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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Verfahren
zur Amplifikation von Nukleinsäuren
stellen zweckdienliche Werkzeuge für die Detektion von Humanpathogenen,
Detektion von humanen genetischen Polymorphismen, Detektion von
RNA- und DNA-Sequenzen, für
die Klonierung von Molekülen,
die Sequenzierung von Nukleinsäuren
und ähnliches
bereit. Insbesondere ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ein
wichtiges Werkzeug für
die Klonierung von DNA-Sequenzen, für die Gerichtsmedizin, für Vater-
und Mutterschaftstests, Identifizierung von Pathogenen, Krankheitsdiagnose
und für
andere zweckdienliche Verfahren geworden, in denen die Amplifikation
einer Nukleinsäuresequenz
erwünscht
ist. Siehe z.B. PCR Technology: Principles and Applications for
DNA Amplification (Erlich, ed., 1992); PCR Protocols: A Guide to
Methods and Applications (Innis et al., eds., 1990).
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Die
PCR erlaubt das Kopieren und folglich eine Amplifikation einer Zielnukleinsäure. Zusammengefasst
wird eine Zielnukleinsäure,
z.B. DNA, mit einem Sense- und Antisense-Primer, dNTPs, DNA-Polymerase und
weiteren Reaktionskomponenten kombiniert. Siehe Innis et al. Der
Sense-Primer kann an den Antisense-Strang einer DNA von Interesse
assoziieren. Der Antisense-Primer kann an den Sense-Strang der DNA-Sequenz
stromabwärts
der Stelle assoziieren, wo der Sense-Primer an das DNA-Ziel assoziiert.
In der ersten Amplifikationsrunde verlängert die DNA-Polymerase den
Antisense- und Sense-Primer, die an der Zielnukleinsäure assoziiert
sind. Die ersten Stränge
sind als Stränge
mit zufälliger
Länge synthetisiert.
In der zweiten Amplifikationsrunde assoziieren die Antisense- und
Sense-Primer an die elterliche Nukleinsäure und an die komplementären Sequenzen
auf den langen Strängen.
Die DNA-Polymerase verlängert
dann die assoziierten Primer und bildet Stränge diskreter Länge, die
zueinander komplementär
sind. Die nachfolgenden Runden dienen vorwiegend der Amplifizierung
von DNA-Molekülen
diskreter Länge.
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Eine
Reihe von Faktoren kann zu einer nicht funktionierenden PCR oder
anderen Amplifikationsreaktionen führen. Ein Nachteil der PCR
ist, dass Artefakte durch Fehlpriming und Primer-Dimerisation erzeugt werden
können.
Solche Artefakte können
in einer herkömmlichen
Multiplex-PCR vermehrt auftreten. Mehrere Primersets erhöhen die
Möglichkeit
einer Primerkomplementarität
an den 3'-Enden,
was zu einer Primer-Dimerisation führt. Diese Artefakte verringern
die Reaktion von dNTPs und Primer und konkurrieren erfolgreicher um
die DNA-Polymerase als die Multiplex-Templates. Derartige Artefakte können durch
ein sorgfältiges
Primerdesign und die Verwendung einer „hot start" PCR vermindert werden. Siehe Chou,
Q. et al., (1992) Nucleic Acids Research, 20: 1717–1723. Es
ist allerdings zunehmend schwierig, alle Wechselwirkungen auszuschließen, die
das Fehlpriming und die Primer-Dimerisation in einer Multiplex-Amplifikation
fördern,
da die Reaktion viele Primer in hoher Konzentration enthalten kann.
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Zusätzlich ist
bei der Multiplex-PCR beobachtet worden, dass sie die Amplifikation
eines Templates im Vergleich mit einem anderen Template bevorzugt
supprimiert. Zahlreiche Faktoren sind an dieser Suppression beteiligt.
Umfasst zum Beispiel eine Multiplex-PCR verschiedene Priming-Ereignisse
für unterschiedliche
Zielsequenzen, so kann die relative Effizienz dieser Ereignisse
für unterschiedliche
Ziele variieren. Dies kann an den Unterschieden bei der thermodynamischen
Struktur, Stabilität
und Hybridisierungskinetiken der verschiedenen eingesetzten Primer
liegen.
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Einfache
Fehler von Anwendern können
ebenfalls zu einer nicht funktionierenden Amplifikationsreaktion
führen.
Zum Beispiel führen
aufgrund von Nachlässigkeit
oder Abbau fehlende Nukleotide oder Enzyme zu einer nicht funktionierenden
Reaktion. Ähnlich
führt eine
nicht funktionsfähige
Sonde zu einer falsch negativen Reaktion, wo Sonden für eine Kontrolle
einer bestimmten Reaktion eingesetzt sind. Dies kann zum Beispiel
vorkommen, wenn eine Sonde fehlt oder die Sonde an ihre Hybridisationsstelle
nicht effizient bindet. Der Einsatz von Sonden, insbesondere von
fluoreszie renden Sonden, wird normalerweise für die Kontrolle der Akkumulation
von Reaktionsprodukten in Echtzeit genutzt, d.h. während die
Amplifikation weiterläuft.
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Mehrere
Schemata für
die Fehlerkontrolle einer Amplifikationsreaktion sind beschrieben
worden. Siehe z.B. Edwards, M. et al., PCR PRIMER, A LABORATORY
MANUAL (Dieffenbach, C. et al., eds. 1995) Seite 157–171. Zum
Beispiel ist es üblich,
positive und negative Kontrollreaktionen in separaten Reaktionsröhrchen zu
fahren. Einfache positive Kontrollen umfassen eine bekannte Menge
an Template, während
negative Kontrollen überhaupt
kein Template für
die Reaktion enthalten. Diese Kontrollen werden unter den selben
Bedingungen wie eine Testprobe durchgeführt und liefern dem Testenden
Informationen über
die Qualität
der Enzyme und Nukleotide, etc. wie auch darüber, ob die Testlösungen kontaminiert
sind.
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Erst
vor kurzem sind interne Kontrollen für die PCR entwickelt worden.
Interne Kontrollen sind von Vorteil, weil sie genau im selben Reaktionsgemisch
wie die Testprobe laufen und deshalb die Aktivität der Reagenzien in der Testprobe
selbst nicht in Frage stellen. Darüber hinaus sind interne Kontrollen
effizienter, weil sie weniger Reaktionen und weniger Reaktionslösung und
Reagenzien erfordern.
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Interne
Kontrollen umfassen üblicherweise
mehrere Reaktionen, die in demselben Reaktionsröhrchen (z.B. Multiplex-PCR)
durchgeführt
werden. In derartigen Reaktionen weist das Vorhandensein wenigstens
eines Amplifikationsproduktes darauf hin, dass einige Variablen,
wie Enzyme oder Nukleotide, während
der Reaktion funktionsfähig
waren. Siehe z.B. Levinson, G. et al. Human. Reprod. 7 (9): 1304–1313 (1992).
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Zusätzlich sind
ebenfalls interne Kontrollen zur Verifizierung des Vorhandenseins
des Zieltemplates beschrieben worden. Zum Beispiel in Multiplex-Assays,
wo eng verwandte Templates, wie Pathogenstämme, mittels Amplifizieren
differierender Sequenzen unterschieden werden, liefern Primer für eine Sequenz,
die in allen Templates vorkommt, eine positive Kontrolle für die Amplifikation.
Siehe z.B. Kaltenboeck, B., et al., J. Clin. Microbiol. 30 (5):
1098–1104
(1992); Way, J., et al., Appl. Environ. Microbiol. 59 (5): 1473–1479 (1993); Wilton,
S. et al., PCR Methods Appl. 1: 269–273 (1992). Rosenstraus et
al. (J. Clin. Microbiol. 36 (1): 191–197 (1998)) haben eine interne
Kontrolle beschrieben, die zu denjenigen der Zielsequenz identische
Primer-bindende Regionen enthält,
und die eine einzigartige Sonden-bindende
Region enthält,
welche die Kontrolle von der amplifizierten Zielsequenz unterscheidet.
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U.S.
5.789.153 beschreibt ein Verfahren zur Quantifizierung von Nukleinsäure. WO
00/46401 beschreibt ein Referenzmaterial für eine Nukleinsäure-Amplifikation.
WO 95/02067 beschreibt ein verbessertes Verfahren zur Quantifizierung
von Nukleinsäure.
WO 99/42618 beschreibt eine quantitative Bestimmung von Nukleinsäure-Amplifikationsprodukten.
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Wie
oben diskutiert, ist häufig
die Quantifizierung der PCR-Produkte mit Hilfe verschiedener fluoreszierender
Sonden erwünscht.
Beispiele für
zweckdienliche fluoreszierende Sonden umfassen, z.B. Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
(FRET), molekulares Leuchtfeuer und TaqMan® Sonden.
Gegenwärtig
gibt es allerdings kein internes Kontrollverfahren, das die Aktivität einer
Ziel-spezifischen Sonde im selben Reaktionsgemisch wie die Testprobe
validiert. Um eine vollständig
validierte Amplifikationsreaktion zu erhalten, muss deshalb eine
positive Kontrolle in einem separaten Reaktionsröhrchen gefahren werden, um
sicherzustellen, dass die Ziel-spezifische Sonde korrekt funktioniert.
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Dementsprechend
besteht ein Bedarf an Zusammensetzungen für eine interne Kontrolle und
an zweckdienlichen Verfahren zur Messung dieser und anderer Amplifikationsvariablen.
