KR101886274B1 - 메르스 코로나 바이러스의 검출용 조성물 및 이를 포함하는 메르스 코로나바이러스 검출방법 및 키트 - Google Patents

메르스 코로나 바이러스의 검출용 조성물 및 이를 포함하는 메르스 코로나바이러스 검출방법 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 메르스 코로나 바이러스의 upE 유전자와 ORF1a 유전자 부위의 특이적인 프라이머와 프로브를 이용하여 실시간 RT-PCR방법에 의한 메르스 코로나 바이러스의 검출에 관한 것으로, 본 발명에 의한 메르스 코로나 바이러스 진단방법은 일반적인 객담 검체의 전처리 방법보다 간단하고 안전하여, 2차 감염 위험을 감소시킬 수 있고, 메르스 코로나 바이러스에만 특이적으로 반응하여 감염 여부를 신속하고 정확하게 확인할 수 있는 효과가 있으며, 검체의 핵산 추출부터 결과 분석과정을 모니터링 할 수 있어 감염의 위험 감소를 통해 검사자의 안전성을 높일 수 있다.

Description

메르스 코로나 바이러스의 검출용 조성물 및 이를 포함하는 메르스 코로나바이러스 검출방법 및 키트 {Composition for detection of MERS-CoV, detection method comprising the composition and kit thereof}
본 발명은 메르스 코로나 바이러스의 검출용 조성물 및 이를 포함하는 메르스 코로나 바이러스 검출방법 및 키트에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 메르스 코로나 바이러스 검출용 프라이머와 프로브 및 이를 이용한 메르스 코로나 바이러스검출방법 및 키트에 관한 것이다.
메르스 코로나 바이러스 (MERS-CoV)는 2012년 9월 사우디아라비아에서 급성 폐렴 및 신부전 증세를 보이는 60대 남성의 허파에서 채취된 표본을 분석하여 코로나바이러스의 변종인 플러스-센스, 외가닥 RNA의 신종 휴먼 베타코로나바이러스를 확인하였다. 초기에는 '2012년 신종 코로나바이러스', '신종 코로나바이러스'로 통용되었으며, 'SARS 유사 바이러스', '중동 사스', '사우디 사스'로도 불렸다. 2013년 5월, 국제바이러스 분류 위원회 (ICTV, International Committee on Taxonomy of Viruses) 에서는 과거 사람에게서는 발견되지 않은 이 신종 코로나바이러스를 메르스 코로나바이러스 (MERS-CoV)라 명명하였으며, 세계 보건기구에서도 이를 받아들여 메르스 (Middle East Respiratory Syndrome; MERS)를 일으키는 이 병원체를 'MERS (Middle East Respiratory Syndrome)-CoV'로 명명하였다 (Alimuddin Zumla; et.al : Middle East Respiratory Syndrome, 5; 386(9997):995.1007, 2015).
메르스는 메르스 코로나바이러스의 인체 감염에 의한 호흡기 감염증으로 발열 및 기침, 호흡곤란 등의 호흡기 증상을 동반한다. 대부분의 환자에서 중증급성하기도질환 (폐렴), 경한 급성상기도 질환을 나타내고, 일부 무증상인 경우도 있지만 심한 경우에는 패혈성 쇼크 (septic shock), 다발성 장기 부전 (multi organ dysfunction)에 의한 장기 손상을 일으켜 사망에 이르기도 하는데 특히 신부전을 동반하는 급성 심부전 동반 사례가 사스 보다 높다.
기저질환 (당뇨, 만성폐질환, 암, 신부전, 면역결핍 질환 등)이 있는 경우와 면역기능 저하자의 경우 메르스 코로나 바이러스 감염이 높을 뿐 아니라 많은 경우에 있어 중증의 급성 호흡기 질환을 일으킨다. 이 외에도 두통, 오한, 인후통, 콧물, 근육통뿐만 아니라 식욕부진, 오심, 구토, 복통, 설사 등의 증상을 나타내기도 한다. 메르스 코로나 바이러스의 잠복기는 평균 5일 (최소 2일 - 최대 14일)이며, 바이러스가 체내에 침입 후 증식기간을 거쳐 몸 밖으로 배출되는데 이때 호흡기 증상이 나타난다 (2016 메르스 대응지침 (4판), 질병관리본부).
메르스 코로나 바이러스 감염 증례에서는 백혈구 감소, 특히 림프구 감소가 있는 것으로 보고되어 왔다. PCR 검사에서 WHO는 기관지폐포세척을 통해 하기도로부터 표본을 얻거나, 객담 또는 기관지의 흡입물 채취를 권장하는데, 이는 이러한 타입의 검체가 가장 바이러스 양이 많기 때문이다. 메르스 코로나 바이러스를 빠르게 식별하기 위하여 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)검사가 주로 사용되는데 이 검사들은 upE, ORF1a, ORF1b등의 증폭을 주로 이용한다. 이 중에서도 WHO는 감도가 높은 upE를 선별분석의 타겟으로 추천하고 있다 (Laboratory testing for Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) Interim guidance Updated June 2015).
