KR101805250B1 - 한국 결핵균주 항원 특이적 면역반응을 이용한 결핵진단 방법 및 키트 - Google Patents

Abstract

본원은 한국형 결핵균주(K-strain)의 서열번호 1로 표시되는 단백질인 MTBK24790 항원 또는 서열번호 2로 표시되는 단백질인 MTBK24800 항원에 대한 시료의 IFN-ν, TNF-α, IL-6, IP-10, 및 MCP-1를 포함하는 사이토카인반응을 검출하여 활동성 및 잠복성 결핵감염을 진단하는 방법 및 키트를 개시한다.

Description

한국 결핵균주 항원 특이적 면역반응을 이용한 결핵진단 방법 및 키트 {Method and kit for TB diagnosis based on immune response to K-strain specific antigens}

본 발명은 한국 결핵균주 항원 특이적 면역반응을 이용한 활동성 결핵 또는 잠복성 결핵 감염 진단방법에 관한 것이다.

결핵은 세계 3대 질병 중의 하나로 전세계 인구의 약 3분의 1인 20억명 정도가 결핵에 감염되어 있고(Dye C, et al. JAMA 282:677?686,1999), 우리나라의 경우 결핵 발생율과 결핵으로 인한 사망율은 OECD 국가 중 1위이며 연간 약 35,000명의 새로운 환자와 약 2,300명 정도의 사망자가 보고되고 있다. 효과적인 결핵퇴치를 위해서는 결핵치료 뿐만 아니라 전 세계 인구의 3분의 1인 결핵균 잠복 감염자(latent tuberculosis infection; LTBI)에 대한 예방 치료 및 예방 백신 개발이 중요하기 때문에 LTBI의 정확한 진단과 예방 백신의 방어 면역을 추정할 수 있는 바이오마커의 발굴은 최근 매우 중요한 이슈로 떠오르고 있다.

현재 잠복결핵 진단은 투베르쿨린검사(tuberculin skin test, TST) 및 IGRA(IFN-γ release assay)와 같은 면역학적 방법으로 잠복결핵감염(LTBI)을 탐지하는 것이다.

TST는 잠복결핵감염을 탐지할 수 있지만 BCG 예방주사를 접종한 경우나 NTM (nontuberculous mycobacteria) 질병을 구별하지 못하며, 잠복결핵감염을 확인하기 위해서는 방사선 검사, 객담, 배양검사와 같은 추가적 검사가 필요하다(American Thoracic Society. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 161:1376?1395, 2000).

IGRA의 일종인 QuantiFERON^®-TB(QFT) 테스트는 환자 검체의 림프구를 결핵 특이 항원으로 감작시켜 세포에서 나오는 감마인터페론을 측정하는 체외(in vitro) 잠복결핵감염 검사인데, 튜버큘린 피내반응검사보다 특이도가 높은 장점이 있지만 (Pai M, et al. Lancet Infect.Dis.4:761?776, 2004), 결핵균 항원으로 PPD(purified protein derivative)를 사용하여서 특이도가 낮다. 예를 들면 QuantiFERON^®-TB Gold(QFT-G) 테스트는 QFT를 개선한 방법으로, 검체는 환자에서 채취한 혈액을 헤파린 응고제와 섞고, 결핵균에 존재하는 특이단백인 ESAT-6 및 CFP-10의 합성펩타이드를 피검자의 백혈구 자극항원으로 사용한다. 잠복결핵감염을 포함한 활동성 결핵 등 모든 결핵에서 결핵균 감염을 진단하는 체외검사법이다. QuantiFERON^®-TB Gold In-Tube(QFT-IT) 테스트는 QFT-G 테스트와 원리는 유사하나 QFT-G는 ESAT-6, CFP-10을 각각 검사하고, QFT-IT는 같은 튜브에 TB 7.7을 추가하여 동시에 검사하는 것으로 따라서 검체 채취시 헤파린튜브가 아니라 항원 및 대조군 전용용기에 직접 혈액을 채취한다. QFT-IT는 검사결과가 항원별로 나오는 것이 아니라 양성 또는 음성으로만 판정되고 이 방법은 활동성 결핵 및 잠복결핵감염을 구별하지 못한다. 즉 TST 및 IGRA 검사 자체만으로는 활동성 결핵, 잠복결핵감염 및 NTM 질환을 구별하기에 충분치 않다.

이러한 기존의 방법은 미국, 유럽 등 결핵의 발생율이 비교적 낮은 국가들에 비해 우리나라와 같이 잠복결핵 감염자가 많고 중등도의 유병율을 보이는 국가나 유병율이 더 높은 국가에서는 그 유용성이 낮게 보고되고 있다(Sollai et al. BMC Infect.Dis.14(Suppl 1):S6, 2014). 따라서 기존방법에 대한 보완과 개선책이 시급한 실정이다.

특히 감염자가 많아 IGRA의 효능이 떨어지는 우리나라에서 주로 분리되는 K-패밀리에 속하는 균주를 이용하여 활동성 결핵 및 잠복성 결핵감염을 구분하여 진단하는 방법에 대한 개발이 필요하다.

국제공개특허 제2013/175459호에는 활동성 결핵과 잠복결핵감염을 구별하여 결핵을 진단하는 방법으로 다양한 종류의 결핵 항원에 의한 다양한 마커들이 개시되어 있으나, 한국형 결핵균주 특이적 항원을 이용한 검출방법에 관하여는 개시되어 있지 않다. 또한 국제공개특허 제2013/087917호에 잠복결핵감염을 판별하는 방법이 개시되어 있으나 이는 IFN-γ단백질을 정량하는 IGRA법을 보완하는 것으로, 여기에도 역시 한국형 결핵균주 특이적 항원을 이용한 검출방법에 관하여는 개시되어 있지 않다.

본원은 한국형 결핵균주 및 이에 특이적 항원을 이용한 활동성 및 잠복성 결핵균 감염을 구분하는 방법을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 한국형 결핵균주(K-strain) 유래의 서열번호 1로 표시되는 단백질인 MTBK24790 항원 또는 서열번호 2로 표시되는 단백질인 MTBK24800 항원 및 상기 항원을 코딩하는 핵산을 제공한다.

다른 양태에서 본원은 상기 항원 또는 그 조합의 활동성 또는 잠복성 결핵균 감염을 구분하는 방법을 제공한다.