Die vorliegende Erfindung erfüllt
diesen Bedarf und stellt zweckdienliche Verfahren und Zusammensetzungen
für eine
Durchführung
einer vollständig
intern kontrollierten Amplifikationsreaktion bereit.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Durchführung einer
Amplifikationsreaktion bereit. Die Schritte der Reaktion umfassen:
- (a) Kombinieren in einer wässrigen Lösung:
- (i) eine Zielsonde, eine erste Kontrollsonde und eine zweite
Kontrollsonde;
- (ii) einen ersten 5'-Primer,
einen ersten 3'-Primer
und ein Zieltemplate, wobei das Zieltemplate eine Hybridisationsstelle
für den
ersten 5'-Primer,
den ersten 3'-Primer
und die Zielsonde umfasst;
- (iii) ein erstes Kontrolltemplate, wobei das erste Kontrolltemplate
eine Hybridisationsstelle für
den ersten 5'-Primer,
den ersten 3'-Primer
und die erste Kontrollsonde umfasst; und
- (iv) einen zweiten 5'-Primer,
einen zweiten 3'-Primer
und ein zweites Kontrolltemplate, wobei das zweite Kontrolltemplate
eine Hybridisationsstelle für
den zweiten 5'-Primer,
den zweiten 3'-Primer,
die Zielsonde und eine zweite Kontrollsonde umfasst;
- (b) Durchführen
einer Amplifikationsreaktion; und
- (c) Quantifizieren einer Bindung der Zielsonde, ersten Kontrollsonde
und zweiten Kontrollsonde.
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In
einigen Anwendungsformen wird der Quantifizierungsschritt während der
Amplifikationsreaktion durchgeführt.
In einigen Anwendungsformen wird der Quantifizierungsschritt nach
der Amplifikationsreaktion durchgeführt.
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In
einigen Anwendungsformen umfassen die Zielsonde, erste Kontrollsonde
und zweite Kontrollsonde ein Fluorophor. Zum Beispiel können die
Zielsonde, erste Kontrollsonde und zweite Kontrollsonde jeweils
ein Fluorophor umfassen, das bei verschiedenen Wellenlängen des
Lichts fluoresziert. In einigen Anwendungsformen können die
Zielsonde, erste Kontrollsonde und zweite Kontrollsonde außerdem jeweils
ein Quenching-Reagenz umfassen. In einigen Anwendungsformen werden
die Zielsonde, erste Kontrollsonde und zweite Kontrollsonde während der
Amplifikationsreaktion enzymatisch gespalten. Zum Beispiel können das
Quenching-Reagenz
und das Fluorophor getrennt werden, wenn die Sonden an ihre Hybridisationsstellen
hybridisieren.
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In
einigen Anwendungsformen ist die Amplifikationsreaktion eine thermozyklische
Amplifikationsreaktion. Zum Beispiel kann die thermozyklische Amplifikationsreaktion
eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sein. In einigen Anwendungsformen
ist die Amplifikationsreaktion eine isothermale Reaktion. Zum Beispiel kann
die isothermale Amplifikationsreaktion eine Transkriptions-vermittelte
Reaktion (TMA) sein.
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Die
vorliegende Erfindung stellt außerdem
Kits bereit, umfassend:
- (a) eine Zielsonde,
eine erste Kontrollsonde und eine zweite Kontrollsonde;
- (b) einen ersten 5'-Primer
und einen ersten 3'-Primer;
- (c) ein erstes Kontrolltemplate, wobei das erste Kontrolltemplate
eine Hybridisationsstelle für
den ersten 5'-Primer,
den ersten 3'-Primer
und die erste Kontrollsonde umfasst; und
- (d) einen zweiten 5'-Primer,
einen zweiten 3'-Primer
und ein zweites Kontrolltemplate, wobei das zweite Kontrolltemplate
eine Hybridisationsstelle für
den zweiten 5'-Primer,
den zweiten 3'-Primer,
die Zielsonde und die zweite Kontrollsonde umfasst.
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In
einigen Anwendungsformen umfasst das Kit außerdem Nukleotide und eine
DNA-Polymerase.
In einigen Anwendungsformen umfassen die Zielsonde, erste Kontrollsonde
und zweite Kontrollsonde ein Fluorophor. Zum Beispiel können die
Zielsonde, erste Kontrollsonde und zweite Kontrollsonde außerdem ein
Quenching-Reagenz
umfassen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine Lösung bereit, umfassend:
- (a) eine Zielsonde, eine erste Kontrollsonde
und eine zweite Kontrollsonde;
- (b) einen ersten 5'-Primer
und einen ersten 3'-Primer;
- (c) ein erstes Kontrolltemplate, wobei das erste Kontrolltemplate
eine Hybridisationsstelle für
den ersten 5'-Primer,
den ersten 3'-Primer
und die erste Kontrollsonde umfasst; und
- (d) einen zweiten 5'-Primer,
einen zweiten 3'-Primer
und ein zweites Kontrolltemplate, wobei das zweite Kontrolltemplate
eine Hybridisationsstelle für
den zweiten 5'-Primer,
den zweiten 3'-Primer,
die Zielsonde und die zweite Kontrollsonde umfasst.
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In
einigen Anwendungsformen umfasst die Lösung außerdem Nukleotide und eine
DNA-Polymerase. Darüber
hinaus können
die Zielsonde, erste Kontrollsonde und zweite Kontrollsonde ein
Fluorophor umfassen. Zusätzlich
können
die Zielsonde, erste Kontrollsonde und zweite Kontrollsonde außerdem ein
Quenching-Reagenz umfassen.
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DEFINITIONEN
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Eine „Amplifikationsreaktion" bezeichnet jede
chemische, einschließlich
enzymatische, Reaktion, die zu vermehrten Kopien einer Template-Nukleinsäuresequenz
führt.
Amplifikationsreaktionen umfassen Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
und Ligase-Kettenreaktion (LCR) (siehe U.S. Patente 4.683.195 und
4.683.202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis
et al., eds., 1990)), Strangverdrängungsamplifikation (SDA) (Walker,
et al., Nucleic Acids Res. 20 (7): 1691–6 (1992); Walker PCR Methods
Appl. 3 (1): 1–6 (1993)),
Transkriptions-vermittelte Amplifikation (Phyffer, et al., J. Clin.
Microbiol. 34: 834–841
(1996); Vuorinen, et al., J. Clin. Microbiol. 33: 1856–1859 (1995)),
Nukleinsäuresequenz-basierte
Amplifikation (NASBA) (Compton, Nature 350 (6313): 91–2 (1991),
Rolling Circle Amplifikation (RCA) (Lisby, Mol. Biotechnol. 12 (1): 75–99 (1999));
Hatch et al., Genet. Anal. 15 (2): 35–40 (1999)) und branched DNA-Signalamplifikation
(bDNA) (siehe z.B. Iqbal et al., Mol. Cell Probes 13 (4): 315–320 (1999)).
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Eine „thermozyklische
Amplifikationsreaktion" bezeichnet
die Amplifikation von DNA-Fragmenten
unter Verwendung von Primer-Oligonukleotiden, die mit Hilfe eines
thermostabilen Enzyms Kopien einer Template-Nukleinsäuresequenz
synthetisiert oder ligiert. Thermozyklische Reaktionen, wie die
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und die Ligase-Kettenreaktion (LCR),
sind gut bekannt.
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Ein „Ziel" oder „Zielnukleinsäure" bezeichnet eine
einzel- oder doppelsträngige
Polynukleotidsequenz, die in einer thermozyklischen Amplifikationsreaktion
amplifiziert werden soll.
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Eine „Sonde" bezeichnet eine
Polynukleotidsequenz, die in der Lage ist, an eine Polynukleotidsequenz von
Interesse zu hybridisieren, und die Detektion der gewählten Polynukleotidsequenz
erlaubt. Zum Beispiel können „Sonden" an fluoreszierende
oder radioaktive Reagenzien gebundene Polynukleotide umfassen, wodurch
die Detektion dieser Reagenzien ermöglicht wird.
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Ein „Template" bezeichnet eine
doppelsträngige
Polynukleotidsequenz, welche das zu amplifizierende Polynukleotid
umfasst, das von den Primer-Hybridisationsstellen flankiert ist.
Folglich umfasst ein „Zieltemplate" die Zielpolynukleotidsequenz,
die von den Hybridisationsstellen für einen 5'-Zielprimer und für einen 3'-Zielprimer flankiert ist. Ein „Kontrolltemplate" bezeichnet eine
Polynukleotidsequenz, die von Primer-Hybridisationssequenzen flankiert ist.
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Ein „5'-Zielprimer" bezeichnet eine
Polynukleotidsequenz, üblicherweise
mit einer Länge
von weniger als 100 Nukleotiden, die an eine Sequenz auf dem Zieltemplate
hybridisiert, die stromaufwärts
des Zielpolynukleotids liegt. Ein „3'-Zielprimer" bezeichnet eine Polynukleotidsequenz, üblicherweise
mit einer Länge
von weniger als 100 Nukleotiden, dessen komplementäre Sequenz
an eine Sequenz stromabwärts
des Zielpolynukleotids auf dem Zieltemplate hybridisiert.
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Eine „Hybridisationsstelle" bezeichnet eine
Polynukleotidsequenz, die für
einen Primer oder Sonden-Polynukleotidsequenz komplementär ist und
die von einem spezifischen Primer oder einer spezifischen Sonde
gebunden werden kann.
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„Quantifizieren
des Bindens" bezeichnet
das Messen des absoluten oder relativen Bindens von Sondenmolekülen an Bereiche
einer Nukleinsäure,
an die sie hybridisieren. Zum Beispiel kann das Binden fluoreszierender
Sonden mit Hilfe der FRET-Technologie durch Quantifizieren der Menge
emittierten Lichts von einer Probe bei einer bestimmten Wellenlänge gemessen
werden. Alternativ kann das Binden von Sonden mit Hilfe von Blotting-
und Hybridisierungsstandardverfahren (z.B. Southern blotting) mit
verschiedenen Computer-gestützten
Scanning-Vorrichtungen
quantifiziert werden.
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„Im Wesentlichen
gleiche Konzentrationen" bedeutet,
dass die Konzentration eines gelösten
Stoffes zwischen 95% bis 105% der Konzentration wenigstens eines
anderen gelösten
Stoffes beträgt.
