WO2024062131A1 - Mehrstufiges pcr-testverfahren sowie pcr-testsystem - Google Patents

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WO2024062131A1
WO2024062131A1 PCT/EP2023/076312 EP2023076312W WO2024062131A1 WO 2024062131 A1 WO2024062131 A1 WO 2024062131A1 EP 2023076312 W EP2023076312 W EP 2023076312W WO 2024062131 A1 WO2024062131 A1 WO 2024062131A1
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pcr test
stage
sample
amplification
main
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PCT/EP2023/076312
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Margarita ASTRUC HOFFMANN
Kerstin Bohmann
Gregor GROSS-CZILWIK
Mark Keller
Daniel Mark
Susanne PROCKSCH
Frank Schwemmer
Oliver Strohmeier
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Dermagnostix GmbH
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
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    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
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    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples

Definitions

  • PCR stands for the English term “polymerase chain reaction”, which in turn describes a reaction for the reproduction of a nucleic acid, in particular for the reproduction of genes or gene sequences that are present in the form of nucleic acid sequences. This reaction is often used to detect pathogens in a sample (more precisely, to test a sample for the presence of a pathogen). A so-called “real-time” PCR is often used for such detection.
  • This real-time PCR is also referred to as real-time PCR, quantitative PCR or qPCR, because a result is determined (“measured”) directly during the reaction process – i.e. in real time.
  • a result is determined (“measured”) directly during the reaction process – i.e. in real time.
  • the nucleic acid is multiplied, i.e. amplified, during PCR, which is why a generic term for the method is also “nucleic acid amplification technique” (NAT).
  • NAT nucleic acid amplification technique
  • nucleic acids There are basically two types of nucleic acids, namely deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA).
  • the human genome (genetic material) and that of microorganisms consist of DNA molecules, while the genetic material of many viruses is present as RNA.
  • PCR can be used to check whether bacterial or viral genes are present in a sample by amplifying them and thereby making them measurable.
  • Various reaction components ensure that only the ( ⁇ fs2012 ⁇ gsi-software ⁇ winpat5 ⁇ document ⁇ amt ⁇ 3857866.docx) last saved: September 22, 2023 FDST Patentanülte, Nuremberg Page 2
  • the gene sequences to be examined (this is usually referred to as a “target sequence”) are amplified, which is why the PCR method is extremely specific.
  • the million-fold duplication itself results in very good sensitivity, as even negligible amounts can be detected.
  • RNA is present in the sample, it is first converted enzymatically into DNA.
  • the DNA double strand is then separated in repeated heating and cooling cycles so that specific primers can bind to the target sequence.
  • the primers are the starting signal for the heat-stable enzyme DNA polymerase, which adds the target sequence back to the double strand.
  • the amplification is therefore exponential.
  • specific probes ie special molecules
  • Ct the concentration of the amplified target sequence
  • the abbreviation “Ct” stands for “Cycle threshold”.
  • the Ct value indicates the number of replication cycles from which so much DNA is present (replicated) that the fluorescence of the probes becomes measurable.
  • the Ct value correlates with the amount of nucleic acid originally used in the PCR test procedure. The higher the initial concentration of the target sequence being sought, the fewer cycles are required until the fluorescence increases.
  • multi-stage (usually two-stage) PCR test procedures (“nested PCR”, “two-step PCR”, etc.) are also carried out, in which an additional PCR step, namely a so-called pre-amplification or pre-amplification, takes place.
  • an additional PCR step namely a so-called pre-amplification or pre-amplification, takes place.
  • the target sequences are pre-amplified with a certain number of heating and cooling cycles.
  • this multiplication is not yet measured.
  • An initial concentration is therefore already used in the subsequent main amplification, which is already (usually significantly) increased compared to the amount originally present in the sample.
  • the advantage of this method is that even smaller amounts of pathogens can be detected, which can increase the sensitivity of the tests.
  • a special feature inherent in the method is that, due to the higher initial concentration, fewer cycles are required in the main amplification compared to a conventional (single-stage) PCR test procedure until the presence of the target sequence is confirmed by the increase in fluorescence ( ⁇ fs2012 ⁇ gsi- software ⁇ winpat5 ⁇ document ⁇ amt ⁇ 3857866.docx) last saved: September 22, 2023 FDST Patentanülte, Nuremberg page 4 becomes measurable. For this reason, the Ct value determined using two-stage PCR testing procedures is lower than the Ct value determined using a standard laboratory PCR. This can lead to a misjudgment of the infectivity of an infected person, so that they may not yet be released from isolation or the like.
  • the invention is based on the object of improving a PCR test method.
  • This task is solved according to the invention by a multi-stage PCR test method with the features of claim 1.
  • this task is solved according to the invention by a PCR test system with the features of claim 9.
  • Advantageous and partly inventive embodiments and further developments of the invention are set out in the subclaims and the following description.
  • the PCR test method according to the invention is a multi-stage PCR test method, which is also referred to, for example, as nested PCR.
  • a sample with an initial concentration of gene sequences is provided and at least part of the sample is fed to a pre-amplification stage.
  • At least one gene target sequence is subjected to a (preferably predetermined) number of preamplification cycles.
  • this part of the sample (specifically at least a part of it), in particular by means of a dilution medium, is diluted by a dilution factor to an intermediate sample amount.
  • at least a portion of the (undiluted) sample quantity originating from the pre-amplification or this intermediate sample quantity (formed by the dilution) is then fed to a main amplification stage as the main sample quantity.
  • the gene target sequence is then ( ⁇ fs2012 ⁇ gsi-software ⁇ winpat5 ⁇ document ⁇ amt ⁇ 3857866.docx) last saved: September 22, 2023 FDST Patentanülte, Nuremberg Page 5 subjected to several main amplification cycles. Furthermore, as part of the main amplification stage, the achievement of a comparison measure for a concentration threshold value is monitored by an actual concentration of the gene target sequence in the main sample quantity, while recording the number of main amplification cycles completed when this comparison measure is reached. In other words, the number of main amplification cycles completed is counted until the actual concentration of the gene target sequence reaches the concentration threshold value.
  • a correction factor can be determined which is characteristic of a difference between the number of main amplification cycles completed and the number of amplification cycles of a one-stage PCR test method.
  • the correction factor determined in this way preferably in advance, ie on the basis of the information mentioned above, in particular for a specific sample carrier or a specific, predetermined test sequence of the PCR test method - is provided.
  • the correction factor is determined and, in particular, made available for a subsequent step.
  • the sample is, for example, a swab, in particular taken using a type of swab, a body fluid taken elsewhere, and the like. This is provided in particular by means of the above-mentioned sample carrier.
  • the sample is introduced into this sample carrier, which in particular has a microfluidic channel and chamber structure.
  • sample carrier is also referred to as a “cartridge”.
  • the sample is prepared, for example by means of a lysis of ( ⁇ fs2012 ⁇ gsi-software ⁇ winpat5 ⁇ document ⁇ amt ⁇ 3857866.docx) last storage: September 22nd 2023 FDST Patentan5.lte, Nuremberg Page 6 Nucleic acid from the sample, optionally an enzymatic transcription of RNA into DNA or the like.
  • the comparison measure for the concentration threshold is in particular a threshold value of a fluorescence that is observed in the main sample quantity.
  • the fluorescence of the main sample quantity is observed by means of a corresponding, in particular light-sensitive, sensor, which fluoresces due to specific probes that couple to the gene target sequence and fluoresce in the coupled state (if necessary under illumination with a light of a predetermined wavelength). , sets.
  • the fluorescence threshold is therefore a qualitative criterion for reaching the concentration threshold.
  • the correction factor described above advantageously promotes comparability between the single-stage (“standard”) PCR test method and the multi-stage PCR test method. Comparatively complex parallel comparison tests to empirically determine a comparison value between single-stage and multi-stage PCR test procedures can therefore be avoided.
  • the value for the comparison variable for the total number of amplification cycles for comparison with the one-stage PCR test method is also determined based on the number of main amplification cycles completed and the correction factor .
  • the correction factor is determined in particular under the assumption that the same value as that present in the main amplification stage when the comparison value of the concentration threshold is reached ( ⁇ fs2012 ⁇ gsi-software ⁇ winpat5 ⁇ document ⁇ amt ⁇ 3857866.docx) last saved: September 22, 2023 FDST Patentanülte, Nuremberg Page 7 Actual concentration also leads to the achievement of a corresponding comparison measure for the concentration threshold in the one-stage PCR test procedure.
  • the correction factor in particular the Ct comparison value
  • the number of preamplification cycles and preferably also the dilution factor are taken into account.
  • the absolute value of the Ct shift is determined in particular from the difference between the Ct value of the standard PCR test method and the Ct value adjusted by the preamplification stage.
  • nha ⁇ ⁇ (1 + ⁇ ⁇ ) ⁇ (2)
  • the Ct value of the standard -PCR test procedure corresponds to the xstandard number of amplification cycles and results from: ( ⁇ fs2012 ⁇ gsi-software ⁇ winpat5 ⁇ document ⁇ amt ⁇ 3857866.docx) last saved: September 22, 2023 FDST Patentanülte, Nuremberg page 8
  • a preamplification concentration that is present after completion of the preamplification stage is preferably also determined - at least theoretically - as: Where npa stands for the preamplification concentration, Epa for the amplification efficiency of the preamplification stage and xpa for
  • the preamplification and main amplification cycles cannot simply be added up. Instead, there is an intermediate concentration nz of the gene target sequence, with which the main amplification stage starts:
  • formula (5) is adjusted accordingly and/or the dilution factor d is used for simplification with the value “1”.
  • the simplification according to formulas (10) and (11) is preferably not carried out.
  • differences between the respective amplification efficiencies are particularly important.
  • the procedure described above is particularly advantageous and simple if the correction factor is specified, ie stored, as an offset for a test procedure (particularly specified for a specific gene target sequence) and/or for a specific sample carrier.
  • the correction factor for this test procedure or sample carrier (for a specific sample carrier is required due to the additives it contains, for example reaction building blocks in the form of nucleic acid building blocks, enzymes, probes and the like), specifically for a specific model or type of sample carrier, specific test procedure specified in order to lead to a reliable result) can therefore only be determined once and can then be called up again and again for the use of this sample carrier.
  • the PCR test system according to the invention has a PCR test device and a number of microfluidic sample carriers (in particular of the type mentioned above).
  • the PCR test device includes a receiving device for at least one of the microfluidic sample carriers, a heating device for supplying heat to the sample carrier at least locally on a partial area (optionally also on the entire surface) of the sample carrier, and a control device that is set up for this purpose is to control the heating device for cyclical heating of the partial area of the sample carrier.
  • the PCR test device includes a reading device for, preferably automatically, reading the ( ⁇ fs2012 ⁇ gsi-software ⁇ winpat5 ⁇ document ⁇ amt ⁇ 3857866.docx) last saved: September 22, 2023 FDST Patentanmaschinelte, Nuremberg Page 11 specific sample carrier related process information.
