DE19634226A1 - Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuremolekülen in niedriger Konzentration - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuremolekülen in niedriger KonzentrationInfo
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Description
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur
Bestimmung von Nukleinsäuremolekülen in niedriger Kon
zentration in zu untersuchenden Proben mittels Amplifi
kationsreaktionen unter Verwendung von Polymerasen sowie
unmarkierten und markierten Primern.
Ein derartiges Amplifikationsverfahren ist für die molekulare
Diagnostik, insbesondere für die Pathogendiagnostik, von
großer Bedeutung. Eine Vielzahl von Techniken ist beschrieben
worden, die geringe Mengen an spezifischer Nukleinsäure
nachzuweisen vermögen. Dem erfindungsgemäßen Verfahren
ähnlich ist der 5′-Nuklease-Assay (die sogenannte TaqMan-
Polymerase-Chain-Reaction; Livak et al. in PCR Methods and
Applications 4 (1995) 357-361). Die Basis dieser Methode
ist ein am 5′-Ende mit einem Reportermolekül (Fluorescein)
und am 3′-Ende mit einem Quenchermolekül (Rhodamin) mar
kiertes Oligonukleotid, welches am 3′-Ende zudem über einen
Phosphatrest gegen eine enzymatische Kettenverlängerung
geschützt ist. Im Verlauf der PCR-Reaktion wird die Sonde
von der 5′-3′-Exonukleaseaktivität der verwendeten Taq-
Polymerase erkannt, wenn sie downstream zu einer primer
gestarteten Polymerase-Reaktion an die zu amplifizierende
Matrize hybridisiert hat. In der Folge sorgt die 5′-3′-
Exonukleaseaktivität für die Hydrolyse des 5′-Endes der
Sonde, wodurch die Fluoreszenz-Emission des Fluorescein-
Reporters ansteigt, da sie nicht länger durch die Nachbar
schaft des Rhodamins gelöscht wird. Gravierende Nachteile
dieses Verfahrens sind die sehr aufwendige und kosten
intensive Präparation der doppeltmarkierten und endgruppen
geschützten Oligonukleotide, die Beteiligung der
enzymatischen Hydrolyse und der Einfluß von Medieneffekten
auf die Fluoreszenzausbeute, d. h. die Quantifizierbarkeit.
Das der Erfindung zugrundeliegende Problem besteht darin,
ein universell einsetzbares, leicht handhabbares und preis
wertes Verfahren zur qualitativen und quantitativen Detektion
von kleinsten Mengen an Nukleinsäure bereitzustellen. Es ist
hierbei insbesondere im Hinblick auf die Diagnostik in
fektiöser Pathogene wünschenswert, daß das gesamte Verfahren
in Kompartimenten ablaufen kann, die nach der Zugabe der
Probe verschlossen werden und im Laufe des Verfahrens nicht
wieder geöffnet werden müssen.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird gelöst durch
ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1. Die
Unteransprüche 2 bis 10 betreffen bevorzugte Ausführungs
formen des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur Bestimmung von
Nukleinsäuremolekülen in niedrigen Konzentrationen in zu
untersuchenden Proben. Dabei werden Amplifikationsreaktionen
eingesetzt. Diese verwenden Polymerasen sowie unmarkierte
Primer (Amplifikationsprimer) und markierte Primer
(Detektionsprimer). Die markierten Primer hybridisieren an
die Nukleinsäure und/oder werden durch die Amplifikations
reaktion in die amplifizierte Nukleinsäure eingebaut, wobei
die Konzentration der freien Detektionsprimer abnimmt. Die
Abnahme dieser Konzentration wird gemessen und als Maß für
das Vorhandensein des zu bestimmenden Nukleinsäuremoleküls
herangezogen.
Vorzugsweise sind die markierten Primer mit fluoreszierenden
Gruppen markiert. Als Amplifikationsreaktionen kommen ins
besondere Primer abhängige Reaktionen wie die Polymerase
kettenreaktion (PCR), Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR),
isothermale 3SR (self-sustained sequence replication), Strand
Displacement Amplification (SDA) und/oder Nucleic Acid
Sequence-based Amplification (NASBA) in Betracht.
Wird die Abnahme der Konzentration der markierten Primer,
wie erfindungsgemäß bevorzugt wird, mittels fluoreszenz
markierter Primer gemessen, ist die Fluoreszenzkorrelations
spektroskopie (FCS) einsetzbar, um ein Maß für das Vorhanden
sein des zu bestimmenden Nukleinsäuremoleküls zu ermitteln.
Bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
werden Amplifikationstechniken mit der Detektionsmethode
Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie gekoppelt. Das er
findungsgemäße Verfahren erlaubt somit die Realisierung einer
Endpunkttitration, wobei die nachzuweisende Sequenz während
der Reaktion stufenweise oder kontinuierlich amplifiziert
wird. Der Endpunkt dieser als Endpunkttitration auffaßbaren
Reaktion ist erreicht, wenn der erfindungsgemäß zu ver
wendende Detektionsprimer durch Inkorporation in die neue
synthetisierte Nukleinsäure verbraucht ist, bzw. eine weitere
Abnahme der Konzentration des Detektionsprimers nicht mehr
feststellbar ist oder einen vorher festlegbaren, zweckmäßigen
Wert erreicht hat.
Vorzugsweise wird dabei eine Polymerase ohne 5′-3′-Exo
nukleaseaktivität verwendet. Anderenfalls würde die Sonde
wie im Ansatz gemäß Livak et al. abgebaut. Die Polymerasen
sind kommerziell erhältlich.
Erfindungsgemäß ist es jedoch auch möglich, auf eine Ex
tension des Detektionsprimers während des Verfahrens zu
verzichten. Dies kann z. B. durch Verwendung eines Didesoxy
nukleotides am 3′-Ende des Detektionsprimers oder durch die
Verwendung von markierten PNA als Detektionsprimern erfolgen.
Erfindungsgemäß ist auch der Anstieg der Diffusionszeiten
des Detektionsprimers durch Hybridisierung an die amplifi
zierte Nukleinsäure ausreichend für eine reproduzierbare
FCS-Detektion.
Die erfindungsgemäße Maßnahme, die Abnahme der Konzentration
der markierten Primer zu messen und als Maß für das Vor
handensein des zu bestimmenden Nukleinsäuremoleküls heranzu
ziehen, beruht auf der Tatsache, daß zu Beginn der Reaktion
der Detektionsprimer sich in einem Zustand hoher Mobilität
befindet, während er am Ende der Reaktion durch die Hybridi
sierung bzw. durch die Amplifikationsreaktion (Einbau in ein
Amplifikationsprodukt) weitgehend bis vollständig in einen
Zustand niedriger Mobilität überführt wird. Diese Mobilitäts
änderung läßt sich in besonders geeigneter Weise durch die
Methode der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie messen,
wobei die Probe im geschlossenen Kompartiment verbleiben
kann. Es kann erfindungsgemäß bevorzugt sein, die Kon
zentration des Detektionsprimers als gering im Verhältnis
zur Konzentration des Amplifikationsprimers zu wählen.
Insbesondere kann die Konzentration des Amplifikationsprimers
das 5- bis 200-fache der Konzentration des Detektionsprimers
betragen.
Aus der vorzugsweise mit der Fluoreszenzkorrelations
spektroskopie ermittelten Korrelationskurve lassen sich
sowohl die Anzahl der fluoreszierenden Moleküle, das relative
Verhältnis fluoreszenzmarkierter Moleküle unterschiedlicher
Größe als auch ihre Diffusionsmobilitäten schnell und zuver
lässig ermitteln. Das erfindungsgemäße Verfahren in Form
einer Endpunkttitration und/oder Hybridisierung weist durch
entsprechende Wahl und Konzentration der fluoreszenz
markierten Primer nur die Anwesenheit der gesuchten Sequenz,
welche eine zum Detektionsprimer komplementäre Sequenz
aufweist, nach.
Das Verfahren ist unempfindlich gegenüber unspezifischen
Amplifikationen. Eine hohe Konzentration an Amplifikations
primer ist wünschenswert, um eine sichere Amplifikation auch
geringer Mengen an nachzuweisenden Nukleinsäuren zu gewähr
leisten. So kann zum Beispiel die Konzentration des Amplifi
kationsprimers 0,5 µM betragen, während der Detektionsprimer
vorzugsweise in einer Konzentration von 1 bis 10 nM vorliegt.
Aus der entsprechenden Wahl unterschiedlicher Konzentrationen
für Amplifikationsprimer und Detektionsprimer ergeben sich
insbesondere die folgenden Vorteile. Bei der Amplifikations
reaktion wie der PCR muß es zu Assoziationsreaktionen
zwischen Primer und Template kommen, um die Primer-Elongation
zu starten. Diese Reaktionen haben normalerweise Geschwindig
keitskonstanten von kR = 10⁴-10⁶ M-1s-1. Im Zeitbereich von
Sekunden bis Minuten kommt es gemäß der Beziehung 1/t = kR
(Cprimer + Ctemplate) nennenswert zu Komplexbildungen, wenn einer
der Partner im Bereich von 0,1 bis 1 µM vorliegt. Dies gilt
nur für bereits hohe Templatekonzentrationen bzw. für die
Reaktion mit den Amplifikationsprimern. Erst wenn die Kon
zentration entsprechend hoch ist, kommt es zur gewünschten
und spezifischen Hybridisierung mit dem Detektionsprimer,
der sich dann in einer der erfindungsgemäßen Ausführungs
formen in wenigen Amplifikationsschritten in gewünschter
Weise verbraucht und nahezu vollständig durch Kettenver
längerung in Amplifikate überführt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere in
Kombination mit Probenträgern wie z. B. Polycarbonat-Folien,
welche sich durch folgende Vorzüge auszeichnen. Sie sind
- a) chemisch inert
- b) fest verschließbar (keine Kontaminationseffekte, keine Verdampfung)
- c) nicht fluoreszierend
- d) von relativ geringer Dicke (10 bis 20 µm im Bereich der Probenflüssigkeit)
- e) von relativ hoher Wärmeleitung.
