JP2009537128A - インフルエンザウイルスの検出方法 - Google Patents
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Abstract
b)結合したウイルスおよび/またはウイルス粒子のノイラミニダーゼ成分を標識酵素基質と反応させ、検出可能なシグナルを発生させる;および
c)段階b)で発生したシグナルを検出する
段階を含む、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ成分を含むインフルエンザウイルスおよび/またはウイルス粒子の迅速検出の方法。
Description
a)ウイルスおよび/またはウイルス粒子を、グリコホリン、a1−酸性糖タンパク質、a2−マクログロブリン、オボムコイドのような糖タンパク質およびその組み合わせと結合しているか、またはそれとの組成物中にある天然または合成オリゴ糖から成る群から選択される少なくとも1種類の糖質受容体を含む担体と結合させるが、その糖質受容体はウイルスおよび/またはウイルス粒子のヘマグルチニン成分と結合する;
b)結合したウイルスおよび/またはウイルス粒子のノイラミニダーゼ成分を標識酵素基質と反応させ、検出可能なシグナルを発生させる;および
c)段階b)で発生したシグナルを検出する。
a)グリコホリン、a1−酸性糖タンパク質、a2−マクログロブリン、オボムコイドのような糖タンパク質およびその組み合わせと結合しているかまたはそれとの組成物中にある天然または合成オリゴ糖から成る群から選択される少なくとも1種類の糖質受容体を含む担体であって、その糖質受容体はウイルスおよび/またはウイルス粒子のヘマグルチニン成分と結合する;
b)ノイラミニダーゼ成分と反応し、それによって検出可能なシグナルを発生する標識酵素基質。
特異的糖質受容体分子の調製のための3’SLN三糖のポリアクリルアミドゲル複合体の合成
MW〜1000kDaのN−ヒドロキシスクシンイミドを用いて完全に活性化されたポリアクリル酸1.7mg(10μmol)を含むDMSO 200μlの溶液、およびジイソプロピルエチルアミン4μlを、3’SLN−O(CH2)3NH21.46mg(2μmol)を含むDMSO 200μlの溶液に加え、混合物を37℃にて48時間保持し、25%アンモニア水溶液40μlまたはエタノールアミン40μlを加え、および溶液を18時間室温に保ち、次いでセファロースLHでゲル浸透クロマトグラフィーを実施し、収率は〜90%であった。
本発明に記載の方法および試験系を用いることによる尿膜液中のインフルエンザウイルスの検出
実施例−キット:
1.試験片
2.プローブ緩衝液 緩衝液#1
3.コントラスト緩衝液 緩衝液#2
4.洗浄緩衝液A 緩衝液#3
5.洗浄緩衝液B 緩衝液#4
6.染色緩衝液 緩衝液#5
7.ダブルストリップ(8ウェル2列)または96ウェルプレート
8.ハサミまたはメス
9.ピンセット
10.試験片洗浄用プレート
11.展開バイアル
12.サーモスタット(または代用品)
13.クロマトグラフィー手順用カメラ(または試験片入り96ウェルプレートを覆うための蓋)。
試験片:ニトロセルロース、吸収体、試料パッド、米国ワットマン社(Whatman)から入手。
1.特異的試薬(フェチュイン、シグマ社(Sigma))は新鮮鶏卵から単離した。
2.緩衝液#1:3M NaClおよび0.5%ツイーン(Tween)20を含む0.2Mトリス−HCl(pH7.2)
3.緩衝液#2:0.3M NaClおよび0.05%ツイーン20を含む0.02Mトリス−HCl(pH7.2)
4.緩衝液#3:0.1M NaClおよび0.05%ツイーン20を含む0.02Mトリス−HCl(pH7.2)
5.緩衝液#4:0.1M NaClを含む0.02Mトリス−HCl(pH7.2)(TN緩衝液)
6.緩衝液#5:0.01M CaCl2を含む4mM Neu−XのTN緩衝液溶液
TN緩衝液は別の適する緩衝液、たとえばリン酸緩衝生理食塩水、または生理食塩水で代替されうる。
1.試料調製。分析直前に1/10部(v/v)の緩衝液#1をプローブへ加え、およびよく振とうする。これがプローブ#1(P#1)である。
1)均一に染色された線が観察される場合、陽性、すなわちプローブがウイルスを含むと考えられる。色強度は対照線の強度と同等となるべきである。
2)薄く染色された線が観察される場合、試料は曖昧でない検出には不十分な濃度でウイルスを含み、および緩衝液#5での試験片の発色は一夜延長すべきであるかまたは試験をもう一度繰り返してもよい。
3)着色した線が無いことは、試料中にウイルスが無いこと、またはウイルスの濃度が最小検出レベル未満であることを意味する。
4)陽性対照線に着色した線が無いことは、実験が誤って行われたか、または 対照線のNAが破壊されていることを意味する。その場合、新しい検査キットを用いて標本を再検査することが推奨される。
本発明に記載の検出系を用いるニワトリ糞便中のインフルエンザウイルスの検出
この実施例では、実施例2と同一の材料および方法を使用した。
2.ニワトリ新鮮糞便へ、1/10部(v/v)のA/duck/Alberta/76ウイルス(HAR力価1:10)を添加し、および混合物をホモジナイズした。緩衝液#2をホモジネートへ添加後(1:1v/v)、結果として生じた懸濁液の一部を採取して検定に使用した。検査ゾーンに暗青色の染色が2時間後に出現した。検査手順の開始前に表1からの試料へニワトリ糞便が添加された場合に検査結果への顕著な影響は観察されなかった。
