CN111926111A - 常见五十五种呼吸道病原体高通量鉴别检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了常见五十五种呼吸道病原体高通量鉴别检测方法，检测无需确定多态性位点的碱基类别，只需通过检测该位点是否发生了单碱基延伸反应来判断检测靶标核酸的有无，从而判断样本种目标病原体的有无；具体包括以下步骤：多重PCR，单碱基延伸反应，质谱检测。本发明的有益效果是：提高了诊断效率，该方法不易交叉污染，试验操作简便，容易标准化，可同时快速检测临床标本中多种常见的呼吸道病毒核酸。通过对常见呼吸道病原体进行高通量鉴别诊断，可以辅助临床及早明确病原体，进行针对性的抗感染治疗具有重要意义。

Description

常见五十五种呼吸道病原体高通量鉴别检测方法
技术领域
本发明属于呼吸道病原体检测技术领域，尤其涉及一种常见五十五种呼吸道病原体高通量鉴别检测方法。
背景技术
呼吸道感染给人类造成了严重的疾病负担，给人类生命健康构成了极大的威胁。能够导致类呼吸道感染的病原体种类繁多。根据2018年WHO发布的统计数据表明，呼吸道感染是全球第四大死因，也是中国5岁以下儿童的第三大死因，占所有死因的19.4％，致病病原包括病毒、细菌、支原体和衣原体，其中儿童患者感染病原中，病毒占比超过70％。中国20-60％的社区获得性肺炎CAP病例无法做出病原学诊断。
常见的呼吸道病原体如副流感病毒1、2、3型，肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道和胞病毒、腺病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒。传统的检测方法为细菌类病原微生物分离培养和间接免疫荧光法检测，但这些方法检测繁琐费时，检测往往不够及时，灵敏度不够，假阳性率偏高，近些年随着分子生物学检测手段的发展和完善，使得及时、快速、准确地诊断呼吸道病原体成为可能。
继2003年SARS冠病毒在全球范围内流行之后，2019年新型冠状病毒突发，疫情四起，截止到2020年5月全世界累计发病近300万，死亡人数30多万，人们依然笼罩在疫情的阴霾之下。病原微生物检测和鉴别诊断再次被推向高潮。在国家发布新冠肺炎诊疗方案中，也重点强调了病原体的检测和鉴别诊断，明确在诊疗方案中提出″新型冠状病毒感染轻型表现需与其它病毒引起的上呼吸道感染相鉴别；新型冠状病毒肺炎主要与流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等其他已知病毒性肺炎及肺炎支原体感染鉴别，尤其是对疑似病例要尽可能采取包括快速抗原检测和多重PCR核酸检测等方法，对常见呼吸道病原体进行检测；还要与非感染性疾病，如血管炎、皮肌炎和机化性肺炎等鉴别″。
抗感染是呼吸道感染治疗的关键环节，在疾病初期、病原体尚未明确时，常采用广谱抗生素进行经验性治疗，明确病原体之后在转为针对性的抗感染治疗。从现有的治疗策略可以看出，早期明确病原体对抗生素的使用和病原体感染的治疗具有重要的指导意义。
不同种类的肺炎、不同免疫状况的人群其易感病原谱存在显著差异，不能一概而论，如病毒性肺炎多发于5岁以下的儿童，而细菌性肺炎多发于成年人，特别是老年人群更为常见；不同病原体所引起的感染症状又十分相似，常常呈现出″一病多因″的状况，对呼吸道病原体的诊断带了极大困难。
目前诊断呼吸道感染方法主要为病原体分离培养法和血清学检测法，前者通常被认为是诊断的″金标准″，但因细胞分离对培养技术的要求高、耗时长、阳性率低，不利于早期诊断；间接免疫荧光法(IFA)属于血清学检测方法中的一种，该方法方便易行，要求标本含有一定量的抗原和抗体，检测快速，但灵敏度或特异度不高，容易出现假阳性和假阴性，而且由于窗口期的存在，也无法在感染早期进行诊断。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一种常见五十五种呼吸道病原体高通量鉴别检测方法。
