择。可以在壳体的外部设置孔洞，该孔洞与设置在壳体内的内部空间中的分析连通。作为替代方式，所述孔洞可以用以允许多孔性样品接收器从所述壳体向壳体的外部位置延伸。

可植入生物传感器

在其他一些实施方式中，炎性疾病标记物使用可植入生物传感器来检测。生物传感器是产生作为生物相互作用的结果的电子信号的电子设备。在一个实施方式中，生物传感器使用抗体、受体、核酸或结合对的其他成员来与通常是结合对的另一个成员的炎性疾病标记物结合。生物传感器可以与血样一起使用以确定炎性疾病标记物的存在而无需进行自动免疫分析系统通常需要的样品制备和/或分离步骤。

在一个实施方式中，传感器是纳米设备。传感器系统包括附接至纳米线的生物识别元件和能够确定与纳米线相关联的性质的检测器。生物识别元件是结合对的一个成员(例如炎性疾病标记物的受体或抗炎性疾病标记物的抗体)，其中正被测量的炎性疾病标记物是结合对的另一个成员。优选的是，纳米线传感器包括半导体纳米线，所述半导体纳米线带有在上面形成的外表面以形成栅极，以及与导体电接触从而形成源极的第一末端和与导体接触从而形成漏极的第二末端。在一个实施方式中，传感器是场效应晶体管，该场效应晶体管包括由绝原材料形成的基板、源极、漏极和布置在它们之间的半导体纳米线，生物识别元件附接在纳米线的表面上。当在生物识别元件与其特异性结合伴侣分子之间发生结合事件时，在场效应晶体管的电流-电压中导致可检测的变化。

在另一个实施方式中，所述传感器系统包括传感器的阵列。该阵列中的一种或多种传感器与保护构件相关联，所述保护构件防止相关联的传感器与周围环境相互作用。在一个选定时间，可以停止所述保护构件的功能，由此允许传感器开始操作以与周围的流体或组织相互作用，使得生物识别元件能够与其结合对的另一个成员(如果该对成员存在的话)相互作用.

在另一个实施方式中，所述保护构件由导电材料形成，所述导电材料可以氧化、具有生物相容性、是生物可吸收的、并且在施加电势后可以溶解在溶液例如血液中。例如，传感器可以形成在基板的孔中，所述孔被导电材料例如生物相容性金属或可电腐蚀的聚合物所覆盖。在另一个实施方式中，所述保护构件使用在预定的时间溶解的材料形成。

质谱法

在其他一些实施方式中，使用质谱法(MS)检测炎性疾病标记物，所述质谱法例如为MALDI/TOF(飞行时间)、SELDI/TOF、液相色谱-质谱法(LC-MS)、气象色谱-质谱法(GC-MS)、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、毛细管电泳-质谱法、核磁共振光谱法、或串联质谱法(例如MS/MS，MS/MS/MS，ESI-MS/MS等)。

质谱法在本领域中是已知的并且已经被用来量化和/或识别生物分子如蛋白。而且，质谱技术已经被发展成允许对分离的蛋白进行至少部分从头测序。在某些实施方式中，使用气相离子分光光度计。在其他一些实施方式中，使用激光-解吸/离子化质谱法来分析样品。可以以两个主要变化方式实施调制解调激光解吸/离子化质谱法(Modem laser desorption/ionization mass spectrometry，LDI-MS)：基质辅助激光解吸/离子化(MALDI)质谱法和表面增强激光解吸/离子化(SELDI)。在MALDI中，将分析物和含有基质的溶液混合，并且将一滴液体放置在基板的表面上。然后基质溶液与生物分子共结晶。将基板插入到质谱仪中。将激光能量引导至吸附并离子化生物分子的基板表面处而无需将它们显著片段化。在SELDI中，对基板表面进行改性，使得其成为解吸过程中的活性参与者。在一个实施方式中，使用选择性结合感兴趣的蛋白的吸附剂和/或捕获试剂对表面进行演生化。在另一个实施方式中，使用以激光轰击时没有被解吸的能量吸收分子对表面进行衍生化。在另一个实施方式中，使用结合感兴趣的蛋白和含有施加激光时断裂的光解键的分子对表面进行衍生化。在这些方法中的每一种方法中，衍生化试剂一般被定位至基板表面上施加样品的特定位置。参见例如美国专利No.5,719,060(Hutchens&Yip)和WO 98/59361(Hutchens&Yip)。可以例如使用SELDI亲和表面来捕获分析物并将含基质液体添加至被捕获的分析物以提供能量吸收材料来将这两种方法组合。

炎性疾病标记物的存在的检测一般将包括信号强度的检测。这又能够反映结合至基板的多肽的量和特性。例如，在某些实施方式中，可以比较来自第一样品和第二样品的光谱的峰值的信号强度(例如采用可视化方式、计算机分析等)，以确定特定生物分子的相对量。诸如Biomarker Wizard程序(Ciphergen Biosystems，Inc.，Fremont，Calif.)之类的软件程序可以被用来帮助分析质谱。质谱仪及其相关技术对于本领域技术人员而言是已知的。

本领域技术人员理解的是，质谱仪的任何构件(例如解吸源、质量分析仪、检测等)和各种样品的制备可以与本文描述的或者本领域已知的其他适当的部件或制备进行组合。例如，在一些实施方式中，对照样品可以含有重原子(例如¹³C)，由此允许在同一轮次的质谱分析中将受检样品与已知的对照样品混合。

在一个优选的实施方式中，使用激光解吸时间飞行(TOF)质谱仪。在激光解吸质谱分析中，将结合有标记物的基板导入到入口系统中。通过来自离子源的激光将所述标记物解吸并离子化成气相。通过离子光学组件将生成的离子收集，然后在时间飞行质谱分析仪中通过短高压场进行使离子加速并让其漂移到高度真空腔室中。在高度真空腔室的远末端，被加速的离子在不同的时间撞击敏感的检测器表面。由于飞行时间是离子质量的函数，因此离子形成和检测器碰撞之间所消逝的时间可以被用来识别具有特定的质量和电荷比的分子的存在或不存在。

在一些实施方式中，通过用计算机执行算法部分地确定第一样品或第二样品中存在的一种或多种炎性疾病标记物的相对量。所述算法识别第一质谱和第二质谱中的至少一个峰值。然后所述算法比较质谱中的第一质谱峰值的信号强度和第二质谱峰值的信号强度。相对信号强度是存在于第一和第二样品中的炎性疾病标记物的量的指示。含有已知量的炎性疾病标记物的标准物可以作为第二样品来分析，以更好地对第一样品中存在的生物分子的量进行定量。在某些实施方式中，也可以对第一和第二样品中的炎性疾病标记物的身份进行确定。

标准值、特异性和灵敏度的确定

在本申请中，炎性疾病标记物的标准表达水平，例如CXCL10的血液浓度可以采用统计学方法进行确定。例如，可以测量健康个体中的CXCL10的血液浓度以通过统计学方法确定CXCL10的标准血液浓度。当收集统计学上足量的群体时，偏离平均值的两倍或三倍的标准偏差(S.D.)的范围内的值常常被用作标准值。因此，与平均值+2x.S.D.或平均值+3x S.D.相对应的值可以用作标准值。理论上所描述的标准值设置分别包括了90％和99.7％的健康个体。

作为替代方式，还可以根据受试者中的真实表达水平(例如CXCR3的血液浓度)来设置标准值。一般而言，以这种方式设置的标准值使假阳性的百分比最小化，并且在满足使检测灵敏度最大化的条件的值的范围中进行选择。此处的假阳性百分比是指这样的百分比，在健康个体中，CXCR3的血液浓度被判断为高于标准值的患者的百分比。相反，在健康个体中，CXCR3的血液浓度被判断为低于标准值的患者的百分比指示特异性。也就是说，假阳性百分比和特异性的和总是为1。检测灵敏度是指在个体群体中炎性疾病诊断已经确诊的所有患者中，CXCR3的血液浓度被判断为高于标准值的患者的百分比。

本文使用的术语“测试灵敏度”是筛查测试被鉴定为真实疾病的能力，也被表征为是具有高度灵敏度的测试少有假阴性，另外是独立于疾病流行的测试。测试灵敏度被计算为真阳性测试/受影响的受检患者的总数，表示为百分数。

术语“测试特异性”是筛查测试，其在不存在疾病中正确地为阴性，具有高特异性和少有假阳性，独立于疾病流行。测试特异性被计算为真阴性测试/不受影响的受检个体中，表示为百分比。

术语“PPV”(阳性预测值)是阳性测试具有疾病的患者的百分比，因此评价阳性测试的可靠性。计算如下：

1.PPV＝(真阳性)/(真阳性+假阳性)。

术语“NPV”(阴性预测值)是指不具有疾病的阴性测试的患者，并且评价阴性测试的可靠性。计算如下：

2.NPV＝(真阴性)/(真阴性和假阴性)。

以上所示关系指示，作为评价诊断准确度的指数的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值的每一个值随用于判断一种或者多种炎性疾病标记物的血液浓度水平的标准值变化。

标准值经常设置成使得假阳性比率低并且灵敏度高。然而，从以上所示关系可以清楚的是，在假阳性比率和灵敏度之间存在折中。也就是说，如果标准值降低，检测灵敏度升高。然而，由于假阳性比率也升高，因此难以满足具有“低假阳性比率”的条件。考虑到这种情况，例如在本申请中可以得到如下预测结果的值可以被选择为优选标准值：(1)假阳性比率为50％以下的标准值(即，特异性不低于50％的标准值)和(2)灵敏度不低于20％的标准值。

可以使用接受者操作特性(ROC)曲线来设定标准值。ROC曲线是在纵轴上显示检测灵敏度并且在横轴上显示假阳性比率(即“1-特异性”)的曲线图。ROC曲线可以通过对灵敏度和假阳性比率的变化进行作图来获得，所述变化在连续改变用于确定炎性疾病标记物如CXCL10的血液浓度的高程度/低程度的标准值之后获得。

