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BETREFF DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft Laboreinmalartikel und insbesondere Reaktionsgefäße zur Durchführung der Kettenpolymerasereaktion
für analytische
und diagnostische Zwecke.
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STAND DER TECHNIK
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Die
Kettenpolymerasereaktion (PCR – engl.:
polymerase chain reaction) erlaubt eine exponentielle Vervielfältigung
(Amplifikation) von Nukleinsäuremolekülen in vitro.
Die PCR wird eingesetzt in der Diagnose von Erb- und Infektionskrankheiten,
zur Erhebung genetischer Fingerabdrücke, zum Klonieren von Genen,
der Bestimmung der Vaterschaft und für vieles anderes mehr. In der
Lebensmittelchemie wird sie verwandt zur Bestimmung der Art und
Menge der Anteile in einer Zubereitung, zum Beispiel von Haselnuss,
Erdnuss, Soja, Fisch, Weizen, Getreide, Tierspezies und eventuell
gentechnisch veränderte
Organismen (GVOs), der Herkunft der Bestandteile und natürlich auch
für den
Nachweis pathogener Keime wie Salmonellen, Listerien und so weiter.
Trotz der vielen Einsatzgebiete erfolgt die Kettenpolymerasereaktion
im Prinzip stets gleich. Die Analysen unterscheiden sich im Wesentlichen
nur in der Probenaufbereitung und der Art der DNA oder RNA, die es
zu vervielfältigen
gilt, beziehungsweise der Startoligonukleotide, auch Primer genannt,
deren Sequenzen komplementär
zum Anfang beziehungsweise Ende eines zu amplifizierenden DNA-Sequenzabschnitts
sein müssen.
Die Primer werden durch Annealing (DNA-Anlagerung) an einen komplementären Nukleotidstrang
in der Probe gebunden, sofern vorhanden, und die synthetisch hergestellten
neuen Doppelstränge
enthalten dann weitere Startstellen für die Synthese weiterer DNA-Stränge. Die
Sensitivität
und Spezifität
der Reaktion ergibt sich aus der Länge und der Sequenz der Primer
und aus der überragenden
Genauigkeit der enzymatischen DNA-Synthese durch die DNA-Polymerase
beziehungsweise die reversen Transkriptase. Die optimale Länge der
Primer beträgt
in der Regel zwischen 15 und 40 Nukleotiden bei einer Schmelztemperatur
zwischen 55 und 70 Grad Celsius. Das Reaktionsgemisch für die Kettenpolymerasereaktion
enthält
neben den speziellen Primern stets die gleichen Deoxynukleosidtriphosphate
(dNTPs), eine wässrige
Pufferlösung,
DNA-Polymerase oder reverse Transkriptase und als Zusatz DNA oder
RNA der zu analysierenden Probe. Nach der Kettenpolymerasereaktion
wird das so synthetisierte DNA-Produkt in der Regel auf seine Länge analysiert
und gegebenenfalls durch enzymatische Restriktion verifiziert. In
Einzelfällen
kann auch eine Sequenzierung der DNA erfolgen.
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Wenngleich
es PCR-Vollautomaten für
den analytischen und diagnostischen Bereich gibt, so sind diese
nur bei ständig
hoher Probenzahl wirtschaftlich zu betreiben. Insbesondere in der
Lebensmittelanalytik werden aber Analysen zur vereinzelten Kontrolle
oder auch stoßweise
nachgefragt, wenn zum Beispiel Verdachtsmomente vorliegen. Einzel-
oder Gruppenanalysen sind schwer zu automatisieren, denn für jede Fragestellung sind
andere Primer und unterschiedliche Probenaufbereitungsverfahren
erforderlich.
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DE 198 40 531 (
WO 00/12756 ;
CA 2 342 581 ) offenbart Reaktionsbehältnisse,
deren ansonsten chemisch oder biochemisch nicht-modifizierten Innenwandung
mit vorgegebenen Mengen an Primern und gegebenenfalls bekannten
Mengen einer Referenznukleinsäure
beschichtet sind. In der Praxis erfolgt die Beschichtung der Innenwandung
durch „schonendes
Lyophilisieren" einer
wässrigen
Nukleinsäurelösung in
dem Kunststoffreaktionsgefäß, so das
die Nukleinsäuren
an der Innenwandung adsorbiert werden. Da eine derartige Adsorption
nicht unbedingt reversibel ist, wird weiterhin empfohlen, den spezifischen
Nukleinsäuren
größere Menge
einer unspezifischen Trägernukleinsäure beizumischen.
Day INM et al. (1995) offenbaren in BioTechniques 18(6): 981-984
in Zusammenhang mit einer genetischen Analyse die Lagerung einer
getrockneten Matrizen-DNA
(Referenz-DNA) und von PCR-Startoligonukleotiden in Mikrotiterplatten.
Bei der genetischen Analyse ist die Menge an DNA in der Probe bekannt
beziehungsweise es kommt auf die Menge an Matrizen-DNA in dem Reaktionsgefäß nicht
an. Das dort beschriebene Verfahren eignet sich nicht für quantitative
Analysen oder die Bestimmung unbekannter Mengen an DNA. In vielen
Bereichen der Lebensmittelanalytik und der Diagnostik ist aber die
Konzentration einer bestimmten Nukleinsäure (DNA oder RNA) in der Probe
genau zu ermitteln und Voraussetzung für derartige quantitative Untersuchungen
ist die Verfügbarkeit
eine genauen Standardverdünnungsreihe.
Bei sehr niedrigen Konzentrationen von 1 bis 100000 Molekülen pro
Reaktionsansatz werden aber selbst Nukleinsäuren „instabil" beziehungsweise die Moleküle sind
einer Reaktion im Reaktionsgefäß nicht
zugänglich.
Man behilft sich dann so, dass man der niedrigkonzentrierten spezifischen
Nukleinsäure
eine größere Menge
unspezifischer DNA zusetzt, die mit der zu detektierenden Nukleinsäure so gut wie
keine Sequenzhomologie besitzt. Dies ist aber aus vielen Gründen problematisch
und kann zu schweren systematischen Fehlern führen, so dass allgemein empfohlen
wird, alle erforderlichen Verdünnungsschritte ausgehend
von einer Stammlösung
definierter Konzentration täglich
neu vorzunehmen. Dies ist sehr arbeitsintensiv und unterliegt der
schwankenden Pipettiergenauigkeit, was die Reproduzierbarkeit und
Zuverlässigkeit
vermindert.