일 구현예에서 시료가 활동성 결핵감염인지 여부를 진단하기 위한 정보를 제공하기 위하여 인비트로에서 활동성 결핵감염 여부를 판단하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 한국형 결핵균주(K-strain)의 서열번호 1로 표시되는 단백질인 MTBK24790 항원 및 서열번호 2로 표시되는 단백질인 MTBK24800 항원 조합을 상기 시료 또는 정상 대조군 시료와 접촉하는 단계; 상기 시료에서 IFN-ν, TNF-α, IL-6, IP-10, 및 MCP-1를 검출하는 단계; 및 상기 검출결과 상기 시료에서 상기 IFN-ν, TNF-α, IL-6, IP-10, 및 MCP-1의 농도가 상기 대조군과 비교하여 높은 경우 상기 시료를 활동성 결핵으로 판단하는 단계를 포함한다. 상기 방법에 사용되는 시료는 이로 제한하는 것은 아니나, 전혈 또는 혈장을 포함하며, 상기 시료는 IGRA 분석에서 음성으로 판단된 시료를 포함한다.

다른 구현예에서는 시료가 잠복성 결핵감염인지 여부를 진단하기 위한 정보를 제공하기 위하여 인비트로에서 잠복성 결핵감염 여부를 판단하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 한국형 결핵균주(K-strain)의 서열번호 2로 표시되는 단백질인 MTBK24800 항원을 상기 시료 또는 정상 대조군 시료와 접촉하는 단계; 상기 시료에서 IFN-ν 및 IP-10을 검출하는 단계; 및 상기 검출결과 상기 시료에서 IFN-ν 및 IP-10가 상기 대조군과 비교하여 높은 경우 상기 시료를 잠복성 결핵으로 판단하는 단계를 포함한다.

또 다른 구현예에서 본원은 시료가 활동성 결핵감염인지 여부를 진단하기 위한 정보를 제공하기 위하여, 인비트로에서 활동성 결핵감염 여부 판단하는 방법을 제고하며, 상기 방법은 한국형 결핵균주(K-strain)의 서열번호 2로 표시되는 단백질인 MTBK24800 항원을 상기 시료 또는 정상 대조군 시료와 접촉하는 단계; 상기 시료에서 IFN-ν 및 IP-10 및 TNF-α를 검출하는 단계; 및 상기 검출결과 상기 시료에서 IFN-ν 및 IP-10및 TNF-α가 상기 대조군과 비교하여 높은 경우 상기 시료를 활동성 결핵으로 판단하는 단계를 포함한다. 상기 방법에 사용되는 시료는 이로 제한하는 것은 아니나, 전혈 또는 혈장을 포함하며, 상기 시료는 IGRA 양성 또는 IGRA 음성으로 판단된 시료를 포함한다.

또 다른 구현예에서 본원은 IGRA 양성으로 판단된 시료가 활동성 결핵감염인지 여부를 판단하기 위한 정보를 제공하기 위하여, 인비트로에서 잠복성 결핵이 활동성 결핵감염인지 여부 판단 방법을 제공하며, 상기 방법은 한국형 결핵균주(K-strain)의 서열번호 1로 표시되는 단백질인 MTBK24790 항원 또는 서열번호 2로 표시되는 단백질인 MTBK24800 항원을 상기 시료 또는 IGRA 양성 대조군 시료와 접촉하는 단계; 상기 시료에서 TNF-α를 검출하는 단계; 및 상기 검출결과 상기 시료에서 TNF-α가 상기 대조군과 비교하여 높은 경우 상기 시료를 활동성 결핵으로 판단하는 단계를 포함한다. 상기 방법에 사용되는 시료는 이로 제한하는 것은 아니나, 전혈 또는 혈장을 포함한다.

다른 양태에서 본원은 서열번호 1로 표시되는 MTBK24790 항원 또는 서열번호 2로 표시되는 MTBK24800 항원 중 하나 이상; 및 IFN-ν, TNF-α, IL-6, IP-10, 또는 MCP-1 중 하나 이상의 싸이토카인에 대한 캡처 항체 및 검출 항체를 포함하는, 인비트로에서 활동성 또는 잠복성 결핵감염 검출용 키트를 제공한다. 일 구현예에서 상기 키트는 면역반응에 기반한 다양한 분석 예를 들면 ELISA 또는 FACS 분석용으로 사용될 수 있다.

본원은 한국형 결핵균주(K-strain)의 서열번호 1로 표시되는 단백질인 MTBK24790 항원 또는 서열번호 2로 표시되는 단백질인 MTBK24800 항원을 확인하고, 상기 항원에 대한 IP-10, IFN-γ, TNF-α 및 IL-6 반응을 통해 활동성 결핵 또는 잠복성 결핵감염여부를 구별하여 결핵을 진단하는 방법에 관한 것이다.

본원에 따른 방법은 우리나라 결핵집단 발생과 재발환자에서 빈번하게 분리되는 결핵균주로부터 분리한 항원을 사용함으로써 기존의 IGRA 방법에 사용되는 결핵항원과 함께 우리나라 실정에 더 적합하게 활동성 결핵 또는 잠복성 결핵감염 여부를 구별하여 결핵을 보다 정확하게 진단할 수 있다.

