DE60120486T2 - Eine vollständig intern kontrollierte amplifikationsreaktion ermöglichende zusammensetzungen und verfahren - Google Patents

Eine vollständig intern kontrollierte amplifikationsreaktion ermöglichende zusammensetzungen und verfahren Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren stellen zweckdienliche Werkzeuge für die Detektion von Humanpathogenen, Detektion von humanen genetischen Polymorphismen, Detektion von RNA- und DNA-Sequenzen, für die Klonierung von Molekülen, die Sequenzierung von Nukleinsäuren und ähnliches bereit. Insbesondere ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ein wichtiges Werkzeug für die Klonierung von DNA-Sequenzen, für die Gerichtsmedizin, für Vater- und Mutterschaftstests, Identifizierung von Pathogenen, Krankheitsdiagnose und für andere zweckdienliche Verfahren geworden, in denen die Amplifikation einer Nukleinsäuresequenz erwünscht ist. Siehe z.B. PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (Erlich, ed., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds., 1990).
  • Die PCR erlaubt das Kopieren und folglich eine Amplifikation einer Zielnukleinsäure. Zusammengefasst wird eine Zielnukleinsäure, z.B. DNA, mit einem Sense- und Antisense-Primer, dNTPs, DNA-Polymerase und weiteren Reaktionskomponenten kombiniert. Siehe Innis et al. Der Sense-Primer kann an den Antisense-Strang einer DNA von Interesse assoziieren. Der Antisense-Primer kann an den Sense-Strang der DNA-Sequenz stromabwärts der Stelle assoziieren, wo der Sense-Primer an das DNA-Ziel assoziiert. In der ersten Amplifikationsrunde verlängert die DNA-Polymerase den Antisense- und Sense-Primer, die an der Zielnukleinsäure assoziiert sind. Die ersten Stränge sind als Stränge mit zufälliger Länge synthetisiert. In der zweiten Amplifikationsrunde assoziieren die Antisense- und Sense-Primer an die elterliche Nukleinsäure und an die komplementären Sequenzen auf den langen Strängen. Die DNA-Polymerase verlängert dann die assoziierten Primer und bildet Stränge diskreter Länge, die zueinander komplementär sind. Die nachfolgenden Runden dienen vorwiegend der Amplifizierung von DNA-Molekülen diskreter Länge.
  • Eine Reihe von Faktoren kann zu einer nicht funktionierenden PCR oder anderen Amplifikationsreaktionen führen. Ein Nachteil der PCR ist, dass Artefakte durch Fehlpriming und Primer-Dimerisation erzeugt werden können. Solche Artefakte können in einer herkömmlichen Multiplex-PCR vermehrt auftreten. Mehrere Primersets erhöhen die Möglichkeit einer Primerkomplementarität an den 3'-Enden, was zu einer Primer-Dimerisation führt. Diese Artefakte verringern die Reaktion von dNTPs und Primer und konkurrieren erfolgreicher um die DNA-Polymerase als die Multiplex-Templates. Derartige Artefakte können durch ein sorgfältiges Primerdesign und die Verwendung einer „hot start" PCR vermindert werden. Siehe Chou, Q. et al., (1992) Nucleic Acids Research, 20: 1717–1723. Es ist allerdings zunehmend schwierig, alle Wechselwirkungen auszuschließen, die das Fehlpriming und die Primer-Dimerisation in einer Multiplex-Amplifikation fördern, da die Reaktion viele Primer in hoher Konzentration enthalten kann.
  • Zusätzlich ist bei der Multiplex-PCR beobachtet worden, dass sie die Amplifikation eines Templates im Vergleich mit einem anderen Template bevorzugt supprimiert. Zahlreiche Faktoren sind an dieser Suppression beteiligt. Umfasst zum Beispiel eine Multiplex-PCR verschiedene Priming-Ereignisse für unterschiedliche Zielsequenzen, so kann die relative Effizienz dieser Ereignisse für unterschiedliche Ziele variieren. Dies kann an den Unterschieden bei der thermodynamischen Struktur, Stabilität und Hybridisierungskinetiken der verschiedenen eingesetzten Primer liegen.
  • Einfache Fehler von Anwendern können ebenfalls zu einer nicht funktionierenden Amplifikationsreaktion führen. Zum Beispiel führen aufgrund von Nachlässigkeit oder Abbau fehlende Nukleotide oder Enzyme zu einer nicht funktionierenden Reaktion. Ähnlich führt eine nicht funktionsfähige Sonde zu einer falsch negativen Reaktion, wo Sonden für eine Kontrolle einer bestimmten Reaktion eingesetzt sind. Dies kann zum Beispiel vorkommen, wenn eine Sonde fehlt oder die Sonde an ihre Hybridisationsstelle nicht effizient bindet. Der Einsatz von Sonden, insbesondere von fluoreszie renden Sonden, wird normalerweise für die Kontrolle der Akkumulation von Reaktionsprodukten in Echtzeit genutzt, d.h. während die Amplifikation weiterläuft.
  • Mehrere Schemata für die Fehlerkontrolle einer Amplifikationsreaktion sind beschrieben worden. Siehe z.B. Edwards, M. et al., PCR PRIMER, A LABORATORY MANUAL (Dieffenbach, C. et al., eds. 1995) Seite 157–171. Zum Beispiel ist es üblich, positive und negative Kontrollreaktionen in separaten Reaktionsröhrchen zu fahren. Einfache positive Kontrollen umfassen eine bekannte Menge an Template, während negative Kontrollen überhaupt kein Template für die Reaktion enthalten. Diese Kontrollen werden unter den selben Bedingungen wie eine Testprobe durchgeführt und liefern dem Testenden Informationen über die Qualität der Enzyme und Nukleotide, etc. wie auch darüber, ob die Testlösungen kontaminiert sind.
  • Erst vor kurzem sind interne Kontrollen für die PCR entwickelt worden. Interne Kontrollen sind von Vorteil, weil sie genau im selben Reaktionsgemisch wie die Testprobe laufen und deshalb die Aktivität der Reagenzien in der Testprobe selbst nicht in Frage stellen. Darüber hinaus sind interne Kontrollen effizienter, weil sie weniger Reaktionen und weniger Reaktionslösung und Reagenzien erfordern.
  • Interne Kontrollen umfassen üblicherweise mehrere Reaktionen, die in demselben Reaktionsröhrchen (z.B. Multiplex-PCR) durchgeführt werden. In derartigen Reaktionen weist das Vorhandensein wenigstens eines Amplifikationsproduktes darauf hin, dass einige Variablen, wie Enzyme oder Nukleotide, während der Reaktion funktionsfähig waren. Siehe z.B. Levinson, G. et al. Human. Reprod. 7 (9): 1304–1313 (1992).
  • Zusätzlich sind ebenfalls interne Kontrollen zur Verifizierung des Vorhandenseins des Zieltemplates beschrieben worden. Zum Beispiel in Multiplex-Assays, wo eng verwandte Templates, wie Pathogenstämme, mittels Amplifizieren differierender Sequenzen unterschieden werden, liefern Primer für eine Sequenz, die in allen Templates vorkommt, eine positive Kontrolle für die Amplifikation. Siehe z.B. Kaltenboeck, B., et al., J. Clin. Microbiol. 30 (5): 1098–1104 (1992); Way, J., et al., Appl. Environ. Microbiol. 59 (5): 1473–1479 (1993); Wilton, S. et al., PCR Methods Appl. 1: 269–273 (1992). Rosenstraus et al. (J. Clin. Microbiol. 36 (1): 191–197 (1998)) haben eine interne Kontrolle beschrieben, die zu denjenigen der Zielsequenz identische Primer-bindende Regionen enthält, und die eine einzigartige Sonden-bindende Region enthält, welche die Kontrolle von der amplifizierten Zielsequenz unterscheidet.
  • U.S. 5.789.153 beschreibt ein Verfahren zur Quantifizierung von Nukleinsäure. WO 00/46401 beschreibt ein Referenzmaterial für eine Nukleinsäure-Amplifikation. WO 95/02067 beschreibt ein verbessertes Verfahren zur Quantifizierung von Nukleinsäure. WO 99/42618 beschreibt eine quantitative Bestimmung von Nukleinsäure-Amplifikationsprodukten.
  • Wie oben diskutiert, ist häufig die Quantifizierung der PCR-Produkte mit Hilfe verschiedener fluoreszierender Sonden erwünscht. Beispiele für zweckdienliche fluoreszierende Sonden umfassen, z.B. Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET), molekulares Leuchtfeuer und TaqMan® Sonden. Gegenwärtig gibt es allerdings kein internes Kontrollverfahren, das die Aktivität einer Ziel-spezifischen Sonde im selben Reaktionsgemisch wie die Testprobe validiert. Um eine vollständig validierte Amplifikationsreaktion zu erhalten, muss deshalb eine positive Kontrolle in einem separaten Reaktionsröhrchen gefahren werden, um sicherzustellen, dass die Ziel-spezifische Sonde korrekt funktioniert.
  • Dementsprechend besteht ein Bedarf an Zusammensetzungen für eine interne Kontrolle und an zweckdienlichen Verfahren zur Messung dieser und anderer Amplifikationsvariablen. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf und stellt zweckdienliche Verfahren und Zusammensetzungen für eine Durchführung einer vollständig intern kontrollierten Amplifikationsreaktion bereit.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Durchführung einer Amplifikationsreaktion bereit. Die Schritte der Reaktion umfassen:
    • (a) Kombinieren in einer wässrigen Lösung:
    • (i) eine Zielsonde, eine erste Kontrollsonde und eine zweite Kontrollsonde;
    • (ii) einen ersten 5'-Primer, einen ersten 3'-Primer und ein Zieltemplate, wobei das Zieltemplate eine Hybridisationsstelle für den ersten 5'-Primer, den ersten 3'-Primer und die Zielsonde umfasst;
    • (iii) ein erstes Kontrolltemplate, wobei das erste Kontrolltemplate eine Hybridisationsstelle für den ersten 5'-Primer, den ersten 3'-Primer und die erste Kontrollsonde umfasst; und
    • (iv) einen zweiten 5'-Primer, einen zweiten 3'-Primer und ein zweites Kontrolltemplate, wobei das zweite Kontrolltemplate eine Hybridisationsstelle für den zweiten 5'-Primer, den zweiten 3'-Primer, die Zielsonde und eine zweite Kontrollsonde umfasst;
    • (b) Durchführen einer Amplifikationsreaktion; und
    • (c) Quantifizieren einer Bindung der Zielsonde, ersten Kontrollsonde und zweiten Kontrollsonde.
  • In einigen Anwendungsformen wird der Quantifizierungsschritt während der Amplifikationsreaktion durchgeführt. In einigen Anwendungsformen wird der Quantifizierungsschritt nach der Amplifikationsreaktion durchgeführt.
  • In einigen Anwendungsformen umfassen die Zielsonde, erste Kontrollsonde und zweite Kontrollsonde ein Fluorophor. Zum Beispiel können die Zielsonde, erste Kontrollsonde und zweite Kontrollsonde jeweils ein Fluorophor umfassen, das bei verschiedenen Wellenlängen des Lichts fluoresziert. In einigen Anwendungsformen können die Zielsonde, erste Kontrollsonde und zweite Kontrollsonde außerdem jeweils ein Quenching-Reagenz umfassen. In einigen Anwendungsformen werden die Zielsonde, erste Kontrollsonde und zweite Kontrollsonde während der Amplifikationsreaktion enzymatisch gespalten. Zum Beispiel können das Quenching-Reagenz und das Fluorophor getrennt werden, wenn die Sonden an ihre Hybridisationsstellen hybridisieren.