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Die
internationale Patentanmeldung
WO
2004/106549 offenbart ein Verfahren zur Haltbarmachung von
Nukleinsäuren,
in dem wässrigen
Lösungen
der Nukleinsäure
in Gegenwart von Disacchariden und Kollagen, vorzugsweise Trehalose
und Kollagen, Iyophilisiert werden. Die Trehalose soll im Wesentlichen
die Nukleinsäuren
haltbarer machen und das Kollagen die auf der Gefäßoberfläche vorliegende
Nukleinsäure
an die Wand kleben und deckend schützen.
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Die
internationale Patentanmeldung
WO
2005/103277 lehrt ein trockenes Amplifikationsgemisch für die Kettenpolymerasereaktion
und die technische PCR-Analyse, das DNA-Polymerase, Desoxyribonukleoside,
Pufferkomponenten, wasserlöslichen
Farbstoff für
die DNA-Elektrophorese enthält
sowie Stabilisator. D-Glucose, Disaccharide wie Innulin, Sucrose,
Trehalose und Maltose, sowie Polysaccharide wie D-Mannitol, Dextrane,
Phycoll, Polyvinylpyrrolidon, etc. Das PCR-Verfahren umfasst das
Lösen des
trockenen Amplifikationsgemisch in einem Puffer mit Magnesiumionen
und dann der Zusatz von Primer und zu analysierender DNA-Probe.
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EP-A2-1 374 827 offenbart
Verfahren zur Stabilisierung von trockenen und halbtrockenen Gemischen mit
PCR-Enzymen und Reagenzien sowie Kits mit diesen Trockenmischungen.
Auch bei Kühlraumtemperaturen
sind diese Gemischen nur über
vergleichsweise kurze Zeiträume
haltbar.
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JA
Tomlinson et al beschreiben in Appl. Environ. Microbiol. (2005)
71 (11) 6702-10 einen Reagenziensatz, um im Feldversuch einen Krankheitserreger
nachzuweisen. Sie beschreiben unter anderem Reaktionsgefäße, die
bei Raumtemperatur lagerfähige
lyophilisierte Echtzeit-PCR-Reagenzien enthalten; die Langzeitstabilisierung
von PCR-Reagenzmischungen
durch Trehalose und einen Kit mit internen PCR-Kontrollen für Pflanzen-DNA,
die den Erfolg der DNA-Extraktion belegen sollen. Die Gefäße enthalten
genug Reagenzien für 10
PCR-Versuche, wobei vor den Versuchen Wasser zuzusetzen ist.
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PR
Klatser et al offenbaren in J. Clin. Microbiol. (1998) 36 (6) 1799, 2 die
Langzeitstabilisierung von PCR-Reagenzmischungen durch Trehalose.
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S
Ramachandran et al beschreiben in IEEE (2006), Proceedings of the
1st Distributed Diagnosis and Home Healthcare (D2H2) Conference,
Arlington, Virginia, USA, April 2-4, 2006 in dem Artikel Dry-reagent
storage for disposable lab-on-a-card diagnosis of enteric pathogens
Untersuchungen zur Stabilisierung von PCR-Reagenzien mittels Trehalose.
Die PCR-Reagenzien befinden sich in einer mikrofluidischen Karte,
wobei die Trehalose die Bildung von Primer-Dimeren bei der Lagerung
verhindert (a.a.O. Seite 18, rechte Spalte).
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Nachteilig
an den vorgenannten Verfahren und dem Stand der Technik ist, dass
trotz allem die in den Gefäßen wirksamen
DNA-Mengen in der Kettenpolymerasereaktion schwanken, selbst wenn
die Gefäße scheinbar
gleiche Mengen DNA enthalten. Dies liegt vermutlich daran, dass
die PCR-Reagenzien, Desoxy(ribo)nukleotidtriphosphate, Primer-Oligonukleotide und
Matrizen-RNAs oder -DNAs entweder einzeln oder im Gemisch zusammen
mit den Spezialsubstanzen oder Stabilisatoren (unspezifische DNA,
Gelatine, Kollagen, Glucose, Innulin, Maltose, Mannitol, Dextrane,
Trehalose, Sucrose und. andere Disaccharide, Thesit®, Polyethlyenglycol,.
Polyvinylpyrrolidon, Triton-X 100®, Tween-20®,
Rinderserumalbumin (BSA), Phycoll, Puffersalzen wie Tris-HCl, KCl,
DTT, etc.) in den Gefäßen durch
Lyophilisierung getrocknet werden. Derart getrocknete PCR-Gemische
sind stark hygroskopisch und verlieren an Aktivität und Wirksamkeit
bei längerer
Lagerung aufgrund der Feuchtigkeitsaufnahme. Dieser Effekt wird
zudem verstärkt
durch den Zusatz von Stabilisatoren wie Kollagen oder Gelatine.
Erfolgt die Lyophilisierung aber ohne Beisein leimbildender Substanzen
wie Kollagen oder Gelatine, bilden sich Flocken der PCR-Reagenzien, die in
den Gefäßen wandern
können,
so dass sie keine quantitativen Bestimmung zulassen.
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Es
besteht deshalb Bedarf an einem PCR-Reagenzienkit, der besonders
für einen
sporadischen Probenanfall geeignet ist, keine besonderen Geräte erfordert
und in allen Labors sofort und ohne besondere Vorbereitungen standardmäßig von
einer geschulten Person wie einer chemisch-technischen Assistentin
für quantitative
und analytische Untersuchungen verwendet werden kann. Es ist weiter
Aufgabe der Erfindung, die Probleme des Stands der Technik zu beheben.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Diese
Aufgabe wird gelöst
durch eine Verpackungseinheit mit vorbereiteten Reaktionsgefäßen nach Anspruch
1 und das erfindungsgemäße Verfahren
nach Anspruch 13. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
sind den Unteransprüchen
zu entnehmen.