  • the PCT test device has an input device by means of which the process information described above can be entered, in particular manually.
  • the control device is also set up to automatically carry out a multi-stage PCR test procedure, in particular the multi-stage PCR test procedure described above.
  • the control unit is set up to use the read process information to determine the correction factor described above, which is characteristic of the difference between the number of main amplification cycles completed and the number of amplification cycles of the one-stage standard PCR test method.
  • a table or the like is stored in a memory of the control unit from which the correction factor can be read based on the process information.
  • the correction factor is part of the process information and is therefore read from it by the control device.
  • control device is preferably set up to use the number of main amplification cycles completed and the correction factor to determine a value for the comparison variable described above for the total number of amplification cycles for comparison with the one-stage PCR test method.
  • the heating device can also be set up for active cooling in order to enable the heated area of the sample carrier to cool down as quickly as possible.
  • the sample carrier in particular has a plurality of process chambers and channels that are at least partially connected to one another to form a line system or network, the dimensions of which (in particular transverse to the basic line course) are in the range of a few micrometers to a few hundred micrometers.
  • the sample carrier is optionally designed in such a way that a sample liquid can be guided, in particular “pumped,” through the line network and in particular into the respective process chambers by means of rotation and/or temperature effects.
  • the sample carrier can also be intended and set up for a PCR test method without rotation.
  • Process chambers optionally contain reaction building blocks, for example nucleic acid building blocks, enzymes, probes and the like.
  • the control device is in particular set up to feed the sample described above (at least part of it) to a lysis step, for example, and then to introduce it into the pre-amplification stage, in particular into a process chamber provided for this purpose.
  • the control device then controls the PCR test device in such a way that part of the sample from the preamplification stage is diluted (e.g. introduced into a chamber in which a dilution medium is kept).
  • the control device then controls the PCR test device in such a way that part of the sample from the pre-amplification stage or part of the intermediate sample quantity is fed to the main amplification stage (as the main sample quantity).
  • the PCR test device preferably also includes a sensor system, in particular a light-sensitive sensor, by means of which it is observed during the main amplification cycles whether the actual concentration of the gene target sequence reaches the comparison measure for the concentration threshold value.
  • a sensor system in particular a light-sensitive sensor
  • the formulas (8) to (11) described above, but at least (9), (10) and/or (11) are stored in the control unit.
  • the PCR test device according to the invention therefore shares the process features described above in the context of the PCR test method and thus also their advantages.
  • the PCR test device enables both the PCR test to be carried out automatically and also to output a Ct comparison value suitable for comparisons, without laboratory staff having to spend more time adapting the result to known assessment measures, in particular the standard Ct value. Value, would have to deal with.
  • control device also: “controller”
  • the control device is formed at least in the core by a microcontroller with a processor and a data memory in which the functionality for carrying out the inventive ( ⁇ fs2012 ⁇ gsi-software ⁇ winpat5 ⁇ document ⁇ amt ⁇ 3857866.docx) last saved: September 22, 2023 FDST Patentanülte, Nuremberg Page 13 PCR test procedure is implemented programmatically in the form of operating software (firmware), so that the procedure - if necessary in interaction with laboratory personnel - is carried out automatically when the operating software is executed in the microcontroller.
  • control device can alternatively also be formed by a non-programmable electronic component, for example an ASIC, in which the functionality for carrying out the test method according to the invention is implemented using circuit technology means.
  • the process information contains at least one value for the dilution factor and/or the respective amplification efficiency of the preliminary and main amplification stages.
  • the dilution factor indicates in particular the extent to which a portion of the sample held in the sample carrier is diluted to the intermediate sample quantity after the preamplification stage.
  • the value of the respective amplification efficiency indicates in particular what percentage of the current concentration of the gene target sequence is multiplied in an amplification cycle.
  • the process information also contains the correction factor (determined in advance for a specific test sequence in accordance with the above statements).
  • the process information indicates the number of preamplification cycles (preferably in addition to the correction factor).
  • the process information is stored in a machine-readable coded form on the respective sample carrier.
  • the process information is preferably firmly connected to the sample carrier.
  • the process information is encoded in an optoelectronically readable code, in particular a 1D or 2D code (in particular a bar or matrix code, for example a data matrix code), applied to a surface of the sample carrier , for example printed on them or applied using a sticker.
  • the reading device of the PCR test device is preferably through a corresponding ( ⁇ fs2012 ⁇ gsi-software ⁇ winpat5 ⁇ document ⁇ amt ⁇ 3857866.docx) last storage: September 22, 2023 FDST Patentanülte, Nuremberg Page 14 trained optical scanning unit, for example a laser scanner or an image sensor.
  • the process information is stored in a chip designed according to the RFID standard and attached to the sample carrier.
  • the reading device is designed by an appropriately designed (RFID) transceiver.
  • the process information is stored on a chip or module set up for so-called near-field communication (“NFC”) and is thus transmitted to a corresponding NFC transceiver (which forms the reading device) using known NFC standards.
  • NFC near-field communication
  • the reading device is optionally arranged in a housing of the PCR test device, the latter having a type of automatic feeder for the sample carrier as a receiving device, which is comparable to a CD feeder in a vehicle CD player.
  • the reading device is installed in such a way that it can read the process information while the sample carrier is “pulled in”. In principle, it is also conceivable that the reading device is positioned on the outside, so that laboratory personnel have to manually “present” the specific sample carrier to the reading device.
  • the process information contains the number of preamplification cycles, this preferably forms a type of specification.
  • the control device is expediently set up to carry out the multi-stage PCR test procedure depending on this specification for the number of preamplification cycles.
  • the control device is preferably set up to carry out the test procedure (ie the PCR test method) based on the process information.
  • the process information “only” contains the type of sample carrier or test and the control device is set up to display parameters for the corresponding test sequence ( ⁇ fs2012 ⁇ gsi-software ⁇ winpat5 ⁇ document ⁇ amt ⁇ 3857866.docx) last saved: 22 September 2023 FDST Patentanülte, Nuremberg page 15 (e.g. the number of preamplification cycles as well as temperature values for the preamplification and main amplification stages - and preferably also the assigned correction factor) from the assigned memory.
  • Fig.1 in a schematic, partially transparent side view of a test system for carrying out PCR test procedures
  • Fig.2 in a schematic top view of a sample carrier of the test system
  • Fig.3 in a schematic flow diagram of a PCR test procedure.
  • Corresponding parts and sizes are always provided with the same reference numbers in all figures.
  • a PCR test system (short: “System 1”) is shown schematically in Fig.1.
  • the system 1 serves to prepare a PCR test method shown in more detail in FIG a sample, loading the sample carrier 4 with the sample and transferring the sample carrier 4 to the device 2).
  • the device 2 includes a housing 6, which delimits a (device) interior 8.
  • a heating device 10 is arranged in the interior 8, by means of which at least a part ( ⁇ fs2012 ⁇ gsi-software ⁇ winpat5 ⁇ document ⁇ amt ⁇ 3857866.docx) is heated during the PCR test procedure as described in more detail below.
  • the device 2 and the sample carrier 4 are set up to carry out the PCR test method on a rotation basis. This means that the corresponding sample carrier 4 is rotated at a variable speed during the PCR test procedure. This allows, for example, sample liquid to be pumped in a targeted manner.
  • the device 2 also includes a rotary drive 12, which acts on a turntable 14, on which the sample carrier 4 is mounted when used as intended.
  • the sample carrier 4 is introduced by means of a type of feeder 16 (comparable to a CD player), which is inserted into the housing 6.
  • the turntable 14 and the feeder 16 form a receiving device for the sample carrier 4.
  • the sample carrier 4 has a number of microfluidic channels 20 and chambers 22.
  • the sample carrier 4 has (merely by way of example and not exhaustive) a sample chamber 24, into which the sample taken from a test object or subject is introduced (e.g. inserted into a “swab” in the sample chamber 24).
  • a buffer liquid (not shown) is stored in the sample chamber 24, in which the material of the sample (which comes from a mucous membrane swab, for example) is intended to be distributed and optionally dissolved.
  • a lysis chamber 26 Downstream of the sample chamber 24 is a lysis chamber 26, in which the sample material dissolved in the buffer liquid is lysed (e.g. cell walls broken, etc.).
  • a pre-amplification chamber 28 is located downstream on the sample carrier 4 shown here. Downstream of this is a dilution chamber 30 and several main amplification chambers 32. A dilution liquid is located upstream in the dilution chamber 30.
  • An optoelectronically readable code 34 (shown here as an example as a bar code) is also arranged on the sample carrier 4, for example printed directly or, in the present exemplary embodiment, stuck on using a sticker. Code 34 provides process information relating to the PCR test procedure to be carried out using the specific sample carrier 4.
  • process information contains at least one value of a dilution factor d, by which the sample quantity forwarded from the preamplification chamber 28 is diluted.
  • the device 2 now includes a control device 40, which is set up to carry out the PCR test method described in more detail with reference to FIG. 3, specifically to control the rotary drive 12 and the heating device 10.
  • the device 2 has a user interface 42, which is coupled to the control device 40 and is used at least to output information about the PCR test carried out and optionally also to enter device settings.
  • the device 2 For automatically reading in the process information represented by the code 34, the device 2 also has a reading device, here specifically a barcode scanner 44. This is arranged in the interior 8 in such a way that the code 34 can be read when the sample carrier 4 is pulled in.
  • the process information can also contain other information in addition to the dilution factor d. These are e.g. B.
  • a sample carrier 4 is set up for a multi-stage PCR test method as in the present exemplary embodiment; a number xpa of amplification cycles to be carried out in a preamplification stage PA carried out in the preamplification chamber 28; an amplification efficiency EPA for the preamplification stage PA; an amplification efficiency Eha for a main amplification stage HA carried out in the main amplification chambers 32 and the like.
  • Fig. 3 shows a sequence of the PCR test procedure carried out with the device 2 and one of the sample carriers 4.
  • a sample carrier 4 specific for a desired examination specifically for detection of a specific pathogen
  • a swab with a swab of mucous membrane is introduced into the sample chamber 24.
  • the sample carrier 4 is then transferred to the device 2 through the feeder 16.
  • ( ⁇ fs2012 ⁇ gsi-software ⁇ winpat5 ⁇ document ⁇ amt ⁇ 3857866.docx) last saved: September 22, 2023 FDST Patentan5.lte, Nuremberg Page 18
  • the device 2 specifically its control device 40, reads out the code 34 in a second process step S2 using the barcode scanner 44 and temporarily stores the process information recorded.
  • the control device 40 displays at least part of the process information on the user interface 42.
  • the control device 40 starts the actual PCR test method.
  • the control unit 40 controls the rotary drive 12 and the heating device 10.
  • the heating device 10 and the rotary drive 12 are controlled in such a way that the sample can mix with the buffer liquid held in the sample chamber 24.
  • the control device 40 controls the rotary drive 12 in such a way that a predetermined (partial) amount of the sample liquid formed in the sample chamber 24 is transferred to the lysis chamber 26. There, cell walls are broken down to reveal genetic material.
