DE69836888T2

DE69836888T2 - Verfahren für Fluoreszenzerkennungstest

Info

Publication number: DE69836888T2
Application number: DE69836888T
Authority: DE
Inventors: Michael C. Baltimore Little; Glenn P. Fuquay-Varina Vonk
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1997-11-04
Filing date: 1998-11-03
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2018-11-04
Also published as: EP0915173A3; JP3689400B2; AU749765B2; CA2249638C; JP3458062B2; EP0915173A2; DE69836888D1; ES2281117T3; US6077669A; JPH11225799A; CA2249638A1; ATE351921T1; JP2003189900A; EP0915173B1; AU8960398A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren zur Durchführung eines fluoreszenzbasierten Echtzeittests mit flüssigen biologischen Proben. Das Verfahren eignet sich besonders für Diagnosetests auf Nukleinsäurebasis (d.h. molekulare Diagnosetests).
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Testverfahren auf Nukleinsäurebasis sind wohlbekannt und sind in einer Vielzahl verschiedener Formate implementiert worden. Einer der häufigeren Prozesse, die in einem solchen Test auf Nukleinsäurebasis durchgeführt werden, ist ein Nukleinsäureamplifikationsprozess. Gewöhnlich wird eine Nukleinsäureamplifikationsreaktion zunächst bis zum Ende durchgeführt, und es wird dann eine Nukleinsäuresonde verwendet, um die Anwesenheit oder Abwesenheit einer amplifizierten Nukleinsäuresequenz von Interesse zu ermitteln. Diese Art von Test wird als Endpunkttest bezeichnet.
Ein Problem bei den Endpunkttests ist, dass die amplifizierte Nukleinsäure (Amplikons) aus der Amplifikationsreaktion physisch in den anschließenden Sondentest überführt werden muss. Wegen der Überführung besteht die Möglichkeit einer Kontamination der Laborumgebung mit den Amplikons. Zudem steigt jedesmal, wenn ein physischer Transfer der Probe erfolgt, die allgemeine Gefahr, eine gegebene Probe falsch zu identifizieren oder sie mit anderen Proben zu verwechseln.
Daher gibt es frühere Vorschläge für in sich geschlossene Testeinheiten, die imstande sind, einen integrierten Nukleinsäureamplifikations- und Nukleinsäuresondentest an einer flüssigen biologischen Probe durchzuführen, während die Probe in der Testeinheit eingeschlossen bleibt. Zum Beispiel beschreibt US-Patent Nr. 5,229,297 von Paul N. Schnipelsky et al. eine Küvette zur DNA-Amplifikation und -detektion, die eine Mehrzahl flexibler Kammern zur Aufnahme einer Probe, von Amplifikationsreagenzien und Nachweisreagenzien umfasst, mit Durchgängen, welche die Proben- und Reagenzienkammern mit einem Detektionsort und einer Abfallkammer verbinden. Eine Rolle wird verwendet, um die Proben- und Reagenzienkammern in einer gewünschten Reihenfolge zu quetschen oder zusammenzudrücken, wodurch die Probe und die Nachweisreagenzien durch die Durchgänge zum Detektionsort und zur Abfallkammer getrieben werden. Vorübergehende Verschlüsse werden verwendet, um die Proben- und die Reagenzienkammern von den Durchgängen zu trennen, bis von der Rolle ein ausreichender Druck erzeugt wird. Obwohl diese Anordnung insofern vorteilhaft ist, als die Probe während der Amplifikation und Detektion innerhalb der Küvette verbleibt, führt die Tatsache, dass eine Rolle erforderlich ist, um die vorübergehenden Verschlüsse aufzubrechen und die verschiedenen Flüssigkeiten zwischen den Kammern strömen zu lassen, zu einer unerwünschten Komplexität und erschwert die Automatisierung des Amplifikations- und Testverfahrens.
Desweiteren wird in US-Patent Nr. 5,639,42 eine verbesserte Testeinheit zur Durchführung integrierter Nukleinsäureamplifikationen und Nachweisverfahren auf der Grundlage von Nukleinsäuresonden offenbart. In der verbesserten Testeinheit wird der Strom von Proben- und Reagenzflüssigkeiten durch die von einer drehenden Vorrichtung angelegte Zentrifugalkraft gesteuert, wodurch die Notwendigkeit von Rollen und anderen komplexen Mechanismen vermieden wird. Während dies eine wesentliche Verbesserung gegenüber der in US-Patent Nr. 5,229,297 offenbarten Anordnung darstellt, besteht weiterhin die Notwendigkeit der Gewährleistung einer kontrollierten Flüssigkeitsbewegung innerhalb der Testeinheit und macht die Testeinheit etwas komplexer als es wünschenswert wäre.
Neben den zuvor erörterten Endpunkttests existieren auch homogene Echtzeit-Testverfahren zum Nukleinsäurenachweis. Homogene Echtzeit-Verfahren erfordern keine physische Überführung des amplifizierten Materials zu einem gesonderten Testort, sondern erfolgen vielmehr gleichzeitig mit der Amplifikationsreaktion, der Nachweis kann daher in Echtzeit stattfinden. Beispiele für bekannte homogene Echtzeit-Verfahren umfassen Fluoreszenzpolarisation, Fluoreszenzenergietransfer und Lichtextinktion.
Wie bei den Endpunkttests gibt es auch für homogene Testverfahren frühere Vorschläge für in sich geschlossene Testeinheiten. Zum Beispiel beschreiben US-Patent Nr. 5,236,827 und seine Entsprechung, das europäische Patent Nr. 0 347 771, eine Vorrichtung mit einem fluorogenen Substrat zur Durchführung eines Tests, in dem ein Enzym-Reaktionsgeschwindigkeitsprofil bestimmt wird, um Mikroorganismen zu identifizieren.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 0 640 828 beschreibt ein Gerät zur gleichzeitigen Beobachtung mehrerer Nukleinsäureamplifikationen. Das Gerät enthält einen Thermozykler und einen Sensor zur gleichzeitigen Erfassung des von mehreren Amplifikationen emittierten Lichts.
US-Patent Nr. 5,219,762 beschreibt eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Messung des Produkts einer enzymatischen Reaktion, wobei das Enzym auf einen Zielanalyten einwirkt, um ein nachweisbares und messbares Enzym-Nebenprodukt zu erzeugen.
Das europäische Patent Nr. 0 298 669 beschreibt Verfahren zur Durchführung von Nukleinsäurereaktionen und -manipulationen in Reaktionsgefäßen mit Reagenzien in einem getrockneten Zustand.
Des weiteren wird in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/878,096, eingereicht am 18. Juni 1997, eine Vorrichtung und ein Verfahren für einen homogenen Fluoreszenzpolarisationstest beschrieben. Diese Vorrichtung enthält sämtliche Reagenzien, die für sowohl eine Nukleinsäureamplifikationsreaktion als auch einen Test auf der Grundlage einer Nukleinsäuresonde erforderlich sind, in getrockneter Form, so dass alle diese Reagenzien im wesentlichen zur gleichen Zeit von einer flüssigen biologischen Probe rehydratisiert werden. Die Vorrichtung ist als flache Karte gestaltet, um die Menge an Probe in jeder Probenzelle der Vorrichtung zu minimieren und dadurch ein Vorwärmen der Vorrichtung und eine schnelle Angleichung der Temperatur zugesetzter flüssiger Probe auf die Temperatur der vorgewärmten Vorrichtung (d.h. einen "Heißstart" des Verfahrens) zu ermöglichen. Jedoch hat sich herausgestellt, dass die Rehydratation aller getrockneten Nukleinsäureamplifikationsreagenzien und aller getrockneten Nukleinsäuresondentest-Reagenzien zur im wesentlichen gleichen Zeit ein unreproduzierbares Fluoreszenznachweissignal erzeugt. Es wird angenommen, dass dieses unreproduzierbare Signal auf eine unterschiedliche Rehydratation der fluoreszenzmarkierten getrockneten Nukleinsäuresonde zurückzuführen ist und zu einer Interferenz mit dem gewünschten Fluoreszenzsignal führt, die aufgrund der unreproduzierbaren Natur des Störsignals nicht ausgeklammert werden kann. Auch erschweren die in dieser Vorrichtung verwendeten kleinen Volumina die Detektion von Amplikons einiger Proben und machen die Vorrichtung für Personen im klinisch-diagnostischen Bereich nicht leicht verwendbar.