Bevorzugt lassen sich Folien mit 96 oder 384 Kompartimenten
verwenden. Die Folien werden mit Testflüssigkeit und Proben
flüssigkeit in ca. 5 bis 20 µl Portionen befüllt und ver
schlossen. Die Lösungen werden als kleine Tropfen durch
Kapillarkräfte im oberen Teil der Folie fixiert, in der das
Kompartiment eine für die FCS-Methode erforderliche Wand
stärke von 10 bis 20 µm besitzt. Die Folien lassen sich in
einen thermostatisierbaren Rahmen einpassen. Sie werden mit
einer dünnen Schicht Immersionsflüssigkeit für das im
FCS-Detektionsverfahren zu verwendende Objektiv benetzt. Die
Kompartimente lassen sich insbesondere für Verdünnungsreihen,
Screenings oder auch für unterschiedliche Testtypen ein
setzen. Die typische Meßzeit für eine Folie mit 96 Kom
partimenten liegt im Bereich weniger Minuten bis maximal
einer halben Stunde. Durch Mitführung geeigneter Standard
verdünnungen des Templates in der gleichen Folie ist die
Quantifizierung der zu detektierenden Nukleinsäure in den
Testkompartimenten möglich.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich bei Verwendung
geeigneter Detektionsprimer auch zum Nachweis von Punkt
mutationen, Translokationen, Deletionen oder Haplotyp-
Differenzierung. Es ist zudem im Sinne einer Multiplex-PCR
einsetzbar. Bei erblichen Stoffwechselkrankheiten, wie z. B.
der autosomal rezessiven zystischen Fibrose, lassen sich
durch Verwendung zweier Detektionsprimer mit unterschied
lichen Farbstoffmarkern heterozygote Patienten von homo
zygoten Patienten unterscheiden. Es ist zudem sowohl zum
Nachweis von DNA- als auch RNA-Genomen geeignet (letzteres
z. B. durch Einsatz in einer RT-PCR oder 3SR-Reaktion).
Die Fig. 1 betrifft eine schematische Darstellung des er
findungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung der PCR.
Die Fig. 2 beschreibt die Verschiebung der Korrelationskurve
G(t) bei Anwesenheit der angegebenen initialen Template-
Mengen.
Die Fig. 3 betrifft die Darstellung der invertierten
Korrelationsfunktion in der Form (G(t=0)-1)/(G(t)-1).
Die Fig. 4a zeigt die im Ausführungsbeispiel 1 durch
FCS-Analyse erhaltenen Autokorrelationsfunktionen G(t).
Die Fig. 4b zeigt die Auftragung dieser Daten in lineari
sierter Form.
Die Fig. 5 verdeutlicht die Änderung der relativen
Diffusionszeiten des Detektionsprimers im Verlauf der Ampli
fikationsreaktion gemäß Ausführungsbeispiel 1.
Die Fig. 6a und b verdeutlichen das Detektionslimit des
erfindungsgemäßen Verfahrens bei Anwendung auf das Aus
führungsbeispiel 1.
Die Fig. 7 zeigt den erfindungsgemäßen Einsatz eines
Detektionsprimers während der NASBA im Ausführungsbeispiel
2.
Die Fig. 8 zeigt die Lokalisation der verwendeten Primer
innerhalb der gag Region des HIV-1 Genomes.
Die Fig. 9 zeigt einen typischen Zeitverlauf der Ver
schiebung der Korrelationskurven aufgrund der Hybridisierung
und Extension des Detektionsprimers im Ausführungsbeispiel
2.
Die Fig. 10 verdeutlicht die Kinetik der Hybridisierungs/
Extensionsreaktion des Detektionsprimers im Ausführungsbei
spiel 2.