  • the sample liquid is then transferred (in particular by means of speed control) into the preamplification chamber 28, if necessary via a filter stage (not shown).
  • Gene components, enzymes, specific brands and the like are added to the sample liquid so that only a specific gene sequence (“gene target sequence”; if it is present) is reproduced during cyclical heating and cooling.
  • a number of amplification cycles (heating and cooling cycles) corresponding to the number xpa are carried out. If the gene target sequence is present in the sample, its concentration is now increased compared to a starting or initial concentration.
  • part of the sample liquid is “pumped” from the preamplification chamber 28 into a dilution chamber 30 and diluted there with the dilution liquid by a factor d to form an “intermediate sample amount”. It is recognized that the concentration of the gene target sequence present after the preamplification stage is reduced.
  • a predetermined subset of this intermediate sample amount is transferred into the main amplification chambers 32 as the respective main sample amount.
  • a main amplification stage HA is carried out.
  • the respective main sample quantity is again heated and cooled cycles ( ⁇ fs2012 ⁇ gsi-software ⁇ winpat5 ⁇ document ⁇ amt ⁇ 3857866.docx) last saved: September 22, 2023 FDST Patentanülte, Nuremberg Page 19 in order to multiply the gene target sequence.
  • fluorescent “probes” ie building blocks that couple to the gene target sequence and carry a fluorescent substance or can couple with it in the state coupled to the gene target sequence) are now added to the sample liquid.
  • the device 2 has an optical sensor 46, which is coupled to the control device 40 and is set up to observe the main amplification chambers 32.
  • the control unit 40 uses the optical sensor 46 to monitor whether a fluorescence limit value has been reached. This forms a comparison measure for a concentration limit value of the actual concentration of the gene target sequence. If the fluorescence limit value is reached, the control device 40 registers the number xha of amplification cycles carried out.
  • the control device 40 calculates a correction value or correction factor xshift based on the above formula (9) and the process information transferred using the code 34, which indicates the amount by which the number xha of amplification cycles in the main amplification stage HA compared to the number using a single-stage PCR test procedure leading to the same actual concentration amplification cycles is shifted.
  • This number of the one-stage PCR test procedure is usually also referred to as the Ct value.
  • the control device 40 From the correction factor xshift and the number xha of (main) amplification cycles, the control device 40 also calculates a corrected Ct value xkorr for the multi-stage PCR test method carried out by adding the correction factor xshift to the number xha of (main) amplification cycles becomes.
  • the corrected Ct value xkorr serves as a reference value for comparison with the one-stage PCR test method.
  • the corrected Ct value xkorr and optionally also the correction factor xshift are displayed as the result of the PCR test procedure via the user interface 42.
  • the amplification efficiency Epa and Eha is assumed to be 100%. This simplifies formula (9) to formula (11).
  • the correction factor xshift is determined in advance and stored in a memory of the control device 40 or transferred to it with the process information.
  • the control device 40 uses the correction factor xshift as a predetermined offset, which, as described above, results in the corrected Ct value xkorr with the number xha of (main) amplification cycles.
  • the process information can only contain the correction factor xshift and the number xpa of preamplification cycles to be carried out.
  • the process information only contains the type of sample carrier 4.
  • the memory of the control device 40 contains - for example in the form of a lookup table - the correction factor xshift determined in advance for this type of sample carrier 4 and the An to be carried out - number xpa of pre-amplification cycles deposited. The control device 40 then uses this stored information to carry out the PCR test procedure accordingly.
  • the sample carrier 4 and also the device 4 can be set up to carry out the PCR test method without rotation support.
  • the channels 20 and chambers 22 are arranged differently, optionally separated with controllable (e.g. magnetic) valves.
  • controllable e.g. magnetic
  • the pre-amplification and main amplification cycles are only carried out by temperature control, or heating and (active) cooling or just heating and allowing to cool.

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Abstract

Ein erfindungsgemäßes PCR-Testsystem (1) weist ein PCR-Testgerät (2) und eine Anzahl von mikrofluidischen Probenträgern (4) auf. Das PCR-Testgerät (2) umfasst eine Aufnahmevorrichtung für wenigstens einen mikrofluidischen Probenträger (4), eine Heizvorrichtung (10) zur wenigstens lokal auf einen Teilbereich des Probenträgers (4) gerichteten Wärmezufuhr auf den Probenträger (4), ein Steuergerät (40), das dazu eingerichtet ist, die Heizvorrichtung (10) zur zyklischen Erwärmung des Teilbereichs des Probenträgers (4) anzusteuern, und eine Einlesevorrichtung (44) zum Einlesen von, den spezifischen Probenträger (4) betreffenden, Prozessinformationen (Epa, Eha, xpa, d). Das Steuergerät (40) ist dabei dazu eingerichtet, ein mehrstufiges PCR-Testverfahren selbsttätig durchzuführen und anhand der eingelesenen Prozessinformationen (Epa, Eha, xpa, d) einen Korrekturfaktor (xshift) zu ermitteln, der charakteristisch für einen Unterschied einer Anzahl (xha) an durchlaufenen Hauptamplifikationszyklen gegenüber einem einstufigen PCR-Testverfahren ist, sowie anhand der Anzahl (xha) der durchlaufenen Hauptamplifikationszyklen und des Korrekturfaktors (xshift) einen Wert für eine Vergleichsgröße (xkorr) für die Gesamtzahl an Amplifikationszyklen zum Vergleich mit dem einstufigen PCR-Testverfahren zu bestimmen.

Description

FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 1 P220543P-CT/AS Beschreibung Mehrstufiges PCR-Testverfahren sowie PCR-Testsystem Die Erfindung betrifft ein mehrstufiges PCR-Testverfahren sowie ein PCR- Testsystem, das insbesondere zur Durchführung des PCR-Testverfahrens einge- richtet und vorgesehen ist. „PCR“ steht für den englischen Begriff „polymerase chain reaction“, der wiederum eine Reaktion zur Vervielfältigung einer Nukleinsäure beschreibt, insbesondere zur Vervielfältigung von Genen oder Gensequenzen die in Form von Nukleinsäu- resequenzen vorliegen. Diese Reaktion wird häufig zum Nachweis von Krankheits- erregern in einer Probe (genauer: für eine Untersuchung einer Probe auf das Vor- handensein eines Krankheitserregers) genutzt. Für einen solchen Nachweis wird häufig eine sogenannte „Real-Time“ PCR herangezogen. Diese Real-Time PCR wird auch als Echtzeit-PCR, quantitative PCR oder qPCR bezeichnet, da direkt während des Reaktionsablaufs – also in Echtzeit – ein Er- gebnis ermittelt („gemessen“) wird. Mit Hilfe dieser Methode wird konkret die Menge einer (meist spezifischen) Nukleinsäure (oder Nukleinsäuresequenz) er- fasst, die in einer Probe vorhanden ist. Die Nukleinsäure wird im Rahmen der PCR vervielfältigt, also amplifiziert, weshalb ein Oberbegriff der Methode auch „Nuklein- säure-Amplifikations-Technik“ (NAT) ist. Es gibt grundsätzlich zwei Arten von Nuk- leinsäuren, nämlich die Desoxyribonukleinsäure (DNA) und die Ribonukleinsäure (RNA). Aus DNA-Molekülen besteht das menschliche Genom (Erbgut) sowie das von Mikroorganismen, während das Erbgut vieler Viren als RNA vorliegt. Mittels PCR kann also überprüft werden, ob in einer Probe bakterielle oder virale Gene vorhanden sind, indem diese vervielfältigt und dadurch messbar gemacht werden. Dabei stellen verschiedene Reaktionskomponenten sicher, dass ausschließlich die (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023 FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 2 zu untersuchenden Gensequenzen (man spricht hier meist von einer „Zielse- quenz“) vervielfältigt werden, weshalb die PCR-Methode äußerst spezifisch ist. Die millionenfache Vervielfältigung an sich resultiert in einer sehr guten Sensitivi- tät, da bereits verschwindend geringe Mengen detektiert werden können. Während eines PCR-Testablaufs wird, sofern RNA in der Probe vorhanden ist, diese zuerst enzymatisch in DNA umgewandelt. Anschließend wird in wiederhol- ten Heiz- und Kühlzyklen der DNA-Doppelstrang vereinzelt, so dass spezifische Primer an die Zielsequenz binden können. Die Primer sind das Startsignal für das hitzestabile Enzym DNA-Polymerase, das die Zielsequenz wieder zum Doppel- strang ergänzt. Auf diese Weise entstehen im ersten Reaktionszyklus aus einer Zielsequenz zwei Doppelstrang-Abschnitte, im zweiten Zyklus bereits vier, im drit- ten Zyklus acht, im vierten Zyklus 16 Abschnitte etc.. Die Amplifikation verläuft also exponentiell. Bereits während der Vervielfältigung binden spezifische Sonden (d. h. spezielle Moleküle) an die neugebildete DNA. Diese Sonden sind üblicher- weise an einen fluoreszierenden Farbstoff gekoppelt. Bei Zunahme der Konzentra- tion der amplifizierten Zielsequenz steigt somit die Intensität der Fluoreszenz, bis sie messbar wird. Genau diese Schwelle, an der die Fluoreszenz messbar wird, bezeichnet man als Ct-Wert. Die Abkürzung „Ct“ steht dabei für „Cycle threshold“, also Zyklenschwelle. Der Ct-Wert gibt damit die Anzahl der Vervielfältigungs-Zyk- len an, ab der so viel DNA vorhanden (vervielfältigt) ist, dass die Fluoreszenz der Sonden messbar wird. Der Ct-Wert korreliert dabei mit der ursprünglich in dem PCR-Testablauf einge- setzten Menge an Nukleinsäure. Je höher nämlich die Ausgangskonzentration der gesuchten Zielsequenz ist, desto weniger Zyklen werden benötigt, bis