또한 우리나라의 경우 약제 내성 또는 다제내성으로 인한 난치성 결핵이 증가하는 추세이고 이로 인해 재발하는 결핵환자들이 증가하기 때문에 재발환자의 임상균주 중 40% 이상에서 발견된 본원에 따른 한국형 균주에서 유래한 항원을 사용하는 것이 궁극적으로 결핵관리에 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 본원의 발명에 따른 결핵균 K 균주 유전체의 MTBK_24790 및 MTBK_24800 항원의 위치를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본원의 발명에 따른 결핵균 K 균주의 MTBK_24790 단백질과 결핵균 표준 균주의 ESAT-6 유사 단백질간의 아미노산 서열을 비교한 것이다.
도 3는 본원의 발명에 따른 결핵균 K 균주의 MTBK_24800 단백질과 결핵균 표준 균주의 CFP-10 유사 단백질간의 아미노산 서열을 비교한 것이다.
도 4는 본원의 발명에 따른 MTBK_24790(A) 및 MTBK_24800(B) 재조합 단백질의 분리 정제 결과를 나타낸 것이다. 그래프는 이온교환크로마토그래피 방법으로 단백질을 정제(FPLC)한 결과로 모든 피크는 280 nm에서 측정되는 단백질의 양을 나타내며 가장 높게 측정되는 피크는 순수하게 정제된 목적 단백질을 나타낸다. 그래프 상에서 가장 높은, 화살표로 표시된 피크는 정제된 MTBK24790 또는 MTBK24800 단백질을 나타낸다.
도 5는 본원의 발명에 따른 활동성 결핵환자(TB, n=53), 잠복결핵감염자(LTBI, n=31), 정상인(control, n=65)에서 MTBK24790와 MTBK24800 항원에 대한 면역 싸이토카인 반응을 나타낸 것이다. 수평바는 중간 수치를 나타낸다(* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, Dunn’s multiple comparison test, Mann Whitney test).
도 6는 본원의 MTBK24790 및 MTBK24800 항원에 대한, 활동성 결핵환자(TB, n=53), 잠복결핵감염자(LTBI, n=31) 및 정상인(control, n=65)에서의 면역 싸이토카인 반응을 나타낸 것이다. 수평바는 중간 수치를 나타낸다(* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, Dunn’s multiple comparison test, Mann Whitney test).
도 7은 본원의 MTBK24790 및 MTBK24800 항원에 대한 ROC 커브를 나타낸 것이다. A는 정상인대조군으로부터 잠복결핵감염을 구별하는 MTBK24800 항원에 대한 IFN-γ, IP-10 반응의 ROC 커브를 나타낸 것이다. B는 잠복결핵감염과 활동성 결핵을 구별하는 MTBK24790, MTBK24800 항원에 대한 TNF-α 반응의 ROC 커브를 나타낸 것이다.

본원은 한국형 결핵균주 K 균주에서 발견한 항원 MTBK24790 및 MTBK24800에 대한 면역반응을 조사한 결과 이를 이용한 싸이토카인의 반응에 따라 활동성 결핵 및 잠복 결핵감염을 구분하여 진단할 수 있다는 발견에 근거한 것이다.

우리나라에서 분리되는 결핵균주의 77%는 베이징 패밀리(Beijing family)에 속하는 것으로 알려져 있고 (Park YK, et al. J. Microbiol. Methods 63:165-172, 2005), 중고등학교에서 집단으로 발생하는 결핵균들의 제한효소 절편 다형(RFLP; restriction fragment length polymorphism)프로파일을 조사한 결과 약 18.4%에서 독특한 균주 집단이 발견되어 이를 K-균주로 명명하고 유사한 균주들을 K-패밀리로 명명하였다(Kim SJ, et al. Int. J. Tuberc. Lung Dis.5:824-830, 2001). 국립마산결핵병원에 입원한 다제내성 재발환자에서 분리한 결핵 균주는 약 46%가 K-패밀리에 속하는 균주들이었다.

따라서 한 양태에서 본원은 한국형 결핵균주(K-strain) 유래의 서열번호 1 (로 나타나는 단백질인 MTBK24790 또는 서열번호 2로 나타나는 단백질인 MTBK24800 항원 또는 이를 코딩하는 핵산 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본원에 따른 항원이 유래된 한국형 결핵균주(K-strain)의 전체 게놈 서열은NCBI에 GenBank:CP007803.1로 등록되어 있다. 상기 유전체 서열을 결핵균 표준 균주인 H37Rv 균주의 서열과 비교하면 K 균주내에 5.7 kb의 유전자가 삽입되어 있는데(Park PJ, et al. J. Microbiol. 52(10) : 871?878, 2014)(도 1), 상기 삽입 서열은 MTBK24790 (도 2) 및 MTBK24800 (도 3)을 포함한다.

본원에 따른 항원 또는 항원의 조합은 시료에서 싸이토카인 반응 즉 IFN-ν, TNF-α, IL-6, IP-10, 및 MCP-1 반응을 유도하여 잠복성 또는 활동성 결핵의 구분에 유용하게 사용될 수 있다.

이런 측면에서 본원은 본원에 따른 항원 또는 항원의 조합에 대한 IFN-ν, TNF-α, IL-6, IP-10, 또는 MCP-1 중 하나 이상의 싸이토카인 반응에 기반한 잠복성 결핵균 감염 또는 활동성 결핵 검출 또는 진단 방법 또는 키트에 관한 것이다.

일 구현예에서는 항원의 조합을 이용한 활동성 결핵감염 여부 판단 방법이 개시된다. 상기 방법은 한국형 결핵균주(K-strain)의 서열번호 1로 표시되는 단백질인 MTBK24790 항원 및 서열번호 2로 표시되는 단백질인 MTBK24800 항원 조합을 상기 시료 또는 정상 대조군 시료와 접촉하는 단계; 상기 시료에서 IFN-ν, TNF-α, IL-6, IP-10, 및 MCP-1를 검출하는 단계; 및 상기 검출결과 상기 시료에서 상기 IFN-ν, TNF-α, IL-6, IP-10, 및 MCP-1의 농도가 상기 대조군과 비교하여 높은 경우 상기 시료를 활동성 결핵감염으로 판단하는 단계를 포함한다. 항원의 조합이 사용되는 경우 각 항원은 특정 비로 포함될 수 있으며, 일 구현예에서는 1:1의 질량비로 사용될 수 있다.

다른 구현예에서는 MTBK24800 항원을 이용한 잠복성 결핵감염 여부 판단 방법이 개시된다. 상기 방법은 한국형 결핵균주(K-strain)의 서열번호 2로 표시되는 단백질인 MTBK24800 항원을 정상 대조군 또는 상기 시료와 접촉하는 단계; 상기 시료에서 IFN-ν 및 IP-10을 검출하는 단계; 및 상기 검출결과 상기 시료에서 IFN-ν 및 IP-10가 상기 대조군과 비교하여 높은 경우 상기 시료를 잠복성 결핵감염으로 판단하는 단계를 포함한다.

또 다른 구현예에서는 MTBK24800 항원을 이용한 활동성 결핵감염 여부 판단 방법이 개시된다. 상기 방법은 한국형 결핵균주(K-strain)의 서열번호 2로 표시되는 단백질인 MTBK24800 항원을 정상 대조군 또는 상기 시료와 접촉하는 단계; 상기 시료에서 IFN-ν 및 IP-10및 TNF-α를 검출하는 단계; 및 상기 검출결과 상기 시료에서 IFN-ν 및 IP-10및 TNF-α가 상기 대조군과 비교하여 높은 경우 상기 시료를 활동성 결핵감염으로 판단하는 단계를 포함한다.

