DE19634226A1 - Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuremolekülen in niedriger Konzentration - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuremolekülen in niedriger Kon­ zentration in zu untersuchenden Proben mittels Amplifi­ kationsreaktionen unter Verwendung von Polymerasen sowie unmarkierten und markierten Primern.

Ein derartiges Amplifikationsverfahren ist für die molekulare Diagnostik, insbesondere für die Pathogendiagnostik, von großer Bedeutung. Eine Vielzahl von Techniken ist beschrieben worden, die geringe Mengen an spezifischer Nukleinsäure nachzuweisen vermögen. Dem erfindungsgemäßen Verfahren ähnlich ist der 5′-Nuklease-Assay (die sogenannte TaqMan- Polymerase-Chain-Reaction; Livak et al. in PCR Methods and Applications 4 (1995) 357-361). Die Basis dieser Methode ist ein am 5′-Ende mit einem Reportermolekül (Fluorescein) und am 3′-Ende mit einem Quenchermolekül (Rhodamin) mar­ kiertes Oligonukleotid, welches am 3′-Ende zudem über einen Phosphatrest gegen eine enzymatische Kettenverlängerung geschützt ist. Im Verlauf der PCR-Reaktion wird die Sonde von der 5′-3′-Exonukleaseaktivität der verwendeten Taq- Polymerase erkannt, wenn sie downstream zu einer primer­ gestarteten Polymerase-Reaktion an die zu amplifizierende Matrize hybridisiert hat. In der Folge sorgt die 5′-3′- Exonukleaseaktivität für die Hydrolyse des 5′-Endes der Sonde, wodurch die Fluoreszenz-Emission des Fluorescein- Reporters ansteigt, da sie nicht länger durch die Nachbar­ schaft des Rhodamins gelöscht wird. Gravierende Nachteile dieses Verfahrens sind die sehr aufwendige und kosten­ intensive Präparation der doppeltmarkierten und endgruppen­ geschützten Oligonukleotide, die Beteiligung der enzymatischen Hydrolyse und der Einfluß von Medieneffekten auf die Fluoreszenzausbeute, d. h. die Quantifizierbarkeit.

Das der Erfindung zugrundeliegende Problem besteht darin, ein universell einsetzbares, leicht handhabbares und preis­ wertes Verfahren zur qualitativen und quantitativen Detektion von kleinsten Mengen an Nukleinsäure bereitzustellen. Es ist hierbei insbesondere im Hinblick auf die Diagnostik in­ fektiöser Pathogene wünschenswert, daß das gesamte Verfahren in Kompartimenten ablaufen kann, die nach der Zugabe der Probe verschlossen werden und im Laufe des Verfahrens nicht wieder geöffnet werden müssen.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1. Die Unteransprüche 2 bis 10 betreffen bevorzugte Ausführungs­ formen des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur Bestimmung von Nukleinsäuremolekülen in niedrigen Konzentrationen in zu untersuchenden Proben. Dabei werden Amplifikationsreaktionen eingesetzt. Diese verwenden Polymerasen sowie unmarkierte Primer (Amplifikationsprimer) und markierte Primer (Detektionsprimer). Die markierten Primer hybridisieren an die Nukleinsäure und/oder werden durch die Amplifikations­ reaktion in die amplifizierte Nukleinsäure eingebaut, wobei die Konzentration der freien Detektionsprimer abnimmt. Die Abnahme dieser Konzentration wird gemessen und als Maß für das Vorhandensein des zu bestimmenden Nukleinsäuremoleküls herangezogen.

Vorzugsweise sind die markierten Primer mit fluoreszierenden Gruppen markiert. Als Amplifikationsreaktionen kommen ins­ besondere Primer abhängige Reaktionen wie die Polymerase­ kettenreaktion (PCR), Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR), isothermale 3SR (self-sustained sequence replication), Strand Displacement Amplification (SDA) und/oder Nucleic Acid Sequence-based Amplification (NASBA) in Betracht.

Wird die Abnahme der Konzentration der markierten Primer, wie erfindungsgemäß bevorzugt wird, mittels fluoreszenz­ markierter Primer gemessen, ist die Fluoreszenzkorrelations­ spektroskopie (FCS) einsetzbar, um ein Maß für das Vorhanden­ sein des zu bestimmenden Nukleinsäuremoleküls zu ermitteln. Bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Amplifikationstechniken mit der Detektionsmethode Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie gekoppelt. Das er­ findungsgemäße Verfahren erlaubt somit die Realisierung einer Endpunkttitration, wobei die nachzuweisende Sequenz während der Reaktion stufenweise oder kontinuierlich amplifiziert wird. Der Endpunkt dieser als Endpunkttitration auffaßbaren Reaktion ist erreicht, wenn der erfindungsgemäß zu ver­ wendende Detektionsprimer durch Inkorporation in die neue synthetisierte Nukleinsäure verbraucht ist, bzw. eine weitere Abnahme der Konzentration des Detektionsprimers nicht mehr feststellbar ist oder einen vorher festlegbaren, zweckmäßigen Wert erreicht hat.