또한, PCR검사에 권장되는 타입의 검체 중 객담은 국내에서도 가장 흔하게 사용하고 있다. 일반적으로 객담 검체의 전처리 방법으로는 NALC-NaOH법이 주로 사용된다. 하지만 이러한 전처리 방법은 다수의 세척과정과 원심분리 과정이 포함되어 있어 검사 시간을 증가시키고 공기 오염을 통한 2차 감염위험을 높일 수 있다.
이에, 기존의 메르스 코로나 바이러스 진단 검사법들이 리얼타임 RT-PCR 방법에만 국한되어 있다는 단점을 극복하고, 간소화된 전처리 방법 및 교차오염이나 2차 감염의 위험성이 높은 메르스 코로나 바이러스의 핵산 추출부터 증폭까지 모두 관리할 수 있는 전체 시스템을 통해 신속, 정확, 안전한 메르스 코로나 바이러스의 검출이 필요한 실정이다.
1. Alimuddin Zumla; et.al : Middle East Respiratory Syndrome, 5; 386(9997):995.1007, 2015.
따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기한 한계점을 극복하기 위한 것으로, 메르스 코로나 바이러스의 upE 유전자와 ORF1a 유전자 부위에 특이적인 프라이머와 프로브를 이용하여 One-step Real-Time RT-PCR에 의한 검출방법을 사용하여 위음성 또는 위양성으로 판별할 가능성을 줄이고, 간소화된 전처리 방법을 통해 시간 단축과 오염을 방지할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 해결하고자 하는 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 메르스 코로나 바이러스 검출용 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 메르스 코로나 바이러스 검출용 프라이머 쌍 및 서열번호 3, 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 메르스 코로나 바이러스 검출용 프로브를 포함하는 메르스 코로나 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 메르스 코로나 바이러스 검출용 프라이머 쌍 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 메르스 코로나 바이러스 검출용 프로브를 포함하는 메르스 코로나 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기의 메르스 코로나 바이러스 검출용 키트를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 특징으로 하는 메르스 코로나 바이러스의 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 PCR 수행 전에 Dithiothreitol 50~100mM, Guanidine 2.5~5M, Tween80 5~10% 와 잔존부 Distilled water(증류수)로 구성된 전처리 조성물을 이용하여 RNA 추출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 메르스 코로나 바이러스 검출방법을 제공한다.
본 발명에 의한 메르스 코로나 바이러스 진단은 일반적인 객담 검체의 전처리 방법보다 간단하고 안전하여, 2차 감염 위험을 감소시킬 수 있고, 메르스 코로나 바이러스에만 특이적으로 반응하여 감염 여부를 신속하고 정확하게 확인할 수 있는 효과가 있으며, 검체의 핵산 추출부터 결과 분석과정을 모니터링 할 수 있어 감염의 위험 감소를 통해 검사자의 안전성을 높일 수 있다.
도 1은 일반적인 객담 전처리 방법과 본 발명에 따른 전처리 용액을 이용한 전처리 방법간의 비교를 나타낸다.
도 2는 메르스 코로나 바이러스의 특정 유전자인 upE 유전자의 추가 probe에 대한 민감도 검증 결과를 나타낸다.
도 3은 메르스 코로나 바이러스의 특정 유전자인 ORF1a 유전자의 추가 reverse primer에 대한 민감도 검증 결과를 나타낸다.
도 4는 일반적인 객담 전처리 방법과 본 발명에 따른 전처리 용액을 이용한 전처리 방법간의 PCR 효율을 비교한 결과를 나타낸다.
도 5는 일반적인 객담 전처리 방법과 본 발명에 따른 전처리 용액을 이용한 전처리 방법간의 소요 시간을 비교한 결과를 나타낸다.
도 6은 메르스 코로나 바이러스의 특정 유전자인 upE 유전자에 대한 최소 검출한계를 본 발명에 따른 전처리 과정부터 핵산 추출 및 리얼타임 RT-PCR 수행 후 통계 분석한 결과를 나타낸다.
도 7은 메르스 코로나 바이러스의 특정 유전자인 ORF1a 유전자에 대한 최소 검출한계를 본 발명에 따른 전처리 과정부터 핵산 추출 및 리얼타임 RT-PCR 수행 후 통계 분석한 결과를 나타낸다.