  • In einigen Anwendungsformen ist die Amplifikationsreaktion eine thermozyklische Amplifikationsreaktion. Zum Beispiel kann die thermozyklische Amplifikationsreaktion eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sein. In einigen Anwendungsformen ist die Amplifikationsreaktion eine isothermale Reaktion. Zum Beispiel kann die isothermale Amplifikationsreaktion eine Transkriptions-vermittelte Reaktion (TMA) sein.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Kits bereit, umfassend:
    • (a) eine Zielsonde, eine erste Kontrollsonde und eine zweite Kontrollsonde;
    • (b) einen ersten 5'-Primer und einen ersten 3'-Primer;
    • (c) ein erstes Kontrolltemplate, wobei das erste Kontrolltemplate eine Hybridisationsstelle für den ersten 5'-Primer, den ersten 3'-Primer und die erste Kontrollsonde umfasst; und
    • (d) einen zweiten 5'-Primer, einen zweiten 3'-Primer und ein zweites Kontrolltemplate, wobei das zweite Kontrolltemplate eine Hybridisationsstelle für den zweiten 5'-Primer, den zweiten 3'-Primer, die Zielsonde und die zweite Kontrollsonde umfasst.
  • In einigen Anwendungsformen umfasst das Kit außerdem Nukleotide und eine DNA-Polymerase. In einigen Anwendungsformen umfassen die Zielsonde, erste Kontrollsonde und zweite Kontrollsonde ein Fluorophor. Zum Beispiel können die Zielsonde, erste Kontrollsonde und zweite Kontrollsonde außerdem ein Quenching-Reagenz umfassen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine Lösung bereit, umfassend:
    • (a) eine Zielsonde, eine erste Kontrollsonde und eine zweite Kontrollsonde;
    • (b) einen ersten 5'-Primer und einen ersten 3'-Primer;
    • (c) ein erstes Kontrolltemplate, wobei das erste Kontrolltemplate eine Hybridisationsstelle für den ersten 5'-Primer, den ersten 3'-Primer und die erste Kontrollsonde umfasst; und
    • (d) einen zweiten 5'-Primer, einen zweiten 3'-Primer und ein zweites Kontrolltemplate, wobei das zweite Kontrolltemplate eine Hybridisationsstelle für den zweiten 5'-Primer, den zweiten 3'-Primer, die Zielsonde und die zweite Kontrollsonde umfasst.
  • In einigen Anwendungsformen umfasst die Lösung außerdem Nukleotide und eine DNA-Polymerase. Darüber hinaus können die Zielsonde, erste Kontrollsonde und zweite Kontrollsonde ein Fluorophor umfassen. Zusätzlich können die Zielsonde, erste Kontrollsonde und zweite Kontrollsonde außerdem ein Quenching-Reagenz umfassen.
  • DEFINITIONEN
  • Eine „Amplifikationsreaktion" bezeichnet jede chemische, einschließlich enzymatische, Reaktion, die zu vermehrten Kopien einer Template-Nukleinsäuresequenz führt. Amplifikationsreaktionen umfassen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Ligase-Kettenreaktion (LCR) (siehe U.S. Patente 4.683.195 und 4.683.202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds., 1990)), Strangverdrängungsamplifikation (SDA) (Walker, et al., Nucleic Acids Res. 20 (7): 1691–6 (1992); Walker PCR Methods Appl. 3 (1): 1–6 (1993)), Transkriptions-vermittelte Amplifikation (Phyffer, et al., J. Clin. Microbiol. 34: 834–841 (1996); Vuorinen, et al., J. Clin. Microbiol. 33: 1856–1859 (1995)), Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA) (Compton, Nature 350 (6313): 91–2 (1991), Rolling Circle Amplifikation (RCA) (Lisby, Mol. Biotechnol. 12 (1): 75–99 (1999)); Hatch et al., Genet. Anal. 15 (2): 35–40 (1999)) und branched DNA-Signalamplifikation (bDNA) (siehe z.B. Iqbal et al., Mol. Cell Probes 13 (4): 315–320 (1999)).
  • Eine „thermozyklische Amplifikationsreaktion" bezeichnet die Amplifikation von DNA-Fragmenten unter Verwendung von Primer-Oligonukleotiden, die mit Hilfe eines thermostabilen Enzyms Kopien einer Template-Nukleinsäuresequenz synthetisiert oder ligiert. Thermozyklische Reaktionen, wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und die Ligase-Kettenreaktion (LCR), sind gut bekannt.
  • Ein „Ziel" oder „Zielnukleinsäure" bezeichnet eine einzel- oder doppelsträngige Polynukleotidsequenz, die in einer thermozyklischen Amplifikationsreaktion amplifiziert werden soll.
  • Eine „Sonde" bezeichnet eine Polynukleotidsequenz, die in der Lage ist, an eine Polynukleotidsequenz von Interesse zu hybridisieren, und die Detektion der gewählten Polynukleotidsequenz erlaubt. Zum Beispiel können „Sonden" an fluoreszierende oder radioaktive Reagenzien gebundene Polynukleotide umfassen, wodurch die Detektion dieser Reagenzien ermöglicht wird.
  • Ein „Template" bezeichnet eine doppelsträngige Polynukleotidsequenz, welche das zu amplifizierende Polynukleotid umfasst, das von den Primer-Hybridisationsstellen flankiert ist. Folglich umfasst ein „Zieltemplate" die Zielpolynukleotidsequenz, die von den Hybridisationsstellen für einen 5'-Zielprimer und für einen 3'-Zielprimer flankiert ist. Ein „Kontrolltemplate" bezeichnet eine Polynukleotidsequenz, die von Primer-Hybridisationssequenzen flankiert ist.
  • Ein „5'-Zielprimer" bezeichnet eine Polynukleotidsequenz, üblicherweise mit einer Länge von weniger als 100 Nukleotiden, die an eine Sequenz auf dem Zieltemplate hybridisiert, die stromaufwärts des Zielpolynukleotids liegt. Ein „3'-Zielprimer" bezeichnet eine Polynukleotidsequenz, üblicherweise mit einer Länge von weniger als 100 Nukleotiden, dessen komplementäre Sequenz an eine Sequenz stromabwärts des Zielpolynukleotids auf dem Zieltemplate hybridisiert.
  • Eine „Hybridisationsstelle" bezeichnet eine Polynukleotidsequenz, die für einen Primer oder Sonden-Polynukleotidsequenz komplementär ist und die von einem spezifischen Primer oder einer spezifischen Sonde gebunden werden kann.
  • „Quantifizieren des Bindens" bezeichnet das Messen des absoluten oder relativen Bindens von Sondenmolekülen an Bereiche einer Nukleinsäure, an die sie hybridisieren. Zum Beispiel kann das Binden fluoreszierender Sonden mit Hilfe der FRET-Technologie durch Quantifizieren der Menge emittierten Lichts von einer Probe bei einer bestimmten Wellenlänge gemessen werden. Alternativ kann das Binden von Sonden mit Hilfe von Blotting- und Hybridisierungsstandardverfahren (z.B. Southern blotting) mit verschiedenen Computer-gestützten Scanning-Vorrichtungen quantifiziert werden.
  • „Im Wesentlichen gleiche Konzentrationen" bedeutet, dass die Konzentration eines gelösten Stoffes zwischen 95% bis 105% der Konzentration wenigstens eines anderen gelösten Stoffes beträgt.
  • Der Ausdruck „Fluorophor" bezeichnet chemische Verbindungen, die, wenn sie mittels Exposition an bestimmten Wellenlängen des Lichts angeregt werden, Licht bei einer anderen Wellenlänge emittieren (d.h. fluoreszieren).
  • Wenn die Energie des angeregten Zustands des Fluorophors auf einen Nichtfluorophor-Akzeptor übertragen wird, wird die Fluoreszenz des Fluorophors ohne anschließende Emission der Fluoreszenz von dem Akzeptor gelöscht. In diesem Fall dient der Akzeptor als ein „Quencher".
  • Der Ausdruck „Nukleinsäure" bezieht sich auf Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide und Polymere davon entweder in der einzel- oder doppelsträngigen Form. Der Ausdruck umfasst Nukleinsäuren, die bekannte Nukleotid-Analoga oder modifizierte Rückgratreste oder -verknüpfungen enthalten, die synthetisch, natürlich vorkommend und nichtnatürlich vorkommend sind, die ähnliche Bindungseigenschaften wie die Referenznukleinsäure aufweisen und die in ähnlicher Weise wie die Referenznukleotide metabolisiert sind. Beispiele für derartige Analoga umfassen ohne Einschränkung Phosphorthioate, Phosphoramidate, Methylphosphonate, chirale Methylphosphonate, 2-O-Methylribonukleotide, Peptidnukleinsäuren (PNAs).
  • Die folgenden Abkürzungen dienen der Vereinfachung für den Leser:
    Ziel = T
    Interne Kontrolle 1 (oder erstes Kontrolltemplate) = IC1
    Interne Kontrolle 2 (oder zweites Kontrolltemplate) = IC2
    Vorwärts-(oder erster 5')-Primer für Ziel und IC1 = P1
    Rückwärts-(oder erster 3')-Primer für Ziel und IC1 = P2
    Vorwärts-(oder zweiter 5')-Primer für IC2 = P3
    Rückwärts-(oder zweiter 3')-Primer für IC2 = P4
    Hybridisationssonde für das Ziel und IC2 („Zielsonde") = HP1
    Hybridisationssonde für IC1 („erste Kontrollsonde") = HP2
    Hybridisationssonde für IC2 („zweite Kontrollsonde") = HP3
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist eine schematische Darstellung einer Anwendungsform der Erfindung. Primer P1 und P2 steuern die Amplifikation des Zieltemplates. In dieser Anwendungsform gibt es drei Templates: das Zieltemplate (T), das interne Kontrolltemplate (IC1) und das interne Kontrolltemplate 2 (IC2). Das Produkt dieser Reaktion wird von der Zielsonde (HP1) gebunden. Primer 1 und 2 steuern ebenfalls die Amplifikation des internen Kontrolltemplates 1. Das Produkt dieser Reaktion wird von der internen Kontrollsonde 1 (HP2) gebunden. Schließlich steuern die Primer P3 und P4 die Amplifikation des internen Kontrolltemplates 2. Das Produkt dieser Reaktion kann sowohl von HP1 als auch von der internen Kontrollsonde 2 (HP3) gebunden werden.
  • BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN ANWENDUNGSFORMEN
  • I. EINFÜHRUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt neuartige Verfahren, Kits und Lösungen bereit, die eine vollständige interne Kontrolle für Amplifikationsreaktionen, wie die PCR, bereitstellen. Insbesondere stellt die Erfindung wenigstens drei Polynukleotidsequenzen bereit: ein Zieltemplate (T) und zwei Kontrolltemplates (IC1 und IC2). Die beiden Kontrolltemplates dienen der Kontrolle der Vollständigkeit der Amplifikationsreaktion. Amplifikationsprodukte des Ziels und der Kontrolltemplates können durch die Quantifizierung der Sondenbindung an die Reaktionsprodukte gemessen werden. Folglich stellt jedes Amplifikationsprodukt ein Ziel für wenigstens eine entsprechende Sonde dar, die für eine Detektion und Quantifizierung der Amplifikationsprodukte zweckdienlich ist.