Vorzugsweise wird dabei eine Polymerase ohne 5′-3′-Exo­ nukleaseaktivität verwendet. Anderenfalls würde die Sonde wie im Ansatz gemäß Livak et al. abgebaut. Die Polymerasen sind kommerziell erhältlich.

Erfindungsgemäß ist es jedoch auch möglich, auf eine Ex­ tension des Detektionsprimers während des Verfahrens zu verzichten. Dies kann z. B. durch Verwendung eines Didesoxy­ nukleotides am 3′-Ende des Detektionsprimers oder durch die Verwendung von markierten PNA als Detektionsprimern erfolgen. Erfindungsgemäß ist auch der Anstieg der Diffusionszeiten des Detektionsprimers durch Hybridisierung an die amplifi­ zierte Nukleinsäure ausreichend für eine reproduzierbare FCS-Detektion.

Die erfindungsgemäße Maßnahme, die Abnahme der Konzentration der markierten Primer zu messen und als Maß für das Vor­ handensein des zu bestimmenden Nukleinsäuremoleküls heranzu­ ziehen, beruht auf der Tatsache, daß zu Beginn der Reaktion der Detektionsprimer sich in einem Zustand hoher Mobilität befindet, während er am Ende der Reaktion durch die Hybridi­ sierung bzw. durch die Amplifikationsreaktion (Einbau in ein Amplifikationsprodukt) weitgehend bis vollständig in einen Zustand niedriger Mobilität überführt wird. Diese Mobilitäts­ änderung läßt sich in besonders geeigneter Weise durch die Methode der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie messen, wobei die Probe im geschlossenen Kompartiment verbleiben kann. Es kann erfindungsgemäß bevorzugt sein, die Kon­ zentration des Detektionsprimers als gering im Verhältnis zur Konzentration des Amplifikationsprimers zu wählen. Insbesondere kann die Konzentration des Amplifikationsprimers das 5- bis 200-fache der Konzentration des Detektionsprimers betragen.

Aus der vorzugsweise mit der Fluoreszenzkorrelations­ spektroskopie ermittelten Korrelationskurve lassen sich sowohl die Anzahl der fluoreszierenden Moleküle, das relative Verhältnis fluoreszenzmarkierter Moleküle unterschiedlicher Größe als auch ihre Diffusionsmobilitäten schnell und zuver­ lässig ermitteln. Das erfindungsgemäße Verfahren in Form einer Endpunkttitration und/oder Hybridisierung weist durch entsprechende Wahl und Konzentration der fluoreszenz­ markierten Primer nur die Anwesenheit der gesuchten Sequenz, welche eine zum Detektionsprimer komplementäre Sequenz aufweist, nach.

Das Verfahren ist unempfindlich gegenüber unspezifischen Amplifikationen. Eine hohe Konzentration an Amplifikations­ primer ist wünschenswert, um eine sichere Amplifikation auch geringer Mengen an nachzuweisenden Nukleinsäuren zu gewähr­ leisten. So kann zum Beispiel die Konzentration des Amplifi­ kationsprimers 0,5 µM betragen, während der Detektionsprimer vorzugsweise in einer Konzentration von 1 bis 10 nM vorliegt. Aus der entsprechenden Wahl unterschiedlicher Konzentrationen für Amplifikationsprimer und Detektionsprimer ergeben sich insbesondere die folgenden Vorteile. Bei der Amplifikations­ reaktion wie der PCR muß es zu Assoziationsreaktionen zwischen Primer und Template kommen, um die Primer-Elongation zu starten. Diese Reaktionen haben normalerweise Geschwindig­ keitskonstanten von k_R = 10⁴-10⁶ M^-1s^-1. Im Zeitbereich von Sekunden bis Minuten kommt es gemäß der Beziehung 1/t = k_R (C_primer + C_template) nennenswert zu Komplexbildungen, wenn einer der Partner im Bereich von 0,1 bis 1 µM vorliegt. Dies gilt nur für bereits hohe Templatekonzentrationen bzw. für die Reaktion mit den Amplifikationsprimern. Erst wenn die Kon­ zentration entsprechend hoch ist, kommt es zur gewünschten und spezifischen Hybridisierung mit dem Detektionsprimer, der sich dann in einer der erfindungsgemäßen Ausführungs­ formen in wenigen Amplifikationsschritten in gewünschter Weise verbraucht und nahezu vollständig durch Kettenver­ längerung in Amplifikate überführt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere in Kombination mit Probenträgern wie z. B. Polycarbonat-Folien, welche sich durch folgende Vorzüge auszeichnen. Sie sind