Die Fig. 1 beschreibt schematisch das erfindungsgemäße
Verfahren unter Verwendung der PCR. Die in der PCR ver
wendeten Amplifikationsprimer p1 und p2 sind als Pfeile
dargestellt, der Detektionsprimer p3 ist mit einem
Fluoreszenzfarbstoff (Kreis) gekoppelt. Der linke Teil der
Figur zeigt amplifizierte Artefakte bei Abwesenheit des
Templates. Hierbei kann es sich z. B. um Primerdimere der
hochkonzentrierten Primer p1 und p2 handeln. Die rechte Seite
der Figur zeigt p2 in Anwesenheit des Templates. Erst wenn
die Amplifikate in genügend hoher Konzentration vorliegen,
wirkt das Amplifikat als Template für den niedrigkonz
entrierten, fluoreszenzmarkierten Detektionsprimer. Die
Mobilitätsänderung des Primers läßt sich deutlich durch eine
Verschiebung der Korrelationskurve erkennen.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielte Ergebnisse an
Mycobacterium tuberculosis sind in den Fig. 2 und 3
dargestellt. Der Nachweis dieses pathogenen Erregers dauerte
bislang aufgrund der aufwendigen Zellkulturverfahren ca. 3
bis 4 Wochen. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens läßt
sich diese Nachweiszeit stark verkürzen.
In der Fig. 2 wird die Verschiebung der Korrelationskurve
G(t) bei Anwesenheit der angegebenen initialen Template-
Mengen gezeigt. Die jeweils angegebene Anzahl von Template
molekülen wurde zu Beginn der Reaktion in jeweils 50 µl
Reaktionsansatz vorgelegt, durch das erfindungsgemäße Ver
fahren in 32 PCR-Zyklen amplifiziert und mittels der
FCS-Methode analysiert. Es wurde ein für den Tuberkuloseerreger
Mycobacterium tuberculosis charakteristisches Template
verwendet. Die Detektionsgrenze lag hier bei 100 Template
molekülen pro Ansatz. Das Verfahren ist damit empfindlich
genug, um in jeder molekulardiagnostischen Anwendung einge
setzt zu werden.
Die Fig. 3 zeigt die Auftragung der invertierten Korre
lationsfunktion in der Form (G(t=0)-1)/((G(t)-1). In dieser
Darstellung wurden die gleichen Daten wie in Fig. 2 ver
wendet. Durch die invertierte Auftragung sind die Kurven im
betrachteten Zeitbereich linearisiert, wodurch ihre Inter
pretation erleichtert wird. Eine Verschiebung von G(t)
entlang der t-Achse zeigt sich in dieser Darstellung als
Abflachung der Steigung, die durch lineare Regression in
einfacher Weise erhalten werden kann. Die Detektionsgrenze
läßt sich deutlich als 100 Templatemoleküle pro Reaktions
ansatz erkennen.
Die Fig. 4a zeigt die durch FCS-Analyse erhaltenen Auto
korrelationsfunktionen G(t) mit zunehmender Anzahl an
PCR-Zyklen der für Mycobacterium tuberculosis und M. bovis
spezifischen Targetsequenz IS6110 (Ausführungsbeispiel 1).
Die PCR-Amplifikation eines 106 bp-Segmentes, ausgehend von
10⁵ Strängen der genomischen Mycobacterium tuberculosis DNA
vor einem Hintergrund von 2.5 µg unspezifischer humaner
Placenta-DNA in 50 µl Reaktionsvolumen, erfolgte unter
Verwendung des Primerpaares S1/S2 als Amplifikationsprimer
und 10 nM TMR-markierter Sonde PR1 als Detektionsprimer
(Tabelle 1). Der Detektionsprimer bindet zwischen den Ampli
fikationsprimern mit derselben Orientierung wie der Amplifi
kationsprimer S2 und überlappt mit dem 3′-Ende von S2 um fünf
Nukleotide. Die Amplifikationsreaktionen wurden nach einer
unterschiedlichen Zahl an Zyklen gestoppt. Die Inkorporation
des Detektionsprimers in die Amplifikate ist an der Ver
schiebung der Autokorrelationskurve zu längeren Korre
lationszeiten, welche einer Zunahme der Diffusionszeit des
Detektionsprimers entspricht, deutlich erkennbar.
Die Fig. 4b zeigt die Auftragung der Daten in der lineari
sierten Form [G(t=0)]/[G(t)]. Mit zunehmender Amplifikation
ist eine Abnahme der Geradensteigung zu beobachten.
Die Fig. 5 verdeutlicht die Änderung der relativen
Diffusionszeiten des Detektionsprimers im Verlauf der Ampli
fikationsreaktion. Die Diffusionszeiten des Detektionsprimers
spiegeln eindeutig die PCR-Amplifikationskinetik mit einer
vor Erreichen des Detektionsgrenzwertes initialen lag-Phase,
schneller exponentieller Anreicherung der Amplifikations
produkte sowie einer Plateauphase wider. Dieses Plateau zeigt
eine Sättigung an, welche dem Endpunkt einer Titration
vergleichbar ist. Die abnehmende Anzahl der durchschnittlich
sich im Laserfokus befindlichen Moleküle des Detektions
primers mit zunehmender Zahl der Temperaturzyklen ist vermut
lich auf Adsorptionseffekte an den Wänden der Reaktionsgefäße
zurückzuführen (Nebenbild der Fig. 5). Zudem ist eine
scheinbare Zunahme emittierter Photonen pro Molekül und
Sekunde zu beobachten (Nebenbild der Fig. 5).