도 8은 메르스 코로나 바이러스의 특정 유전자인 upE 유전자에 대한 cut-off를 본 발명에 따른 전처리 과정부터 핵산 추출 및 리얼타임 RT-PCR 수행 후 통계 분석한 결과를 나타낸다.
도 9는 메르스 코로나 바이러스의 특정 유전자인 ORF1a 유전자에 대한 cut-off를 본 발명에 따른 전처리 과정부터 핵산 추출 및 리얼타임 RT-PCR 수행 후 통계 분석한 결과를 나타낸다.
도 10은 메르스 코로나 바이러스의 특정 유전자인 upE 유전자와 ORF1a 유전자에 대한 Dynamic range를 본 발명에 따른 전처리 과정부터 핵산 추출 및 리얼타임 RT-PCR 수행 후 통계 분석한 결과를 나타낸다.
도 11은 메르스 코로나 바이러스의 특정 유전자인 upE 유전자와 ORF1a 유전자에 대한 메르스 검사 자동화 전체 시스템의 실패율을 본 발명에 따른 전처리 과정부터 핵산 추출 및 리얼타임 RT-PCR 수행 후 분석 결과를 나타낸다.
본 발명에서는 종래 메르스 코로나 바이러스 검사방법 보다 신속하고 정확하게 메르스 코로나 바이러스를 검출할 수 있는 방법을 개발하고자, 객담 샘플의 전처리 과정을 간소화하고, 메르스 코로나 바이러스의 upE 유전자와 ORF1a 유전자 부위에 특이적인 프라이머와 프로브를 이용하여 One-step Real-Time RT-PCR방법을 적용하여 검출하는 방법을 개발하였다.
본 발명에서 사용되는 메르스 코로나 바이러스 검출용 키트는 일반적인 Coronavirus의 아형 (Coronavirus OC43, 229E, NL63 등)들에는 반응하지 않고, 메르스 코로나 바이러스에만 특이적으로 반응하여 감염 여부를 신속하고 정확하게 확인할 수 있다. 뿐만 아니라 메르스 코로나 바이러스검사 자동화 시스템을 적용함으로써 전처리 과정이 끝난 검체의 핵산 추출부터 결과 분석까지 모니터링 할 수 있어 감염의 위험 감소를 통해 검사자의 안전성을 높일 수 있다.
따라서 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 메르스 코로나 바이러스 검출용 프라이머 쌍, 서열번호 4 및 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 메르스 코로나 바이러스 검출용 프라이머 쌍 및 서열번호 3 또는 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 메르스 코로나 바이러스 검출용 프로브와 추가적인 분석을 통해 추가된 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 메르스 코로나 바이러스 검출용 프로브 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 메르스 코로나 바이러스 검출용 역방향 프라이머에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 메르스 코로나 바이러스 검출 방법은 다음과 같다:
1) 발열이나 기침 등의 증상을 보이는 메르스 코로나 바이러스 감염 의심 환자의 객담과 같은 호흡기 관련 검체를 전처리한 후, RNA를 추출하는 단계:
2) 1)단계의 전처리 과정은 전처리 용액 (Inactivation solution)을 검체와 동량으로 넣고 혼합하는 단계:
3) 1)단계에서 추출된 바이러스의 핵산을 서열번호 1~3, 7이 포함되어 있는 진공 건조된 키트와 서열번호 4~6, 8이 포함되어 있는 진공 건조된 키트를 이용하여 실시간 역전사 중합효소연쇄반응 (Real-Time RT-PCR)을 수행함으로써 핵산을 증폭시키는 단계:
4) 3) 단계에서 증폭되는 산물을 실시간 그래프를 통해 확인하고, 분석프로그램을 통해 메르스 코로나 바이러스의 upE 유전자에 특이적으로 반응 하는 것, 및 ORF1a 유전자에 특이적으로 반응하는 것을 확인하는 단계:
다른 관점에서 본 발명은 또한, 서열번호 1, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 메르스 코로나 바이러스 검출용 프라이머 쌍 및 서열번호 3, 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 메르스 코로나 바이러스 검출용 프로브를 포함하는 메르스 코로나 바이러스 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 키트를 사용한 검출 시의 최종 프라이머와 프로브의 농도는 각각 300nM~900nM인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응 (예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 비대칭 PCR 수행을 위한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있으며, 액상형 어레이를 이용한 융해곡선 분석을 위한 람다 엑소뉴클라아제, 다양한 버퍼 및 시약, 마이크로웰 플레이트를 포함할 수 있다.
또한, 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있으며, 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트 (compartment)로 제작될 수 있다.