In Anbetracht des Obengesagten besteht auf dem Fachgebiet ein Bedarf für ein Verfahren zur Durchführung einer homogenen Nukleinsäureamplifikation und eines Echtzeit-Nukleinsäuresonden-Nachweistests mit minimaler Komplexität, das in der Lage ist, ein konsistentes, zuverlässiges Fluoreszenznachweissignal zu liefern.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge einer Zielnukleinsäure in einer Probe bereit, das Schritte umfasst, in denen die Probe mit einer ersten Reagenzformulierung exponiert wird, die ein Nukleinsäuremolekül enthält, das imstande ist, an die Zielnukleinsäure zu hybridisieren, und das eine detektierbare Fluoreszenzsignalveränderung erzeugen kann, wenn sich die Menge an Zielnukleinsäure ändert. Eine solche Exposition erzeugt ein erstes Gemisch, das anschließend mit einer zweiten Reagenzformulierung exponiert wird, die, wenn Zielnukleinsäure in der Probe vorhanden ist, dann die Menge an Zielnukleinsäure verändern wird.
Das Verfahren der Erfindung kann mittels eines Kits durchgeführt werden, das beinhaltet: (1) ein erstes Gefäß oder eine erste Mehrzahl von Gefäßen, welche Nukleinsäureprimer und ein Nukleinsäuremolekül enthalten, das imstande ist, an die Zielnukleinsäure zu hybridisieren, und das eine detektierbare Fluoreszenzsignalveränderung erzeugen kann, und (2) ein zweites Gefäß oder eine zweite Mehrzahl von Gefäßen, welche dem ersten Gefäß oder der ersten Mehrzahl von Gefäßen entsprechen und ein Reagenz enthalten, das eine Reaktion startet, bei der sich, wenn die Zielnukleinsäure in der Probe vorhanden ist, dann die Menge der Zielnukleinsäure verändern wird.
Bei einer alternativen Ausführungsform beinhaltet das Kit zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung ein Gefäß mit einer ersten Abteilung und wenigstens einer anderen Abteilung. Die erste Abteilung enthält Nukleinsäureprimer und ein Nukleinsäuremolekül, das imstande ist, an die Zielnukleinsäure zu hybridisieren, wobei das zur Hybridisierung an die Zielnukleinsäure fähige Nukleinsäuremolekül eine detektierbare Fluoreszenzsignalveränderung erzeugen kann, wenn sich die Menge an Zielnukleinsäure ändert. Die andere Abteilung des Gefäßes enthält ein Reagenz, das eine Reaktion startet, bei der sich, wenn die Zielnukleinsäure in der Probe vorhanden ist, dann die Menge an Zielnukleinsäure verändern wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die verschiedenen Ziele, Vorteile und Neuheitsmerkmale der vorliegenden Erfindung werden leicht aus der folgenden ausführlichen Beschreibung verständlich werden, wenn diese in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen gelesen wird, wobei:
1 die Ergebnisse eines Vergleichsexperiments darstellt, bei dem ein Amplifikations- und homogener Fluoreszenz-Echtzeit-Nachweistest in einer bekannten Vorrichtung durchgeführt wurde, wobei sämtliche Testreagenzien in einem einzigen Tupfen in der Vorrichtung getrocknet waren;
2 die Ergebnisse eines zweiten Vergleichsexperiments darstellt, bei dem ein Amplifikations- und homogener Fluoreszenz-Echtzeit-Nachweistest in einer bekannten Vorrichtung durchgeführt wurde, wobei die Testreagenzien in zwei Tupfen in der Vorrichtung getrocknet waren;
3 die Ergebnisse eines Experiments darstellt, bei dem ein Amplifikations- und homogener Fluoreszenz-Echtzeit-Nachweistest durchgeführt wurde, worin eine HIV-Nukleinsäuresequenz mit einer rehydratisierten Fluoreszenzsonde amplifiziert wurde; und
4 die Ergebnisse eines Experiments darstellt, bei dem ein Amplifikations- und homogener Fluoreszenz-Echtzeit-Nachweistest durchgeführt wurde, worin eine Chlamydia-Nukleinsäuresequenz mit einer rehydratisierten Fluoreszenzsonde amplifiziert wurde.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DRR ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Testverfahren, bei denen die Detektion eines Fluoreszenzsignals in Echtzeit (d.h., während eine Reaktion abläuft) durchgeführt wird. Bei solchen Tests wird eine Veränderung im Fluoreszenzsignal erfasst.
Damit solche Echtzeit-Fluoreszenznachweistests brauchbar sind, muss die zeitliche Veränderung im Fluoreszenzsignal erfaßbar und verfolgbar sein. Folglich ist ein störender Fluoreszenzhintergrund (d.h. ein Fluoreszenzsignal, das auf andere Zustände als die Anwesenheit eines Zielanalyten zurückzuführen ist) für Echtzeit-Fluoreszenznachweistests ungünstig, wenn er nicht konstant oder reproduzierbar ist. Das heißt, der störende Hintergrund kann im Verhältnis zum spezifischen Signal von beträchtlichem Umfang sein, solange die Veränderung im Fluoreszenzhintergrund (1) im Verhältnis zur Veränderung im spezifischen Signal gering ist oder (2) durch Anwendung eines numerischen Algorithmus kompensiert werden kann.
Wenn jedoch Echtzeit-Fluoreszenznachweistests mit Reagenzien in trockener Form, die hydratisiert werden müssen, formatiert werden, bewirkt die Rehydratation des trockenen fluoreszenzmarkierten Reagenzes einen störenden Fluoreszenzhintergrund, der nicht konstant ist und sich unreproduzierbar ändert. Folglich überdeckt dieser störende Hintergrund die spezifische Fluoreszenzveränderung und kann nicht durch numerische Verfahren korrigiert werden. Daher ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung dafür konzipiert, diese Ursache eines störenden Fluoreszenzhintergrundes zu beseitigen, indem der Start der Nachweisreaktion, welche die gewünschte Veränderung im Fluoreszenzsignal erzeugt, bis nach der Rehydratation des fluoreszenzmarkierten Reagenzes verschoben wird.
Beim Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine Probe, die eine Zielnukleinsäure enthalten könnte, mit einer ersten Reagenzformulierung exponiert, die Nukleinsäureprimer und ein fluoreszenzmarkiertes Nukleinsäuremolekül enthält, das imstande ist, an die Zielnukleinsäure zu hybridisieren. Eine solche Exposition erzeugt ein erstes Gemisch. Dann wird das erste Gemisch mit einer zweiten Reagenzformulierung exponiert, die, wenn die Zielnukleinsäure vorhanden ist, eine nachweisbare Veränderung im erzeugten Fluoreszenzsignal bewirken wird.
Bei einem solchen Verfahren wird das fluoreszenzmarkierte Reagenz (d.h. das fluoreszenzmarkierte Nukleinsäuremolekül, das imstande ist, an die Zielnukleinsäure zu hybridisieren) vor dem Start der Nachweisreaktion rehydratisiert. Das heißt, die Nachweisreaktion wird bis nach der Rehydratation des zur Hybridisierung an die Zielnukleinsäure fähigen fluoreszenzmarkierten Nukleinsäuremoleküls verschoben.
Das fluoreszenzmarkierte Nukleinsäuremolekül der ersten Reagenzformulierung besitzt eine Bindungsspezifität für die Zielnukleinsäure, die ausreicht, um die Zielnukleinsäure von anderen Nukleinsäuren zu unterscheiden. Das zur Hybridisierung an die Zielnukleinsäure fähige Nukleinsäuremolekül ist ein Nukleinsäuremolekül, das eine ausreichende Komplementarität aufweist, so dass das Bindungspartner-Nukleinsäuremolekül an die Zielnukleinsäure hybridisieren wird.
Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung von Nukleinsäuremolekülen (d.h. Konjugation) sind dem Fachmann wohlbekannt. Beispiele für geeignete Fluoreszenzmarker zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen Xanthenfarbstoffe wie Fluoresceine, Rhodamine und Rosamine und Naphthylamine wie 1-Dimethylaminonaphthyl-5-sulfonat, 1-Anilino-8-naphthalensulfonat und 2-p-Toluidinyl-6-naphthalensulfonat.