• a) chemisch inert
• b) fest verschließbar (keine Kontaminationseffekte, keine Verdampfung)
• c) nicht fluoreszierend
• d) von relativ geringer Dicke (10 bis 20 µm im Bereich der Probenflüssigkeit)
• e) von relativ hoher Wärmeleitung.

Bevorzugt lassen sich Folien mit 96 oder 384 Kompartimenten verwenden. Die Folien werden mit Testflüssigkeit und Proben­ flüssigkeit in ca. 5 bis 20 µl Portionen befüllt und ver­ schlossen. Die Lösungen werden als kleine Tropfen durch Kapillarkräfte im oberen Teil der Folie fixiert, in der das Kompartiment eine für die FCS-Methode erforderliche Wand­ stärke von 10 bis 20 µm besitzt. Die Folien lassen sich in einen thermostatisierbaren Rahmen einpassen. Sie werden mit einer dünnen Schicht Immersionsflüssigkeit für das im FCS-Detektionsverfahren zu verwendende Objektiv benetzt. Die Kompartimente lassen sich insbesondere für Verdünnungsreihen, Screenings oder auch für unterschiedliche Testtypen ein­ setzen. Die typische Meßzeit für eine Folie mit 96 Kom­ partimenten liegt im Bereich weniger Minuten bis maximal einer halben Stunde. Durch Mitführung geeigneter Standard­ verdünnungen des Templates in der gleichen Folie ist die Quantifizierung der zu detektierenden Nukleinsäure in den Testkompartimenten möglich.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich bei Verwendung geeigneter Detektionsprimer auch zum Nachweis von Punkt­ mutationen, Translokationen, Deletionen oder Haplotyp- Differenzierung. Es ist zudem im Sinne einer Multiplex-PCR einsetzbar. Bei erblichen Stoffwechselkrankheiten, wie z. B. der autosomal rezessiven zystischen Fibrose, lassen sich durch Verwendung zweier Detektionsprimer mit unterschied­ lichen Farbstoffmarkern heterozygote Patienten von homo­ zygoten Patienten unterscheiden. Es ist zudem sowohl zum Nachweis von DNA- als auch RNA-Genomen geeignet (letzteres z. B. durch Einsatz in einer RT-PCR oder 3SR-Reaktion).

Die Fig. 1 betrifft eine schematische Darstellung des er­ findungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung der PCR.

Die Fig. 2 beschreibt die Verschiebung der Korrelationskurve G(t) bei Anwesenheit der angegebenen initialen Template- Mengen.

Die Fig. 3 betrifft die Darstellung der invertierten Korrelationsfunktion in der Form (G(t=0)-1)/(G(t)-1).

Die Fig. 4a zeigt die im Ausführungsbeispiel 1 durch FCS-Analyse erhaltenen Autokorrelationsfunktionen G(t).

Die Fig. 4b zeigt die Auftragung dieser Daten in lineari­ sierter Form.

Die Fig. 5 verdeutlicht die Änderung der relativen Diffusionszeiten des Detektionsprimers im Verlauf der Ampli­ fikationsreaktion gemäß Ausführungsbeispiel 1.

Die Fig. 6a und b verdeutlichen das Detektionslimit des erfindungsgemäßen Verfahrens bei Anwendung auf das Aus­ führungsbeispiel 1.

Die Fig. 7 zeigt den erfindungsgemäßen Einsatz eines Detektionsprimers während der NASBA im Ausführungsbeispiel 2.

Die Fig. 8 zeigt die Lokalisation der verwendeten Primer innerhalb der gag Region des HIV-1 Genomes.

Die Fig. 9 zeigt einen typischen Zeitverlauf der Ver­ schiebung der Korrelationskurven aufgrund der Hybridisierung und Extension des Detektionsprimers im Ausführungsbeispiel 2.

Die Fig. 10 verdeutlicht die Kinetik der Hybridisierungs/ Extensionsreaktion des Detektionsprimers im Ausführungsbei­ spiel 2.