Die Fig. 6a und 6b verdeutlichen das Detektionslimit des
erfindungsgemäßen Verfahrens bei Anwendung auf das Aus
führungsbeispiel 1. Die PCR-Amplifikationsreaktionen wurden
unter Verwendung unterschiedlicher Amplifikations- und
Detektionsprimer durchgeführt (Tabelle 1). Vor einem Hinter
grund von 2.5 µg unspezifischer humaner Plazenta-DNA in 50
µl Reaktionsvolumen wurde eine konstante Anzahl an PCR-Zyklen
(entweder 36 oder 40 Zyklen) mit jeweils unterschiedlichen
Ausgangskonzentrationen an Targetgenomen durchgeführt. Bei
Verwendung der Amplifikationsprimer S1/S2 mit 1 nM
Detektionsprimer PR1 (Fig. 6a) oder der Amplifikationsprimer
B1B/B2B mit 5 nM Detektionsprimer PR3 (Fig. 6b) liegt das
Detektionslimit unterhalb von 100 Mycobacterium tuberculosis
Genomen. Eine Quantifizierung von bis zu lediglich 10 Target
genomen kann durch Vergleich mit einem Verdünnungsstandard
erfolgen. Die mittels FCS bestimmten Diffusionszeiten des
Detektionsprimers stimmen gut mit den Ergebnissen der dem
Fachmann in bekannter Weise durchgeführten Sequenzanalyse
überein (Fig. 6a). Nichtbindende Sonden, wie z. B. der Primer
HS3, zeigen bei Amplifikation der Targetsequenz keine Ver
änderung der Autokorrelationsfunktion bzw. ihrer
Diffusionszeiten (Fig. 6b).
Die Fig. 7 zeigt den erfindungsgemäßen Einsatz eines De
tektionsprimers während der Amplifikationsreaktion gemäß
Ausführungsbeispiel 2. Die von van Genem et al. (PCR Methods
and applications 4, 177-184, 1995) beschriebene NASBA-Methode
wurde erfindungsgemäß folgendermaßen variiert:
- 1. Ein Detektionsprimer (gag1) wurde dem Reaktionsansatz zugesetzt. Dieser hybridisierte an einer spezifischen Sequenz des 145 b RNA-Stranges. Durch Reverse Transkription mittels AMV-RT entstand ein ds DNA-Molekül mit 130 bp, während das unter Verwendung der Primer 1 und 2 entstandene Amplifi kationsprodukt 167 bp aufwies.
- 2. Alle Komponenten der NASBA-Reaktion einschließlich des Detektionsprimers und der Enzyme wurden auf Eis gemischt; der in der Literatur beschriebene Denaturierungsschritt konnte ohne Einfluß auf Reaktionsspezifität entfallen.
- 3. In Standard-NASBA-Verfahren wird die amplifizierte RNA mittels Hybridisierungstechniken wie ELGA (enzyme-linked gel assay) und ECL (Elektrochemilumineszenz) detektiert und quantifiziert. Diese Techniken erfordern die Öffnung der Probenträger mit der Gefahr von carryover-Kontaminationen. Durch die Verwendung von FCS als Detektionsmethode ist es erfindungsgemäß in vorteilhafter Weise möglich, die Proben lösung ohne Öffnung der Probenträger zu analysieren.
Die Fig. 8 zeigt die Lokalisation der verwendeten Primer
innerhalb der gag Region des HIV-1-Genomes.
Die Fig. 9 zeigt einen typischen Zeitverlauf der Ver
schiebung der Korrelationskurven (- 10 min, . . . . . 20 min,
.-.-.- 35 min . . . . . . . . 50 min, - - - 60 min nach Beginn der
Amplifikation) aufgrund der Hybridisierung sowie Extension
des Detektionsprimers. Die Anfangskonzentration der HIV-1
RNA-Moleküle betrug 5000 pro ml Plasma. Hinsichtlich der
theoretischen Beschreibung der Autokorrelationskurven eines
Zweikomponentensystems wird auf das Ausführungsbeispiel 1
verwiesen. Im vorliegenden Beispiel wurden der hybridisierte
(gag1-145 b RNA) Detektionsprimer und die durch Extension
entstandene 130 bp-Komponenten aufgrund ihrer annähernd
gleichen Diffusionszeiten als eine Komponente behandelt. Zur
Bestimmung der Kinetik der hybridisierten/extendierten
Detektionsprimers wurden die Korrelationskurven unter Ver
wendung der dem Fachmann bekannten Gleichung zur Beschreibung
der Autokorrelationsfunktion eines Zweikomponentensystems
gefittet.