또 다른 구현예에서는 MTBK24790 항원 또는 MTBK24800 항원을 이용한, IGRA 양성으로 판단된 잠복성 결핵감염 시료가 활동성 결핵감염인지 여부를 판단하는 방법이 개시된다. 상기 방법은 한국형 결핵균주(K-strain)의 서열번호 1로 표시되는 단백질인 MTBK24790 항원 또는 서열번호 2로 표시되는 단백질인 MTBK24800 항원을 상기 시료 또는 잠복성 결핵감염 대조군 (IGRA 양성 대조군 시료)과 접촉하는 단계; 상기 시료에서 TNF-α를 검출하는 단계; 및 상기 검출결과 상기 시료에서 TNF-α가 상기 대조군과 비교하여 높은 경우 상기 시료를 활동성 결핵감염으로 판단하는 단계를 포함한다.

본원에 따른 방법에 사용되는 항원은 즉 서열번호 1로 나타나는 단백질인 MTBK24790 또는 서열번호 2로 나타나는 단백질인 MTBK24800은 본원에 개시된 서열을 기반으로 공지된 유전자 재조합 방법을 통해 합성 분리 및 정제될 수 있으며, 예를 들면 본원에 개시된 방법을 참고할 수 있다.

본원의 ‘활동성 결핵’은 결핵을 유발할 수 있는 결핵균이 잠복기가 아닌 활발한 증식을 일으키는 상태로, 객담검사(도말검사, 배양검사, 핵산증폭검사(PCR))등에서 양성이 나올 수 있거나, 영상의학 검사(흉부엑스선검사 또는 CT 등) 상 활동성 병변이 관찰된 결핵을 의미하며 재발성 결핵을 포함한다.

본원의‘잠복성 결핵감염(latent TB infection)’은 결핵균에 감염은 되었으나 임상적으로 결핵 증상이 없는 감염자로, 결핵 세균학적, 방사선 검사 등의 결핵검사에서 음성이며 타인에게 전파를 할 수 없는 상태를 말한다.

본원의 ‘재발성 결핵’은 이전에 결핵을 앓았던 사람이 치료 후 다시 결핵에 걸리는 경우를 의미하며 약제내성으로 인해 재발 하는 경우와 환자가 임의대로 투약을 중단하여 재발하는 경우 모두를 포함한다. 즉 현재 결핵진단을 받았지만 이전에 한번 이상 결핵 발병력이 있는 결핵환자를 의미한다.

이로 한정되는 것은 아니나 본원의 IP-10 (Interferon gamma-induced protein 10)’은 CXCL10(C-X-C motif chemokine 10)이라고도 하는 CXCL10 유전자에 의해 코딩되는 인간에게 있는 8.7 kDa의 단백질을 말한다. 본원의 MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1)은 케모카인의 일종으로 모노사이트 및 마크로파이지의 이동과 침윤을 조절하는 주요 인자이다. 본원의 IFN-γ (Interferon gamma)는 인터페론 분자종의 하나로서 인터페론α나 β와는 상동성이 없어 Ⅱ형 인터페론으로 분류되는 것으로, T 림프구의 분열촉진제 혹은 특이항원 처리에 의해 유발되는 것을 말한다. 본원의 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha) 는 염증반응에 포함되고 급성기 반응(acute-phase protein)의 구성원인 사이토카인을 말한다. 본원의 IL-6 (Interleukin-6)은 향 염증성 싸이토카인인 동시에 항 염증성 마이오카인이다.

본원에 따른 방법에 사용되는 검체 시료는, 예를 들면 전혈, 혈청, 혈장을 포함하며, 본원에 따른 일 구현예에서는 전혈 또는 혈장이 사용된다.

본원에 따른 방법에서 정상 대조군은 임상적으로 결핵증상이 없고 흉부 엑스선 검사에서 활동성 병변이 발견되지 않았으며 IGRA (QuantiFERON-TB Gold In-Tube; QFT-IT) 검사에서 음성을 보인 사람 또는 그 유래의 시료이다. 잠복성 결핵감염 대조군 또는 IGRA 양성 대조군은 임상적으로 결핵증상이 없고 흉부 엑스선 검사에서 활동성 병변이 발견되지 않았으나 IGRA 검사에서 양성반응을 보인 사람 또는 그 유래의 시료이다.

본원에서 인터페론감마방출 분석 (IFN-γ release assay, IGRA)는 검체 또는 시료의 림프구를 결핵 특이 항원으로 감작시켜 세포에서 나오는 감마인터페론을 측정하는 체외(in vitro) 잠복결핵 검사이며, 예를 들면 QuantiFERON^®-TB(QFT) 및 QFT-G, QFT-IT 등이 있다. QuantiFERON^®-TB Goild(QFT-G) 테스트는 QFT를 개선한 방법으로, 검체는 환자에서 채취한 혈액을 헤파린 응고제와 섞고, 결핵균에 존재하는 특이단백인 ESAT-6 및 CFP-10의 합성펩타이드를 피검자의 백혈구 자극항원으로 사용한다. 잠복결핵을 포함한 활동성 결핵 등 모든 결핵에서 결핵균 감염증을 진단하는 체외검사법이다. QuantiFERON^®-TB Goild In-Tube(QFT-IT) 테스트는 QFT-G 테스트와 원리는 비슷한데, 그러나 QFT-G는 ESAT-6, CFP-10을 각각 검사하였으나, QFT-IT는 같은 튜브에 TB 7.7을 추가하여 동시에 검사하는 것으로 검체 채취시 헤파린튜브가 아니라 항원 및 대조군 전용용기에 직접 혈액을 채취한다. QFT-IT는 검사결과가 항원별로 나오는 것이 아니라 양성 또는 음성으로만 판정된다. 그런데 이 방법은 활동성 결핵 및 잠복결핵을 구별하지 못한다.

또한 본원에 따른 시료가 활동성 결핵감염인지 여부를 판단하는 방법은 기존의 IGRA 분석결과 음성으로 판단된 시료, 또는 기존의 IGRA 분석결과 양성 즉 잠복성으로 판단된 시료가 실제로는 활동성 결핵인지 여부 또는 잠복성 결핵 감염여부의 재확인(confirm)에 사용될 수 있으며, 이러한 측면에서 본원에 따른 방법에 사용되는 시료는 IGRA 분석에서 음성 및/또는 양성으로 판단된 시료를 포함한다.