Der fluoreszenzmarkierte Nukleinsäuremolekül-Bindungspartner befindet sich in der ersten Reagenzformulierung zusammen mit Nukleinsäureprimern, die für eine Zielnukleinsäure von Interesse spezifisch sind. Jedoch können weitere Reagenzien in der ersten Reagenzformulierung vorhanden sein, solange eine bestimmte zweite Reagenzformulierung, welche die Nachweisreaktion starten würde, von der ersten Reagenzformulierung und dem Gemisch, das durch Exposition der Probe mit der ersten Reagenzformulierung erzeugt wird, zurückgehalten wird. Wenn zum Beispiel eine auf Polymerase beruhende Nukleinsäureamplifikationsreaktion Teil des Nachweistests ist, kann die zweite Reagenzformulierung eine Polymerase enthalten, da eine Exposition der Probe mit einem ersten Reagenzgemisch, das keine Polymerase enthält, keinen Start des Nachweistests bewirken wird, aber die Rehydratation eines getrockneten fluoreszenzmarkierten Nukleinsäuremolekül-Bindungspartners ermöglichen wird. Ebenso kann, wenn ein solcher Nachweistest erst bei Anwendung einer bestimmten Temperatur gestartet wird, die Rehydratation der ersten, den fluoreszenzmarkierten Nukleinsäuremolekül-Bindungspartner enthaltenden Reagenzformulierung durch Exposition mit der Probe dann bei einer niedrigeren Temperatur erfolgen, und das Gemisch wird anschließend Wärme als Startbedingung für den Nachweistest ausgesetzt.
Der Start des Nachweistests ist der Beginn einer Änderung der Menge an Zielnukleinsäure. Die Änderung der Menge an Zielnukleinsäure ist ein Mengenanstieg, der durch die Produktion von Amplikons (d.h. Kopien des Zielnukleinsäuremolekül-Analyten) durch eine Nukleinsäureamplifikationsreaktion verursacht wird. Solche Nukleinsäureamplifikationsreaktionen sind dem Fachmann wohlbekannt, und geeignete Beispiele für solche Reaktionen umfassen Strangverdrängungsamplifikation ("SDA"), Polymerasekettenreaktion ("PCR"), Ligasekettenreaktion ("LCR"), transkriptionsvermittelte Amplifikation ("TMA") und Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation ("NASBA"). Bei solchen Reaktionen bewirkt die Produktion von Amplikons (d.h. ein Anstieg der Menge an Zielanalyt) eine Veränderung im Fluoreszenzsignal, welche detektiert werden kann, während die Menge an Zielnukleinsäure mit der Zeit ansteigt (d.h. Echtzeit-Detektion).
Bei einem Test, der auf Fluoreszenzenergietransfer ("FET") beruht, wird beispielsweise eine Veränderung in der Intensität eines Fluoreszenzsignals erfasst. Bei solchen Tests sind ein Fluoreszenzenergie-Donorteil und ein Fluoreszenzenergie-Akzeptorteil auf dem Zielanalyt-Bindungspartner vorhanden. Wenn sich der Donor- und der Akzeptorteil in ausreichend enger Nachbarschaft befinden, wird die Intensität des Fluoreszenzsignals vom Donorteil durch den Akzeptorteil gequencht. Folglich sind FET-Tests derart konzipiert, dass: (1) ein Anstieg in der Intensität des Fluoreszenzsignals die Anwesenheit eines Zielanalyten anzeigt (d.h. die Donor- und Akzeptorteile befinden sich anfänglich in enger Nachbarschaft, und die Anwesenheit des Zielanalyten bewirkt eine Abnahme dieser Nähe); oder (2) ein Abnahme in der Intensität des Fluoreszenzsignals die Anwesenheit eines Zielanalyten anzeigt (d.h. die Donor- und Akzeptorteile befinden sich anfänglich nicht in enger Nachbarschaft, und die Anwesenheit des Zielanalyten bewirkt eine Zunahme dieser Nähe).
Damit eine Zunahme oder eine Abnahme der Nähe der Fluoreszenzenergie-Donor- und Akzeptorteile erfolgen kann, ist der Bindungspartner zu einer gewissen Veränderung der Sekundärstruktur fähig. Beispiele für Nukleinsäuremolekül-Sekundärstrukturen, die einen Fluoreszenz-Donorteil und einen Fluoreszenz-Akzeptorteil in ausreichender Nähe halten, um Fluoreszenzsignale zu quenchen, sind G-Quartetts und Stemloop- oder Haarnadelstrukturen. Nukleinsäuremoleküle mit solchen Sekundärstrukturen sind dem Fachmann aus Literaturquellen wie Varani, G., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1995, 24: 379-404 und Williamson, J., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1994, 23: 703-30 wohlbekannt. Diese Sekundärstrukturen sind auch zu einer Formänderung imstande, um eine lineare Sekundärstruktur zu liefern, bei der die Nähe des Fluoreszenzenergie-Donorteils und des Fluoreszenzenergie-Akzeptorteils verringert ist, was ein geringeres Quenching des Fluoreszenzsignals zur Folge hat. Bei Verwendung von Fluoreszenz-Donor-Akzeptor-Paaren wie Fluorescein – Rox oder DABCYL – Fluorescein, wie es in der US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/865,675, eingereicht am 30. Mai 1997, und in der US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/855,085, eingereicht am 13. Mai 1997, gelehrt wird, kann nach Formänderung einer Haarnadelstruktur in Gegenwart von Amplikons ein fünf- bis zehnfacher Anstieg des Fluoreszenzsignals beobachtet werden.
Wenn das Gemisch aus Probe und erster Reagenzformulierung mit einer zweiten Reagenzformulierung exponiert wird, kann die physische Trennung der ersten Reagenzformulierung von der zweiten Reagenzformulierung durch eine Vielzahl verschiedener Mittel erreicht werden. Bei einer Ausführungsform können entsprechende erste und zweite Gefäße wie etwa Vertiefungen jeweils die erste Reagenzformulierung und die zweite Reagenzformulierung enthalten. Bei einer solchen Anordnung können die entsprechenden ersten und zweiten Vertiefungen mit entsprechenden Hinweisen auf ihre Bezogenheit gekennzeichnet sein. Zum Beispiel können die entsprechenden ersten und zweiten Vertiefungen mit Strichcodes oder anderen Codes gekennzeichnet oder farbcodiert sein, um ihre Bezogenheit anzugeben. Solche Hinweise auf Bezogenheit sind nützlich, um die Möglichkeit einer falschen Überführung von Reaktionsgemisch aus einer ersten Vertiefung in eine zweite Vertiefung zu verringern, wenn entsprechende Multiwellplatten oder andere Vorrichtungen verwendet werden.
Alternativ kann ein einziges Gefäß wie eine Vertiefung in zwei oder mehrere Abteilungen unterteilt sein. Bei einer solchen Ausführungsform befindet sich die erste Reagenzformulierung in einer ersten Abteilung des Gefäßes und befindet sich die zweite Reagenzformulierung in einer zweiten Abteilung der Vertiefung. Obwohl die Abteilungen der Vertiefung wie oben beschrieben gekennzeichnet sein können, mag dies bei dieser Ausführungsform nicht so wichtig sein, da das Gemisch, das durch die Exposition der ersten Reagenzformulierung mit der Probe erzeugt wird, statt in eine zweite Vertiefung lediglich in eine andere Abteilung derselben Vertiefung überführt werden wird. Folglich besteht eine geringere Fehlergefahr bei der Überführung und eine geringere Notwendigkeit für die Kennzeichnung entsprechender Abteilungen zur Einschränkung einer solchen Gefahr.
Bei jeder der obigen Ausführungsformen liegen die erste Reagenzformulierung und die zweite Reagenzformulierung typischerweise in einem trockenen Format in Form eines Tupfens auf einer Innenwand eines Gefäßes vor. Die Reagenzien in dem getrockneten Tupfen der ersten Reagenzformulierung und dem getrockneten Tupfen der zweiten Reagenzformulierung sind in einer leicht löslichen Matrix wie Trehalose oder einem anderen Kohlenhydrat enthalten. Diese Reagenzien werden leicht rehydratisieren, wenn sie in einer Vertiefung einer wässerigen Flüssigkeit ausgesetzt sind. Jede Ausführungsform ist aber auch brauchbar, wenn die zweite Reagenzformulierung nicht in trockener Form vorliegt.
