DE102020213472A1

DE102020213472A1 - Mikrofluidische Analysevorrichtung und Verfahren zu ihrem Betrieb

Info

Publication number: DE102020213472A1
Application number: DE102020213472.3A
Authority: DE
Inventors: Franz Laermer; Martina Budde; Stefanie Wagner; Daniel Sebastian Podbiel; Anke Detzer; Yvonne Beyl; Jochen Hoffmann
Original assignee: Robert Bosch GmbH
Current assignee: Robert Bosch GmbH
Priority date: 2020-10-27
Filing date: 2020-10-27
Publication date: 2022-04-28
Also published as: US20240018568A1; WO2022090273A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine mikrofluidische Analysevorrichtung und ein Verfahren zum Betreiben der mikrofluidischen Analysevorrichtung. Das Verfahren umfasst ein Bereitstellen einer Probe, welche DNA enthält, ein Durchführen (1) einer PCR-Voramplifikation der Probe, ein Aufteilen (2) der Probe auf wenigstens zwei Reaktionskompartimente, und ein Durchführen (3) jeweils wenigstens eines Singleplex-Nachweises in den wenigstens zwei Reaktionskompartimenten. Der Singleplex-Nachweis wird jeweils mittels eines isothermalen Amplifikationssystems durchgeführt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Betreiben einer mikrofluidischen Analysevorrichtung. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung eine mikrofluidische Analysevorrichtung, die eingerichtet ist, um mittels des Verfahrens betrieben zu werden.
Stand der Technik
Mikrofluidische Analysevorrichtungen, die auch als Lab-on-Chips (LoCs) bezeichnet werden, ermöglichen ein automatisiertes, zuverlässiges, schnelles, kompaktes und kostengünstiges Prozessieren von Proben für die medizinische Diagnostik. Durch die Kombination einer Vielzahl von Operationen für die kontrollierte Manipulation von Fluiden können komplexe molekulardiagnostische Testabläufe auf einer Kartusche einer mikrofluidischen Analysevorrichtung durchgeführt werden.
Bei der molekulardiagnostischen Analyse einer Probe soll diese bei hoher Sensitivität auf eine Vielzahl von genetischen Merkmalen untersucht werden. Dies wird als multiplexer Nachweis verschiedener Gentargets beziehungsweise Nukleinsäuresequenzen bezeichnet. Dies kann auf der Grundlage von Amplifikationsreaktionen zur gezielten Vervielfältigung von vorgegebenen Nukleinsäuresequenzen, wie insbesondere der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), erfolgen. Eine sogenannte Nested-PCR basiert auf einem zweistufigen Nachweis der Gentargets. Dabei werden zunächst längere DNA-Sequenzen, welche durchaus mehrere DNA-Targets umfassen können, in einer PCR-Voramplifikation vervielfältigt. Daraufhin erfolgt eine Verdünnung, Aliquotierung und Verteilung der Reaktionsmischung mit den amplifizierten Nukleinsäuresequenzen auf eine Vielzahl von Reaktionskompartimenten, in denen jeweils Target-spezifische Primer für einen PCR-Nachweis im Singleplex-Format vorliegen. Durch die Kombination aus Multiplex-Voramplifikation und einem Nachweis der Targets im Singleplex-Format, kann einerseits eine hohe Sensitivität und andererseits ein hoher Multiplexgrad erreicht werden.
Für die Durchführung der einzelnen Singleplex-PCR Nachweisreaktionen ist allerdings eine präzise zeitgesteuerte Temperierung der einzelnen Reaktionskompartimente notwendig, was eine gute thermische Anbindung der Reaktionskompartimente an wenigstens eine externe Heiz- und/oder Kühlvorrichtung voraussetzt. Polymermaterialien, wie sie für eine kostengünstige Herstellung von Kartuschen mikrofluidischer Analysevorrichtungen zum Einsatz kommen, weisen allerdings üblicherweise nur eine geringe Wärmeleitfähigkeit auf. Dies führt zu langen Aufwärm- und Abkühlzeiten und damit zu einem insgesamt hohen Zeitaufwand für einen derartigen PCR-Nachweis.
