JP2011139656A - インフルエンザウイルスの検知方法およびインフルエンザウイルスの検知装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】居室空間Ｒ等の空気中に浮遊するインフルエンザウイルスを簡便に検出する技術を提供すること。
【解決手段】インフルエンザウイルスをエアフィルタにより捕集し、エアフィルタをノイラミニダーゼ抽出液に接触させ、エアフィルタに接触したノイラミニダーゼ抽出液を、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼにより分解されて発色するノイラミニダーゼ発色基質に反応させ、そのノイラミニダーゼ発色基質の発色により雰囲気中に含まれるインフルエンザウイルスを検知する。
【選択図】図１
【解決手段】インフルエンザウイルスをエアフィルタにより捕集し、エアフィルタをノイラミニダーゼ抽出液に接触させ、エアフィルタに接触したノイラミニダーゼ抽出液を、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼにより分解されて発色するノイラミニダーゼ発色基質に反応させ、そのノイラミニダーゼ発色基質の発色により雰囲気中に含まれるインフルエンザウイルスを検知する。
【選択図】図１
Description
本発明は、インフルエンザウイルスを検知する技術に関し、特に、居室空間等の空気中に浮遊するインフルエンザウイルスを検出するインフルエンザウイルスの検知方法およびインフルエンザウイルスの検知装置に関する。
従来、インフルエンザウイルスは、ウイルス感染の疑われる人などからインフルエンザウイルスの多く含まれる鼻汁、痰等の試料を採取し、その試料をもとに培養、分離、同定するという手順で確認することが行われている。しかし、このような手法を用いると、結果を得るまでに数日を要するために、近年、イムノクロマトグラフィを用いた簡易的な検査キットが開発されている（たとえば、特許文献１）。これは、ウイルスを抗原とした抗原抗体反応により、特異的に発色する抗体や、インフルエンザウイルスに特異の酵素ノイラミニダーゼとの反応により発色する発色基質を用い、試料と抗体や発色基質との接触により発色を観察することによってウイルスの存在を知るものである。この方法によれば、数分から数十分の間にインフルエンザウイルスを検出し、感染患者の治療等に有効活用できるものとなってきている。
しかし、イムノクロマトグラフィによっても、試料は鼻汁、痰等の比較的ウイルスが大量に存在する部位から採取する必要があり、また、感度も信頼性７０％程度のものであるといわれている。
また、さらに、ＭＥＭＳ（ＭｉｃｒｏＥｌｅｃｔｒｏＭｅｃｈａｎｉｃａｌＳｙｓｔｅｍ）を用いた簡易検知システムも提案されているが（非特許文献１）、このような検知システムであっても、基本的には、検出対象は高濃度のウイルスを含有する溶液であることが前提であり、希薄な状態で浮遊するウイルスの調製から検出方法までのインフルエンザウイルスの分析を簡便、迅速に行えるものではなく、インフルエンザウイルスによる感染拡大の防御のために必要である、空気中に浮遊するウイルスを検出する場合において、適切な採取方法、および検出方法となっておらず、簡便に活用できない現状にある。
Ｆｅｒｎａｎｄｏ Ｐａｔｏｌｓｋｙ， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７８， ２３， ４２６０−４２６９（２００６）
そのため、居室空間等の空気中に浮遊するインフルエンザウイルスを検出する場合に、採取した居室空間内の空気よりウイルスを濃縮して簡便に液状の試料としうる、ウイルスモニタに適した試料調製方法の開発が必要であり、上述の従来の検知技術を適用しようとすると、その場で簡便かつ迅速に分析できないうえに、長期的にウイルスの状況をモニタするというような用途では使用することができなかった。
そこで、本発明は、上記実情に鑑み、居室空間等の空気中に浮遊するインフルエンザウイルスを簡便に検出する技術を提供することにある。
そこで、本発明は、上記実情に鑑み、居室空間等の空気中に浮遊するインフルエンザウイルスを簡便に検出する技術を提供することにある。
〔構成〕
上記技術課題を解決するための本発明のインフルエンザウイルス検知方法の特徴構成は、
インフルエンザウイルスをエアフィルタにより捕集し、
前記エアフィルタをノイラミニダーゼ抽出液（以後、単に抽出液ともいう）に接触させ、
前記エアフィルタに接触した抽出液を、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼにより分解されて発色するノイラミニダーゼ発色基質（以後、単に発色基質ともいう）に反応させ、
その発色基質の発色により雰囲気中に含まれるインフルエンザウイルスを検知する点にある。
〔作用効果〕
つまり、本発明のインフルエンザウイルスの検知方法は、インフルエンザウイルスをエアフィルタにより捕集するから、簡便に居室空間等の空気中に浮遊するインフルエンザウイルスの試料を採取することができる。この前記エアフィルタを抽出液に接触させ、採取された試料にインフルエンザウイルスが含まれていると、インフルエンザウイルスの表面に存在するノイラミニダーゼは抽出液に抽出される。そのため、前記エアフィルタに接触した抽出液には、インフルエンザウイルスの量に応じたノイラミニダーゼが含まれていることになる。このノイラミニダーゼを含む抽出液を、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼにより分解されて発色する発色基質に反応させると、そのノイラミニダーゼの量に応じて発色するから、インフルエンザウイルスの検出が行えるのである。
上記技術課題を解決するための本発明のインフルエンザウイルス検知方法の特徴構成は、
インフルエンザウイルスをエアフィルタにより捕集し、
前記エアフィルタをノイラミニダーゼ抽出液（以後、単に抽出液ともいう）に接触させ、
前記エアフィルタに接触した抽出液を、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼにより分解されて発色するノイラミニダーゼ発色基質（以後、単に発色基質ともいう）に反応させ、
その発色基質の発色により雰囲気中に含まれるインフルエンザウイルスを検知する点にある。
〔作用効果〕
つまり、本発明のインフルエンザウイルスの検知方法は、インフルエンザウイルスをエアフィルタにより捕集するから、簡便に居室空間等の空気中に浮遊するインフルエンザウイルスの試料を採取することができる。この前記エアフィルタを抽出液に接触させ、採取された試料にインフルエンザウイルスが含まれていると、インフルエンザウイルスの表面に存在するノイラミニダーゼは抽出液に抽出される。そのため、前記エアフィルタに接触した抽出液には、インフルエンザウイルスの量に応じたノイラミニダーゼが含まれていることになる。このノイラミニダーゼを含む抽出液を、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼにより分解されて発色する発色基質に反応させると、そのノイラミニダーゼの量に応じて発色するから、インフルエンザウイルスの検出が行えるのである。
したがって、空気中に浮遊するインフルエンザウイルスを簡便に採取して、その場で発色させる操作を行うことができる簡便な検出方法を行うことにより、きわめて容易にインフルエンザウイルスを検知することができるようになった。
〔構成〕
なお、前記エアフィルタが、ゼラチン、ニトロセルロースからなる群より選ばれる少なくとも一種の材質であれば好ましく、
前記エアフィルタが、ポリカーボネート、銀、セラミクスからなる群より選ばれる少なくとも一種の材質であってもよい。
なお、前記エアフィルタが、ゼラチン、ニトロセルロースからなる群より選ばれる少なくとも一種の材質であれば好ましく、
前記エアフィルタが、ポリカーボネート、銀、セラミクスからなる群より選ばれる少なくとも一種の材質であってもよい。
〔作用効果〕
エアフィルタとしては、インフルエンザウイルスを捕捉可能な０．０１〜数μｍ程度の孔径のものが良好に用いられるが、ゼラチンのように、抽出液に接触させたときに溶解して消失する水溶性の材質のものであれば、簡易的に用いることが出来るとともに、ウイルス付着のフィルタを後処理（無害化）する上で好ましい。
エアフィルタとしては、インフルエンザウイルスを捕捉可能な０．０１〜数μｍ程度の孔径のものが良好に用いられるが、ゼラチンのように、抽出液に接触させたときに溶解して消失する水溶性の材質のものであれば、簡易的に用いることが出来るとともに、ウイルス付着のフィルタを後処理（無害化）する上で好ましい。
また、焼却処分容易なニトロセルロース等の材質のものも用いることが出来、オートクレーブや洗浄処理により再生可能なポリカーボネート等、洗浄処理のみならず燃焼処理によっても再生できる銀、セラミクス等の材質であっても衛生面、くり返し使用による効率化の面から好適であるといえる。
〔構成〕
また、前記抽出液が界面活性剤を含有するものであれば好ましい。
また、前記抽出液が界面活性剤を含有するものであれば好ましい。
〔作用効果〕
ここで、抽出液とは、通常、水が好適に用いられるが、インフルエンザウイルスと接触して、その表面のノイラミニダーゼを溶出させる効果のある液体であれば適用することができる。
ここで、抽出液とは、通常、水が好適に用いられるが、インフルエンザウイルスと接触して、その表面のノイラミニダーゼを溶出させる効果のある液体であれば適用することができる。
また、このような抽出液を用いると、先述のゼラチン等の水溶性のエアフィルタを溶解して処理することが出来るので好適であるとともに、インフルエンザウイルスを容易に均一分散させることができるので、ノイラミニダーゼを抽出して後続の発色反応を精度良く行うことが出来る。
また、エアフィルタによらず、連続供給するシステムに組み込みやすく、取り扱い容易である。
〔構成〕
また、前記発色基質がシアル酸を結合した発色団であり、シアル酸としては、例えば、N-アセチルノイラミン酸など、発色団としては、例えば、４−メチルウンベリフェロン誘導体、５−ブロモインドール酸誘導体などが挙げられる。
〔構成〕
また、前記発色基質がシアル酸を結合した発色団であり、シアル酸としては、例えば、N-アセチルノイラミン酸など、発色団としては、例えば、４−メチルウンベリフェロン誘導体、５−ブロモインドール酸誘導体などが挙げられる。
〔作用効果〕
ノイラミニダーゼにより、例えば、４−メチルウンベリフェロン誘導体と末端シアル酸の複合体である４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ノイラミン酸アンモニウム（４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−α−Ｄ−ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ，Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ：４ＭＵ−ＮＡＮＡ）が分解されると、蛍光物質４−メチルウンベリフェロンを生じる。この時の４−メチルウンベリフェロンの生成量に基づき、酵素活性を算出することが出来、その酵素活性からインフルエンザウイルス濃度を推定することが出来る。