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Der
Ausdruck „Fluorophor" bezeichnet chemische
Verbindungen, die, wenn sie mittels Exposition an bestimmten Wellenlängen des
Lichts angeregt werden, Licht bei einer anderen Wellenlänge emittieren
(d.h. fluoreszieren).
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Wenn
die Energie des angeregten Zustands des Fluorophors auf einen Nichtfluorophor-Akzeptor übertragen
wird, wird die Fluoreszenz des Fluorophors ohne anschließende Emission
der Fluoreszenz von dem Akzeptor gelöscht. In diesem Fall dient
der Akzeptor als ein „Quencher".
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Der
Ausdruck „Nukleinsäure" bezieht sich auf
Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide und Polymere davon entweder
in der einzel- oder doppelsträngigen
Form. Der Ausdruck umfasst Nukleinsäuren, die bekannte Nukleotid-Analoga
oder modifizierte Rückgratreste
oder -verknüpfungen
enthalten, die synthetisch, natürlich
vorkommend und nichtnatürlich
vorkommend sind, die ähnliche
Bindungseigenschaften wie die Referenznukleinsäure aufweisen und die in ähnlicher
Weise wie die Referenznukleotide metabolisiert sind. Beispiele für derartige
Analoga umfassen ohne Einschränkung
Phosphorthioate, Phosphoramidate, Methylphosphonate, chirale Methylphosphonate,
2-O-Methylribonukleotide, Peptidnukleinsäuren (PNAs).
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Die
folgenden Abkürzungen
dienen der Vereinfachung für
den Leser:
Ziel = T
Interne Kontrolle 1 (oder erstes Kontrolltemplate)
= IC1
Interne Kontrolle 2 (oder zweites Kontrolltemplate) =
IC2
Vorwärts-(oder
erster 5')-Primer
für Ziel
und IC1 = P1
Rückwärts-(oder
erster 3')-Primer
für Ziel
und IC1 = P2
Vorwärts-(oder
zweiter 5')-Primer
für IC2
= P3
Rückwärts-(oder
zweiter 3')-Primer
für IC2
= P4
Hybridisationssonde für
das Ziel und IC2 („Zielsonde") = HP1
Hybridisationssonde
für IC1
(„erste
Kontrollsonde")
= HP2
Hybridisationssonde für
IC2 („zweite
Kontrollsonde")
= HP3
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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1 ist
eine schematische Darstellung einer Anwendungsform der Erfindung.
Primer P1 und P2 steuern die Amplifikation des Zieltemplates. In
dieser Anwendungsform gibt es drei Templates: das Zieltemplate (T),
das interne Kontrolltemplate (IC1) und das interne Kontrolltemplate
2 (IC2). Das Produkt dieser Reaktion wird von der Zielsonde (HP1)
gebunden. Primer 1 und 2 steuern ebenfalls die Amplifikation des
internen Kontrolltemplates 1. Das Produkt dieser Reaktion wird von
der internen Kontrollsonde 1 (HP2) gebunden. Schließlich steuern
die Primer P3 und P4 die Amplifikation des internen Kontrolltemplates
2. Das Produkt dieser Reaktion kann sowohl von HP1 als auch von
der internen Kontrollsonde 2 (HP3) gebunden werden.
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BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN
ANWENDUNGSFORMEN
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I. EINFÜHRUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt neuartige Verfahren, Kits und Lösungen bereit,
die eine vollständige interne
Kontrolle für
Amplifikationsreaktionen, wie die PCR, bereitstellen. Insbesondere
stellt die Erfindung wenigstens drei Polynukleotidsequenzen bereit:
ein Zieltemplate (T) und zwei Kontrolltemplates (IC1 und IC2). Die
beiden Kontrolltemplates dienen der Kontrolle der Vollständigkeit
der Amplifikationsreaktion. Amplifikationsprodukte des Ziels und
der Kontrolltemplates können
durch die Quantifizierung der Sondenbindung an die Reaktionsprodukte
gemessen werden. Folglich stellt jedes Amplifikationsprodukt ein
Ziel für
wenigstens eine entsprechende Sonde dar, die für eine Detektion und Quantifizierung
der Amplifikationsprodukte zweckdienlich ist.
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Die
Erfindung stellt ein Zieltemplate (T) bereit, das eine Nukleinsäure mit
Hybridisationsstellen für
einen 5' und 3'-Zielprimer (P1 beziehungsweise
P2) umfasst. Das Zieltemplate (T) umfasst eine Polynukleotidsequenz,
die amplifiziert werden soll („die
Zielsequenz"). Diese
Sequenz oder eine Teilsequenz dieser Sequenz stellt eine Hybridisierungssequenz
für eine
Zielsonde (HP1) dar.
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Das
erste Kontrolltemplate (IC1) umfasst die gleichen Zielprimer-Hybridisationssequenzen
(d.h. für
P1 und P2) wie für
das Zieltemplate (T) und eine Sonden-Hybridisationssequenz, die sich vom
Zieltemplate unterscheidet. Folglich kontrolliert die Amplifikation
von diesem Template die Vollständigkeit
der allgemeinen Reaktion, z.B. Funktion von Enzym, Reagenzien, Zielprimer,
etc. Falls zum Beispiel kein Zielprodukt produziert ist, aber das
erste Kontrolltemplate (IC1) in einer Reaktion amplifiziert ist,
deutet dies darauf hin, dass die Amplifikationsbedingungen (Puffer,
Temperatur, Primer, Enzyme, etc.) eine Amplifizierung des Templates
zuließen.
Falls das erste Kontrolltemplate (IC1) nicht amplifiziert ist, so
ist es wahrscheinlich, dass das Reaktionsgemisch fehlerhaft war
und deshalb ein negatives Produkt von dem Template nicht auf ein
Fehlen eines Templates zurückzuführen ist.
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Das
zweite Kontrolltemplate (IC2) umfasst Hybridisationssequenzen für die Zielsonde
(HP1) und eine zweite Kontrollsonde (HP3). Diese beiden Sequenzen
sind von Hybridisationssequenzen für ein Paar zweiter Kontrollprimer
(P3 und P4) flankiert. Eine Amplifikation dieses Templates stellt
eine Kontrolle für
das Binden der Zielsonde (HP1) an die Zielsequenz dar. Falls zum
Beispiel die zweite Kontrollsonde (HP3) kein Signal erzeugt, dann
ist es wahrscheinlich, dass es keine Amplifikation des zweiten Kontrolltemplates
(IC2) gab. Falls allerdings die zweite Kontrollsonde (HP3) ein Signal
erzeugt, die Zielsonde (HP1) jedoch keines, so ist es wahrscheinlich,
dass die Zielsonde (HP1) nicht funktioniert.
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Weil
das zweite Kontrolltemplate (IC2) jeweils eine Kopie der Zielsonden-Hybridisationssequenz
und der zweiten Kontrollhybridisationssequenz besitzt, sollte ein
Signal von der Zielsonde (HP1) und der zweiten Kontrollsonde (HP3)
im Wesentlichen gleich sein, falls das Zieltemplate (T) nicht vorhanden
ist. Falls das Zieltemplate (T) vorhanden ist, so sollten mehr Hybridisationssequenzen
für die
Zielsonde (HP1) (d.h. Zielamplifikationsprodukte) im Verhältnis zu
Hybridisationssequenzen für
die zweite Kontrollsonde (HP3) verfügbar sein. Folglich sollte
eine korrekt funktionierende Reaktion mehr Signal von einer Zielsonde
(HP1) als von der zweiten Kontrollsonde (HP3) ergeben. Dies ist
besonders für
frühe Amplifikationsrunden
zutreffend. Deshalb kann in einigen Anwendungsformen eine Echtzeitmessung
der Sondenbindung, z.B. für
eine quantitative PCR, zweckdienlich sein, wie unten diskutiert.
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II. ZIELTEMPLATES
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Zielnukleinsäuresequenzen
können
doppel- oder einzelsträngige
DNA oder RNA aus einer beliebigen biologischen Quelle, z.B. Bakterium,
Tier, Pflanze etc., sein. Vorzugsweise ist das Zieltemplate eine
isolierte DNA-Sequenz. Ziel-DNA-Sequenzen können mit Hilfe verschiedener
Techniken isoliert sein. Zum Beispiel sind Verfahren zur Lyse von
Organismen und zur Präparation
von Extrakten oder Reinigung von DNA bekannt. Siehe Current Protocols
in Molecular Biology Volumes 1–3,
John Wiley & Sons,
Inc. (Ausubel et al., eds., 1994–1998) (nachstehend „Ausubel
et al."). Ebenfalls
können
Gesamt-RNA oder PolyA + RNA revers transkribiert werden, um cDNA
herzustellen, die als Ziel-DNA dienen kann.
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Im
Allgemeinen sind die unten beschriebene Terminologie und Laborverfahren
der rekombinanten DNA-Technologie bekannt und finden üblicherweise
im Fachgebiet Verwendung. Standardtechniken sind für die Klonierung,
Isolierung, Amplifikation und Reinigung von DNA und RNA angewandt.
Im Allgemeinen sind Enzymreaktionen, welche DNA-Ligase, DNA-Polymerase,
Restriktionsendonukleasen und ähnliches
umfassen, entsprechend den Herstelleranleitungen durchgeführt. Diese
Techniken und verschiedene andere Techniken sind im Allgemeinen
nach Sambrook et al., Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989) oder
Ausubel et al., oben, durchgeführt.
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Im
Allgemeinen sind die Nukleinsäuren,
die Gene der Ziel-DNA-Sequenzen von Interesse codieren, von cDNA
und genomischen DNA-Bibliotheken durch Hybridisierung mit einer
Sonde kloniert oder mit Hilfe von Amplifikationstechniken mit Oligonukleotid-Primern
isoliert. Vorzugsweise sind die Zieltemplatesequenzen Polynukleotidsequenzen
von Humanpathogenen. In einer anderen Anwendungsform stammt das
Zieltemplate von Nukleinsäuren
von Säugern
(z.B. Mensch). Ziel-DNA-Sequenzen
sind üblicherweise
aus Säuger-Nukleinsäure-Bibliotheken
(genomische DNA oder cDNA) durch Hybridisieren mit einer Nukleinsäure-Sonde
isoliert, wobei deren Sequenz von dem Gen der zu klonierenden Ziel-DNA-Sequenz
stammen kann.