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Die
erfindungsgemäße Verpackungseinheit
für die
Durchführung
einer Kettenpolymerasereaktion für analytische,
diagnostische und technische Zwecke, umfasst einen Satz bezeichneter
trockener Reaktionsgefäße in Lagerform
mit einer Reihe bekannter Mengen an Primer-Oligonukleotiden, die
nach Zugabe von geeigneten Reagenzien, Enzym und DNA- oder RNA-Probe
in einer Kettenpolymerasereaktion eine Amplifikation der Zielsequenz
starten; einen Satz bezeichneter trockener Reaktionsgefäße in Lagerform
mit einer Reihe bekannter Mengen an Primer-Oligonukleotiden und
Referenznukleinsäure,
die nach Zugabe fester Mengen an Flüssigkeit eine Konzentrationsreihe
der Referenznukleinsäure
ergeben, wobei die Referenznukleinsäure die Zielsequenz enthält. Die
beiden Sätze
an bezeichneten trockenen Reaktionsgefäßen in Lagerform sind erfindungsgemäß so hergestellt,
dass in den Reaktionsgefäßen jeweils
wässrige
Lösungen
bekannter Mengen an Primer-Oligonukleotiden mit und ohne Referenznukleinsäure nur
in Gegenwart von 1 bis 5 mMol/L Trehalose unter Umgebungsdruck bei
einer Temperatur von 5 bis höchstens
30 Grad Celsius über
Raumtemperatur eingetrocknet werden, so dass das resultierende Pellet
vollkommen trocken, aber nicht hygroskopisch ist. In einer alternativen
Ausführungsform
der Erfindung sind die beiden Sätze
an bezeichneten trockenen Reaktionsgefäßen in Lagerform so hergestellt
sind, dass in den Reaktionsgefäßen jeweils
wässrige
Lösungen
bekannter Mengen an Primer-Oligonukleotiden mit und ohne Referenznukleinsäure nur
in Gegenwart von 1 bis 5 mMol/L Trehalose bei Raumtemperatur unter
vermindertem Umgebungsdruck von 0.1 bis 0.3 Bar schonend eingetrocknet
sind und zwar so, dass das resultierende Pellet vollkommen trocken,
aber nicht hygroskopisch ist, und die Trehalose nicht kristallisieren
kann.
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Der
Stand der Technik lehrt regelmäßig ein
Lyophilisieren der Oligonukleotidprimer oder der Referenznukleinsäure, um
deren Stabilität
zu gewährleisten.
Das Lyophilisieren von Nukleinsäuren
oder Oligonukleotiden führt
aber regelmäßig zu Flusen,
so dass keine lagerfähigen
Reaktionsgefäße erhalten
werden. Auch bewirkt das „aktive
Trocknen" oder Lyophilisieren
von Puffern oder Amplifikationsgemischen regelmäßig Oberflächen reaktionen. Es bilden sich
mit den hydroxy- und anderen sauerstoffhaltigen Gruppen auf der
Wand der Reaktionsgefäße enge
Wasserstoffbrücken,
wobei selbst Nukleinsäuren
partiell unlöslich
werden. Es ist dann notwendig, die Nukleinsäuren und Oligonukleotide in
einem eigenen Schritt wieder von den Oberflächen abzulösen. Daher werden den Trockenlösungen im
Stand der Technik auch hydroxylhaltige, wasserstoffbrückenbildende
Moleküle
wie unspezifische DNA, Gelatine, Kollagen, Glucose, Innulin, Maltose,
Mannitol, Dextrane, Trehalose, Sucrose und andere Disaccharide,
Thesit®,
Polyethlyenglycol, Polyvinylpyrrolidon, Triton-X 100®, Tween-20®,
Rinderserumalbumin (BSA), Phycoll, und so weiter zugesetzt, um die
Nukleinsäuren
und die Oligonukleotide in den vorgesehenen sehr geringen Konzentrationen
zu „stabilisieren" und das Pellet auf
der Gefäßwandung
zu halten. Da derartige Pufferlösungen
langsam und ungenügend
trocken, werden diese Lösungen
regelmäßig lyophilisiert,
was zu hygroskopischen Pellets führt,
in denen dann wiederum die Nukleinsäuren und Primer-Oligonukleotide
nicht stabil sind. Die Erfinder haben entdeckt, dass ein Trocknen
bei leicht erhöhter Temperatur
in Gegenwart nur einer geringer Konzentration Trehalose zu sehr
viel besseren Ergebnissen führt. Zu
viel Trehalose oder anderer Puffersalze bewirken beim Trocknen aber
eine Flockenbildung. Bei einer Trocknung unter erhöhter Temperatur über 1 bis
4 Stunden bildet sich erfindungsgemäß aber ein glasharte, auf der Oberfläche der
Gefäßwandung
fest anhaftende Trehaloseschicht, in der die Primer-Oligonukleotide
und/oder die Referenznukleinsäure
eingebunden sind. Nur bei einer derartigen Trocknung verdrängt die
Trehalose die Wassermoleküle
aus den Wasserstoffbrücken
derart, dass die Nukleinsäuren
und Oligonukleotide in den nötigen,
sehr geringen Mengen stabil sind.
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Die
Erfindung liegt weiterhin in der Kombination von gleichartig hergestellten
Reaktionsgefäßen mit Primer-Oligonukleotiden
beziehungsweise Referenznukleinsäure.
Es ist überraschend,
dass sogar eine so geringe Kopienzahl der Zielsequenz von 100 oder
1000 stabil ist, wird die wässrige
Lösung
der Referenznukleinsäure
nur in Gegenwart von Trehalose eingetrocknet. Da die Reaktionsgefäße mit den
Primern und der Referenznukleinsäure
gleich hergestellt sind, ist eine absolute Vergleichbarkeit zwischen
Probe und Referenz gegeben.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
liegt in einer Verpackungseinheit mit den genannten bezeichneten Reaktionsgefäßen, wobei
das Volumen der wässrigen
Lösungen
in den Reaktionsgefäßen vor
dem Eintrocknen 1 bis 25 μl.
Die Konzentration der Primer liegt zwischen 0,1 und 100 μMol/L bei
1 bis 5 mMol/L Trehalose. In den Reaktionsgefäßen mit der Referenznukleinsäure ist
die Zielsequenz bevorzugt in einer Menge von 10 bis 100 000 Kopien
enthalten und zwar als genomische DNA oder Plasmid. Es kann auch
ein Amplifikat verwendet werden. Es hat sich aber herausgestellt,
dass Amplifikate unter diesen Bedingungen sehr viel weniger stabil
sind. Vermutlich wird bei Amplifikaten regelmäßig eine Exonukleaseaktivität mit eingeführt. Die
Kopienzahl pro Reaktionsgefäß beträgt bevorzugt
100 bis 5 000.
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Eine
weitere Ausführungsform
betrifft Reaktionsgefäße für eine Hot-Start-PCR.