Wenn es in einer bevorzugten Ausführungsform durchgeführt wird, beinhaltet das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine Nukleinsäureamplifikationsreaktion, bei der ein Nukleinsäuremolekül-Bindungspartner mit einem Fluoreszenz-Donorteil und einem Fluoreszenz-Akzeptorteil verwendet wird. Eine erste Vertiefung enthält einen solchen Bindungspartner in einer getrockneten Form und sämtliche anderen Reagenzien außer Nukleinsäureamplifikationsenzyme in einer getrockneten Form (d.h. die erste Reagenzformulierung). Solche Enzyme (d.h. die zweite Reagenzformulierung) befinden sich in einer trockenen Form in einer entsprechenden zweiten Vertiefung. Eine flüssige Probe, die einen Zielanalyten (d.h. ein Nukleinsäuremolekül) enthalten mag, wird der ersten Vertiefung zugesetzt und bewirkt eine Rehydratation der ersten Reagenzformulierung und die Bildung eines Gemisches aus Probe und erster Reagenzformulierung. Das Gemisch wird dann in die zweite Vertiefung überführt und bewirkt die Rehydratation der zweiten Reagenzformulierung, wodurch eine homogene Nukleinsäureamplifikation und ein Echtzeit-Fluoreszenz-Nachweistest ausgelöst werden. Die zweite Vertiefung wird mittels eines Fluoreszenzdetektionsgerätes abgelesen. Wenn der Zielanalyt anwesend ist, werden Amplikons erzeugt, und es wird ein ansteigendes Fluoreszenzsignal detektiert werden, wenn sich die Fluoreszenz-Donorteile und Fluoreszenz-Akzeptorteile voneinander entfernen, wodurch das Quenching des Fluoreszenzsignal abnimmt. Die anfängliche Menge an Zielanalyt kann daher mittels numerischer Analyse des angestiegenen Fluoreszenzsignals über die Zeit berechnet werden. Numerische Verfahren zur Berechnung der anfänglichen Zielzahl anhand von Fluoreszenzraten-Daten umfassen Gesamtanstieg, Berechnung der Zeit zum ersten Positiven und Maximalgeschwindigkeit der Veränderung.
Bei einer Art der Quantifizierungsanalyse werden beispielsweise eine Mehrzahl bekannter Mengen einer Nukleinsäuresequenz in jeweiligen Kalibrierungsproben (d.h. Standards) und eine unbekannte Menge der Nukleinsäuresequenz in einer Testprobe parallel während eines Zeitintervalls amplifiziert. Es werden dann mittels konventioneller Techniken an Meßpunkten in dem Zeitintervall Indizien für die Mengen der amplifizierten Nukleinsäuresequenz in den Kalibrierungs- und Testproben gemessen. Die Indizien für die Mengen der amplifizierten Nukleinsäure können die Form von Fluoreszenzsignalen annehmen (z.B. Fluoreszenzintensitäten oder detektierbarer Fluoreszenzenergietransfer), wenn die Proben Fluoreszenzindikatoren (z.B. Fluoreszenzfarbstoffe, -markierungen, -interkalatoren etc.) enthalten. Es können auch andere Indizien, die sich für eine Echtzeit-Messung eignen, (z.B. radioaktive Signale) verwendet werden.
Es wird dann ein Schritt durchgeführt, um einen ersten möglichen Grenzpegel und eine entsprechende erste Reihe von Zeitpunkten in dem Zeitintervall zu bestimmen, an denen die gemessenen Indizien für die Mengen der amplifizierten Nukleinsäuresequenz in jeder der Kalibrierungsproben dem ersten Grenzpegel entsprechen. Dieser Schritt wird dann für jeden einer Anzahl verschiedener möglicher Grenzpegel wiederholt, so dass für jeden möglichen Grenzpegel jeweilige Reihen von Zeitpunkten in dem Zeitintervall erhalten werden können. Gemäß einer bevorzugten Erscheinungsform dieser Quantifizierungsanalyse wird anschließend ein Schritt durchgeführt, um hinsichtlich eines statistischen Kriteriums zu bestimmen, welche der Reihen von Punkten in dem Zeitintervall das statistische Kriterium gegenüber den bekannten Mengen der Nukleinsäuresequenz in den Kalibrierungsproben besser erfüllt. Es wird dann eine Menge der Nukleinsäuresequenz in den Testproben auf der Basis derjenigen Reihe von Punkten bestimmt, welche das statistische Kriterium besser oder am besten erfüllt.
Der Schritt zur Bestimmung, welche Reihe von Punkten das statistische Kriterium besser erfüllt, kann zum Beispiel den Schritt der Bestimmung enthalten, welche Reihe von Punkten in dem Zeitintervall eine bessere lineare Anpassung gegenüber Logarithmen der bekannten Anfangsmengen der Nukleinsäuresequenz in den Kalibrierungsproben liefert. Vorzugsweise umfasst dieser Schritt die Schritte des Anpassens von Regressionsgeraden an jeweilige "graphische Auftragungen" jeder dieser Reihen von Zeitpunkten in dem Zeitintervall versus Logarithmen der bekannten Anfangsmengen der Nukleinsäuresequenz in den Kalibrierungsproben. Es werden dann Standardabweichungen der Anpassungen zwischen jeder der Zeitpunktreihen und jeweiligen Regressionsgeraden bestimmt. Anschließend wird die Zeitpunktreihe, die vorzugsweise der geringsten Standardabweichung der Anpassung entspricht, dazu verwendet, den bevorzugten Grenzpegel aus den möglichen Grenzpegeln auszuwählen und dann auf Basis des bevorzugten Grenzpegels die Anfangsmenge der Nukleinsäure in der Testprobe zu bestimmen. Dieses vorteilhafte Ergebnis wird vorzugsweise erreicht, indem man eine Zeit bestimmt, zu der die gemessenen Indizien für die Mengen der Nukleinsäuresequenz in der Testprobe dem bevorzugten Grenzpegel entsprechen, und dann diese Zeit auf der "bevorzugten" Regressionsgerade, die der bevorzugten Zeitpunktreihe entspricht, aufträgt. Anschließend kann anhand der bevorzugten Regressionsgerade der Logarithmus der Anfangskonzentration der Nukleinsäuresequenz in der Testprobe ermittelt werden.
Gemäß einer anderen Quantifizierungsanalyse wird eine Operation der Kurvenanpassung durchgeführt, um den bevorzugten Indizien-Grenzpegel (z.B. den bevorzugten Fluoreszenzsignal-Grenzpegel) genauer zu berechnen. Insbesondere werden jeweilige "Daten"-Kurven vorzugsweise "graphischen Auftragungen" verschiedener Punkte der gemessenen Fluoreszenzsignale einzelner Kalibrierungs- und Testproben versus Punkten in dem Zeitintervall, an denen die entsprechenden Fluoreszenzsignale gemessen wurden, angepasst. Hier kann eine nichtparametrische Kurvenglättungsoperation durchgeführt werden, nachdem die verschiedenen Punkte zu einer gemeinsamen Grundlinie normalisiert worden sind. Es ist auch möglich, die Genauigkeit des bevorzugten Indizien-Grenzpegels noch weiter zu verbessern, indem man für jede der "geglätteten" Datenkurven untere Konfidenzgrenzkurven ermittelt. Die unteren Konfidenzgrenzkurven können ebenfalls mittels einer nichtparametrischen Glättungsoperation geglättet werden. Dann kann jede der oben beschriebenen Reihen von Zeitpunkten in dem Zeitintervall durch Bestimmung von Schnittpunkten zwischen jeder der geglätteten unteren Konfidenzgrenzkurven und den jeweiligen möglichen Grenzpegeln ermittelt werden.
Wie oben beschrieben, kann eine Zeitpunktreihe, die einer geringsten Standardabweichung der Anpassung entspricht, zur genauen Bestimmung eines bevorzugten Grenzpegels und der anschließenden Bestimmung der Anfangsmenge der Nukleinsäure in der Testprobe auf Basis des bevorzugten Grenzpegels verwendet werden. Gemäß einer anderen Art der Quantifizierungsanalyse können jedoch Kontrollproben, die bekannte Anfangsmengen der Nukleinsäuresequenz enthalten, auch dazu verwendet werden, die Bestimmung eines bevorzugten Grenzpegels zu vereinfachen. Insbesondere kann, nachdem für jede den Kalibrierungsproben entsprechende Reihe von Zeitpunkten in dem Zeitintervall jeweilige Regressionsgeraden angepasst wurden, ein mittlerer Vorhersagefehler (APE, average prediction error) zwischen jeder Regressionsgerade und jener einer jeweiligen den Kontrollproben entsprechenden Zeitpunktreihe bestimmt werden. Der mögliche Grenzpegel, welcher der damit verbundenen Regressionsgeraden mit dem geringsten mittleren Vorhersagefehler entspricht, kann dann verwendet werden, um die Anfangskonzentration der Nukleinsäuresequenz in der Testprobe zu ermitteln.
Wie aus der obigen Beschreibung des Verfahrens ersichtlich, eignen sich die Reagenzformulierungen und Gefäße zur Kombination in einem Kit, insbesondere, wenn diese Gefäße Vertiefungen von Standard-Mikrowellplatten mit 96 Vertiefungen sind. Ein solches Kit umfasst die entsprechenden ersten und zweiten Gefäße, wobei die erste Reagenzformulierung in dem ersten Gefäß getrocknet vorliegt und die zweite Reagenzformulierung entweder in dem zweiten Reaktionsgefäß getrocknet vorliegt oder in dem Kit zwar enthalten ist, jedoch als flüssige Formulierung in einem zusätzlichen Behälter in dem Kit.