본원에 따른 방법에서 상기 항원에 대한 면역반응에 따른 마커 IP-10, IFN-γ, TNF-α, MCP-1 및 IL-6는 공지된 다양한 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 일 구현예에서는 상기 싸이토카인을 항원으로 하는 항원-항체 복합체 형성 또는 면역반응에 기초한 방법이 사용되며, 이러한 방법은 예를 들면 방사상 면역확산 (Radial Immunodiffusion), 면역전기영동 또는 역전류 전기영동을 포함하는 면역 침전분석, RIA (Radioimmunoassay), FACS 또는 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 본원에 따른 일구현예에서는 ELISA 방법, 특히 샌드위치 방식의 ELISA가 사용되며, 이 경우 상기 싸이토카인에 특이적으로 결합하는 캡처항체 및/또는 검출항체가 또한 사용될 수 있다.

본원에 따른 항원에 대한 면역반응에 따른 마커 검출 과정을 통해 검체의 최종적인 시그널의 세기를 분석하고 이를 대조군의 시료의 시그널과 비교하여, 변화가 있는 경우, 예를 들면 높은 경우 상술한 바와 같이 활동성 결핵 또는 잠복성 결핵감염으로 판단 또는 진단 할 수 있다.

본원에 따른 일구현예에서는 ELISA 방법, 특히 샌드위치 방식의 ELISA가 사용되며, 이 경우 상기 싸이토카인에 특이적으로 결합하는 캡처항체 및/또는 검출항체가 또한 사용될 수 있다.

본원에 따른 마커의 검출에 사용되는 캡처 항체는 상기 싸이토카인을 특이적으로 인식하는 항체로 시중에 판매되는 것을 사용할 수 있으며, 시각적 또는 다양한 이미지 검출 장비를 이용하여 검출할 수 있는 물질로 표지될 수 있고, 예를 들면 본원에 기재된 것이 사용될 수 있다.

본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 검출 항체는 인간 IgG에 특이적으로 결합하며, 상기 검출항체는 시각적 또는 다양한 이미지 검출 장비를 이용하여 검출할 수 있는 물질로 표지될 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서 표지물질로서 호스라디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)와 같은 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase), 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase), 유레아제(urease), 카탈라아제(catalase), 아스파르기나아제(asparginase), 리보뉴클레아제(ribonuclease), 말레이트 디하이드로지나아제(malate dehydrogenase), 스타필로코칼 뉴클레아제(staphylococcal nuclease), 트리오스 포스페이트 이소머라아제(triose phospate isomerase), 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로지나아제(glucose-6-phosphate dehydrogenase), 글루코아밀라아제(glucoamylase), 그리고 아세틸콜린 에스터라아제(acetylcholine esterase)와 같이 특정 기질(substrate)의 존재하에서 화학반응을 촉매하여 검출가능한 발색반응 또는 광을 방출할 수 있는 효소로 표지될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

다른 구현 예에서, 본원에 따른 표지물질은 광의 조사에 의해 조사된 광과 상이한 파장의 광을 방출하는 바이로루미네슨스, 케미루미네슨스, 일렉트로루미네슨스, 일렉트로케미루미네슨스 및 포토루미네슨에 사용되는 발색단 예를 들면 단백질로서 그린형광단백질; 유기화합물로서 플루오르세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 파이코에리쓰린(phycoerythrin), 파이코시아닌(phycocyanin), 알로파이코시아닌(allophycocyanin), 그리고 플루오르카민(fluorecamine)을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다.

또 다른 구현 예에서, 본원에 따른 표지물질은 다양한 방사선 동위원소 물질을 포함한다.

본원에서 표지물질의 검출은 예를 들어 방사선동위원소인 경우 신틸레이션 카운터(scintillation counter)에 의해 수행할 수 있으며, 예를 들어 표지물질이 형광물질인 경우, 스펙트로스코피, 포스포이미징 장치 또는 형광계측기 등과 같은 방법에 의해 수행할 수 있다. 효소로 표지된 경우, 적절한 기질의 존재 하에서 효소에 의한 발색성 기질의 변환에 의해 나타나는 발색 산물을 계측을 함으로써 수행할 수 있다. 또한, 적당한 표준 혹은 대조군과의 비교를 통해 효소반응에 의해 나타나는 발색 산물의 색 비교로서 탐지할 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 검출항체 및/또는 캡처항체는 예를 들면 발색단; 알칼라인 포스파타제, 바이오틴, 베타-갈락토시다제 또는 퍼옥시다제를 포함하는 효소; 방사선물질; 또는 콜로이드성 금입자 또는 착색 라텍스입자 등과 같은 나노입자를 포함하는 물질을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.

다른 양태에서 본원은 또한 상기한 본원에 따른 방법에 사용되는, 서열번호 1로 표시되는 MTBK24790 항원 또는 서열번호 2로 표시되는 MTBK24800 항원 중 하나 이상; 및 IFN-ν, TNF-α, IL-6, IP-10, 또는 MCP-1 중 하나 이상의 싸이토카인에 대한 캡처 항체 및 검출 항체를 포함하는, 인비트로에서 활동성 또는 잠복성 결핵감염 검출용 키트에 관한 것이다.

본원에 따른 키트에 포함되는 구성 중 상술한 바와 중복되는 것은 위의 기재를 참고할 수 있다.

본원에 따른 키트에서 캡처항체는 96웰 마이크로웰 플레이트와 같은 마이크로 웰플레이트, 콜로이드성 금입자 또는 착색 라텍스 입자를 포함하는 비드 또는 입자 또는 셀룰로스, 나이트로셀룰로스, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리딘, 플루오라이드, 나일론, 하전나일론 및 폴리테트라플루오로에틸렌 등과 같은 멤브레인에 부착될 수 있다. 부착 또는 코팅하는 방법은 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들면 본원 실시 예에 기재된 것을 참고할 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법 또는 키트는 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), RIA (Radio Immuno Assay) 등과 같은 샌드위치 방식의 면역분석방식으로 사용될 수 있다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱 (예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 멤브레인, 슬라이드 또는 마이크로웰플레이트에 결합된 캡처항체에 시료 예를 들면 본원에 따른 항원과 접촉된 시료를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 상술한 바와 같은 ³H 또는 ¹²⁵I와 같은 방사성 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 정성 또는 정량적으로 검출 할 수 있다. 또한 면역분석 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있다. ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 등과 같은 상술한 물질로 표지된 2차 검출항체 및 검출에 사용되는 기질 등을 추가로 포함할 수 있다.