Hierzu werden die eingetrockneten Primer oder die Referenznukleinsäure mit
einem Kohlenwasserstoffwachs überdeckt,
das bei 57 Grad Celsius schmilzt und in der wässrigen Lösung nach oben floatet. Hierdurch
wird verhindert, dass Primer und Nukleinsäuren bereits bei niedrigeren
Temperaturen miteinander hybridisieren. Der gleiche Effekt kann zwar
auch durch Hot-Start-Polymerasen erreicht werden, die erst bei Temperaturen über 50 Grad
Celsius aktiv werden. Hot-Start-Polymerasen sind aber wesentlich
teurer als herkömmliche
DNA-Polymerasen und Reverse Transkriptasen. Die Schicht mit dem
hochschmelzenden Kohlenwasserstoffwachs schützt zudem das darunter liegende
Pellet mit den Primern und/oder der Referenznukleinsäure vor
Nebelfeuchtigkeit.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung sind in dem Kit Reaktionsgefäße vorhanden, in denen räumlich getrennt
Primer-Oligonukleotide und Referenznukleinsäure in Gegenwart von Trehalose
so auf die Gefäßwand aufgetrocknet
sind, dass nach Zugabe der wässrigen
Lösung
mit den weiteren Reagenzien für
die Kettenpolymerasereaktionen Primer-Oligonukleotide und Referenznukleinsäure in der wässrigen
Lösung
gelöst
sind.
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Aus
praktischen Gründen
sind die Reaktionsgefäße bevorzugt
als Vertiefungen einer Mikrotiterplatte ausgebildet. Mikrotiterplatten
werden im Handel üblicherweise
als Platten mit 24, 48, 96, 192 und 384 Vertiefungen angeboten.
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Die
Menge der beiden Primer in den Reaktionsgefäßen ist bevorzugt auf 7,5 pMol
(2,5pmol bis 15pmol) normiert und die Menge an Referenznukleinsäure auf
100 oder 1000 Kopien der Zielsequenz. In der ersten Phase der Amplifikation
ist nämlich
die Matrizenmenge (Zielsequenz) begrenzt und die Wahrscheinlichkeit,
dass sich Matrize, Primer und Polymerase treffen, suboptimal, während in
der dritten Phase der Amplifikation die Menge der Produkte (DNA,
Pyrophosphat, Monophosphatnukleotide) derart ansteigt, dass es zur Hemmung
durch diese kommt, häufiger
Produktfragmente miteinander hybridisieren, die Substrate langsam verbraucht
werden und letztlich die Polymerasen und Nukleotide durch die Hitze
langsam zerstört
werden. Ein exponentieller und somit bei Verwendung von Fluoreszenzen
für die
Realtime-PCR quantifizierbarer Anstieg tritt nur in der Phase dazwischen
auf. Exponentiell bleibt eine Kettenpolymerasereaktion bei 12 bis
400 Ausgangskopien für
ca. 30 Zyklen, bei 200 bis 3200 für 25 Zyklen und bei anfänglich 3000
bis 50.000 für
höchstens 20
Zyklen. Um immer am Anfang der exponentiellen Phase messen zu können, wird
häufig
der CT-Wert (Threshold Cycle = "Schwellenwert-Zyklus") bzw. der Cp-Wert
(Crossing Point) verwendet, der den Zyklus beschreibt, an dem die
Fluoreszenz erstmalig signifikant über die Hintergrund-Fluoreszenz
ansteigt.
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Daneben
kann die Verpackungseinheit enthalten ein oder mehrerer folgender
Puffer- und Reaktionslösungen,
zum Beispiel DNA- oder RNA-Extraktionslösung, Proteinase-K-Lösung, Gelladepuffer,
Nukleotid- und Amplifikationspuffer (MasterMix), DNA-Polymerase
oder reverse Transkriptase. Da aber kommerziell höchst ausgereifte
und für
alle möglichen
Zwecke optimierte Amplifikationsgemische in fertiger Form zur Verfügung stehen,
wie zum Beispiel der AmpliTaqGold® MasterMix
von Roche Molecular Systems, Inc, werden die Anwender den bisher
verwendeten Gemischen weiter vertrauen wollen, so dass die letztgenannte
Option – einschließlich MasterMix – hier nur
aus der Gründen
der Vollständigkeit
erwähnt
ist.
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Erfindungsgemäß befinden
sich nur Primer-Oligonukleotide und Referenznukleinsäure auf
der Innenwand des Reaktionsraums beziehungsweise des Reaktionsgefäßes und
zwar eingebettet in einem Film aus Trehalose. Trehalose (auch Mykose
genannt) ist ein nicht-reduzierender Zweifachzucker, der aus zwei α-1,1-glykosidisch
verknüpften
D-Glucose-Molekülen besteht,
die mit Proteinen und Nukleotiden Wasserstoffbrücken eingehen können; siehe
Colaco C et al (1992) in Bio/Technology 10, 1007-1011. Trehalose
ist daher ein starker PCR-Enhancer, der in Lösung die Schmelztemperatur
absenkt und andererseits die Taq-DNA-Polymerase thermisch stabilisiert
(Spiess AN et al. (2004) Clinical Chemistry 50(7), 1256-1259). Es
wird ferner gelehrt, in einer Hot-Start-PCR einen Teil der Reaktionskomponenten
in Gegenwart von Trehalose einzutrocknen und mit einem Wachs, das
bei ca. 57°C
schmilzt, zu ummanteln (siehe Kaijalainen et al. (1993), Nucleic Acids
Res., 21(12):2959-2960). Die in dem Wachstropfen eingebetteten Reaktionskomponenten
werden dann zu den anderen Reaktionskomponenten des PCR-Ansatzes erst nach
Erreichen höherer
Temperaturen und Schmelzen des Wachsüberzuges freigesetzt, wodurch
ein Mispriming und ein zu früher
Start der DNA-Polymerasereaktion bei niedrigen Temperaturen vermieden
werden kann. Dieses Verfahren eignet sich aber nur in Bereichen
mit sehr hohen Probenzahlen, da das Einbetten eines Teils der Reaktionskomponenten
in einem Wachstropfen auf einem Polyethylenfaden kompliziert ist.