Die getrocknete erste Reagenzformulierung ist einer Innenwand jedes ersten Gefäßes in Form eines einzigen Einzeltupfens angeheftet. Die getrocknete zweite Reagenzformulierung ist einer Innenwand jedes entsprechenden zweiten Gefäßes in Form eines einzigen Einzeltupfens angeheftet. In jedes der ersten Gefäße können flüssige Proben eingebracht werden (vorzugsweise durch Pipettieren). Desgleichen kann nach Rehydratation der ersten Reagenzformulierung durch Exposition mit der Probe das Gemisch dieser zwei Einheiten in jedes der entsprechenden zweiten Gefäße eingebracht werden. Wie nachstehend beschrieben werden wird, kommt die flüssige biologische Probe, die in das erste Probengefäß eingebracht wird, mit dem getrockneten Tupfen der ersten Reagenzformulierung in dem Probengefäß in Berührung und löst diesen.
Ein Verschlussmittel wie ein Streifen wird ebenfalls bereitgestellt, um die zweiten Gefäße zu verschließen, nachdem das Gemisch aus erster Reagenzformulierung und Probe in die zweiten Gefäße eingebracht worden ist. Vorzugsweise ist das Verschlussmittel ein Material, das mit einer Schicht von druckempfindlichem Klebstoff auf seiner Unterseite versehen ist. Bei einer Ausführungsform wird ein flexibler Verschlussstreifen in ähnlicher Weise wie ein Klebeband aufbracht und dient dazu, die zweiten Gefäße dauerhaft zu verschließen.
Das Verschließen der zweiten Gefäße mittels des Verschlußstreifens bietet mehrere Vorteile. Der grundlegende Vorteil des Verschlussstreifens ist, dass er die Freisetzung von Nukleinsäureamplikons aus den zweiten Gefäßen verhindert und dadurch eine Kontamination der Laborumgebung verhindert. Zweitens verhindert der Verschlussstreifen eine Verdunstung des flüssigen Gemisches aus den zweiten Gefäßen während der homogenen Nukleinsäureamplifikation und des Echtzeit-Fluoreszenz-Nachweistests. Angesichts der Tatsache, dass das Gemischvolumen in einer typischen Vertiefung einer Mikrowellplatte im Vergleich zu anderen bekannten Vorrichtungen wie Karten ziemlich groß ist (z.B. etwa 300 μl Volumen einer Vertiefung im Gegensatz zu etwa 20 μl Volumen einer Karten-Probenzelle), stellt jedoch der Verdunstungsverlust aus Mikrovertiefungen kein so bedeutendes Problem dar wie der bei einer Kartenvorrichtung.
Typischerweise werden die verschiedenen flüssigen biologischen Proben, die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, aus Urinproben, Blutproben oder anderen Körperflüssigkeitsproben von verschiedenen Patienten bestehen, die sämtlich mit einer homogenen Nukleinsäureamplifikation und einem Echtzeit-Fluoreszenz-Nachweistest auf das gleiche Pathogen getestet werden. Es versteht sich jedoch, dass Ausführungsformen möglich sind, bei denen mehr als eine der biologischen Proben von demselben Patienten genommen werden und bei denen sich die erste Reagenzformulierung von einem ersten Gefäß zum nächsten unterscheidet.
Zum Nachweis einer Fluoreszenzsignaländerung im zweiten Gefäß kann jedes handelsübliche Fluoreszenzmessgerät verwendet werden, wie etwa ein Mikroplatten-Fluorometer oder ein Mikroplatten-Lesegerät. Alternativ kann ein Spezialgerät entwickelt werden. Abhängig von den Temperaturerfordernissen der homogenen Nukleinsäureamplifikation und des Echtzeit-Fluoreszenz-Nachweistests sind für die ersten Probengefäße und/oder zweiten Gefäße sowie auch innerhalb des Geräts Heizmittel, gewöhnlich in Form von Heizblöcken, vorgesehen.
Bei einem Test auf der Grundlage von Fluoreszenzpolarisation ("FP") wird eine Veränderung im FP-Wert detektiert. Bei Fluoreszenzpolarisationstests wird ein polarisierter Anregungsstrahl einer bestimmten Lichtwellenlänge dazu verwendet, den fluoreszenzmarkierten Oligonucleotid-Bindungspartner anzuregen. Die Intensität der Fluoreszenzemission von diesen angeregten Bindungspartnern bei einer bestimmten Wellenlänge wird in der Ebene, die parallel zur Anregungspolarisation polarisiert ist, und auch in der Ebene, die senkrecht zur Anregungspolarisation polarisiert ist, gemessen. Wenn ein fluoreszenzmarkierter Oligonucleotid-Bindungspartner an ein Nukleinsäureamplikon hybridisiert, steigt die Intensität der Fluoreszenzemission in der Ebene parallel zur Anregungsebene an. Typischerweise werden sowohl parallele als auch senkrechte Intensitäten gemessen. Dann werden die Änderungen in der Gesamtintensität durch Anwendung der folgenden Formel kompensiert: P = (IPARA – IPER)/(IPARA + IPER),wobei:

I_PARA: = Fluoreszenzintensität in der Ebene, die parallel zur Ebene der Anregungspolarisation polarisiert ist; und
I_PER: = Fluoreszenzintensität in der Ebene, die senkrecht zur Anregungspolarisation polarisiert ist.

Diese Formel liefert die dimensionslose Größe, die als Polarisationsverhältnis (P) bezeichnet wird.
Da es die Polarisationsintensität in der Ebene parallel zur Anregungspolarisation ist, die bei zunehmender Hybridisierung ansteigt, wird eine Messung der Intensität der Polarisation in der Ebene parallel zur Anregungspolarisation über die Zeit die zunehmende Hybridisierung von Oligonucleotid-Bindungspartner an Oligonucleotid-Zielanalyt über die Zeit zeigen. Dies ist eine kinetische oder dynamische Herangehensweise an die Messung von Fluoreszenzpolarisation, die sich auch zur Verwendung bei Fluoreszenzenergietransfer- und Lichtextinktionstests eignet. Durch Anwendung solch einer kinetischen oder dynamischen Methode wird die Kompensation absoluter Intensität etwas weniger wichtig, da jede Probe gegen sich selbst gemessen wird und somit eine Relativmessung darstellt. Im Falle eines Fluoreszenzpolarisationstests wird es daher erforderlich, Fluoreszenzintensität nur in der Ebene, die parallel zur Ebene der Anregungspolarisation polarisiert ist, zu messen.
Die folgenden Beispiele erläutern spezielle Ausführungsformen der hierin beschriebenen Erfindung. Wie einem Fachmann ersichtlich wäre, sind verschiedene Änderungen und Modifikationen möglich und im Rahmen der beschriebenen Erfindung vorgesehen.
BEISPIEL 1
Vergleichsbeispiel unter Verwendung eines Kits und eines Verfahrens, worin Rehydratation von trockener Fluoreszenzdetektorsonde und Amplifikation eines Zielanalyten in einem ersten Gefäß eines solchen Kits während eines ersten Schrittes eines solchen Verfahrens erfolgen
Dieses Beispiel wurde als eine Erläuterung von Problemen durchgeführt, die mit existierenden Kits und Verfahren, welche zur Durchführung von Fluoreszenznachweistests verwendet werden, verbunden sind. Das für dieses Beispiel verwendete Kit umfaßte eine Vorrichtung für einen homogenen Fluoreszenzpolarisationstest, wie sie in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/878,096, eingereicht am 18. Juni 1997, ("DNA Card") beschrieben ist. Das bei diesem Beispiel angewendete Verfahren wird ebenfalls in der verwiesenen Patentanmeldung gelehrt. Kurz gesagt ist, wie im obigen Abschnitt "Hintergrund" beschrieben, die DNA-Karte eine Vorrichtung, die sämtliche erforderlichen Reagenzien für sowohl eine Nukleinsäureamplifikationsreaktion als auch einen auf Nukleinsäuresonden beruhenden Test in getrockneter Form enthält, so dass alle diese Reagenzien im wesentlichen gleichzeitig durch eine flüssige biologische Probe rehydratisiert werden.
Materialien und Methoden
In diesem Beispiel war HIV der Zielanalyt, wobei Strangverdrängungsamplifikation (Strand Displacement Amplification, "SDA") in einem homogenen Echtzeit-Fluoreszenz-Nachweistest verwendet wurde. Die Sequenznummerierung für das HIV-gag-Gen hält sich an die in Gurgo C., Guo H.G., Franchini G., Aldovini A., Collalti E., Farrell K., Wong-Staal G., Gallo R.C. und Reitz M.S. Jr. (1988), Virology 164, 531-536 beschriebene. Ein Teil des HIV-GAG-1-Gens wurde zur Verwendung als Ziel in einen pGEM11Zf(+)-Vektor kloniert. Die klonierte GAG-Sequenz war identisch mit HIV MN und entspricht den von Gurgo et al. beschriebenen Positionen 1222-1839.