또 다른 관점에서, 정방향 프라이머인 서열번호 4, 역방향 프라이머인 서열번호 5, 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 메르스 코로나 바이러스 검출용 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 메르스 코로나 바이러스 검출용 프로브를 포함하는 메르스 코로나 바이러스 검출용 키트에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 메르스 코로나 바이러스 검출용 키트를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 특징으로 하는 메르스 코로나 바이러스의 검출방법에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 PCR 수행 전에 Dithiothreitol 50~100mM, Guanidine 2.5~5M, Tween80 5~10% 와 잔존부 Distilled water(증류수)로 구성된 전처리 조성물을 이용하여 RNA 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 메르스 코로나 바이러스 검출방법에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1
1-1: 메르스 코로나 바이러스의 유전자 검출을 위한 프라이머, 프로브의 제작
메르스 코로나 바이러스는 최소 2가지 이상 특이 유전자 PCR 양성, 또는 1가지 이상의 특이 유전자 PCR 양성과 다른 유전자 염기서열의 확보의 경우에 양성으로 확진한다.
따라서 특이 유전자에 속하는 upE 유전자와 ORF1a 유전자를 타겟 부위로 선정하였다. 이 중 upE 진단 키트는 upE 유전자에 특이적으로 반응하는 서열번호 1 (upE F), 서열번호 2 (upE R)의 염기서열을 가지는 프라이머와 서열번호 3 (upE P)의 염기서열을 가지는 프로브를 선정하였다.
ORF1a 진단 키트는 ORF1a 유전자에 특이적으로 반응하는 서열번호 4 (ORF1a F) 및 서열번호 5 (ORF1a R)의 염기서열을 가지는 프라이머와 서열번호 8 (ORF1a P)의 염기서열을 가지는 프로브를 선정하였다.
상기 프라이머와 프로브는 세계보건기구 (WHO)에서 권고한 참고문헌을 바탕으로 선정되었다 (V M Corman; et.al : Detection of a novel human coronavirus by real-time reverse-transcription polymerase chain reaction, 2012;17(39)m 2012, EuroSurveill., 2012.; V M Corman; et.al: Assays for laboratory confirmation of novel human coronavirus (hCoV-EMC) infections, 2012;17(49), EuroSurveill., 2012). 또한, 추가적인 분석을 통해 한국형과 중국형 메르스 코로나 바이러스에서 생긴 변이를 포함시키기 위해 서열번호 7 (upE P2), 서열번호 6 (ORF1a R2)을 추가하였다 (표 1 및 표 2).
메르스 코로나 바이러스 (upE) 진단용 프라이머 및 프로브
유전자형 프라이머 염기서열 위치 서열번호
upE upE F 5' GCAACGCGCGATTCAGTT 3' 27458 1
upE R 5' GCCTCTACACGGGACCCATA 3' 27530 2
upE P 5'FAM CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG EBQ-3' 27477 3
upE P2 5'FAM CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTGT EBQ-3' 27477 7
메르스 코로나 바이러스 (ORF1a) 진단용 프라이머 및 프로브
유전자형 프라이머 염기서열 위치 서열번호
ORF1a ORF1a F 5' CCACTACTCCCATTTCGTCAG 3' 11107 4
ORF1a R 5' CAGTATGTGTAGTGCGCATATAAGCA 3' 11255 5
ORF1a R2 5' CAGTATGTGTAGTGCGCATATAAACA 3' 11255 6
ORF1a P 5'FAM TTGCAAATTGGCTTGCCCCCACT EBQ-3' 11230 8
1-2: 메르스 진단을 위한 키트 제작
상기 표 1 및 표 2에 기재된 메르스 코로나 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 PCR 조성물을 제조하였으며, 대한민국 등록특허 제1098764호에 개시되어 있는 진공 건조 방법을 참조하여 건조된 진단 키트를 제작하였다.
구체적으로는 감압진공건조방법을 이용하여 건조하였다. 이외에도 가온건조, 실온건조 등을 통하여 키트를 제조할 수 있다.
실시예 2: 메르스 검사 자동화 시스템의 구성
메르스 검사 자동화 시스템은 전처리 용액을 이용하여 전처리된 검체의 핵산 추출부터 결과 분석까지의 모든 과정을 포함한다. 이를 위해 유전자증폭장치 (A22520.01, 2등급)와 핵산추출기구 (A22280.02, 1등급)를 포함한 복합구성의료기기인 ExiStation을 기반으로 한다. 여기에 전처리용액인 전처리 용액 (Inactivation solution)과 유전자추출시약인 ExiPrep Dx Viral RNA Kit (K-4472, Bioneer, 한국), 그리고 메르스 진단 키트 (upE, ORF1a 진단키트)를 포함한다. 이 자동화 시스템은 ExiSatation 매니저 프로그램을 이용하여 각 단계를 조절할 수 있으며, 결과 분석까지 가능하다.