Eine Langzeit-Haltbarkeit von Primern und Referenznukleinsäure auf
dem Polyethylenfaden wird nicht gelehrt. Im Gegensatz zur Wachstropfen-Technologie werden erfindungsgemäß die Primer
und/oder die Referenznukleinsäure
in Gegenwart von Trehalose auf die Wand des Reaktionsgefäßes getrocknet,
bevorzugt im Boden des Gefäßes. Die
so zweckspezifisch vorbereiteten bezeichneten Probengefäße können dann
durch Zugabe einer definierten Menge Wasser und Amplifikationsgemisch
(DNA-Polymerase,
dNTPs, Mg2+, Tris-HCl-Puffer, pH 8,0) aktiviert
werden. Weitere Schritte sind nicht erforderlich, da die bezeichneten
Probengefäße bereits
die Primer und eine vorgegebene Kopienzahl der Zielsequenz in bekannten
Mengen enthalten, geschützt
von einer glasartigen Schicht Trehalose, die unter den Bedingungen
einer Kettenpolymerasereaktion aber völlig in Lösung gehen. Dabei wirkt die
Trehalose vermutlich als Lösungshilfe
für die
wenigen Kopien der Referenznukleinsäure.
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Es
ist zwar bekannt, in einem Reaktionsgefäß die für eine Enzymreaktion notwendigen
Reagenzien vorzugeben und gegebenenfalls die Reagenzien auf die
Oberfläche
des Probengefäßes aufzutrocknen.
Problematisch ist aber, dass beim Lyophilisieren oder Trocknen der
Reagenzien diese unterschiedlich auskristallisieren und kleinteilige,
nicht auf der Oberfläche
anhaftende Flocken bilden, die sich überall im Gefäß verteilen können. Möchte man
alle Reagenzien als Pellet am Boden eines Reaktionsgefäßes binden,
so sind größere Salzmengen
erforderlich. Diese können
zum einen nachfolgende enzymatische Reaktionen beeinträchtigen und
zum anderen Wasser ziehen wodurch die Stabilität der einzelnen Reagenzien
nicht mehr gewährleistet
ist. Erfindungsgemäß wird dieses
Problem so gelöst,
dass die überflüssige Reagenzien
weggelassen werden und die Oligonukleotide und Referenznukleinsäuren nur
in Gegenwart physiologischer Mengen Trehalose auf einem inerten
Substrat wie auf einer Polyethylenwand aufgetrocknet werden. Es
sind nicht alle Zucker geeignet, sondern nur solche, die beim Trocknen
eine glasartige Schicht ergeben. Gleichzeitig muss der Zucker in
Gegenwart von Wasser rasch in Lösung
gehen.
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Diese
Anforderungen werden ideal gelöst
durch Trehalose. Trehalose ist schwach hygroskopisch und besitzt
einen vergleichsweise hohen Gelier- und Glasübergangspunkt. Trehalose schützt in der
Natur die Zellen vor Verletzungen durch Eiskristalle bei Frost oder
Tiefkühlprozessen
und auch bei Trockenheit. In gewisser Weise ist Trehalose funktionell
gleichartig zu Saccharose, besitzt aber andere Glaspunkt- und Stabilisierungseigenschaften.
Trehalose kommt natürlich
in Pflanzen und Pilzen und auch in der Hämolymphe vieler Insekten vor.
Trehalose ist chemisch, thermisch und gegenüber Säure stabil und in Wasser rasch
löslich,
wobei bei niedrigen Temperaturen Trehalose weniger und bei höheren Temperaturen
stärker
löslich
ist als Saccharose. Im Gegensatz zu den Disacchariden ist Trehalose
aber nicht hydrolysierbar und sie kann nicht an einer Maillard-Reaktion mit den
Aminosäuren
oder Proteinen teilnehmen. Auch besitzt sie eine hohe Klebkraft
auf Kunststoffwandungen.
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Dadurch
stehen Reaktionsgefäße für die Kettenpolymerasereaktion
zur Verfügung,
welche über
Monate und Jahre bei Raumtemperatur gelagert werden können. Die
Reaktionsgefäße können bei
Bedarf sofort verwandt werden. Damit können auch kleinere und mittlere
Laboren mit diskontinuierlichem oder sporadischen Probenanfall analytische
oder quantitative PCR-Analysen sofort und ohne größeren Aufwand
manuell abarbeiten. Alle Primer und Referenznukleinsäuren liegen
sofort verwendbar und exakt in den Reaktionsgefäßen vor und es müssen nur
für die
jeweilige Analysereaktion aufbereitete Proben-DNA oder -RNA und
ein Mastermix (Amplifikationsgemisch) eingesetzt werden. Dies ist
aber immer notwendig. Erfindungsgemäß entfallen die möglichen
Fehler durch ein Falschansetzen oder Falschbestimmen der Mengen
an Primer und Referenznukleinsäure.
In einer bevorzugten Ausführungsform
werden neben den erfindungsgemäßen Probengefäßen auch
Gefäße mit einer „falschen" Nukleinsäure oder
weiteren positiven und negativen Kontrollen ausgeliefert.
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Gebrauchsfertige
Master- oder Amplifikationsgemische können von einer Vielzahl Hersteller
kommerziell erworben werden, mit unterschiedlichen natürlichen
oder gentechnisch veränderten
oder chemisch modifizierten DNA-Polymerasen oder reversen Transkriptasen.
Typisch eingesetzte DNA-Polymerasen sind die Taq-DNA-Polymerase,
die rekombinante trunkierte Form der Taq-DNA-Polymerase, der die
5'-3'-Exoaktivität (KlenTaq)
fehlt, eine chemisch modifizierte Taq-DNA-Polymerase für eine Hot-Start-PCR,
oder eine hochgenaue rekombinante thermostabile DNA-Polymerase aus
Pyrococcus abyssii, etc. Die Mastermixe können mehrfach konzentriert
sein und mit und ohne Magnesiumionen sein. Das heißt, die
Magnesiumionen können auch
aus einem eigenen Magnesiumstock (bspw. 25mM MgCl2)
zugesetzt werden. Die Mastermixe können ferner Verbindungen enthalten,
welche die Probendichte erhöhen,
so dass die Produkte aus der Kettenpolymerasereaktion direkt in
die Vertiefungen eines analytischen oder quantitativen Agarosegels
gegeben werden können.
Der Mastermix kann ferner Farbstoffe enthalten, entweder für eine Real-Time-PCR
oder für
Analyse auf dem Agarosegel.
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BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
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Weitere
Aufgaben, Vorteile und Lösungen
der Erfindungen sind den nachfolgenden Beispielen und den Abbildungen
zu entnehmen. Es zeigt:
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1 eine
Gelelektrophorese der Amplifikationsprodukte in bezeichneten Reaktionsgefäßen mit
unterschiedlichen Proben und Referenznukleinsäuren gemäß der Erfindung
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2 eine
Gelelektrophorese der Amplifikationsprodukte in bezeichneten Reaktionsgefäßen mit
herkömmlich
und erfindungsgemäß hergestellten
Trockenproben der Referenznukleinsäure in einem Alterungsversuch
von 6 Monaten bei 37°C
(Vergleich des Alterungsverhaltens);
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3 eine
Gelelektrophese der Amplifikationsprodukte in erfindungsgemäß hergestellten
Reaktionsgefäßen bei
unterschiedlichen Mengen an zugesetzter Haselnuss-DNA und Alterung über 6 Monate
bei 37°C (Sensitivitätsversuch).