用于获得ROC曲线的“标准值”是临时用于统计分析的值。用于获得ROC曲线的所述“标准值”一般可以在允许覆盖所有可选择的标准的范围内连续变化。例如，标准值可以在受分析的群体中测得的最小和最大的血液CXCL10值之间变化。

根据所获得的ROC曲线，准备用于本申请的优选标准值可以从满足上述条件的范围内选择。作为替代方式，标准值可以根据通过使标准值在包含大多数测得的血液CXCL10的范围内变化产生的ROC曲线进行选择。

监测炎性疾病治疗的过程

在某些实施方式中，使用一种或者多种炎性疾病标记物的水平来监测炎性疾病治疗的过程。在这个方法中，从进行炎性疾病治疗的受试者提供生物样品。优选的是，在治疗之前、治疗过程中或治疗之后的多个不同的时间点从受试者获得多个受检的生物样品。然后将治疗后样品中的癌症标记物的表达水平与治疗前样品中的炎性疾病标记物的水平进行比较，或者，作为替代方式，与参考样品(例如正常对照水平)进行比较。例如，如果治疗后标记物水平低于治疗前标记物水平，那么可以得出治疗有效的结论。同样的，如果治疗后标记物水平与正常对照标记物水平类似或者相同，那么也可以得出治疗有效的结论。

“有效”的治疗是导致受试者中的炎性疾病标记物的水平降低或者炎性疾病症状减轻的治疗。当治疗是预防性地施加时，“有效”意味着治疗阻碍或预防癌症的发生或减缓炎性疾病的临床症状。可以使用标准的临床程序来对炎性疾病进行评价。而且，治疗的有效性可以与用于诊断或治疗炎性疾病的任何已知方法相关地进行确定。

在一个实施方式中，将生物样品中的炎性疾病标记物水平与其和参考样品如正常对照样品相关联的对应炎性疾病标记物水平进行比较。术语“正常对照水平”是指在没有患有炎性疾病的群体的生物样品中一般发现的炎性疾病标记物的水平。参考样品优选具有与受检样品的性质类似的性质。例如，如果受检样品包括患者血清，那么参考样品应当也是血清。来自对照和受检受试者的生物样品中的炎性疾病标记物水平可以在相同的时间确定，或者作为替代方式，正常对照水平可以采用统计学方法基于通过分析先前从对照组收集的样品的癌症标记物的水平获得的结果来确定。

用于检测炎性疾病或监测疾病进程的试剂盒

本申请的另一个方面涉及用于检测炎性疾病或监测炎性疾病进展的试剂盒。在一个实施方式中，所述试剂盒包括用于确定生物样品中的CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和/或CXCR5的表达的试剂和用于如何使用所述试剂的说明书，其中，所述试剂包括抗CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和/或CXCR5的多种探针或结合试剂。所述试剂盒可以进一步包括如上所述的各种不同的组II、组III、组IV和/或其他炎性疾病标记物和检测形式。

所述试剂盒可以额外地包括诸如盒子、箱子或管子之类的载体，它们具有严密封闭在其中的一种或者多种容器如管形瓶、管子、安瓿、瓶子、袋子和封套等。在一些不同的实施方式中，所述试剂盒包括一种或者多种组分，所述组分选自由用于测量本文所公开的各种炎性疾病标记物和炎性疾病标记物组的试剂和一种或多种介质或介质成分。例如，本申请的试剂盒还可以包括相同或不同的容器，一种或多种DNA聚合酶、一种或多种引物、一种或多种适当的缓冲剂、一种或多种核苷酸(例如脱氧核苷三磷酸(dNTP)和优选经过荧光标记的dNTP)和标记用组分。所述一种或多种组分可以容纳在相同的容器中，或者可以容纳在不同的容器中以在使用前混合。本申请的试剂盒还可以包括用于进行本申请的方法的一种或多种说明书或程序。所述试剂盒还可以包括计算机或计算机部件，如计算机可读的存储介质或设备。存储介质的例子包括但不限于光盘如CD、DVD和蓝光光盘(Blu-ray Discs，BD)；磁光盘；磁性介质如磁带和内置硬盘和可移动硬盘；半导体存储设备如EPROM，EEPROM和闪存；和RAM。计算机可读存储介质可以包括编码本文公开的各种治疗和治疗方案的各种疗法和治疗方案的的参考的软件。所述软件可以由计算机编译以为从业者提供根据如本文所提供的炎性疾病标记物的各种测量浓度进行的治疗。在一些不同的实施方式中，所述试剂盒包括炎性疾病标记物分析，包括带有风险阈值的检测的基于侧流的医疗点快速测试(lateral-flow-based point-of-care rapid test)，或者带有用于组成型炎性疾病标记物的定量分析的生物芯片。

本申请通过如下实施例进一步进行说明，所述实施例不应被解释为是限制性的。在整个本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请以及图和表的内容都通过参引方式引入本文。

实施例1：趋化因子及其受体在炎性疾病中的上调

材料和方法

本文使用的趋化因子的蛋白序列在NIH-NCBI GenBank中记录如下：(1)CXCR1(ACCESSION#NP 000625)、(2)CXCR2(ACCESSION#NP 001548)、(3)CXCL1(ACCESSION#NP001502)、(4)CXCL2(ACCESSION#NP 002080)、(5)CXCL3(ACCESSION#NP 002081)、(6)CXCL5(ACCESSION#NP002985)、(7)CXCL6(ACCESSION#NP 002984)、(8)CXCL7(ACCESSION#NP 002695),(9)CXCL8(IL-8，ACCESSION#NP 000575)、(10)CXCR4(ACCESSION#NP 003458)、(11)CXCL12(ACCESSION#NP 000600)、(12)CXCR5A(ACCESSION#NP 116743)、(13)CXCR5B(ACCESSION#NP001707)、(14)CXCL13(ACCESSION#NP 006410)、(15)CXCR6(ACCESSION#NP 006555)、(16)CXCL16(ACCESSION#NP 071342)、(17)CCL16(ACCESSION#NP 004581)、(18)CCL25(ACCESSION#NP_005616.2)、(19)CCL25-1(ACCESSION#NP 005615)、(20)CCL25-2(ACCESSION#NP683686)、(21)CX3CR1(ACCESSION#NP 001328)和(22)CX3CL1(ACCESSION#NP 002987)。

cDNA序列是已知的并且可以以如下登录号在NIH-NCBIGenBank中获得：(23)CXCR1(ACCESSION#NM 000634)、(24)CXCR2(ACCESSION#NM 001557)、(25)CXCL1(ACCESSION#NM 001511)、(26)CXCL2(ACCESSION#NM 002089)、(27)CXCL3(ACCESSION#NM 002090)、(28)CXCL5(ACCESSION#NM 002994)、(29)CXCL6(ACCESSION#NM 002993)、(30)CXCL7(ACCESSION#NM 002704)、(31)CXCL8(IL-8，ACCESSION#NM 000584)、(32)CXCR4(ACCESSION#NM003467)、(33)CXCL12(ACCESSION#NM 000609)、(34)CXCR5A(ACCESSION#NM 032966)、-(35)CXCR5B(ACCESSION#NM 001716)(36)CXCL13(ACCESSION#NM006419)、(37)CXCR6(ACCESSION#NM 006564)、(38)CXCL16(ACCESSION#NM 022059)、(39)CCL16(ACCESSION#NM 004590)、(40)CCL25(ACCESSION#NM_005624.3)、(41)CCL25-1(ACCESSION#NM 005624)、(42)CCL25-2(ACCESSION#NM 148888)、(43)CX3CR1(ACCESSION#NM 001337)和(44)CX3CL1(ACCESSION#NM002996)。

引物设计。CXCL9、CXCL10、CXCL11，CCRL1，CCRL2，CCR5，CCL1，CCL2，CCL3，CCL4，CCL4L1，CCL5，CCL7，CCL8，CCL14-1，CCL14-2，CCL14-3，CCL15-1，CCL15-2，CCL16，CCL19，CCL23-1，CCL23-2，CCL24，CCL26，CCR6，CCL20和CCL25，CCL25-1，CCL25-2的信使RNA序列从NIH-NCBI基因数据库获得。使用BeaconJ 2.0计算机程序设计引物。使用计算机程序Primer PremierJ和MIT Primer 3对引物进行热力学分析。将所得的引物组与整个人类基因组进行比较以确认特异性。

实时PCR分析。将淋巴细胞或炎性组织培养在RMPI-1640中，所述RMPI-1640含有10％胎牛血清、2％人类血清，补充有非必需氨基酸L-谷氨酸盐和丙酮酸钠(完全培养基)。另外，从临床分离物(Clinomics Biosciences，Frederick，Md.和UAB TissueProcurement，Birmingham，Ala.)中获得初级炎性和正常配对的匹配组织。信使RNA(mRNA)根据制造商的程序使用TriReagent(Molecular Research Center，Cincinnati，Ohio)从10⁶个细胞获得。通过使用10U/μl无RNase(RNA酶)的DNase(DNA酶)(Invitrogen，San Diego，Calif.)在37℃处理15分钟而从这些样品中除去潜在的基因组DNA污染物。然后沉淀RNA并且重悬在RNASecure(Ambion，Austin，Tex.)中。通过使用Taqman7逆转录试剂(AppliedBiosystems，Foster City，Calif.)根据制造商程序逆转录约2μg的总RNA来生成cDNA。然后，使用SYBR7Green PCRmaster混合试剂(Applied Biosystems)根据制造商程序利用对CXCL9、CXCL10、CXCL11，CCRL1，CCRL2，CCR5，CCL1，CCL2，CCL3，CCL4，CCL4L1，CCL5，CCL7，CCL8，CCL14-1，CCL14-2，CCL14-3，CCL15-1，CCL15-2，CCL16，CCL19，CCL23-1，CCL23-2，CCL24，CCL26，CCR6，CCL20和CCL25，CCL25-1，CCL25-2具有特异性的人类cDNA引物扩增cDNA。使用BioRad Icycler和软件(Hercules，Calif.)通过实时PCR分析评价这些靶标的mRNA的拷贝水平。