  • Die Erfindung stellt ein Zieltemplate (T) bereit, das eine Nukleinsäure mit Hybridisationsstellen für einen 5' und 3'-Zielprimer (P1 beziehungsweise P2) umfasst. Das Zieltemplate (T) umfasst eine Polynukleotidsequenz, die amplifiziert werden soll („die Zielsequenz"). Diese Sequenz oder eine Teilsequenz dieser Sequenz stellt eine Hybridisierungssequenz für eine Zielsonde (HP1) dar.
  • Das erste Kontrolltemplate (IC1) umfasst die gleichen Zielprimer-Hybridisationssequenzen (d.h. für P1 und P2) wie für das Zieltemplate (T) und eine Sonden-Hybridisationssequenz, die sich vom Zieltemplate unterscheidet. Folglich kontrolliert die Amplifikation von diesem Template die Vollständigkeit der allgemeinen Reaktion, z.B. Funktion von Enzym, Reagenzien, Zielprimer, etc. Falls zum Beispiel kein Zielprodukt produziert ist, aber das erste Kontrolltemplate (IC1) in einer Reaktion amplifiziert ist, deutet dies darauf hin, dass die Amplifikationsbedingungen (Puffer, Temperatur, Primer, Enzyme, etc.) eine Amplifizierung des Templates zuließen. Falls das erste Kontrolltemplate (IC1) nicht amplifiziert ist, so ist es wahrscheinlich, dass das Reaktionsgemisch fehlerhaft war und deshalb ein negatives Produkt von dem Template nicht auf ein Fehlen eines Templates zurückzuführen ist.
  • Das zweite Kontrolltemplate (IC2) umfasst Hybridisationssequenzen für die Zielsonde (HP1) und eine zweite Kontrollsonde (HP3). Diese beiden Sequenzen sind von Hybridisationssequenzen für ein Paar zweiter Kontrollprimer (P3 und P4) flankiert. Eine Amplifikation dieses Templates stellt eine Kontrolle für das Binden der Zielsonde (HP1) an die Zielsequenz dar. Falls zum Beispiel die zweite Kontrollsonde (HP3) kein Signal erzeugt, dann ist es wahrscheinlich, dass es keine Amplifikation des zweiten Kontrolltemplates (IC2) gab. Falls allerdings die zweite Kontrollsonde (HP3) ein Signal erzeugt, die Zielsonde (HP1) jedoch keines, so ist es wahrscheinlich, dass die Zielsonde (HP1) nicht funktioniert.
  • Weil das zweite Kontrolltemplate (IC2) jeweils eine Kopie der Zielsonden-Hybridisationssequenz und der zweiten Kontrollhybridisationssequenz besitzt, sollte ein Signal von der Zielsonde (HP1) und der zweiten Kontrollsonde (HP3) im Wesentlichen gleich sein, falls das Zieltemplate (T) nicht vorhanden ist. Falls das Zieltemplate (T) vorhanden ist, so sollten mehr Hybridisationssequenzen für die Zielsonde (HP1) (d.h. Zielamplifikationsprodukte) im Verhältnis zu Hybridisationssequenzen für die zweite Kontrollsonde (HP3) verfügbar sein. Folglich sollte eine korrekt funktionierende Reaktion mehr Signal von einer Zielsonde (HP1) als von der zweiten Kontrollsonde (HP3) ergeben. Dies ist besonders für frühe Amplifikationsrunden zutreffend. Deshalb kann in einigen Anwendungsformen eine Echtzeitmessung der Sondenbindung, z.B. für eine quantitative PCR, zweckdienlich sein, wie unten diskutiert.
  • II. ZIELTEMPLATES
  • Zielnukleinsäuresequenzen können doppel- oder einzelsträngige DNA oder RNA aus einer beliebigen biologischen Quelle, z.B. Bakterium, Tier, Pflanze etc., sein. Vorzugsweise ist das Zieltemplate eine isolierte DNA-Sequenz. Ziel-DNA-Sequenzen können mit Hilfe verschiedener Techniken isoliert sein. Zum Beispiel sind Verfahren zur Lyse von Organismen und zur Präparation von Extrakten oder Reinigung von DNA bekannt. Siehe Current Protocols in Molecular Biology Volumes 1–3, John Wiley & Sons, Inc. (Ausubel et al., eds., 1994–1998) (nachstehend „Ausubel et al."). Ebenfalls können Gesamt-RNA oder PolyA + RNA revers transkribiert werden, um cDNA herzustellen, die als Ziel-DNA dienen kann.
  • Im Allgemeinen sind die unten beschriebene Terminologie und Laborverfahren der rekombinanten DNA-Technologie bekannt und finden üblicherweise im Fachgebiet Verwendung. Standardtechniken sind für die Klonierung, Isolierung, Amplifikation und Reinigung von DNA und RNA angewandt. Im Allgemeinen sind Enzymreaktionen, welche DNA-Ligase, DNA-Polymerase, Restriktionsendonukleasen und ähnliches umfassen, entsprechend den Herstelleranleitungen durchgeführt. Diese Techniken und verschiedene andere Techniken sind im Allgemeinen nach Sambrook et al., Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989) oder Ausubel et al., oben, durchgeführt.
  • Im Allgemeinen sind die Nukleinsäuren, die Gene der Ziel-DNA-Sequenzen von Interesse codieren, von cDNA und genomischen DNA-Bibliotheken durch Hybridisierung mit einer Sonde kloniert oder mit Hilfe von Amplifikationstechniken mit Oligonukleotid-Primern isoliert. Vorzugsweise sind die Zieltemplatesequenzen Polynukleotidsequenzen von Humanpathogenen. In einer anderen Anwendungsform stammt das Zieltemplate von Nukleinsäuren von Säugern (z.B. Mensch). Ziel-DNA-Sequenzen sind üblicherweise aus Säuger-Nukleinsäure-Bibliotheken (genomische DNA oder cDNA) durch Hybridisieren mit einer Nukleinsäure-Sonde isoliert, wobei deren Sequenz von dem Gen der zu klonierenden Ziel-DNA-Sequenz stammen kann.
  • Primer-basierte Amplifikationstechniken können ebenfalls zur Amplifizierung und Isolierung von Ziel-DNA-Sequenzen von DNA oder RNA angewandt sein (siehe z.B. Dieffenbach & Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual). Primer können z.B. für die Amplifizierung entweder der vollständigen Sequenz oder einer Sonde von ein bis mehreren hundert Nukleotiden verwendet sein, die dann für eine Durchmusterung einer Säuger-Bibliothek auf eine vollständige Nukleinsäure der Wahl verwendet ist. Zum Beispiel können degenerierte Primersets für eine Isolierung relevanter Ziel-DNA-Sequenzen verwendet sein. Nukleinsäuren können ebenfalls von Expressionsbibliotheken unter Verwendung von Antikörpern als Sonden isoliert sein. Derartige polyklonale oder monoklonale Antikörper können unter Verwendung der vorhergesagten Aminosäuresequenz der zu klonierenden Ziel-DNA-Sequenz produziert sein.
  • Polymorphe Varianten und Allele, die im Wesentlichen mit der Ziel-DNA-Sequenz der Wahl identisch sind, können mit Hilfe von Nukleinsäuresonden und Oligonukleotiden unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mittels Durchmusterung von Bibliotheken isoliert sein. Alternativ können Expressionsbibliotheken verwendet sein, um Varianten der zu klonierenden Ziel-DNA-Sequenz zu klonieren, wie polymorphe Varianten, Interspezies-Homologe und Allele, mit Hilfe der immunologischen Detektion exprimierter Homologe mit Antiseren oder gereinigten Antikörpern, die gegen die vorhergesagte Aminosäuresequenz der Ziel-DNA-Sequenz hergestellt sind.
  • Zur Herstellung einer cDNA-Bibliothek sollte man eine Quelle wählen, die reich an mRNA der Ziel-DNA-Sequenz von Interesse ist. Aus der mRNA wird dann unter Verwendung von reverser Transkriptase cDNA hergestellt, in einen rekombinanten Vektor ligiert und in einen rekombinanten Wirt zur Vermehrung, Durchmusterung und Klonierung transfiziert. Verfahren zur Herstellung und Durchmusterung von cDNA-Bibliotheken sind gut bekannt (siehe z.B. Gubler & Hoffman, (1983) Gene 25: 263– 269; Sambrook et al., (2. Ausgabe 1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual; und Ausubel et al.
  • Für eine genomische DNA-Bibliothek ist die DNA aus dem Gewebe und entweder mechanisch geschnitten oder enzymatisch verdaut, um Fragmente von etwa 12–20 kb zu gewinnen. Die Fragmente sind dann mittels Gradientenzentrifugation von unerwünschten Größen abgetrennt und in nichtlambda-Expressionsvektoren hineinkonstruiert. Diese Vektoren sind in vitro verpackt. Rekombinante Phagen sind mit Hilfe der Plaque-Hybridisierung, wie in Benton & Davis (1977), Science 196: 180–182 beschrieben, untersucht. Kolonie-Hybridisierung erfolgt, wie allgemein von Grunstein et al., (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3961–3965, beschrieben. Ein alternatives Verfahren zur Isolierung einer Nukleinsäure und ihrer Homologe kombiniert die Verwendung synthetischer Oligonukleotid-Primer und Amplifikation eines RNA- oder DNA-Templates mit Hilfe der PCR (siehe unten).
  • Synthetische Oligonukleotide können zur Konstruktion rekombinanter Nukleinsäuren für eine Verwendung als Sonden oder für eine Expression der Ziel-DNA-Sequenzproteine verwendet sein. Oligonukleotide können chemisch gemäß dem Phosphoramidittriester-Festphasenverfahren, das zuerst von Beaucage & Caruthers, (1981) Tetrahydron Letts. 22: 1859–1862 beschrieben worden ist, mit Hilfe eines automatischen Synthetisierers, wie es in Van Devanter et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12: 6159–6168 beschrieben ist, chemisch synthetisiert sein. Die Reinigung der Oligonukleotide erfolgt üblicherweise entweder mit einer nativen Acrylamidgelelektrophorese oder mittels Anionenaustausch-HPLC, wie von Pearson & Ranier, (1983) J. Chrom. 255: 137–149, beschrieben. Die Sequenz der klonierten Gene und synthetischen Oligonukleotide kann nach dem Klonieren mit Hilfe z.B. des Kettenabbruchverfahrens zur Sequenzierung doppelsträngiger Templates nach Wallace et al., (1981) Gene 16: 21–26 verifiziert sein. Dieses Verfahren ist unter Verwendung einer Reihe überlappender Oligonukleotide durchgeführt, die normalerweise 40–120 bp lang sind und sowohl den Sense-Strang als auch den Antisense-Strang des Gens darstellen. Diese DNA-Fragmente werden dann assoziiert, ligiert und kloniert.