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EINGEHENDE BESCHREIBUNG VON AUSFÜHRUNGSFORMEN
DER ERFINDUNG.
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BEISPIELE
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BEISPIEL 1 Test zum Nachweis von Haselnuss
(Corylus Avellana) in Lebensmitteln
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Die
bezeichneten Reaktionsgefäße aus Polypropylen,
in deren Vertiefungen (200 μl)
bekannte Mengen spezifische Primer für die Haselnussbestimmung und
als Referenznukleinsäure
Haselnuss-Gesamt-DNA aufgetrocknet waren. Pro Reaktionsgefäß war dies
eine Mischung aus 0,75 μl
eines ersten Primers CaMAV-F3 mit einer Konzentration von 10μMol/L, 0,75 μl eines zweiten
Primers Ca-R05 mit einer Konzentration von 10μMol/L, 2 μl einer 5 mMol/L Trehaloselösung und
0,5μl Wasser.
Bei der Referenznukleinsäure
waren dies 200 pg genomische Haselnuss-DNA, entsprechend 100 Kopien
der Zielsequenz (Amplikonsequenz), sowie das 5- und 10-fache davon,
jeweils in 0,5 μl
gelöst
und anstelle des Wassers der Lösung
zugesetzt. Die Trocknungsdauer betrug 3 Stunden bei 40°C unter Umgebungsdruck.
Die Trocknung erfolgte in einem trockenen Wärmeofen. Die Reaktionsgefäße wurden
bis zur Verwendung verschlossen. Es wurden keine weiteren PCR-Sonden
für eine
RealTime-PCR aufgetrocknet, selbst wenn dies an dieser Stelle möglich wäre. Am Ende enthielten
die vorbereiteten Vertiefungen der Mikrotiterplatte die für den Nachweis
notwendigen Primer in der optimalen Menge für die Bestimmung von Haselnuss-DNA
in der Probe bzw. für
die Negativkontrolle (Überprüfung des
Mastermixes auf Kontamination) und für die Extraktionskontrolle
(Überprüfung der
Extraktion auf Kontamination). Die rotmarkierten Reaktionsvertiefungen
enthielten zusätzlich
zu den Primern noch eine Haselnuss-DNA in niedrigen Mengen. Sie
erlauben damit zum einen eine Positivkontrolle (Funktionsfähigkeit
des Mastermixes), zum anderen eine Inhibitionskontrolle (Überprüfung des
DNA-Isolats auf Inhibitoren) und zum dritten eine Quantifizierung
der DNA in der Probe.
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Die
DNA-Extraktion erfolgte nach dem CTAB-Verfahren (ISO 21571, Fondstuffs – Methods
of analysis for the detection of genetically modified organisms
and derived products – Methods
for nucleic acid extraction) mit anschließender Reinigung über eine
Silicamatrix. Hierzu wurden die Proben homogenisiert, jeweils 1
g in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen
einwogen, 10 ml CTAB-Extraktionslösung (2% Cetyltrimethylammoniumbromid, 1,4
Mol/L NaCl, 0,02 M EDTA, 0,1 Mol/L Tris-HCl, pH 8,0) und 50 μl Proteinase-K
(10 mg/ml) zugegeben, gemischt und für mindestens 90 Minuten bei
60 °C unter
Schütteln
inkubiert. Es wurde jeweils 1 ml Flüssigkeit abgenommen, diese
5 Minuten bei 17.000 × g
zentrifugiert, dann hiervon 750 μl Überstand
mit 300 μl
Chloroform/Isoamylalkohol „Ready
RedTM (MB Biomedicals, Illkirch, Frankreich)
extrahiert. Es folgte eine weitere Zentrifugation von 5 Minuten
bei 17.000 × g.
500 μl wässriger Überstand
wurden dann mit 300 μl
Isopropanol versetzt, gemischt und die ausfallende DNA 10 Minuten
mit 17.000 × g
pelletiert. Das Pellet wurde mit 500 μl 70%igen Ethanol gewaschen
und erneut 5 Minuten durch 17.000 × g pelletiert. Der Überstand
wurde abgenommen, das DNA-Pellet an Luft kurz trocknen gelassen
und dann in 100 μl
Wasser gelöst
(eventuell durch Ultraschallbehandlung).
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Die
weitere DNA-Aufreinigung erfolgt mit dem QIAquick® PCR-Purification-Kit
von Qiagen GmbH, Hilden, DE. Zu 100 μl DNA-Extrakt wurden 500 μl PB-Puffer
(Qiagen GmbH) zugegeben, gut durchmischt, die Lösung auf die Säule gegeben,
und die Säule
1 Minute bei 17.000 × g
zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen, 750 μl PE-Puffer
(Qiagen GmbH) auf die Säule
gegeben und 30 Sekunden bei 17.000 × g zentrifugiert. Der Durchfluss
wurde wieder verworfen und die Säule
ohne weitere Beladung nochmals für
30 Sekunden bei 17.000 × g
zentrifugiert. Das Auffangröhrchen
wurde verworfen und die Säule
in ein neues Reaktionsgefäß eingesetzt.
Nach Beladen der Säule
mit 250 μl
EB-Puffer wurde
diese 1 Minute bei 17.000 × g
zentrifugiert, die Säule
verworfen und das Eluat für
die PCR verwendet. Alle Arbeiten erfolgten unter den üblichen
Schutzmaßnahmen.
Zur Vermeidung von Verschleppungen empfiehlt es sich neben Schutzkleidung
Mikropipetten mit Filterspitzen zu verwenden.
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Die
isolierte und gereinigte DNA wurde in den Reaktionsvertiefungen
der Mikrotiterplatte amplifiziert. In den Vertiefungen wurden 12,5 μl DNA-Extraktion
und 12,5 μl
2 × AmpliTaqGold® Mastermix
von Applied Biosystems eingesetzt. Es folgte eine Amplifikation
der Zielsequenz auf einem Thermocycler (Eppendorf Mastercycler).