抗血清制备。从趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCRL1、CCRL2、CCR5、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL4L1、CCL5、CCL7、CCL8、CCL14-1、CCL14-2、CCL14-3、CCL15-1、CCL15-2、CCL16、CCL19、CCL23-1、CCL23-2、CCL24、CCL26、CCR6、CCL20以及CCL25、CCL25-1、CCL25-2合成(Sigma Genosys，TheWoodlands，Tex.)具有15个氨基的肽，并且将所述肽偶联至鸡蛋溶菌酶(Pierce,Rockford,Ill)中，以产生用于为制备抗血清或生成单克隆抗体而进行的随后免疫的抗原。采用显色鲎变形细胞裂解物分析(chromogenic Limulus amebocyte lysate assay，Cape Cod，Inc.，Falmouth，Miss.)对趋化因子肽偶联物的内毒素水平进行定量，并且显示为小于5EU/mg。使用100μg的作为免疫原的抗原和完全弗氏佐剂Ribi Adjuvant体系(RAS)一起用于第一次免疫，终体积为1.0ml。这种混合物以100μl等分试样皮下施用于兔子背部的两个部位，并且以400ml肌肉内施用在每条后腿的肌肉中。三至四周后，除了非完全弗氏佐剂外，让兔子接受100μg抗原进行随后的3次免疫。当抗体效价达到1：1,000,000时收集抗血清。随后，使正常或抗血清热失活并且以1：50稀释在PBS中。

单克隆抗体制备。从趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCRL1、CCRL2、CCR5、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL4L1、CCL5、CCL7、CCL8、CCL14-1、CCL14-2、CCL14-3、CCL15-1、CCL15-2、CCL16、CCL19、CCL23-1、CCL23-2、CCL24、CCL26、CCR6、CCL20以及CCL25、CCL25-1、CCL25-2合成(SigmaGenosys，The Woodlands，Tex.)具有15个氨基的肽，并且将所述肽偶联至鸡蛋溶菌酶(Pierce)中，以产生用于为制备抗血清或生成单克隆抗体而进行的随后免疫的抗原。采用显色鲎变形细胞溶解产物分析(chromogenic Limulus amebocyte lysate assay，Cape Cod，Inc.，Falmouth，Miss.)对趋化因子肽偶联物的内毒素水平进行定量，并且显示为小于5EU/mg。使用100μg的作为免疫原的抗原和完全弗氏佐剂Ribi Adjuvant体系(RAS)一起用于第一次免疫，终体积为200μl。这种混合物以100ml等分试样皮下施用于兔子、小鼠或免疫球蛋白人源化小鼠的背部的两个部位。两周后，除了非完全弗氏佐剂之外，使动物接受100μg抗原的而进行随后的3次免疫。收集血清并且当抗-CXCL9、-CXCL10、-CXCL11、-CCRL1、-CCRL2、-CCR5、-CCL1、-CCL2、-CCL3、-CCL4、-CCL4L1、-CCL5、-CCL7、-CCL8、-CCL14-1、-CCL14-2、-CCL14-3、-CCL15-1、-CCL15-2、-CCL16、-CCL19、-CCL23-1、-CCL23-2、-CCL24、-CCL26、-CCR6、-CCL20以及-CCL25、-CCL25-1、-CCL25-2抗体的效价达到1：2,000,000时处死宿主，并分离脾细胞用于生成杂交瘤。

将来自免疫宿主的脾和淋巴结的B细胞与永生骨髓瘤细胞系(例如YB2/0)融合。接着在杂交瘤克隆的选择性培养条件(即，HAT-补充培养基)和限制稀释方法之后分离杂交瘤。使用ELISA选择产生具有所需特异性的抗体的细胞。使用常用的分子生物学技术对来自正常大鼠或小鼠的杂交瘤进行人源化。克隆高度亲和和丰富的杂交瘤之后，从腹水或培养物上清液分离抗体，将抗体调节至1：2,000,000的效价，并以1：50稀释在PBS中。

抗血清或单克隆抗体处理。每三天使用腹膜内注射200μl的对每一种趋化因子具有特异性的抗血清或单克隆抗体来治疗自然或当处理时患上炎性疾病的敲除或转基因小鼠(8至12周龄，CharlesRiver Laboratory，Wilmington，Mass.)。然后监测宿主的炎性疾病状态的疾病进展(progression)或消退。

通过ELISA进行的细胞因子分析。按照制造商说明书(E-Biosciences，San Diego，Calif.)通过ELISA确定IL-2、-IL-6、-TNF-α、和-IFN-γ的血清水平。使用处在0.1M碳酸氢盐缓冲液(pH9.5)的100μl的相应捕获抗体将板包被，并在N/O于4℃温育。抽吸并用洗涤缓冲液洗涤后，在RT使用分析稀释液将孔包被1小时。添加样品和标准物并在RT温育2小时。接着，添加100μl的检测抗体溶液并温育1小时。添加100μl抗生物素蛋白-HRP溶液并温育30分钟。然后，添加100μl的四甲基联苯胺(TMB)底物溶液并使其反应20分钟。添加50μl的终止溶液并在450nm读板。细胞因子ELISA分析对于每次分析都能够检测大于15pg/ml。

通过多重细胞因子ELISA进行的细胞因子分析。还采用由BioRad提供的Beadlyte小鼠多细胞因子检测体系试剂盒按照制造商说明书确定血清中的T辅助细胞衍生的细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α。使用100μl的bio-plex分析缓冲液冲洗过滤底板并使用Millipore Multiscreen Separation Vacuum ManifoldSystem(Bedford，Mass.)去除，Hg设置在5。向孔中添加处在分析缓冲液中的IL-1α、IL-1β、IL-2；IL-12、IFN-γ、TNF-α珠。接着，添加50μl血清或标准物溶液并在密封板之后，在使用Lab-Line Instrument Titer Plate Shaker(Melrose，Ill.)持续振荡(设置为3档)的情况下在RT将板温育30分钟。如前所述，洗涤过滤底板两次，并在300x g离心30秒。然后每个孔中添加50μl的抗小鼠IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α抗体-生物素报告子溶液，然后再持续振荡的同时温育30分钟，之后在300x g离心30秒。和以前一样，使用100μl的bio-plex分析缓冲液洗板3次。接着，向每个孔中添加50μl链霉亲和素-藻红素溶液并在持续振荡的情况下在RT温育10分钟。添加125μl的bio-plex分析缓冲液并使用Luminexl仪器(Austin，Tex.)测量Beadlyte读数。收集所得数据并使用Bio-plexl软件(Bio-Rad)计算。细胞因子Beadlyte分析能够检测大于5pg/ml的每种分析物。

血清淀粉样蛋白A(BAA)ELISA。使用由Biosource International，(Camarillo，Calif.)提供的试剂盒通过ELISA测定SAA水平。简而言之，使用50μl的SAA特异性单克隆抗体溶液包被微量滴定带(micro-titer strip)以捕获SAA。向孔中添加血清样品和标准物并在RT温育2小时。在分析缓冲液中洗涤之后，添加HRP偶联的抗-SAA单克隆抗体溶液并在37℃温育1小时。洗涤之后，添加100μl四甲基联苯胺(TMB)底物溶液并在RT温育15分钟之后终止反应。添加终止溶液之后，在450nm读板。

组织学和病理学打分。切制6μm的固定组织切片，并使用苏木精和曙红染色以进行光显微检查。肠损伤是多病灶的并且严重度不同，考虑病变的数量以及它们的严重度而对肠的所有切片进行评级。根据如下标准打分(0至4)：(0级)正常组织没有变化。(1级)1或数个多病灶单核细胞浸润，极小畸形并且没有损耗粘液。(2级)病变往往涉及更多的粘膜并且在由单核细胞构成的固有层中病变具有若干个病灶但还是轻度的炎性细胞浸润，轻度畸形，偶有上皮细胞腐蚀，在粘膜下没有发现炎症。(3级)病变涉及大面积的粘膜或并且比2级的频度更高，其中炎性是中度的，并且一般涉及皮下粘膜以及中度上皮细胞畸形，带有单核细胞和嗜中性粒细胞的混合物。(4级)病变一般涉及大部分的切片，并且比3级的病变更加严重。另外，4级炎症更加严重并且包括单核细胞和嗜中性粒细胞；上皮细胞畸形被标记为伸长的腺体中的上皮细胞聚集。这些分数的总和提供了每只小鼠的炎性疾病总分数。疾病分数可以从0(在任何片段(segemnt)中都没有变化至最大的12(带有4级病变的片段)。

数据分析。SigmaStat 2000(Chicago，Ill.)软件被用来分析和确认数据的统计显著性。数据随后使用双因素非配对检验通过Student's t检验进行分析。在这种分析中，将受处理的样品与未处理对照进行比较。显著性水平设定为p<0.05。