Offenbarung der Erfindung
In dem Verfahren zum Betreiben einer mikrofluidischen Analysevorrichtung wird zunächst eine Probe bereitgestellt, welche DNA enthält. Hierbei handelt es sich insbesondere um eine Patientenprobe. Ist die in dem Verfahren zu amplifizierende Zielnukleinsäure eine Ribonukleinsäure (RNA), so wird vor dem Bereitstellen der Probe zunächst eine reverse Transkription durchgeführt, welche die RNA in DNA umschreibt. Anschließend wird eine PCR-Voramplifikation der Probe durchgeführt, um eine ausreichende Menge an DNA für eine anschließende Durchführung von Singleplex-Nachweisen zu erzeugen. Gegebenenfalls kann eine Verdünnung der Probe erfolgen, bevor im nächsten Schritt ein Aufteilen beziehungsweise eine Aliquotierung der Probe auf wenigstens zwei Reaktionskompartimente vorgenommen wird. In den Reaktionskompartimenten wird dann jeweils wenigstens ein Singleplex-Nachweis durchgeführt. Insofern entsprechen die Schritte des Verfahrens einem herkömmlichen Betrieb einer mikrofluidischen Analysevorrichtung unter Verwendung einer Multiplex-Voramplifikation und mehrerer Singleplex-Nachweise.
Jedoch wurde festgestellt, dass das Problem langer Aufwärm- und Abkühlzeiten in einem derartigen Verfahren überwunden werden kann, indem die Singleplex-Nachweise jeweils mittels eines isothermalen Amplifikationssystems durchgeführt werden. Auf diese Weise ist keine zyklische Temperierung der Vielzahl von Reaktionskompartimenten mehr erforderlich. Es ist also unproblematisch, wenn das Material der mikrofluidischen Analysevorrichtung, welches die Reaktionskompartimente umgibt, nur eine geringe Wärmeleitfähigkeit aufweist und/oder von einem Material umgeben wird, welches nur eine geringe Wärmeleitfähigkeit aufweist. Auf diese Weise ergibt sich ein bedeutender Vorteil gegenüber dem Stand der Technik.
Durch eine Durchführung der isothermalen Nachweise im Singleplex-Format ist ein besonders einfaches Design der isothermalen Nachweisreaktionen möglich. Die voneinander unabhängige Durchführung der einzelnen Singleplex-Nachweisreaktionen erlaubt eine besonders einfache Anpassung des Detektionspanels eines Assays durch ein Hinzufügen oder Austauschen von Singleplex-Nachweisreaktionen. Ferner wird eine besonders einfache Anpassung des Detektionspanels ermöglicht durch ein simples Hinzufügen oder Austauschen entsprechender Primer-Paare bei der PCR-Voramplifikation, was sich insbesondere daraus ergibt, dass die PCR-Voramplifikation nur mit geringer Verstärkung arbeitet und daher unterschiedliche Verstärkungsfaktoren für einzelne Reaktionsprodukte nicht so stark ins Gewicht fallen wie bei einer PCR-Voramplifikation, die tief in die Sättigung hineingesteuert wird.
Beispielsweise geeignete isothermale Amplifikationssysteme, die in dem Verfahren für die Durchführung der Singleplex-Nachweise verwendet werden können, sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SDA (Strand Displacement Amplification), RPA (Recombinase Polymerase Amplification), LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification), RCA (Rolling Cycle Amplification), MDA (Multidisplacement Amplification), NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), HDA (Helicase-dependent Amplification), NEAR (Nicking Enzyme Amplification Reaction), NESA (Nicking Endonuclease Signal Amplification) und HCR (Hybridization Chain Reaction).
Es ist bevorzugt, dass die Reaktionskompartimente jeweils ein Volumen von weniger als 1 µl aufweisen. Besonders bevorzugt ist das Volumen kleiner als 100 nl und ganz besonders bevorzugt liegt es im Bereich zwischen 10 nl und 50 nl. Ein so kleines Volumen ist für einen Singleplex-Nachweis in Kombination mit einer Voramplifikation ausreichend, um einen sowohl sensitiven als auch multiplexen Nachweis einer Vielzahl von DNA-Targets zu ermöglichen. Insbesondere kann auf diese Weise ein besonders kleines Volumen einer Probenflüssigkeit für eine Analyse eingesetzt werden. Umgekehrt ist im Zusammenhang mit der mikrofluidischen Prozessierung bereits eine geringe Transfereffizienz bei der Herstellung der mikrofluidischen Reaktionskompartimente ausreichend, um eine Analyse zu ermöglichen. Ferner kann ein derart kleines Volumen bei einer gegebenen Wärmeleitfähigkeit der Flüssigkeit und der Vorrichtung besonders schnell auf die für das isothermale Amplifikationssystem erforderliche Temperatur gebracht werden.
Weiterhin ist es bevorzugt, dass die Probe auf 5 bis 500 Reaktionskompartimente, besonders bevorzugt auf 10 bis 200 Reaktionskompartimente aufgeteilt wird. Dies ermöglicht die Untersuchung der Probe auf eine Vielzahl unterschiedlicher Gentargets. Durch die kleinen Volumina der Reaktionskompartimente ist dies ferner möglich, ohne dass hierzu das Volumen der Gesamtprobe so groß sein müsste, dass dessen Aufheizen oder Abkühlen bei der PCR-Voramplifikation zu einem signifikanten Zeitverlust führen würde.