ノイラミニダーゼにより、例えば、４−メチルウンベリフェロン誘導体と末端シアル酸の複合体である４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ノイラミン酸アンモニウム（４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−α−Ｄ−ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ，Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ：４ＭＵ−ＮＡＮＡ）が分解されると、蛍光物質４−メチルウンベリフェロンを生じる。この時の４−メチルウンベリフェロンの生成量に基づき、酵素活性を算出することが出来、その酵素活性からインフルエンザウイルス濃度を推定することが出来る。
但し、発色基質としては、４ＭＵ−ＮＡＮＡ以外にも種々の誘導体を利用することが出来、ノイラミニダーゼとの反応により発生する物質を光学的に検知できる物質であれば、基質として用いることが出来ることが明らかである。本発明では、これら物質を総称して発色基質と呼ぶものとする。
〔構成〕
また、ノイラミニダーゼと発色基質とを反応させる場合には、前記発色基質をシート基材に固定化しておき、前記エアフィルタにより捕集された捕集物を前記抽出液により前記シート基材に転写して前記発色基質を発色させることができる。
あるいは、前記発色基質を前記抽出液に含有させておき、前記エアフィルタにより捕集された捕集物に、前記抽出液を供給して前記発色基質を発色させる、または、別途、基質槽を設け、基質槽より前期発色基質溶液を供給して前期抽出液と接触させることにより前期発色基質を発色することもできる。
また、ノイラミニダーゼと発色基質とを反応させる場合には、前記発色基質をシート基材に固定化しておき、前記エアフィルタにより捕集された捕集物を前記抽出液により前記シート基材に転写して前記発色基質を発色させることができる。
あるいは、前記発色基質を前記抽出液に含有させておき、前記エアフィルタにより捕集された捕集物に、前記抽出液を供給して前記発色基質を発色させる、または、別途、基質槽を設け、基質槽より前期発色基質溶液を供給して前期抽出液と接触させることにより前期発色基質を発色することもできる。
〔作用効果〕
つまり、前記発色基質をシート基材に固定化しておくと、発色基質は乾燥状態で保管することが出来、安定に長期保管が容易にできるものとなるので、簡易に検査を継続して行いたいような場合に好適である。このようにして固定化された発色基質は、ノイラミニダーゼを含む溶液を塗布することによって、発色反応させることが出来る。つまり、前記エアフィルタにより捕集された捕集物を前記抽出液により前記シート基材に転写して前記発色基質を発色させると、簡便な操作により発色反応を行わせることが出来る。この発色したシート基材は、常法により発色検知ユニットで分析され、インフルエンザウイルスの検知が行えるものとなる。
つまり、前記発色基質をシート基材に固定化しておくと、発色基質は乾燥状態で保管することが出来、安定に長期保管が容易にできるものとなるので、簡易に検査を継続して行いたいような場合に好適である。このようにして固定化された発色基質は、ノイラミニダーゼを含む溶液を塗布することによって、発色反応させることが出来る。つまり、前記エアフィルタにより捕集された捕集物を前記抽出液により前記シート基材に転写して前記発色基質を発色させると、簡便な操作により発色反応を行わせることが出来る。この発色したシート基材は、常法により発色検知ユニットで分析され、インフルエンザウイルスの検知が行えるものとなる。
尚、発色基質をシート基材に固定しておくと、無水状態で安定的に保存することが出来、溶液状態で保管するのに比べて長期的に安定に使用することができるので、本願の目的とする居室空間内のインフルエンザウイルスを継続的にモニタするような場合に好適に用いることが出来る。
また、前記発色基質を前記抽出液に含有させておき、前記エアフィルタにより捕集された捕集物に、前記抽出液を供給すると、前記捕集物にインフルエンザウイルスが含まれていた場合に、そのウイルスから溶離されるノイラミニダーゼが前記発色基質と接触することになるので、他の媒体を使用することなく直接発色反応を行うことが出来るので、さらに簡単な操作で前記発色基質を発色させることが出来る。この前記発色基質の発色は、常法により発色検知ユニットで検知され、インフルエンザウイルスの検知が行えるものとなる。
〔構成〕
また、本発明のインフルエンザウイルス検知装置の特徴構成は、インフルエンザウイルスを捕集可能なエアフィルタを着脱可能なフィルタ部を備え、前記フィルタ部を介して空気を流通させるエア流通部を備えたサンプリングユニットを設け、
発色基質をシート基材に固定化した発色用シートに対し、前記エアフィルタにより捕集された捕集物を抽出液により転写する転写部を備えるとともに、前記転写部で転写された前記捕集物と発色基質との反応による発色を検出する検出部を備えた発色検知ユニットを設けた点にある。
また、本発明のインフルエンザウイルス検知装置の特徴構成は、インフルエンザウイルスを捕集可能なエアフィルタを着脱可能なフィルタ部を備え、前記フィルタ部を介して空気を流通させるエア流通部を備えたサンプリングユニットを設け、
発色基質をシート基材に固定化した発色用シートに対し、前記エアフィルタにより捕集された捕集物を抽出液により転写する転写部を備えるとともに、前記転写部で転写された前記捕集物と発色基質との反応による発色を検出する検出部を備えた発色検知ユニットを設けた点にある。
〔作用効果〕
つまり、サンプリングユニットには、インフルエンザウイルスを捕集可能なエアフィルタを着脱可能なフィルタ部を備えるから、フィルタ部にエアフィルタを装着するだけでそのエアフィルタにインフルエンザウイルスを捕集することが出来るとともに、そのエアフィルタは着脱自在であるから、インフルエンザウイルスを捕集したエアフィルタは、容易に交換除去することが出来る。尚、前記フィルタ部には、空気を流通させるエア流通部を備えるだけで、簡単に前記フィルタ部に空気を流通させることが出来るので、低濃度のインフルエンザウイルスであったとしても、捕集時間を長くとることによって、インフルエンザウイルス濃度を効率良く検出できる高濃度に濃縮することが出来るようになる。
つまり、サンプリングユニットには、インフルエンザウイルスを捕集可能なエアフィルタを着脱可能なフィルタ部を備えるから、フィルタ部にエアフィルタを装着するだけでそのエアフィルタにインフルエンザウイルスを捕集することが出来るとともに、そのエアフィルタは着脱自在であるから、インフルエンザウイルスを捕集したエアフィルタは、容易に交換除去することが出来る。尚、前記フィルタ部には、空気を流通させるエア流通部を備えるだけで、簡単に前記フィルタ部に空気を流通させることが出来るので、低濃度のインフルエンザウイルスであったとしても、捕集時間を長くとることによって、インフルエンザウイルス濃度を効率良く検出できる高濃度に濃縮することが出来るようになる。
そして、前記発色検知ユニットは、発色基質をシート基材に固定化した発色用シートに対し、前記エアフィルタにより捕集された捕集物を前記抽出液により転写する転写部を備えるから、捕集されたインフルエンザウイルスから、ノイラミニダーゼを溶離させ、転写して、前記発色用シートに供給することが出来る。その結果、前記発色用シート上では、ノイラミニダーゼと発色基質との反応を行うことが出来る。この反応により、前記発色基質は発色するからその発色を、検出部において検出することによって、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼを検出することが出来る。つまり、そのノイラミニダーゼを提供するインフルエンザウイルスを検知することができる。
したがって、居室空間内の空気をエアフィルタに通過させ、エアフィルタに抽出液を供給して転写することによって発色した発色を検出部によって検出するという一連の操作を簡便に行うことが出来、容易に居室空間内のインフルエンザウイルスを検知することが出来、インフルエンザウイルスを前培養する必要がなく簡便にインフルエンザウイルスの検出が行えるとともに継続的に使用することが出来るようになった。
〔構成〕
また、本発明のインフルエンザウイルス検知装置の別の特徴構成は、インフルエンザウイルスを捕集可能なエアフィルタを着脱可能なフィルタ部を備え、前記フィルタ部を介して空気を流通させるエア流通部を備えたサンプリングユニットを設け、
発色基質を抽出液に含有させておき、前記エアフィルタにより捕集された捕集物に、前記抽出液を供給して、得られた反応液を受ける抽出部を設け、前記抽出部における前記捕集物と発色基質との反応による発色を検出する検出部を備えた発色検知ユニットを設けた点にある。
また、本発明のインフルエンザウイルス検知装置の別の特徴構成は、インフルエンザウイルスを捕集可能なエアフィルタを着脱可能なフィルタ部を備え、前記フィルタ部を介して空気を流通させるエア流通部を備えたサンプリングユニットを設け、
発色基質を抽出液に含有させておき、前記エアフィルタにより捕集された捕集物に、前記抽出液を供給して、得られた反応液を受ける抽出部を設け、前記抽出部における前記捕集物と発色基質との反応による発色を検出する検出部を備えた発色検知ユニットを設けた点にある。
〔作用効果〕
つまり、サンプリングユニットには、インフルエンザウイルスを捕集可能なエアフィルタを着脱可能なフィルタ部を備えるから、フィルタ部にエアフィルタを装着するだけでそのエアフィルタにインフルエンザウイルスを捕集することが出来るとともに、そのエアフィルタは着脱自在であるから、インフルエンザウイルスを捕集したエアフィルタは、容易に交換除去することが出来る。尚、前記フィルタ部には、空気を流通させるエア流通部を備えるだけで、簡単に前記フィルタ部に空気を流通させることが出来るので、低濃度のインフルエンザウイルスであったとしても、捕集時間を長くとることによって、インフルエンザウイルス濃度を効率良く検出できる高濃度に濃縮することが出来るようになる。
つまり、サンプリングユニットには、インフルエンザウイルスを捕集可能なエアフィルタを着脱可能なフィルタ部を備えるから、フィルタ部にエアフィルタを装着するだけでそのエアフィルタにインフルエンザウイルスを捕集することが出来るとともに、そのエアフィルタは着脱自在であるから、インフルエンザウイルスを捕集したエアフィルタは、容易に交換除去することが出来る。尚、前記フィルタ部には、空気を流通させるエア流通部を備えるだけで、簡単に前記フィルタ部に空気を流通させることが出来るので、低濃度のインフルエンザウイルスであったとしても、捕集時間を長くとることによって、インフルエンザウイルス濃度を効率良く検出できる高濃度に濃縮することが出来るようになる。
そして、前記発色検知ユニットは、前記発色基質を前記抽出液に含有させておき、前記エアフィルタにより捕集された捕集物に、前記抽出液を供給すると、前記捕集物にインフルエンザウイルスが含まれていた場合に、そのウイルスから溶離されるノイラミニダーゼが前記発色基質と接触することになるので、他の媒体を使用することなく直接発色反応を行うことが出来る。