结果

分子靶标的半定量化RT-PCR鉴定。使用CXCL9-、CXCL10-、CXCL11-、CCRL1-、CCRL2-、CCR5-、CCL1-、CCL2-、CCL3-、CCL4-、CCL4L1-、CCL5-、CCL7-、CCL8-、CCL14-1-、CCL14-2-、CCL14-3-、CCL15-1-、CCL15-2-、CCL16-、CCL19-、CCL23-1-、CCL23-2-、CCL24-、CCL26-、CCR6-、CCL20-以及CCL25-、CCL25-1-、CCL25-2特异性引物组获得的RT-PCR产物没有与其他基因靶标交叉反应，因为排除了与宿主序列退火的引物。所使用的引物产生不同大小的扩增子产物，相对的多态性导致CCL4与CCL4L1、CCL14-1、CCL14-2与CCL14-3、CCL15-1与CCL15-2、CCL23-1与CCL23-2以及CCL25、CCL25-1与CCL25-2。为此，来自显示出过敏性反应、关节炎(例如类风湿性关节炎、银屑病性关节炎)、哮喘、变态反应(例如药物、昆虫、植物、食物)、动脉粥样硬化、迟发型超敏反应、皮炎、糖尿病(例如mellitus型、青少年型糖尿病)、移植物排斥反应、炎性肠病(如克罗恩氏症、溃疡性结肠炎、肠炎)、多发性硬化症、重症肌无力、肺炎、银屑病、肾炎、鼻炎、脊椎关节病、硬皮病、系统性红斑狼疮或甲状腺炎的受试者的组织的RT-PCR分析显示，CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCRL1、CCRL2、CCR5、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL4L1、CCL5、CCL7、CCL8、CCL14-1、CCL14-2、CCL14-3、CCL15-1、CCL15-2、CCL16、CCL19、CCL23-1、CCL23-2、CCL24、CCL26、CCR6、CCL20以及CCL25、CCL25-1、CCL25-2被炎性宿主细胞差异表达。

体内炎性疾病抑制。使患有过敏性反应、脓毒性休克、关节炎(例如类风湿性关节炎、银屑病性关节炎)、哮喘、变态反应(例如药物、昆虫、植物、食物)、动脉粥样硬化、支气管炎、慢性阻塞性肺病、迟发型超敏反应、皮炎、糖尿病(例如mellitus型、青少年型糖尿病)、移植物排斥反应、格雷夫氏症、桥本氏甲状腺炎、炎性肠病(如克罗恩氏症、溃疡性结肠炎、肠炎)、间质性膀胱炎、多发性硬化症、重症肌无力、银屑病、肾炎、鼻炎、脊椎关节病、硬皮病、系统性红斑狼疮或甲状腺炎的哺乳动物患上相关的炎性疾病。如通过组织学打分和比较IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、淀粉样蛋白A的处理前和处理后血清水平所确定的那样，抗-CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCRL1、CCRL2、CCR5、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL4L1、CCL5、CCL7、CCL8、CCL14-1、CCL14-2、CCL14-3、CCL15-1、CCL15-2、CCL16、CCL19、CCL23-1、CCL23-2、CCL24、CCL26、CCR6、CCL20或CCL25、CCL25-1、CCL25-2的抗体对炎性疾病的进展和消退具有不同的影响。如通过组织学打分和比较IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、淀粉样蛋白A的处理前和处理后血清水平所确定的那样，抗-CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCRL1、CCRL2、CCR5、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL4L1、CCL5、CCL7、CCL8、CCL14-1、CCL14-2、CCL14-3、CCL15-1、CCL15-2、CCL16、CCL19、CCL23-1、CCL23-2、CCL24、CCL26、CCR6、CCL20或CCL25、CCL25-1、CCL25-2抗体有效地导致炎性疾病的消退并阻碍进展。

如前文所指出的那样，在本申请的方法中使用的趋化因子是已知的。它们的蛋白序列的登录号在表2中确认。

如表1中所示，炎性疾病引起的特定的趋化因子随疾病的不同而不同。它们在个体之间也不同。因此，当治疗个体时，鉴定在患者组织中上升的具体趋化因子是明智的。使用抗每一种趋化因子所产生的抗体并且将来自于患者的组织样品暴露于特定的抗体，然后评价抗体/趋化因子结合的量，可以评价每一种趋化因子的表达水平，并且可以向患者施用将结合过量的趋化因子的特定抗体。这种针对炎性疾病的定制治疗方法是新颖的，并且是本申请特别有价值的方面。

实施例2：IFN-γ、CXCL10、MIG、I-TAC、CXCR3在鼠科动物 结肠炎中的mRNA表达

图1显示了鼠科动物结肠炎过程中IFN-γ、CXCL10、MIG、I-TAC和CXCR3的mRNA表达。从具有C57BL/6背景的笼子圈养的IL-10^-/-小鼠移除层流障碍(Laminar flow barrier)以自然患上结肠炎。处死后，在结肠炎发作之前(无菌条件，空白矩形柱)和患上结肠炎之后(填充矩形柱)从小鼠的结肠或肠系膜淋巴结分离总RNA。在能够检测大于20拷贝的转录cDNA的RT-PCT分析之后确定IFN-γ、IP-10、MIG、I-TAC和CXCR3mRNA表达水平。在图1中，转录本的Log₁₀拷贝相对于18S rRNA的真实拷贝表示。

如图1所示，在患有结肠炎的IL-10^-/-小鼠的发炎结肠中观察到CXCR3和CXCL10表达的显著上升。而且，在患有结肠炎的IL-10^-/-小鼠的肠系膜淋巴结中观察到CXCL10表达的显著上升。

实施例3：通过继承性转移接受CD45RB ^HI 或CXCR3 ⁺ CD4 ⁺ T细 胞的TCRβxδ ^-/- 小鼠中的IBD的组织学分析

图2显示了通过继承性转移接受CD45RB^HI或CXCR3⁺CD4⁺T细胞的TCRβxδ^-/-小鼠中的IBD的组织学分析。接受来自正常C57BL/6小鼠的CD45RB^Lo-(图A)、CD45RB^Hi-(图B)或CXCR3⁺-CD4⁺T细胞(图C)的TCRβxδ^-/-小鼠中的肠炎的60倍放大图。使用苏木精-曙红染色6μm石蜡切片，肠的横切切片展示壁厚度、粘膜层的增大、隐窝变形和白血球浸润的差异。

这个分析显示，均由CD45RB群体构成的CXCR3⁺CD4⁺T细胞在TCRβxδ^-/-小鼠(图C)中诱导了结肠炎的诱导作用

实施例4：IL-10 ^-/- 小鼠中的SAA水平和结肠炎的发展

图3显示了IL-10^-/-小鼠中的血清淀粉样蛋白A(SAA)水平和结肠炎的发展。大于200μg/ml的SAA浓度与第0周时无症状结肠炎的发作相关联。小鼠每三天接受200μl的初免(pre-immune)(空白圆圈)或抗-小鼠CXCL10(填充圆圈)Ab溶液。每两周收集血清，并且所提供的数据是平均SAA浓度±SEM。

图3中的结果显示，使用抗-小鼠CXCL10抗体阻断CXCL10抑制了与IBD相关联的升高的SAA水平。

实施例5：IL-10 ^-/- 小鼠的体重变化

图4显示了IL-10^-/-小鼠的体重变化。通过监测第0周时初始体重的变化来观察与鼠科动物CD相关联的消耗症。IL-10^-/-小鼠每三天接受200μl的初免(空白圆圈)或抗-小鼠CXCL10(填充圆圈)Ab溶液。每两周记录体重，并且以百分比表示相对于初始体重的变化：第0周时的体重减去第1，3，5，7，9或11周时的体重再除以第0周时的体重。

图4中的结果显示，使用抗-小鼠CXCL10抗体阻断CXCL10抑制了与IBD相关联的体重损失。

实施例6：血清IL-6和SAA水平与鼠科动物结肠炎的关联

图5显示了血清IL-6和SAA水平与鼠科动物结肠炎的关联。IL-10^-/-小鼠每三天接受200μl的初免(空白柱)或抗-小鼠CXCL10(填充柱)Ab溶液。通过ELISA测定第11周时SAA和血清IL-6的水平。数据提供为平均SAA或IL-6浓度±SEM。

图5的结果显示，使用抗-小鼠CXCL10抗体阻断CXCL10显著地降低了SAA和IL-6血清浓度(与对照小鼠相比)。该结果进一步说明使用SAA水平作为这种CD鼠科动物模型从急性(即无症状)转向慢性结肠炎的指示的效用。

实施例7：IL-10 ^-/- 小鼠中的总粪便和血清Ab水平

图6显示了IL-10^-/-小鼠中的总粪便和血清Ab水平。每组5只IL-10-/-小鼠的多个组每三天接受200μl的初免(空白矩形柱)或抗-小鼠IP-10-(填充矩形柱)Ab溶液。数据提供为总Ig Ab(ng/ml)的平均浓度±SEM。在第11周时收集粪便提取物中的总IgA和IgGAb或血清中的IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b和IgG3Ab并通过ELISA测定水平。星号表示两组之间具有统计学显著性差异，即，p<0.05(*)。

测定总粪便IgG和IgA水平以确定CD过程中肠Ab的变化的相关性。如图6所示，粪便提取物中的IgA Ab水平相对稳定。在接受IP-10Ab溶液的IL-10^-/-小鼠中观察到粪便IgG Ab的显著下降(图6)。这些结果显示，阻断IP-10减弱了CD过程中鼠科动物从肠系膜的外周到内腔的IgG Ab的分泌。另外，比较对照小鼠和使用抗-CXCL10Ab处理的那些小鼠的血清之间的总IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3和IgM抗体水平。对照和CXCL10Ab-处理小鼠具有类似的IgM，IgG1，IgG2b和IgG3Ab水平。然而，与使用抗CXCL10Ab处理小鼠相比，患有活动性结肠炎的小鼠的总血清IgG2a水平显著较高(图6)。该结果显示，阻断CXCL10减弱了CD过程中总IgG2a水平和IgG Ab的分泌，这与所预测的CD过程中Th1>>Th2细胞因子水平的不平衡是吻合的。

实施例8：患有IBD的IL-10 ^-/- 小鼠的血清IL-12、IFN-γ、IL-2、 TNF-α、IL-1α和IL-1β水平

图7显示了患有IBD的IL-10^-/-小鼠的血清IL-12、IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-1α和IL-1β水平。IL-10^-/-小鼠每三天接受200μl初免-(空白矩形柱)或抗-小鼠IP-10-(填充矩形柱)Ab溶液。通过ELISA测定第11周时血清细胞因子水平。数据提供为平均细胞因子浓度±SEM(ng/ml)。