Das Aufteilen der Probe erfolgt vorzugsweise unter Verwendung eines zumindest teilweise fluorierten Kohlenwasserstoffs. Solche Kohlenwasserstoffe sind chemisch inert und deshalb gut als Transportmedien und/oder für eine thermostabile Versiegelung der Reaktionskompartimente geeignet. Neben vollständig fluorierten Perfluorcarbonen, wie beispielsweise Bis(nonafluorobutyl)-(trifluormethyl)amin (Fluorinert FC-40 der Firma 3M) können insbesondere auch teilweise fluorierte Kohlenwasserstoffe verwendet werden, die neben mindestens einem perfluorierten Rest auch mindestens eine unsubstituierte Alkylgruppe tragen, wie beispielsweise Ethylperfluorheptylether (Novec 7500 der Firma 3M).
Die PCR-Voramplifikation wird in einem Reaktionsvolumen durchgeführt, das bevorzugt im Bereich von 10 µl bis 50 µl und besonders bevorzugt im Bereich von 20 µl bis 30 µl liegt. Ganz besonders bevorzugt beträgt es 25 µl. Ein solches Reaktionsvolumen reicht aus, um eine Vielzahl von Reaktionskompartimenten mit voramplifizierten Probenportionen zu versorgen und kann dennoch schnell erhitzt und abgekühlt werden.
Um eine Vielzahl unterschiedlicher Singleplex-Nachweise durchzuführen, ist es außerdem bevorzugt, dass die PCR-Voramplifikation unter Verwendung von 2 bis 100 Target-spezifischen Primerpaaren durchgeführt wird, besonders bevorzugt unter Verwendung von 5 bis 30 Target-spezifischen Primerpaaren. Die bei der Voramplifikation eingesetzten PCR-Primer können zudem eine vorteilhafte Funktionalität bei einem anschließenden isothermalen Nachweis bereitstellen. Beispielsweise kann die Länge der Primer vorteilhaft ausgelegt werden, um einerseits eine Voramplifikation zu ermöglichen und andererseits zusätzlich beispielsweise eine „Displacement“-Funktionalität bei den isothermalen Nachweisreaktionen bereitzustellen.
Insbesondere erfolgt die Vervielfältigung der Nukleinsäuren im Zuge der Voramplifikation unter Berücksichtigung der Transfereffizienz, welche bei der mikrofluidischen Prozessierung erzielt wird. Auf diese Weise ist bereits eine geringe Transfereffizienz ausreichend, um mittels des Verfahrens - bei hinreichender Voramplifikation - einen sensitiven Nachweis einer Vielzahl von Gen-Targets zu erzielen.
Im Gegensatz zu den isothermalen Amplifikationssystemen der Singleplex-Nachweise, sind für die PCR-Voramplifikation Temperaturzyklen erforderlich. Hierbei durchläuft die PCR-Voramplifikation bevorzugt 5 bis 30 Temperaturzyklen und besonders bevorzugt 12 bis 20 Temperaturzyklen. Dabei erfolgt die Temperaturzyklisierung vorzugsweise, indem die zu amplifizierende Probe zwischen mehreren, insbesondere zwei, Kammern hin und her gepumpt wird, deren Wände auf unterschiedliche konstante Temperaturen gehalten werden. So ist es auch bei einer geringen Wärmeleitfähigkeit der Kammerwände möglich die Temperatur der Probe schnell zu ändern, da die Kammerwände lediglich auf einer konstanten Temperatur gehalten werden müssen und ihre Temperatur nicht zyklisch geändert werden muss.
Schließlich ist es bevorzugt, dass zwischen der PCR-Voramplifikation und dem Aufteilen der Probe, mindestens ein Bestandteil der Probe inaktiviert wird. Das Inaktivieren betrifft insbesondere mindestens ein Bestandteil der Probe, welcher für den isothermalen Nachweis nachteilig ist. Die Inaktivierung kann beispielsweise mittels eines Verdünnens oder Temperierens der Probe, durch eine Änderung der Zusammensetzung ihrer Pufferlösung, insbesondere eine Änderung des pH-Werts der Pufferlösung, durch eine enzymatische Inaktivierung insbesondere von Uracil-haltigen PCR-Primern, durch eine Extraktion von Reaktanden aus der Probe oder durch Extraktion von Amplicons, das heißt von vervielfältigten Nukleinsäuresequenzen, erfolgen.