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Primer-basierte
Amplifikationstechniken können
ebenfalls zur Amplifizierung und Isolierung von Ziel-DNA-Sequenzen
von DNA oder RNA angewandt sein (siehe z.B. Dieffenbach & Dveksler (1995)
PCR Primer: A Laboratory Manual). Primer können z.B. für die Amplifizierung entweder
der vollständigen
Sequenz oder einer Sonde von ein bis mehreren hundert Nukleotiden
verwendet sein, die dann für
eine Durchmusterung einer Säuger-Bibliothek
auf eine vollständige
Nukleinsäure
der Wahl verwendet ist. Zum Beispiel können degenerierte Primersets
für eine
Isolierung relevanter Ziel-DNA-Sequenzen verwendet sein. Nukleinsäuren können ebenfalls
von Expressionsbibliotheken unter Verwendung von Antikörpern als
Sonden isoliert sein. Derartige polyklonale oder monoklonale Antikörper können unter
Verwendung der vorhergesagten Aminosäuresequenz der zu klonierenden
Ziel-DNA-Sequenz produziert sein.
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Polymorphe
Varianten und Allele, die im Wesentlichen mit der Ziel-DNA-Sequenz
der Wahl identisch sind, können
mit Hilfe von Nukleinsäuresonden
und Oligonukleotiden unter stringenten Hybridisierungsbedingungen
mittels Durchmusterung von Bibliotheken isoliert sein. Alternativ
können
Expressionsbibliotheken verwendet sein, um Varianten der zu klonierenden
Ziel-DNA-Sequenz zu klonieren, wie polymorphe Varianten, Interspezies-Homologe
und Allele, mit Hilfe der immunologischen Detektion exprimierter
Homologe mit Antiseren oder gereinigten Antikörpern, die gegen die vorhergesagte
Aminosäuresequenz
der Ziel-DNA-Sequenz hergestellt sind.
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Zur
Herstellung einer cDNA-Bibliothek sollte man eine Quelle wählen, die
reich an mRNA der Ziel-DNA-Sequenz von Interesse ist. Aus der mRNA
wird dann unter Verwendung von reverser Transkriptase cDNA hergestellt,
in einen rekombinanten Vektor ligiert und in einen rekombinanten
Wirt zur Vermehrung, Durchmusterung und Klonierung transfiziert.
Verfahren zur Herstellung und Durchmusterung von cDNA-Bibliotheken sind
gut bekannt (siehe z.B. Gubler & Hoffman,
(1983) Gene 25: 263– 269;
Sambrook et al., (2. Ausgabe 1989) Molecular Cloning, A Laboratory
Manual; und Ausubel et al.
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Für eine genomische
DNA-Bibliothek ist die DNA aus dem Gewebe und entweder mechanisch
geschnitten oder enzymatisch verdaut, um Fragmente von etwa 12–20 kb zu
gewinnen. Die Fragmente sind dann mittels Gradientenzentrifugation
von unerwünschten
Größen abgetrennt
und in nichtlambda-Expressionsvektoren hineinkonstruiert. Diese
Vektoren sind in vitro verpackt. Rekombinante Phagen sind mit Hilfe
der Plaque-Hybridisierung, wie in Benton & Davis (1977), Science 196: 180–182 beschrieben,
untersucht. Kolonie-Hybridisierung erfolgt, wie allgemein von Grunstein
et al., (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3961–3965, beschrieben.
Ein alternatives Verfahren zur Isolierung einer Nukleinsäure und
ihrer Homologe kombiniert die Verwendung synthetischer Oligonukleotid-Primer
und Amplifikation eines RNA- oder DNA-Templates mit Hilfe der PCR
(siehe unten).
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Synthetische
Oligonukleotide können
zur Konstruktion rekombinanter Nukleinsäuren für eine Verwendung als Sonden
oder für
eine Expression der Ziel-DNA-Sequenzproteine
verwendet sein. Oligonukleotide können chemisch gemäß dem Phosphoramidittriester-Festphasenverfahren,
das zuerst von Beaucage & Caruthers,
(1981) Tetrahydron Letts. 22: 1859–1862 beschrieben worden ist,
mit Hilfe eines automatischen Synthetisierers, wie es in Van Devanter
et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12: 6159–6168 beschrieben ist, chemisch synthetisiert
sein. Die Reinigung der Oligonukleotide erfolgt üblicherweise entweder mit einer
nativen Acrylamidgelelektrophorese oder mittels Anionenaustausch-HPLC,
wie von Pearson & Ranier,
(1983) J. Chrom. 255: 137–149,
beschrieben. Die Sequenz der klonierten Gene und synthetischen Oligonukleotide
kann nach dem Klonieren mit Hilfe z.B. des Kettenabbruchverfahrens
zur Sequenzierung doppelsträngiger
Templates nach Wallace et al., (1981) Gene 16: 21–26 verifiziert
sein. Dieses Verfahren ist unter Verwendung einer Reihe überlappender
Oligonukleotide durchgeführt,
die normalerweise 40–120
bp lang sind und sowohl den Sense-Strang als auch den Antisense-Strang
des Gens darstellen. Diese DNA-Fragmente werden dann assoziiert, ligiert
und kloniert.
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Alternativ
können
Amplifizierungsverfahren mit exakten Primern angewandt sein, um
eine spezifische Subsequenz der Ziel-DNA-Sequenz zu amplifizieren,
die von der Nukleinsäure
codiert ist. Die spezifische Subsequenz wird dann in einen Vektor
ligiert.
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III. ERSTES UND ZWEITES
KONTROLLTEMPLATE
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Wie
oben beschrieben, ist das erste Kontrolltemplate (IC1) eine Nukleinsäure, die
Hybridisationssequenzen für
eine erste Kontrollsonde (HP2) umfasst, die von den Zielprimern
(P1 und P2) flankiert sind. Das zweite Kontrolltemplate (IC2) ist
eine Nukleinsäure,
die Hybridisationssequenzen für
die Zielsonde (HP1) und die zweite Kontrollsonde (HP3) umfasst,
die von Hybridisationssequenzen für die zweiten Kontrollprimer
(P3 und P4) flankiert sind. In einigen Anwendungsformen sind beide
Kontrolltemplates in einem einzigen Polynukleotidmolekül enthalten.
Alternativ kann das Kontrolltemplate zu dem Reaktionsgemisch als
separate Moleküle
gegeben sein. Eine Amplifikation des ersten (IC1) und des zweiten
(IC2) Kontrolltemplates liefert unterschiedliche Informationen über die
Amplifikationsreaktion. Keine Amplifikation der ersten Kontrolle
(IC1) weist darauf hin, dass die Basisreagenzien der Amplifikation
(Enzym, Inhibitor-freie Lösung,
Primer, Reaktionstemperaturen, etc.) mangelhaft waren. Eine Amplifikation
und Sondenbindung an der zweiten Kontrolle (IC2) liefert Informationen über die
Bindungsfähigkeit
der Zielsonde.
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Die
zweite Kontrolle (IC2) liefert die meiste Information, wenn die
Konzentration der bindenden Zielsonde (HP1) mit der Konzentration
der zweiten Kontrollsonde (HP3) verglichen wird. Bei Abwesenheit
des Zieltemplates (T) sollten Zielsonde (HP1) und zweite Kontrollsonde
(HP3) gleiche Mengen an DNA binden. Siehe Tabelle 1. Falls allerdings
die Zielsonde mangelhaft ist, dann bindet die Zielsonde (HP1) weniger
oder keine DNA, während
die zweite Kontrollsonde (HP2) alle ihre amplifizierten Hybridisationssequenzen
binden sollte. Andererseits, falls das Zieltemplate (T) vorhanden
und amplifiziert ist, dann bindet mehr Zielsonde (HP1) ihre Hybridisationssequenz
und mehr Zielsignal wird im Verhältnis
zur zweiten Kontrollsonde (HP3) erzeugt werden.
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Üblicherweise
liegt zu Beginn einer Amplifikationsreaktion wenigstens entweder
das erste Kontrolltemplate (IC1) oder das zweite Kontrolltemplate
(IC2) in höheren
Konzentrationen als das Zieltemplate (T) vor. Dies ist zweckdienlich,
um zum Beispiel sicherzustellen, dass wenigstens eine Kontrollreaktion
getestet werden kann, wobei dadurch wenigstens einige Reaktionskomponenten
validiert werden können.
Zum Beispiel liegen in einer bevorzugten Anwendungsform das erste
und zweite Kontrolltemplate (IC1 und IC2) in wenigstens 1 bis 200
Kopien pro Reaktion vor. In einer bevorzugteren Anwendungsform liegt
die Konzentration des ersten und zweiten Kontrolltemplates (IC1
und IC2) bei wenigstens 5 bis 100 Kopien pro Reaktion. In einer
besonders bevorzugten Anwendungsform liegt die Konzentration des
ersten und zweiten Kontrolltemplates (IC1 und IC2) bei etwa 10 oder
etwa 50 Kopien pro Reaktion.
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Darüber hinaus
sind in manchen Anwendungsformen die Konzentrationen der Zielsonde
(HP1), der ersten Kontrollsonde (HP2) und der zweiten Kontrollsonde
(HP3) nicht gleich. Ähnlicherweise
sind in manchen Anwendungsformen die Konzentration der Zielprimer
(P1 und P2) und die Konzentration der Kontrollprimer (P3 und P3)
unterschiedlich. Der Fachmann weiß, dass entsprechende Konzentrationen
der verschiedenen Primer-Paare und Sonden in Abhängigkeit der auszuführenden
spezifischen Reaktionen optimiert werden können.