  • Alternativ können Amplifizierungsverfahren mit exakten Primern angewandt sein, um eine spezifische Subsequenz der Ziel-DNA-Sequenz zu amplifizieren, die von der Nukleinsäure codiert ist. Die spezifische Subsequenz wird dann in einen Vektor ligiert.
  • III. ERSTES UND ZWEITES KONTROLLTEMPLATE
  • Wie oben beschrieben, ist das erste Kontrolltemplate (IC1) eine Nukleinsäure, die Hybridisationssequenzen für eine erste Kontrollsonde (HP2) umfasst, die von den Zielprimern (P1 und P2) flankiert sind. Das zweite Kontrolltemplate (IC2) ist eine Nukleinsäure, die Hybridisationssequenzen für die Zielsonde (HP1) und die zweite Kontrollsonde (HP3) umfasst, die von Hybridisationssequenzen für die zweiten Kontrollprimer (P3 und P4) flankiert sind. In einigen Anwendungsformen sind beide Kontrolltemplates in einem einzigen Polynukleotidmolekül enthalten. Alternativ kann das Kontrolltemplate zu dem Reaktionsgemisch als separate Moleküle gegeben sein. Eine Amplifikation des ersten (IC1) und des zweiten (IC2) Kontrolltemplates liefert unterschiedliche Informationen über die Amplifikationsreaktion. Keine Amplifikation der ersten Kontrolle (IC1) weist darauf hin, dass die Basisreagenzien der Amplifikation (Enzym, Inhibitor-freie Lösung, Primer, Reaktionstemperaturen, etc.) mangelhaft waren. Eine Amplifikation und Sondenbindung an der zweiten Kontrolle (IC2) liefert Informationen über die Bindungsfähigkeit der Zielsonde.
  • Die zweite Kontrolle (IC2) liefert die meiste Information, wenn die Konzentration der bindenden Zielsonde (HP1) mit der Konzentration der zweiten Kontrollsonde (HP3) verglichen wird. Bei Abwesenheit des Zieltemplates (T) sollten Zielsonde (HP1) und zweite Kontrollsonde (HP3) gleiche Mengen an DNA binden. Siehe Tabelle 1. Falls allerdings die Zielsonde mangelhaft ist, dann bindet die Zielsonde (HP1) weniger oder keine DNA, während die zweite Kontrollsonde (HP2) alle ihre amplifizierten Hybridisationssequenzen binden sollte. Andererseits, falls das Zieltemplate (T) vorhanden und amplifiziert ist, dann bindet mehr Zielsonde (HP1) ihre Hybridisationssequenz und mehr Zielsignal wird im Verhältnis zur zweiten Kontrollsonde (HP3) erzeugt werden.
  • Üblicherweise liegt zu Beginn einer Amplifikationsreaktion wenigstens entweder das erste Kontrolltemplate (IC1) oder das zweite Kontrolltemplate (IC2) in höheren Konzentrationen als das Zieltemplate (T) vor. Dies ist zweckdienlich, um zum Beispiel sicherzustellen, dass wenigstens eine Kontrollreaktion getestet werden kann, wobei dadurch wenigstens einige Reaktionskomponenten validiert werden können. Zum Beispiel liegen in einer bevorzugten Anwendungsform das erste und zweite Kontrolltemplate (IC1 und IC2) in wenigstens 1 bis 200 Kopien pro Reaktion vor. In einer bevorzugteren Anwendungsform liegt die Konzentration des ersten und zweiten Kontrolltemplates (IC1 und IC2) bei wenigstens 5 bis 100 Kopien pro Reaktion. In einer besonders bevorzugten Anwendungsform liegt die Konzentration des ersten und zweiten Kontrolltemplates (IC1 und IC2) bei etwa 10 oder etwa 50 Kopien pro Reaktion.
  • Darüber hinaus sind in manchen Anwendungsformen die Konzentrationen der Zielsonde (HP1), der ersten Kontrollsonde (HP2) und der zweiten Kontrollsonde (HP3) nicht gleich. Ähnlicherweise sind in manchen Anwendungsformen die Konzentration der Zielprimer (P1 und P2) und die Konzentration der Kontrollprimer (P3 und P3) unterschiedlich. Der Fachmann weiß, dass entsprechende Konzentrationen der verschiedenen Primer-Paare und Sonden in Abhängigkeit der auszuführenden spezifischen Reaktionen optimiert werden können.
  • Das erste (IC1) und das zweite (IC2) Kontrolltemplate besitzen vorzugsweise ungefähr dieselbe Länge wie das Zieltemplate (T). Folglich ist die Zeit dieselbe, welche die Polymerase für die Herstellung einer Kopie der Templates benötigt, ungeachtet welches Template, Ziel oder welche Kontrolle amplifiziert wird.
  • IV. AMPLIFIKATIONSREAKTIONEN DER ERFINDUNG
  • Die Amplifikation eines RNA- oder DNA-Templates mit Hilfe von Reaktionen ist bekannt (siehe U.S. Patente 4.683.195 und 4.683.202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds., 1990)). Verfahren, wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Ligase-Kettenreaktion (LCR) können angewandt sein, um Nukleinsäuresequenzen von Ziel-DNA-Sequenzen direkt von mRNA, von cDNA, von genomischen Bibliotheken oder cDNA-Bibliotheken zu amplifizieren. Die Reaktion ist bevorzugt in einem Thermocycler durchgeführt, um die Inkubation bei erwünschten Temperaturen zu erleichtern. Degenerierte Oligonukleotide können zur Amplifikation von Homologen der Ziel-DNA-Sequenz unter Verwendung bekannter Sequenzen, welche die Ziel-DNA-Sequenz codieren, konstruiert sein. Restriktionsendonuklease-Schnittstellen können in die Primer eingebaut sein. Die Polymerase-Kettenreaktion oder andere in vitro Amplifikationsverfahren können ebenfalls zweckdienlich sein, um zum Beispiel Nukleinsäuresequenzen zu klonieren, die für die zu exprimierenden Ziel-DNA-Sequenzproteine codieren. Mit der PCR-Reaktion amplifizierte Gene können aus Agarosegelen gereinigt und in einen geeigneten Vektor kloniert werden.
  • Beispielhafte Bedingungen für PCR-Reaktion umfassen üblicherweise entweder zwei- oder dreistufige Zyklen. Zweistufige Zyklen umfassen einen Denaturierungsschritt und einen anschließenden Hybridisations-/Elongationsschritt. Dreistufige Zyklen umfassen einen Denaturierungsschritt, dann einen Hybridisationsschritt und einen anschließenden separaten Elongationsschritt.
  • Isothermische Amplifikationsreaktionen sind ebenfalls bekannt und können gemäß den Verfahren der Erfindung angewandt sein. Beispiele für isothermische Amplifikationsreaktionen umfassen Strangverdrängungsamplifikation (SDA) (Walker, et al., Nucleic Acids Res. 20 (7): 1691–6 (1992); Walker PCR Methods Appl. 3 (1): 1–6 (1993)), Transkriptions-vermittelte Amplifikation (Phyffer, et al., J. Clin. Microbiol. 34: 834–841 (1996); Vuorinen, et al., J. Clin. Microbiol. 33: 1856–1859 (1995)), Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA) (Compton, Nature 350 (6313): 91–2 (1991), Rolling Circle Amplifikation (RCA) (Lisby, Mol. Biotechnol. 12 (1): 75–99 (1999)); Hatch et al., Genet. Anal. 15 (2): 35–40 (1999)) und branched DNA-Signalamplifikation (bDNA) (siehe z.B. Iqbal et al., Mol. Cell Probes 13 (4): 315–320 (1999)). Weitere dem Fachmann bekannte Amplifikationsverfahren umfassen CPR (Cycling Probe Reaction), SSR (Self-Sustained Sequence Replication); SDA (Strangverdrängungsamplifikation), QBR (Q-Beta Replikase), Re-AMP (früher RAMP), RCR (Repair Chain Reaction), TAS (Transkription-basiertes Amplifikationssystem) und HCS.
  • A. Reaktionskomponenten
  • Oligonukleotid-Primer
  • Die Oligonukleotide, die in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden, wie auch Oligonukleotide, die zur Detektion von Amplifikationsprodukten konstruiert sind, können chemisch synthetisiert sein, wie es oben beschrieben ist. Diese Oligonukleotide können mit Radioisotopen, chemilumineszenten Resten oder fluoreszierenden Resten markiert sein. Derartige Markierungen sind für die Charakterisierung und Detektion von Amplifikationsprodukten mit Hilfe der Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zweckdienlich.
  • Die Primerkomponenten können in dem PCR-Reaktionsgemisch mit einer Konzentration von z.B. zwischen 0,1 und 1,0 μM vorliegen. Wie oben diskutiert, kann die Konzentration der Zielprimer (P1 und P2) größer als die Konzentration der Primer P3 und P4 sein. Zum Beispiel kann die P1-P2-Konzentration 0,6 μM betragen, während die Konzentration für P3 und P4 0,4 μM beträgt. Die Primerlänge kann zwischen z.B. 12–100 Nukleotiden betragen und vorzugsweise 50–60% G und C in der Zusammensetzung enthalten. Für die Wahl der Primer ist es bevorzugt, die exakt paarenden Basen am 3'-Ende des Primers zu haben, aber diese Anforderung wird am 5'-Ende relativ belanglos. Vorzugsweise besitzen alle Primer der Erfindung ungefähr die gleiche Schmelztemperatur.
  • Puffer
  • Puffer, die eingesetzt ein können, basieren auf Borat, Phosphat, Carbonat, Barbital, Tris, etc. Siehe Rose et al., U.S. Patent Nr. 5.508.178. Der pH der Reaktion sollte im Bereich von etwa 4,5 bis etwa 9,5 gehalten sein. Siehe U.S. Patent Nr. 5.508.178. Der in den Amplifikationsreaktionen eingesetzte Standardpuffer ist ein auf Tris basierender Puffer zwischen 10 und 50 mM mit einem pH von etwa 8,3 bis 8,8. Siehe Innis et al., oben.
  • Der Fachmann weiß, dass die Pufferbedingungen so gestaltet sein sollen, dass sie das Funktionieren aller Reaktionen von Interesse berücksichtigen. Folglich können die Pufferbedingungen so gestaltet sein, dass sie die Amplifikationsreaktion wie auch beliebige Enzymreaktionen, die mit der Erzeugung eines Signals von Sonden in Verbindung stehen, unterstützen. Ein bestimmter Reaktionspuffer kann auf seine Fähigkeit, verschiedene Reaktionen zu unterstützen, durch Testen der Reaktionen sowohl einzeln als auch in Kombination getestet werden.
  • Salzkonzentration
  • Die Konzentration der in der Reaktion vorhandenen Salze kann die Fähigkeit der Primer beeinflussen, an die Zielnukleinsäure zu assoziieren. Siehe Innis et al. Kaliumchlorid ist bis zu einer Konzentration von etwa 50 mM zum Reaktionsgemisch gegeben, um die Primer-Assoziierung zu fördern. Natriumchlorid kann ebenfalls zugegeben sein, um die Primer-Assoziierung zu fördern. Siehe Innis et al.