Die Fig. 1 beschreibt schematisch das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung der PCR. Die in der PCR ver­ wendeten Amplifikationsprimer p1 und p2 sind als Pfeile dargestellt, der Detektionsprimer p3 ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Kreis) gekoppelt. Der linke Teil der Figur zeigt amplifizierte Artefakte bei Abwesenheit des Templates. Hierbei kann es sich z. B. um Primerdimere der hochkonzentrierten Primer p1 und p2 handeln. Die rechte Seite der Figur zeigt p2 in Anwesenheit des Templates. Erst wenn die Amplifikate in genügend hoher Konzentration vorliegen, wirkt das Amplifikat als Template für den niedrigkonz­ entrierten, fluoreszenzmarkierten Detektionsprimer. Die Mobilitätsänderung des Primers läßt sich deutlich durch eine Verschiebung der Korrelationskurve erkennen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielte Ergebnisse an Mycobacterium tuberculosis sind in den Fig. 2 und 3 dargestellt. Der Nachweis dieses pathogenen Erregers dauerte bislang aufgrund der aufwendigen Zellkulturverfahren ca. 3 bis 4 Wochen. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens läßt sich diese Nachweiszeit stark verkürzen.

In der Fig. 2 wird die Verschiebung der Korrelationskurve G(t) bei Anwesenheit der angegebenen initialen Template- Mengen gezeigt. Die jeweils angegebene Anzahl von Template­ molekülen wurde zu Beginn der Reaktion in jeweils 50 µl Reaktionsansatz vorgelegt, durch das erfindungsgemäße Ver­ fahren in 32 PCR-Zyklen amplifiziert und mittels der FCS-Methode analysiert. Es wurde ein für den Tuberkuloseerreger Mycobacterium tuberculosis charakteristisches Template verwendet. Die Detektionsgrenze lag hier bei 100 Template­ molekülen pro Ansatz. Das Verfahren ist damit empfindlich genug, um in jeder molekulardiagnostischen Anwendung einge­ setzt zu werden.

Die Fig. 3 zeigt die Auftragung der invertierten Korre­ lationsfunktion in der Form (G(t=0)-1)/((G(t)-1). In dieser Darstellung wurden die gleichen Daten wie in Fig. 2 ver­ wendet. Durch die invertierte Auftragung sind die Kurven im betrachteten Zeitbereich linearisiert, wodurch ihre Inter­ pretation erleichtert wird. Eine Verschiebung von G(t) entlang der t-Achse zeigt sich in dieser Darstellung als Abflachung der Steigung, die durch lineare Regression in einfacher Weise erhalten werden kann. Die Detektionsgrenze läßt sich deutlich als 100 Templatemoleküle pro Reaktions­ ansatz erkennen.

Die Fig. 4a zeigt die durch FCS-Analyse erhaltenen Auto­ korrelationsfunktionen G(t) mit zunehmender Anzahl an PCR-Zyklen der für Mycobacterium tuberculosis und M. bovis spezifischen Targetsequenz IS6110 (Ausführungsbeispiel 1). Die PCR-Amplifikation eines 106 bp-Segmentes, ausgehend von 10⁵ Strängen der genomischen Mycobacterium tuberculosis DNA vor einem Hintergrund von 2.5 µg unspezifischer humaner Placenta-DNA in 50 µl Reaktionsvolumen, erfolgte unter Verwendung des Primerpaares S1/S2 als Amplifikationsprimer und 10 nM TMR-markierter Sonde PR1 als Detektionsprimer (Tabelle 1). Der Detektionsprimer bindet zwischen den Ampli­ fikationsprimern mit derselben Orientierung wie der Amplifi­ kationsprimer S2 und überlappt mit dem 3′-Ende von S2 um fünf Nukleotide. Die Amplifikationsreaktionen wurden nach einer unterschiedlichen Zahl an Zyklen gestoppt. Die Inkorporation des Detektionsprimers in die Amplifikate ist an der Ver­ schiebung der Autokorrelationskurve zu längeren Korre­ lationszeiten, welche einer Zunahme der Diffusionszeit des Detektionsprimers entspricht, deutlich erkennbar.

Die Fig. 4b zeigt die Auftragung der Daten in der lineari­ sierten Form [G(t=0)]/[G(t)]. Mit zunehmender Amplifikation ist eine Abnahme der Geradensteigung zu beobachten.