为实现上述目的，本发明所设计的常见五十五种呼吸道病原体高通量鉴别检测方法，检测无需确定多态性位点的碱基类别，只需通过检测该位点是否发生了单碱基延伸反应来判断检测靶标核酸的有无，从而判断样本种目标病原体的有无；具体包括以下步骤：
S1、多重PCR，根据待鉴定位点两端的侧翼序列设计引物，进行多重PCR以扩增待检测位点；
S2、应用虾碱性磷酸酶对所述步骤S1的PCR反应产物进行处理，消化剩余的脱氧核糖核苷三磷酸；
S3、单碱基延伸反应，延伸探针结合到所述步骤S1的PCR的扩增子上，令延伸的第一个碱基为需检测的多态性位点；
S4、质谱检测，通过质谱检测延伸单碱基质量以明确该多态性位点的碱基构成。
进一步，所述目标病原体包括42种常见呼吸道感染病毒、11种常见呼吸道感染细菌和2种肺炎衣原体/支原体。
进一步，所述42种常见呼吸道感染病毒包括冠状病毒和常见呼吸道感染病毒；所述冠状病毒包括人冠状病毒SARS-CoV-2、人冠状病毒229E、人冠状病毒OC43、人冠状病毒NL63、人冠状病毒HKU1、严重急性呼吸综合征冠状病毒SARSr-CoV、中东呼吸综合征冠状病毒MERSr-CoV。
进一步，所述常见呼吸道感染细菌包括嗜肺军团菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌、百日咳鲍特菌、白喉棒状杆菌。
进一步，所述人冠状病毒SARS-CoY-2的所述延伸探针序列为ACCTACAACTTGTGCTAATGACCC，靶标基因为ORFlab。
进一步，所述人冠状病毒SARS-CoV-2的所述延伸探针序列为ACACCATCATTAAATGGTAGGACA，靶标基因为S。
进一步，所述人冠状病毒SARS-CoV-2的所述延伸探针序列为ACGCGTACGCGCAAACAG，靶标基因为N。
进一步，所述中东呼吸综合征冠状病毒MERSr-CoV的所述延伸探针序列为cccttattCTCCTTCAACTTTTGGGACG，靶标基因为N。
进一步，所述肺炎衣原体的所述延伸探针序列为CTGCAGCACCTTCCCATAT；靶标基因为ompA。
进一步，所述肺炎支原体的所述延伸探针序列为TGGCAACCTCACCTGGTTCGGGC；靶标基因为P1adhensiongene。
本发明的有益效果是：基于MassARRAY核酸质谱分析系统作为检测平台，利用多重PCR与基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)技术联用来鉴定目标病原体，具有检测通量大，低成本，检测结果快等特点；提高了诊断效率，该方法不易交叉污染，试验操作简便，容易标准化，可同时快速检测临床标本中多种常见的呼吸道病毒核酸。通过对常见呼吸道病原体进行高通量鉴别诊断，可以辅助临床及早明确病原体，进行针对性的抗感染治疗具有重要意义。
附图说明
图1为本方法采用的MassARRAY核酸质谱基因分析系统的检测原理图。
图2为本方法7种人冠状病毒病原体及靶标基因列表图。
图3为本方法常见呼吸道感染病毒病原体及靶标基因列表图。
图4为本方法常见呼吸道感染细菌病原体及靶标基因列表图。
图5为本方法常见肺炎衣原体/支原体及靶标基因列表图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
如图1～5所示，本实施例的常见五十五种呼吸道病原体高通量鉴别检测方法，检测无需确定多态性位点的碱基类别，只需通过检测该位点是否发生了单碱基延伸反应来判断检测靶标核酸的有无，从而判断样本种目标病原体的有无；
本方法采用MassARRAY核酸质谱基因分析系统作为检测平台，该系统的核心构件为一台桌面台式质谱仪，其独特之处在于可以鉴定短链核苷酸序列的分子量，配合芯片点样仪可以实现大样本量的快速上样。如图1为本方法采用的MassARRAY核酸质谱基因分析系统的检测原理图。
本方法通过获得55种病原体靶标基因的保守序列，并且设计多重PCR引物，实现同时对55种病原体检测。首先对55种病原体按核酸类型进行分类，共包括29种DNA病原体和26种RNA病原体，分别将29种DNA病原体设计在一个多重PCR反应体系里，将26种RNA病原体设计在另一个多重PCR反应体系里。