  • Magnesiumionen-Konzentration
  • Die Konzentration von Magnesiumionen in der Reaktion kann für die Amplifikation der erwünschten Sequenzen) entscheidend sein. Siehe Innis et al. Primer-Assoziierung, Strangdenaturierung, Amplifikationsspezifität, Primer-Dimerisation und Enzymaktivität sind alles Beispiele für Parameter, die von der Magnesiumkonzentration beeinflusst sind. Siehe Innis et al. Amplifikationsreaktionen sollten etwa eine Magnesiumkonzentration von 0,5 bis 2,5 mM über der Konzentration an dNTPs enthalten. Das Vorhandensein von Magnesium-Chelatoren in der Reaktion kann sich auf die optimale Magnesiumkonzentration auswirken. Eine Reihe an Amplifikationsreaktionen können über einen Bereich an Magnesiumkonzentrationen durchgeführt werden, um die optimale Magnesiumkonzentration zu bestimmen. Die optimale Konzentration kann in Abhängigkeit der Natur der Zielnukleinsäure(n) und der eingesetzten Primer und anderer Parameter variieren.
  • Desoxynukleotidtriphosphat-Konzentration
  • Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) sind zu der Reaktion in einer Endkonzentration von etwa 20 μM bis etwa 300 μM gegeben. Jedes der vier dNTPs (G, A, C. T) sollte in gleichen Konzentrationen vorliegen. Siehe Innis et al.
  • Nukleinsäure-Polymerase
  • Eine Reihe DNA-abhängiger Polymerasen sind im Handel erhältlich, die mit den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung funktionsfähig sind. Zum Beispiel kann die Taq-DNA-Polymerase verwendet sein, um Ziel-DNA- Sequenzen zu amplifizieren. Der PCR-Assay kann unter Verwendung als eine Enzym-Komponente eine Quelle thermostabiler DNA-Polymerase durchgeführt sein, die geeigneterweise Taq-DNA-Polymerase umfasst, die das von Thermus aquaticus gereinigte native Enzym sein kann und/oder eine gentechnisch hergestellte Form des Enzyms sein kann. Andere im Handel erhältliche Polymerase-Enzyme umfassen z.B. von Promega oder Pharmacia vermarktete Taq-Polymerasen. Weitere Beispiele für thermostabile DNA-Polymerasen, die in der Erfindung verwendet sein könnten, umfassen z.B. von Thermus und Pyrococcus Spezies gewonnene DNA-Polymerasen. Konzentrationsbereiche der Polymerasen können im Bereich von 1–5 Einheiten pro Reaktionsgemisch liegen. Das Reaktionsgemisch umfasst üblicherweise zwischen 20 und 100 μl.
  • In einigen Anwendungsformen kann eine „hot start" Polymerase verwendet sein, um eine Extension von Fehlpriming-Ereignissen zu verhindern, wenn die Temperatur einer Reaktion zu Beginn ansteigt. Hot-Starts sind besonders im Zusammenhang mit Multiplex-PCR zweckdienlich. Hot-Start-Polymerasen können zum Beispiel hitzeinstabile Addukte besitzen, die einen Hitzeaktivierungsschritt erfordern (üblicherweise 95°C für ungefähr 10–15 Minuten), oder einen mit der Polymerase assoziierten Antikörper umfassen, um die Aktivierung zu verhindern.
  • Weitere Agentien
  • Weitere ausgesuchte Agentien sind manchmal zu der Reaktion gegeben, um die erwünschten Ergebnisse zu erzielen. Zum Beispiel kann DMSO zu der Reaktion gegeben sein, aber es wird bereichtet, dass DMSO die Aktivität der Taq-DNA-Polymerase hemmt. Nichtsdestotrotz ist DMSO für die Amplifikation von mehreren Ziel-DNA-Sequenzen in derselben Reaktion empfohlen worden. Siehe Innis et al. Stabilisatoren wie Gelatine, bovines Serumalbumin und nichtionische Detergenzien (z.b. Tween-20) sind normalerweise zu den Amplifikationsreaktionen gegeben. Siehe Innis et al.
  • B. Amplifikation von mehreren Ziel-DNA-Sequenzen
  • Die Verfahren der Erfindung können in herkömmlichen Multiplex-Reaktionen verwendet sein. Die Multiplex-PCR führt zur Amplifikation von mehreren Polynukleotid-Fragmenten in derselben Reaktion. Siehe z.B. PCR PRIMER, A LABORATORY MANUAL (Dieffenbach, C., ed. 1995) Cold Spring Harbor Press, Seiten 157–171. Zum Beispiel können verschiedene Zieltemplates im selben Reaktionsgefäß zugegeben und parallel amplifiziert werden. Der Fachmann weiß, dass eine Reaktion mit einer zweiten (oder mehr) Zielpolynukleotidsequenz gemäß den Verfahren der Erfindung durch die Zugabe entsprechender erster und zweiter Kontrollreaktion überwacht werden kann. Folglich kann die Qualität herkömmlicher Multiplex-Reaktionen (d.h. die Akkumulation des amplifizierten Produkts) gemäß den Verfahren der Erfindung überwacht sein.
  • Die Konzentration des Magnesiumsalzes im Reaktionsgemisch kann wichtig sein, wenn versucht wird, verschiedene Ziel-DNA-Sequenzen zu kopieren. Folglich kann eine gewisse Variation der Magnesiumsalz-Konzentration, z.B. Magnesiumchlorid, erforderlich sein, um die Reaktion für eine Amplifizierung der Zielnukleinsäuren von Interesse zu optimieren. Der Fachmann kann die Konzentration des im Reaktionsgemisch vorhandenen Magnesiumsalzes oder -ions variieren, um geeignete Bedingungen für eine Amplifikation zu erhalten.
  • V. SONDEN
  • Sonden der Erfindung sind in der Lage, an eine bestimmte Polynukleotidsequenz zu hybridisieren. Folglich können Sonden der Erfindung eine Polynukleotidsequenz umfassen, die zu der nachzuweisenden Sequenz komplementär ist. In einigen Anwendungsformen umfasst die Sonde ebenfalls ein Fluorophor oder ein Enzym, wie es unten beschrieben ist, welches den Nachweis der Bindung der Sonde an ihre komplemtäre Sequenz erlaubt.
  • Eine Zielsonde ist eine Sonde, die an die Zielsequenz bindet. Folglich kann die Menge an amplifizierter Zielsequenz durch die Quantifizierung der Bindung der Zielsonde an ihre komplementäre Sequenz quantifiziert werden. Ähnlicherweise umfassen die erste und zweite Kontrollsonde Polynukleotide, die in der Lage sind, ihre jeweiligen Kontrolltemplates zu binden. Wie es unten beschrieben ist, können die erste und zweite Kontrollsonde ebenfalls ein Fluorophor oder Enzym umfassen, das für die Detektion der gebundenen Sonde zweckdienlich ist.
  • Die Sondenkonzentration sollte für ein Binden an die amplifizierten Ziel- oder Kontrollsequenzen hinreichend sein, um eine genaue Abschätzung der Menge an amplifizierter Sequenz zu liefern. Der Fachmann weiß, dass der Betrag der Sondenkonzentration entsprechend der Bindungsaffinität der Sonde wie auch der Menge an zu bindender Sequenz variiert. Typische Sondenkonzentrationen liegen im Bereich von 0,01 μM bis 0,5 μM. Wie es oben beschrieben ist, können in einigen Anwendungsformen die relativen Mengen einer Sonde im Verhältnis zur anderen Sonde eingestellt sein, um die Sondensignale besser zu unterscheiden. Zum Beispiel kann die Konzentration der ersten Kontrollsonde geringer sein als die Konzentration der Zielsonde und der zweiten Kontrollsonde, um das von der Zielsonde erzeugte Signal besser zu unterscheiden.
  • VI. QUANTIFIZIERUNG DER SONDENBINDUNG
  • Die Bindung der Sonde an ihre Hybridisierungssequenz erlaubt dem Anwender, die Akkumulation einer bestimmten Sequenz zu quantifizieren, ohne notwendigerweise die Inhalte aus dem Reaktionsgefäß zu entnehmen. Im Allgemeinen kann eine beliebige Markierung, die den Nachweis und die Unterscheidung verschiedener Sonden erlaubt, gemäß den Verfahren der Erfindung verwendet sein.
  • Die Akkumulation des amplifizierten Produkts kann mit einem beliebigen in der Technik bekannten Verfahren quantifiziert sein. Zum Beispiel kann die Fluoreszenz einer Sonde durch Messen des Lichts bei einer bestimmten Frequenz detektiert werden. Ähnlicherweise kann die Akkumulation verschiedener chemischer Produkte, die in einer Enzymreaktion entstehen und an der Sonde gebunden sind, zum Beispiel durch Messen der Lichtabsorption bei einer bestimmten Wellenlänge gemessen werden. In anderen Anwendungsformen können die Amplifikationsreaktionen durch Blotten auf einen festen Träger und Hybridisieren mit einer radioaktiven Nukleinsäuresonde direkt quantifiziert werden. Sobald die nicht gebundene Sonde weggewaschen ist, kann, wie es dem Fachmann bekannt ist, die Sondenmenge durch Messen der Radioaktivität quantifiziert werden. Andere Variationen dieser Technik nutzen die Chemilumineszenz, um Hybridisationsereignisse zu detektieren.
  • Eine Messung von Amplifikationsprodukten kann nach Vollendung der Reaktion erfolgen oder kann in „Echtzeit" (d.h. kontinuierlich) gemessen werden. Falls eine Messung des akkumulierten amplifizierten Produkts nach der vollendeten Amplifikation erfolgt, dann können Detektionsreagenzien (z.B. Sonden) nach der Amplifikationsreaktion zugegeben werden. Alternativ können Sonden zu der Reaktion vor oder während der Amplifikationsreaktion gegeben werden, was folglich eine Messung der amplifizierten Produkte entweder nach Vollendung der Amplifikation oder in Echtzeit erlaubt. Echtzeit-Messungen sind bevorzugt, da sie eine Messung bei jeder beliebigen gegebenen Runde der Reaktion erlauben und folglich mehr Information über eine Akkumulation der Produkte während der gesamten Reaktionszeit liefern. Für Messungen von Amplifikationsprodukten in Echtzeit ist die Verwendung fluoreszierender Sonden bevorzugt.
  • Zum Beispiel sind in einer bevorzugten Anwendungsform wenigstens drei verschiedene Fluorophore eingesetzt, die bei drei verschiedenen Wellenlängen fluoreszieren. In dieser Anwendungsform ist ein Fluorophor an jede der drei verschiedenen Sonden (z.B. Zielsonde, erste Kontrollsonde und zweite Kontrollsonde) geheftet. Vorzugsweise sind Sonden, die auf TaqMan®, molekularem Leuchtfeuer oder FRET-Technologie basieren, wie es unten diskutiert ist, in Übereinstimmung mit der Erfindung eingesetzt. Der Fachmann weiß, dass eine große Anzahl verschiedener Fluorophore eingesetzt sein können. Einige Fluorophore, die in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung zweckdienlich sind, umfassen: Fluorescein, Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), Carboxytetrachlorfluorescein (TET), NHS-Fluorescein, 5- und/oder 6-Carboxyfluorescein (FAM), 5-(oder 6-)Iodacetamidofluorescein, 5-{[2 (und 3)-5-(Acetylmercapto)-succinyl]amino}fluorescein (SAMSA-Fluorescein) und weitere Fluorescein-Derivate, Rhodamin, Lissaminrhodamin B Sulfonylchlorid, Texas Rot Sulfonylchlorid, 5- und/oder 6-Carboxyrhodamin (ROX) und weitere Rhodamin-Derivate, Cumarin, 7-Aminomethylcumarin, 7-Amino-4-methylcumarin-3-essigsäure (AMCA) und weitere Cumarin-Derivate, BODIPYTM Fluorophore, Cascade BlueTM Fluorophore, wie 8-Methoxypyren-1,3,6-trisulfonsäure Trinatriumsalz, Lucifer Gelb Fluorophore, wie 3,6-Disulfonat-4-aminonaphthalimid, Phycobiliprotein-Derivate, Alexa Fluorfarbstoffe (von Molecular Probes, Eugene, OR, erhältlich) und weitere Fluorophore, die dem Fachmann bekannt sind. Eine allgemeine Auflistung zweckdienlicher Fluorophore, siehe in Hermanson, G. T., BIOCONJUGATE TECHNIQUES (Academic Press, San Diego, 1996). Folglich fluoresziert jede Sonde bei einer anderen Wellenlänge und kann einzeln ohne eine Interferenz mit weiteren Sonden detektiert werden.