Die Fig. 5 verdeutlicht die Änderung der relativen Diffusionszeiten des Detektionsprimers im Verlauf der Ampli­ fikationsreaktion. Die Diffusionszeiten des Detektionsprimers spiegeln eindeutig die PCR-Amplifikationskinetik mit einer vor Erreichen des Detektionsgrenzwertes initialen lag-Phase, schneller exponentieller Anreicherung der Amplifikations­ produkte sowie einer Plateauphase wider. Dieses Plateau zeigt eine Sättigung an, welche dem Endpunkt einer Titration vergleichbar ist. Die abnehmende Anzahl der durchschnittlich sich im Laserfokus befindlichen Moleküle des Detektions­ primers mit zunehmender Zahl der Temperaturzyklen ist vermut­ lich auf Adsorptionseffekte an den Wänden der Reaktionsgefäße zurückzuführen (Nebenbild der Fig. 5). Zudem ist eine scheinbare Zunahme emittierter Photonen pro Molekül und Sekunde zu beobachten (Nebenbild der Fig. 5).

Die Fig. 6a und 6b verdeutlichen das Detektionslimit des erfindungsgemäßen Verfahrens bei Anwendung auf das Aus­ führungsbeispiel 1. Die PCR-Amplifikationsreaktionen wurden unter Verwendung unterschiedlicher Amplifikations- und Detektionsprimer durchgeführt (Tabelle 1). Vor einem Hinter­ grund von 2.5 µg unspezifischer humaner Plazenta-DNA in 50 µl Reaktionsvolumen wurde eine konstante Anzahl an PCR-Zyklen (entweder 36 oder 40 Zyklen) mit jeweils unterschiedlichen Ausgangskonzentrationen an Targetgenomen durchgeführt. Bei Verwendung der Amplifikationsprimer S1/S2 mit 1 nM Detektionsprimer PR1 (Fig. 6a) oder der Amplifikationsprimer B1B/B2B mit 5 nM Detektionsprimer PR3 (Fig. 6b) liegt das Detektionslimit unterhalb von 100 Mycobacterium tuberculosis Genomen. Eine Quantifizierung von bis zu lediglich 10 Target­ genomen kann durch Vergleich mit einem Verdünnungsstandard erfolgen. Die mittels FCS bestimmten Diffusionszeiten des Detektionsprimers stimmen gut mit den Ergebnissen der dem Fachmann in bekannter Weise durchgeführten Sequenzanalyse überein (Fig. 6a). Nichtbindende Sonden, wie z. B. der Primer HS3, zeigen bei Amplifikation der Targetsequenz keine Ver­ änderung der Autokorrelationsfunktion bzw. ihrer Diffusionszeiten (Fig. 6b).

Die Fig. 7 zeigt den erfindungsgemäßen Einsatz eines De­ tektionsprimers während der Amplifikationsreaktion gemäß Ausführungsbeispiel 2. Die von van Genem et al. (PCR Methods and applications 4, 177-184, 1995) beschriebene NASBA-Methode wurde erfindungsgemäß folgendermaßen variiert:

• 1. Ein Detektionsprimer (gag1) wurde dem Reaktionsansatz zugesetzt. Dieser hybridisierte an einer spezifischen Sequenz des 145 b RNA-Stranges. Durch Reverse Transkription mittels AMV-RT entstand ein ds DNA-Molekül mit 130 bp, während das unter Verwendung der Primer 1 und 2 entstandene Amplifi­ kationsprodukt 167 bp aufwies.
• 2. Alle Komponenten der NASBA-Reaktion einschließlich des Detektionsprimers und der Enzyme wurden auf Eis gemischt; der in der Literatur beschriebene Denaturierungsschritt konnte ohne Einfluß auf Reaktionsspezifität entfallen.
• 3. In Standard-NASBA-Verfahren wird die amplifizierte RNA mittels Hybridisierungstechniken wie ELGA (enzyme-linked gel assay) und ECL (Elektrochemilumineszenz) detektiert und quantifiziert. Diese Techniken erfordern die Öffnung der Probenträger mit der Gefahr von carryover-Kontaminationen. Durch die Verwendung von FCS als Detektionsmethode ist es erfindungsgemäß in vorteilhafter Weise möglich, die Proben­ lösung ohne Öffnung der Probenträger zu analysieren.

Die Fig. 8 zeigt die Lokalisation der verwendeten Primer innerhalb der gag Region des HIV-1-Genomes.