Bumper-Primer B1, 5'dTACATCAGGCCATATCACC (SEQ ID NO: 1), entspricht den gag-Positionen 1223-1241. Bumper-Primer B2, 5'dGCAGCT TCCTCATTGAT (SEQ ID NO: 2), entspricht den Positionen 1424-1408. Amplifikationsprimer S1, 5'dACCGCATCGAATGCATGTCTCGGGTGGTAAAA GTAGTAGAAG (SEQ ID NO: 3), und S2, 5'dCGATTCCGCTCCAGACTTC TCGGGGTGTTTAGCATGGTGTT (SEQ ID NO: 4) entsprechen den gag-Positionen 1260-1276 bzw. den Positionen 1368-1348.
Die Endbedingungen für die HIV-SDA-Reaktion waren wie folgt: 35 mM KPO₄ (pH 7,6), 0,1 mg/ml acetyliertes Rinderserumalbumin, 1 μM Primer S1, 0, 75 μM Primer S2, jeweils 0, 05 μM Primer B1 und B2, 400 nM FAM-ROX-Detektorsonde (5'-FAM-dGTCACTCGAGAT(ROX)TCAGCATTATCAGAAGGA GCCACCCCAC-3' (SEQ ID NO: 5)), 1,4 mM dCTPαS, 0,5 mM dUTP, jeweils 0,2 mM dATP und dGTP, 7,5 mM MgOAc, 5% DMSO, 8% Glycerol, 500 ng menschliche Plazenta-DNA, 320 Einheiten BsoB1 und 20 Einheiten Bst pro 50 μl Reaktionsendvolumen. In Trocknungsexperimenten wurde genügend Trehalose zugesetzt, um nach Dehydratation harte glasartige Filme zu erzielen. Die verwendete Menge an Trehalose betrug 1% (w/v) des SDA-Endvolumens.
Geräte und Messausrüstung
DNA-Karten wurden von Celluloseacetatbutyrat-Platten abgestanzt und unter Verwendung einer Klebefolie zusammengefügt. Zwei Platten bilden eine Vertiefung, in der Reagenzien getrocknet wurden. Hinzufügung einer dritten Platte vervollständigt eine DNA-Karte mit 64 Probenkompartimenten. Jedes Probenkompartiment kann ein 20-μl-Volumen fassen und ist durch eine Probenzugabeöffnung zugänglich. Eine zweite Öffnung ist als Lüftungsloch vorgesehen. Nach der Probenzugabe wurde ein klebstoffbeschichteter Verschlussstreifen über beide Öffnungen gegeben, um eine Verdunstung und Kontamination zukünftiger SDA-Reaktionen zu verhindern. Während der Amplifikation erfolgten durch die transparenten Platten der DNA-Karte Fluoreszenzmessungen.
Ein Fluoroskan Mikrowell-Fluorometer (Labsystems, Rochester, NY) wurde modifiziert, um Echtzeit-SDA in DNA-Karten durchzuführen. Diese Modifikationen umfassten die Einstellung der Stufenhöhe und Einführung einer Heizstufe zur Regelung der Temperatur in der DNA-Karte mit +/- 0,3°C bei jedem Einstellpunkt zwischen 50 und 60°C. Das Glasfaserbündel wurde um 15 Grad von der Vertikalen versetzt, um den Hintergrund zu verringern, der auf Licht zurückzuführen ist, das von der DNA-Karte wegreflektiert wird. Zur Unterscheidung von Anregungs(485 nm) und Emissionslicht (535 nm) wurden Bandpass-Interferenzfilter verwendet. Modifikationen an der Genesis^TM-Software (Labsystems, Rochester, NY) erleichterten Echtzeitmessung von Fluoreszenzintensität in bis zu 64 Probenkompartimenten. Die Nachweisgrenze für Fluoresceinisothiocyanat betrug etwa 20 nM bei doppelter Hintergrundfluoreszenz mit einer über 1000 nM hinausgehenden Linearität. Typische Zykluszeiten waren 1 Sekunde pro Messung oder etwa 1 Minute zur Ablesung einer ganzen DNA-Karte mit 64 Proben.
Verfahren
Die oben beschriebenen SDA-Reagenzien mit Ausnahme von KPi, DMSO und Glycerol wurden in einem 5x-Mix zusammengemischt. Die Konzentration von KPi-Puffer in dem Trocknungsmix betrug 37,5 mM. Aliquots dieses Mixes (4 μl) wurden einzelnen DNA-Karten-Probenkompartimenten zugesetzt und in einem einzigen Tupfen zu glasartigen Filmen getrocknet. HIV-Ziel wurde in 31 mM KPi, 5,8% Glycerol und 5% DMSO zubereitet. Jedem Probenkompartiment wurden Ziel-Aliquots zugesetzt, die Kompartimente wurden verschlossen, und es wurde 30 Minuten hindurch die Fluoreszenz (485 (EX)/535 (EM)) verfolgt.
Ergebnisse und Schlussfolgerungen
Wie in 1 dargestellt, zeigen die Ergebnisse während der ersten 5 Minuten der Amplifikationsreaktion eine veränderliche und negative Signalfluktuation. Eine solche veränderliche Signalfluktuation war einer Kompensation durch Anwendung eines numerischen Algorithmus nicht zugänglich. Überdies macht eine solche veränderliche Signalfluktuation die diagnostischen Ergebnisse eines derartigen Tests unzuverlässig.
BEISPIEL 2
Weiteres Vergleichsbeispiel, bei dem Hintergrundamplifikation im wesentlichen ausgeschaltet ist
Dieses Beispiel wurde als eine weitere Erläuterung von Problemen durchgeführt, die mit existierenden Kits und Verfahren, welche zur Durchführung von Fluoreszenznachweistests verwendet werden, verbunden sind. Das für dieses Beispiel verwendete Kit war das gleiche wie das für Beispiel 1 verwendete. Auch die Methoden und Materialien sowie die Geräte und Messausrüstung waren die gleichen wie die in Beispiel 1 verwendeten.
Wegen der veränderlichen Signalfluktuation und der resultierenden unzuverlässigen diagnostischen Ergebnisse in Beispiel 1 wurde ein Experiment durchgeführt, bei dem Hintergrundamplifikation im wesentlichen beseitigt wurde, indem die SDA-Reagenzien in dem Probenkompartiment der DNA-Karte statt in einem Tupfen in zwei Tupfen getrocknet wurden.
Insbesondere wurde das Verfahren von Beispiel 1 eingehalten, außer, dass ein erster trockener Tupfen (3 μl) alle zur Amplifikation erforderlichen Reagenzien mit Ausnahme von dUTP enthielt, das in einen zweiten trockenen Tupfen (1 μl) eingebracht worden war. Trehalose wurde auf der gleichen Endkonzentration gehalten, jedoch anteilsmäßig entsprechend dem Volumen in jedem Tupfen aufgeteilt. Der Rehydratationspuffer war gemäß Beispiel 1 zusammengesetzt.
Ergebnisse und Schlussfolgerungen
Wie in 2 dargestellt, zeigen die Ergebnisse während der ersten 10 Minuten der Amplifikationsreaktion sowohl eine große positive als auch eine große negative Schwankung im Fluoreszenzsignal. Wie in Beispiel 1 war eine solche veränderliche Signalfluktuation einer Kompensation durch Anwendung eines numerischen Algorithmus nicht zugänglich. Überdies macht eine solche veränderliche Signalfluktuation die diagnostischen Ergebnisse eines derartigen Tests unzuverlässig. Dieses Ergebnis deutete auch darauf hin, dass es die Rehydratation der Fluoreszenzsonde während der Amplifikationsreaktion sein könnte, die eine solche veränderliche Signalfluktuation erzeugte.
BEISPIEL 3
Stabilisierung von Fluoreszenzsignal in einem Verfahren zur Amplifikation und homogenen Echtzeit-Fluoreszenzdetektion eines Zielanalyten (HIV)
Um die Hypothese, dass Rehydratation der Fluoreszenzsonde während der Amplifikation eines Zielanalyten die in Beispiel 1 und 2 beobachtete veränderliche Signalfluktuation verursachte, zu prüfen, wurde ein Experiment wie in obigem Beispiel 1 durchgeführt, es wurden jedoch nur die SDA-Enzyme (d.h. BsoB1 und Bst) in Gegenwart von 37,5 mM Mg(OAc)₂, 0,25 mg/ml BSA, 7,5 mM KPi mit 5% (w/v) Trehalose getrocknet, wobei jedem Probenkompartiment der DNA-Karte ein 4-μl-Aliquot des Mixes zugesetzt wurde. Die restlichen SDA-Reagenzien wurden dem Probenkompartiment in nasser Form zusammen mit dem Zielanalyten und der Probe zugesetzt.