または、別途、基質槽を設け、基質槽より前期発色基質溶液を供給して前期捕集物と接触させると、前記捕集物にインフルエンザウイルスが含まれていた場合に、そのウイルスから溶離されるノイラミニダーゼが前期発色基質を発色させることになり、その結果、簡単な操作で前記発色基質を発色させることが出来る。
この反応により、前記発色基質は発色するからその発色を、検出部において検出することによって、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼを検出することが出来る。つまり、そのノイラミニダーゼを提供するインフルエンザウイルスを検知することができる。
または、別途、基質槽を設け、基質槽より前期発色基質溶液を供給して前期捕集物と接触させると、前記捕集物にインフルエンザウイルスが含まれていた場合に、そのウイルスから溶離されるノイラミニダーゼが前期発色基質を発色させることになり、その結果、簡単な操作で前記発色基質を発色させることが出来る。
この反応により、前記発色基質は発色するからその発色を、検出部において検出することによって、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼを検出することが出来る。つまり、そのノイラミニダーゼを提供するインフルエンザウイルスを検知することができる。
したがって、居室空間内の空気をエアフィルタに通過させ、エアフィルタに抽出液を供給して転写することによって発色した発色を検出部によって検出するという一連の操作を簡便に行うことが出来、容易に居室空間内のインフルエンザウイルスを検知することが出来、インフルエンザウイルスを前培養する必要がなく簡便にインフルエンザウイルスの検出が行えるとともに継続的に使用することが出来るようになった。
〔構成〕
また、前記インフルエンザウイルス検知装置は、前記エアフィルタが、ポリカーボネート、銀、セラミクス、からなる群より選ばれる少なくとも一種の材質からなり、前記エアフィルタを再生する再生ユニットを設けてあることが好ましい。
また、前記インフルエンザウイルス検知装置は、前記エアフィルタが、ポリカーボネート、銀、セラミクス、からなる群より選ばれる少なくとも一種の材質からなり、前記エアフィルタを再生する再生ユニットを設けてあることが好ましい。
〔作用効果〕
つまり、エアフィルタが、ポリカーボネート、銀、セラミクス、からなる群より選ばれる少なくとも一種の材質からなる場合、このフィルタは、洗浄処理、オートクレーブ、燃焼処理等によって再生することが出来る。そこで、このエアフィルタを再生する再生ユニットを設けてあると、エアフィルタは再生により再利用することが出来、くり返し利用によりインフルエンザウイルス検知装置を経済的に運転できるようになるとともに、継続的に運転を行う場合に、エアフィルタを有効利用することが出来る。
つまり、エアフィルタが、ポリカーボネート、銀、セラミクス、からなる群より選ばれる少なくとも一種の材質からなる場合、このフィルタは、洗浄処理、オートクレーブ、燃焼処理等によって再生することが出来る。そこで、このエアフィルタを再生する再生ユニットを設けてあると、エアフィルタは再生により再利用することが出来、くり返し利用によりインフルエンザウイルス検知装置を経済的に運転できるようになるとともに、継続的に運転を行う場合に、エアフィルタを有効利用することが出来る。
また、インフルエンザウイルスの付着したエアフィルタは汚染されているため、無害化して廃棄等する必要があるが、再生ユニットにより再生する際に、前記エアフィルタが無害化される構成となるので、エアフィルタの管理運用がより簡便かつ安全になる。
〔構成〕
また、前記再生ユニットが、前記エアフィルタを再生するとともに、前記検出部における発色基質の発色廃液を無害化するオートクレーブ処理または燃焼処理を行うことが好ましい。
また、前記再生ユニットが、前記エアフィルタを再生するとともに、前記検出部における発色基質の発色廃液を無害化するオートクレーブ処理または燃焼処理を行うことが好ましい。
〔作用効果〕
つまり、フィルタの再生を行う際にオートクレーブ処理または燃焼処理が選択できる場合に、その処理中にインフルエンザウイルスに汚染された前記検出部における発色基質の発色廃液を同時に処理することが出来るので、インフルエンザウイルス検知装置に導入されたインフルエンザウイルスがインフルエンザウイルス検知装置外に排出されるのを防止することが出来る。
つまり、フィルタの再生を行う際にオートクレーブ処理または燃焼処理が選択できる場合に、その処理中にインフルエンザウイルスに汚染された前記検出部における発色基質の発色廃液を同時に処理することが出来るので、インフルエンザウイルス検知装置に導入されたインフルエンザウイルスがインフルエンザウイルス検知装置外に排出されるのを防止することが出来る。
〔構成〕
また、再生ユニットを設けたインフルエンザウイルス検知装置においては、前記エアフィルタがサンプリングユニット、発色検知ユニット、再生ユニットの順に稼動する機構であって、1つのユニットでサンプリング、発色検知、および再生の動作が成されても良く、より好ましくは、動作ごとに個別ユニットを持ち、各ユニットを移動可能にする移動機構を設ける構造を取る。
また、再生ユニットを設けたインフルエンザウイルス検知装置においては、前記エアフィルタがサンプリングユニット、発色検知ユニット、再生ユニットの順に稼動する機構であって、1つのユニットでサンプリング、発色検知、および再生の動作が成されても良く、より好ましくは、動作ごとに個別ユニットを持ち、各ユニットを移動可能にする移動機構を設ける構造を取る。
〔作用効果〕
つまり、エアフィルタはインフルエンザウイルス検知の過程で、サンプリングユニット、発色検知ユニット、再生ユニットを順に移動させられるから、動作の待機時間を抑え、継続的にインフルエンザウイルスを検知することが容易になるとともに自動化も可能になり、操作ミス等による誤検知、装置外部の汚染等を極力防止するのに役立つ。
つまり、エアフィルタはインフルエンザウイルス検知の過程で、サンプリングユニット、発色検知ユニット、再生ユニットを順に移動させられるから、動作の待機時間を抑え、継続的にインフルエンザウイルスを検知することが容易になるとともに自動化も可能になり、操作ミス等による誤検知、装置外部の汚染等を極力防止するのに役立つ。
以下に、本発明のインフルエンザウイルス検知装置および方法を説明する。尚、以下に好適な実施例を記すが、これら実施例はそれぞれ、本発明をより具体的に例示するために記載されたものであって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々変更が可能であり、本発明は、以下の記載に限定されるものではない。
本発明のインフルエンザウイルス検知方法は、図１、３に示すように、
＜ａ＞インフルエンザウイルスＶをエアフィルタ１１ａにより捕集する。
＜ｂ＞前記エアフィルタ１１ａを抽出液２３ａに接触させる。
＜ｃ＞前記エアフィルタ１１ａに接触した抽出液２３ａを、ノイラミニダーゼＮＡにより分解されて発色する発色基質Ｌに反応させる。
＜ｄ＞その発色基質Ｌの発色により雰囲気中に含まれるインフルエンザウイルスＶを検知する。
の工程を順に行う。
＜ａ＞インフルエンザウイルスＶをエアフィルタ１１ａにより捕集する。
＜ｂ＞前記エアフィルタ１１ａを抽出液２３ａに接触させる。
＜ｃ＞前記エアフィルタ１１ａに接触した抽出液２３ａを、ノイラミニダーゼＮＡにより分解されて発色する発色基質Ｌに反応させる。
＜ｄ＞その発色基質Ｌの発色により雰囲気中に含まれるインフルエンザウイルスＶを検知する。
の工程を順に行う。
前記＜ａ＞の工程（工程ａと記載する。以下同様。）は、インフルエンザウイルス検知装置のサンプリングユニット１で行い、前記工程ｂ〜ｄは発色検知ユニット２において行う。
前記工程ａでは、エアフィルタ１１ａに居室空間Ｒ内の空気を流通させて、前記居室空間Ｒ内の浮遊インフルエンザウイルスＶを捕集する。図１に示すように居室空間Ｒ内のインフルエンザウイルスＶは、エアフィルタ１１ａを通過する空気の流れによりエアフィルタ１１ａに捕捉される。この空気の流通を所定時間継続して行えば、前記エアフィルタ１１ａ上には、居室空間Ｒ内に存在するインフルエンザウイルスＶが乾式で濃縮される。
前記工程ｂでは、エアフィルタ１１ａを抽出液２３ａに浸漬したり、浸潤させたりすることによってエアフィルタ１１ａの捕集された捕集物を抽出液２３ａに接触させる。すると、エアフィルタ１１ａ上のインフルエンザウイルスＶ表面からノイラミダーゼＮＡが溶離し、前記抽出液２３ａにノイラミダーゼＮＡが含まれた状態になる。
尚、インフルエンザウイルスＶは、ヘマグルチニンＨＡや、ノイラミニダーゼＮＡを有する表皮を備え、界面活剤含有水溶液等の抽出液２３ａに浸漬されると、その抽出液２３ａ中にノイラミニダーゼＮＡを容易に放出する性質を持つことが知られている（図５参照）。
前記工程ｃでは、ノイラミダーゼＮＡを含む前記抽出液２３ａを発色基質Ｌと接触させ、反応させる。このとき、前記工程２において前記エアフィルタ１１ａを、表面に発色基質Ｌをシート基材２１ｓに塗布してある発色基質シート２１ａに重ねあわせた状態で抽出液２３ａを供給していれば、少量の抽出液２３ａで即座に工程３の反応が行える。また、前記エアフィルタ１１ａが前記抽出液２３ａに溶解するものであれば、前記抽出液２３ａは、インフルエンザウイルスＶ、ノイラミニダーゼＮＡ、エアフィルタ１１ａを溶解した状態で、そのまま反応に供給される。また、前記抽出液２３ａ自体に発色基質Ｌが含まれているような場合には、抽出液２３ａをエアフィルタ１１ａに供給した時点で、別に設ける基質槽より発色基質Ｌを供給する場合は、前期ノイラミニダーゼを含む抽出液２３ａが発色基質Ｌと接触した時点で、前記ノイラミニダーゼＮＡと発色基質Ｌとの反応が行える。
また、発色基質Ｌとしては、たとえば、化１に示す４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ノイラミン酸アンモニウム（４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−α−Ｄ−ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ， Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ：４ＭＵ−ＮＡＮＡ）等のシアル酸を結合した発色団を用いることが出来、他に、５−ブロモインドキシル−４,７，−ジメトキシーＮ−アセチルノイラミン酸α―ケトシド（５−Ｂｒｏｍｏｉｎｄｏｘｙｌ−４，７−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄα−ｋｅｔｏｓｉｄｅ）等を用いられる。この発色基質Ｌは、通常、ノイラミニダーゼＮＡによりノイラミン酸部分Ｌ１と、発色生成物Ｌ２とに分解され、前記発色生成物Ｌ２が発色（蛍光物質の場合発光）することにより、発色基質Ｌの分解量がわかる。つまり、その発色基質Ｌの分解量からノイラミニダーゼＮＡの量が求められ、インフルエンザウイルスＶ量が推定される。
