KR20210135892A - 결핵균을 검출하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 결핵균을 검출하는 방법에 있어서, 긴 시간이 소요되는 기존의 활동성 결핵을 검출하는 방법을 대체할 수 있는, 객담 도는 기관지 세척액 시료를 멤브레인 필터로 농축하고, 항체 또는 방사성동위원소가 표지 된 항체를 이용하여 결핵 또는 기관지 세척액 시료에서 결핵균을 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

결핵균을 검출하는 방법 {Method for detecting mycobacterium tuberculosis}
본 발명은 결핵균을 검출하는 방법에 있어서, 긴 시간이 소요되는 기존의 활동성 결핵을 검출하는 방법을 대체할 수 있는, 객담 또는 기관지 세척액 시료를 멤브레인 필터로 농축하고, 항체 또는 방사성동위원소가 표지 된 항체를 이용하여 결핵 또는 기관지 세척액 시료에서 결핵균을 검출하는 방법에 관한 것이다.
전 세계적으로 매년 1천만 명 이상의 신규 결핵(Tuberculosis, TB) 환자가 발생하고 있으며, 결핵 사망자 수는 연간 180만 명에 달해 전 세계적으로 질병 부담이 심각한 상황이다. 2017년 한국에서 발생한 결핵환자는 총 36,044명이며, 이는 OECD 국가 중 전체 1위로서 국내 공중보건에 큰 위협이 되고 있다(질병관리본부, 2017). 또한, 북한의 결핵문제는 전 세계에서 가장 심각한 상태로서 2017년 기준 결핵환자는 13만 명으로 추산되며, 사망률 또한 크게 증가하고 있어 남북한 결핵문제는 세계적으로 중요한 이슈이다(WHO, 2018).
Mycobacterium Tuberculosis 등 결핵균에 의하여 발병되는 결핵은 결핵균의 상태에 따라 잠복결핵(Latent tuberculosis)과 활동성결핵(Active tuberculosis)으로 구분된다. 결핵균이 잠복하고 있어 결핵증상과 전염성이 없는 상태를 잠복결핵이라고 하며, 면역력 저하 등의 다양한 원인으로 인하여 결핵증상과 전염성을 가지게 되는 상태를 활동성결핵이라고 한다. 따라서, 결핵의 전염을 억제하고 조기에 치료하기 위해서는 활동성결핵을 신속하게 진단하는 것이 가장 중요하다.
활동성결핵을 진단하기 위해서는, 객담 등 환자로부터 발생한 시료에서 살아있는 상태의 결핵균을 검출하는 것이 필요하다. 현재는 환자의 객담 시료로부터 살아있는 결핵균을 배양하여 확인하는 배양법이 표준 방법(gold standard)으로 사용되고 있다. 그러나 배양법으로 결핵균을 검출하기 위해서는 4~8주의 긴 시간이 필요하다. 이렇게 활동성결핵의 진단에 소요되는 시간이 길기 때문에, 조기에 결핵을 치료하기 어려울 뿐만 아니라 격리조치가 어려워 결핵 전파의 주요 원인이 되고 있다. 따라서 환자의 시료에서 살아있는 결핵균을 보다 신속하게 검출함으로써 활동성결핵을 진단할 수 있는 새로운 기술이 필요하다.
본 발명은 결핵균을 검출하는 방법에 있어서, 긴 시간이 소요되는 기존의 활동성 결핵을 검출하는 방법을 대체할 수 있는 기술로서, 객담 또는 기관지 세척액 시료를 멤브레인 필터로 농축하고, 항체 또는 방사성동위원소가 표지 된 항체를 이용하여 결핵 또는 기관지 세척액 시료에서 결핵균을 신속하게 검출하는 방법을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 0.45um 내지 1.00um 사이즈의 멤브레인 필터를 이용하여 시료내 결핵균을 검출하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 멤브레인 필터는 Polyvinylidene Fluoride(PVDF) 또는 Polytetrafluoroethylene(PTFE) 소재로 제작된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 시료는 객담 시료 또는 기관지 세척액 시료일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 결핵균은 활동성 결핵균일 수 있다.
본 발명은 또한 0.45um 내지 1.00um 사이즈의 멤브레인 필터 및 결핵균에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는 결핵 진단용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 멤브레인 필터는 Polyvinylidene Fluoride(PVDF) 또는 Polytetrafluoroethylene(PTFE) 소재로 제작된 것 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 분석 대상이 되는 시료는 객담 또는 또는 기관지 세척액 시료일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 추가로 상기 항체에 특이적으로 결합하는 검출체, 세척액 및 효소반응 정지액을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 검출체는 발색효소, 형광물질 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 표지된 접합체일 수 있다.