Die mikrofluidische Analysevorrichtung ist eingerichtet, um mittels des Verfahrens betrieben zu werden. Ihr Substrat, das die Reaktionskammern, in denen das Verfahren durchgeführt wird, begrenzt, kann insbesondere aus einem Polymer, einem Glas, einem Metall oder einem Halbmetall, wie beispielsweise Silicium bestehen. Das Material kann porös sein und/oder eine Oberflächenfunktionalisierung aufweisen. Auch Materialien mit einer schlechten Wärmeleitfähigkeit sind für die Realisierung der mikrofluidischen Analysevorrichtung geeignet, da diese durch das isothermale Amplifikationssystem des Singleplex-Nachweises den Betrieb der mikrofluidischen Analysevorrichtung nicht nennenswert verlangsamen.
Figurenliste
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen dargestellt und werden in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert.

1 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.
2 zeigt ein Ablaufdiagramm eines anderen Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Ausführungsbeispiele der Erfindung
In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung wird eine mikrofluidische Analysevorrichtung betrieben, die für die Durchführung einer Multiplex-PCR-Voramplifikation und mehrerer isothermaler Singleplex-Nachweise eingerichtet ist. Eine bereitgestellte Patientenprobe, welche zu untersuchende DNA-Stränge enthält, wird in eine erste Voramplifikationskammer mit einem Volumen von 25 µl eingeleitet. Wie in 1 dargestellt ist erfolgt zunächst ein Durchführen 1 einer PCR-Voramplifikation der Probe. Dazu wird sie unter anderem mit 20 Target-spezifischen Primerpaaren versetzt und durchläuft anschließend 15 Temperaturzyklen. Hierzu wird sie zwischen der ersten Voramplifikationskammer und einer zweiten Voramplifikationskammer, welche dasselbe Volumen aufweist, hin und her gepumpt. Die erste Voramplifikationskammer wird auf eine erste Temperatur geheizt und die zweite Voramplifikationskammer auf eine zweite Temperatur gebracht. Nach Abschluss der PCR-Voramplifikation erfolgt ein Aufteilen 2 der Probe auf 100 mikrofluidische Reaktionskompartimente mit einem Volumen von jeweils 25 nl. Die Reaktionskompartimente sind als Mikrokavitäten ausgeführt. Fluorinert FC-40 wird als Transport- und Trennmedium verwendet. Der nicht auf Reaktionskompartimente aufgeteilte Rest der Probe wird verworfen oder anderweitig analysiert.
Schließlich erfolgt ein Durchführen 3 von jeweils wenigstens eines Singleplex-Nachweises in den Reaktionskompartimenten. Hierzu wird beispielsweise SDA als isothermales Amplifikationssystem verwendet. Der Nachweis der unterschiedlichen für die jeweiligen Reaktionskompartimente vorgegebenen Gentargets erfolgt beispielsweise fluoreszenzbasiert.
In einem zweiten Ausführungsbeispiel des Verfahrens, das in 2 dargestellt ist, erfolgt nach dem Durchführen 1 der PCR-Voramplifikation und vor dem Aufteilen 2 der Probe ein Inaktivieren 12 von Bestandteilen der Probe, welche sich negativ auf die isothermale Amplifikation mittels SDA auswirken würden. Dazu wird die Zusammensetzung der Pufferlösung so geändert, dass sich ihr pH-Wert ändert und Enzyme inaktiviert werden.

Claims

Verfahren zum Betreiben einer mikrofluidischen Analysevorrichtung, umfassend die folgenden Schritte: - Bereitstellen einer Probe, welche DNA enthält, - Durchführen (1) einer PCR-Voramplifikation der Probe, - Aufteilen (2) der Probe auf wenigstens zwei Reaktionskompartimente, und - Durchführen (3) jeweils wenigstens eines Singleplex-Nachweises in den wenigstens zwei Reaktionskompartimenten, dadurch gekennzeichnet, dass der Singleplex-Nachweis jeweils mittels eines isothermalen Amplifikationssystems durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das isothermale Amplifikationssystem ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SDA, RPA, LAMP, RCA, MDA, NASBA, HDA, NEAR, NESA und HCR.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionskompartimente jeweils ein Volumen von weniger als 1 µl aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe auf 2 bis 500 Reaktionskompartimente aufgeteilt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Aufteilen (2) der Probe unter Verwendung eines zumindest teilweise fluorierten Kohlenwasserstoffs erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die PCR-Voramplifikation in einem Reaktionsvolumen im Bereich von 10 µl bis 50 µl durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die PCR-Voramplifikation unter Verwendung von 2 bis 100 Target-spezifischen Primerpaaren durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die PCR-Voramplifikation zyklisch unter Durchlaufen von 5 bis 30 Temperaturzyklen durchgeführt wird, wobei die Probe zwischen mehreren Kammern hin und her gepumpt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der PCR-Voramplifikation und dem Aufteilen der Probe mindestens ein Bestandteil der Probe inaktiviert wird (12).
Mikrofluidische Analysevorrichtung, dadurch gekennzeichnet, dass sie eingerichtet ist, um mittels eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9 betrieben zu werden.