Die Fig. 10 verdeutlicht die Kinetik der Hybridisierungs-
/Extensionsreaktion des Detektionsprimers. Die Bedeutung der
verwendeten Symbole ist wie folgt:
o negative Kontrolle; O falsch-positive Probe; n Anfangs konzentration von 1000 HIV-1 RNA-Molekülen pro ml Plasma; l Anfangskonzentration von 2000 HIV-1 RNA-Molekülen pro ml Plasma; t Anfangskonzentration von 5000 HIV-1 RNA-Molekülen pro ml Plasma; s Anfangskonzentration von 20000 HIV-1 RNA-Molekülen pro ml Plasma. Bei geringer Anfangskonzentration ist die Kurve zu längeren Inkubationszeiten verschoben. Bei einer mit wenigen Molekülen kontaminierten falsch-positiven Probe ist diese Verschiebung besonders auffällig, so daß eine klare Unterscheidung zwischen falsch-positiven und positiven Proben möglich ist.
o negative Kontrolle; O falsch-positive Probe; n Anfangs konzentration von 1000 HIV-1 RNA-Molekülen pro ml Plasma; l Anfangskonzentration von 2000 HIV-1 RNA-Molekülen pro ml Plasma; t Anfangskonzentration von 5000 HIV-1 RNA-Molekülen pro ml Plasma; s Anfangskonzentration von 20000 HIV-1 RNA-Molekülen pro ml Plasma. Bei geringer Anfangskonzentration ist die Kurve zu längeren Inkubationszeiten verschoben. Bei einer mit wenigen Molekülen kontaminierten falsch-positiven Probe ist diese Verschiebung besonders auffällig, so daß eine klare Unterscheidung zwischen falsch-positiven und positiven Proben möglich ist.
Der Wert der initialen Konzentration an HIV-1 RNA Molekülen
erlaubt eine Unterscheidung zwischen positiven und falsch
positiven Proben. Die direkte quantitative Analyse der
Anfangskonzentration an RNA-Molekülen in einer Probe kann
erfindungsgemäß wie folgt ermittelt werden. Die Zeitabhängig
keit der Konzentration der Amplifikationsprodukte in einer
NASBA-Reaktion ist annähernd durch folgende Exponential
funktion beschreibbar: P(t)= P₀ exp(kt), wobei keine für den
Amplifikationsmechanismus repräsentative Konstante darstellt.
Der Logarithmus der in der Probe enthaltenen Moleküle stellt
eine lineare Funktion der zur Erzielung eines bestimmten
Primerbindungsgrades notwendigen Inkubationszeit dar (Neben
bild der Fig. 10). Mittels einer Verdünnungsserie läßt sich
somit die Anfangskonzentration an RNA-Molekülen ermitteln.
Im vorliegenden Ausführungsbeispiel wurde der kombinierte
Ansatz aus Hybridisierung und Extension des Detektionsprimer
dargestellt. Die mittels der FCS erhaltenen Daten wurden
durch Sequenzierung konfirmiert. Es konnte bei mehr als 50
durchgeführten Analysen keine unspezifische Bindung des
Detektionsprimers festgestellt werden, so daß sich hiermit
die Möglichkeit ergibt, auf eine Extension des Detektions
primers während der Analysen zu verzichten. Dies kann z. B.
durch Verwendung eines Didesoxynucleotides am 3′-Ende des
Detektionsprimers oder durch Verwendung von PNA-Primern
erfolgen. Erfindungsgemäß ist auch der Anstieg der
Diffusionszeiten des Detektionsprimers durch Hybridisierung
an die amplifizierte RNA ausreichend für eine reproduzierbare
FCS-Detektion.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens wird als Amplifikationsmethode die Polymerase
kettenreaktion (PCR) mit einer auf der Methode der
Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) beruhenden
Detektionstechnik unter Verwendung eines mit fluoreszierenden
Gruppen markierten Detektionsprimers, wie z. B. einem
N,N,N′,N′-tetramethyl-5-carboxyrhodamin(TMR)-markierten
Detektionsprimer, kombiniert. Die Detektionsprimer werden
durch die Amplifikationsreaktion in die amplifizierte Nu
kleinsäure eingebaut, wobei der Einbau mit einer Zunahme der
Diffusionszeit des Detektionsprimers einhergeht, welche
mittels FCS beobachtet werden kann.