Das Cycler-Profil im vorliegenden Fall betrug 10 Minuten bei 95°C als initiale
Aktivierung der Polymerase, 15 Sekunden bei 95°C und 60 Sekunden bei 62°C für 45 Zyklen.
Gegebenenfalls muss das vergebene Zeitwertprofil angepasst werden.
5μl Amplifikat
(78-Basenpaar-Amplifikat)
wurde dann nach Zugabe Ladepuffer auf einem 2,5%-igem Agarosegel
(2 bis 4 μl
Ethidiumbromid in TAE-Puffer) und üblicher Elektrophorese (10 Minuten,
bei 3 bis 6 Volt/cm) analysiert und das Produkt auf einem Transilluminator
sichtbar gemacht.
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Für ein korrektes
Analysenergebnis musste im vorliegenden Fall die positive Referenz
mit der Zielsequenz eine Bande von 78 Basepaar Länge zeigen und die Negativkontrolle
durfte keine Bande in diesem Bereich zeigen (siehe 1).
War bei der Probe eine Bande in gleicher Höhe wie bei der Referenz zu
sehen, so konnte die Reaktion als positiv gewertet werden. War keine
Bande zu sehen, so konnte dies dann nur bedeuten, dass keine Haselnuss-DNA
in der Probe vorhanden oder dass die Reaktion inhibiert war. Eine
Inhibition konnte man ausschließen,
wenn das gleiche DNA-Isolat in einer Vertiefung mit der Referenznukleinsäure eindeutig
positiv war. War dies nicht der Fall, so lag eine Inhibition vor
und das DNA-Isolat wurde dann in einer größeren Verdünnung amplifiziert.
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Auf
der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte
mit den genormten Mengen an Referenz- und Kontrollnukleinsäuren sowie
den optimierten Primer-Konzentrationen können so alle Fallkonstellationen
auf einmal abgearbeitet werden, da der Fall, dass auch die Referenznukleinsäure in ungenügenden Mengen
wegen Abbaus vorliegen, nicht vorkommt.
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Die
Sequenzidentität
des Amplifikats kann dann zusätzlich über eine
Restriktion, bspw. mit BamH I überprüft werden.
Im Fall der Haselnuss-DNA entstehen hierbei zwei Fragmente mit Längen von
20 pb und 58 pb. Die Nachweisgrenze für genomische Haselnuss-DNA
liegt bei ca. 50 pg. Die vorliegende Reaktion war spezifisch gegenüber jeweils
100 ng DNA folgender Spezies: Erdnuss, Mandel, Cashewnüsse, Macadamianüsse, Walnüsse, Pekanüsse, Pistazien,
Aprikose, Mais, Soja, Sellerie, Kohl, Apfelsine, Mandarine, Paranuss, Weizen,
Roggen, Gerste, Hafer, Dinkel, Buchweizen (siehe 1.)
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Über den
Intensitätsabgleich
mit den Referenznukleinsäure
ist ferner eine Quantifizierung der positiven Proben-DNA möglich.
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BEISPIEL 2 Alterung und relative Sensitität bei Trocknung
mit und ohne Trehalose Stresstests zur Beurteilung der Lagerfähigkeit/Stabilität/Ausbeute
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Die
bezeichneten Reaktionsgefäße wurden
wie in Beispiel 1 hergestellt mit dem Unterschied, dass eine Anzahl
Reaktionsgefäße mit Referenz-DNA
in Gegenwart von Trehalose getrocknet wurde und eine Zahl an Reaktionsgefäßen mit
Referenz-DNA ohne Trehalose. Die Reaktionsgefäße wurden dann 6 Monate bei 37°C gelagert.
Die Reaktionsgefäße wurden
zur Amplifikation mit 12,5μl
zweifach konzentrierten MasterMix (AmpliTaqGold® MasterMix)
und 12,5μl
Wasser gefüllt,
verschlossen und in den PCR-Cycler
(Eppendorf Mastercycler) gestellt. Das Cyclerrpofil war identisch
mit dem Profil in Beispiel 1. Die anschließende Gelelektrophorese zeigte
bei beiden Reaktionsgefäßen eine
Bande bei 78 bp. Allerdings betrug die Intensität der Banden aus den Reaktionsgefäßen ohne
Trehalose nur ca 1/3 der Bandenintensität der Amplifikate aus den Reaktionsgefäßen mit
Trehalose (siehe 2).
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Dies
bedeutet, dass bei längerer
Lagerung die Reaktionsgefäße, in denen
Primer und Referenz-DNA nicht in der Gegenwart von Trehalose getrocknet
wurde, eine deutlich geringere Ausbeute in der Amplifikation liefern
und somit eine geringere Sensitivität besitzen.
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BEISPIEL 3 Sensitivität nach Lagerung bei 37°C
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Die
bezeichneten Reaktionsgefäße wurden
hergestellt wie in Beispiel 1 und 6 Monate bei 37°C gelagert.
Die Reaktionsgefäße wurden
zur Amplifikation mit 12,5μl
zweifach konzentriertem MasterMix (AmpliTaqGold® MasterMix)
und 12,5μl
DNA-Isolat gefüllt,
verschlossen und in den PCR-Cycler (Eppendorf Mastercycler) gestellt.
Die DNA-Isolate enthielten Haselnuss-DNA in den Mengen 100 pg, 50
pg, 25 pg, 6,25 pg und keine Haselnuss-DNA. Das Cyclerprofil war
wiederum identisch mit dem Profil in Beispiel 1. Die Gelelektrophorese
zeigte eine Amplifikation eines 78bp langen Fragmentes in allen
Reaktionsgefäßen, ausgenommen
dem, das keine Haselnuss-DNA enthielt (siehe 3)
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Werden
die Primer in der Gegenwart von 5 mMol/L Trehalose getrocknet, behalten
sie somit ihre Aktivität
auch bei längerer
Lagerung bei erhöhter
Temperatur.
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BEISPIEL 4 Anwendung in der einer Echtzeit-PCR
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Pro
Reaktionsgefäß wurde
eine Mischung aus 0,45μl
eines ersten Primers CaMAV-F3 mit einer Konzentration von 50μMol/L, 0,45μl eines zweiten
Primers Ca-R05 mit einer Konzentration von 50μMol/L, 0,625μl einer Sonde CaMAV-S1 mit einer
Konzentration von 10μMol/L,
2μl einer
5mMol/L Trehaloselösung
und 0,475μl Wasser.