前記発色基質シート２１ａのシート基材２１ｓは、例えば、後述のニトロセルロース膜等を用いることが出来、例えば、４ＭＵ−ＮＡＮＡ等の発色基質ＬをノイラミニダーゼＮＡと反応可能なように固定化できるものであれば良く、ニトロセルロース膜の他にポリテトラフルオロエチレン膜、ポリビニリデンフルオライド膜、ポリエチレン膜、ポリカーボネート膜、ポリプロピレン膜等が用いられる。
前記工程ｄでは、抽出液２３ａの反応による発色（発光）を検出する。通常発色は、発色基質Ｌに対して励起光を照射するとともに、その発色基質Ｌからの発色光の強度を測定することにより確認することが出来る。この発色光の強度からインフルエンザイルスＶ濃度を知ることが出来る。
以下の実施例では、上述のインフルエンザウイルス検知方法を行うためのインフルエンザウイルス検知装置について詳述する。
〔実施例１〕
ここでは、図２に示すように、エアフィルタ１１ａとして、抽出液２３ａに溶解消失可能なものが好適に用いられる例を示す。
ここでは、図２に示すように、エアフィルタ１１ａとして、抽出液２３ａに溶解消失可能なものが好適に用いられる例を示す。
＜１−１：サンプリングユニット＞
前記サンプリングユニット１は、エアフィルタ１１ａを着脱可能なフィルタ部１１を備え、前記フィルタ部１１を介して空気を流通させるエアポンプ１２ａを有するエア流通部１２を備える。これにより、サンプリングユニット１におけるエアポンプ１２ａを駆動すると、居室空間Ｒ内の空気が前記フィルタ部１１を介して導入され、排気口１３から居室空間Ｒに戻される循環流が形成される。
前記サンプリングユニット１は、エアフィルタ１１ａを着脱可能なフィルタ部１１を備え、前記フィルタ部１１を介して空気を流通させるエアポンプ１２ａを有するエア流通部１２を備える。これにより、サンプリングユニット１におけるエアポンプ１２ａを駆動すると、居室空間Ｒ内の空気が前記フィルタ部１１を介して導入され、排気口１３から居室空間Ｒに戻される循環流が形成される。
前記エアフィルタ１１ａとしては、この実施例では、好ましくは後述のゼラチンフィルタ等の抽出液２３ａに溶解消失可能なものが好適に用いられるが、例えばニトロセルロースフィルタ、銀メンブレンフィルタ、ポリカーボネートフィルタ、セラミクスフィルタ等抽出液２３ａに溶解しないものであっても同様に用いることが出来る。これらのエアフィルタ１１ａは、インフルエンザウイルスＶを捕集するのに適した孔径を有し、居室空間Ｒ内の空気中に含まれるインフルエンザウイルスＶをろ過して捕集することが出来るものであればよい。
したがって、前記居室空間Ｒ内にインフルエンザウイルスＶが存在すると、前記インフルエンザウイルスＶがフィルタ部１１に装着されたエアフィルタ１１ａに捕集されることになる。
＜１−２：発色検知ユニット＞
前記発色検知ユニット２は、ロール状の発色基質シート２１ａを巻き戻して供給するシート供給部２１を設けるとともに、前記シート供給部２１から供給される発色基質シート２１ａに対して、前記エアフィルタ１１ａのろ過面を対向させて配置して転写する転写部２２を設け、前記転写部２２に配置されたエアフィルタ１１ａに抽出液２３ａを供給する抽出液供給部２３を設けてある。
前記発色検知ユニット２は、ロール状の発色基質シート２１ａを巻き戻して供給するシート供給部２１を設けるとともに、前記シート供給部２１から供給される発色基質シート２１ａに対して、前記エアフィルタ１１ａのろ過面を対向させて配置して転写する転写部２２を設け、前記転写部２２に配置されたエアフィルタ１１ａに抽出液２３ａを供給する抽出液供給部２３を設けてある。
これにより、前記転写部２２に、前記エアフィルタ１１ａのろ過面を発色基質シート２１ａに対向させて配置した状態で、前記抽出液供給部２３から抽出液２３ａを転写部２２に供給すると、前記転写部２２において前記エアフィルタ１１ａに収集されたインフルエンザウイルスＶからノイラミニダーゼＮＡが溶離され、前記発色基質シート２１ａ上に転写される。ここで、前記エアフィルタ１１ａが抽出液２３ａに溶解するものであれば、前記エアフィルタ１１ａは、そのまま発色基質シート２１ａに転写されて消失する。また、消失しないものであれば、前記エアフィルタ１１ａは、発色基質シート２１ａを前記転写部から搬出する際に、発色基質シート２１ａから再度分離され、除去される。
前記ノイラミニダーゼＮＡが転写されて、ノイラミニダーゼＮＡと発色基質Ｌとの反応が起きる発色基質シート２１ａは、次いで検知部２４に搬送される。検知部２４には、発色基質Ｌから生じた発色生成物Ｌ２の発色（蛍光物質の場合発光）を測定するための発光素子２４ａと、受光素子２４ｂとを備え、発色生成物Ｌ２の透過光、蛍光等を光学的に測定し、定量可能に設けてある。
前記検知部２４で光学測定の終わった発色基質シート２１ａは、インフルエンザウイルスＶに汚染されているので、抽出液２３ａの適用された範囲で切断され、廃棄される。その後、さらに発色基質シート２１ａが供給可能な状態になり、次に居室空間Ｒ内の空気を流通させたエアフィルタ１１ａを用いてインフルエンザウイルスＶの検知を行うことができる。
〔実施例２〕
ここでは、図４に示すように、エアフィルタ１１ａとして、加熱再生容易なものを用いる場合に好適な例を示す。
ここでは、図４に示すように、エアフィルタ１１ａとして、加熱再生容易なものを用いる場合に好適な例を示す。
＜２−１：サンプリングユニット＞
前記サンプリングユニット１は、実施例１のものと同様に、フィルタ部１１及びエア流通部１２を備え、エアポンプ１２ａにより、居室空間Ｒ内の空気が前記フィルタ部１１を介して導入され、排気口１３から居室空間Ｒに戻される循環流が形成される。したがって、前記居室空間Ｒ内にインフルエンザウイルスＶが存在すると、前記インフルエンザウイルスＶがフィルタ部１１に装着されたエアフィルタ１１ａに捕集されることになる。
前記サンプリングユニット１は、実施例１のものと同様に、フィルタ部１１及びエア流通部１２を備え、エアポンプ１２ａにより、居室空間Ｒ内の空気が前記フィルタ部１１を介して導入され、排気口１３から居室空間Ｒに戻される循環流が形成される。したがって、前記居室空間Ｒ内にインフルエンザウイルスＶが存在すると、前記インフルエンザウイルスＶがフィルタ部１１に装着されたエアフィルタ１１ａに捕集されることになる。
ここでは、エアフィルタ１１ａとして、銀メンブレンフィルタ、ポリカーボネートフィルタ、セラミクスフィルタ等の加熱再生可能な材質のもの、特に、セラミクスフィルタ等、燃焼再生可能なものが好適に用いられる。
また、図４に記載のサンプリングユニット１には、フィルタ搬送機構４が連設してあり、前記フィルタ搬送機構４により、前記サンプリングユニット１で居室空間Ｒ内の空気中からインフルエンザウイルスＶを収集したエアフィルタ１１ａは、後述の発色検知ユニット２に搬送される構成としてある。
＜２−２：発色検知ユニット＞
前記発色検知ユニット２は、フィルタ搬送機構４により搬送されたエアフィルタ１１ａを取り付ける抽出液供給部２３を設け、その抽出液供給部２３に取り付けたエアフィルタ１１ａに発色基質Ｌを含有する抽出液２３ａを供給して、前記エアフィルタ１１ａに捕集されたインフルエンザウイルスＶと前記抽出液２３ａとを接触させ、抽出部２５において反応液２３ｂを得ることができるように構成してある。
前記発色検知ユニット２は、フィルタ搬送機構４により搬送されたエアフィルタ１１ａを取り付ける抽出液供給部２３を設け、その抽出液供給部２３に取り付けたエアフィルタ１１ａに発色基質Ｌを含有する抽出液２３ａを供給して、前記エアフィルタ１１ａに捕集されたインフルエンザウイルスＶと前記抽出液２３ａとを接触させ、抽出部２５において反応液２３ｂを得ることができるように構成してある。
得られた反応液２３ｂは、抽出部２５に流入してさらに反応が持続される。ここでは、ノイラミニダーゼＮＡと発色基質Ｌとの反応により発色しているので、前記抽出部２５に発色基質Ｌから生じた発色生成物Ｌ２の発色（蛍光物質の場合発光）を測定するための発光素子２４ａと、受光素子２４ｂとを備え、発色生成物Ｌ２の透過光、蛍光等を光学的に測定し、定量可能に設けてある。
前記発色検知ユニット２で発色を検出した後のエアフィルタ１１ａは、前記搬送機構４により搬送され、再生ユニット３に搬送されて加熱再生される。
＜２−３：再生ユニット＞
前記再生ユニット３は、前記発色検知ユニット２から搬送されるエアフィルタ１１ａを受けて燃焼加熱滅菌可能な再生部３１および燃焼部３２を備える。燃焼部３２では、前記エアフィルタ１１ａをバーナ３２ａで加熱し、前記エアフィルタ１１ａに捕集された捕集物を燃焼消失させる。他に燃焼再生不能なエアフィルタ１１ａを用いる場合、オートクレーブにより加熱再生可能なものであれば、前記燃焼部に代えて加圧過熱可能な再生部を設けることによって、エアフィルタ１１ａの再生が可能となる。
前記再生ユニット３は、前記発色検知ユニット２から搬送されるエアフィルタ１１ａを受けて燃焼加熱滅菌可能な再生部３１および燃焼部３２を備える。燃焼部３２では、前記エアフィルタ１１ａをバーナ３２ａで加熱し、前記エアフィルタ１１ａに捕集された捕集物を燃焼消失させる。他に燃焼再生不能なエアフィルタ１１ａを用いる場合、オートクレーブにより加熱再生可能なものであれば、前記燃焼部に代えて加圧過熱可能な再生部を設けることによって、エアフィルタ１１ａの再生が可能となる。
前記エアフィルタ１１ａが再生されると、そのエアフィルタ１１ａは前記搬送機構４により、サンプリングユニット１に搬送され、再度居室空間Ｒ内の空気のサンプリングに利用される。ここでは、エアフィルタ１１ａは、３枚を１セットとして用い、前記サンプリングユニット１、前記発色検知ユニット２、前記再生ユニットが順次並行して行われるように構成してある。このような構成によると、居室空間Ｒ内のインフルエンザウイルスＶの検知を常時継続して行うことが出来る利点がある。
また、前記発色検知ユニット２で発色を測定した後の反応液２３ｂは、インフルエンザウイルスＶに汚染されているので、廃棄に際して無害化する必要があるが、前記再生ユニット３が燃焼加熱を行うものであれば、前記抽出部２５の反応液２３ｂを前記再生部３１に搬送供給する排出ポンプ４１を設けて、前記反応液２３ａを前記再生部３１において焼却処理可能に構成することによって、前記エアフィルタ１１ａの再生と同時に、前記反応液２３ｂの焼却除去も行えるという利点がある。
以下に上記インフルエンザウイルス検知装置および方法のインフルエンザウイルスＶの検知能力を検証した検証実験を以下に示す。
〔検証実験〕
＜３−１：サンプリングユニット＞
（インフルエンザウイルス捕集能力）
インフルエンザウイルスを用いた実証実験には、相当の設備が必要となり、現実的ではないので、通常の発塵実験室で用いることの出来るモデルウイルスとして、ファージφＸ１７４を散布し、サンプリングユニットに装着した各種エアフィルタにてファージφＸ１７４の回収の有無を確認してインフルエンザウイルス捕集能力を検討した。
＜３−１：サンプリングユニット＞
（インフルエンザウイルス捕集能力）
インフルエンザウイルスを用いた実証実験には、相当の設備が必要となり、現実的ではないので、通常の発塵実験室で用いることの出来るモデルウイルスとして、ファージφＸ１７４を散布し、サンプリングユニットに装着した各種エアフィルタにてファージφＸ１７４の回収の有無を確認してインフルエンザウイルス捕集能力を検討した。
＝材料等＝
○モデルウイルス
ａ．宿主大腸菌：
ＮＢＲＣ １３８９８：独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＢＲＣ）より入手