* Inactivation solution 구성 성분 및 비율
Dithiothreitol 50 ~ 100mM
Guanidine 2.5 ~ 5M
Tween 80 5 ~ 10%
Distilled water (증류수)
실시예 3: 전처리 용액 (Inactivation solution)을 이용한 객담 검체의 전처리와 핵산 추출
1) 전처리 용액 (Inactivation solution)의 사용목적
전처리 용액 (Inactivation solution)은 객담과 같은 검체의 단백질 결합을 분해시켜 점성을 제거해 줄 뿐만 아니라 lysis buffer를 포함하고 있어 검체 내에 있을 수 있는 바이러스를 불활성화 시켜 공기오염을 통한 2차 감염 위험을 줄일 수 있다.
2) 검체의 전처리
기존의 방법에서는 객담 검체를 일정농도로 희석된 NaOH 용액을 이용하여 전처리하였다. 하지만 본 발명에서는 MERS-CoV 핵산의 안정성 유지를 위해 NaOH를 대신해 전처리 용액 (Inactivation solution)을 이용하여 원심분리와 세척단계를 없애 전처리 시간의 단축을 가능하게 하였으며 (도1), 다음의 전처리 과정을 거치도록 하였다.
① 수집된 객담 검체에 전처리 용액 (Inactivation solution)을 1ml (객담과 1:1 비율) 넣어준다.
② ①을 약 30초 간 vortex하여 잘 섞어준다.
③ ②를 상온에서 15분간 방치한 후, 간단히 vortex하고 피펫으로 취하여 검사에 사용한다.
3) 핵산 추출
전처리가 끝난 검체에서 바이러스 RNA 추출은 재현성과 검출효율을 높이기 위해 핵산추출기구 (A22280.02, 1등급)에서 ExiPrep Dx Viral RNA Kit(K-4472, Bioneer, 한국)를 사용하여 추출하였다.
실시예 4: 실시간 역전사 중합효소연쇄반응 (Real-Time RT-PCR)
메르스 검사 자동화 시스템을 이용하기 때문에 핵산 추출이 끝나면 추출된 핵산이 자동으로 메르스 진단 키트에 분주된다. 메르스 진단 키트는 upE 유전자 검출용 키트와 ORF1a 유전자 검출용 키트로 구성하였다. 핵산이 분주된 키트를 유전자증폭장치 (A22520.01, 2등급)로 옮기고, 역전사 반응 후에 실시간 중합효소 연쇄반응이 진행되는 One-step RT-PCR을 수행하였다. 이 과정은 50℃에서 15분간 역전사 (Reverse Transcription)반응을 진행하고, 이것을 95℃에서 5분간 1차 반응, 95℃ 5초, 55℃ 5초를 45회 반복하여 추출된 RNA를 증폭시켰다.
* 키트 주요 구성 성분
- upE 진단 키트
역전사 효소 (reverse transcriptase)
Taq DNA 중합효소
10X 반응 완충액 (10X reaction buffer)
보관안정제 (stabilizer)
프라이머 혼합액 (서열번호 1~3, 7)
- ORF1a 진단 키트
역전사 효소 (reverse transcriptase)
Taq DNA 중합효소
10X 반응 완충액 (10X reaction buffer)
보관안정제 (stabilizer)
프라이머 혼합액 (서열번호 4~6,8)
실시예 5: 메르스 코로나 바이러스의 민감도 검증
5-1: upE 진단 키트 민감도 검증
본 발명에 따른 프라이머 혼합액 (서열번호 1~3, 7, 조건 3)의 민감도를 확인하기 위하여 upE의 기존 probe(G) (서열번호 3)와 변형 probe(T) (서열번호 7)에 대해 확보된 gene 합성 product의 농도를 이용하여 copy수를 계산한 후, 각각을 100 copies/test로 희석하였다. 이에, 상기 upE의 기존 probe(G) (서열번호 3)와 변형 probe(T) (서열번호 7)에 대한 product를 1:1로 혼합하여 50 copies/test를 사용하여 상기 실시예 4의 16번 반복적인 One-step 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응의 결과를 도 2에 나타냈다.
또한, 본 발명에 따른 프라이머 혼합액 (서열번호 1~3, 7, 조건 3)의 민감도 확인을 위한 비교예로서 서열번호 1~3의 프라이머 혼합액 (조건 1), 서열번호 1,2,7의 프라이머 혼합액 (조건 2)을 시험하여 그 결과 역시 도 2에 나타냈다.
첨부된 도 2에서 좌측은 조건 1, 중앙은 조건 2, 맨 우측은 본 발명에 따른 조건 3의 프라이머 혼합액에 의한 결과로, 각 조건은 내부표준물질 (IPC, internal positive control)을 통해 유효성을 확인하였으며, 각각의 검출율은 93.75%, 87.5%, 100%로 나타났다. 따라서 본 발명에 따른 프라이머 혼합액 (조건 3)에 의해 메르스 코로나 바이러스에 대한 민감도가 상승함을 확인하였다.