对照组显示了与IP-10Ab处理的小鼠相比中度较高的血清IL-12p40水平(图7)。相反，抗-CXCL10Ab治疗显著地降低了IL-10^-/-小鼠中的IFN-γ水平，以及IL-2的水平、TNF-α、IL-1α和IL-1β水平。IBD过程中IL-2、IL-12、TNF-α、IL-1α和IL-1β的过量产生已经得到很好地证明。CXCL10阻断显著降低了血清IL-2、TNF-α、IL-1α和IL-1β水平(图7)，这与通过抗-CXCL10Ab处理显著降低患有活动性结肠炎的宿主的炎症状态相吻合。

实施例9：IL-10 ^-/- 小鼠所呈现的结肠炎的组织学特性

图8显示了IL-10^-/-小鼠所呈现的结肠炎的组织学特性。小鼠每三天接受200μl的初免-(C或D)或抗-小鼠IP-10-(A或B)Ab溶液的变化。在第11周处死后，将肠固定，并切制6μm的切片并染色。以40X(A和C)或200X(B和D)的放大视图显微检查切片。

所观察到的病理学变化包括上行结肠和横行结肠的固有层中的小的多病灶浸润。这些浸润由淋巴细胞和偶然的少量嗜中性粒细胞组成。上皮细胞在IP-10抑制组中没有过度增大。在对照小鼠中还存在多核的增大的上皮细胞和伸长的腺细胞。然而，在对照组中结肠炎进展更加快速，如大肠尤其是结肠中所有区域的多病灶病变所示。这些结果显示结肠炎中的显著改善与CXCL10阻断有关。

实施例10：抗-CXCL10抗体消除了严重结肠炎

图9显示，抗-CXCL10抗体消除了严重结肠炎。从IL-10^-/-小鼠开始具有结肠炎症状(即，当小鼠失去了它们的约10％至15％的初始体重并且达到峰值SAA水平)后第14周开始每三天接受200μl对照Ab(空白圆圈)或抗-小鼠CXCL10Ab(填充圆圈)，并且持续到小鼠在第26周被处死为止。每周记录IL-10^-/-小鼠的SAA水平±SEM和体重，相对于初始体重的变化表示为结肠炎发作前(第-2周)的体重减去随后周数的体重再除以结肠炎发作前的体重的百分比(±SEM)。数据表示为包括每组5只小鼠的三个独立实验的平均值。星号指示在抗-CXCL10Ab-和对照Ab-处理组之间具有统计学显著差异(p<0.01)。

IL-10^-/-小鼠中的慢性结肠炎与SAA水平的升高(>300μg/mL)一致(FIG 9A)，并且与小鼠体重与它们的初始体重相比下降10％至15％一致(图9B)。当与使用对照Ab处理的患有慢性结肠炎的IL-10^-/-小鼠所经历的体重损失相比时，患有慢性结肠炎的小鼠中的CXCL10阻断减轻了的体重损失。

实施例11：严重结肠炎过程中粘膜组织中的Th1细胞因子、 CXCL10和CXCR3mRNA表达

图10显示了严重结肠炎过程中粘膜组织中的Th1细胞因子、CXCL10和CXCR3mRNA表达。患上慢性结肠炎之后，小鼠在有症状结肠炎发作(即，当小鼠已经失去它们的约15％初始体重时)之后第14周开始，每三天接受200μl的对照Ab(实心柱(solid bar))或抗-CXCL10Ab(斜纹柱(hashed bar))或正常WT小鼠(空白柱(open bar))。处死小鼠之后，从使用对照Ab、野生型或抗-CXCL10Ab处理的小鼠的结肠和肠系膜淋巴结(MLN)分离总RNA。通过能够检测大于20个拷贝的转录cDNA的RT-PCR分析来确定IFN-γ、CXCL10、TNF-α、IL-12p40和CXCR3mRNA表达的水平。在图10中，转录本的Log₁₀拷贝相对于18S rRNA的真实拷贝±SEM表示。数据表示为包括每组5只小鼠的三个独立实验的平均值。星号指示在抗-CXCL10和对照Ab-处理组之间具有统计学显著差异(p<0.01)。

如图10所示，与使用抗-CXCL10Ab处理的小鼠相比，患有慢性结肠炎的IL-10^-/-小鼠的MLN和结肠中发现TNF-α和IL-12p40mRNA表达显著上升。与使用抗-CXCL10Ab处理的小鼠相比，使用对照Ab处理的IL-10^-/-小鼠在慢性结肠炎过程中结肠和MLN的CXCL10mRNA表达也显著提高。与对照Ab处理相比，抗-CXCL10Ab处理之后患有严重结肠炎的小鼠的MLN中的IFN-γ水平降低；然而，在两组的结肠中，这种Th1相关的细胞因子低于可检测水平。在CXCL10抑制之后，患有结肠炎的IL-10^-/-小鼠的结肠中的CXCR3mRNA表达显著降低，但是其在MLN中的水平与对照Ab处理的小鼠相比在相同处理过程中没有减少。

实施例12：严重结肠炎进展过程中血清中的Th1和炎性细胞因 子水平

图11显示了严重结肠炎进展过程中血清中的Th1和炎性细胞因子水平。IL-10^-/-小鼠在有症状结肠炎发作之后第14周开始，每三天接受200μl的对照Ab(空白圆圈)或抗-CXCL10Ab(填充圆圈)，连续接受到第26周。在处死之前，通过能够检测大于10pg/ml的IL-12p40、IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-1α和IL-1β的ELISA来测定第26周时血清细胞因子的水平。数据表示为平均浓度±SEM。星号指示在两组之间具有统计学显著性差异，即p<0.01(*)。实验组由5只小鼠组成，并且实验重复三次。数据表示为三个独立实验的平均值。

和图10中的RT-PCR分析一致，抗-CXCL10Ab处理降低了患有慢性结肠炎的IL-10^-/-小鼠中的IFN-γ和IL-12p40血清水平(图11)。与对照Ab处理小鼠相比，患有慢性结肠炎的IL-10^-/-小鼠在CXCL10阻断之后的血清IL-2、TNF-α、IL-1α和IL-1β水平也下降。这些数据显示，CXCL10阻断导致患有慢性结肠炎的IL-10^-/-小鼠的SAA、IL-6、IL-12p40、IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-1α和IL-1β血清水平降低。

实施例13：抗-CXCL10抗体对结肠炎病理学的影响

图12显示了抗-CXCL10抗体对结肠炎病理学的影响。来自患有慢性结肠炎的如前所述使用对照Ab(图A和B)或抗-CXCL10Ab处理(图C至D)的IL-10^-/-小鼠的结肠的组织病理学。通过光学显微术检查切片。实验组由5只小鼠组成，并且重复3次。

接受抗-CXCL10Ab的小鼠显示肠炎中的显著减轻。在慢性结肠炎过程中的肠中观察到白细胞浸润的升高(图12A)和腺结构的变形(图12B)。抗-CXCL10Ab降低了淋巴细胞浸润，并且部分地恢复了腺细胞和杯状细胞结构(图12C)，这同样与肠隐窝的伸长一致(图12D)。另外，患有严重结肠炎的接受对照Ab的IL-10^-/-小鼠的平均组织学得分显著高于使用抗-CXCL10Ab处理的小鼠的得分(数据未示出)。类似的，通过组织学分析确定，SAA水平与结肠炎的严重度相关。病理学变化包括对照Ab处理的IL-10^-/-小鼠的结肠的LP中的白细胞浸润，CXCL10阻断后这些浸润的数量降低。总而言之，这些结果显示与慢性结肠炎相关的特征性肠炎在CXCL10阻断后有显著的改善。

实施例14：在CD患者的结肠中的CXCL9、CXCL10、CXCL11 和TNF-α的组织学和免疫荧光定位

图13显示了在CD患者的结肠中的CXCL9、CXCL10、CXCL11和TNF-α的组织学和免疫荧光定位。对CD患者和正常对照的肠中的结肠变化的组织病理学进行固定，并且切制6μm的切片，并且使用苏木精和曙红或者抗-CXCL9、CXCL10、CXCL11或TNF-α抗体染色。以130X的放大视图检查切片。发炎的结肠展示出正常和CD患者之间在粘膜壁厚度、隐窝畸形、白细胞浸润和腺伸长中的差异。

对照样品的结肠病理学显示在多个部位处的过度生长的上皮细胞层，具有仅少数的炎性浸润和CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCR3的低表达(图13)。相反，血清CXCL9、CXCL10和CXCL11水平高的CD患者在结肠中还表达显著水平的CXCL9和CXCL11，CXCL110具有适度的提高。

实施例15：自发性结肠炎过程中IL-10 ^-/- 小鼠的MAP特异性血 清Ab反应

图14显示了自发性结肠炎过程中IL-10^-/-小鼠的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种(MAP)特异性血清Ab反应。所提供的数据为来自独立实验的MAP-特异性IgG亚类的平均值+SD浓度(ng/ml)。星号(*)指示与对照相比具有统计学显著性差异，即p<0.01。小鼠实验组由15只小鼠组成。分析重复3次。

图14显示，常规圈养的患有自发性结肠炎的小鼠中的MAP-特异性IgG2a Ab反应显著高于在无菌条件下圈养的没有患病的类似对照小鼠。这与之前描述的在结肠炎过程中细胞因子水平的不平衡(Th1>Th2)是一致的，说明有与结肠炎的进展有关的偏Th1的体液反应。