Die Oligodesoxynukleotide (Tabelle
1) wurden in HPLC-reiner Qualität bei der Fa. NAPS
(D-Göttingen) erworben. Die Markierung der Sonden PR1, PR3, HS1
und HS3 erfolgte mit dem 5-Isomer von TMR an ihrem 5′-Ende
über einen Aminohexyllinker. Die Konzentrationen wurden unter
Berücksichtigung der Absorption des TMR-Labels bei 260 nm
(mit A₂₆₀/A₅₅₄ = 0.49) bestimmt, und der Substitutionsgrad
(DOS), entsprechend einem Markierungslabel pro Molekül, wurde
mittels folgender Formel bestätigt:
DOS = [10×N/86)×A₅₅₄)]/[A₂₆₀-(0,49×A₅₅₄)], wobei
N die Anzahl der Basen in der Probe angibt.
2′-Desoxynucleosid-5′-Triphosphate (dNTPs) wurden von der
Fa. Pharmacia erworben; das 5′-3′-exonukleasefreie Stoffel
fragment der Thermus aquaticus DNA-Polymerase von der Fa.
Perkin-Elmer. Die humane Placenta DNA wurde bei der Fa. Sigma
erworben. Zudem wurde genomische DNA von Mycobacterium
tuberculosis verwendet.
Die Amplifikations
reaktion erfolgte entweder in 50 µl oder 25 µl Proben mit
10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl₂, 0.1 mg/ml
Gelatine, jeweils 0.5 µM der beiden Amplifikationsprimer,
jeweils 200 µM der vier dNTPs, 50 ng/µl humaner Placenta-DNA
als Überschuß unspezifischer DNA, 1 bis 20 nM des TMR-markierten
Detektionsprimers, und 0.05 U/µl des 5′-3′-exo
nukleasefreien Stoffelfragmentes der Thermus aquaticus
DNA-Polymerase. Die Menge an genomischer Mycobacterium tuber
culosis DNA (im Bereich von 0 bis 10⁶ Moleküle je 50 µl der
Reaktionsmischung) betrug wie angegeben. Die PCR-Reaktion
erfolgte in Reaktionsröhrchen (Multiple-Safecap tubes) der
Fa. Sarstedt. Es wurde folgendes Temperaturprogramm in einem
TRIO-Thermoblock-Cycler der Fa. Biometra (Göttingen) ange
wendet: Denaturierung bei 94°C für 30 s, Primerbindung bei
56°C (Primerpaar S1/S2) oder 60°C (Primerpaar B1B/B2B) für
20 s, und Elongation bei 72°C für 30 s, jeweils für die
angegebene Zahl der Zyklen.
Im Anschluß an die PCR wurden 10 µl der Reaktionsmischung
mittels FCS unter Verwendung eines 63×1.2 Wasser-Immersions
objektives untersucht. Eine detaillierte Beschreibung der
FCS ist in dem Artikel von Eigen und Rigler (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 91: 5740-5747) zu finden. Die Autokorre
lationsfunktion für eine Mischung von Partikeln mit schnellen
und langsamen Translationsdiffusionszeiten ist bei Thompson
(Topics in Fluorescence Spectroscopy, Vol. I, Lakowicsz, JR
(ed), Plenum 1991) beschrieben.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die
isothermale Amplifikationsmethode NASBA (nucleic acid
sequence-based amplification) mit der Detektionsmethode FCS
kombiniert. Das erfindungsgemäße Verfahren wird in diesem
Ausführungsbeispiel verwendet, um eine simulierte HIV-In
fektion nachzuweisen.
Die Komponenten für die RNA-Iso
lierung sowie für die Amplifikationsmethode NASBA wurden bei
der Fa. Organon Teknika (Eppelheim) erworben. Der mit
TMR-markierte Detektionsprimer gag1 wurde von der Fa. NAPS
(Göttingen) synthetisiert. Die Probenträger mit 96 Reaktions
kompartimenten wurden in der Feinmechanikwerkstatt des Max-
Planck-Institutes für Biophysikalische Chemie angefertigt;
jedes Kompartiment besitzt ein Volumen von 40 µl und eine
Wandstärke von 40 µm. Das verwendete Plasma war Hepatits B-
und C-, CMV- und HIV-1-negativ.
Jeweils 1 ml Plasma wurde
mit unterschiedlichen Mengen (1000, 2000, 5000, 20000 Mole
küle) an genomischer HIV-1 RNA (HXB2) versetzt. 9 ml Lyse-
Puffer (5.25 M Guanidinthiocyanat, 50 mM Tris pH 6.4, 20 mM
EDTA, 1.3% w/v Triton X-100) wurden zugesetzt.
Die Nukleinsäuren wurden an aktivierte Kieselerde (50 µl Suspension,
1 mg/ml), welche der Lyse-Mischung zugesetzt wurde, gebunden.