다른 구현예에서, 본원에 따른 방법 또는 키트는 마이크로어레이를 포함하는 어레이 또는 칩의 형태로 사용될 수 있다. 유리 또는 나이트로셀룰로스와 같은 지지체의 표면에 캡처항체가 부착될 수 있으며, 어레이 제조 기술은 예를 들면 Schena et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA. 93(20):10614-9; Schena et al., 1995, Science 270(5235):467-70; 및 U.S. Pat. Nos. 5,599,695, 5,556,752 또는 5,631,734를 참조할 수 있다. 형광 광도는 스캐닝 콘포칼 현미경이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Affymetrix, Inc. 또는 Agilent Technologies, Inc 등에서 입수할 수 있다.

또한 본원에 따른 방법 또는 키트는 분석양태에 따라 딥스틱 래피드 (dip stick rapid kit) 형태로 사용된다. 딥스틱의 경우, POCT (Point of Care Treatment) 분야에서 널리 이용되는 기술로, 본원에 따른 싸이토카인에 결합하는 캡처항체가 나이트로셀룰로스와 같은 기질에 결합되어 있고, 이를 예를 들면 본원에 따른 항원과 접촉된 시료와 담그면 시료가 모세관 현상에 의해 기질을 이동하여, 기질 중의 항체와 결합시 발색하는 방식으로, 검출하는 것이다.

또한 본원의 키트는 분석양태에 따라 측방유동분석에 사용될 수 있다. 측방유동 분석(lateral flow assay)은 검체에 포함된 특정 물질, 예를 들면 특정 핵산 또는 단백질을 정량 또는 정성적으로 측정하는 방법으로, 예를 들면 캡처항체가 특정 위치에 결합되어 있는 나이트로셀룰로스 멤브레인(전개용 매질)을 이용하여 크로마토그래피 방법으로 예를 들면 본원에 따른 항원과 접촉된 시료를 이동시켜 항원 항체 반응을 통해 시료 중의 특정 단백질을 검출하는 방법이다.

또한 본원의 키트는 본원에 따른 마커의 사용법에 관한 안내서를 포함할 수 있다. 또한 대조군에 특이적인 항체 또는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약 등을 추가로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실 시 예

실험 재료

실험대상자 모집 : 2013년 4월부터 2014년 3월까지 아주대학교 병원에서 연구 참가자들의 동의하에 53명의 폐결핵환자와 96명의 폐결핵 및 당뇨, 암 질환이 없는 건강한 정상인을 모집하였다(IRB 승인: 아주대학교 병원기관 연구윤리 심의위원회 AJIRB-GEN-GEN- 13-025). 폐결핵은 임상 증상, 흉부 x-ray, 객담도말, 객담 배양검사 등을 통하여 진단하였고, 정상인은 QFT-IT 검사를 통하여 QFT-IT 양성을 보인 31명의 잠복결핵군(LTBI)과 음성을 보인 65명의 건강한 대조군(control)으로 구별하였다.

본원에서 활동성 결핵군은 결핵환자를 나타내며, 잠복결핵감염군은 모집된 건강한 정상인 가운데 임상적으로 결핵증상이 없는 사람이고 QFT-IT검사에서 양성반응을 보인 군을 나타내며, 대조군은 정상대조군 혹은 음성대조군으로, 모집된 건강한 정상인 중에서 임상적으로 결핵증상이 없는 사람들 중 QFT-IT검사에서 음성을 보인 사람들이다.

실시예 1. 한국형 결핵 균주에서의 항원 발굴 및 상기 항원 단백질 정제

1-1 한국형 결핵 균주에서의 항원 발굴

본 발명에서 한국형 결핵균주 K 균주의 전체 유전체 서열분석(whole genome sequencing)을 하였고 이 결과는 NCBI에 등록되었다(GenBank: CP007803.1). 이러한 결과를 바탕으로 결핵균 표준 균주인 H37Rv 균주와 염기서열을 비교하였을 때 K 균주 내에 5.7 kb의 유전자가 삽입되어 있는 부위를 확인하였고(Park PJ, et al. J. Microbiol. 52(10):871?878, 2014)(도 1), 특히 이 부위에 삽입되어 있는 여러 ORF들 중 현재 IGRA(IFN-γ release assay) 결핵 진단법에 이용되고 있는 ESAT-6 항원과 유사한 아미노산 염기서열을 가진 MTBK24790 유전자가 삽입되어 있음을 확인하였다(도 2). 또한 ESAT-6와 함께 결핵균의 중요한 T cell 항원으로 알려진 CFP-10 항원과 유사한 단백질을 코딩하고 있는 MTBK24800 유전자도 같이 삽입되어 있음을 확인하였다(도 3). 본 발명은 이러한 2가지 유전자, 즉 MTBK24790, MTBK24800 유전자들을 대상으로 대장균으로부터 재조합단백질을 생산하여 항원으로 사용하였으며, 이는 각각 서열번호 1 및 2로 표시된다.

1-2. 한국형 결핵균주 항원 단백질 정제

재조합 단백질과 발현을 위한 벡터로 T7 프로모터를 이용하여 발현시킬 수 있는 pET-11a 벡터(Novagen)를 이용하였다. pET-11a 벡터의 아미노기말단에 6 x His tag을 발현하도록 제작하여 이를 pET-11a-KB라고 명명하고 재조합 단백질의 정제시에 금속킬레이팅크로마토그래피를 이용할 수 있게 하였다. 결핵균 K 균주의 MTBK_24790 및 MTBK_24800의 염기 서열 정보를 바탕으로 하여 하기 프라이머 (MTBK_24790: F: 5’-ttgcatatgacgatcaattatcagttcgg-3’; R: 5’-gcggatccagcccagctggaacccact-3’

MTBK_24800: F: 5’-attcatatggaagggagcggtgtg-3’; R: 5’-cccggatccgctgctcaaaatctgct-3‘)를 이용하여 ATG 개시 코돈으로부터 각 항원의 DNA 단편을 증폭하고, 이를 클로닝벡터에 삽입하였다. 각각의 단백질은 이소프로필-β-D-1-티오갈락토시드(IPTG)를 이용하여 발현을 유도하였고 세균 배양액을 원심분리하여 얻은 균체를 용해시킨 후 다시 13,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 얻은 봉입체(inclusion body)를 용해시킨 후 원심분리 후의 상층액만 취하여 6 x His tag에 친화력이 있는 50% Ni-NTA 슬러리(slurry) 1 mL을 첨가하여 metal chelation chromatography로 정제하였다. 이렇게 1차로 정제된 단백질을 FPLC 이온교환 크로마토그래피를 이용하여 다시 한번 정제하였다(도 4). 정제된 단백질은 50 mM Tris (pH 7.5)에서 투석하여 단백질의 리폴딩(refolding)을 유도하였고, 최종적으로 정제된 단백질은 전혈에 처리할 목적으로 감마선 조사를 통한 살균을 시행하였다.