die Fluores- zenz ansteigt. Betrachtet man ein entsprechendes Diagramm (Konzentration der Zielsequenz über der Zyklenzahl), so stellt sich die exponentielle Amplifikation als linearer Anstieg dar, bis die Reaktion später gesättigt ist und in ein Plateau über- geht. Als Ergebnis des PCR-Testablaufs wird also der Ct-Wert betrachtet, um eine Aus- sage über die ursprünglich vorhandene Menge an bakteriellen oder viralen (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023 FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 3 Gensequenzen zu treffen. Der Allgemeinheit näher bekannt wurde der Ct-Wert im Zusammenhang mit der SARS-CoV-2 Pandemie, insbesondere dem Nachweis des SARS-CoV-2-Virus einerseits zum Beleg einer Infektion überhaupt, sowie an- dererseits auch zur Beurteilung einer potentiellen Infektiosität einer infizierten Per- son. Verschiedene Studien (s. z. B.: Perera R. A. et al., Serological assays for se- vere acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), March 2020. Euro Surveill.2020; 25(16): 2000421; Van Beek J. et al., From more testing to smart testing: data-guided SARS-CoV-2 testing choices, the Netherlands, May to Sep- tember 2020. Euro Surveill.2022; 27(8): 2100702; Wolfel R. et al. (2020). Virologi- cal assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature 581, 465-469) deuten darauf hin, dass eine Replikationsfähigkeit des Virus mit der Viruskonzent- ration in der Probe in Zusammenhang steht. Anders ausgedrückt scheint also bei hoher Viruskonzentration in der Probe die Wahrscheinlichkeit höher zu sein, dass sich das Virus replizieren kann und somit ansteckend ist. Deshalb wurde der Ct- Wert herangezogen, um die Infektiosität eines Patienten einzuschätzen. In Deutschland wurde als Grenze bspw. ein Ct-Wert von 30 herangezogen, ab dem eine Person als nicht mehr infektiös eingestuft und somit z. B. aus einer Isolation entlassen werden kann. Es werden aber auch mehrstufige (meist zweistufige) PCR-Testverfahren („nested PCR“, „two-step PCR“ etc.) durchgeführt, bei denen ein zusätzlicher PCR-Schritt, nämlich eine sogenannte Vor-Amplifikation oder Präamplifikation, stattfindet. Wäh- rend der Präamplifikation werden die Zielsequenzen mit einer bestimmten Anzahl an Heiz- und Kühlzyklen vorvervielfältigt. Allerdings wird diese Vervielfältigung noch nicht gemessen. Es wird also bereits eine Ausgangskonzentration in der spä- ter nachfolgenden Haupt-Amplifikation eingesetzt, die im Vergleich zur ursprüng- lich in der Probe vorhandenen Menge bereits (meist deutlich) erhöht ist. Der Vor- teil dieser Methode ist, dass dadurch noch geringere Mengen an Pathogenen nachgewiesen werden können, wodurch die Sensitivität der Tests gesteigert wer- den kann. Eine dem Verfahren innewohnende Besonderheit ist, dass aufgrund der höheren Ausgangskonzentration im Vergleich zu einem herkömmlichen (einstufi- gen) PCR-Testablauf in der Haupt-Amplifikation weniger Zyklen benötigt werden, bis das Vorhandensein der Zielsequenz anhand der Fluoreszenzzunahme (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023 FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 4 messbar wird. Aus diesem Grund ist der bei zwei-stufigen PCR-Testverfahren er- mittelte Ct-Wert niedriger als der Ct-Wert, der mit einer Standard-Labor-PCR er- mittelt wird. Dies kann zu einer Fehleinschätzung der Infektiosität einer infizierten Person führen, so dass diese gegebenenfalls noch nicht aus der Isolation oder dergleichen entlassen werden würden. Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein PCR-Testverfahren zu verbes- sern. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein mehrstufiges PCR- Testverfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Des Weiteren wird diese Auf- gabe erfindungsgemäß gelöst durch ein PCR-Testsystem mit den Merkmalen des Anspruchs 9. Vorteilhafte und teils für sich erfinderische Ausführungsformen und Weiterentwicklungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen und der nachfol- genden Beschreibung dargelegt. Bei dem erfindungsgemäßen PCR-Testverfahren handelt es sich um ein mehrstu- figes PCR-Testverfahren, das bspw. auch als nested PCR bezeichnet wird. Erfindungsgemäß wird bei Durchführung des (mehrstufigen) PCR-Testverfahrens (vorzugsweise mittels eines Probenträgers) eine Probe mit einer Initialkonzentra- tion an Gensequenzen bereitgestellt und zumindest ein Teil der Probe einer Vora- mplifikationsstufe zugeführt. In dieser Voramplifikationsstufe wird wenigstens eine Genzielsequenz einer (vorzugsweise vorgegebenen) Anzahl von Voramplifikati- onszyklen unterworfen. In einer optionalen, zweckmäßigen Verfahrensvariante wird nach der Voramplifikationsstufe, insbesondere also nach Durchlauf der An- zahl der Voramplifikationszyklen, dieser Teil der Probe (konkret zumindest wiede- rum ein Teil davon), insbesondere mittels eines Verdünnungsmediums, um einen Verdünnungsfaktor zu einer Zwischenprobenmenge verdünnt. Wiederum zumin- dest ein Teil der aus der Voramplifikation stammenden (unverdünnten) Proben- menge oder dieser (durch die Verdünnung gebildeten) Zwischenprobenmenge wird anschließend einer Hauptamplifikationsstufe als Hauptprobenmenge zuge- führt. Im Rahmen der Hauptamplifikationsstufe wird die Genzielsequenz dann (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023 FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 5 mehreren Hauptamplifikationszyklen unterworfen. Des Weiteren wird im Rahmen der Hauptamplifikationsstufe ein Erreichen eines Vergleichsmaßes für einen Kon- zentrationsschwellwert durch eine Istkonzentration der Genzielsequenz in der Hauptprobenmenge unter Registrierung der Anzahl der durchlaufenen Hauptamp- lifikationszyklen bei Erreichen dieses Vergleichsmaßes überwacht. Anders ausge- drückt wird insbesondere die Anzahl der durchlaufenen Hauptamplifikationszyklen gezählt bis die Istkonzentraktion der Genzielsequenz den Konzentrationsschwell- wert erreicht. Anhand der Anzahl der Voramplifikationszyklen, und eines Werts ei- ner Amplifikationseffizienz sowie optional anhand des Verdünnungsfaktors, kann ein Korrekturfaktor ermittelt werden, der charakteristisch für einen Unterschied zwischen der Anzahl der durchlaufenen Hauptamplifikationszyklen und der Anzahl der Amplifikationszyklen eines einstufigen PCR-Testverfahrens ist. In einer Vari- ante wird der derart – vorzugsweise vorab, d. h. auf Basis der vorstehend genann- ten Informationen insbesondere für einen spezifischen Probenträger oder einen spezifischen, vorgegebenen Testablauf des PCR-Testverfahrens – ermittelte Kor- rekturfaktor bereitgestellt. Insbesondere wird – zumindest in dem Fall, dass der Korrekturfaktor vorab ermittelt und bereitgestellt wird – anhand der Anzahl der durchlaufenen Hauptamplifikationszyklen und dem Korrekturfaktor ein Wert für eine Vergleichsgröße für die Gesamtzahl an Amplifikationszyklen zum Vergleich mit einem einstufigen PCR-Testverfahren, insbesondere also ein Ct-Vergleichs- wert, bestimmt und bevorzugt auch ausgegeben. Optional wird der Korrekturfaktor ermittelt und insbesondere für einen nachfolgenden Schritt bereitgestellt. Bei der Probe handelt es sich beispielsweise um einen, insbesondere mittels einer Art Tupfer („Swab“) entnommenen, Abstrich, eine anderweitig entnommene Kör- perflüssigkeit und dergleichen. Diese wird insbesondere mittels des vorstehend genannten Probenträgers bereitgestellt. Insbesondere wird die Probe in diesen Probenträger, der insbesondere eine mikrofluidische Kanal- und Kammerstruktur aufweist, eingebracht. Ein solcher Probenträger wird auch als „Kartusche“ be- zeichnet. Vorzugsweise erfolgt in einem Anfangsschritt des PCR-Testverfahrens vor der Vo- ramplifikationsstufe eine Aufbereitung der Probe, bspw. mittels einer Lyse von (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023 FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 6 Nukleinsäure aus der Probe, optional einer enzymatischen Transkription von RNA in DNA oder dergleichen. Bei dem Vergleichsmaß für den Konzentrationsschwellwert handelt es sich insbe- sondere um einen Schwellwert einer Fluoreszenz, die in der Hauptprobenmenge beobachtet wird. Vorzugsweise wird hierbei mittels eines entsprechenden, insbe- sondere lichtempfindlichen, Sensors die Fluoreszenz der Hauptprobenmenge beo- bachtet, die sich aufgrund von spezifischen Sonden, die an die Genzielsequenz koppeln und im gekoppelten Zustand (gegebenenfalls unter Beleuchtung mit ei- nem Licht vorgegebener Wellenlänge) fluoreszieren, einstellt. Je mehr Fluores- zenz beobachtet wird, desto höher ist also die Istkonzentration der Genzielse- quenz in der Hauptprobenmenge. Der Fluoreszenzschwellwert ist also ein qualita- tives Kriterium für das Erreichen des Konzentrationsschwellwerts. Der vorstehend beschriebene Korrekturfaktor fördert vorteilhafterweise die Ver- gleichbarkeit zwischen dem einstufigen („Standard“-) PCR-Testverfahren und dem mehrstufigen PCR-Testverfahren. Vergleichsweise aufwendige parallele Ver- gleichstests zur empirischen Bestimmung eines Vergleichswerts zwischen einstufi- gen und mehrstufigen PCR-Testverfahren können somit unterbleiben. Des Weite- ren wird damit auch die Nutzerfreundlichkeit gefördert, da auch vergleichsweise unerfahrenes Laborpersonal, das keinen großen Erfahrungsschatz an ein- und mehrstufigen PCR-Testverfahren hat, ein besonders verlässliches Testergebnis generieren kann. Vorzugsweise wird – insbesondere als der vorstehend genannte nachfolgende Schritt – auch anhand der Anzahl der durchlaufenen Hauptamplifikationszyklen und dem Korrekturfaktor der Wert für die Vergleichsgröße für die Gesamtzahl an Amplifikationszyklen zum Vergleich mit dem einstufigen PCR-Testverfahren, ins- besondere also der Ct-Vergleichswert, bestimmt. In einer zweckmäßigen Ausführung wird der Korrekturfaktor insbesondere unter der Annahme ermittelt, dass der gleiche Wert der in der Hauptamplifikationsstufe bei Erreichen des Vergleichsmaßes des Konzentrationsschwellwerts vorliegenden (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023 FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 7 Istkonzentration auch bei dem einstufigen PCR-Testverfahren zum Erreichen ei- nes korrespondierenden Vergleichsmaßes für den Konzentrationsschwellwert führt. Bei einem einstufigen PCR-Testverfahren wird insbesondere davon ausgegangen, dass folgender Zusammenhang zwischen der Initialkonzentration ninit der Probe, der Amplifikationseffizienz E und der Anzahl der Amplifikationszyklen x besteht: ^ = ^^^^^(1 + ^)^ (1) Dies ist bspw. aus N. Arnheim u. H. Erlich, Annu. Rev. Biochem.61 (1992) 131- 156 bekannt. Um nun den Korrekturfaktor (insbesondere auch den Ct-Vergleichswert) zu be- stimmen, werden die Anzahl der Voramplifikationszyklen und vorzugsweise auch der Verdünnungsfaktor berücksichtigt. Der absolute Wert der Ct-Verschiebung (d. h. also der Korrekturfaktor) wird insbesondere aus der Differenz zwischen dem Ct- Wert des Standard-PCR-Testverfahrens und dem um die Voramplifikationsstufe angepassten Ct-Wert bestimmt. Zur Bestimmung des Ct-Werts des Standard-PCR-Testverfahrens wird angenom- men, dass die Istkonzentration nha („ha“ für Hauptamplifikation), die zum Erreichen des Vergleichsmaßes führt, bei einem einstufigen PCR-Testverfahren nach einer Anzahl xstandard erreicht wird, bei ansonst gleichen Voraussetzungen (insbeson- dere also gleicher Initialkonzentration und Amplifikationseffizienz Eha): ^^^ = ^^^^^(1 + ^^^)^^^^^^^^^ (2) Der Ct-Wert des Standard-PCR-Testverfahrens entspricht dabei der Anzahl xstan- dard der Amplifikationszyklen und ergibt sich aus: (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023 FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 8
Figure imgf000010_0001
Analog zu Formel (1) bzw. Formel (2) wird vorzugsweise auch – zumindest theore- tisch – eine Voramplifikationskonzentration, die nach Abschluss der Voramplifikati- onsstufe vorliegt, bestimmt zu:
Figure imgf000010_0002
Wobei npa für die Voramplifikationskonzentration, Epa für die Amplifikationseffizi- enz der Voramplifikationsstufe und xpa für die Anzahl der Voramplifikationszyklen stehen. Da optional der in der Voramplifikationsstufe prozessierte (amplifizierte) Teil der ursprünglichen Probe zur Zwischenprobenmenge verdünnt wird, bevor letztere dann zumindest zum Teil der Hauptamplifikationsstufe zugeführt wird, können die Vor- und Hauptamplifikationszyklen nicht einfach aufaddiert werden. Stattdessen ergibt sich insbesondere eine Zwischenkonzentration nz der Genzielsequenz, mit der die Hauptamplifikationsstufe startet:
Figure imgf000010_0003
Die Istkonzentration nha, die sich während der Hauptamplifikationsstufe beim Errei- chen des Vergleichsmaßes für den Konzentrationsschwellwert einstellt, wird dabei ausgehend von der Zwischenkonzentration bestimmt: ^^^ = ^/(1 + ^^^)^%^ (6) Wobei für die Amplifikationseffizienz der Hauptamplifikationsstufe und xha für die Anzahl der Hauptamplifikationszyklen stehen. (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023 FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 9 Durch Einsetzen der Formeln (5) und (4) in Formel (6) und entsprechendes Umfor- men ergibt sich
Figure imgf000011_0001
Der Korrekturfaktor xshift ergibt sich wie vorstehend beschrieben insbesondere aus ^ ^^6^ = ^ ^^^!^"! − ^^^ (8) und somit durch Einsetzen der Formeln (7) und (3) sowie Umformen aus
Figure imgf000011_0002
In einer optionalen Weiterbildung wird vereinfachend angenommen, dass die Amplifikationseffizienzen in der Voramplifikationsstufe und der Hauptamplifikati- onsstufe zumindest annähernd gleich sind (d. h. sich insbesondere nur zu einem vernachlässigbaren Teil unterscheiden). Dadurch ergibt sich aus Formel (9)
Figure imgf000011_0003
(E gibt die gemeinsame bzw. einheitliche Amplifikationseffizienz an). Bei einer Annahme von 100 % Amplifikationseffizienz ergibt sich weiter vereinfa- chend
Figure imgf000011_0004
(\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023 FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 10 Der mit einer der Formeln (9) bis (11) errechnete Korrekturfaktor wird entspre- chend auf die Anzahl der Hauptamplifikationszyklen aufaddiert, um den aus dem hier beschriebenen mehrstufigen PCR-Testverfahren generierten Ct-Wert (also die Anzahl der Hauptamplifikationszyklen) mit dem eines Standard-PCR- Testverfahrens vergleichen zu können. Für den Fall, dass keine Verdünnung erfolgt, wird Formel (5) entsprechend ange- passt und/oder der Verdünnungsfaktor d wird vereinfachend mit dem Wert „1“ ein- gesetzt. In diesem Fall erfolgt jedoch die Vereinfachung gemäß der Formeln (10) und (11) vorzugsweise nicht. Vielmehr fallen in diesem Fall insbesondere Unter- schiede zwischen den jeweiligen Amplifikationseffizienzen ins Gewicht. Das vorstehend beschriebene Vorgehen ist besonders vorteilhaft und einfach, wenn der Korrekturfaktor als Offset für einen (insbesondere für eine spezifische Genzielsequenz vorgegebenen) Testablauf und/oder für einen spezifischen Pro- benträger vorgegeben, d. h. hinterlegt wird. In diesem Fall braucht der Korrek- turfaktor für diesen Testablauf bzw. Probenträger (für einen spezifischen Proben- träger ist aufgrund dessen enthaltenen Zusatzstoffen, bspw. Reaktionsbausteinen in Form von Nukleinsäurebausteinen, Enzymen, Sonden und dergleichen, ein für diesen Probenträger, konkret also für ein bestimmtes Modell oder einen Typ von Probenträger, spezifischer Testablauf vorgegeben, um zu einem belastbaren Er- gebnis zu führen) also nur einmal bestimmt werden und kann für die Verwendung dieses Probenträgers dann immer wieder aufgerufen werden. Das erfindungsgemäße PCR-Testsystem weist ein PCR-Testgerät und eine An- zahl von mikrofluidischen Probenträgern (insbesondere der vorstehend genannten Art) auf. Das PCR-Testgerät umfasst dabei eine Aufnahmevorrichtung für wenigs- tens einen der mikrofluidischen Probenträger, eine Heizvorrichtung zur wenigstens lokal auf einen Teilbereich (optional auch auf die gesamte Fläche) des Probenträ- gers gerichteten Wärmezufuhr auf den Probenträger, sowie ein Steuergerät, das dazu eingerichtet ist, die Heizvorrichtung zur zyklischen Erwärmung des Teilbe- reichs des Probenträgers anzusteuern. Des Weiteren umfasst das PCR-Testgerät eine Einlesevorrichtung zum, vorzugsweise selbsttätigen, Einlesen von, den (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023 FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 11 spezifischen Probenträger betreffenden, Prozessinformationen. Alternativ weist das PCT-Testgerät eine Eingabevorrichtung auf, mittels derer die vorstehend be- schriebenen Prozessinformationen, insbesondere manuell, eingegeben werden können. Das Steuergerät ist ferner dazu eingerichtet, ein mehrstufiges PCR- Testverfahren, insbesondere das vorstehend beschriebene mehrstufige PCR- Testverfahren, selbsttätig durchzuführen. Außerdem ist das Steuergerät dazu ein- gerichtet, anhand der eingelesenen Prozessinformationen den vorstehend be- schriebenen Korrekturfaktor, der charakteristisch für den Unterschied zwischen der Anzahl an durchlaufenen Hauptamplifikationszyklen und der Anzahl an Ampli- fikationszyklen des einstufigen Standard-PCR-Testverfahrens ist, zu ermitteln. Beispielsweise ist in einem Speicher des Steuergeräts eine Tabelle oder derglei- chen hinterlegt, aus der der Korrekturfaktor anhand der Prozessinformationen aus- gelesen werden kann. Alternativ ist der Korrekturfaktor Teil der Prozessinformatio- nen und wird somit von dem Steuergerät aus diesen ausgelesen. Weiterhin ist das Steuergerät vorzugsweise dazu eingerichtet, anhand der Anzahl der durchlaufe- nen Hauptamplifikationszyklen und des Korrekturfaktors einen Wert für die vorste- hend beschriebene Vergleichsgröße für die Gesamtzahl an Amplifikationszyklen zum Vergleich mit dem einstufigen PCR-Testverfahren zu bestimmen. Optional kann die Heizvorrichtung auch zum aktiven Kühlen eingerichtet sein, um eine möglichst schnelle Abkühlung des erwärmten Bereichs des Probenträgers zu ermöglichen. Der Probenträger weist insbesondere eine Mehrzahl von zumindest teilweise mit- einander zu einem Leitungssystem oder -netzwerk verbundenen Prozesskammern und Kanälen auf, deren Abmessungen (insbesondere quer zum grundsätzlichen Leitungsverlauf) im Bereich weniger Mikrometer bis zu wenige hundert Mikrometer liegen. Der Probenträger ist dabei optional derart gestaltet, dass mittels Rotation und/oder Temperatureinwirkung eine Probenflüssigkeit durch das Leitungsnetz- werk und insbesondere in die jeweiligen Prozesskammern geleitet, insbesondere „gepumpt“ werden kann. Alternativ kann der Probenträger aber auch für ein PCR- Testverfahren ohne Rotation vorgesehen und eingerichtet sein. In manchen (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023 FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 12 Prozesskammern sind optional Reaktionsbausteine, bspw. Nukleinsäurebau- steine, Enzyme, Sonden und dergleichen vorgelagert. Das Steuergerät ist insbesondere dazu eingerichtet, die vorstehend beschriebene Probe (zumindest einen Teil derer) bspw. einem Lyseschritt zuzuführen und an- schließend der Voramplifikationsstufe, insbesondere in eine dazu vorgesehene Prozesskammer einzuleiten. Optional steuert das Steuergerät das PCR-Testgerät anschließend derart an, dass ein Teil der Probe aus der Voramplifikationsstufe verdünnt wird (bspw. in eine Kammer eingeleitet wird, in der ein Verdünnungsme- dium vorgehalten ist). Jedenfalls steuert das Steuergerät das PCR-Testgerät an- schließend derart an, dass ein Teil der Probe aus der Voramplifikationsstufe oder ein Teil der Zwischenprobenmenge der Hauptamplifikationsstufe (als Hauptpro- benmenge) zugeführt wird. Vorzugsweise umfasst das PCR-Testgerät auch eine Sensorik, insbesondere einen lichtempfindlichen Sensor, mittels dessen während der Hauptamplifikationszyklen beobachtet wird, ob die Istkonzentration der Genzi- elsequenz das Vergleichsmaß für den Konzentrationsschwellwert erreicht. Optional sind die vorstehend beschriebenen