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Das
erste (IC1) und das zweite (IC2) Kontrolltemplate besitzen vorzugsweise
ungefähr
dieselbe Länge wie
das Zieltemplate (T). Folglich ist die Zeit dieselbe, welche die
Polymerase für
die Herstellung einer Kopie der Templates benötigt, ungeachtet welches Template,
Ziel oder welche Kontrolle amplifiziert wird.
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IV. AMPLIFIKATIONSREAKTIONEN
DER ERFINDUNG
-
Die
Amplifikation eines RNA- oder DNA-Templates mit Hilfe von Reaktionen
ist bekannt (siehe U.S. Patente 4.683.195 und 4.683.202; PCR Protocols:
A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds., 1990)).
Verfahren, wie die Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) und Ligase-Kettenreaktion (LCR) können angewandt sein, um Nukleinsäuresequenzen
von Ziel-DNA-Sequenzen direkt von mRNA, von cDNA, von genomischen
Bibliotheken oder cDNA-Bibliotheken zu amplifizieren. Die Reaktion
ist bevorzugt in einem Thermocycler durchgeführt, um die Inkubation bei
erwünschten
Temperaturen zu erleichtern. Degenerierte Oligonukleotide können zur
Amplifikation von Homologen der Ziel-DNA-Sequenz unter Verwendung
bekannter Sequenzen, welche die Ziel-DNA-Sequenz codieren, konstruiert
sein. Restriktionsendonuklease-Schnittstellen
können
in die Primer eingebaut sein. Die Polymerase-Kettenreaktion oder
andere in vitro Amplifikationsverfahren können ebenfalls zweckdienlich
sein, um zum Beispiel Nukleinsäuresequenzen
zu klonieren, die für
die zu exprimierenden Ziel-DNA-Sequenzproteine codieren. Mit der
PCR-Reaktion amplifizierte Gene können aus Agarosegelen gereinigt
und in einen geeigneten Vektor kloniert werden.
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Beispielhafte
Bedingungen für
PCR-Reaktion umfassen üblicherweise
entweder zwei- oder dreistufige Zyklen. Zweistufige Zyklen umfassen
einen Denaturierungsschritt und einen anschließenden Hybridisations-/Elongationsschritt.
Dreistufige Zyklen umfassen einen Denaturierungsschritt, dann einen
Hybridisationsschritt und einen anschließenden separaten Elongationsschritt.
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Isothermische
Amplifikationsreaktionen sind ebenfalls bekannt und können gemäß den Verfahren
der Erfindung angewandt sein. Beispiele für isothermische Amplifikationsreaktionen
umfassen Strangverdrängungsamplifikation
(SDA) (Walker, et al., Nucleic Acids Res. 20 (7): 1691–6 (1992);
Walker PCR Methods Appl. 3 (1): 1–6 (1993)), Transkriptions-vermittelte
Amplifikation (Phyffer, et al., J. Clin. Microbiol. 34: 834–841 (1996);
Vuorinen, et al., J. Clin. Microbiol. 33: 1856–1859 (1995)), Nukleinsäuresequenz-basierte
Amplifikation (NASBA) (Compton, Nature 350 (6313): 91–2 (1991),
Rolling Circle Amplifikation (RCA) (Lisby, Mol. Biotechnol. 12 (1):
75–99
(1999)); Hatch et al., Genet. Anal. 15 (2): 35–40 (1999)) und branched DNA-Signalamplifikation
(bDNA) (siehe z.B. Iqbal et al., Mol. Cell Probes 13 (4): 315–320 (1999)).
Weitere dem Fachmann bekannte Amplifikationsverfahren umfassen CPR
(Cycling Probe Reaction), SSR (Self-Sustained Sequence Replication);
SDA (Strangverdrängungsamplifikation),
QBR (Q-Beta Replikase), Re-AMP (früher RAMP), RCR (Repair Chain
Reaction), TAS (Transkription-basiertes Amplifikationssystem) und
HCS.
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A. Reaktionskomponenten
-
Oligonukleotid-Primer
-
Die
Oligonukleotide, die in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden,
wie auch Oligonukleotide, die zur Detektion von Amplifikationsprodukten
konstruiert sind, können
chemisch synthetisiert sein, wie es oben beschrieben ist. Diese
Oligonukleotide können
mit Radioisotopen, chemilumineszenten Resten oder fluoreszierenden
Resten markiert sein. Derartige Markierungen sind für die Charakterisierung
und Detektion von Amplifikationsprodukten mit Hilfe der Verfahren
und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zweckdienlich.
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Die
Primerkomponenten können
in dem PCR-Reaktionsgemisch mit einer Konzentration von z.B. zwischen
0,1 und 1,0 μM
vorliegen. Wie oben diskutiert, kann die Konzentration der Zielprimer
(P1 und P2) größer als
die Konzentration der Primer P3 und P4 sein. Zum Beispiel kann die
P1-P2-Konzentration 0,6 μM
betragen, während
die Konzentration für
P3 und P4 0,4 μM
beträgt.
Die Primerlänge
kann zwischen z.B. 12–100
Nukleotiden betragen und vorzugsweise 50–60% G und C in der Zusammensetzung
enthalten. Für
die Wahl der Primer ist es bevorzugt, die exakt paarenden Basen
am 3'-Ende des Primers
zu haben, aber diese Anforderung wird am 5'-Ende relativ belanglos. Vorzugsweise
besitzen alle Primer der Erfindung ungefähr die gleiche Schmelztemperatur.
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Puffer
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Puffer,
die eingesetzt ein können,
basieren auf Borat, Phosphat, Carbonat, Barbital, Tris, etc. Siehe Rose
et al., U.S. Patent Nr. 5.508.178. Der pH der Reaktion sollte im
Bereich von etwa 4,5 bis etwa 9,5 gehalten sein. Siehe U.S. Patent
Nr. 5.508.178. Der in den Amplifikationsreaktionen eingesetzte Standardpuffer
ist ein auf Tris basierender Puffer zwischen 10 und 50 mM mit einem
pH von etwa 8,3 bis 8,8. Siehe Innis et al., oben.
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Der
Fachmann weiß,
dass die Pufferbedingungen so gestaltet sein sollen, dass sie das
Funktionieren aller Reaktionen von Interesse berücksichtigen. Folglich können die
Pufferbedingungen so gestaltet sein, dass sie die Amplifikationsreaktion
wie auch beliebige Enzymreaktionen, die mit der Erzeugung eines
Signals von Sonden in Verbindung stehen, unterstützen. Ein bestimmter Reaktionspuffer
kann auf seine Fähigkeit,
verschiedene Reaktionen zu unterstützen, durch Testen der Reaktionen
sowohl einzeln als auch in Kombination getestet werden.
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Salzkonzentration
-
Die
Konzentration der in der Reaktion vorhandenen Salze kann die Fähigkeit
der Primer beeinflussen, an die Zielnukleinsäure zu assoziieren. Siehe Innis
et al. Kaliumchlorid ist bis zu einer Konzentration von etwa 50
mM zum Reaktionsgemisch gegeben, um die Primer-Assoziierung zu fördern. Natriumchlorid
kann ebenfalls zugegeben sein, um die Primer-Assoziierung zu fördern. Siehe
Innis et al.
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Magnesiumionen-Konzentration
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Die
Konzentration von Magnesiumionen in der Reaktion kann für die Amplifikation
der erwünschten Sequenzen)
entscheidend sein. Siehe Innis et al. Primer-Assoziierung, Strangdenaturierung, Amplifikationsspezifität, Primer-Dimerisation
und Enzymaktivität
sind alles Beispiele für
Parameter, die von der Magnesiumkonzentration beeinflusst sind.
Siehe Innis et al. Amplifikationsreaktionen sollten etwa eine Magnesiumkonzentration
von 0,5 bis 2,5 mM über
der Konzentration an dNTPs enthalten. Das Vorhandensein von Magnesium-Chelatoren
in der Reaktion kann sich auf die optimale Magnesiumkonzentration
auswirken. Eine Reihe an Amplifikationsreaktionen können über einen
Bereich an Magnesiumkonzentrationen durchgeführt werden, um die optimale
Magnesiumkonzentration zu bestimmen. Die optimale Konzentration
kann in Abhängigkeit
der Natur der Zielnukleinsäure(n)
und der eingesetzten Primer und anderer Parameter variieren.
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Desoxynukleotidtriphosphat-Konzentration
-
Desoxynukleotidtriphosphate
(dNTPs) sind zu der Reaktion in einer Endkonzentration von etwa
20 μM bis
etwa 300 μM
gegeben. Jedes der vier dNTPs (G, A, C. T) sollte in gleichen Konzentrationen
vorliegen. Siehe Innis et al.
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Nukleinsäure-Polymerase
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Eine
Reihe DNA-abhängiger
Polymerasen sind im Handel erhältlich,
die mit den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
funktionsfähig
sind. Zum Beispiel kann die Taq-DNA-Polymerase verwendet sein, um
Ziel-DNA- Sequenzen
zu amplifizieren. Der PCR-Assay kann unter Verwendung als eine Enzym-Komponente
eine Quelle thermostabiler DNA-Polymerase durchgeführt sein,
die geeigneterweise Taq-DNA-Polymerase umfasst, die das von Thermus
aquaticus gereinigte native Enzym sein kann und/oder eine gentechnisch
hergestellte Form des Enzyms sein kann. Andere im Handel erhältliche
Polymerase-Enzyme umfassen z.B. von Promega oder Pharmacia vermarktete
Taq-Polymerasen. Weitere Beispiele für thermostabile DNA-Polymerasen,
die in der Erfindung verwendet sein könnten, umfassen z.B. von Thermus
und Pyrococcus Spezies gewonnene DNA-Polymerasen. Konzentrationsbereiche
der Polymerasen können
im Bereich von 1–5
Einheiten pro Reaktionsgemisch liegen. Das Reaktionsgemisch umfasst üblicherweise
zwischen 20 und 100 μl.