实施例16：使用MAP挑战的IL-10 ^-/- 小鼠的组织学特性

图15显示了使用MAP挑战的IL-10^-/-小鼠的组织学特性。挑战之后第14周，将来自通过强饲法接受单剂量的200μl对照媒介物(只有乳脂(cream))、在乳脂中的10⁴CFU的活MAP、或在乳脂中的10⁴CFU的热灭活MAP并且持此之外在无菌条件下保持的IL-10^-/-小鼠的结肠的组织病理学固定，切制6μm的切片并使用苏木精和曙红染色。在各组中发现轻度(空白三角)和重度(填充三角)细胞浸润(即，活的MAP>>热灭活的MAP>对照)。在活的MAP挑战的小鼠中，细胞浸润聚集一般与病灶病变和过度生长的隐窝长度降低的上皮细胞有关。通过光学显微术检查切片(40X放大率)。实验组由15只小鼠组成。显示代表性样品。

图15显示，使用活的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种挑战的小鼠的肠组织显示出由淋巴细胞和偶有的多形核细胞组成的细胞浸润水平增加。接受活的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种的小鼠中的结肠炎进展更加快速，如由它们的大肠的所有区域的多病灶或者细胞浸润聚集所示。另外，使用活的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种挑战的小鼠的上皮细胞过度生长，肠隐窝长度降低，并且粘膜和粘膜下层也都存在伸长的腺细胞。

实施例17：MAP挑战后的IL-10 ^-/- 小鼠的体重变化

图16显示了MAP挑战后的IL-10^-/-小鼠的体重变化。通过监测结肠炎进展过程中的体重来观测与鼠科动物结肠炎有关的消耗病。具有B6背景的IL-10^-/-小鼠接受单剂量的200μl正常对照(乳脂，空白圆圈)、在乳脂中的10⁴CFUs的活的MAP(填充圆圈)或在乳脂中的经过巴氏消毒的10⁴CFUs的MAP(三角形)，除此之外在无菌条件下保持。每两周记录IL-10^-/-小鼠的初始体重的百分比。所提供的数据为3个独立实验的平均值+SD。星号(*)指示与对照相比具有统计学显著性差异，即p<0.01。实验组由15只小鼠组成，并且分析重复3次。

图16显示，使用副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种挑战的小鼠并且除此之外放在无菌的条件下的小鼠失去更多的体重，并且经历更高的SAA水平(与以热灭活的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种挑战的类似小鼠或给予对照媒介物的类似小鼠相比)。暴露于热灭活的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种的小鼠与暴露于活的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种的那些小鼠相比体重损失较少，但是在SAA水平上仅具有小幅的上升。这些结果显示，与对照组相比，使用活的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种挑战的小鼠显示出快速的与SAA水平升高和体重下降相关的结肠炎进展。

实施例18：MAP挑战后的IL-10 ^-/- 小鼠中的血清细胞因子水平

图17显示了MAP挑战后的IL-10^-/-小鼠中的血清细胞因子水平。具有B6背景的IL-10^-/-小鼠通过强饲法接受单剂量的200μl对照媒介物(即，乳脂)、在乳脂中的10⁴CFUs的活的MAP或在乳脂中的热灭活的10⁴CFU的MAP，除此之外在无菌条件下保持。通过ELISA确定挑战后14周血清TNF-α和IFN-γ以及CXCL9、CXCL10和CXCL11的水平，所述ELISA能够检测大于10pg/ml TNF-α、IFN-γ或CXCR3配体。所提供的数据为平均TNF-α、IFN-γ和CXCR3配体浓度+SD(ng/ml)。星号(*)指示与对照相比具有统计学显著性差异，即p<0.01。实验组由15只小鼠组成。分析重复3次。

副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种挑战之后，使用活的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种挑战的IL-10^-/-小鼠的血清中的IFN-γ和TNF-α水平显著(约6倍)高于对照小鼠；暴露于热灭活的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种的小鼠的TNF-α和IFN-γ反应比对照的那些小鼠高约2倍，但是这些差异没有显著性(图17)。CXCL10和CXCL11的血清水平在使用活的或热灭活的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种挑战的小鼠与对照组中的那些小鼠相比显著上升，但是CXCL9的血清水平没有显著上升。这些结果显示，暴露于副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种增加了系统性IFN-γ、TNF-α、CXCL10和CXCL11的产生。

实施例19：通过来自IL-10 ^-/- 小鼠的CD4 ⁺ T细胞导致抗-肽#25 Ag(来自MPT59)-诱导增殖和IL-2产生

图18显示通过来自IL-10^-/-小鼠的CD4⁺T细胞导致的抗-肽#25Ag(来自MPT59)-诱导增殖和IL-2产生。具有B6背景的IL-10^-/-小鼠接受单剂量的200μl的对照媒介物(空白柱，仅有乳脂)、在乳脂中的10⁴CFU的活的MAP(斜纹柱)或在乳脂中的热灭活的10⁴CFU的MAP(填充柱)，除此之外在无菌条件下保持。将衍生自小鼠的MLN和PP的CD4⁺淋巴细胞纯化并且采用γ-辐射APC(10⁶细胞/ml)以5×10⁶细胞/ml的密度和肽#25(1μg/ml)一起培养3天。通过ELISA测定培养物上清液中存在的细胞因子。通过BrdU引入测量增殖。所提供的数据为一式四份培养物的增殖反应的平均OD₄₅₀或平均IL-2分泌(pg/ml)±SD。星号(*)指示与对照相比具有统计学显著性差异，即p<0.01。实验组由15只小鼠组成并且实验重复3次。

图18显示，来自之前使用活的或热灭活的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种挑战的小鼠的MLN和PP的肽25-刺激CD4⁺T细胞与单独的乳脂挑战的小鼠的类似CD4⁺T细胞相比在BrdU引入中显示出显著的上升。这些结果表明，暴露于副结核杆菌鸟结核分枝杆菌亚种之后的Ag重复刺激增强了CD4⁺T细胞的增殖。

实施例20：IBD患者中的血清CXCR3配体和分支杆菌特异性 Ab反应

图19显示IBD患者中的血清CXCR3配体和分支杆菌特异性Ab反应。分离来自62CD和88UC女性患者和32个正常健康女性供体(没有经历任何治疗)的血清并评价CXCR3配体(即CXCL9、CXCL10和CXCL11)和分支杆菌特异性IgG1、IgG2、IgG3和IgG4Ab的存在。通过能够检测大于10pg/ml的这些配体的ELISA来测定这些水平。所提供的数据为浓度±SEM。星号指示健康供体和IBD患者之间具有统计学显著性差异，即p<0.01。

虽然总IgG1，IgG2，IgG3和IgG4亚类Ab在IBD患者的血清中显著高于健康供体(数据未示出)，但是IBD患者的IgG体液反应的曲线也显示分支杆菌特异性IgG1和IgG2Ab升高(图19)。CD患者中的这些反应显著高于UC患者或正常健康供体。在这些样品中的CXCR3配体与健康供体相比也升高了。这些结果表明，IBD患者具有较高的CXCL9、CXCL10和CXCL11水平和分支杆菌特异性IgG1和IgG2Ab反应。而且，这些发现与之前显示在常规圈养条件下的IL-10^-/-小鼠中的自发性结肠炎过程中的分支杆菌特异性IgG2a和CXCR3配体的水平较高的发现相关。

实施例21：分支杆菌挑战后IBD患者和IL-10 ^-/- 小鼠中的SAA 水平的变化

图20显示分支杆菌挑战后IBD患者和IL-10^-/-小鼠中的SAA水平的变化。具有B6背景的IL-10^-/-小鼠接受200μl的单独乳脂乳(cream milk)(空白圆圈，对照)、含有10⁴CFUs的活的(填充圆圈)或热灭活(填充三角形)的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌(M.aviumparatuberculosis)的乳脂乳。通过ELISA测量分支杆菌增强的结肠炎过程中以及IBD患者和健康供体的SAA水平。实验组由5只小鼠组成，并且实验重复3次。所提供的数据为SAA的平均值±SEM浓度。星号指示对照和分支杆菌处理组或健康供体和IBD患者之间具有统计学显著性差异，即p<0.01。

图20中的结果显示，使用活的分支杆菌挑战，除此之外在没有特异性病原体的条件下的小鼠当与使用热灭活的分支杆菌挑战的类似小鼠或对照小鼠相比时SAA水平经历了显著的上升。

实施例22：使用分支杆菌挑战的IL-10 ^-/- 小鼠的肠组织学特性

图21显示了使用分支杆菌(Mycobacteria)挑战的IL-10^-/-小鼠的肠组织学特性。具有B6背景的IL-10^-/-小鼠接受200μl的单独乳脂乳(空白圆圈，对照)、含有10⁴CFU的活的(填充圆圈)或热灭活(填充三角形)的副结核杆菌鸟结核分枝杆菌的乳脂乳。处死之后，将肠固定，切制6μm的切片，并使用苏木精和曙红染色。通过光学显微术检查切片。实验组由5只小鼠组成，并且实验重复3次。

使用分支杆菌挑战的肠组织显示在由淋巴细胞和偶有的多形核细胞组成的白细胞浸润的增加较高，并且在活的与热灭活的分支杆菌挑战组中的淋巴小结的频度较高(图21)。而且，与对照小鼠相比，在接受活的分支杆菌的小鼠中，结肠炎恶化更快，如大肠的多病灶病变和白细胞浸润的聚集所示。

实施例23：IC患者中的血清CXCL9、CXCL10和CXCL11浓度

图22显示了IC患者中的血清CXCL9、CXCL10和CXCL11浓度。图A：将来自IC患者(n＝32)和正常健康供体(n＝16)的血清分离并且通过能够检测大于10pg/ml的每种CXCR3配体的ELISA来评价CXCR3配体的存在。所提供的数据为IC患者和正常健康供体的平均CXCL9、CXCL10和CXCL11浓度±SEM。星号(＊)指示在健康供体和IC患者之间具有统计学显著性差异，即p<0.01。图B：在CYP挑战之前两天施用对照或抗-CXCL10Ab溶液，此后每两天施用对照或抗-CXCL10Ab溶液。施用CYP五天后，通过ELISA测定CXCL9、CXCL10和CXCL11的血清水平。所提供的数据为每组的平均浓度±SEM。星号(＊)指示未受影响的组和CYP诱导组之间具有统计学显著性(p<0.01)差异。三角形指示对照Ab处理和抗-CXCL10Ab处理组(施用CYP)之间具有统计学显著性(p<0.01)差异。