  • A. Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
  • Verfahren, welche die Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Technik (FRET) einsetzen, können mit Hilfe der Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eingesetzt sein. FRET ist eine abstandsabhängige Wechselwirkung zwischen einem Donor- und Akzeptormolekül. Das Donor- und Akzeptormolekül sind Fluorophore. Falls die Fluorophore angeregt sind und die Emissionsspektren sich überlappen, dann wird in sehr enger Nachbarschaft (üblicherweise zwischen 10 bis 100 Ångström) die Anregung des Donorfluorophors auf das Akzeptorfluorophor übertragen. Folglich ist die Lebenszeit des Donormoleküls vermindert und seine Fluoreszenz wird gelöscht, während die Fluoreszenzintensität des Akzeptormoleküls erhöht und depolarisiert wird. Wenn die Energie des angeregten Zustands des Donors auf einen Nichtfluorophor-Akzeptor übertragen wird, verlöscht die Fluororeszenz des Donors ohne darauffolgende Fluoreszenz des Akzeptors. In diesem Fall dient der Akzeptor als ein Quenching-Reagenz.
  • Haarnadel-FRET-Assay
  • In einem bestimmten Verfahren, das FRET einsetzt, sind fluoreszierende Markierungen für den Energie-Transfer in einen PCR-Primer eingebaut, der eine Haarnadelstruktur einnehmen kann. Siehe Nazarenko et al., U.S. Patent Nr. 5.866.336; Nadeau et al., U.S. Patent Nr. 5.958.700; Tygai et al., U.S. Patent Nr. 5.925.517. Die PCR-Primer können auf eine Art und Weise gestaltet sein, dass sie nur dann, wenn der Primer eine lineare Struktur einnimmt, d.h. in ein PCR-Produkt eingebaut ist, ein fluoreszierendes Signal erzeugt wird. Siehe Nazarenko et al., U.S. Patent Nr. 5.866.336; Nadeau et al., U.S. Patent Nr. 5.958.700.
  • In Übereinstimmung mit dem Verfahren von U.S. Patent Nr. 5.866.336 können FRET-Paare in die Primer der vorliegenden Erfindung oder in Signal-Oligonukleotide eingebaut sein, die dann zu dem Reaktionsgemisch gegeben werden können, um ein Verfahren zum Nachweis des Einbaus des Primers in ein Polymerisierungsprodukt zu liefern. Die Primer der vorliegenden Erfindung oder die Oligonukleotide sind in der Lage, eine intramolekular Basen-gepaarte Struktur (z.B. Haarnadelstruktur) einzunehmen. Die Signal-Oligonukleotide oder die Primer der vorliegenden Erfindung sind mit zwei fluoreszierenden Farbstoffresten modifiziert, die ein Donor/Akzeptor-Farbstoffpaar bilden. Zum Beispiel kann der Donor-Farbstoffrest ein Fluorescein oder Fluorescein-Derivat sein und der Akzeptor kann DABCYL sein. Diese beiden Farbstoffe sind so auf dem markierten Oligonukleotid positioniert, dass sie in einer sehr engen räumlichen Nähe (üblicherweise etwa 10–100 Ångström) in der Basen-gepaarten, gefalteten Sekundärstruktur sind. Falls die Farbstoffe in einer engen räumlichen Nähe sind, dann wird die Donor-Fluoreszenz von dem Akzeptor-Farbstoff gelöscht.
  • Der Haarnadel-Primer besitzt einen Quencher an seinem 5'-terminalen Nukleotid und enthält ein Donor-Fluorophor an der gegenüberliegenden Seite seiner Duplex, wobei das Fluorophor und der Quencher ein FRET-Paar bilden. In der ersten PCR-Runde hybridisieren beide Primer an die jeweiligen Zielstränge und werden von der DNA-Polymerase verlängert. In der zweiten Runde wird das verlängerte Produkt von dem Rückwärts-Primer ein Template für den Vorwärts-Primer und das verlängerte Produkt von dem Vorwärts-Primer wird ein Template für den Rückwärts-Primer. Wenn der Vorwärts-Primer an seinem 5'-Ende der Haarnadelstruktur verlängert wird, können entweder zwei Dinge abhängig von der eingesetzten DNA-Polymerase geschehen: entweder die 5'-3'-Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase hydrolysiert die 5'-Nukleotide mit Quencher und/oder die DNA-Polymerase verdrängt das 5'-Ende der Haarnadel und kopiert das Template. In beiden Fällen werden der Quencher und das Fluorophor voneinander getrennt und ein Signal wird erzeugt.
  • Bei der praktischen Umsetzung ist festgestellt worden, dass Sonden, wie molekulare Leuchtfeuer, die verschiedene Fluorophore enthalten, verwendet sein können, um kleine Unterschiede in einer Zielsequenz (S. Tyagi et al., Nature Biotechnology 14, 303 (1996)) und die Menge einer Zielsequenz zu unterscheiden (S. Tyagi et al., Nature Biotechnology 16, 49 (1998)).
  • B. TaqMan-Assay
  • Die Amplifikationsprodukte können ebenfalls in Lösung nach den Verfahren der Erfindung mit Hilfe eines fluorogenen 5'-Nuklease-Assays – des TaqMan Assays-detektiert werden. Siehe Holland et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276–7280; Livak et al., U.S. Patent, Nr. 5.538.848, 5.723.591 und 5.876.930. Die TaqMan-Sonde ist so konstruiert, dass sie an eine Sequenz innerhalb des erwünschten PCR-Produktes hybridisiert. Das 5'-Ende der TaqMan-Sonde enthält einen fluoreszierenden Reporterfarbstoff. Das 3'-Ende der Sonde ist blockiert, um eine Sondenerweiterung zu verhindern und enthält einen Farbstoff, der die Fluoreszenz des 5'-Fluorophors löscht. Während einer anschließenden Amplifikation wird die 5' fluoreszierende Markierung abgespalten, wenn eine Polymerase mit 5'-Exonuklease-Aktivität in der Reaktion vorhanden ist. Das Entfernen des 5'-Fluorophors führt zu einem Anstieg der Fluoreszenz, die detektiert werden kann.
  • Eine TaqMan-Sonde kann zusammen mit der vorliegenden Erfindung verwendet sein. Zum Beispiel kann eine Sonde, die mit einem geeigneten Donor/Quencher-Paar markiert ist und zu einem Teil der Zielnukleinsequenz zwischen den Bindungsstellen der Ziel-spezifischen Primer komplementär ist, in dem TaqMan-Assay funktionieren.
  • C. Enzymreaktion
  • Eine Reihe an Enzymreaktionen sind ebenfalls bekannt, die für eine Detektion der Sonden in der Reaktion verwendet sein können. Zum Beispiel umfassen Enzyme, die für die Bereitstellung eines detektierbaren Produktes für die Sonden der Erfindung zweckdienlich sind, Meerrettich-Peroxidase (MRP) (siehe z.B. Ausubel et al. Kapitel 9), alkalische Phosphatase (AP) (siehe z.B. Ausubel et al. Kapitel 14), Urease (siehe z.B. Ausubel et al. Kapitel 11), β-Galactosidase (siehe z.B. Ausubel et al. Kapitel 9), β-Glucuronidase (siehe z.B. Ausubel et al. Kapitel 9) und α-Helikase (siehe z.B. Eggleston, A. K., et al. Nucleic Acids Res. 24 (7): 1179–89 (1996)). Die Akkumulation verschiedener chemischer Produkte, die über eine Enzymreaktion gebildet sind und an der Sonde gebunden sind, können zum Beispiel durch Messen der Licht absorption des Enzymproduktes bei einer bestimmten Wellenlänge gemessen werden.
  • D. Hybridisierung
  • In anderen Anwendungsformen der Erfindung können die Amplifikationsreaktionen direkt durch Blotten der Reaktionsprodukte auf einen festen Träger (z.B. Nitrocellulose) und hybridisieren mit einer radioaktiven Nukleinsäuresonde quantifiziert werden. Siehe Sambrook et al., oben; und Ausubel et al. Sobald die nichtgebundene Sonde weggewaschen ist, kann die Sondenmenge durch Messen der Radioaktivität, wie es dem Fachmann bekannt ist, gemessen werden. Andere Variationen dieser Technik nutzen die Chemilumineszenz, um hybridisierte Sonden zu detektieren.
  • VII. KITS UND LÖSUNGEN DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung stellt ebenfalls Kits und Lösungen zur Durchführung der Amplifikationsverfahren der Erfindung bereit. Zum Beispiel stellt die Erfindung Kits bereit, die ein oder mehrere Reaktionsgefäße umfassen, die Aliquote von einigen oder allen Reaktionskomponenten der Erfindung darin enthalten. Die Aliquote können in flüssiger oder getrockneter Form vorliegen. Die Reaktionsgefäße können Kartuschen zur Probenverarbeitung oder andere Gefäße umfassen, die das Einschließen, Verarbeiten und/oder die Amplifikation von Proben im selben Gefäß erlauben. Derartige Kits erlauben die rasche Detektion von Amplifikationsprodukten der Erfindung in tragbaren Amplifikationsvorrichtungen oder Standardvorrichtungen. Die Kits können ebenfalls schriftliche Gebrauchsanleitungen für den Einsatz des Kits enthalten, um die Zielprobe zu amplifizieren und deren Amplifikation zu kontrollieren.
  • Kits können zum Beispiel (1) eine Zielsonde, eine erste Kontrollsonde und eine zweite Kontrollsonde, (2) einen ersten 5'-Primer und einen ersten 3'-Primer und (3) ein erstes Kontrolltemplate enthalten. Das erste Kontrolltemplate kann eine Hybridisationsstelle für den ersten 5'-Primer, den ersten 3'-Primer und die erste Kontrollsonde umfassen. Das Kit kann ebenfalls einen zweiten 5'-Primer, einen zweiten 3'-Primer und ein zweites Kontrolltemplate enthalten. Das zweite Kontrolltemplate kann eine Hybridisationsstelle für den zweiten 5'-Primer, den zweiten 3'-Primer, die Zielsonde und die zweite Kontrollsonde umfassen. Die Zielsonde, erste Kontrollsonde und zweite Kontrollsonde des Kits umfassen ein Fluorophor, einschließlich eines Quenchers. Zusätzlich kann das Kit Nukleotide (A, C, G, T) und eine DNA-Polymerase enthalten.