실시예 2. MTBK24790/MTBK24800 항원에 대한 17종의 면역 싸이토카인 반응 비교분석을 통한, 활동성 결핵 및 잠복 결핵감염의 구분

먼저 기존에 사용되고 있는 IGRA검사에 이용되는 ESAT-6/CFP-10항원조합에 대한 면역반응과 한국형 결핵균주 항원조합에 대한 면역반응을 비교하기 위해 활동성 폐결핵환자, QFT-IT 양성을 보인 잠복결핵자, QFT-IT 음성을 보인 정상인 그룹에서 전혈 1 mL을 RPMI배지에 희석 후 MTBK24790/MTBK24800 항원(10 mg/mL)과 1:1로 섞어 37℃에서 배양하였다. 배양 7일 후, 상층액을 수집하여 FACS분석(싸이토카인 비드 어레이(cytokine bead array))를 통해 동시에 17종의 면역 싸이토카인 반응을 조사한 결과, 5종(IFN-γ, TNF-α, IL-6, IP-10, MCP-1)의 싸이토카인 수치가 정상인에 비해 활동성 결핵환자에서 높은 결과를 나타냈다. 한편 IP-10 반응은 정상인과 잠복결핵감염자에서도 유의성 있는 차이를 보여 활동성 결핵 진단 뿐만 아니라 잠복결핵감염 진단을 위한 바이오마커로 활용될 수 있음을 나타냈고, 샘플사이즈가 증가될 경우 IFN-γ도 정상인과 잠복결핵감염을 구별할 수 있는 통계학적인 유의성을 보일 것으로 예상되었다. 또한 잠복결핵감염 그룹에 비해 활동성 결핵환자 그룹에서 높은 수치의 TNF-α, IL-6 반응이 관찰되었는데 이는 TNF-α, IL-6반응이 결핵의 감염상태(활동성 vs 잠복기)를 구별하는 중요한 마커가 될 수 있음을 의미한다. 결과는 도 5에 나타나 있다.

한편, 상기 항원조합에 의한 면역반응 결과에서 선별된 4종의 싸이토카인(IFN-γ, TNF-α, IL-6, IP-10)에 대하여 MTBK24790 및 MTBK24800항원 각각에 대한 면역반응을 분석한 결과, 정상인 대조군으로부터 잠복결핵군을 구별하는 IFN-γ, IP-10의 기능은 MTBK24800항원에 의한 것임이 밝혀졌다(도 6). 그러나 TNF-α는 MTBK24790과 MTBK24800 모두에 의해 잠복결핵감염과 활동성 결핵을 구별하는 것으로 나타났다(도 6). 따라서 현재 잠복결핵감염을 진단하는 방법으로 널리 사용되고 있는 ESAT-6, CFP-10, TB7.7항원조합을 이용한 IGRA 방법과 비교했을 시, MTBK24800항원은 IFN-γ와 IP-10의 측정으로 정상인으로부터 잠복결핵감염과 활동성 결핵을 모두 구별할 수 있고 더불어 TNF-α의 측정으로 잠복결핵감염과 활동성 결핵 또한 구별진단할 수 있는 이점을 가지고 있다.

실시예 3. MTBK24790/MTBK24800 항원에 대한 IFN-γ, IP-10, TNF-α, IL-6 반응의 ROC 커브 분석을 통한, 활동성 결핵 및 잠복 결핵감염의 구별

그룹간 면역반응의 유의성 있는 차이를 보인 IFN-γ, IP-10, TNF-α, IL-6에 대해 그룹별 ROC(Receiver Operating Characteristic) 커브를 분석하여 AUC(Area Under the Curve) 값을 도출하였다. 먼저 MTBK24790, MTBK24800 항원조합에 의한 면역반응에서 IL-6 반응이 정상인에게서 활동성 결핵을 구별하고 동시에 잠복결핵감염으로부터 활동성 결핵을 구별하는 가장 높은 AUC값을 보였다 (r=0.8308 for control vs TB, r=0.7486 for LTBI vs TB, P<0.001). 또한 각각의 항원에 대한 면역반응에서는 MTBK24800항원에 대해 IFN-γ, IP-10이 정상인으로부터 잠복결핵감염 및 활동성 결핵을 모두 구별하였고, 정상인으로부터 잠복결핵감염을 구별하는 AUC값은 0.8025 (IFN-γ), 0.7419 (IP-10)로서 IGRA처럼 잠복결핵감염을 진단하는 마커로 활용될 수 있음을 관찰하였다(도 7A). 또한 잠복결핵감염과 활동성 결핵을 구별하는 TNF-α의 AUC값은 MTBK24790, MTBK24800 항원에 대해 각각 0.8095, 0.7809 (P<0.001)을 보임으로써 이는 두 항원에 대한 TNF-α의 측정이 잠복결핵감염과 활동성 결핵을 구별하는 진단마커로서 가치를 지닌다는 것을 나타낸다(도 7B).

즉, 한국형 결핵균주(K-strain)에서 발견한 MTBK24790 및 MTBK24800항원들에 대한 싸이토카인(IP-10, IFN-γ, TNF-α, IL-6 및 MCP-1)에 대한 면역반응은 우리나라 결핵환자의 진단뿐만 아니라 잠복결핵감염 관리를 위해 중요한 바이오마커로 개발될 수 있다. 특히 MTBK24800 항원에 대한 IFN-γ, IP-10 및 TNF-α의 동시 측정은 정상인으로부터 잠복결핵감염과 활동성 결핵을 구별하고 동시에 잠복결핵감염과 활동성 결핵도 구별진단하는 유용한 바이오마커가 될 수 있다.