如图22A所示，IC患者中的CXCL9和CXCL10的血清水平显著高于不受影响的健康供体的水平。特别是，对于IC患者和健康供体之间的血清水平差异，CXCL9(p<0.001)最大，CXCL10(p<0.01)和CXCL11(p>0.1)次之。这些CXCR3配体水平也与每个个体患者的病理学报告所示的疾病严重度相关(尽管没有统计学显著性)(数据未示出)。而且，这些患者显示组织损伤的多病理学特征，这些组织损伤常常包括尿道上皮剥蚀、粘膜水肿和/或白细胞浸润。

当与不受影响的对照的水平相比时，小鼠中CYP诱导的膀胱炎导致CXCL10>>CXCL9的血清水平的实质性增加()(图22B)。在采用IC患者中的CXCR3配体水平进行确认时，鼠科动物CXCL11水平在采用CYP诱导的组中没有显著变化。总之，患有CYP诱导膀胱炎的小鼠比不受影响的对照表达较高的血清CXCL10>CXCL9，而IC患者显示出比不受影响的个体更高的CXCL9>CXCL10血清水平。

实施例24：CYP诱导膀胱炎之后的组织学变化

图23显示了CYP诱导膀胱炎之后的组织学变化。在CYP处理之前两天施加对照或抗-小鼠CXCL10Ab溶液，此后每两天施加。施加CYP五天后，将小鼠的膀胱固定，并切制6μm的切片，使用苏木精和曙红染色。这些切片在10X和100X的放大视图中进行显微检查。图A和C显示来自对照Ab处理小鼠的放大切片，而图B和D显示来自给予CYP以展示发炎膀胱的抗-CXCL10Ab处理的小鼠的类似切片，并且表征粘膜壁厚度、粘膜层增大、白细胞浸润和腺伸长中的差异。

给予CYP的对照Ab处理小鼠显示膀胱炎的病理学迹象(即，膀胱发炎，不连续的尿道上皮(uroepitheium)。然而，使用抗-CXCL10Ab处理的受影响小鼠显示膀胱炎的减缓，如膀胱白细胞浸润的降低所示(图23)。对照Ab处理和抗-CXCL10Ab处理的小鼠(患有CYP诱导膀胱炎)的组织学差异被认为是显著的，并且显示CXCL10阻断显著地减缓了CYP诱导的膀胱炎。

实施例25：CYP处理小鼠中的CXCR3、CXCR9、CXCR10和 CXCR11mRNA表达

图24显示了CYP处理小鼠中的CXCR3、CXCR9、CXCR10和CXCR11mRNA表达。在CYP处理之前两天施用对照或抗小鼠CXCL10Ab溶液，之后每两天施用。施用CYP之后5天，从小鼠的脾、回肠淋巴结或膀胱分离总的RNA。图A：进行CXCR3、CXCL9、CXCL10或CXCL11mRNA表达的RT-PCR分析。图B：进行IFN-γ、IL-12p40或TNF-αmRNA表达的RT-PCR分析。转录本的Log₁₀拷贝±SEM相对于18S rRNA的真实拷贝表示。星号(＊)指示不受影响的组和CYP诱导组之间具有统计学显著性(p<0.01)差异。三角形指示对照Ab和抗-CXCL10Ab处理组(施加CYP)之间具有统计学显著性(p<0.01)差异。

如图24A所示，小鼠中的CYP诱导的膀胱炎导致膀胱白细胞的CXCL10、CXCL11和CXCR3mRNA的表达有实质性的增加以及回肠淋巴结淋巴细胞的CXCL9和CXCR3转录本的表达有适度增加(与正常未处理小鼠相比)。相反，来自CYP处理的小鼠的脾细胞中的这些IFN-γ和细胞核因子κB((NFκB)可诱导的趋化因子和CXCR3mRNA的表达与来自对照小鼠的类似细胞相比显著地降低。抗-CXCL10Ab处理显著地降低了回肠淋巴结白细胞的CXCL9和CXCR3mRNA的表达，并且减少了膀胱白细胞的CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCR3mRNA的产生。

为了研究CYP诱导的膀胱炎过程中Th1和炎性细胞因子表达中的局部和外周变化，通过定量RT-PCR分析测量从脾、回肠淋巴结和膀胱分离的由白细胞表达的IFN-γ、IL-12p40和TNF-αmRNA的水平。接受对照Ab的CYP诱导小鼠显示脾细胞表达的IFN-γ、IL-12p40和TNF-αmRNA有实质性地降低；然而，这种处理显著地提高了膀胱白细胞表达的细胞因子(与不受影响的小鼠相比)(图24B)。患有CYP诱导的膀胱炎的小鼠显示回肠淋巴结淋巴细胞表达的IFN-γmRNA增加(与来自不受影响的小鼠的类似细胞相比)。然而，来自患有膀胱炎的小鼠的膀胱淋巴细胞表达的IFN-γ、IL-12p40和TNF-αmRNA在抗-CXCL10Ab处理后与来自使用对照Ab处理的CYP诱导小鼠的类似细胞相比有显著的降低。

实施例26：活动性克罗恩氏症(CD)过程中血清CXCL10浓度

图25显示了活动性CD过程中CXCL10的上调表达。将来自CD患者(n＝120)和正常健康供体(n＝30)(不经处理)的血清分离并评价CXCL10的存在。通过能够检测大于20pg/ml的CXCL10的ELISA分析确定CXCL10的水平。所提供的数据为CD患者和健康供体中的平均CXCL10浓度±SEM。星号指示两组之间具有统计学显著性差异，即p<0.05(*)。

图25中的结果显示，CD患者与健康供体相比显示出致轻素和CXCL10有显著的上升。

实施例27：活动性克罗恩氏症过程中的血清CXCL11和CXCL9 浓度

图26显示了活动性克罗恩氏症过程中CXCL11和CXCL9的上调表达。将来自CD患者(n＝120)和正常健康供体(n＝30)(不经处理)的血清分离并评价CXCL11和CXCL9的存在。通过能够检测大于20pg/ml的每一种Th1细胞因子的ELISA确定血清CXCL11和CXCL9的水平。所提供的数据为CD患者和健康供体中的平均CXCL11(图26A)和CXCL9(图26B)浓度±SEM。星号指示两组之间具有统计学显著性差异，即p<0.05(*)。

图26中的结果显示，CD患者与健康供体相比显示出致轻素以及CXCL11和CXCL9有显著的上升。

实施例28：活动性克罗恩氏症过程中血清淀粉样蛋白A(SAA) 和IL-6的浓度

图27显示了CD患者中血清淀粉样蛋白A(SAA)和IL-6的上调血清浓度。将来自CD患者(n＝120)和正常健康供体(n＝30)(不经处理)的血清分离并评价SAA和IL-6水平的存在。通过能够检测大于20pg/ml的SAA和IL-6浓度的ELISA确定血清SAA和IL-6的水平。所提供的数据为CD患者和健康供体中的平均SAA(图27A)和IL-6(图27B)浓度±SEM。星号指示两组之间具有统计学显著性差异，即p<0.05(*)。这个数据与和CD的严重度对应的升高的SAA和血清IL-6水平是一致的。

图27中的结果显示，CD患者与健康供体相比显示出SAA和IL-6有显著的上升。

实施例29：活动性克罗恩氏症过程中血清IL-12p40和IFN-γ 水平相关

图28显示了CD过程中血清IL-12p40和IFN-γ水平相关。将来自CD患者(n＝120)和正常健康供体(n＝30)(不经处理)的血清分离并评价IL-12p40和IFN-γ的存在。通过能够检测大于20pg/ml的每种细胞因子的ELISA确定血清IL-12p40和IFN-γ的水平。所提供的数据为来自CD患者和健康供体的血清中的平均IL-12p40(图28A)和IFN-γ(图28B)浓度±SEM。星号指示两组之间具有统计学显著性差异，即p<0.05(*)。

图28中的结果显示，CD患者与健康供体相比显示出IL-12p40和IFN-γ有显著的上升。

实施例30：活动性克罗恩氏症过程中炎性细胞因子水平

图29显示了活动性CD过程中炎性细胞因子水平。将来自CD患者(n＝120)和正常健康供体(n＝30)(不经处理)的血清分离并评价TNF-α和IL-1β的存在。通过能够检测大于20pg/ml的每种细胞因子的ELISA确定血清TNF-α和IL-1β的水平。所提供的数据为来自CD患者和健康供体的血清的平均TNF-α(图29A)和IL-1β(图29B)浓度±SEM。星号指示两组之间具有统计学显著性差异，即p<0.05(*)。

图29中的结果显示，CD患者与健康供体相比显示出TNF-α和IL-1β有显著的上升。

实施例31：正常和CD患者的结肠炎的组织学特性

图30显示了正常和CD患者(具有高血清CXCR3配体浓度)中的结肠炎的组织学特性。将来自正常健康供体和CD患者的结肠活组织检查的组织病理学固定，切制6μm的切片，并用苏木精和曙红染色。通过显微术检查切片。

图30显示，CD患者中的结肠展示正常和CD患者之间在隐窝畸形、白细胞浸润、腺伸长/过度生长和水肿上的差异。

实施例32：CD患者的结肠中的CXCL9、CXCL10、CXCL11 和TNFα表达

图31显示了通过组织病理学检查正常和CD患者的结肠中的CXCR3配体和TNFα表达。将来自正常和CD患者的结肠冷冻、固定、切制6μm的切片，并且对CXCL9-阳性细胞、CXCL10-阳性细胞、CXCL11-阳性细胞和TNFα-阳性细胞进行荧光染色。通过荧光共聚焦显微镜检查切片。