Die Fig. 9 zeigt einen typischen Zeitverlauf der Ver­ schiebung der Korrelationskurven (- 10 min, . . . . . 20 min, .-.-.- 35 min . . . . . . . . 50 min, - - - 60 min nach Beginn der Amplifikation) aufgrund der Hybridisierung sowie Extension des Detektionsprimers. Die Anfangskonzentration der HIV-1 RNA-Moleküle betrug 5000 pro ml Plasma. Hinsichtlich der theoretischen Beschreibung der Autokorrelationskurven eines Zweikomponentensystems wird auf das Ausführungsbeispiel 1 verwiesen. Im vorliegenden Beispiel wurden der hybridisierte (gag1-145 b RNA) Detektionsprimer und die durch Extension entstandene 130 bp-Komponenten aufgrund ihrer annähernd gleichen Diffusionszeiten als eine Komponente behandelt. Zur Bestimmung der Kinetik der hybridisierten/extendierten Detektionsprimers wurden die Korrelationskurven unter Ver­ wendung der dem Fachmann bekannten Gleichung zur Beschreibung der Autokorrelationsfunktion eines Zweikomponentensystems gefittet.

Die Fig. 10 verdeutlicht die Kinetik der Hybridisierungs- /Extensionsreaktion des Detektionsprimers. Die Bedeutung der verwendeten Symbole ist wie folgt:
o negative Kontrolle; O falsch-positive Probe; n Anfangs­ konzentration von 1000 HIV-1 RNA-Molekülen pro ml Plasma; l Anfangskonzentration von 2000 HIV-1 RNA-Molekülen pro ml Plasma; t Anfangskonzentration von 5000 HIV-1 RNA-Molekülen pro ml Plasma; s Anfangskonzentration von 20000 HIV-1 RNA-Molekülen pro ml Plasma. Bei geringer Anfangskonzentration ist die Kurve zu längeren Inkubationszeiten verschoben. Bei einer mit wenigen Molekülen kontaminierten falsch-positiven Probe ist diese Verschiebung besonders auffällig, so daß eine klare Unterscheidung zwischen falsch-positiven und positiven Proben möglich ist.

Der Wert der initialen Konzentration an HIV-1 RNA Molekülen erlaubt eine Unterscheidung zwischen positiven und falsch­ positiven Proben. Die direkte quantitative Analyse der Anfangskonzentration an RNA-Molekülen in einer Probe kann erfindungsgemäß wie folgt ermittelt werden. Die Zeitabhängig­ keit der Konzentration der Amplifikationsprodukte in einer NASBA-Reaktion ist annähernd durch folgende Exponential­ funktion beschreibbar: P(t)= P₀ exp(kt), wobei keine für den Amplifikationsmechanismus repräsentative Konstante darstellt. Der Logarithmus der in der Probe enthaltenen Moleküle stellt eine lineare Funktion der zur Erzielung eines bestimmten Primerbindungsgrades notwendigen Inkubationszeit dar (Neben­ bild der Fig. 10). Mittels einer Verdünnungsserie läßt sich somit die Anfangskonzentration an RNA-Molekülen ermitteln.

Im vorliegenden Ausführungsbeispiel wurde der kombinierte Ansatz aus Hybridisierung und Extension des Detektionsprimer dargestellt. Die mittels der FCS erhaltenen Daten wurden durch Sequenzierung konfirmiert. Es konnte bei mehr als 50 durchgeführten Analysen keine unspezifische Bindung des Detektionsprimers festgestellt werden, so daß sich hiermit die Möglichkeit ergibt, auf eine Extension des Detektions­ primers während der Analysen zu verzichten. Dies kann z. B. durch Verwendung eines Didesoxynucleotides am 3′-Ende des Detektionsprimers oder durch Verwendung von PNA-Primern erfolgen. Erfindungsgemäß ist auch der Anstieg der Diffusionszeiten des Detektionsprimers durch Hybridisierung an die amplifizierte RNA ausreichend für eine reproduzierbare FCS-Detektion.

Ausführungsbeispiel 1

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als Amplifikationsmethode die Polymerase­ kettenreaktion (PCR) mit einer auf der Methode der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) beruhenden Detektionstechnik unter Verwendung eines mit fluoreszierenden Gruppen markierten Detektionsprimers, wie z. B. einem N,N,N′,N′-tetramethyl-5-carboxyrhodamin(TMR)-markierten Detektionsprimer, kombiniert. Die Detektionsprimer werden durch die Amplifikationsreaktion in die amplifizierte Nu­ kleinsäure eingebaut, wobei der Einbau mit einer Zunahme der Diffusionszeit des Detektionsprimers einhergeht, welche mittels FCS beobachtet werden kann.