본 발명에 따른 결핵균을 검출하는 방법은 멤브레인 필터를 사용하여 환자의 객담 또는 기관지 폐포 세척액 시료를 농축하고, 검출하고자 하는 결핵균의 농도를 높여 검출 효율을 향상 시키는 효과가 있다. 결핵균에 결합하는 항체 또는 방사성 동위원소가 표지 된 항체를 농축된 시료와 반응시킨 후에 발색법 또는 방사선 계수법으로 확인함으로써, 멤브레인 상의 결핵균을 직접으로 검출함으로써, 검출에 소요되는 시간을 단축시키며 신속하게 활동성 결핵을 진단할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 방사성동위원소가 표지된 항체를 이용하여 결핵균을 검출 한 뒤, 방사선계수법을 이용하여 결핵균을 검출한 결과이다.
도 2은 I-125 주입량 대비 흡착량 분석 결과이다.
본 발명자들은 결핵균을 검출하는 방법에 있어서, 긴 시간이 소요되는 기존의 활동성 결핵을 검출하는 방법을 대체할 수 있는 기술로서, 객담 또는 기관지 세척액 시료를 멤브레인 필터로 농축하고, 항체 또는 방사성동위원소가 표지 된 항체를 이용하여 결핵 또는 기관지 세척액 시료에서 결핵균을 신속하게 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 0.45um 내지 1.00um 사이즈의 멤브레인 필터를 이용하여 시료내 결핵균을 검출하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 멤브레인 필터는 Polyvinylidene Fluoride(PVDF) 또는 Polytetrafluoroethylene(PTFE) 소재로 제작된 것일 수 있다.
본 발명자들은 다양한 사이즈 및 종류의 멤브레인 필터를 사용하여 결핵균을 검출한 결과, Polyvinylidene Fluoride(PVDF) 또는 Polytetrafluoroethylene(PTFE) 소재로 제작된 0.45um 내지 1.00um의 pore size의 멤브레인 필터가 최적임을 확인하였다 (표 1).
상기 시료는 객담 시료 또는 기관지 세척액 시료일 수 있다.
상기 결핵균은 활동성 결핵균일 수 있다.
본 발명은 또한 0.45um 내지 1.00um 사이즈의 멤브레인 필터 및 결핵균에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는 결핵 진단용 키트를 제공할 수 있다.
상기 멤브레인 필터는 Polyvinylidene Fluoride(PVDF) 또는 Polytetrafluoroethylene(PTFE) 소재로 제작된 것 일 수 있다.
분석 대상이 되는 시료는 객담 또는 또는 기관지 세척액 시료일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 키트에 추가로 상기 항체에 특이적으로 결합하는 검출체, 세척액 및 효소반응 정지액을 포함할 수 있다.
상기 검출체는 발색효소, 형광물질 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 표지된 접합체일 수 있다. 예를 들어, 상기 발색효소는 퍼록시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 또는 산성 포스파타제(acid phosphatase)[예: 양고추냉이 퍼록시다제(horseradish peroxidase)]일 수 있고; 형광물질인 경우, 콜로이드 골드(Coloid gold), 플루오레신카복실산(FCA), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), RITC(Rhodamine-Bisothiocyanate), 플루오레신 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸일 수 있고, 동위원소인 경우 I-125, H-3, C-14, P-32, P-33, Cr-51 등을 사용하는 것이 가능하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 키트는 상기 항원항체 복합체의 항원항체 반응을 측정하는 방법 또는 상기 항원항체 복합체에 검출체를 처리한 후 검출체의 양을 측정함으로써 결핵을 진단할 수 있다. 상기 항원항체 반응으로서 효소면역측정법 (ELISA), 면역침강법, 형광면역법, 효소기질발색법, 항원항체응집법 등을 들 수 있고, 검출체의 양 측정이나 존재 검출은 발색, 형광, 발광, 화학발광(chemiluminescence), 흡광도, 반사 또는 투과를 통해 이루어질 수 있다
상기 검출체의 양을 탐색하는 방법으로는 검출체로 방사선 동위원소가 부착되어 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법 또는 검출체에 결합된 발색효소의 발색을 유도하는 기질을 처리하여 발색반응을 측정하는 방법을 이용하는 것이 바람직하고, 여기에는 검출체로 형광물질이 부착되어 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법; 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 멤브레인 필터의 조건 및 항체의 발색법을 이용한 결핵균 검출