○モデルウイルス
ａ．宿主大腸菌：
ＮＢＲＣ １３８９８：独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＢＲＣ）より入手
ｂ．ファージφＸ１７４，：
ＮＢＲＣ １０３４０５：ＮＢＲＣより入手
ＮＢＲＣ １０３４０５：ＮＢＲＣより入手
ｃ．復水液７０２：
ポリペプトン ：１０ｇ
イーストエクストラクト：２ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ・７Ｈ2Ｏ ：１ｇ
上記材料に適当量の水を加えて溶解したのち、ｐＨ７．０に調製し、水を加えて１Ｌにする。これを、オートクレーブ滅菌する。
ポリペプトン ：１０ｇ
イーストエクストラクト：２ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ・７Ｈ2Ｏ ：１ｇ
上記材料に適当量の水を加えて溶解したのち、ｐＨ７．０に調製し、水を加えて１Ｌにする。これを、オートクレーブ滅菌する。
ｄ．寒天平板培地（ｍｅｄｉｕｍ ８０２）
ポリペプトン １０ｇ
イーストエクストラクト ２ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ
上記材料に適当量の水を加えて溶解したのち、ｐＨ７．０に調製し、水を加えて１Ｌにする。これにＡｇａｒ１５ｇを添加し、オートクレーブ滅菌を行ったのち、無菌的に浅型シャーレに１０ｍｌずつ分注、液がシャーレ内に均一に行き渡るようにし、固化させる。
ポリペプトン １０ｇ
イーストエクストラクト ２ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ
上記材料に適当量の水を加えて溶解したのち、ｐＨ７．０に調製し、水を加えて１Ｌにする。これにＡｇａｒ１５ｇを添加し、オートクレーブ滅菌を行ったのち、無菌的に浅型シャーレに１０ｍｌずつ分注、液がシャーレ内に均一に行き渡るようにし、固化させる。
○エアフィルタ
エアフィルタとしては、ｅ〜ｉのものを用いた。
ｅ．ゼラチンフィルタ
ザルトリウス社製，直径：９ｃｍ，ポアサイズ：３μｍ
エアフィルタとしては、ｅ〜ｉのものを用いた。
ｅ．ゼラチンフィルタ
ザルトリウス社製，直径：９ｃｍ，ポアサイズ：３μｍ
ｆ．ニトロセルロースフィルタ
ザルトリウス社製，直径：９ｃｍ，ポアサイズ：０．４５μｍ
ザルトリウス社製，直径：９ｃｍ，ポアサイズ：０．４５μｍ
ｇ．銀メンブレンフィルタ
アイシス社製，直径：４．５ｃｍ，ポアサイズ：０．１μｍ
アイシス社製，直径：４．５ｃｍ，ポアサイズ：０．１μｍ
ｈ．ポリカーボネートフィルタ
ミリポア社製，ニュークリポアー・メンブレンフィルタ，直径：４．５ｃｍ，ポアサイズ：０．１μｍ，０．０５μｍ
ミリポア社製，ニュークリポアー・メンブレンフィルタ，直径：４．５ｃｍ，ポアサイズ：０．１μｍ，０．０５μｍ
ｉ．オブラートフィルタ
市販のオブラート，直径：９ｃｍ，ポアサイズ：不明
市販のオブラート，直径：９ｃｍ，ポアサイズ：不明
ｊ．サンプリングユニット：
ＭＤ８エアポート ザルトリウス社製
ＭＤ８エアポート ザルトリウス社製
＝測定法＝
○宿主大腸菌とファージ液の調製
宿主大腸菌およびファージφＸ１７４は共に、ＮＢＲＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｂｒｃ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／）より入手した。ＮＢＲＣ添付のマニュアルに従い、宿主大腸菌のアンプルを開封し、２００μｌの復水液７０２を添加した。数分静置ののち、アンプル底部をタッピングして混和し、数μｌを複数の寒天平板培地（ｍｅｄｉｕｍ ８０２）に塗布した。また、数十μｌを、予め、培養試験管に分注した復水液７０２，４ｍｌに加えて軽く混和した。３０℃に設定したインキュベータ中に置き、平板寒天プレートは静置、培養試験管は１５０ｒｐｍで振とうし、終夜培養した。寒天平板培地、培養試験管ともに大腸菌の増殖が確認されたことから、寒天平板培地よりコロニーを単離し、フレッシュな復水液７０２を分注した培養試験管に移し、３０℃下に振とう培養を行った。十分な増殖を確認したのち、滅菌済みｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ（ＤＭＳＯ）を終濃度１０％、あるいは、２０％になるように大腸菌液に加えたのち、−８０℃下に保存した。
○宿主大腸菌とファージ液の調製
宿主大腸菌およびファージφＸ１７４は共に、ＮＢＲＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｂｒｃ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／）より入手した。ＮＢＲＣ添付のマニュアルに従い、宿主大腸菌のアンプルを開封し、２００μｌの復水液７０２を添加した。数分静置ののち、アンプル底部をタッピングして混和し、数μｌを複数の寒天平板培地（ｍｅｄｉｕｍ ８０２）に塗布した。また、数十μｌを、予め、培養試験管に分注した復水液７０２，４ｍｌに加えて軽く混和した。３０℃に設定したインキュベータ中に置き、平板寒天プレートは静置、培養試験管は１５０ｒｐｍで振とうし、終夜培養した。寒天平板培地、培養試験管ともに大腸菌の増殖が確認されたことから、寒天平板培地よりコロニーを単離し、フレッシュな復水液７０２を分注した培養試験管に移し、３０℃下に振とう培養を行った。十分な増殖を確認したのち、滅菌済みｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ（ＤＭＳＯ）を終濃度１０％、あるいは、２０％になるように大腸菌液に加えたのち、−８０℃下に保存した。
ファージφＸ１７４は宿主大腸菌と同様にアンプルを開封、２００μｌの復水液７０２を添加して数分静置した。アンプル底部をタッピングして混和したのち、５０μｌを取り、対数増殖期にあると思われる宿主大腸菌液２５０μｌに添加、タッピングにより十分混和したのち、３７℃で１５分間振とう培養（１５０ｒｐｍ）した。予め調製し、４５℃下にインキュベートしておいたソフトアガー（０．６％ｗ／ｖ溶液）７ｍｌと混和したのち、寒天平板培地に撒き、ソフトアガーが固化したのち、３７℃下、終夜培養した。ソフトアガー表面のプラーク形成を確認したのち、寒天平板培地１枚に対し復水液１０ｍｌを加えてピペッティングし、上層の液を回収した。遠心分離（３０００ｒｐｍ×１５分）後、上清を回収した（ファージ液）。この操作を複数回行うことによって、十分な感染価を持つファージ液を調製し、モデルウイルスとした。
○ファージφＸ１７４の捕集
前記モデルウイルスを使用し、容量２４ｍ3の実験空間内にモデルウイルスを散布し、各種エアフィルタによるモデルウイルス捕集実験を行った。
前記モデルウイルスを使用し、容量２４ｍ3の実験空間内にモデルウイルスを散布し、各種エアフィルタによるモデルウイルス捕集実験を行った。
宿主大腸菌に感染させコピー数を増やしたモデルウイルスの一定量（約１×１０8〜１×１０10個／ｍｌ×０．９ｍｌ）を、密閉状態にした発塵実験室内で散布（３５Ｋｇ／ｃｍ、５分間散布）する。次に、前記モデルウイルスを、各エアフィルタを装着したサンプリングユニットで捕集した（２ｍ3／ｈｒ×３０分間）。
なお、サンプリング試験を実施した際の発塵実験室内の環境は、２６〜３０℃、２０〜４０％ＲＨの範囲であった。
（エアフィルタからのインフルエンザウイルス回収）
捕集終了後に各エアフィルタを取り外し、抽出液としての復水液７０２に、溶解、あるいは洗浄によりフィルタ上に捕集された捕集物を回収した。さらに捕集物に含まれるモデルウイルスを宿主大腸菌に感染させ、一定時間経過後、モデルウイルスによるプラークの形成（プラークアッセイ）を観察した。
捕集終了後に各エアフィルタを取り外し、抽出液としての復水液７０２に、溶解、あるいは洗浄によりフィルタ上に捕集された捕集物を回収した。さらに捕集物に含まれるモデルウイルスを宿主大腸菌に感染させ、一定時間経過後、モデルウイルスによるプラークの形成（プラークアッセイ）を観察した。
○収集したモデルウイルスの定量
モデルウイルスを復水液７０２で１０倍希釈（５０μｌのファージφＸ１７４に復水液７０２を４５０μｌ加える）し、１０-1〜１０-8までの希釈系列を調整した。対数増殖期にあると思われる宿主大腸菌培養液を、培養試験管に２５０μｌずつ分注し、ついで、モデルウイルス希釈系列を５０μｌずつ添加し、タッピングして十分混和した。３７℃下に１５分間振とう培養を行った。培養後の各試験管に、４５℃下にインキュベートしておいた０．６％ソフトアガー溶液７ｍｌを加え、泡立たせないよう素早くピペッティングにより攪拌した。予め、３７℃下にインキュベートした寒天平板培地に播き込み、ソフトアガーが全面に行き渡るよう均し、室温で固化させた。３７℃に設定したインキュベータ中に静置し８時間培養後（その後４℃保存）、形成されたプラーク数を計測した。
モデルウイルスを復水液７０２で１０倍希釈（５０μｌのファージφＸ１７４に復水液７０２を４５０μｌ加える）し、１０-1〜１０-8までの希釈系列を調整した。対数増殖期にあると思われる宿主大腸菌培養液を、培養試験管に２５０μｌずつ分注し、ついで、モデルウイルス希釈系列を５０μｌずつ添加し、タッピングして十分混和した。３７℃下に１５分間振とう培養を行った。培養後の各試験管に、４５℃下にインキュベートしておいた０．６％ソフトアガー溶液７ｍｌを加え、泡立たせないよう素早くピペッティングにより攪拌した。予め、３７℃下にインキュベートした寒天平板培地に播き込み、ソフトアガーが全面に行き渡るよう均し、室温で固化させた。３７℃に設定したインキュベータ中に静置し８時間培養後（その後４℃保存）、形成されたプラーク数を計測した。
＝結果＝
モデルウイルスの回収状況について表１にまとめた。一部のエアフィルタは、使用したエアーサンプラーと規格が合わず、サンプリング操作が困難であったため、ファージ回収の有無を評価できなかったが、ゼラチンフィルタ、およびニトロセルロースフィルタについては、ファージの回収を確認する事ができた。
また、表２にファージの回収が可能であったフィルタについてその回収率をまとめた。表２より、インフルエンザウイルスと同等の大きさのモデルウイルス（コントロールファージ）が捕集されたプラークが検出されていることから、前記ゼラチンフィルタ、ニトロセルロースフィルタと同等の孔径を有する材質のものであれば、エアフィルタとして用いることができることがわかった。
モデルウイルスの回収状況について表１にまとめた。一部のエアフィルタは、使用したエアーサンプラーと規格が合わず、サンプリング操作が困難であったため、ファージ回収の有無を評価できなかったが、ゼラチンフィルタ、およびニトロセルロースフィルタについては、ファージの回収を確認する事ができた。
また、表２にファージの回収が可能であったフィルタについてその回収率をまとめた。表２より、インフルエンザウイルスと同等の大きさのモデルウイルス（コントロールファージ）が捕集されたプラークが検出されていることから、前記ゼラチンフィルタ、ニトロセルロースフィルタと同等の孔径を有する材質のものであれば、エアフィルタとして用いることができることがわかった。