Nach einem Wasch- und Trocknungsschritt wurden die Nuklein
säuren mit 50 µl Elutionspuffer (1 mM Tris pH 8.5) eluiert
und bei -70°C gelagert.
Typische Reaktionen wurden durchgeführt in einem 20 µl Reaktions
volumen, enthaltend 40 mM Tris pH 8.5, 12 mM MgCl₂, 42 mM
KCl, 5 mM DTT, 15% v/v DMSO, jeweils 1 mM dNTP, jeweils 2 mM
NTP, 0.1 U RNase H, 0.1 µg/µl BSA, 40 U T7 RNA-Polymerase,
8 U AMV Reverse Transkriptase, 0.2 µM Primer 1,2 und 5 µl
isolierte Nukleinsäure (enthaltend 100, 200, 500, 2000 HIV-1
BNA-Moleküle). In negativen Kontrollreaktionen wurden diese
5 µl isolierter Nukleinsäure durch 5 µl bidestilliertes
Wasser ersetzt. Die Sequenzen der Amplifikationsprimer sind
innerhalb der gag Region des HIV-1-Genomes lokalisiert (Fig.
8). Sie weisen die folgenden Sequenzen auf:
Zum Reaktionsansatz wurden 1 µl TMR-markierter
gag1-Detektionsprimer (Endkonzentration: 4.5 nM) zugesetzt:
Diese Amplifikationsansätze von jeweils 21 µl wurden in ver
schließbare Probenträger, insbesondere Polycarbonatfolien
mit 96 Vertiefungen, überführt und in die auf 42°C vor
temperierte Temperierungseinheit eines dem Fachmann bekannten
FCS-Gerätes eingesetzt. In einem typischen Experiment wurden
10 Amplifikationsreaktionen einschließlich negativer Kon
trollen in parallelisierter Form durchgeführt. Die
FCS-online-Detektion erfolgte unter Verwendung eines Wasser-
Immersionsobjektives (Zeiss Plan Neofluar 40×0.9). Das durch
den Laserstrahl und ein Pinhole in einer dem Fachmann be
kannten Weise definierte Detektionsvolumen lag in der Größen
ordnung von 10-15 l.
Claims (10)
1. Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuremolekülen in
niedriger Konzentration in zu untersuchenden Proben
mittels Amplifikationsreaktionen, unter Verwendung von
Polymerasen sowie unmarkierten Primern (Amplifikations
primer) und markierten Primern (Detektionsprimer),
wobei die markierten Primer an die zu bestimmende
Nukleinsäure hybridisieren und die Abnahme der Konzen
tration der markierten Primer gemessen wird und als Maß
für das Vorhandensein des zu bestimmenden Nukleinsäure
moleküls herangezogen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die an die zu bestim
mende Nukleinsäure hybridisierten markierten Primer
durch die Amplifikationsreaktion in die amplifizierte
Nukleinsäure eingebaut werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, wobei die mar
kierten Primer mit fluoreszierenden Gruppen markiert
sind.
4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3,
wobei als Amplifikationsreaktion primerabhängige Reakt
ionen wie Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR), isothermale
3 SR (self-sustained-sequence-replication), Strand-
Displacement-Amplification (SDA), Reverse Transkriptase
PCR (RT-PCR) und/oder Nucleic Acid Sequence-based
Amplification (NASBA) eingesetzt werden.
5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, daß die Abnahme der Konzen
tration der markierten Primer mittels der Fluoreszenz
korrelationsspektroskopie (FCS) gemessen wird.
6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase keine 5′-3′-
Exonukleaseaktivität aufweist.
7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des
Detektionsprimers gering im Verhältnis zur Konzen
tration des Amplifikationsprimers ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß
die Konzentration des Amplifikationsprimers das 5- bis
200-fache der Konzentration des Detektionsprimers
beträgt.
9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren mittels
Probenträgern, insbesondere Polycarbonat-Folien, durch
geführt wird.
10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9,
dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der
nachzuweisenden Nukleinsäuremoleküle bestimmt wird.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19634226A DE19634226A1 (de) | 1996-08-24 | 1996-08-24 | Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuremolekülen in niedriger Konzentration |
PCT/EP1996/005472 WO1997021832A1 (de) | 1995-12-08 | 1996-12-06 | Verfahren zur bestimmung von nukleinsäuremolekülen in niedriger konzentration |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19634226A DE19634226A1 (de) | 1996-08-24 | 1996-08-24 | Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuremolekülen in niedriger Konzentration |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
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ID=7803578
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DE19634226A Withdrawn DE19634226A1 (de) | 1995-12-08 | 1996-08-24 | Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuremolekülen in niedriger Konzentration |
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DE (1) | DE19634226A1 (de) |
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1996
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