Verwendete Materialien

Die Oligodesoxynukleotide (Tabelle 1) wurden in HPLC-reiner Qualität bei der Fa. NAPS (D-Göttingen) erworben. Die Markierung der Sonden PR1, PR3, HS1 und HS3 erfolgte mit dem 5-Isomer von TMR an ihrem 5′-Ende über einen Aminohexyllinker. Die Konzentrationen wurden unter Berücksichtigung der Absorption des TMR-Labels bei 260 nm (mit A₂₆₀/A₅₅₄ = 0.49) bestimmt, und der Substitutionsgrad (DOS), entsprechend einem Markierungslabel pro Molekül, wurde mittels folgender Formel bestätigt:

DOS = [10×N/86)×A₅₅₄)]/[A₂₆₀-(0,49×A₅₅₄)], wobei N die Anzahl der Basen in der Probe angibt.

2′-Desoxynucleosid-5′-Triphosphate (dNTPs) wurden von der Fa. Pharmacia erworben; das 5′-3′-exonukleasefreie Stoffel­ fragment der Thermus aquaticus DNA-Polymerase von der Fa. Perkin-Elmer. Die humane Placenta DNA wurde bei der Fa. Sigma erworben. Zudem wurde genomische DNA von Mycobacterium tuberculosis verwendet.

PCR in Gegenwart von Detektionsprimer

Die Amplifikations­ reaktion erfolgte entweder in 50 µl oder 25 µl Proben mit 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl₂, 0.1 mg/ml Gelatine, jeweils 0.5 µM der beiden Amplifikationsprimer, jeweils 200 µM der vier dNTPs, 50 ng/µl humaner Placenta-DNA als Überschuß unspezifischer DNA, 1 bis 20 nM des TMR-markierten Detektionsprimers, und 0.05 U/µl des 5′-3′-exo­ nukleasefreien Stoffelfragmentes der Thermus aquaticus DNA-Polymerase. Die Menge an genomischer Mycobacterium tuber­ culosis DNA (im Bereich von 0 bis 10⁶ Moleküle je 50 µl der Reaktionsmischung) betrug wie angegeben. Die PCR-Reaktion erfolgte in Reaktionsröhrchen (Multiple-Safecap tubes) der Fa. Sarstedt. Es wurde folgendes Temperaturprogramm in einem TRIO-Thermoblock-Cycler der Fa. Biometra (Göttingen) ange­ wendet: Denaturierung bei 94°C für 30 s, Primerbindung bei 56°C (Primerpaar S1/S2) oder 60°C (Primerpaar B1B/B2B) für 20 s, und Elongation bei 72°C für 30 s, jeweils für die angegebene Zahl der Zyklen.

FCS-Messung und Bestimmung relativer Diffusionszeiten

Im Anschluß an die PCR wurden 10 µl der Reaktionsmischung mittels FCS unter Verwendung eines 63×1.2 Wasser-Immersions­ objektives untersucht. Eine detaillierte Beschreibung der FCS ist in dem Artikel von Eigen und Rigler (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5740-5747) zu finden. Die Autokorre­ lationsfunktion für eine Mischung von Partikeln mit schnellen und langsamen Translationsdiffusionszeiten ist bei Thompson (Topics in Fluorescence Spectroscopy, Vol. I, Lakowicsz, JR (ed), Plenum 1991) beschrieben.

Ausführungsbeispiel 2

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die isothermale Amplifikationsmethode NASBA (nucleic acid sequence-based amplification) mit der Detektionsmethode FCS kombiniert. Das erfindungsgemäße Verfahren wird in diesem Ausführungsbeispiel verwendet, um eine simulierte HIV-In­ fektion nachzuweisen.

Verwendete Materialien

Die Komponenten für die RNA-Iso­ lierung sowie für die Amplifikationsmethode NASBA wurden bei der Fa. Organon Teknika (Eppelheim) erworben. Der mit TMR-markierte Detektionsprimer gag1 wurde von der Fa. NAPS (Göttingen) synthetisiert. Die Probenträger mit 96 Reaktions­ kompartimenten wurden in der Feinmechanikwerkstatt des Max- Planck-Institutes für Biophysikalische Chemie angefertigt; jedes Kompartiment besitzt ein Volumen von 40 µl und eine Wandstärke von 40 µm. Das verwendete Plasma war Hepatits B- und C-, CMV- und HIV-1-negativ.