＜３−２：発色検知ユニット＞
発色基質をニトロセルロース膜に固定化してシート状にしたものを作成して、発色基質シートとし、エアフィルタに捕集されたインフルエンザウイルスに基づくノイラミニダーゼをモデル化して、種々材質のエアフィルタ用材料にノイラミニダーゼを固定化したものを作製した。この固定化ノイラミニダーゼを微量の水の存在下に接触させることにより、上記実施例１，２の転写部、抽出部における反応を再現し、その光学的検出を検討した。
発色基質をニトロセルロース膜に固定化してシート状にしたものを作成して、発色基質シートとし、エアフィルタに捕集されたインフルエンザウイルスに基づくノイラミニダーゼをモデル化して、種々材質のエアフィルタ用材料にノイラミニダーゼを固定化したものを作製した。この固定化ノイラミニダーゼを微量の水の存在下に接触させることにより、上記実施例１，２の転写部、抽出部における反応を再現し、その光学的検出を検討した。
（３−２−１：発色基質とノイラミニダーゼとの反応）
まず、ノイラミニダーゼと発色基質との反応性について検討した。
まず、ノイラミニダーゼと発色基質との反応性について検討した。
＝材料等＝
ａ．発色基質：
４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−α−Ｄ−ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ， Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ（４ＭＵ−ＮＡＮＡ），ナカライテスク，ｃａｔ Ｎｏ．２３２２９−０４
（蛍光測定のための推奨波長は λｅｘ（励起光波長）：３６５ｎｍ， λｅｍ（蛍光波長）：４４５ｎｍ）
ａ．発色基質：
４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−α−Ｄ−ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ， Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ（４ＭＵ−ＮＡＮＡ），ナカライテスク，ｃａｔ Ｎｏ．２３２２９−０４
（蛍光測定のための推奨波長は λｅｘ（励起光波長）：３６５ｎｍ， λｅｍ（蛍光波長）：４４５ｎｍ）
ｂ． Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ 由来ノイラミニダーゼ：
ナカライテスク， ｃａｔ Ｎｏ．２４２２９−６１，８０Ｕ／ｍｇ ｏｒ ｍｏｒｅ
ナカライテスク， ｃａｔ Ｎｏ．２４２２９−６１，８０Ｕ／ｍｇ ｏｒ ｍｏｒｅ
ｃ．Ｉｎｆｕｌｅｎｚａ Ａ Ｈ１Ｎ１ノイラミニダーゼ：
Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ， ｃａｔ Ｎｏ．４８４−ＮＭ， ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ， ｃａｔ Ｎｏ．４８４−ＮＭ， ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｄ．ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ：
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ５ｍＭ ＣａＣｌ２， ２００ｍＭ ＮａＣｌ， ｐＨ７．５
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ５ｍＭ ＣａＣｌ２， ２００ｍＭ ＮａＣｌ， ｐＨ７．５
ｅ．ゼラチンフィルタ
ザルトリウス社製，直径：９ｃｍ，ポアサイズ：３μｍ
ザルトリウス社製，直径：９ｃｍ，ポアサイズ：３μｍ
ｆ．使用機器：
Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，蛍光プレートリーダー，Ａｃｅｎｔ ＦＬ
（λｅｘ：３５５ｎｍ， λｅｍ：４６０ｎｍ）
Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，蛍光プレートリーダー，Ａｃｅｎｔ ＦＬ
（λｅｘ：３５５ｎｍ， λｅｍ：４６０ｎｍ）
＝測定法＝
前記発色基質をＤＭＳＯにて溶解し１０ｍＭ溶液を調製する（これを基質原液とする）。基質原液をａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒにて４００μＭになるように希釈し基質溶液とする。（基質溶液中のＤＭＳＯ終濃度は４％である）これを、ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒに溶解させて５０μｌとした溶液を用意する（即ち、アッセイ系当りのＤＭＳＯ濃度は終濃度として２％である）。
前記発色基質をＤＭＳＯにて溶解し１０ｍＭ溶液を調製する（これを基質原液とする）。基質原液をａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒにて４００μＭになるように希釈し基質溶液とする。（基質溶液中のＤＭＳＯ終濃度は４％である）これを、ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒに溶解させて５０μｌとした溶液を用意する（即ち、アッセイ系当りのＤＭＳＯ濃度は終濃度として２％である）。
この溶液に、前記ノイラミニダーゼ，あるいは前記ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒを５０μｌ加えて、撹拌混合し、蛍光強度の経時変化を測定した。尚、これらの溶液は、反応開始まで氷上に静置した。
＝結果＝
検討したノイラミニダーゼ２種は、４ＭＵ−ＮＡＮＡと反応することが観察され、本アッセイ系にて酵素活性を確認する事ができた（図６、図７）。したがって、観測対象のインフルエンザウイルスの持つノイラミニダーゼと反応する発色基質を選択すると、少量のインフルエンザウイルスであっても発色基質の発色によって検知できることがわかる。この結果に基づき、以下、実験系としては、より入手容易な、 Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ由来ノイラミニダーゼを用いる。
検討したノイラミニダーゼ２種は、４ＭＵ−ＮＡＮＡと反応することが観察され、本アッセイ系にて酵素活性を確認する事ができた（図６、図７）。したがって、観測対象のインフルエンザウイルスの持つノイラミニダーゼと反応する発色基質を選択すると、少量のインフルエンザウイルスであっても発色基質の発色によって検知できることがわかる。この結果に基づき、以下、実験系としては、より入手容易な、 Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ由来ノイラミニダーゼを用いる。
（３−２−２：発色基質とエアフィルタ上のノイラミニダーゼとの反応性）
次に、エアフィルタに捕集されたインフルエンザウイルスから溶離させたノイラミニダーゼと、発色基質との反応について検討した。ゼラチンフィルタの場合、ファージ捕集後のフィルタを溶解し、その溶液をノイラミニダーゼ活性測定系に持ち込む事となるため、ゼラチンフィルタ溶解液がノイラミニダーゼ活性測定系に与える影響を検討した。
次に、エアフィルタに捕集されたインフルエンザウイルスから溶離させたノイラミニダーゼと、発色基質との反応について検討した。ゼラチンフィルタの場合、ファージ捕集後のフィルタを溶解し、その溶液をノイラミニダーゼ活性測定系に持ち込む事となるため、ゼラチンフィルタ溶解液がノイラミニダーゼ活性測定系に与える影響を検討した。
＝材料等＝
ａ．発色基質：
４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−α−Ｄ−ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ， Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ（４ＭＵ−ＮＡＮＡ），ナカライテスク，ｃａｔ Ｎｏ．２３２２９−０４
（蛍光測定のための推奨波長は λｅｘ（励起光波長）：３６５ｎｍ， λｅｍ（蛍光波長）：４４５ｎｍ）
ａ．発色基質：
４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−α−Ｄ−ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ， Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ（４ＭＵ−ＮＡＮＡ），ナカライテスク，ｃａｔ Ｎｏ．２３２２９−０４
（蛍光測定のための推奨波長は λｅｘ（励起光波長）：３６５ｎｍ， λｅｍ（蛍光波長）：４４５ｎｍ）
ｂ． Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ 由来ノイラミニダーゼ：
ナカライテスク， ｃａｔ Ｎｏ．２４２２９−６１，８０Ｕ／ｍｇ ｏｒ ｍｏｒｅ
ナカライテスク， ｃａｔ Ｎｏ．２４２２９−６１，８０Ｕ／ｍｇ ｏｒ ｍｏｒｅ
ｃ．ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ：
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ５ｍＭ ＣａＣｌ２， ２００ｍＭ ＮａＣｌ， ｐＨ７．５
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ５ｍＭ ＣａＣｌ２， ２００ｍＭ ＮａＣｌ， ｐＨ７．５
ｄ．ゼラチンフィルタ
ザルトリウス，直径：９ｃｍ，ポアサイズ：３μｍ
ザルトリウス，直径：９ｃｍ，ポアサイズ：３μｍ
ｅ．使用機器：
Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，蛍光プレートリーダー，Ａｃｅｎｔ ＦＬ
（λｅｘ：３５５ｎｍ， λｅｍ：４６０ｎｍ）
Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，蛍光プレートリーダー，Ａｃｅｎｔ ＦＬ
（λｅｘ：３５５ｎｍ， λｅｍ：４６０ｎｍ）
＝測定法＝
ゼラチンフィルタを２ｍｌの超純水（ｍｉｌｌｉＱ水）を加え、３７℃、５分静置し均一な溶液とした（ゼラチンフィルタ溶解液）。また、ノイラミニダーゼはＡ． ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ 由来ノイラミニダーゼをａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで初濃度０．０２２Ｕ／ｍｌになるように調製し、検討に用いた。
ゼラチンフィルタを２ｍｌの超純水（ｍｉｌｌｉＱ水）を加え、３７℃、５分静置し均一な溶液とした（ゼラチンフィルタ溶解液）。また、ノイラミニダーゼはＡ． ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ 由来ノイラミニダーゼをａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで初濃度０．０２２Ｕ／ｍｌになるように調製し、検討に用いた。