本発明に記載の検出系を用いる死亡ニワトリの肺組織中のインフルエンザウイルスの検出
この実施例では、実施例2と同一の材料および方法を使用した。
ウイルスは脊髄性小児麻痺およびウイルス脳炎協会(Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitis)(モスクワ) およびインフルエンザ協会(Institute of Influenza)(サンクトペテルブルク)から入手した。
Claims (19)
- a)ウイルスおよび/またはウイルス粒子を、グリコホリン、a1−酸性糖タンパク質、a2−マクログロブリン、オボムコイドのような糖タンパク質およびその組み合わせと結合しているか、またはそれとの組成物中にある天然または合成オリゴ糖から成る群から選択される少なくとも1種類の糖質受容体を含む担体と結合させるが、その糖質受容体はウイルスおよび/またはウイルス粒子のヘマグルチニン成分と結合する;
b)結合したウイルスおよび/またはウイルス粒子のノイラミニダーゼ成分を標識酵素基質と反応させ、検出可能なシグナルを発生させる;および
c)段階b)で発生したシグナルを検出する
段階を含む、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ成分を含むインフルエンザウイルスおよび/またはウイルス粒子の迅速検出の方法。 - インフルエンザウイルスおよび/またはウイルス粒子がすべての既知の鳥インフルエンザ(AI)亜型を含む、請求項1に記載の方法。
- インフルエンザウイルスおよび/またはウイルス粒子が特定の一亜型、または亜型のグループを含む、請求項2に記載の方法。
- インフルエンザウイルスおよび/またはウイルス粒子が高病原性変異株を含む、請求項2に記載の方法。
- 担体がクロマトグラフィー用ペーパーまたはメンブレンである、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 糖質受容体が担体と共有結合しているかまたは担体に物理的に吸着されている、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 糖質受容体がアルファ2−3Galモチーフを含む、請求項6に記載の方法。
- ウイルスおよび/またはウイルス粒子の結合が、ウイルスおよび/またはウイルス粒子を含む試料の、担体へスポットとしての負荷(ドットブロット法)によって行われる、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
- ウイルスおよび/またはウイルス粒子の結合が、ウイルスおよび/またはウイルス粒子を含む試料を、担体に沿って浸漬すること(側方流動法)によって行われる、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
- ノイラミニダーゼ成分の標識酵素基質が、結合したウイルスおよび/またはウイルス粒子の位置に沈着する、請求項1から9のいずれかに記載の方法。
- 酵素基質が発色団で標識され、およびノイラミニダーゼとの反応が酵素基質の色変化を誘導する、請求項1から10のいずれかに記載の方法。
- 酵素基質がN−アセチルノイラミン酸の発色誘導体、特に5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−α−N−アセチルノイラミン酸である、請求項1から11のいずれかに記載の方法。
- ノイラミニダーゼとの反応が特異的蛍光シグナルを誘導する、請求項1から12のいずれかに記載の方法。
- a)グリコホリン、a1−酸性糖タンパク質、a2−マクログロブリン、オボムコイドのような糖タンパク質およびその組み合わせと結合しているかまたはそれとの組成物中にある天然または合成オリゴ糖から成る群から選択される少なくとも1種類の糖質受容体を含む担体であって、その糖質受容体はウイルスおよび/またはウイルス粒子のヘマグルチニン成分と結合する;
b)ノイラミニダーゼ成分と反応し、それによって検出可能なシグナルを発生する標識酵素基質
を含む、請求項1〜13のいずれかに記載の方法を使用する、インフルエンザウイルスおよび/またはウイルス粒子の迅速検出のための検出系。 - 担体が、試料および陽性対照を用いた検査結果を読み取るための窓があるプラスチックホルダーに封入されている、請求項14に記載の検出系。
- 担体が、試料中のウイルス含量の半定量的評価のための、少なくとも2種類の異なる量の特異的結合剤を含む、請求項14および/または15に記載の検出系。
- 担体が、異なる亜型に属するウイルスの同時検出のための、異なる亜型特異性の少なくとも2種類の特異的受容体を含む、請求項14および/または16に記載の検出系。
- 対象とされる特異性のウイルスおよび/またはウイルス粒子の存在を明らかにした後の系が、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応といった確認試験のための、試料容器および輸送ユニットとして役立つ、請求項16〜17のいずれかに記載の検出系。
- 環境試料中のスワブ、糞便および血液といった動物および/またはヒトの試料中のインフルエンザウイルスおよび/またはウイルス粒子の検出のための、および/または発生する高病原性ウイルス亜型の早期警告システムとしての、請求項14 から18のいずれかに記載の検出系の使用。
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