图31显示，来自CD患者的结肠显示与正常对照患者相比白细胞浸润有增加。这些显微照片进一步证实正常对照患者的结肠中CXCR3配体和TNFα表达的降低的免疫反应活性染色。

以上说明是为了教导本领域技术人员如何实施本申请的目的，并不是为了详细描述本申请的本领域技术人员在阅读上述说明后将会清楚的所有那些显而易见的改进和变化。然而，拟将所有这些显而易见的改进和变化包括在本的由所附权利要求限定的范围内。所述权利要求拟将覆盖有效地符合预期目的任意顺序的组分和步骤，除非上下文有明确的相反说明。在说明书中所引用的所有参考文献通过参引方式将其所有内容引入本文。

Claims (27)

1.一种用于检测受试者中的炎性疾病的方法，所述方法包括：

(a)检测获自所述受试者的生物样品中的一种或者多种炎性疾病标记物的表达水平；和

(b)比较所述生物样品中的所述一种或者多种炎性疾病标记物的表达水平和所述一种或者多种炎性疾病标记物的正常表达水平，

其中，高于所述多个炎性疾病标记物中的一种或者多种在所述生物样品中的正常表达水平指示所述受试者中存在炎性疾病，其中所述多个炎性疾病标记物的所述正常表达水平是预定值，并且其中所述一种或者多种炎性疾病标记物包括选自由CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5组成的组中的一种或者多种标记物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或者多种炎性疾病标记物进一步包括选自由CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL9、CCL11、CCL12、CCL13、CCL17、CCL20、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、XCL1、CX3CL1、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR4、XCR1组成的组中的一种或者多种标记物。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或者多种炎性疾病标记物进一步包括选自由致轻素、肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素-γ(IF-γ)、白介素-1α(IL-1α)、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17和IL-23组成的组中的一种或者多种标记物。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或者多种炎性疾病标记物进一步包括抗炎症相关微生物的一种或者多种抗体和/或衍生自炎症相关微生物的一种或者多种抗原，所述炎症相关微生物选自由分枝杆菌(Mycobacterium)、拟杆菌(Bacteroides)、布鲁氏菌(Brucella)、弯曲菌(Campylobacter)、大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、克氏杆菌(Klebsiella)、假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)、梭状芽孢杆菌(Clostridium)、肠球菌(Enterococcus)、真细菌(Eubacterium)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、消化链球菌(Peptostreptococcus)、螺杆菌(Helicobacter)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、荧光假单胞菌(Pseudomanas fluorescens)、沙门氏菌(Salmonella)、衣原体(Chlamydia)、人类肝炎病毒、人类鼻病毒组成的组。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述炎性疾病选自由如下疾病组成的组：过敏性反应、脓毒性休克、脓毒性关节炎、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、哮喘、迟发型超敏反应、皮炎、糖尿病、青少年型糖尿病、移植物排斥反应、炎性肠病、克罗恩氏症、溃疡性结肠炎、肠炎、间质性膀胱炎、多发性硬化症、重症肌无力、格雷夫氏症、桥本氏甲状腺炎、肺炎、肾炎、肺炎、阻塞性肺病、支气管炎、支气管炎性鼻炎、脊柱关节病、硬皮病、系统性红斑狼疮和肝炎。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物样品是血浆样品、唾液样品、滑液样品、尿液样品或粪便样品。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测步骤包括使所述生物样品与特异性地结合所述一种或者多种炎性疾病标记物的一种或者多种结合试剂接触。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述一种或者多种结合试剂以0.01pM至1μM范围内的kd值结合所述一种或者多种炎性疾病标记物。

9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述结合试剂包含一种或者多种肽或者多肽。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述结合试剂包含一种或者多种抗体、肽适体和/或合成抗体。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或者多种炎性疾病标记物包括CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或者多种炎性疾病标记物包括：

(1)选自由CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5组成的组中的至少一种炎性疾病标记物；

(2)选自由CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL9、CCL11、CCL12、CCL13、CCL17、CCL20、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、XCL1、CX3CL1、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR4、XCR1组成的组中的至少一种炎性疾病标记物；和

(3)选自由致轻素、肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素-γ(IF-γ)、白介素-1α(IL-1α)、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17和IL-23组成的组中的至少一种炎性疾病标记物。

13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或者多种炎性疾病标记物包括：

(1)选自由CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5组成的组中的至少一种炎性疾病标记物；

(2)选自由CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL9、CCL11、CCL12、CCL13、CCL17、CCL20、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、XCL1、CX3CL1、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR4、XCR1；致轻素、肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素-γ(IF-γ)、白介素-1α(IL-1α)、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17和IL-23组成的组中的至少一种炎性疾病标记物；和

(3)抗选自由如下炎症相关微生物组成的组中的至少一种抗体：分枝杆菌(Mycobacterium)、拟杆菌(Bacteroides)、布鲁氏菌(Brucella)、弯曲菌(Campylobacter)、大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、克氏杆菌(Klebsiella)、假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)、梭状芽孢杆菌(Clos tridium)、肠球菌(Enterococcus)、真细菌(Eubacterium)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、消化链球菌(Peptostreptococcus)、螺杆菌(Helicobacter)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、荧光假单胞菌(Pseudomanas fluorescens)、沙门氏菌(Salmonella)、衣原体(Chlamydia)、人类肝炎病毒、人类鼻病毒。

14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述炎性疾病是关节炎，并且其中所述一种或者多种炎性疾病标记物进一步包括选自由CXCL12、CCL20、XCL1、CX3CL1、CXCR4、CXCR5、CCR6、XCR1、CX3CR1组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物。

15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述炎性疾病是哮喘，并且其中所述一种或者多种炎性疾病标记物进一步包括选自由CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCR3、CCR4、CCR5、CCL11、CCL15、CCL17、CCL22、CCL24和CCL26组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物。

16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述炎性疾病是脓毒性休克或者过敏性反应，并且其中所述一种或者多种炎性疾病标记物进一步包括选自由CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CCL5、CXCR1和CXCR2组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物。

17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述炎性疾病是糖尿病，并且其中所述一种或者多种炎性疾病标记物进一步包括选自由CCL2、CCL9、CX3CL1、CCR2、CCR4和CX3CR1组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物。

18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述炎性疾病是皮炎或迟发型超敏反应，并且其中所述一种或者多种炎性疾病标记物进一步包括选自由CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL17、CCL29、CCL22、CCL27、CCR4、CCR5、CCR6和CCR10组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物。

19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述炎性疾病是移植物排斥反应，并且其中所述一种或者多种炎性疾病标记物进一步包括选自由CCL3、CCL4、CCL5、XCL1、CCR5和XCR1组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物。

20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述炎性疾病是间质性膀胱炎，并且其中所述一种或者多种炎性疾病标记物进一步包括选自由CCL3、CCL4、CCL5和CCR5组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物。

21.根据权利要求1所述的方法，其中，所述炎性疾病是多发性硬化症，并且其中所述一种或者多种炎性疾病标记物进一步包括选自由CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL14、CCL15、CCL23、CCR1和CCR5组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物。

22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述炎性疾病是重症肌无力、格雷夫氏症或桥本氏甲状腺炎，并且其中所述一种或者多种炎性疾病标记物进一步包括选自由CCL3、CCL4、CCL5、XCL1、CCR5和XCR1组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物。

23.根据权利要求1所述的方法，其中，所述炎性疾病是肾炎或系统性红斑狼疮，并且其中所述一种或者多种炎性疾病标记物进一步包括选自由CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL8、CCL12、CCL13、CX3CL1、CCR2、CCR4和CX3CR1组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物。

24.根据权利要求1所述的方法，其中，所述炎性疾病是肺炎、慢性阻塞性肺病(COPD)或慢性支气管炎，并且其中所述一种或者多种炎性疾病标记物进一步包括选自由CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL7、CXCL8、CCL3、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL24、CCL26、CXCR2和CCR3组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物。

25.一种用于监测受试者中炎性疾病治疗过程的方法，所述方法包括；

测定在所述治疗过程中或者所述治疗之后获自所述受试者的一种或者多种生物样品中的一种或者多种炎性疾病标记物的表达水平；和

比较所述一种或者多种生物样品中的所述一种或者多种炎性疾病标记物的表达水平和所述一种或者多种炎性疾病标记物的对照表达水平，

其中，所述一种或者多种炎性疾病标记物的所述对照表达水平是预定参考水平或者所述受试者中的所述一种或者多种炎性疾病标记物的治疗前水平，

其中，如果在所述治疗过程中或者所述治疗之后获自所述受试者的所述一种或者多种生物样品中的所述一种或者多种炎性疾病标记物的表达水平类似于或者低于所述对照表达水平，那么认为所述治疗是有效的，

其中，所述一种或者多种炎性疾病标记物包括选自由CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5组成的组中的一种或者多种炎症标记物。

26.一种用于检测受试者中的炎性疾病的试剂盒，所述试剂盒包括：

用于测定选自由CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR3和CXCR5组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物的表达的试剂；

用于测定生物样品中的选自由致轻素、肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素-γ(IF-γ)、白介素-1α(IL-1α)、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17和IL-23组成的组中的一种或者多种炎性疾病标记物的表达的试剂；

和关于如何使用所述试剂的说明书。

27.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述炎性疾病选自由如下疾病组成的组：过敏性反应、脓毒性休克、脓毒性关节炎、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、哮喘、迟发型超敏反应、皮炎、糖尿病、青少年型糖尿病、移植物排斥反应、炎性肠病、克罗恩氏症、溃疡性结肠炎、肠炎、间质性膀胱炎、多发性硬化症、重症肌无力、格雷夫氏症、桥本氏甲状腺炎、肺炎、肾炎、肺炎、阻塞性肺病、支气管炎、支气管炎性鼻炎、脊柱关节病、硬皮病、系统性红斑狼疮和肝炎。