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In
einigen Anwendungsformen kann eine „hot start" Polymerase verwendet sein, um eine
Extension von Fehlpriming-Ereignissen zu verhindern, wenn die Temperatur
einer Reaktion zu Beginn ansteigt. Hot-Starts sind besonders im
Zusammenhang mit Multiplex-PCR zweckdienlich. Hot-Start-Polymerasen
können
zum Beispiel hitzeinstabile Addukte besitzen, die einen Hitzeaktivierungsschritt
erfordern (üblicherweise 95°C für ungefähr 10–15 Minuten),
oder einen mit der Polymerase assoziierten Antikörper umfassen, um die Aktivierung
zu verhindern.
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Weitere Agentien
-
Weitere
ausgesuchte Agentien sind manchmal zu der Reaktion gegeben, um die
erwünschten
Ergebnisse zu erzielen. Zum Beispiel kann DMSO zu der Reaktion gegeben
sein, aber es wird bereichtet, dass DMSO die Aktivität der Taq-DNA-Polymerase hemmt.
Nichtsdestotrotz ist DMSO für
die Amplifikation von mehreren Ziel-DNA-Sequenzen in derselben Reaktion
empfohlen worden. Siehe Innis et al. Stabilisatoren wie Gelatine,
bovines Serumalbumin und nichtionische Detergenzien (z.b. Tween-20)
sind normalerweise zu den Amplifikationsreaktionen gegeben. Siehe
Innis et al.
-
B. Amplifikation von mehreren
Ziel-DNA-Sequenzen
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Die
Verfahren der Erfindung können
in herkömmlichen
Multiplex-Reaktionen verwendet sein. Die Multiplex-PCR führt zur
Amplifikation von mehreren Polynukleotid-Fragmenten in derselben
Reaktion. Siehe z.B. PCR PRIMER, A LABORATORY MANUAL (Dieffenbach,
C., ed. 1995) Cold Spring Harbor Press, Seiten 157–171. Zum
Beispiel können
verschiedene Zieltemplates im selben Reaktionsgefäß zugegeben
und parallel amplifiziert werden. Der Fachmann weiß, dass
eine Reaktion mit einer zweiten (oder mehr) Zielpolynukleotidsequenz
gemäß den Verfahren
der Erfindung durch die Zugabe entsprechender erster und zweiter
Kontrollreaktion überwacht
werden kann. Folglich kann die Qualität herkömmlicher Multiplex-Reaktionen
(d.h. die Akkumulation des amplifizierten Produkts) gemäß den Verfahren
der Erfindung überwacht
sein.
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Die
Konzentration des Magnesiumsalzes im Reaktionsgemisch kann wichtig
sein, wenn versucht wird, verschiedene Ziel-DNA-Sequenzen zu kopieren.
Folglich kann eine gewisse Variation der Magnesiumsalz-Konzentration,
z.B. Magnesiumchlorid, erforderlich sein, um die Reaktion für eine Amplifizierung
der Zielnukleinsäuren
von Interesse zu optimieren. Der Fachmann kann die Konzentration
des im Reaktionsgemisch vorhandenen Magnesiumsalzes oder -ions variieren,
um geeignete Bedingungen für
eine Amplifikation zu erhalten.
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V. SONDEN
-
Sonden
der Erfindung sind in der Lage, an eine bestimmte Polynukleotidsequenz
zu hybridisieren. Folglich können
Sonden der Erfindung eine Polynukleotidsequenz umfassen, die zu
der nachzuweisenden Sequenz komplementär ist. In einigen Anwendungsformen
umfasst die Sonde ebenfalls ein Fluorophor oder ein Enzym, wie es
unten beschrieben ist, welches den Nachweis der Bindung der Sonde
an ihre komplemtäre
Sequenz erlaubt.
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Eine
Zielsonde ist eine Sonde, die an die Zielsequenz bindet. Folglich
kann die Menge an amplifizierter Zielsequenz durch die Quantifizierung
der Bindung der Zielsonde an ihre komplementäre Sequenz quantifiziert werden. Ähnlicherweise
umfassen die erste und zweite Kontrollsonde Polynukleotide, die
in der Lage sind, ihre jeweiligen Kontrolltemplates zu binden. Wie
es unten beschrieben ist, können
die erste und zweite Kontrollsonde ebenfalls ein Fluorophor oder
Enzym umfassen, das für
die Detektion der gebundenen Sonde zweckdienlich ist.
-
Die
Sondenkonzentration sollte für
ein Binden an die amplifizierten Ziel- oder Kontrollsequenzen hinreichend
sein, um eine genaue Abschätzung
der Menge an amplifizierter Sequenz zu liefern. Der Fachmann weiß, dass
der Betrag der Sondenkonzentration entsprechend der Bindungsaffinität der Sonde
wie auch der Menge an zu bindender Sequenz variiert. Typische Sondenkonzentrationen
liegen im Bereich von 0,01 μM
bis 0,5 μM.
Wie es oben beschrieben ist, können
in einigen Anwendungsformen die relativen Mengen einer Sonde im
Verhältnis
zur anderen Sonde eingestellt sein, um die Sondensignale besser
zu unterscheiden. Zum Beispiel kann die Konzentration der ersten
Kontrollsonde geringer sein als die Konzentration der Zielsonde
und der zweiten Kontrollsonde, um das von der Zielsonde erzeugte
Signal besser zu unterscheiden.
-
VI. QUANTIFIZIERUNG DER
SONDENBINDUNG
-
Die
Bindung der Sonde an ihre Hybridisierungssequenz erlaubt dem Anwender,
die Akkumulation einer bestimmten Sequenz zu quantifizieren, ohne
notwendigerweise die Inhalte aus dem Reaktionsgefäß zu entnehmen.
Im Allgemeinen kann eine beliebige Markierung, die den Nachweis
und die Unterscheidung verschiedener Sonden erlaubt, gemäß den Verfahren
der Erfindung verwendet sein.
-
Die
Akkumulation des amplifizierten Produkts kann mit einem beliebigen
in der Technik bekannten Verfahren quantifiziert sein. Zum Beispiel
kann die Fluoreszenz einer Sonde durch Messen des Lichts bei einer bestimmten
Frequenz detektiert werden. Ähnlicherweise
kann die Akkumulation verschiedener chemischer Produkte, die in
einer Enzymreaktion entstehen und an der Sonde gebunden sind, zum
Beispiel durch Messen der Lichtabsorption bei einer bestimmten Wellenlänge gemessen
werden. In anderen Anwendungsformen können die Amplifikationsreaktionen
durch Blotten auf einen festen Träger und Hybridisieren mit einer
radioaktiven Nukleinsäuresonde
direkt quantifiziert werden. Sobald die nicht gebundene Sonde weggewaschen
ist, kann, wie es dem Fachmann bekannt ist, die Sondenmenge durch
Messen der Radioaktivität
quantifiziert werden. Andere Variationen dieser Technik nutzen die
Chemilumineszenz, um Hybridisationsereignisse zu detektieren.
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Eine
Messung von Amplifikationsprodukten kann nach Vollendung der Reaktion
erfolgen oder kann in „Echtzeit" (d.h. kontinuierlich)
gemessen werden. Falls eine Messung des akkumulierten amplifizierten
Produkts nach der vollendeten Amplifikation erfolgt, dann können Detektionsreagenzien
(z.B. Sonden) nach der Amplifikationsreaktion zugegeben werden.
Alternativ können
Sonden zu der Reaktion vor oder während der Amplifikationsreaktion
gegeben werden, was folglich eine Messung der amplifizierten Produkte
entweder nach Vollendung der Amplifikation oder in Echtzeit erlaubt.
Echtzeit-Messungen sind bevorzugt, da sie eine Messung bei jeder
beliebigen gegebenen Runde der Reaktion erlauben und folglich mehr
Information über
eine Akkumulation der Produkte während
der gesamten Reaktionszeit liefern. Für Messungen von Amplifikationsprodukten
in Echtzeit ist die Verwendung fluoreszierender Sonden bevorzugt.
-
Zum
Beispiel sind in einer bevorzugten Anwendungsform wenigstens drei
verschiedene Fluorophore eingesetzt, die bei drei verschiedenen
Wellenlängen
fluoreszieren. In dieser Anwendungsform ist ein Fluorophor an jede
der drei verschiedenen Sonden (z.B. Zielsonde, erste Kontrollsonde
und zweite Kontrollsonde) geheftet. Vorzugsweise sind Sonden, die
auf TaqMan®,
molekularem Leuchtfeuer oder FRET-Technologie basieren, wie es unten
diskutiert ist, in Übereinstimmung
mit der Erfindung eingesetzt. Der Fachmann weiß, dass eine große Anzahl
verschiedener Fluorophore eingesetzt sein können. Einige Fluorophore, die
in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung zweckdienlich
sind, umfassen: Fluorescein, Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), Carboxytetrachlorfluorescein
(TET), NHS-Fluorescein, 5- und/oder 6-Carboxyfluorescein (FAM),
5-(oder 6-)Iodacetamidofluorescein, 5-{[2 (und 3)-5-(Acetylmercapto)-succinyl]amino}fluorescein (SAMSA-Fluorescein)
und weitere Fluorescein-Derivate, Rhodamin, Lissaminrhodamin B Sulfonylchlorid,
Texas Rot Sulfonylchlorid, 5- und/oder 6-Carboxyrhodamin (ROX) und
weitere Rhodamin-Derivate,
Cumarin, 7-Aminomethylcumarin, 7-Amino-4-methylcumarin-3-essigsäure (AMCA)
und weitere Cumarin-Derivate, BODIPYTM Fluorophore,
Cascade BlueTM Fluorophore, wie 8-Methoxypyren-1,3,6-trisulfonsäure Trinatriumsalz, Lucifer
Gelb Fluorophore, wie 3,6-Disulfonat-4-aminonaphthalimid, Phycobiliprotein-Derivate,
Alexa Fluorfarbstoffe (von Molecular Probes, Eugene, OR, erhältlich)
und weitere Fluorophore, die dem Fachmann bekannt sind. Eine allgemeine
Auflistung zweckdienlicher Fluorophore, siehe in Hermanson, G. T.,
BIOCONJUGATE TECHNIQUES (Academic Press, San Diego, 1996). Folglich
fluoresziert jede Sonde bei einer anderen Wellenlänge und
kann einzeln ohne eine Interferenz mit weiteren Sonden detektiert
werden.