  • In gegenwärtig bevorzugten Anwendungsformen umfassen die Kits Gefäße, wie Kartuschen zur Probenverarbeitung, die für eine schnelle Amplifikation einer Probe zweckdienlich sind, wie es in Belgrader, P., et al., Biosensors and Bioelectronics 14: 849–852 (2000); Belgrader, P., et al., Science 284: 449–450 (1999); und Northrup, M. A., et al, „A New Generation of PCR Instruments and Nucleic Acid Concentration Systems" in PCR PROTOCOLS (Sninsky, J. J. et al. (eds.)) Academic, San Diego, Kapitel 8 (1998)) beschrieben ist.
  • VIII. QUANTITATIVE AMPLIFIKATIONSREAKTIONEN
  • Die Verfahren der Erfindung sind für eine Verwendung bei quantitativen Amplifikationsreaktionen, wie die quantitative PCR, gut geeignet. Die quantitative Amplifikation bezieht sich auf Verfahren zur Detektion der Menge an Nukleinsäuretemplate in einer Probe. Die Verfahren umfassen generell den Vergleich der Amplifikationsrate einer Probe (wie sie in mehreren Reaktionszyklen gemessen ist) mit der Amplifikation einer bekannten Menge an Template, d.h. die Konzentration einer positiven Kontrolle oder Kompetitorsequenz Siehe z.B. Orlando et al., Clin. Chem. Lab. Med. 36 (5): 255–69 (1998); Gililand, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2725–2729 (1990). Die Quantifizierung der Amplifikationsreaktion erfolgt durch Vergleich der Endkonzentration des Ziels mit bekannten Mengen des Kompetitors. Die Reaktionen der Erfindung umfassen interne positive Kontrollen, die als Kompetitoren für die Quantifizierung wirken können. Deshalb können alle für eine Quantifizierung der Produkte einer Amplifikationsreaktion erforderlichen Daten von einer einzigen Reaktion der Erfindung erhalten sein. Darüber hinaus können quantitative Amplifikationsreaktionen in Echtzeit gemäß den Verfahren der Erfindung gemessen werden.
  • Untersuchungen haben gezeigt, dass die anfängliche Kopienzahl während einer Echtzeit-PCR-Analyse, basierend auf dem Schwellen-Zyklus (Ct), quantifiziert werden kann. Siehe Higuchi, R. et al., Biotechnology 11: 1026–1030 (1993). Der Ct ist als der Zyklus definiert, bei dem die Fluoreszenz als statistisch signifikant gegen den Hintergrund bestimmt wird. Der Schwellen-Zyklus ist zum log der anfänglichen Kopienzahl umgekehrt proportional. Je mehr Template zu Beginn vorhanden ist, umso weniger Zyklen werden benötigt, um einen Punkt zu erreichen, bei dem das Fluoreszenz-Signal gegen den Hintergrund detektierbar ist. Die auf dem Schwellen-Zyklus basierende quantitative Information kann genauer sein als die Information, die auf der Endpunkt-Bestimmung basiert, weil sie auf einer Messung beruht, die während der exponentiellen Phase der PCR-Amplifikation erfolgt, wenn die PCR-Effizienz von limitierenden Reagenzien, kleinen Differenzen bei Reaktionskomponenten oder Zyklusbedingungen noch beeinflusst sein muss.
  • Tabelle 1 zeigt, wie die Zyklusschwellenwerte für die Bestimmung der Vollständigkeit einer bestimmten Reaktion zweckdienlich sind. Die Tabelle liefert hypothetische Ct-Werte in Abhängigkeit verschiedener Reaktionsabläufe.
  • Figure 00300001
  • BEISPIEL
  • Es wird ein Verfahren beschrieben, bei dem die Zugabe zweier interner Kontrollen (IC) die Sicherheit bereitstellt, dass klinische Proben in einem Echtzeit-Assayformat erfolgreich amplifiziert und detektiert werden. Die erste IC ist zur Überwachung der Vollständigkeit des Amplifikationsgemisches, einschließlich der Primer, dNTPs und Polymerase, eingesetzt. Die zweite IC kontrolliert die Vollständigkeit der Ziel-spezifischen Hybridisierungssonde. Der Wert der beiden internen Kontrollen ist, dass der Erhalt eines positiven Signals von beiden Kontrollen eine erfolgreiche Amplifikation anzeigt, wobei dadurch ein richtig positives Ergebnis für die Zielprobe validiert wird.
  • Material und Methoden
  • Eine 10 μl Probe einer präparierten Probe wird zu 15 μl Mastergemisch, das IC1 mit 100 Kopien, IC2 mit 10 Kopien, je 0,6 μM Primer 1 und Primer 2, je 0,4 μM Primer 3 und Primer 4, je 200 μM dNTP, 0,4 μM FAM-markierte Ziel- und IC2-spezifische Hybridisationssonde (HP1), 0,2 μM TET-markierte IC1-spezifische Hybridisationssonde (HP2), 0,2 μM ROX-markierte IC2 Hybridisationssonde (HP3) und 1,25 Einheiten Hot-Start-Polymerase mit 5' nach 3' Nuklease-Aktivität enthält. Sämtliche Reaktionen werden in 1 × Amplifikationspuffer durchgeführt: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM KCl und 3,5 mM MgCl2. Proben werden im Cepheid Smart Cycler® System mit den folgenden thermalen Zyklusparametern behandelt: 95°C 90 Sekunden (initiale Denaturierung) und dann 40 Zyklen mit 95°C 15 Sekunden und 60°C 30 Sekunden.
  • Ergebnisinterpretation
  • Der Wert „X" ist als der maximale Zyklusschwellenwert (Ct) für ein validiertes Ergebnis für HP2 definiert. Der Wert „Y" ist als der maximale Zyklusschwellenwert (Ct) für ein validiertes Ergebnis für HP3 definiert. Der Faktor „z" stellt die Differenz zwischen den tatsächlichen Messungen dar, wenn HP1 (wie mit FAM gemessen) und HP3 (wie mit ROX gemessen) Ct-Werte sind.
  • Proben, die einen FAM Ct-Wert (Ziel und IC2) um einen Faktor „z" kleiner als Y ergeben, werden als positiv interpretiert, ungeachtet der IC1 (TET) und IC2 (ROX) Ergebnisse. Siehe Tabelle 1. Proben, die einen FAM Ct-Wert kleiner als Y ergeben, werden als positiv interpretiert, falls der Ct-Wert von IC1 (TET) gleich oder kleiner als X ist und der Ct-Wert von IC2 (ROX) gleich oder kleiner als Y ist. Siehe Tabelle 1. Proben, die einen FAM Ct-Wert (Ziel und IC2) gleich dem Ct-Wert von IC2 (ROX) ergeben, der gleich oder kleiner als Y ist, werden als negativ interpretiert, falls der Ct-Wert von IC1 (TET) gleich oder kleiner als X ist. Proben, die keine positiven Signale ergeben, sind fehlerhaft und müssen wiederholt werden. Proben, die keine FAM Ct-Werte oder FAM Ct-Werte gleich dem Ct-Wert von IC2 (ROX) ergeben, werden als fehlerhaft interpretiert, wenn die Ct-Werte für IC1 (TET) und IC2 (ROX) größer als X beziehungsweise Y sind. Siehe Tabelle 1. Proben, die einen FAM Ct-Wert (Ziel und IC2) kleiner als den Ct-Wert von IC2 (ROX) ergeben, werden als positiv ohne der Fähigkeit zur Quantifizierung aufgrund von Inhibitoren interpretiert, wenn der Ct-Wert für IC1 (TET) und IC2 (ROX) größer als X beziehungsweise Y ist oder geringe Endpunkt-Fluoreszenzwerte erhalten werden. Siehe Tabelle 1.
  • Obschon die vorangehende Erfindung anhand von Abbildungen und Beispiel zum besseren Verständnis recht ausführlich beschrieben worden ist, ist für den Fachmann im Lichte der Inhalte dieser Erfindung ohne weiteres erkennbar, dass bestimmte Änderungen und Modifizierungen daran vorgenommen werden können, ohne von den angefügten Ansprüchen abzuweichen.

Claims (20)

  1. Verfahren zum Durchführen einer Amplifikationsreaktion, umfassend: (a) Kombinieren in einer wässrigen Lösung: (i) eine Zielsonde, eine erste Kontrollsonde und eine zweite Kontrollsonde; (ii) einen ersten 5'-Primer, einen ersten 3'-Primer und ein Zieltemplate, welches Zieltemplate eine Hybridisationsstelle für den ersten 5'-Primer, den ersten 3'-Primer und die Zielsonde umfasst; (iii) ein erstes Kontrolltemplate, welches erste Kontrolltemplate eine Hybridisationsstelle für den ersten 5'-Primer, den ersten 3'-Primer und die erste Kontrollsonde umfasst; und (iv) einen zweiten 5'-Primer, einen zweiten 3'-Primer und ein zweites Kontrolltemplate, welches zweite Kontrolltemplate eine Hybridisationsstelle für den zweiten 5'-Primer, den zweiten 3'-Primer, die Zielsonde und eine zweite Kontrollsonde umfasst; (b) Durchführen einer Amplifikationsreaktion zur Erzeugung von Amplifikationsprodukten; und (c) Quantifizieren der Bindung der Zielsonde, ersten Kontrollsonde und zweiten Kontrollsonde an die Amplifikationsprodukte.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Quantifizierungsschritt während der Amplifikationsreaktion vorgenommen wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Quantifizierungsschritt nach der Amplifikationsreaktion vorgenommen wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zielsonde, erste Kontrollsonde und zweite Kontrollsonde ein Fluorophor umfassen.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Zielsonde, erste Kontrollsonde und zweite Kontrollsonde jeweils ein Fluorophor umfassen, welches bei einer unterschiedlichen Wellenlänge des Lichts fluoresziert.
  6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Zielsonde, erste Kontrollsonde und zweite Kontrollsonde außerdem ein Quenching-Reagenz umfassen.
  7. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Zielsonde, erste Kontrollsonde und die zweite Kontrollsonde während der Amplifikationsreaktion enzymatisch gespalten werden.
  8. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Quenching-Reagenz und das Fluorophor getrennt werden, wenn die Sonden an ihre Hybridisationsstellen hybridisieren.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Amplifikationsreaktion eine thermozyklische Amplifikationsreaktion ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die thermozyklische Amplifikationsreaktion eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Amplifikationsreaktion eine isothermische Reaktion ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die isothermische Reaktion eine Transkriptions-vermittelte Amplifikation (TMA) ist.
  13. Kit, umfassend: (a) eine Zielsonde, einer erste Kontrollsonde und eine zweite Kontrollsonde; (b) einen ersten 5'-Primer und einen ersten 3'-Primer; (c) ein erstes Kontrolltemplate, welches erstes Kontrolltemplate eine Hybridisationsstelle für den ersten 5'-Primer, den ersten 3'-Primer und die erste Kontrollsonde umfasst; und (d) einen zweiten 5'-Primer, einen zweiten 3'-Primer und ein zweites Kontrolltemplate, welches zweite Kontrolltemplate eine Hybridisationsstelle für den zweiten 5'-Primer, den zweiten 3'-Primer, die Zielsonde und die zweite Kontrollsonde umfasst.