5-2: ORF1a 진단 키트 민감도 검증
ORF1a도 마찬가지로 본 발명에 따른 프라이머 혼합액 (서열번호 4~6, 8, 조건 3)의 민감도를 확인하기 위하여 ORF1a의 기존 reverse primer(C) (서열번호 5)와 변형 reverse primer(T) (서열번호 6)에 대한 product를 1:1로 혼합하여 50 copies/test로 상기 실시예 4의 16번 반복적인 One-step 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 실험을 진행하였다 (도 3).
또한, 본 발명에 따른 프라이머 혼합액 (서열번호 4~6, 8, 조건 3)의 민감도 확인을 위한 비교예로서 서열번호 4,5,8의 프라이머 혼합액 (조건 1), 서열번호 4,6,8의 프라이머 혼합액 (조건 2)을 시험하여 그 결과 역시 도 3에 나타냈다.
첨부된 도 2에서 좌측은 조건 1, 중앙은 조건 2, 맨 우측은 본 발명에 따른 조건 3의 프라이머 혼합액에 의한 결과로, 각 조건은 내부표준물질(IPC, internal positive control)을 통해 유효성을 확인하였으며, 각각의 검출율은 87.5%, 81.25%, 100%로 나타났다. 따라서 본 발명에 따른 프라이머 혼합액 (조건 3)에 의해 메르스 코로나 바이러스에 대한 민감도가 상승함을 확인하였다.
따라서 상기 보완 oligo의 적용을 통해 저역가 검체에 대한 메르스 코로나 바이러스의 민감도를 높일 수 있음을 확인 하였다.
실시예 6: 전처리용액 (Inactivation solution)사용에 따른 전처리 반응시간 및 검출 효율 비교
본원발명의 전처리 방법과 기존의 객담 전처리에 사용되는 전처리 방법과 실제로 비교해 보았을 때 결과에 어떤 영향을 주는지를 확인하였다.
일반적으로 사용되는 전처리 방법과 본원발명의 전처리 용액 (Inactivation solution)을 사용하는 전처리 방법을 비교하여, 표 3에 나타내었다.
객담 검체의 전처리 방법
NALC-NaOH법 Inactivation solution법(본 발명)
1. 검체와 동량의 NALC-NaOH를 첨가
2. Vortex로 내용물을 섞음
3. 상온에서 15분간 방치
4. >3,000 Xg에서 15~20분간 원심분리
5. 상층액을 버리고 1XPBS나 멸균 증류수로 pellet을 세척함
6. 4,5과정을 반복함
7. 세척이 완료된 pellet을 핵산 추출에 이용하거나 boiling하여 얻어진 상층액을 PCR에 이용함		 1. 검체와 동량의 Inactivation solution을 첨가
2. vortex로 내용물을 30초간 섞음
3. 상온에 15분간 방치
4. 400ul를 이용하여 핵산추출에 이용함
표 3의 방법을 비교하기 위해 음성객담에 메르스 코로나 바이러스 Panel (Purified AccuPlex MERS High Titer Stock (Seracare, Part No. 0505-0002, Lot No. 10141528) 에서 추출한 핵산을 첨가하여 두 가지 방법으로 전처리 한 후 Real-Time PCR결과를 비교하였다. 그 결과 Ct값에서는 큰 차이가 없음이 확인되었다. 이는 실질적으로 PCR 효율에는 큰 차이가 없음을 의미한다. 하지만, 본원 발명의 전처리 용액 (Inactivation solution)을 이용한 전처리에서는 NaOH 방법보다 dRn값이 더 높은 것을 볼 수 있어 효과적인 개선이 있음을 확인하였다 (도 4). 또한, 전처리 방법 시간에서도 NaOH를 이용하는 방법보다 본원 발명의 전처리 용액(Inactivation solution)을 사용하는 경우 두 배 이상 시간이 단축되는 것을 확인하였다 (도 5).
실시예 7: 분석적 성능평가
7-1: 메르스 진단 키트의 최소 검출한계 및 cut-off 설정
최소 검출한계 (limit of detection, LoD)를 측정하기 위하여 Panel (Purified AccuPlex MERS High Titer Stock (Seracare, Part No. 0505-0002, Lot No. 10141528, Viral Titer 5X105 copies/㎖)을 정량하여 이용하였다. CLSI 가이드라인의 EP-17A의 내용을 참고하였으며, 음성으로 확인된 객담을 전처리 용액 (Inactivation solution)으로 전처리한 것을 희석용액으로 사용하여 panel을 400 copies/㎖ 에서 1.65 copies/㎖ 로 희석하였다. 농도별 16~24 반복으로 준비하여 핵산 추출을 거쳐 One-step 리얼타임 RT-PCR 결과를 얻었으며, 측정된 결과값은 probit analysis를 통하여 통계 분석하여 95% 이상 검출 가능한 최소농도를 LoD로 설정하였다.