생리식염수 50ul(대조군) 및 결핵환자의 객담을 배양한 시료 50ul(실험군)를 아래의 조건별 멤브레인 필터에 주입하고, Tris-buffered Saline(TBS) 2ml을 주입하여 세척하였다. 결핵균에 결합하는 1차 항체 100ul를 넣고 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. TBS 5~10ml을 2회 주입하여 세척하였다. 1차 항체에 결합하는 Horseradish peroxidase(HRP)가 표지된 2차 항체 100ul를 넣고 30분간 상온에서 반응시켰다. TBS 5~10ml을 2회 주입하여 세척하였다. 발색법으로 결핵균을 검출하기 위하여 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine(TMB) 100ul를 넣고, 5분간 상온에서 반응시켰다. 발색 여부를 확인함으로써 결핵균 검출을 위한 멤브레인 필터의 조건을 평가하였다. 시료 내 존재하는 결핵균을 농축하여 검출하기 위해서는 Polyvinylidene Fluoride(PVDF) 또는 Polytetrafluoroethylene(PTFE) 소재로 제작된 0.45um ~ 1.00um의 pore size의 멤브레인 필터가 최적임을 확인하였다 (표 1).
Figure pat00001
추가로 결핵균에 대한 특이적 검출을 확인하기 위하여 타 세균(E.coli)를 이용한 음성대조군 실험을 수행하였다. 위 실험과 같은 조건에서 생리식염수 50ul(대조군), E.coli(음성대조군), 결핵균(실험군)을 각각 주입하여 평가한 결과, 음성대조군에서는 발색이 되지 않았다. 이를 통하여 결핵균 특이적인 검출이 가능함을 확인하였다 (표 2).
Figure pat00002
실시예 2. 방사성동위원소가 표지된 항체 및 방사선계수법을 이용한 결핵균 검출
생리식염수 50ul(대조군) 및 결핵환자의 객담을 배양한 시료 50ul(실험군)를 멤브레인 필터에 주입하고, Tris-buffered Saline(TBS) 2ml을 주입하여 세척하였다. 결핵균에 결합하는 1차 항체 100ul를 넣고 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. TBS 5~10ml을 2회 주입하여 세척하였다. 방사성동위원소 I-125가 표지된 2차 항체 100ul를 넣고 30분간 상온에서 반응시켰다. TBS 5~10ml을 2회 주입하여 세척하였다. I-125의 주요 감마 에너지 영역(35.49 keV)에 대한 방사능량을 Multichannel Analyzer(MCA)를 이용하여 1,800초간 측정하였다. 또한, 측정된 값을 초기 주입된 방사능량(Injected Dose)으로 나누어, 결핵균에 I-125 표지항체가 결합된 비율(%Binding)을 분석하였다. Background 및 대조군에 비하여 실험군에서 높은 방사능량이 측정되었다. 이로써 방사성동위원소가 표지된 항체 및 방사선계수법을 이용하여 결핵균 검출이 가능함을 확인하였다 (도 1 및 도 2).
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (9)

  1. 0.45um 내지 1.00um 사이즈의 멤브레인 필터를 이용하여 시료내 결핵균을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 멤브레인 필터는 Polyvinylidene Fluoride(PVDF) 또는 Polytetrafluoroethylene(PTFE) 소재로 제작된, 결핵균을 검출하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 시료는 객담 시료 또는 기관지 세척액 시료인, 결핵균을 검출하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 결핵균은 활동성 결핵균인, 결핵균을 검출하는 방법.
  5. 0.45um 내지 1.00um 사이즈의 멤브레인 필터 및 결핵균에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는 결핵 진단용 키트.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 멤브레인 필터는 Polyvinylidene Fluoride(PVDF) 또는 Polytetrafluoroethylene(PTFE) 소재로 제작된, 결핵 진단용 키트.
  7. 제 5항에 있어서, 분석 대상이 되는 시료는 객담 또는 또는 기관지 세척액 시료인, 결핵 진단용 키트.
  8. 제 5항에 있어서, 추가로 상기 항체에 특이적으로 결합하는 검출체, 세척액 및 효소반응 정지액을 포함하는, 결핵 진단용 키트.
  9. 제 5항에 있어서, 상기 검출체는 발색효소, 형광물질 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 표지된 접합체인, 결핵 진단용 키트.

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