Simulation einer HIV-1-Infektion

Jeweils 1 ml Plasma wurde mit unterschiedlichen Mengen (1000, 2000, 5000, 20000 Mole­ küle) an genomischer HIV-1 RNA (HXB2) versetzt. 9 ml Lyse- Puffer (5.25 M Guanidinthiocyanat, 50 mM Tris pH 6.4, 20 mM EDTA, 1.3% w/v Triton X-100) wurden zugesetzt.

Isolierung von Nukleinsäuren aus dem Plasma

Die Nukleinsäuren wurden an aktivierte Kieselerde (50 µl Suspension, 1 mg/ml), welche der Lyse-Mischung zugesetzt wurde, gebunden. Nach einem Wasch- und Trocknungsschritt wurden die Nuklein­ säuren mit 50 µl Elutionspuffer (1 mM Tris pH 8.5) eluiert und bei -70°C gelagert.

NASBA-Amplifikation der isolierten HIV-1 RNA

Typische Reaktionen wurden durchgeführt in einem 20 µl Reaktions­ volumen, enthaltend 40 mM Tris pH 8.5, 12 mM MgCl₂, 42 mM KCl, 5 mM DTT, 15% v/v DMSO, jeweils 1 mM dNTP, jeweils 2 mM NTP, 0.1 U RNase H, 0.1 µg/µl BSA, 40 U T7 RNA-Polymerase, 8 U AMV Reverse Transkriptase, 0.2 µM Primer 1,2 und 5 µl isolierte Nukleinsäure (enthaltend 100, 200, 500, 2000 HIV-1 BNA-Moleküle). In negativen Kontrollreaktionen wurden diese 5 µl isolierter Nukleinsäure durch 5 µl bidestilliertes Wasser ersetzt. Die Sequenzen der Amplifikationsprimer sind innerhalb der gag Region des HIV-1-Genomes lokalisiert (Fig. 8). Sie weisen die folgenden Sequenzen auf:

Zum Reaktionsansatz wurden 1 µl TMR-markierter gag1-Detektionsprimer (Endkonzentration: 4.5 nM) zugesetzt:

Diese Amplifikationsansätze von jeweils 21 µl wurden in ver­ schließbare Probenträger, insbesondere Polycarbonatfolien mit 96 Vertiefungen, überführt und in die auf 42°C vor­ temperierte Temperierungseinheit eines dem Fachmann bekannten FCS-Gerätes eingesetzt. In einem typischen Experiment wurden 10 Amplifikationsreaktionen einschließlich negativer Kon­ trollen in parallelisierter Form durchgeführt. Die FCS-online-Detektion erfolgte unter Verwendung eines Wasser- Immersionsobjektives (Zeiss Plan Neofluar 40×0.9). Das durch den Laserstrahl und ein Pinhole in einer dem Fachmann be­ kannten Weise definierte Detektionsvolumen lag in der Größen­ ordnung von 10^-15 l.

Table 1. Amplifikations- und Detektionsprimer für die DNA-Amplifikation von IS6110 mittels PCR

Claims (10)

1. Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuremolekülen in niedriger Konzentration in zu untersuchenden Proben mittels Amplifikationsreaktionen, unter Verwendung von Polymerasen sowie unmarkierten Primern (Amplifikations­ primer) und markierten Primern (Detektionsprimer), wobei die markierten Primer an die zu bestimmende Nukleinsäure hybridisieren und die Abnahme der Konzen­ tration der markierten Primer gemessen wird und als Maß für das Vorhandensein des zu bestimmenden Nukleinsäure­ moleküls herangezogen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die an die zu bestim­ mende Nukleinsäure hybridisierten markierten Primer durch die Amplifikationsreaktion in die amplifizierte Nukleinsäure eingebaut werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, wobei die mar­ kierten Primer mit fluoreszierenden Gruppen markiert sind.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei als Amplifikationsreaktion primerabhängige Reakt­ ionen wie Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR), isothermale 3 SR (self-sustained-sequence-replication), Strand- Displacement-Amplification (SDA), Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR) und/oder Nucleic Acid Sequence-based Amplification (NASBA) eingesetzt werden.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Abnahme der Konzen­ tration der markierten Primer mittels der Fluoreszenz­ korrelationsspektroskopie (FCS) gemessen wird.

6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase keine 5′-3′- Exonukleaseaktivität aufweist.

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Detektionsprimers gering im Verhältnis zur Konzen­ tration des Amplifikationsprimers ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Amplifikationsprimers das 5- bis 200-fache der Konzentration des Detektionsprimers beträgt.

9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren mittels Probenträgern, insbesondere Polycarbonat-Folien, durch­ geführt wird.

10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der nachzuweisenden Nukleinsäuremoleküle bestimmt wird.