具体包括以下步骤：
S1、多重PCR，根据待鉴定位点两端的侧翼序列设计引物，进行多重PCR以扩增待检测位点；
S2、应用虾碱性磷酸酶对步骤S1的PCR反应产物进行处理，消化剩余的脱氧核糖核苷三磷酸；
S3、单碱基延伸反应，延伸探针结合到步骤S1的PCR的扩增子上，令延伸的第一个碱基为需检测的多态性位点；
S4、质谱检测，通过质谱检测延伸单碱基质量以明确该多态性位点的碱基构成。
目标病原体包括42种常见呼吸道感染病毒、11种常见呼吸道感染细菌和2种肺炎衣原体/支原体。42种常见呼吸道感染病毒包括常见呼吸道感染病毒和7种人冠状病毒；7种人冠状病毒包括人冠状病毒SARS-CoV-2、人冠状病毒229E、人冠状病毒OC43、人冠状病毒NL63、人冠状病毒HKU1、严重急性呼吸综合征冠状病毒SARSr-CoV、中东呼吸综合征冠状病毒MERSr-CoV。
所述常见呼吸道感染细菌包括嗜肺军团菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌、百日咳鲍特菌、白喉棒状杆菌。所述人冠状病毒SARS-CoV-2的所述延伸探针序列为ACCTACAACTTGTGCTAATGACCC，靶标基因为ORFlab。所述人冠状病毒SARS-CoV-2的所述延伸探针序列为ACACCATCATTAAATGGTAGGACA，靶标基因为S。所述人冠状病毒SARS-CoV-2的所述延伸探针序列为ACGCGTACGCGCAAACAG，靶标基因为N。所述中东呼吸综合征冠状病毒MERSr-CoV的所述延伸探针序列为cccttattCTCCTTCAACTTTTGGGACG，靶标基因为N。所述肺炎衣原体的所述延伸探针序列为CTGCAGCACCTTCCCATAT；靶标基因为ompA。所述肺炎支原体的所述延伸探针序列为TGGCAACCTCACCTGGTTCGGGC；靶标基因为P1adhensiongene。
在本发明的方法中，可以采用不同已知浓度的一个或多个内部定量标准核酸。在本发明的其中一个方面，采用不同已知浓度的多个内部定量标准核酸。在本发明的其中另一个方面，采用不同已知浓度的一个内部定量标准核酸，不同浓度的所述核酸具有不同的标记。
在本发明的方法中，将所述多个内部定量标准核酸的第二阶段扩增反应在不同反应容器内进行。这些反应容器中分别加入对应与各个所述具有不同已知浓度的一个或多个内部定量标准核酸的第二重扩增用的引物对，所述方法中还包括根据每个所述定量标准核酸的第二扩增子的指定定量标准Ct生成标准曲线，以对靶核酸的第二扩增子进行定量分析。
在本示例性方法中，使用不同的人工合成的核酸模板(例如在序列和/或长度上不同)来用作多重PCR的定量标准模板。不同的人工合成的核酸模板采用不同的稀释系列。优选的，用作定量标准的所述人工合成的核酸在特定扩增条件下具有相似的扩增效率，并在多重设置中的每个给定稀释浓度产生相同或相似的Ct值。
在本发明的方法中，用于扩增同一个工作曲线的几个定量人工合成标准物的第二重扩增用的引物对中，其中一个序列相同，即共同引物，而另一个引物具有特异性的序列，即特异性引物。而且这几个定量人工合成标准物的第一重扩增用的引物对相同。
在本发明的其中一个方面，本发明的方法中的人工合成模板复合内标工作曲线是直线。直线工作曲线的特征包括斜率和当测试物为零时的截距。
鉴于在检查靶生物体时，该生物体的扩增可能具有与内标不同的扩增特征，在本发明方法的其中一个方面，可以使用反应特异性校正因子来调整系统分析的偏差，以提高对未知浓度的靶生物体的计算浓度的准确度。例如，当标准定量曲线是直线时，可以以斜率为校正因子：校正斜率可以用于校正扩增效率。有例如，可以以截距为校正因子：校正截距可以用于校正导致目标Ct延迟的非最佳PCR条件导致的截距变化。在本发明的其中一个方面，可以同时以斜率和截距为校正因子。在本发明采用的巢式PCR中，在第二重PCR观察到的不同扩增特征可能是来源于第一重PCR效率的不同。因此，第二重PCR中观察到的截距的差异可能是第一重PCR反应的结果。在这种情况下，校正因子可以根据期望的量化精确度设置为一个常数。
在一种示例性PCR反应中，PCR循环设置：