Ergebnisse und Schlussfolgerungen
Wie in 3 dargestellt, zeigen die Ergebnisse während der ersten 10 Minuten der Amplifikation ein stabileres Fluoreszenzsignal. Folglich könnten zuverlässigere diagnostische Testergebnisse erhältlich sein, wenn Rehydratation einer Fluoreszenzsonde und Amplifikation eines Zielanalyten nicht gleichzeitig erfolgen.
BEISPIEL 4
Stabilisierung von Fluoreszenzsignal in einem Verfahren zur Amplifikation und homogenen Echtzeit-Fluoreszenzdetektion eines Zielanalyten (Chlamydia)
Um die Ergebnisse von Beispiel 3 zu bestätigen, wurde ein ähnliches Experiment für die Amplifikation und homogene Echtzeitdetektion einer Chlamydia-Nukleinsäuresequenz durchgeführt.
Materialien und Methoden
Für dieses Beispiel wurden Chlamydia-Elementarkörperchen (Serotyp E) von der University of North Carolina bezogen und vor der Verwendung als Zielmaterial 5 Minuten bei 95°C lysiert. Die Zielsequenz stammt von einer konservierten Region des kryptischen Chlamydienplasmids.
Bei der SDA-Reaktion wurden die Amplifikationsprimer S1.1 5'-dACCGCATCGAATCGATGTCTCGGGTAGAAAATCGCATGCAAGATA (SEQ ID NO: 6) und S2.1 5'-dCGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGAGCTGCCTCAG AATATACTCAG (SEQ ID NO- 7) mit einer Konzentration von 750 nM bzw. 188 nM verwendet. Die Bumper-Primer B1c 5'-dTAAACATGAAAACTCGTTCCG (SEQ ID NO: 8) und B2c 5'-dTTTTATGATGAGAACACTTAAACTCA (SEQ ID NO: 9) wurden mit einer Konzentration von jeweils 75 nM verwendet. SDA-Endbedingungen beinhalteten 40 mM KPi (pH 7,5), 6,5 mM Mg(OAc)₂, 1,4 mM dCTPαS, jeweils 0,2 mM dATP, dTTP und dGTP, 3% (v/v) DMSO, 8,2% (v/v) Glycerol, 50 ng/μl menschliche Plazenta-DNA, 0,5 U/μl Bst, 4,5 U/μl Ava1, 1% (w/v) Trehalose und 50 μg/ml BSA.
Geräte und Messausrüstung
In diesem Beispiel wurden die gleichen Geräte und die gleiche Messausrüstung verwendet wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme, dass in den Probenkompartimenten der DNA-Karten Aliquots (4 μl) eines Trocknungsmixes, der aus 20 mM KPi, 10 ng/ml menschlicher Plazenta-DNA, 2,5 U/μl Bst, 22,5 U/μl Ava1, 2 mM Mg(OAc)₂, 5% (w/v) Trehalose und 0,02 mg/ml BSA bestand, bei 37°C unter kontrollierte niedriger Feuchtigkeit zu glasartigen Filmen getrocknet wurden.
Verfahren
Ein Rehydratationsmix, der aus Chlamydia-Ziel, 36 mM KPi, 1,4 mM dCTPαS, jeweils 0,2 mM dATP, dTTP und dGTP, 3% (v/v) DMSO, 8,2% (v/v) Glycerol, 400 nM FAM-Rox-Detektorsonde 5'(FAM)dTAGCACCCGAGTGCT (ROX)AGAGTCTTCAAATATCAGAGCTTTACCTAACAA (SEQ ID NO: 10), Primern (S1.1, S2.1) und Bumpern (B1c, B2c) mit den oben angeführten Konzentrationen, 48 ng/μl humaner Plazenta-DNA, 6,1 mM Mg(OAc)₂ und 46 μg/ml BSA bestand, wurde 2 Minuten bei 97°C hitzedenaturiert und DNA-Karten zugesetzt, die auf 55°C vorgewärmt waren. Verschlussstreifen wurden aufgebracht, und die Fluoreszenz wurde bei 485 (EX)/535 (EM) nm auf dem Fluorometergerät verfolgt.
Ergebnisse und Schlussfolgerungen
Wie in 4 dargestellt, zeigte die Betrachtung des resultierenden Fluoreszenzsignals bis zu den offenkundigen Anzeichen einer amplifikationsspezifischen Fluoreszenzänderung nur geringe Fluktuationen. In jedem Fall war der Umfang der Fluoreszenzänderung proportional zum zugesetzten Ziel. Folglich könnte jegliche Fluktuation durch einen numerischen Algorithmus kompensiert werden.
BEISPIEL 5
Praktische Kit-Anwendung eines Verfahrens zur Amplifikation und homogenen Fluoreszenz-Echtzeit-Detektion einer Nukleinsäuresequenz eines Neisseria-gonorrhoeae-Zielanalyten
Die Ergebnisse der obigen Beispiele 3 und 4 zeigten die Brauchbarkeit eines Verfahrens zur Amplifikation und homogenen Fluoreszenz-Echtzeit-Detektion einer Zielnukleinsäuresequenz, bei dem die Rehydratation einer Fluoreszenzsonde getrennt von und vor der Amplifikationsreaktion erfolgte. Das Verfahren wurde jedoch nicht in einem Format durchgeführt, das für einen typischen Praktiker als optimal angesehen würde.
Somit wurde ein Kit entwickelt, bei dem ein erstes Gefäß bestimmte Reagenzien für eine solche Reaktion wie zum Beispiel die Primer für die Amplifikation sowie die Fluoreszenzsonde in einer trockenen Form enthielt, aber ein Reagenz oder eine Bedingung, das bzw. die einen Start der Amplifikationsreaktion bewirken würde, weggelassen worden war. Daher wurde die Fluoreszenzsonde durch Zugabe von Probe rehydratisiert, die Amplifikation startete jedoch erst, wenn das rehydratisierte Sondengemisch einem solchen Reagenz oder einer solchen Bedingung ausgesetzt wurde.
Insbesondere wurde ein Kit entwickelt, das zwei entsprechende Mikrotiterplatten umfasste. Die Vertiefungen der ersten Mikrotiterplatte enthielten die Primer und die Fluoreszenzsonde, und die Vertiefungen der zweiten Mikrotiterplatte enthielten die Enzyme für die Amplifikationsreaktion. Genauer gesagt wurden folgendes Kit und Verfahren zur Amplifikation und homogenen Fluoreszenz-Echtzeit-Detektion von Neisseria-gonorrhoeae-Nukleinsäure entwickelt:
Materialien und Methoden
Die erste Mikrotiterplatte enthielt in jeder Vertiefung in einem einzigen trockenen Tupfen die folgenden Bestandteile:

– 37,5 mM Kaliumphosphat, pH 7,6
– 3,5% Trehalose
– 0,19 mg/ml acetyliertes BSA
– 0,675 mM DTT
– 3,75 mM Magnesiumacetat
– 1,9 μM ersten Amplifikationsprimer GCIR-AL5.3 (5'CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGAACAGCTTGAAGTTTT3') (SEQ ID NO: 11)
– 1,9 μM zweiten Amplifikationsprimer GCIR-AR5.1 (5'ACCGCATCGAATGCATGTCTCGGGTCCTTGCAGTTAGGC3') (SEQ ID NO: 12)
– 0,19 μM ersten Bumper GCIR-BL5.1 (5'CGCAAATCATCAAAG3') (SEQ ID NO: 13)
– 0,19 μM zweiten Bumper GCIR-BR5.1 (5'TCAAGACGCTTCACG3') (SEQ ID NO: 14)
– 0,75 μM FamRox-Detektorsonde GCIR5-FD10 (5'TAGCACCCGAGTGCTTTCTCCGTCTGCTCTTTTATCTTCTC3') (SEQ ID NO : 15)
– 0,94 mM dUTP
– 3600 ng rohe dialysierte menschliche Plazenta-DNA

Die zweite Mikrotiterplatte enthielt in jeder Vertiefung, die einer ersten Vertiefung entsprach, in einem einzigen trockenen Tupfen die folgenden Bestandteile:

– 25 mM Kaliumphosphat, pH 7,6
– 2,3% Trehalose
– 0,125 mg/ml acetyliertes BSA
– 0,45 mM DTT
– 10 mM Magnesiumacetat
– 320 Einheiten BsoB1, 20 Einheiten Bst-Polymerase
– 1,75 mM dCsTP
– 0,25 mM dATP
– 0,25 mM dGTP

Es wurde dann das folgende Protokoll durchgeführt:
In jede Vertiefung der ersten Mikrotiterplatte wurden Aliquots (~150 μl) einer Probe gegeben, die ein Plasmid GC10 enthielt. GC10 enthält eine 800-Basenpaar-Region des Neisseriagonorrhoeae-Genoms, die in PUC18 inseriert ist.