Formeln (8) bis (11), zumindest aber (9), (10) und/oder (11) in dem Steuergerät hinterlegt. Das erfindungsgemäße PCR-Testgerät teilt mithin die vorstehend im Rahmen des PCR-Testverfahrens beschriebenen Verfahrensmerkmale und somit auch deren Vorteile. Des Weiteren ermöglicht das PCR-Testgerät, sowohl den PCR-Test ins- besondere selbsttätig durchzuführen sowie auch einen für Vergleiche geeigneten Ct-Vergleichswert auszugeben, ohne dass sich Laborpersonal intensiver mit einer Anpassung des Ergebnisses auf bekannte Beurteilungsmaße, insbesondere also den Standard-Ct-Wert, beschäftigen müsste. Dadurch, dass das PCR-Testgerät die Prozessinformationen auch selbsttätig einliest, ist auch das Risiko von Fehlein- gaben verringert. In bevorzugter Ausgestaltung ist das Steuergerät (auch: „Controller“) zumindest im Kern durch einen Mikrocontroller mit einem Prozessor und einem Datenspeicher gebildet, in dem die Funktionalität zur Durchführung des erfindungsgemäßen (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023 FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 13 PCR-Testverfahrens in Form einer Betriebssoftware (Firmware) programmtech- nisch implementiert ist, so dass das Verfahren – gegebenenfalls in Interaktion mit Laborpersonal – bei Ausführung der Betriebssoftware in dem Mikrocontroller auto- matisch durchgeführt wird. Das Steuergerät kann im Rahmen der Erfindung alter- nativ aber auch durch ein nicht-programmierbares elektronisches Bauteil, z.B. ei- nen ASIC, gebildet sein, in dem die Funktionalität zur Durchführung des erfin- dungsgemäßen Testverfahrens mit schaltungstechnischen Mitteln implementiert ist. In einer zweckmäßigen Ausführung enthalten die Prozessinformationen zumindest einen Wert für den Verdünnungsfaktor und/oder die jeweilige Amplifikationseffizi- enz der Vor- und der Hauptamplifikationsstufe. Der Verdünnungsfaktor gibt insbe- sondere an, um welches Maß ein Teil der im Probenträger vorgehaltenen Probe nach der Voramplifikationsstufe zu der Zwischenprobenmenge verdünnt wird. Der Wert der jeweiligen Amplifikationseffizienz gibt insbesondere an, wie viel Prozent der aktuellen Konzentration der Genzielsequenz in einem Amplifikationszyklus vervielfacht werden. Zusätzlich oder alternativ enthalten die Prozessinformationen auch den (gemäß den vorstehenden Ausführungen für einen spezifischen Testab- lauf vorab ermittelten) Korrekturfaktor. Optional geben die Prozessinformationen, die Anzahl der Voramplifikationszyklen (vorzugsweise zusätzlich zu dem Korrekturfaktor) an. In einer bevorzugten Ausführung sind die Prozessinformationen in einer maschi- nenlesbar codierten Form an dem jeweiligen Probenträger vorgehalten. Vorzugs- weise sind die Prozessinformationen dabei fest mit dem Probenträger verbunden. In einer zweckmäßigen Variante sind die Prozessinformationen dabei in einem optoelektronisch auslesbaren Code, insbesondere einem 1D- oder 2D-Code (ins- besondere also einem Strich- oder Matrixcode, bspw. einem Data-Matrix-Code), codiert auf eine Oberfläche des Probenträgers aufgebracht, bspw. auf diesen auf- gedruckt oder mittels eines Aufklebers aufgebracht. Die Einlesevorrichtung des PCR-Testgeräts ist in diesem Fall vorzugweise durch eine entsprechend (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023 FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 14 ausgebildete optische Scaneinheit ausgebildet, bspw. ein Laserscanner oder ein Bildsensor. In einer alternativen Variante sind die Prozessinformationen in einem nach dem RFID-Standard ausgebildeten Chip hinterlegt und an dem Probenträger ange- bracht. Die Einlesevorrichtung ist hierbei durch einen entsprechend ausgebildeten (RFID-) Transceiver ausgebildet. Weiter alternativ sind die Prozessinformationen auf einem zu einer sogenannten Nahfeld-Kommunikation („NFC“) eingerichteten Chip oder Modul hinterlegt und werden somit mittels bekannter NFC-Standards an einen entsprechenden NFC-Transceiver (der die Einlesevorrichtung bildet) über- mittelt. In beiden Fällen ist die Einlesevorrichtung dabei optional in einem Gehäuse des PCR-Testgeräts angeordnet, wobei letzteres als Aufnahmevorrichtung eine Art Automatikeinzug für den Probenträger aufweist, der vergleichbar mit einem CD- Einzug eines Fahrzeug-CD-Spielers ist. Die Einleseeinrichtung ist dabei derart in- stalliert, dass diese die Prozessinformationen einlesen kann, während der Proben- träger „eingezogen“ wird. Grundsätzlich ist es aber auch denkbar, dass die Einlesevorrichtung außenseitig positioniert ist, so dass Laborpersonal den spezifischen Probenträger manuell der Einlesevorrichtung „präsentieren“ muss. Für den Fall, dass die Prozessinformationen die Anzahl von Voramplifikationszyk- len enthalten, bilden diese vorzugsweise eine Art Vorgabe. Das Steuergerät ist hierbei zweckmäßigerweise dazu eingerichtet, das mehrstufige PCR- Testverfahren in Abhängigkeit von dieser Vorgabe zur Anzahl von Voramplifikati- onszyklen durchzuführen. In diesem Fall kann das PCR-Testverfahren besonders einfach an spezifische Testtypen angepasst werden. Vorzugsweise ist das Steuer- gerät in diesem Fall also dazu eingerichtet, anhand der Prozessinformationen den Testablauf (d. h. das PCR-Testverfahren) durchzuführen. Optional enthalten die Prozessinformationen „nur“ den Typ des Probenträgers bzw. des Tests und das Steuergerät ist dazu eingerichtet, Parameter für den entsprechenden Testablauf (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023 FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 15 (bspw. die Anzahl von Voramplifikationszyklen sowie Temperaturwerte für Vor- und Hauptamplifikationsstufe – und vorzugsweise auch den zugeordneten Korrek- turfaktor) aus dem zugeordneten Speicher auszulesen. Die Konjunktion „und/oder“ ist hier und im Folgenden insbesondere derart zu ver- stehen, dass die mittels dieser Konjunktion verknüpften Merkmale sowohl gemein- sam als auch als Alternativen zueinander ausgebildet sein können. Nachfolgend wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung anhand einer Zeichnung näher erläutert. Darin zeigen: Fig.1 in einer schematischen teildurchsichtigen Seitenansicht ein Testsystem zur Durchführung von PCR-Testverfahren, Fig.2 in einer schematischen Draufsicht einen Probenträger des Testsystems, und Fig.3 in einem schematischen Ablaufdiagramm ein PCR-Testverfahren. Einander entsprechende Teile und Größen sind in allen Figuren stets mit gleichen Bezugszeichen versehen. In Fig.1 ist schematisch ein PCR-Testsystem (kurz: „System 1“) dargestellt. Die- ses umfasst ein PCR-Testgerät (kurz: „Gerät 2“) sowie eine Anzahl (insbesondere Mehrzahl) von mikrofluidischen Probenträgern 4 (hier nur einer dargestellt). Das System 1 dient dazu, ein in Fig.3 näher dargestelltes PCR-Testverfahren, d. h. konkret einen PCR-Test auf das Vorliegen einer spezifischen Gensequenz, die beispielsweise als Hinweis auf einen spezifischen Krankheitserreger dienen kann, zumindest im Wesentlichen (vorzugsweise bis auf ein Vorbereiten einer Probe, Bestücken des Probenträgers 4 mit der Probe sowie Übergeben des Probenträ- gers 4 an das Gerät 2) selbsttätig durchzuführen. Das Gerät 2 umfasst ein Gehäuse 6, das einen (Geräte-) Innenraum 8 umgrenzt. In dem Innenraum 8 ist eine Heizvorrichtung 10 angeordnet, mittels derer während des PCR-Testverfahrens wie nachfolgend näher beschrieben zumindest ein Teil (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023 FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 16 des Probenträgers 4 erwärmt wird. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel sind das Gerät 2 sowie der Probenträger 4 dazu eingerichtet, das PCR-Testverfahren rota- tionsbasiert durchzuführen. Das heißt, dass während des PCR-Testverfahrens der entsprechende Probenträger 4 mit variabler Drehzahl rotiert wird. Dadurch kann bspw. Probenflüssigkeit zielgerichtet gepumpt werden. Hierzu umfasst das Gerät 2 auch einen Drehantrieb 12, der auf einen Drehteller 14 wirkt, auf dem wiederum im bestimmungsgemäßen Einsatz der Probenträger 4 gelagert ist. Das Einbringen des Probenträgers 4 erfolgt dabei mittels einer Art Einzug 16 (vergleichbar zu ei- nem CD-Spieler), der in das Gehäuse 6 eingesetzt ist. Der Drehteller 14 und der Einzug 16 bilden dabei eine Aufnahmevorrichtung für den Probenträger 4. Eine optional vorhandene Positionierungshilfe, mittels derer gegebenenfalls der Pro- benträger 4 auf dem Drehteller 14 abgelegt und positioniert wird, ist nicht darge- stellt. Der Probenträger 4 weist eine Anzahl von mikrofluidischen Kanälen 20 und Kam- mern 22 auf. Als Kammern 22 weist der Probenträger 4 (lediglich beispielhaft und nicht erschöpfend) eine Probenkammer 24 auf, in welche die von einem Testob- jekt oder -subjekt entnommene Probe eingebracht wird (bspw. in ein „Swab“ in die Probenkammer 24 eingesteckt wird). In der Probenkammer 24 ist eine Pufferflüs- sigkeit (nicht dargestellt) vorgelagert, in der sich das Material der Probe (das bspw. von einem Schleimhautabstrich stammt) verteilen und optional lösen soll. Der Probenkammer 24 ist nachgelagert eine Lysekammer 26, in der das in der Pufferflüssigkeit gelöste Probenmaterial lysiert (bspw. Zellwände aufgebrochen etc.) wird. Nachgelagert befindet sich auf dem hier dargestellten Probenträger 4 eine Voramplifikationskammer 28. Dieser wiederum nachgelagert ist eine Verdün- nungskammer 30 sowie mehrere Hauptamplifikationskammern 32. In der Verdün- nungskammer 30 ist eine Verdünnungsflüssigkeit vorgelagert. Auf dem Probenträger 4 ist außerdem ein optoelektronisch lesbarer Code 34 (hier beispielhaft als Strichcode dargestellt) angeordnet, bspw. direkt aufgedruckt oder im vorliegenden Ausführungsbeispiel mittels eines Aufklebers aufgeklebt. Der Code 34 stellt Prozessinformationen bereit, die das mittels des spezifischen Pro- benträgers 4 durchzuführende PCR-Testverfahren betreffen. Die (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023 FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 17 Prozessinformationen enthalten