95℃，2分钟，1个循环；
95℃，10秒，然后56℃，30秒，10个循环；
95℃，10秒，然后64℃，30秒，30个循环。
进行双重巢式PCR的引物对和探针序列进行设计和测试，获得特异性扩增目标微生物的引物。部分微生物的扩增引物对来自可商购的产品。在储存器加入上述致病微生物或相关抗药基因的第一阶段PCR反应混合物，其中包括针对每个靶核酸的扩增引物对，每个引物对包括对应的特异性上游外引物和下游外引物。同时，在储存器加入复合内标和复合内标的第一阶段PCR扩增引物对。在另一反应器中的3个分别加入3个复合内标的第二阶段PCR扩增引物对。根据MassARRAY核酸质谱基因分析系统提供的标准操作程序对前述样本进行检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，同样也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种常见五十五种呼吸道病原体高通量鉴别检测方法，其特征在于：检测无需确定多态性位点的碱基类别，只需通过检测该位点是否发生了单碱基延伸反应来判断检测靶标核酸的有无，从而判断样本种目标病原体的有无；具体包括以下步骤：
S1、多重PCR，根据待鉴定位点两端的侧翼序列设计引物，进行多重PCR以扩增待检测位点；
S2、应用虾碱性磷酸酶对所述步骤S1的PCR反应产物进行处理，消化剩余的脱氧核糖核苷三磷酸；
S3、单碱基延伸反应，延伸探针结合到所述步骤S1的PCR的扩增子上，令延伸的第一个碱基为需检测的多态性位点；
S4、质谱检测，通过质谱检测延伸单碱基质量以明确该多态性位点的碱基构成。
2.根据权利要求1所述的常见五十五种呼吸道病原体高通量鉴别检测方法，其特征在于：所述目标病原体包括42种常见呼吸道感染病毒、11种常见呼吸道感染细菌和2种肺炎衣原体/支原体。
3.根据权利要求2所述的常见五十五种呼吸道病原体高通量鉴别检测方法，其特征在于：所述42种常见呼吸道感染病毒包括冠状病毒和常见呼吸道感染病毒；所述冠状病毒包括人冠状病毒SARS-CoV-2、人冠状病毒229E、人冠状病毒OC43、人冠状病毒NL63、人冠状病毒HKU1、严重急性呼吸综合征冠状病毒SARSr-CoV、中东呼吸综合征冠状病毒MERSr-CoV。
4.根据权利要求2所述的常见五十五种呼吸道病原体高通量鉴别检测方法，其特征在于：所述常见呼吸道感染细菌包括嗜肺军团菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌、百日咳鲍特菌、白喉棒状杆菌。
5.根据权利要求3所述的常见五十五种呼吸道病原体高通量鉴别检测方法，其特征在于：所述人冠状病毒SARS-CoY-2的所述延伸探针序列为ACCTACAACTTGTGCTAATGACCC，靶标基因为ORFlab。
6.根据权利要求3所述的常见五十五种呼吸道病原体高通量鉴别检测方法，其特征在于：所述人冠状病毒SARS-CoV-2的所述延伸探针序列为ACACCATCATTAAATGGTAGGACA，靶标基因为S。
7.根据权利要求3所述的常见五十五种呼吸道病原体高通量鉴别检测方法，其特征在于：所述人冠状病毒SARS-CoV-2的所述延伸探针序列为ACGCGTACGCGCAAACAG，靶标基因为N。
8.根据权利要求3所述的常见五十五种呼吸道病原体高通量鉴别检测方法，其特征在于：所述中东呼吸综合征冠状病毒MERSr-CoV的所述延伸探针序列为cccttattCTCCTTCAACTTTTGGGACG，靶标基因为N。
9.根据权利要求2所述的常见五十五种呼吸道病原体高通量鉴别检测方法，其特征在于：所述肺炎衣原体的所述延伸探针序列为CTGCAGCACCTTCCCATAT；靶标基因为ompA。
10.根据权利要求2所述的常见五十五种呼吸道病原体高通量鉴别检测方法，其特征在于：所述肺炎支原体的所述延伸探针序列为TGGCAACCTCACCTGGTTCGGGC；靶标基因为P1adhenSion gene。
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