그 결과, 도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, 메르스 코로나 바이러스의 upE 진단 키트의 LoD는 56.23 copies/㎖ (95% 신뢰구간 : 25.70~123.03 copies/㎖), 메르스 코로나 바이러스의 ORF1a 진단 키트의 LoD는 79.43 copies/㎖ (95% 신뢰구간 : 37.15~169.80 copies/㎖)로 나타났다.
농도별 Panel 을 이용한 LOD 시험 결과를 이용한 cut-off를 산출했을 때, upE는 도 8에 따라 41.35Ct, ORF1a는 도 9에 따라 41.82Ct로 확인되었다.
7-2: 메르스 진단 키트의 측정범위(Dynamic range) 설정
상기 실시예 1에서 선정된 진단키트의 측정범위를 설정하고, One-step 리얼타임 RT-PCR 반응의 효율을 확인하기 위하여 Positive control RNA를 1x107 copies/㎖ ~1x101 copies/㎖의 각 농도에서 3번 반복 시험하여 PCR 결과를 도출하였다. 각 농도에서 도출되는 결과를 바탕으로 standard curve를 작성하여 linearity(R2)가 0.99이상으로 확인되는 구간을 측정범위로 설정하였다. 도 10과 같이 upE와 ORF1a 모두 linearity(R2)가 1x107 copies/㎖ ~1x101 copies/㎖ 구간에서 0.99이상임을 확인하였다.
7-3: 메르스 바이러스 진단용 프라이머, 프로브의 특이도 검증
실시예 1에서 선정된 프라이머, 프로브 세트가 검출하고자 하는 특이 유전자형의 메르스 바이러스 유전자에 대한 특이성을 나타내는지 확인하기 위해 호흡기바이러스 관련 원인 바이러스와 상재균 및 기타 균주들에 대한 교차반응성을 확인하였다. 호흡기 바이러스 25종, human total RNA와 상재균 및 기타 균주 27종을 대상으로 3번 반복 시험하여 교차반응성을 확인하였다. 사용한 호흡기 바이러스 목록은 표 4, 상재균 및 기타 균주 목록은 표 5에 표시하였으며, 시험에 사용한 핵산들과의 교차반응성은 없는 것으로 나타났다.
Figure 112017044020350-pat00001
Figure 112017044020350-pat00002
7-4: 메르스 진단의 간섭 물질 반응 시험
검체에 포함되어 있을 수 있는 다양한 물질에 대한 간섭반응 여부를 확인하기 위해 객담 검체 사용 시 영향을 줄 수 있는 간섭물질 (Blood 5%, Homoglobin 0.2%)과 호흡기 질환에 사용되는 약제의 성분 (NaCl 7.4mg/㎖, 염산키실로메타졸린 1mg/㎖, musin 1%)을 사용하고, Positive control RNA는 LoD X 3배 이하의 농도를 사용하여 각 물질별 3번의 반복 시험으로 결과를 도출하였다. Ct값에 대하여 SD와 CV를 구하고 비교한 결과 하기 표 6과 같이 6가지 간섭물질에 대하여 SD<1.0, CV<2.0% 이내로 간섭 영향이 없음을 확인하였다.
Figure 112017044020350-pat00003
7-5: 메르스 검사 자동화 전체 시스템의 실패율 시험
메르스 검사 자동화 전체 시스템의 안정성을 확인하기 위해 LOD X 3배 이하 농도의 positive control RNA를 사용하여 upE와 ORF1a 각각 94회 반복 시험을 수행하였다. 그 결과 도 11과 같이 94반복 시험에서 100% signal이 검출 되었으므로, 메르스 검사 자동화 전체 시스템의 실패율은 0%로 확인되었다.
7-6: 메르스 진단 키트의 보관안정성(가속화 시험)
메르스 진단 키트의 안정성을 확인하기 위해 Positive control RNA를 1X104 copies/test ~ 1X102 copies/test의 농도를 사용하여 시험을 수행하였다. 실제 보관온도 (-20℃이하)보다 높은 온도 (4℃)에 보관하면서 1주일 단위로 70일 이상의 결과를 확인하였다. 이때 보관 일수를 환산하는 이론은 아레니우스 식(표 7)을 참고하였다. 최장 시점에서 도출된 결과를 이용하여 SD, CV를 분석하였으며, 최장 시점에서 SD, CV 값이 기준에 부합하지 않는 경우 이전 시점까지의 결과를 이용하여 SD, CV값이 기준에 부합하는 해당 보관일까지 안정성이 확보된 것으로 판단하였다. 그 결과 표 8과 같이 3 batch, 25℃에서 10일간의 가속화 test의 결과 SD < 1.0, CV < 2.0%로 현재 -20℃에서 180일 간의 보관안정성이 확인되었다.