前記発色基質をＤＭＳＯにて溶解し１０ｍＭ溶液を調製する（これを基質原液とする）。基質原液をａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒにて８００μＭになるように希釈し基質溶液とする。（基質溶液中のＤＭＳＯ終濃度は８％である）これを、ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒに溶解させて２５μｌとした溶液を用意する（即ち、アッセイ系当りのＤＭＳＯ濃度は終濃度として２％である）。
この溶液に、前記ゼラチンフィルタ溶解液５０μｌ及び、前記ノイラミニダーゼ（０．０２２Ｕ／ｍｌ）あるいは前記ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒを２５μｌ加えて、撹拌混合し、蛍光強度の経時変化を測定した。また、ゼラチンフィルタを用いることなく、発色基質濃度をこれと同じ濃度に調製したコントロル溶液についても同様に蛍光強度の経時変化を測定した。尚、これらの溶液は、反応開始まで氷上に静置した。
＝結果＝
インフルエンザウイルス捕集能力の試験で用いたゼラチンフィルタは、１０ｍｌの培地溶液に溶解し、試験系に持ち込まれたのに対し、実際のインフルエンザウイルス検知装置では、２ｍｌの超純水に溶解させていることから、セラチンフィルター溶解液は、上記条件の約５倍濃度でノイラミニダーゼ活性測定系に混合されている。しかし、結果は図８のようになり、この場合においても、ゼラチンフィルタ溶解液（○印）と、培地のみの系（△印）を比較しても蛍光強度に大きな差はなく、ノイラミニダーゼ活性への影響はほとんど無いことがわかる。
インフルエンザウイルス捕集能力の試験で用いたゼラチンフィルタは、１０ｍｌの培地溶液に溶解し、試験系に持ち込まれたのに対し、実際のインフルエンザウイルス検知装置では、２ｍｌの超純水に溶解させていることから、セラチンフィルター溶解液は、上記条件の約５倍濃度でノイラミニダーゼ活性測定系に混合されている。しかし、結果は図８のようになり、この場合においても、ゼラチンフィルタ溶解液（○印）と、培地のみの系（△印）を比較しても蛍光強度に大きな差はなく、ノイラミニダーゼ活性への影響はほとんど無いことがわかる。
つまり、一旦フィルタ上に捕集されたインフルエンザウイルスであっても、良好に発色基質との反応が行えることがわかった。したがって、ゼラチンフィルタを用いても、前記インフルエンザウイルスの検知が行えることがわかった。
（３−２−３：発色基質シートとノイラミニダーゼとの反応性）
次に前記発色基質を、シート基材に固定した発色基質シートのノイラミニダーゼとの反応性を調べた。
次に前記発色基質を、シート基材に固定した発色基質シートのノイラミニダーゼとの反応性を調べた。
＝材料等＝
ａ．ニトロセルロース膜：
アドバンテック社製
ａ．ニトロセルロース膜：
アドバンテック社製
ｂ．ノイラミニダーゼ：
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ 由来ノイラミニダーゼ：
ナカライテスク， ｃａｔ Ｎｏ．２４２２９−６１，８０Ｕ／ｍｇ ｏｒ ｍｏｒｅ
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ 由来ノイラミニダーゼ：
ナカライテスク， ｃａｔ Ｎｏ．２４２２９−６１，８０Ｕ／ｍｇ ｏｒ ｍｏｒｅ
ｃ．発色基質：
４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−α−Ｄ−ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ， Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ（４ＭＵ−ＮＡＮＡ），ナカライテスク，ｃａｔ Ｎｏ．２３２２９−０４
４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−α−Ｄ−ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ， Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ（４ＭＵ−ＮＡＮＡ），ナカライテスク，ｃａｔ Ｎｏ．２３２２９−０４
ｃ．ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ：
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ５ｍＭ ＣａＣｌ２， ２００ｍＭ ＮａＣｌ， ｐＨ７．５
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ５ｍＭ ＣａＣｌ２， ２００ｍＭ ＮａＣｌ， ｐＨ７．５
＝発色基質シートの調製＝
前記発色基質４ＭＵ−ＮＡＮＡを１０％ＤＭＳＯ含有ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒにて、２００， ４００， ８００μＭに調製した。３．５ｃｍ角に裁断したニトロセルロース膜に対し、上記溶液１ｍｌを付着させ、遮光下、室温１〜２時間反応させ固定した。ニトロセルロース膜をａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで十分に洗浄後、３７℃，３０分間インキュベートして完全に乾燥させ、発色基質シートを得た。
前記発色基質４ＭＵ−ＮＡＮＡを１０％ＤＭＳＯ含有ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒにて、２００， ４００， ８００μＭに調製した。３．５ｃｍ角に裁断したニトロセルロース膜に対し、上記溶液１ｍｌを付着させ、遮光下、室温１〜２時間反応させ固定した。ニトロセルロース膜をａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで十分に洗浄後、３７℃，３０分間インキュベートして完全に乾燥させ、発色基質シートを得た。
＝測定法＝
前記蛍光測定器の分析面積に合わせて、上記発色基質シートを直径約１．５ｃｍの円形に切り出し、前記蛍光測定器の測定部に装着した。前記発色基質シートに、ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ、あるいは、ノイラミニダーゼ（０．０８３１Ｕ／ｍｌ），０．１ｍｌを添加して基質固定化膜を湿潤させ、ノイラミニダーゼ反応による発色基質シート上の蛍光強度の変化を測定した。
前記蛍光測定器の分析面積に合わせて、上記発色基質シートを直径約１．５ｃｍの円形に切り出し、前記蛍光測定器の測定部に装着した。前記発色基質シートに、ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ、あるいは、ノイラミニダーゼ（０．０８３１Ｕ／ｍｌ），０．１ｍｌを添加して基質固定化膜を湿潤させ、ノイラミニダーゼ反応による発色基質シート上の蛍光強度の変化を測定した。
＝結果＝
その結果、発色基質シートに対し、膜表面が濡れる程度の少量のノイラミニダーゼ溶液を添加することにより、直ちに酵素反応が開始し、ニトロセルロース膜ではノイラミニダーゼ溶液の添加と共に反応が開始される（図９）ことがわかった。
つまり、発色基質シート上の発色基質であってもノイラミニダーゼと反応して良好に発色反応を行えるため、発色基質を膜に固定しても、インフルエンザウイルス検知に用いることができることがわかった。
その結果、発色基質シートに対し、膜表面が濡れる程度の少量のノイラミニダーゼ溶液を添加することにより、直ちに酵素反応が開始し、ニトロセルロース膜ではノイラミニダーゼ溶液の添加と共に反応が開始される（図９）ことがわかった。
つまり、発色基質シート上の発色基質であってもノイラミニダーゼと反応して良好に発色反応を行えるため、発色基質を膜に固定しても、インフルエンザウイルス検知に用いることができることがわかった。
尚、ニトロセルロース膜を用いた実験結果から、固定化に用いる基質濃度は４００μＭが適当と考えられた。
（３−２−４：発色基質シートとエアフィルタ上のノイラミニダーゼとの反応性）
さらに、発色基質シートとエアフィルタ上のノイラミニダーゼ（ノイラミニダーゼ固定化膜）との反応性について調べた。この系が、本発明のインフルエンザウイルス検知方法及び装置の発色検知ユニットの構成を再現するものとなる。
さらに、発色基質シートとエアフィルタ上のノイラミニダーゼ（ノイラミニダーゼ固定化膜）との反応性について調べた。この系が、本発明のインフルエンザウイルス検知方法及び装置の発色検知ユニットの構成を再現するものとなる。
＝材料等＝
ａ．ニトロセルロース膜：
アドバンテック社製
ａ．ニトロセルロース膜：
アドバンテック社製
ｂ．ＨＦフィルタ：
イムノクロマト用Ｈｉ Ｆｌｏｗ（ＨＦ）メンブレン：
ミリポア社製
イムノクロマト用Ｈｉ Ｆｌｏｗ（ＨＦ）メンブレン：
ミリポア社製
ｃ．ノイラミニダーゼ：
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ 由来ノイラミニダーゼ：
ナカライテスク， ｃａｔ Ｎｏ．２４２２９−６１，８０Ｕ／ｍｇ ｏｒ ｍｏｒｅ
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ 由来ノイラミニダーゼ：
ナカライテスク， ｃａｔ Ｎｏ．２４２２９−６１，８０Ｕ／ｍｇ ｏｒ ｍｏｒｅ
ｄ．発色基質：
４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−α−Ｄ−ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ， Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ（４ＭＵ−ＮＡＮＡ），ナカライテスク，ｃａｔ Ｎｏ．２３２２９−０４
４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−α−Ｄ−ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ， Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ（４ＭＵ−ＮＡＮＡ），ナカライテスク，ｃａｔ Ｎｏ．２３２２９−０４
ｅ．ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ：
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ５ｍＭ ＣａＣｌ２， ２００ｍＭ ＮａＣｌ， ｐＨ７．５
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ５ｍＭ ＣａＣｌ２， ２００ｍＭ ＮａＣｌ， ｐＨ７．５
ｆ．使用機器：
Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，蛍光プレートリーダー，Ａｃｅｎｔ ＦＬ
Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，蛍光プレートリーダー，Ａｃｅｎｔ ＦＬ
＝測定法＝
（３−２−３）の＝発色基質シートの調製＝の項と同一操作にて、発色基質（４ＭＵ−ＮＡＮＡ，１０％ＤＭＳＯ含有水溶液）をＨＦメンブレンに固定化し、発色基質シートを得た。一方、ノイラミニダーゼについては、シート基材としてニトロセルロース膜を使用し、ノイラミニダーゼ（メンブレンへの作用量：０．０１１０Ｕ）をニトロセルロース膜にマウントし、室温１時間静置したのち、ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで十分に洗浄後、３７℃，３０分間インキュベートして完全に乾燥させて、ノイラミニダーゼ固定化膜を得た。それぞれ、蛍光測定器の分析面積に合わせ、直径約１．５ｃｍの円形部分を切り出し、以下の３条件にて室温下に静置させた。１０分経過後に接触させたノイラミニダーゼ固定化膜を除去し、各八色基質シート上の蛍光強度を経時的に測定した。
（３−２−３）の＝発色基質シートの調製＝の項と同一操作にて、発色基質（４ＭＵ−ＮＡＮＡ，１０％ＤＭＳＯ含有水溶液）をＨＦメンブレンに固定化し、発色基質シートを得た。一方、ノイラミニダーゼについては、シート基材としてニトロセルロース膜を使用し、ノイラミニダーゼ（メンブレンへの作用量：０．０１１０Ｕ）をニトロセルロース膜にマウントし、室温１時間静置したのち、ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで十分に洗浄後、３７℃，３０分間インキュベートして完全に乾燥させて、ノイラミニダーゼ固定化膜を得た。それぞれ、蛍光測定器の分析面積に合わせ、直径約１．５ｃｍの円形部分を切り出し、以下の３条件にて室温下に静置させた。１０分経過後に接触させたノイラミニダーゼ固定化膜を除去し、各八色基質シート上の蛍光強度を経時的に測定した。
（１）発色基質シート単独（単独）、
（２）発色基質シート＋ノイラミニダーゼ固定化膜（両者接触、基質＋酵素（水なし））、
（３）発色基質シート＋５０μｌのａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒと接触させたノイラミニダーゼ固定化膜（両者接触、基質＋酵素（水あり））
（２）発色基質シート＋ノイラミニダーゼ固定化膜（両者接触、基質＋酵素（水なし））、
（３）発色基質シート＋５０μｌのａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒと接触させたノイラミニダーゼ固定化膜（両者接触、基質＋酵素（水あり））
＝結果＝
ノイラミニダーゼ固定化膜除去後１０分経過した基質固定化膜上の蛍光強度を、図１０に示した。２０分経過後も蛍光強度に変化は見られず、反応はプラトーに達しているものと考えられた。ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで表面を湿潤されたノイラミニダーゼ固定化膜の場合（両者接触、基質＋酵素（水あり））のみ、基質固定化膜上での基質の分解による蛍光物質の生成が観察された。
ノイラミニダーゼ固定化膜除去後１０分経過した基質固定化膜上の蛍光強度を、図１０に示した。２０分経過後も蛍光強度に変化は見られず、反応はプラトーに達しているものと考えられた。ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで表面を湿潤されたノイラミニダーゼ固定化膜の場合（両者接触、基質＋酵素（水あり））のみ、基質固定化膜上での基質の分解による蛍光物質の生成が観察された。
つまり、発色基質シート上の発色基質と、一旦フィルタ上に捕集されたインフルエンザウイルスであっても前記発色基質と、前記インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼとの反応が行え、インフルエンザウイルスの検知に用いることが出来ることがわかり、本発明の構成によって、インフルエンザウイルスの検知が可能であることが確認できた。
〔別実施形態〕
先の実施の形態においては、インフルエンザウイルスとして居室空間Ｒ内の空気中に含まれるものを対象に捕集する場合を例示して説明したが、実施例３に示すように発色基質とインフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼが反応して発色する現象に基づきインフルエンザウイルスを検知するものであるから、検知対象箇所としては居室空間Ｒに限るものではない。
先の実施の形態においては、インフルエンザウイルスとして居室空間Ｒ内の空気中に含まれるものを対象に捕集する場合を例示して説明したが、実施例３に示すように発色基質とインフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼが反応して発色する現象に基づきインフルエンザウイルスを検知するものであるから、検知対象箇所としては居室空間Ｒに限るものではない。
また、発色の検出は４ＭＵ−ＮＡＮＡを用いた場合蛍光発光として測定したが、これに限らず、発色基質の物性に併せて、発色反応を検出可能な手段であれば種々汎用の手段を用いることが出来る。尚、本発明では、可視光の発色、蛍光の発色等を総称して単に発色と称するものとする。
Ｒ 居室空間
Ｖ インフルエンザウイルス
Ｌ 発色基質
Ｌ１ ノイラミン酸部分
Ｌ２ 発色生成物
ＮＡ ノイラミニダーゼ
１ サンプリングユニット
１１ フィルタ部
１１ａ エアフィルタ
１２ａ エアポンプ
１２ エア流通部
１３ 排気口
２ 発色検知ユニット
２１ シート供給部
２１ａ 発色基質シート
２１ｓ シート基材
２２ 転写部
２３ 抽出液供給部
２３ａ 抽出液
２３ｂ 反応液
２４ 検知部
２４ａ 発光素子
２４ｂ 受光素子
２５ 抽出部
３ 再生ユニット
３１ 再生部
３２ 燃焼部
３２ａ バーナ
４ フィルタ搬送機構
４１ 排出ポンプ
Ｖ インフルエンザウイルス
Ｌ 発色基質
Ｌ１ ノイラミン酸部分
Ｌ２ 発色生成物
ＮＡ ノイラミニダーゼ
１ サンプリングユニット
１１ フィルタ部
１１ａ エアフィルタ
１２ａ エアポンプ
１２ エア流通部
１３ 排気口
２ 発色検知ユニット
２１ シート供給部
２１ａ 発色基質シート
２１ｓ シート基材
２２ 転写部
２３ 抽出液供給部
２３ａ 抽出液
２３ｂ 反応液
２４ 検知部
２４ａ 発光素子
２４ｂ 受光素子
２５ 抽出部
３ 再生ユニット
３１ 再生部
３２ 燃焼部
３２ａ バーナ
４ フィルタ搬送機構
４１ 排出ポンプ
Claims (15)
- インフルエンザウイルスをエアフィルタにより捕集し、前記エアフィルタをノイラミニダーゼ抽出液に接触させ、前記エアフィルタに接触したノイラミニダーゼ抽出液を、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼにより分解されて発色するノイラミニダーゼ発色基質に反応させ、そのノイラミニダーゼ発色基質の発色により雰囲気中に含まれるインフルエンザウイルスを検知するインフルエンザウイルス検知方法。
- 前記エアフィルタが、ゼラチンからなる請求項１に記載のインフルエンザウイルス検知方法。
- 前記エアフィルタが、ニトロセルロース、ポリカーボネート、銀、セラミクスからなる群より選ばれる少なくとも一種の材質からなる請求項１に記載のインフルエンザウイルス検知方法。
- 前記ノイラミニダーゼ抽出液が界面活性剤成分を含有する請求項１〜３のいずれか１項に記載のインフルエンザウイルス検知方法。
- 前記ノイラミニダーゼ発色基質がシアル酸を結合した発色団である請求項１〜４のいずれか１項に記載のインフルエンザウイルス検知方法。
- 前記ノイラミニダーゼ発色基質をシート基材に固定化しておき、前記エアフィルタにより捕集された捕集物を前記ノイラミニダーゼ抽出液により前記シート基材に転写して前記ノイラミニダーゼ発色基質を発色させる請求項１〜５のいずれか１項に記載のインフルエンザウイルス検知方法。
- 前記ノイラミニダーゼ発色基質を前記ノイラミニダーゼ抽出液に含有させておき、前記エアフィルタにより捕集された捕集物に、前記ノイラミニダーゼ抽出液を供給して前記ノイラミニダーゼ発色基質を発色させる請求項１〜５のいずれか１項に記載のインフルエンザウイルス検知方法。
- 前記エアフィルタにより捕集された捕集物に、前記ノイラミニダーゼ抽出液を接触させて得られた抽出物に、前記ノイラミニダーゼ発色基質を供給し前記ノイラミニダーゼ発色基質を発色させる請求項１〜５のいずれか１項に記載のインフルエンザウイルス検知方法。
- インフルエンザウイルスを捕集可能なエアフィルタを着脱可能なフィルタ部を備え、前記フィルタ部を介して空気を流通させるエア流通部を備えたサンプリングユニットを設け、ノイラミニダーゼ発色基質をシート基材に固定化した発色用シートに対し、前記エアフィルタにより捕集された捕集物をノイラミニダーゼ抽出液により転写する転写部を備えるとともに、前記転写部で転写された前記捕集物とノイラミニダーゼ発色基質との反応による発色を検出する検出部を備えた発色検知ユニットを設けたインフルエンザウイルス検知装置。
- インフルエンザウイルスを捕集可能なエアフィルタを着脱可能なフィルタ部を備え、前記フィルタ部を介して空気を流通させるエア流通部を備えたサンプリングユニットを設け、ノイラミニダーゼ発色基質をノイラミニダーゼ抽出液に含有させておき、前記エアフィルタにより捕集された捕集物に、前記ノイラミニダーゼ抽出液を供給して、得られた反応液を受ける抽出部を設け、前記抽出部における前記捕集物とノイラミニダーゼ発色基質との反応による発色を検出する検出部を備えた発色検知ユニットを設けたインフルエンザウイルス検知装置。
- インフルエンザウイルスを捕集可能なエアフィルタを着脱可能なフィルタ部を備え、前記フィルタ部を介して空気を流通させるエア流通部を備えたサンプリングユニットを設け、前記エアフィルタにより捕集された捕集物に、ノイラミニダーゼ抽出液を接触させて得られた抽出物を受ける抽出部を設け、ノイラミニダーゼ発色基質を供給して、前記抽出物とノイラミニダーゼ発色基質との反応による発色を検出する検出部を備えた発色検知ユニットを設けたインフルエンザウイルス検知装置。
- 前記エアフィルタが、ポリカーボネート、銀、セラミクス、からなる群より選ばれる少なくとも一種の材質からなり、前記エアフィルタを再生する再生ユニットを設けた請求項９〜１１のいずれか１項に記載のインフルエンザウイルス検知装置。
- 前記再生ユニットが、前記エアフィルタを洗浄処理、オートクレーブ処理または燃焼処理により再生するとともに、前記検出部におけるノイラミニダーゼ発色基質の発色廃液を無害化するオートクレーブ処理または燃焼処理を行う請求項１２に記載のインフルエンザウイルス検知装置。
- 前記エアフィルタがサンプリングユニット、発色検知ユニット、再生ユニットの順に稼動する一体型ユニットである請求項１２または１３に記載のインフルエンザウイルス検知装置。
- 前記エアフィルタがサンプリングユニット、発色検知ユニット、再生ユニットの順に移動可能にする移動機構を設けてある請求項１２または１３に記載のインフルエンザウイルス検知装置。
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