  14. Kit nach Anspruch 13, wobei der Kit außerdem Nukleotide und eine DNA-Polymerase umfasst.
  15. Kit nach Anspruch 13, wobei die Zielsonde, erste Kontrollsonde und zweite Kontrollsonde ein Fluorophor umfassen.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Zielsonde, erste Kontrollsonde und zweite Kontrollsonde außerdem ein Quenching-Reagenz umfassen.
  17. Lösung, umfassend: (a) eine Zielsonde, eine erste Kontrollsonde und eine zweite Kontrollsonde; (b) einen ersten 5'-Primer und einen ersten 3'-Primer; (c) ein erstes Kontrolltemplate, welches erste Kontrolltemplate eine Hybridisationsstelle für den ersten 5'-Primer, den ersten 3'-Primer und die erste Kontrollsonde umfasst; und (d) einen zweiten 5'-Primer, einen zweiten 3'-Primer und ein zweites Kontrolltemplate, welches zweite Kontrolltemplate eine Hybridisationsstelle für den zweiten 5'-Primer, den zweiten 3'-Primer, die Zielsonde und die zweite Kontrollsonde umfasst.
  18. Lösung nach Anspruch 17, wobei die Lösung außerdem Nukleotide und eine DNA-Polymerase umfasst.
  19. Lösung nach Anspruch 17, wobei die Zielsonde, erste Kontrollsonde und zweite Kontrollsonde ein Fluorophor umfassen.
  20. Lösung nach Anspruch 19, wobei die Zielsonde, erste Kontrollsonde und zweite Kontrollsonde außerdem ein Quenching-Reagenz umfassen.
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WO (1) WO2002052030A2 (de)

Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6261808B1 (en) * 1992-08-04 2001-07-17 Replicon, Inc. Amplification of nucleic acid molecules via circular replicons
WO1994003624A1 (en) * 1992-08-04 1994-02-17 Auerbach Jeffrey I Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules
EP1313880A2 (de) * 2000-05-30 2003-05-28 PE Corporation (NY) Methoden zur detektion gewünschter nukleinsäuren mittels kombinierter ligation und amplifizierung
WO2002072889A2 (en) * 2001-01-12 2002-09-19 Applera Corporation Methods and compositions for microarray control
US7691571B2 (en) * 2001-01-31 2010-04-06 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of bordetella
US20030165866A1 (en) * 2001-01-31 2003-09-04 Cockerill Franklin R. Detection of bordetella
US20020197611A1 (en) * 2001-06-21 2002-12-26 Chagovetz Alexander Michael Method for real-time detection and quantification of nucleic acid sequences using fluorescent primers
US7226732B2 (en) * 2001-07-16 2007-06-05 Cepheid Methods, apparatus, and computer programs for verifying the integrity of a probe
US6767733B1 (en) 2001-10-10 2004-07-27 Pritest, Inc. Portable biosensor apparatus with controlled flow
US20040060987A1 (en) * 2002-05-07 2004-04-01 Green Larry R. Digital image analysis method for enhanced and optimized signals in fluorophore detection
US20070059690A1 (en) * 2002-05-31 2007-03-15 Amirul Islam "Met/fret based method of target nucleic acid detection whereby the donor/acceptor moieties are on complementary strands"
US7074598B2 (en) * 2002-09-25 2006-07-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of vancomycin-resistant enterococcus spp.
AU2002342093A1 (en) * 2002-10-23 2004-05-25 Applera Corporation Methods and composition for detecting targets
US20040235005A1 (en) * 2002-10-23 2004-11-25 Ernest Friedlander Methods and composition for detecting targets
WO2004083806A2 (en) 2003-01-22 2004-09-30 University Of South Florida Autonomous genosensor apparatus and methods for use
EP1469083A1 (de) * 2003-04-17 2004-10-20 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Kalibrierungsverfahren für reverse Transkriptionen unter Verwendung einer synthetischen mRNA als interne Kontrolle
JP4805158B2 (ja) 2003-05-16 2011-11-02 アメリカ合衆国 核酸増幅系に用いる内部コントロール核酸分子
CA2523040C (en) * 2003-05-23 2012-01-17 Bio-Rad Laboratories, Inc. Localized temperature control for spatial arrays of reaction media
WO2005001129A2 (en) * 2003-06-06 2005-01-06 Applera Corporation Mobility cassettes
US20050239104A1 (en) * 2003-11-04 2005-10-27 Ferea Tracy L Microarray controls
US7824857B2 (en) 2003-12-02 2010-11-02 Musc Foundation For Research Development Methods and compositions for diagnosing epithelial cell cancer
US7981616B2 (en) 2004-02-27 2011-07-19 Musc Foundation For Research Development Enhanced detection of RNA using a panel of truncated gene-specific primers for reverse transcription
AU2005271960B2 (en) 2004-07-09 2011-12-08 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Identification of markers in lung and breast cancer
US20080193961A1 (en) * 2004-09-29 2008-08-14 Easley Christopher J Localized Control of Thermal Properties on Microdevices and Applications Thereof
US8056881B2 (en) 2004-10-13 2011-11-15 University Of Virginia Patent Foundation Electrostatic actuation for management of flow in micro-total analysis systems (μ-TAS) and related method thereof
US20060142233A1 (en) * 2004-11-09 2006-06-29 Ting-Kai Li Gene expression and genetic changes implicated in alcoholism
US7051536B1 (en) * 2004-11-12 2006-05-30 Bio-Rad Laboratories, Inc. Thermal cycler with protection from atmospheric moisture
US20060110724A1 (en) 2004-11-19 2006-05-25 Burkhardt William Iii Quantitative real-time assay for noroviruses and enteroviruses with built in quality control standard
WO2006069305A2 (en) * 2004-12-22 2006-06-29 University Of Virginia Patent Foundation The use of microwaves for thermal and non-thermal applications in micro and nanoscale devices
EP2333561A3 (de) 2005-03-10 2014-06-11 Gen-Probe Incorporated System zum Durchführen von Tests in mehreren Formaten
US8343755B2 (en) * 2005-08-01 2013-01-01 University Of Virginia Patent Foundation Microdevices for chemical sensing and chemical actuation
US8220493B2 (en) * 2005-08-23 2012-07-17 University Of Virginia Patent Foundation Passive components for micro-fluidic flow profile shaping and related method thereof
US20110033922A1 (en) * 2005-10-04 2011-02-10 Landers James P Microchip-based acoustic trapping or capture of cells for forensic analysis and related method thereof
WO2007047336A2 (en) * 2005-10-12 2007-04-26 University Of Virginia Patent Foundation Integrated microfluidic analysis systems
EP1842926B1 (de) * 2006-03-10 2015-08-19 Epigenomics AG Verfahren zur Bestimmung einer biologischen Probe zur Methylisierungsanalyse
US8119352B2 (en) 2006-06-20 2012-02-21 Cepheld Multi-stage amplification reactions by control of sequence replication times
US8012744B2 (en) 2006-10-13 2011-09-06 Theranos, Inc. Reducing optical interference in a fluidic device
US8642746B2 (en) * 2007-07-13 2014-02-04 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Unique calibrator polynucleotides and methods of using in quantitative nucleic acid assays
CA3138078C (en) 2007-10-02 2024-02-13 Labrador Diagnostics Llc Modular point-of-care devices and uses thereof
FR2926367B1 (fr) * 2008-01-10 2013-01-04 Novaleads Procede fluorimetrique pour evaluer l'influence d'une condition sur un echantillon biologique et ses applications.
EP2393941A2 (de) 2009-02-09 2011-12-14 Frederic Zenhausern Verbesserungen bei und in verbindung mit mikrofluidikvorrichtungen zur verarbeitung einer probe
US20110045458A1 (en) * 2009-08-20 2011-02-24 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of Enterovirus
NZ599873A (en) 2009-10-19 2014-09-26 Theranos Inc Integrated health data capture and analysis system
US9121054B2 (en) * 2009-12-08 2015-09-01 Biohelix Corporation Detection of nucleic acid amplification products in the presence of an internal control sequence on an immunochromatographic strip
AU2011272868B2 (en) * 2010-06-30 2015-09-17 Gen-Probe Incorporated Method and apparatus for identifying analyte-containing samples using single-read determination of analyte and process control signals
CN103069007A (zh) * 2010-07-29 2013-04-24 霍夫曼-拉罗奇有限公司 微生物核酸的定性和定量检测
US8877464B2 (en) 2010-07-29 2014-11-04 Roche Molecular Systems, Inc. Qualitative and quantitative detection of microbial nucleic acids
EP2665833B1 (de) 2011-01-17 2017-04-19 Life Technologies Corporation Arbeitsablauf zur nachweis von liganden mit nukleinsäuren
EP2665815B1 (de) * 2011-01-17 2017-08-09 Life Technologies Corporation Enzymatische ligation von nukleinsäuren
CN106290160A (zh) 2011-01-21 2017-01-04 提拉诺斯公司 样品使用最大化的系统和方法
JP2013153709A (ja) * 2012-01-31 2013-08-15 Fujirebio Inc 等温核酸増幅反応における検出シグナルの補正方法
US9932628B2 (en) 2012-07-27 2018-04-03 Gen-Probe Incorporated Dual reference calibration method and system for quantifying polynucleotides
WO2014093360A1 (en) 2012-12-10 2014-06-19 Landers James P Frequency-based filtering of mechanical actuation using fluidic device
GB201403076D0 (en) * 2014-02-21 2014-04-09 ALERE TECHNOLOGIES GmbH Methods for detecting multiple nucleic acids in a sample
CN104560982B (zh) * 2015-01-28 2018-05-18 中国医科大学附属第一医院 不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子
DE102018213027A1 (de) * 2018-08-03 2020-02-06 Robert Bosch Gmbh Reaktionsgemisch, Verfahren und Kit zur Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5447839A (en) * 1988-09-09 1995-09-05 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of human papillomavirus by the polymerase chain reaction
JP3594598B2 (ja) * 1993-07-09 2004-12-02 アクゾ・ノベル・エヌ・ベー 改良された核酸定量方法
CA2159044A1 (en) * 1994-09-26 1996-03-27 Falko-Guenter Falkner Method of quantitating nucleic acids
CA2255774C (en) * 1996-05-29 2008-03-18 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
CA2257109C (en) * 1996-06-04 2009-10-06 University Of Utah Research Foundation Monitoring hybridization during pcr
US6365346B1 (en) * 1998-02-18 2002-04-02 Dade Behring Inc. Quantitative determination of nucleic acid amplification products
US5952202A (en) * 1998-03-26 1999-09-14 The Perkin Elmer Corporation Methods using exogenous, internal controls and analogue blocks during nucleic acid amplification
GB9902422D0 (en) * 1999-02-03 1999-03-24 Lgc Teddington Limited Reference material for nucleic acid amplification

Also Published As

Publication number Publication date
EP1352091B1 (de) 2006-06-07
DE60120486D1 (de) 2006-07-20
WO2002052030A3 (en) 2003-01-23
US6534645B2 (en) 2003-03-18
ATE329059T1 (de) 2006-06-15
EP1352091A2 (de) 2003-10-15
AU2002239544A1 (en) 2002-07-08
US20020119464A1 (en) 2002-08-29
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