Figure 112017044020350-pat00004
Figure 112017044020350-pat00005
7-7: 메르스 진단 키트의 보관안정성 (실시간 시험)
실험 내, 실험 간, 실험 일 간 조건에서 실험 수행 시 도출되는 결과의 정밀도를 측정하기 위해 Positive control RNA를 1X104 copies/㎖ ~ 1X102 copies/㎖의 농도를 사용하였으며, 농도 당 2번의 반복 시험을 수행하였다. 도출된 실험결과를 이용하여 평균, SD를 분석하여 기준에 부합되는지 확인한 결과, 표 9와 같이 3 batch에 대하여 실제 보관 온도인 -20℃에서 보관한 결과 6개월까지의 보관 안정성이 확인되었다.
Figure 112017044020350-pat00006
7-8: 메르스 진단의 반복성 시험
실험 내, 실험 간, 실험 일 간 조건에서 실험 수행 시 도출되는 결과의 정밀도를 측정하기 위해 Positive control RNA를 1X104 copies/㎖ ~ 1X102 copies/㎖의 농도를 사용하였으며, 농도 당 2번의 반복 시험을 수행하였다. 도출된 실험결과를 이용하여 평균, SD를 분석하여 기준에 부합되는지 확인한 결과, 표 10과 같이 5일간의 반복성 test 결과 SD <1.0로 확인되었다.
Figure 112017044020350-pat00007
7-9: 메르스 진단의 재현성 시험
검사 장비 간, 검사자 간, batch 간 조건에서 실험 수행 시 도출되는 결과의 재현성을 측정하기 위해 Positive control RNA를 1X104 copies/㎖ ~ 1X102 copies/㎖의 농도를 사용하였으며, 농도 당 2번의 반복, 5일 간, 3명의 검사자로 시험을 수행하였다. 도출된 실험결과를 이용하여 평균, SD, CV를 분석하여 기준에 부합되는지 확인한 결과, 표 11과 같이 검사 장비 간, 검사자 간, batch 간 재현성 test 결과 SD < 1.0, CV < 2.0%로 확인되었다.
Figure 112017044020350-pat00008
실시예 8: 메르스 진단 키트의 임상적 성능 평가
식품의약품안전처의 승인이 완료된 임상시험계획서 (승인번호 제690호, 2016.08.01) 내용에 따라 충남대학교 병원과의 임상적 성능평가를 진행했다. 표 12와 같이 임상 평가에 사용된 검체 수는 양성 41건, 음성 71건으로 확진 결과와 100% 일치하는 결과를 보였으며, 임상적 민감도 100% (95% 신뢰구간: 89.33%~100%), 임상적 특이도 100% (95% 신뢰구간: 93.60%~100%)로 도출되었다.
Figure 112017044020350-pat00009
Figure 112017044020350-pat00010
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Center for Diease Control and Prevention Bioneer Corporation <120> Composition for detection of MERS-CoV, Detection method comprising the composition and kit thereof <130> GNP4331 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer upE-F <400> 1 gcaacgcgcg attcagtt 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer upE-R <400> 2 gcctctacac gggacccata 20 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe upE-P <400> 3 ctcttcacat aatcgccccg agctcg 26 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ORF1a-F <400> 4 ccactactcc catttcgtca g 21 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ORF1a-R <400> 5 cagtatgtgt agtgcgcata taagca 26 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ORF1a-R2 <400> 6 cagtatgtgt agtgcgcata taaaca 26 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe upE-P2 <400> 7 ctcttcacat aatcgccccg agctgt 26 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe ORF1a-P <400> 8 ttgcaaattg gcttgccccc act 23

Claims (6)

  1. 서열번호 1, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 메르스 코로나 바이러스 검출용 프라이머 쌍 및 서열번호 3, 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 메르스 코로나 바이러스 검출용 프로브를 포함하는 메르스 코로나 바이러스 검출용 키트.
  2. 제1항의 메르스 코로나 바이러스 검출용 키트를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 특징으로 하는 메르스 코로나 바이러스 검출방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 PCR 수행 전에 Dithiothreitol 50~100mM, Guanidine 2.5~5M, Tween80 5~10% 와 잔존부 Distilled water(증류수)로 구성된 전처리 조성물을 이용하여 RNA 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 메르스 코로나 바이러스 검출방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
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