Die Vertiefungen der ersten Mikrotiterplatte wurden abgedeckt, und die Platte wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur gehalten. Die erste Mikrotiterplatte wurde dann von der Abdeckung befreit und 10 Minuten bei 75°C inkubiert, während die zweite Mikrotiterplatte 10 Minuten auf 52°C vorgewärmt wurde.
Nach der 10-minütigen Inkubation wurden 100-μl-Aliquots aus jeder Vertiefung der ersten Mikrotiterplatte in eine entsprechende Vertiefung in der zweiten Mikrotiterplatte überführt (pipettiert). Die zweite Mikrotiterplatte wurde dann mit einer klebenden Abdeckung versiegelt und in ein Fluoreszenzlesegerät eingesetzt, wie es in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung mit noch zu erteilender Serien-Nr., eingereicht am 15. September 1997, (Becton Dickinson Docket Nr. P-4067) beschrieben wird, deren Offenbarung eigens hierin durch Verweisung einbezogen wird. (Andere Standard-Mikrotiterplatten-Fluoreszenzlesegeräte könnten ebenfalls verwendet werden.)
Das Fluoreszenzsignal von den Vertiefungen der zweiten Mikrotiterplatte wurde 60 Minuten beobachtet. Die versiegelte zweite Mikrotiterplatte wurde dann in einer geschlossenen Tasche verworfen, um eine potentielle Amplikon-Kontamination der Laborumgebung weiterhin sicher auszuschließen.
Ergebnisse und Schlussfolgerungen
Das Fluoreszenzsignal von den Vertiefungen zeigte einen stetigen Anstieg über die Zeit, und das Signal wies keine unkorrigierbare veränderliche Signalfluktuation auf, wie sie in Beispiel 1 und 2 zu beobachten war.
BEISPIEL 6
Praktische Kit-Anwendung eines Verfahrens zur Amplifikation und homogenen Fluoreszenz-Echtzeit-Detektion einer Nukleinsäuresequenz eines Chlamydia-trachomatis-Zielanalyten
Wie in Beispiel 5 wurde ein Kit entwickelt, das zwei entsprechende Mikrotiterplatten umfasste. Die Vertiefungen der ersten Mikrotiterplatte enthielten die Primer und die Fluoreszenzsonde, und die Vertiefungen der zweiten Mikrotiterplatte enthielten die Enzyme für die Amplifikationsreaktion. Genauer gesagt wurden folgendes Kit und Verfahren zur Amplifikation und homogenen Fluoreszenz-Echtzeit-Detektion von Nukleinsäure des kryptischen Chlamydiatrachomatis-Plasmids entwickelt:
Materialien und Methoden
Die erste Mikrotiterplatte enthielt in jeder Vertiefung in einem einzigen trocknen Tupfen die folgenden Bestandteile:

– 37,5 mM Kaliumphosphat, pH 7,6
– 3,5% Trehalose
– 0,19 mg/ml acetyliertes BSA
– 0,675 mM DTT
– 3,75 mM Magnesiumacetat
– 1,9 μM ersten Amplifikationsprimer CtpF8.AL1 (5'CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGAC AAAATCAACACCTG3') (SEQ ID NO: 16)
– 1,9 μM zweiten Amplifikationsprimer CtpF8.AR1 (5'ACCGCATCGAATGCATGTCTCGGGGAGACTGTTAAAGATA3') (SEQ ID NO: 17)
– 0,19 μM ersten Bumper CtpF8.BL (5'CAGCAAATAATCCTTGG3') (SEQ ID NO: 18)
– 0,19 μM zweiten Bumper CtpF8.BR (5'CATTGGTTGATGAATTATT3') (SEQ ID NO: 19)
– 0,75 μM FamRox-Detektorsonde CtpF8.FD1 (5'TAGCACCCGAGTGCTCGCAGCCAAAATGACAGCTTCTGATGGAA3') (SEQ ID NO: 20)
– 0,94 mM dUTP
– 3600 ng rohe dialysierte menschliche Plazenta-DNA

Es wurde dann das folgende Protokoll durchgeführt:
In jede Vertiefung der ersten Mikrotiterplatte wurden Aliquots (~150 μl) einer Probe gegeben, die ein Plasmid pCT16 enthielt. pCT16 enthält die Regionen B und F des kryptischen Plasmids von Chlamydia trachomatis (aus Serotyp J), die in PUC18 inseriert sind.
Die Vertiefungen der ersten Mikrotiterplatte wurden abgedeckt, und die Platte wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur gehalten. Die erste Mikrotiterplatte wurde dann von der Abdeckung befreit und 10 Minuten bei 75°C inkubiert, während die zweite Mikrotiterplatte 10 Minuten auf 52°C vorgewärmt wurde.
Nach der 10-minütigen Inkubation wurden 100-μl-Aliquots aus jeder Vertiefung der ersten Mikrotiterplatte in eine entsprechende Vertiefung in der zweiten Mikrotiterplatte überführt (pipettiert). Die zweite Mikrotiterplatte wurde dann mit einer klebenden Abdeckung versiegelt und in ein Fluoreszenzlesegerät eingesetzt, wie es in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung mit noch zu erteilender Serien-Nr., eingereicht am 15. September 1997, (Becton Dickinson Docket Nr. P-4067) beschrieben wird, deren Offenbarung eigens hierin durch Verweisung einbezogen wird. (Andere Standard-Mikrotiterplatten-Fluoreszenzlesegeräte könnten ebenfalls verwendet werden.)
Das Fluoreszenzsignal von den Vertiefungen der zweiten Mikrotiterplatte wurde 60 Minuten beobachtet. Die versiegelte zweite Mikrotiterplatte wurde dann in einer geschlossenen Tasche verworfen, um eine potentielle Amplikon-Kontamination der Laborumgebung weiterhin sicher auszuschließen.
Ergebnisse und Schlussfolgerungen
Wie in Beispiel 5 zeigten die Fluoreszenzsignale von den Vertiefungen einen stetigen Anstieg über die Zeit, und das Signal wies keine unkorrigierbare veränderliche Signalfluktuation auf, wie sie in Beispiel 1 und 2 zu beobachten war.
Obwohl die Erfindung mit einer gewissen Spezifität beschrieben wurde, können für den Durchschnittsfachmann ersichtliche Modifikationen vorgenommen werden, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. In den folgenden Ansprüchen sind verschiedene Merkmale der Erfindung dargelegt. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Durchführung eines Fluoreszenz-Nachweistests zur Bestimmung der Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge einer Zielnukleinsäure in einer Probe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Herstellung eines Gemisches durch Exposition der Probe mit einer ersten Reagenzformulierung, die Nukleinsäureprimer und ein trockenes, hydratisierbares Nukleinsäuremolekül enthält, das imstande ist, an die Zielnukleinsäure zu hybridisieren, wobei das zur Hybridisierung an die Zielnukleinsäure fähige Molekül eine detektierbare Fluoreszenzsignalveränderung erzeugen kann, wenn sich die Menge an Zielnukleinsäure ändert, und vor Einleitung von Schritt b) durch Exposition mit der Probe hydratisiert wird; und (b) Exposition des Gemisches mit einer zweiten Reagenzformulierung, die, wenn die Zielnukleinsäure in der Probe vorhanden ist, dann die Menge der Zielnukleinsäure verändern wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das zur Hybridisierung an die Zielnukleinsäure fähige Nukleinsäuremolekül einen Fluoreszenzenergie-Donorteil und einen Fluoreszenzenergie-Akzeptorteil in ausreichend enger Nähe umfasst, so dass eine Abnahme dieser Nähe zu der detektierbaren Veränderung des Fluoreszenzsignals führt.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das zur Hybridisierung an die Zielnukleinsäure fähige Molekül und die Primer in einer trockenen Form vorliegen.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die zweite Reagenzformulierung ein für eine Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion erforderliches Enzym umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem das Enzym eine Polymerase ist.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Polymerase in einer trockenen Form vorliegt.