gemäß der hier beschriebenen Variante zumin- dest einen Wert eines Verdünnungsfaktors d, um den die aus der Voramplifikati- onskammer 28 weitergeleitete Probenmenge verdünnt wird. Das Gerät 2 umfasst nun ein Steuergerät 40, das dazu eingerichtet ist, das an- hand von Fig.3 näher beschriebene PCR-Testverfahren durchzuführen, konkret dazu den Drehantrieb 12 sowie die Heizvorrichtung 10 anzusteuern. Außerdem weist das Gerät 2 eine Nutzerschnittstelle 42 auf, die mit dem Steuergerät 40 ge- koppelt ist und zumindest zur Ausgabe von Informationen über den durchgeführ- ten PCR-Test sowie optional auch zur Eingabe von Geräteeinstellungen dient. Zum selbsttätigen Einlesen der mit dem Code 34 dargestellten Prozessinformatio- nen weist das Gerät 2 außerdem eine Einlesevorrichtung, hier konkret einen Bar- codescanner 44 auf. Dieser ist im Innenraum 8 derart angeordnet, dass beim Ein- ziehen des Probenträger 4 der Code 34 gelesen werden kann. Optional können die Prozessinformationen neben dem Verdünnungsfaktor d auch weitere Informationen enthalten. Diese sind z. B., dass der Probenträger 4 wie im vorliegenden Ausführungsbeispiel für ein mehrstufiges PCR-Testverfahren einge- richtet ist; eine Anzahl xpa an Amplifikationszyklen, die in einer in der Voramplifika- tionskammer 28 durchgeführten Voramplifikationsstufe PA durchzuführen sind; eine Amplifikationseffizienz Epa für die Voramplifikationsstufe PA; eine Amplifikati- onseffizienz Eha für eine in den Hauptamplifikationskammern 32 durchgeführte Hauptamplifikationsstufe HA und dergleichen. Fig.3 zeigt einen Ablauf des mit dem Gerät 2 und einem der Probenträger 4 durchgeführten PCR-Testverfahrens. In einem ersten Verfahrensschritt S1 wird ein für eine gewünschte Untersuchung (konkret für einen Nachweis eines spezifi- schen Krankheitserregers) spezifischer Probenträger 4 ausgewählt mit der bereit- gestellten Probe bestückt. Bspw. wird dazu ein Tupfer mit einem Schleimhautab- strich in die Probenkammer 24 eingeführt. Anschließend wird der Probenträger 4 durch den Einzug 16 an das Gerät 2 übergeben. (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023 FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 18 Das Gerät 2, konkret dessen Steuergerät 40, liest in einem zweiten Verfahrens- schritt S2 mittels des Barcodescanners 44 den Code 34 aus und speichert die da- bei erfassten Prozessinformationen zwischen. Optional zeigt das Steuergerät 40 zumindest einen Teil der Prozessinformationen an der Nutzerschnittstelle 42 an. In einem dritten Verfahrensschritt S3 startet das Steuergerät 40 das eigentliche PCR-Testverfahren. Dazu steuert das Steuergerät 40 den Drehantrieb 12 und die Heizvorrichtung 10 an. Zunächst wird die Heizvorrichtung 10 und der Drehantrieb 12 derart gesteuert, dass sich die Probe mit der in der Probenkammer 24 vorge- haltenen Pufferflüssigkeit vermengen kann. Nach einer entsprechenden Wartezeit steuert das Steuergerät 40 den Drehantrieb 12 so an, dass eine vorgegebene (Teil-) Menge der in der Probenkammer 24 gebildeten Probenflüssigkeit in die Ly- sekammer 26 überführt wird. Dort werden Zellwände aufgebrochen, um Erbgut of- fenzulegen. Anschließend wird die Probenflüssigkeit (insbesondere mittels Dreh- zahlsteuerung) gegebenenfalls über eine nicht näher dargestellte Filterstufe in die Voramplifikationskammer 28 überführt. Die Probenflüssigkeit wird dabei mit Gen- bausteinen, Enzymen, spezifischen Marken und dergleichen versetzt, so dass bei einem nun erfolgenden zyklischen Aufheizen und Abkühlen nur eine spezifische Gensequenz („Genzielsequenz“; sofern diese vorhanden ist) vervielfältigt wird. In dieser Voramplifikationsstufe PA werden der Anzahl xpa entsprechend viele Ampli- fikationszyklen (Aufheiz- und Abkühlzyklen) durchgeführt. Liegt die Genzielse- quenz in der Probe vor, ist deren Konzentration nun gegenüber einer Ausgangs- oder Initialkonzentration erhöht. In einem vierten Verfahrensschritt S4 wird ein Teil der Probenflüssigkeit aus der Voramplifikationskammer 28 in eine Verdünnungskammer 30 „gepumpt“, und dort mit der Verdünnungsflüssigkeit um den Faktor d zu einer „Zwischenprobenmenge“ verdünnt. Dabei wird erkanntermaßen die nach der Voramplifikationsstufe vorlie- gende Konzentration der Genzielsequenz verringert. Anschließend wird wiederum eine vorgegebene Teilmenge dieser Zwischenprobenmenge als jeweilige Haupt- probenmenge in die Hauptamplifikationskammern 32 überführt. Nun wird eine Hauptamplifikationsstufe HA durchgeführt. Während der Hauptamplifikationsstufe HA wird abermals die jeweilige Hauptprobenmenge Heiz- und Kühlzyklen (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023 FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 19 unterworfen, um die Genzielsequenz zu vervielfachen. Zusätzlich sind in der Hauptamplifikationsstufe HA der Probenflüssigkeit nun fluoreszierende „Sonden“ (d. h. Bausteine, die an die Genzielsequenz koppeln und einen Fluoreszenzstoff tragen oder mit diesem im mit der Genzielsequenz gekoppelten Zustand koppeln können) zugesetzt. Steigt die Istkonzentration der Genzielsequenz in der jeweili- gen Hauptprobenmenge, nimmt auch die Fluoreszenz zu. Um diese zu überwa- chen, weist das Gerät 2 einen optischen Sensor 46 auf, der mit dem Steuergerät 40 gekoppelt ist und zur Beobachtung der Hauptamplifikationskammern 32 einge- richtet ist. Das Steuergerät 40 überwacht mittels des optischen Sensors 46, ob ein Fluores- zenzgrenzwert erreicht wird. Dieser bildet ein Vergleichsmaß für einen Konzentra- tionsgrenzwert der Istkonzentration der Genzielsequenz. Wird der Fluoreszenz- grenzwert erreicht, registriert das Steuergerät 40 die Anzahl xha der durchgeführ- ten Amplifikationszyklen. Parallel errechnet das Steuergerät 40 anhand der obenstehenden Formel (9) und den mittels des Codes 34 übergebenen Prozessinformationen einen Korrekturwert oder Korrekturfaktor xshift, der angibt um welchen Betrag die Anzahl xha der Amplifi- kationszyklen in der Hauptamplifikationsstufe HA gegenüber der Anzahl mittels ei- nes einstufigen PCR-Testverfahrens zu der gleichen Istkonzentration führenden Amplifikationszyklen verschoben ist. Diese Anzahl des einstufigen PCR- Testverfahrens wird meist auch als Ct-Wert bezeichnet. Aus dem Korrekturfaktor xshift und der Anzahl xha der (Haupt-) Amplifikationszyklen errechnet das Steuerge- rät 40 außerdem einen korrigierten Ct-Wert xkorr für das durchgeführte mehrstufige PCR-Testverfahren, indem der Korrekturfaktor xshift auf die Anzahl xha der (Haupt-) Amplifikationszyklen aufaddiert wird. Der korrigierte Ct-Wert xkorr dient als Ver- gleichsgröße zum Vergleich mit dem einstufigen PCR-Testverfahren. Der korrigierte Ct-Wert xkorr und optional auch der Korrekturfaktor xshift werden als Ergebnis des PCR-Testverfahrens über die Nutzerschnittstelle 42 angezeigt. (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023 FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 20 In einem optionalen Ausführungsbeispiel wird die Amplifikationseffizienz Epa und Eha mit 100 % angenommen. Dadurch vereinfacht sich Formel (9) zu Formel (11). In einer Variante des vorstehend beschriebenen Ausführungsbeispiels wird der Korrekturfaktor xshift vorab ermittelt und in einem Speicher des Steuergeräts 40 hinterlegt oder diesem mit den Prozessinformationen übergeben. Das Steuergerät 40 nutzt in diesem Fall den Korrekturfaktor xshift als vorab bestimmten Offset, der wie vorstehend beschrieben mit der Anzahl xha der (Haupt-) Amplifikationszyklen den korrigierten Ct-Wert xkorr ergibt. Die Prozessinformationen können in diesem Fall auch nur den Korrekturfaktor xshift und die durchzuführende Anzahl xpa an Vo- ramplifikationszyklen enthalten. In einer weiteren Variante enthalten die Prozessin- formationen lediglich den Typ des Probenträgers 4. In dem Speicher des Steuer- geräts 40 sind – bspw. in Form eine Lookup-Tabelle – der vorab für diesen Typ des Probenträgers 4 ermittelte Korrekturfaktor xshift und die durchzuführende An- zahl xpa an Voramplifikationszyklen hinterlegt. Das Steuergerät 40 nutzt dann diese hinterlegten Informationen, um das PCR-Testverfahren entsprechend durch- zuführen. Der Gegenstand der Erfindung ist nicht auf die vorstehend beschriebenen Ausfüh- rungsbeispiele beschränkt. Vielmehr können weitere Ausführungsformen der Erfin- dung von dem Fachmann aus der vorstehenden Beschreibung abgeleitet werden. Insbesondere können die anhand der verschiedenen Ausführungsbeispiele be- schriebenen Einzelmerkmale der Erfindung und deren Ausgestaltungsvarianten auch in anderer Weise miteinander kombiniert werden. Beispielsweise kann der Probenträger 4 und auch das Gerät 4 dazu eingerichtet sein, das PCR- Testverfahren ohne Rotationsunterstützung durchzuführen. In diesem Fall sind die Kanäle 20 und Kammern 22 unterschiedlich angeordnet, optional mit ansteuerba- ren (bspw. magnetischen) Ventilen getrennt. Die Vor- und Hauptamplifikationszyk- len werden in diesem Fall lediglich durch eine Temperatursteuerung, bzw. Heizen und (aktives) Kühlen oder nur Heizen und Abkühlen-Lassen, durchgeführt. (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023 FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 21 Bezugszeichenliste 1 System 2 Gerät 4 Probenträger 6 Gehäuse 8 Innenraum 10 Heizvorrichtung 12 Drehantrieb 14 Drehteller 16 Einzug 20 Kanal 22 Kammer 24 Probenkammer 26 Lysekammer 28 Voramplifikationskammer 30 Verdünnungskammer 32 Hauptamplifikationskammer 34 Code 40 Steuergerät 42 Nutzerschnittstelle 44 Barcodescanner 46 Sensor d Verdünnungsfaktor xpa, xha Anzahl PA Voramplifikationsstufe Epa, Eha Amplifikationseffizienz HA Hauptamplifikationsstufe S1-S4 Verfahrensschritt xshift Korrekturfaktor xkorr korrigierter Ct-Wert (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023

Claims

FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 22 Ansprüche 1. Mehrstufiges PCR-Testverfahren, bei dem verfahrensgemäß - eine Probe mit einer Initialkonzentration an Gensequenzen bereitgestellt wird, - zumindest ein Teil der Probe einer Voramplifikationsstufe (PA) zugeführt wird, - in der Voramplifikationsstufe (PA) wenigstens eine Genzielsequenz einer Anzahl (xpa) von Voramplifikationszyklen unterworfen wird, - zumindest ein Teil der Probe nach der Voramplifikationsstufe (PA) einer Hauptamplifikationsstufe (HA) als Hauptprobenmenge zugeführt wird, - in der Hauptamplifikationsstufe (HA) die Genzielsequenz mehreren Haupt- amplifikationszyklen unterworfen wird, - im Rahmen der Hauptamplifikationsstufe (HA) ein Erreichen eines Ver- gleichsmaßes für einen Konzentrationsschwellwert durch eine Istkonzent- ration der Genzielsequenz in der Hauptprobenmenge unter Registrierung einer Anzahl (xha) der durchlaufenen Hauptamplifikationszyklen bei Errei- chen des Vergleichsmaßes überwacht wird, - ein anhand der Anzahl (xpa) der Voramplifikationszyklen und eines Werts einer Amplifikationseffizienz (Epa, Eha) ermittelter Korrekturfaktor (xshift), der charakteristisch für einen Unterschied der Anzahl (xha) der durchlaufenen Hauptamplifikationszyklen zu einem einstufigen PCR-Testverfahren ist, bereitgestellt wird, und - anhand der Anzahl (xha) der durchlaufenen Hauptamplifikationszyklen und dem Korrekturfaktor (xshift) ein Wert für eine Vergleichsgröße (xkorr) für die Gesamtzahl an Amplifikationszyklen zum Vergleich mit einem einstufigen PCR-Testverfahren bestimmt wird. 2. Mehrstufiges PCR-Testverfahren, bei dem verfahrensgemäß - eine Probe mit einer Initialkonzentration an Gensequenzen bereitgestellt wird, - zumindest ein Teil der Probe einer Voramplifikationsstufe (PA) zugeführt wird, (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023 FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 23 - in der Voramplifikationsstufe (PA) wenigstens eine Genzielsequenz einer Anzahl (xpa) von Voramplifikationszyklen unterworfen wird, - zumindest ein Teil der Probe nach der Voramplifikationsstufe (PA) einer Hauptamplifikationsstufe (HA) als Hauptprobenmenge zugeführt wird, - in der Hauptamplifikationsstufe (HA) die Genzielsequenz mehreren Haupt- amplifikationszyklen unterworfen wird, - im Rahmen der Hauptamplifikationsstufe (HA) ein Erreichen eines Ver- gleichsmaßes für einen Konzentrationsschwellwert durch eine Istkonzent- ration der Genzielsequenz in der Hauptprobenmenge unter Registrierung einer Anzahl (xha) der durchlaufenen Hauptamplifikationszyklen bei Errei- chen des Vergleichsmaßes überwacht wird, und - anhand der Anzahl (xpa) der Voramplifikationszyklen und eines Werts einer Amplifikationseffizienz (Epa, Eha) ein Korrekturfaktor (xshift) ermittelt wird, der charakteristisch für einen Unterschied der Anzahl (xha) der durchlaufe- nen Hauptamplifikationszyklen zu einem einstufigen PCR-Testverfahren ist. 3. PCR-Testverfahren nach Anspruch 2, wobei anhand der Anzahl (xha) der durchlaufenen Hauptamplifikationszyklen und dem Korrekturfaktor (xshift) ein Wert für eine Vergleichsgröße (xkorr) für die Gesamtzahl an Amplifikationszyklen zum Vergleich mit einem einstufigen PCR-Testverfahren bestimmt wird. 4. PCR-Testverfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Korrekturfaktor (xshift) unter der Annahme ermittelt wird, dass der gleiche Wert der in der Hauptamplifikationsstufe (HA) bei Erreichen des Ver- gleichsmaßes des Konzentrationsschwellwerts vorliegenden Istkonzentration auch bei dem einstufigen PCR-Testverfahren zum Erreichen eines korres- pondierenden Vergleichsmaßes für den Konzentrationsschwellwert führt. 5. PCR-Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Teil der Probe nach der Voramplifikationsstufe (PA) um einen Ver- dünnungsfaktor (d) zu einer Zwischenprobenmenge verdünnt wird, und (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023 FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 24 wobei zumindest ein Teil der Zwischenprobenmenge der Hauptamplifikati- onsstufe (HA) als Hauptprobenmenge zugeführt wird. 6. PCR-Testverfahren nach Anspruch 5, wobei der Korrekturfaktor (xshift) zusätzlich anhand der Verdünnungsfaktors (d) ermittelt wird. 7. PCR-Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Korrekturfaktor (xshift) anhand der Formel ^ ln71 + ^ 8 − ln 2 ^ = +^ +^ ^^6^ ln(1 + ^^^) ermittelt wird, wobei xpa die Anzahl der Voramplifikationszyklen, Epa die Amp- lifikationseffizienz der Voramplifikationsstufe (PA), Eha die Amplifikationseffi- zienz der Hauptamplifikationsstufe (HA) und d einen Verdünnungsfaktor wie- dergeben. 8. PCR-Testverfahren nach Anspruch 7, wobei der Korrekturfaktor (xshift) unter der Annahme, dass die Amplifikations- effizienzen (Epa, Eha) der Voramplifikationsstufe (PA) und der Hauptamplifika- tionsstufe (HA) zumindest annähernd gleich ist, anhand der Formel
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ermittelt wird, wobei xpa die Anzahl der Voramplifikationszyklen, E die ge- meinsame Amplifikationseffizienz und d den Verdünnungsfaktor wiederge- ben. 9. PCR-Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Korrekturfaktor (xshift) als vorgegebener Offset für einen spezifi- schen mikrofluidischen Probenträger hinterlegt wird. 10. PCR-Testsystem (1), aufweisend ein PCR-Testgerät (2) und eine Anzahl von mikrofluidischen Probenträgern (4), (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023 FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 25 wobei das PCR-Testgerät (2) umfasst: - eine Aufnahmevorrichtung für wenigstens einen mikrofluidischen Proben- träger (4), - eine Heizvorrichtung (10) zur wenigstens lokal auf einen Teilbereich des Probenträgers (4) gerichteten Wärmezufuhr auf den Probenträger (4), - ein Steuergerät (40), das dazu eingerichtet ist, die Heizvorrichtung (10) zur zyklischen Erwärmung des Teilbereichs des Probenträgers (4) anzu- steuern, - eine Einlesevorrichtung (44) zum Einlesen oder eine Eingabevorrichtung zur Eingabe von, den spezifischen Probenträger (4) betreffenden, Prozes- sinformationen (Epa, Eha, xpa, d), wobei das Steuergerät (40) dazu eingerichtet ist, ein mehrstufiges PCR- Testverfahren, insbesondere gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, selbsttätig durchzuführen und anhand der eingelesenen Prozessinformationen (Epa, Eha, xpa, d) einen Korrekturfaktor (xshift) zu ermitteln, der charakteristisch für einen Unterschied einer Anzahl (xha) an durchlaufenen Hauptamplifikationszyklen gegenüber einem einstufigen PCR-Testverfahren ist, sowie vorzugsweise an- hand der Anzahl (xha) der durchlaufenen Hauptamplifikationszyklen und des Korrekturfaktors (xshift) einen Wert für eine Vergleichsgröße (xkorr) für die Ge- samtzahl an Amplifikationszyklen zum Vergleich mit dem einstufigen PCR- Testverfahren zu bestimmen. 11. PCR-Testsystem (1) nach Anspruch 10, wobei die Prozessinformationen den Korrekturfaktor (xshift) und/oder zumin- dest einen Verdünnungsfaktor (d) enthalten, der wiedergibt, um welches Maß ein Teil der im Probenträger (4) vorgehaltenen Probe nach einer Voramplifi- kationsstufe (PA) zu einer Zwischenprobenmenge verdünnt wird. 12. PCR-Testsystem (1) nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Prozessinformationen (Epa, Eha, xpa, d) in einer maschinenlesbar codierten Form an dem jeweiligen Probenträger (4) vorgehalten sind. 13. PCR-Testsystem (1) nach Anspruch 12, (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023 FDST Patentanwälte, Nürnberg Seite 26 wobei die Prozessinformationen (Epa, Eha, xpa, d) in einem optoelektronisch auslesbaren Code (34), insbesondere einem 1D- oder 2D-Code, codiert auf eine Oberfläche des Probenträgers (4) aufgebracht sind, und wobei die Ein- lesevorrichtung (44) durch eine entsprechend ausgebildete optische Scaneinheit ausgebildet ist. 14. PCR-Testsystem (1) nach Anspruch 12, wobei die Prozessinformationen (Epa, Eha, xpa, d) in einem nach dem RFID- Standard ausgebildeten Chip hinterlegt und an dem Probenträger (4) ange- bracht sind, und wobei die Einlesevorrichtung durch einen entsprechend aus- gebildeten Transceiver ausgebildet ist. 15. PCR-Testsystem (1) nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei die Prozessinformationen eine Vorgabe zur Anzahl (xpa) von Vorampli- fikationszyklen enthält und wobei das Steuergerät (40) dazu eingerichtet ist, das mehrstufige PCR-Testverfahren in Abhängigkeit der Vorgabe zur Anzahl (xpa) von Voramplifikationszyklen durchzuführen. (\\fs2012\gsi-software\winpat5\document\amt\3857866.docx) letzte Speicherung: 22. September 2023
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111926111A (zh) * 2020-06-11 2020-11-13 北京健云康生物信息科技有限公司 常见五十五种呼吸道病原体高通量鉴别检测方法
WO2022033815A1 (de) * 2020-08-14 2022-02-17 SpinDiag GmbH Kartusche für ein rotationsbasiertes und einen einseitigen wärmeeintrag nutzendes analyseverfahren, rotationsbasiertes analyseverfahren und verwendung einer kartusche

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111926111A (zh) * 2020-06-11 2020-11-13 北京健云康生物信息科技有限公司 常见五十五种呼吸道病原体高通量鉴别检测方法
WO2022033815A1 (de) * 2020-08-14 2022-02-17 SpinDiag GmbH Kartusche für ein rotationsbasiertes und einen einseitigen wärmeeintrag nutzendes analyseverfahren, rotationsbasiertes analyseverfahren und verwendung einer kartusche

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
N. ARNHEIM U. H. ERLICH, ANNU. REV. BIOCHEM., vol. 61, 1992, pages 131 - 156
PERERA R. A. ET AL.: "Serological assays for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2", EURO SURVEILL, vol. 25, no. 16, March 2020 (2020-03-01), pages 2000421
VAN BEEK J. ET AL.: "From more testing to smart testing: data-guided SARS-CoV-2 testing choices", EURO SURVEILL. 2022, vol. 27, no. 8, May 2020 (2020-05-01), pages 2100702
WOLFEL R. ET AL.: "Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019", NATURE, vol. 581, 2020, pages 465 - 469, XP055834951, DOI: 10.1038/s41586-020-2196-x
YUAN JOSHUA S ET AL: "Statistical analysis of real-time PCR data", BMC BIOINFORMATICS, BIOMED CENTRAL , LONDON, GB, vol. 7, no. 1, 22 February 2006 (2006-02-22), pages 85, XP021013977, ISSN: 1471-2105, DOI: 10.1186/1471-2105-7-85 *

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