-
A. Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
-
Verfahren,
welche die Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Technik (FRET)
einsetzen, können mit
Hilfe der Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
eingesetzt sein. FRET ist eine abstandsabhängige Wechselwirkung zwischen
einem Donor- und Akzeptormolekül.
Das Donor- und Akzeptormolekül
sind Fluorophore. Falls die Fluorophore angeregt sind und die Emissionsspektren
sich überlappen, dann
wird in sehr enger Nachbarschaft (üblicherweise zwischen 10 bis
100 Ångström) die Anregung
des Donorfluorophors auf das Akzeptorfluorophor übertragen. Folglich ist die
Lebenszeit des Donormoleküls
vermindert und seine Fluoreszenz wird gelöscht, während die Fluoreszenzintensität des Akzeptormoleküls erhöht und depolarisiert
wird. Wenn die Energie des angeregten Zustands des Donors auf einen
Nichtfluorophor-Akzeptor übertragen
wird, verlöscht
die Fluororeszenz des Donors ohne darauffolgende Fluoreszenz des
Akzeptors. In diesem Fall dient der Akzeptor als ein Quenching-Reagenz.
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Haarnadel-FRET-Assay
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In
einem bestimmten Verfahren, das FRET einsetzt, sind fluoreszierende
Markierungen für
den Energie-Transfer in einen PCR-Primer eingebaut, der eine Haarnadelstruktur
einnehmen kann. Siehe Nazarenko et al., U.S. Patent Nr. 5.866.336;
Nadeau et al., U.S. Patent Nr. 5.958.700; Tygai et al., U.S. Patent
Nr. 5.925.517. Die PCR-Primer können
auf eine Art und Weise gestaltet sein, dass sie nur dann, wenn der
Primer eine lineare Struktur einnimmt, d.h. in ein PCR-Produkt eingebaut
ist, ein fluoreszierendes Signal erzeugt wird. Siehe Nazarenko et
al., U.S. Patent Nr. 5.866.336; Nadeau et al., U.S. Patent Nr. 5.958.700.
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In Übereinstimmung
mit dem Verfahren von U.S. Patent Nr. 5.866.336 können FRET-Paare
in die Primer der vorliegenden Erfindung oder in Signal-Oligonukleotide eingebaut
sein, die dann zu dem Reaktionsgemisch gegeben werden können, um
ein Verfahren zum Nachweis des Einbaus des Primers in ein Polymerisierungsprodukt
zu liefern. Die Primer der vorliegenden Erfindung oder die Oligonukleotide
sind in der Lage, eine intramolekular Basen-gepaarte Struktur (z.B.
Haarnadelstruktur) einzunehmen. Die Signal-Oligonukleotide oder
die Primer der vorliegenden Erfindung sind mit zwei fluoreszierenden
Farbstoffresten modifiziert, die ein Donor/Akzeptor-Farbstoffpaar
bilden. Zum Beispiel kann der Donor-Farbstoffrest ein Fluorescein
oder Fluorescein-Derivat sein und der Akzeptor kann DABCYL sein.
Diese beiden Farbstoffe sind so auf dem markierten Oligonukleotid
positioniert, dass sie in einer sehr engen räumlichen Nähe (üblicherweise etwa 10–100 Ångström) in der
Basen-gepaarten,
gefalteten Sekundärstruktur
sind. Falls die Farbstoffe in einer engen räumlichen Nähe sind, dann wird die Donor-Fluoreszenz
von dem Akzeptor-Farbstoff gelöscht.
-
Der
Haarnadel-Primer besitzt einen Quencher an seinem 5'-terminalen Nukleotid
und enthält
ein Donor-Fluorophor an der gegenüberliegenden Seite seiner Duplex,
wobei das Fluorophor und der Quencher ein FRET-Paar bilden. In der
ersten PCR-Runde hybridisieren beide Primer an die jeweiligen Zielstränge und
werden von der DNA-Polymerase
verlängert.
In der zweiten Runde wird das verlängerte Produkt von dem Rückwärts-Primer
ein Template für
den Vorwärts-Primer
und das verlängerte
Produkt von dem Vorwärts-Primer
wird ein Template für
den Rückwärts-Primer.
Wenn der Vorwärts-Primer
an seinem 5'-Ende
der Haarnadelstruktur verlängert
wird, können
entweder zwei Dinge abhängig
von der eingesetzten DNA-Polymerase geschehen: entweder die 5'-3'-Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase
hydrolysiert die 5'-Nukleotide mit Quencher und/oder
die DNA-Polymerase verdrängt
das 5'-Ende der
Haarnadel und kopiert das Template. In beiden Fällen werden der Quencher und
das Fluorophor voneinander getrennt und ein Signal wird erzeugt.
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Bei
der praktischen Umsetzung ist festgestellt worden, dass Sonden,
wie molekulare Leuchtfeuer, die verschiedene Fluorophore enthalten,
verwendet sein können,
um kleine Unterschiede in einer Zielsequenz (S. Tyagi et al., Nature
Biotechnology 14, 303 (1996)) und die Menge einer Zielsequenz zu
unterscheiden (S. Tyagi et al., Nature Biotechnology 16, 49 (1998)).
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B. TaqMan-Assay
-
Die
Amplifikationsprodukte können
ebenfalls in Lösung
nach den Verfahren der Erfindung mit Hilfe eines fluorogenen 5'-Nuklease-Assays – des TaqMan
Assays-detektiert
werden. Siehe Holland et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88: 7276–7280;
Livak et al., U.S. Patent, Nr. 5.538.848, 5.723.591 und 5.876.930. Die
TaqMan-Sonde ist so konstruiert, dass sie an eine Sequenz innerhalb
des erwünschten
PCR-Produktes hybridisiert. Das 5'-Ende der TaqMan-Sonde enthält einen
fluoreszierenden Reporterfarbstoff. Das 3'-Ende der Sonde ist blockiert, um eine
Sondenerweiterung zu verhindern und enthält einen Farbstoff, der die
Fluoreszenz des 5'-Fluorophors
löscht.
Während
einer anschließenden
Amplifikation wird die 5' fluoreszierende
Markierung abgespalten, wenn eine Polymerase mit 5'-Exonuklease-Aktivität in der Reaktion vorhanden
ist. Das Entfernen des 5'-Fluorophors führt zu einem
Anstieg der Fluoreszenz, die detektiert werden kann.
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Eine
TaqMan-Sonde kann zusammen mit der vorliegenden Erfindung verwendet
sein. Zum Beispiel kann eine Sonde, die mit einem geeigneten Donor/Quencher-Paar markiert ist
und zu einem Teil der Zielnukleinsequenz zwischen den Bindungsstellen
der Ziel-spezifischen Primer komplementär ist, in dem TaqMan-Assay funktionieren.
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C. Enzymreaktion
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Eine
Reihe an Enzymreaktionen sind ebenfalls bekannt, die für eine Detektion
der Sonden in der Reaktion verwendet sein können. Zum Beispiel umfassen
Enzyme, die für
die Bereitstellung eines detektierbaren Produktes für die Sonden
der Erfindung zweckdienlich sind, Meerrettich-Peroxidase (MRP) (siehe
z.B. Ausubel et al. Kapitel 9), alkalische Phosphatase (AP) (siehe
z.B. Ausubel et al. Kapitel 14), Urease (siehe z.B. Ausubel et al.
Kapitel 11), β-Galactosidase
(siehe z.B. Ausubel et al. Kapitel 9), β-Glucuronidase (siehe z.B. Ausubel
et al. Kapitel 9) und α-Helikase
(siehe z.B. Eggleston, A. K., et al. Nucleic Acids Res. 24 (7):
1179–89 (1996)).
Die Akkumulation verschiedener chemischer Produkte, die über eine
Enzymreaktion gebildet sind und an der Sonde gebunden sind, können zum
Beispiel durch Messen der Licht absorption des Enzymproduktes bei
einer bestimmten Wellenlänge
gemessen werden.
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D. Hybridisierung
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In
anderen Anwendungsformen der Erfindung können die Amplifikationsreaktionen
direkt durch Blotten der Reaktionsprodukte auf einen festen Träger (z.B.
Nitrocellulose) und hybridisieren mit einer radioaktiven Nukleinsäuresonde
quantifiziert werden. Siehe Sambrook et al., oben; und Ausubel et
al. Sobald die nichtgebundene Sonde weggewaschen ist, kann die Sondenmenge
durch Messen der Radioaktivität,
wie es dem Fachmann bekannt ist, gemessen werden. Andere Variationen
dieser Technik nutzen die Chemilumineszenz, um hybridisierte Sonden
zu detektieren.
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VII. KITS UND LÖSUNGEN DER
ERFINDUNG
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Die
Erfindung stellt ebenfalls Kits und Lösungen zur Durchführung der
Amplifikationsverfahren der Erfindung bereit. Zum Beispiel stellt
die Erfindung Kits bereit, die ein oder mehrere Reaktionsgefäße umfassen, die
Aliquote von einigen oder allen Reaktionskomponenten der Erfindung
darin enthalten. Die Aliquote können in
flüssiger
oder getrockneter Form vorliegen. Die Reaktionsgefäße können Kartuschen
zur Probenverarbeitung oder andere Gefäße umfassen, die das Einschließen, Verarbeiten
und/oder die Amplifikation von Proben im selben Gefäß erlauben.