본 발명을 통해 우리나라 결핵집단 발생과 재발환자에서 빈번하게 분리되는 결핵균주로부터 분리한 항원은 기존의 QFT-IT 방법에 사용되는 결핵항원과 함께 우리나라 실정에 더 적합한 결핵진단 및 감염 바이오마커로 활용될 수 있다. 또한 이러한 한국형 결핵균주 항원에 대한 면역반응은 향후 균주 타입을 고려한 결핵 백신 개발시 중요한 참고데이터로서의 가치를 지니고 있다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Method and kit for TB diagnosis based on immune response to K-strain specific antigens <130> DP201503011P <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 94 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis K (MTBK_24790) <400> 1 Met Thr Ile Asn Tyr Gln Phe Gly Asp Val Asp Ala His Gly Ala Met 1 5 10 15 Ile Arg Ala Gln Ala Ala Ala Leu Glu Ala Glu His Gln Ala Ile Val 20 25 30 Arg Asp Val Leu Ala Ala Gly Asp Phe Trp Gly Gly Ala Gly Ser Val 35 40 45 Ala Cys Gln Glu Phe Ile Thr Ala Leu Gly Arg Asn Phe Ala Val Ile 50 55 60 Tyr Gln Gln Ala Asn Ala His Gly Gln Lys Ile Gln Ala Ala Gly Ser 65 70 75 80 Asn Met Ala Gln Thr Asp Ser Ala Val Gly Ser Ser Trp Ala 85 90 <210> 2 <211> 99 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis K (MTBK24800) <400> 2 Met Val Ala Thr Arg Phe Met Thr Asp Pro His Ala Met Arg Asp Met 1 5 10 15 Ala Gly Arg Phe Glu Val His Ala Gln Thr Val Glu Asp Glu Ala Arg 20 25 30 Arg Met Trp Ala Ser Ser Gln Asn Ile Ser Gly Ala Gly Trp Ser Gly 35 40 45 Leu Ala Glu Ala Thr Ser Leu Asp Thr Met Thr Gln Met Asn Gln Ala 50 55 60 Phe Arg Asn Ile Val Asn Met Leu His Gly Val Arg Asp Gly Leu Val 65 70 75 80 Arg Asp Ala Asn Asn Tyr Glu Gln Gln Glu Gln Ala Ser Gln Gln Ile 85 90 95 Leu Ser Ser

Claims (11)

1. 서열번호 1로 표시되는 MTBK24790 항원 또는 서열번호 2로 표시되는 MTBK24800 항원 또는 상기 항원의 조합을 포함하는, GenBank CP007803.1로 기탁된 핵산서열을 갖는 한국형 K-strain 결핵균주 검출용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 결핵균주의 검출은 활동성 또는 잠복성 결핵 감염여부 판단인, 조성물.
   
3. 시료가 활동성 결핵감염인지 여부를 진단하기 위한 정보를 제공하기 위하여,
   한국형 결핵균주(K-strain)의 서열번호 1로 표시되는 MTBK24790 항원 및 서열번호 2로 표시되는 MTBK24800 항원 조합을 상기 시료 또는 정상 대조군 시료와 접촉하는 단계;
   상기 시료에서 IFN-ν, TNF-α, IL-6, IP-10, 및 MCP-1를 검출하는 단계; 및
   상기 검출결과 상기 시료에서 상기 IFN-ν, TNF-α, IL-6, IP-10, 및 MCP-1의 농도가 상기 대조군과 비교하여 높은 경우 상기 시료를 활동성 결핵으로 판단하는, 인비트로에서 활동성 결핵감염 여부 판단 방법.
   
4. 제 3 항에서 상기 시료는 전혈 또는 혈장 이며, IGRA 분석 음성으로 판단된 시료를 포함하는 것인, 방법.
   
5. 시료가 잠복성 결핵감염인지 여부를 진단하기 위한 정보를 제공하기 위하여,
   한국형 결핵균주(K-strain)의 서열번호 2로 표시되는 MTBK24800 항원을 상기 시료 또는 정상 대조군 시료와 접촉하는 단계;
   상기 시료에서 IFN-ν 및 IP-10을 검출하는 단계; 및
   상기 검출결과 상기 시료에서 IFN-ν 및 IP-10가 상기 대조군과 비교하여 높은 경우 상기 시료를 잠복성 결핵으로 판단하는, 인비트로에서 잠복성 결핵감염 여부 판단 방법.
   
6. 시료가 활동성 결핵감염인지 여부를 진단하기 위한 정보를 제공하기 위하여,
   한국형 결핵균주(K-strain)의 서열번호 2로 표시되는 MTBK24800 항원을 상기 시료 또는 정상 대조군 시료와 접촉하는 단계;
   상기 시료에서 IFN-ν 및 IP-10 및 TNF-α를 검출하는 단계; 및
   상기 검출결과 상기 시료에서 IFN-ν 및 IP-10 및 TNF-α가 상기 대조군과 비교하여 높은 경우 상기 시료를 활동성 결핵으로 판단하는, 인비트로에서 활동성 결핵감염 여부 판단 방법.
   
7. 제 5 항 또는 제 6 항에서 상기 시료는 전혈 또는 혈장이며, 상기 시료는 IGRA 양성 또는 IGRA 음성으로 판단된 시료인, 방법.
   
8. IGRA 양성으로 판단된 시료가 활동성 결핵감염인지 여부를 판단하기 위한 정보를 제공하기 위하여,
   한국형 결핵균주(K-strain)의 서열번호 1로 표시되는 MTBK24790 항원 또는 서열번호 2로 표시되는 MTBK24800 항원을 상기 시료 또는 IGRA 양성 대조군 시료와 접촉하는 단계;
   상기 시료에서 TNF-α를 검출하는 단계; 및
   상기 검출결과 상기 시료에서 TNF-α가 상기 대조군과 비교하여 높은 경우 상기 시료를 활동성 결핵으로 판단하는, 인비트로에서 잠복성 결핵이 활동성 결핵감염인지 여부 판단 방법.
   
9. 제 8 항에서 상기 시료는 전혈 또는 혈장을 포함하는 것인, 방법.
   
10. 서열번호 1로 표시되는 MTBK24790 항원 또는 서열번호 2로 표시되는 MTBK24800 항원 중 하나 이상; 및 IFN-ν, TNF-α, IL-6, IP-10, 또는 MCP-1 중 하나 이상의 싸이토카인에 대한 캡처 항체 및 검출 항체를 포함하는, 인비트로에서 활동성 또는 잠복성 결핵감염 검출용 키트.
    
11. 제 10 항에 있어서, 상기 키트는 ELISA 또는 FACS 분석용인, 키트.

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