Derartige Kits erlauben die rasche Detektion von Amplifikationsprodukten
der Erfindung in tragbaren Amplifikationsvorrichtungen oder Standardvorrichtungen.
Die Kits können
ebenfalls schriftliche Gebrauchsanleitungen für den Einsatz des Kits enthalten,
um die Zielprobe zu amplifizieren und deren Amplifikation zu kontrollieren.
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Kits
können
zum Beispiel (1) eine Zielsonde, eine erste Kontrollsonde und eine
zweite Kontrollsonde, (2) einen ersten 5'-Primer und einen ersten 3'-Primer und (3) ein
erstes Kontrolltemplate enthalten. Das erste Kontrolltemplate kann
eine Hybridisationsstelle für
den ersten 5'-Primer,
den ersten 3'-Primer
und die erste Kontrollsonde umfassen. Das Kit kann ebenfalls einen
zweiten 5'-Primer,
einen zweiten 3'-Primer
und ein zweites Kontrolltemplate enthalten. Das zweite Kontrolltemplate
kann eine Hybridisationsstelle für
den zweiten 5'-Primer,
den zweiten 3'-Primer, die Zielsonde
und die zweite Kontrollsonde umfassen. Die Zielsonde, erste Kontrollsonde
und zweite Kontrollsonde des Kits umfassen ein Fluorophor, einschließlich eines
Quenchers. Zusätzlich
kann das Kit Nukleotide (A, C, G, T) und eine DNA-Polymerase enthalten.
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In
gegenwärtig
bevorzugten Anwendungsformen umfassen die Kits Gefäße, wie
Kartuschen zur Probenverarbeitung, die für eine schnelle Amplifikation
einer Probe zweckdienlich sind, wie es in Belgrader, P., et al.,
Biosensors and Bioelectronics 14: 849–852 (2000); Belgrader, P.,
et al., Science 284: 449–450
(1999); und Northrup, M. A., et al, „A New Generation of PCR Instruments
and Nucleic Acid Concentration Systems" in PCR PROTOCOLS (Sninsky, J. J. et
al. (eds.)) Academic, San Diego, Kapitel 8 (1998)) beschrieben ist.
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VIII. QUANTITATIVE AMPLIFIKATIONSREAKTIONEN
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Die
Verfahren der Erfindung sind für
eine Verwendung bei quantitativen Amplifikationsreaktionen, wie die
quantitative PCR, gut geeignet. Die quantitative Amplifikation bezieht
sich auf Verfahren zur Detektion der Menge an Nukleinsäuretemplate
in einer Probe. Die Verfahren umfassen generell den Vergleich der
Amplifikationsrate einer Probe (wie sie in mehreren Reaktionszyklen
gemessen ist) mit der Amplifikation einer bekannten Menge an Template,
d.h. die Konzentration einer positiven Kontrolle oder Kompetitorsequenz
Siehe z.B. Orlando et al., Clin. Chem. Lab. Med. 36 (5): 255–69 (1998);
Gililand, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2725–2729 (1990).
Die Quantifizierung der Amplifikationsreaktion erfolgt durch Vergleich
der Endkonzentration des Ziels mit bekannten Mengen des Kompetitors.
Die Reaktionen der Erfindung umfassen interne positive Kontrollen,
die als Kompetitoren für
die Quantifizierung wirken können.
Deshalb können
alle für
eine Quantifizierung der Produkte einer Amplifikationsreaktion erforderlichen
Daten von einer einzigen Reaktion der Erfindung erhalten sein. Darüber hinaus
können
quantitative Amplifikationsreaktionen in Echtzeit gemäß den Verfahren
der Erfindung gemessen werden.
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Untersuchungen
haben gezeigt, dass die anfängliche
Kopienzahl während
einer Echtzeit-PCR-Analyse, basierend auf dem Schwellen-Zyklus (Ct),
quantifiziert werden kann. Siehe Higuchi, R. et al., Biotechnology 11:
1026–1030
(1993). Der Ct ist als der Zyklus definiert, bei dem die Fluoreszenz
als statistisch signifikant gegen den Hintergrund bestimmt wird.
Der Schwellen-Zyklus ist zum log der anfänglichen Kopienzahl umgekehrt
proportional. Je mehr Template zu Beginn vorhanden ist, umso weniger
Zyklen werden benötigt,
um einen Punkt zu erreichen, bei dem das Fluoreszenz-Signal gegen
den Hintergrund detektierbar ist. Die auf dem Schwellen-Zyklus basierende
quantitative Information kann genauer sein als die Information,
die auf der Endpunkt-Bestimmung basiert, weil sie auf einer Messung
beruht, die während
der exponentiellen Phase der PCR-Amplifikation erfolgt, wenn die
PCR-Effizienz von
limitierenden Reagenzien, kleinen Differenzen bei Reaktionskomponenten
oder Zyklusbedingungen noch beeinflusst sein muss.
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Tabelle
1 zeigt, wie die Zyklusschwellenwerte für die Bestimmung der Vollständigkeit
einer bestimmten Reaktion zweckdienlich sind. Die Tabelle liefert
hypothetische Ct-Werte
in Abhängigkeit
verschiedener Reaktionsabläufe.
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BEISPIEL
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Es
wird ein Verfahren beschrieben, bei dem die Zugabe zweier interner
Kontrollen (IC) die Sicherheit bereitstellt, dass klinische Proben
in einem Echtzeit-Assayformat erfolgreich amplifiziert und detektiert
werden. Die erste IC ist zur Überwachung
der Vollständigkeit
des Amplifikationsgemisches, einschließlich der Primer, dNTPs und
Polymerase, eingesetzt. Die zweite IC kontrolliert die Vollständigkeit
der Ziel-spezifischen
Hybridisierungssonde. Der Wert der beiden internen Kontrollen ist,
dass der Erhalt eines positiven Signals von beiden Kontrollen eine
erfolgreiche Amplifikation anzeigt, wobei dadurch ein richtig positives
Ergebnis für
die Zielprobe validiert wird.
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Material und Methoden
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Eine
10 μl Probe
einer präparierten
Probe wird zu 15 μl
Mastergemisch, das IC1 mit 100 Kopien, IC2 mit 10 Kopien, je 0,6 μM Primer
1 und Primer 2, je 0,4 μM
Primer 3 und Primer 4, je 200 μM
dNTP, 0,4 μM FAM-markierte
Ziel- und IC2-spezifische Hybridisationssonde (HP1), 0,2 μM TET-markierte
IC1-spezifische Hybridisationssonde (HP2), 0,2 μM ROX-markierte IC2 Hybridisationssonde
(HP3) und 1,25 Einheiten Hot-Start-Polymerase mit 5' nach 3' Nuklease-Aktivität enthält. Sämtliche
Reaktionen werden in 1 × Amplifikationspuffer
durchgeführt:
10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM KCl und 3,5 mM MgCl2.
Proben werden im Cepheid Smart Cycler® System
mit den folgenden thermalen Zyklusparametern behandelt: 95°C 90 Sekunden
(initiale Denaturierung) und dann 40 Zyklen mit 95°C 15 Sekunden
und 60°C
30 Sekunden.
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Ergebnisinterpretation
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Der
Wert „X" ist als der maximale
Zyklusschwellenwert (Ct) für
ein validiertes Ergebnis für
HP2 definiert. Der Wert „Y" ist als der maximale
Zyklusschwellenwert (Ct) für
ein validiertes Ergebnis für
HP3 definiert. Der Faktor „z" stellt die Differenz
zwischen den tatsächlichen
Messungen dar, wenn HP1 (wie mit FAM gemessen) und HP3 (wie mit
ROX gemessen) Ct-Werte sind.
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Proben,
die einen FAM Ct-Wert (Ziel und IC2) um einen Faktor „z" kleiner als Y ergeben,
werden als positiv interpretiert, ungeachtet der IC1 (TET) und IC2
(ROX) Ergebnisse. Siehe Tabelle 1. Proben, die einen FAM Ct-Wert
kleiner als Y ergeben, werden als positiv interpretiert, falls der
Ct-Wert von IC1 (TET) gleich oder kleiner als X ist und der Ct-Wert
von IC2 (ROX) gleich oder kleiner als Y ist. Siehe Tabelle 1. Proben,
die einen FAM Ct-Wert (Ziel und IC2) gleich dem Ct-Wert von IC2
(ROX) ergeben, der gleich oder kleiner als Y ist, werden als negativ
interpretiert, falls der Ct-Wert
von IC1 (TET) gleich oder kleiner als X ist. Proben, die keine positiven
Signale ergeben, sind fehlerhaft und müssen wiederholt werden. Proben,
die keine FAM Ct-Werte
oder FAM Ct-Werte gleich dem Ct-Wert von IC2 (ROX) ergeben, werden
als fehlerhaft interpretiert, wenn die Ct-Werte für IC1 (TET)
und IC2 (ROX) größer als
X beziehungsweise Y sind. Siehe Tabelle 1. Proben, die einen FAM
Ct-Wert (Ziel und IC2) kleiner als den Ct-Wert von IC2 (ROX) ergeben,
werden als positiv ohne der Fähigkeit
zur Quantifizierung aufgrund von Inhibitoren interpretiert, wenn
der Ct-Wert für
IC1 (TET) und IC2 (ROX) größer als
X beziehungsweise Y ist oder geringe Endpunkt-Fluoreszenzwerte erhalten
werden. Siehe Tabelle 1.
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Obschon
die vorangehende Erfindung anhand von Abbildungen und Beispiel zum
besseren Verständnis
recht ausführlich
beschrieben worden ist, ist für
den Fachmann im Lichte der Inhalte dieser Erfindung ohne weiteres
erkennbar, dass bestimmte Änderungen
und Modifizierungen daran vorgenommen werden können, ohne von den angefügten Ansprüchen abzuweichen.