Bei der Referenznukleinsäure
waren dies 200 pg genomische Haselnuss-DNA, entsprechend 100 Kopien
der Zielsequenz (Amplikonsequenz) jeweils in 0,475 μl gelöst und anstelle
des Wassers der Lösung
zugesetzt. Die Trocknung erfolgte 3 Stunden bei 40°C unter Umgebungsdruck
in einem trockenen Wärmeofen. Die
Reaktionsgefäße wurden
danach mit einer Folie verschlossen und bis zur Verwendung dunkel
gelagert.
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Für die Amplifikation
wurden 12,5μl
Universal MasterMix® von Applied Biosystems
und 12,5μl DNA-Isolat
pro Reaktionsgefäß zugegeben
und die Reaktionsgefäße in ein
Realtime-PCR-Gerat (SDS 7500 von Applied Biosystems) gestellt. Amplifiziert
wurde mit dem gleichen Temperaturprofil wie in Beispiel 1.
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Als
Matrize wurde ein Haselnuss-DNA-Isolat in verschiedenen Konzentrationen
zugegeben. Die Kopienzahlen pro Reaktionsgefäß lagen dabei zwischen 20 und
100 000 Kopien. Jede Kopienzahl wurde in Triplikaten amplifiziert.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt: TABELLE 1 Echtzeit-PCR in erfindungsgemäß vorbereiteten
Reaktionsgefäßen
| 20K – 100 000K |
| Kopien | Ct
MW | Steigung |
| 100
000 | 24,77 | -3,10 |
| 10
000 | 28,88 | Achsenabs. |
| 1000 | 32,05 | 40,82 |
| 100 | 34,48 | Korrelation |
| 40 | 35,93 | 0,991 |
| 20 | 36,42 | |
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Die
erhaltenen Ct-Werte zeigen eine gute Linearität über den gesamten Kopienzahlenbereich.
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Mit
den erfindungsgemäß vorbereiteten
Reaktionsgefäßen sind
somit molekularbiologische Lebensmittelanalysen nun einfach und
standardisiert durchführbar.
Es stehen also innovative Produkte zur Verfügung für den einfachen molekularbiologischen
Nachweis von spezifischen DNA-Fragmenten in Lebensmitteln und Futtermitteln.
Die vorbereiteten Reaktionsgefäße könnend adaptiert
werden für
alle relevante Parameter aus den Bereichen Allergene, GMO, Tierarten
und Hygiene.
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In
den erfindungsgemäßen PCR-Reaktionsgefäßen sind
nämlich
die wichtigsten Schlüsselreagenzien gebrauchsfertig
in optimalen Mengen vorgelegt: Spezifische Primersequenzen sowie
die erforderlichen artspezifischen Positivkontrollen. Es entfallen
somit alle aufwendigen Pipettierschritte und Qualitätssicherungsmaßen zur
Vermeidung eventuell auftretender Kontaminationen während der
PCR-Durchführung.
Die in den Reaktionsgefäßen enthaltenen
artspezifischen DNA-Kontrollen ermöglichen die einwandfreie Überprüfung der PCR,
wie die Mitführung
einer Positivkontrolle (Überprüfung der
Funktionalität
des Master-Mixes) und die Prüfung
auf inhibitorische Effekte (Inhibitionskontrolle) in der extrahierten
Proben-DNA. Gleichzeitig ermöglicht
die Testanordnung auch die Negativkontrolle (Wasserkontrolle) und
die Überprüfung einer
kontaminationsfreien Extraktion (Extraktionskontrolle). Diese Kontrollen
sind dem Analyten gleichgestellt und erlauben eine praxisnahe Inhibitionskontrolle
der Matrix.
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Es
muss nur mehr die DNA wird aus der Probe nach einem standardisierten
Probenaufarbeitungsprotokoll isoliert werden. Im Stand der Technik
empfohlene und validierte DNA-Aufarbeitungskits stehen zur Verfügung und
können
der Verpackungseinheit beigelegt werden. Nach der Extraktion der
DNA aus dem Probenmaterial sind für die Abarbeitung der PCR nur
noch zwei Pipettierschritte notwendig: 12,5 μl der Proben-DNA sowie 12,5 μl doppelt konzentrierter MasterMix,
der bereits Polymerase, Nukleotide, Magnesiumchlorid und Puffer
in optimalen Konzentrationen enthält, werden in das Reaktionsgefäß pipettiert.
Der Anwender entnimmt aus dem Testkit die hierfür benötigte Menge an Reaktionsgefäßen und
lagert die nicht benötigten
Reaktionsgefäße bequem
wieder ein. Die Reaktionsgefäße sind
bevorzugt übersichtlich
in einem Rack analog einer Mikrotiterplatte angeordnet.
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Der
Test bzw. die Reaktionsgefäße mit den
Reagenzien sind bis zu 2 Jahre bei 2 bis 10°C lagerbar. Die gekennzeichneten
Reaktionsgefäße enthalten
neben den Primern zusätzlich
die Kontroll-DNA. Der MasterMix kann über führende Anbieter wie Applied
Biosystems Inc. bezogen werden. Der Universal MasterMix ist an alle
Parameter adaptiert, das heißt
für die
gesamte Produktlinie ist nur noch ein MasterMix erforderlich. Das reduziert
den Arbeitsaufwand im Labor erheblich und macht die PCR sicherer
und reproduzierbarer.
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Das
Temperatur- bzw. Cyclerprofil ist annähernd für alle Parameter identisch
und in der Testkitbeschreibung vorgegeben. Dadurch können verschiedene
Parameter gleichzeitig in einem Durchgang analysiert und bestimmt
werden. Der Anwender ist in der Lage, selbst einen Makrochip zusammenzustellen
(zum Beispiel gleichzeitiges Screenen der Allergene Soja, Haselnuss
und Erdnuss oder mehrere GMO Parameter nebeneinander).
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Die
Detektion erfolgt in der Regel im Agarosegel mit Ethidiumbromid.
Ausgewählte
Parameter können auch
in Echtzeit zur Abarbeitung im Blockcycler vorgesehen sein.
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Folgende
Parameter bieten sich unter anderem für den erfindungsgemäßen Testkit
an: Lebensmittel-Allergene: Haselnuss, Mandel, Walnuss, Pekannuss,
Paranuss, Cashew, Pistazie, Erdnuss, Weizen/Gerste/Roggen, Weizen,
Sellerie, Senf, Sesam, Soja, Fisch, Lupine. Tierarten: Schwein,
Rind, Wiederkäuer,
Säugetier,
Huhn, Pute, Ente, Geflügel,
Schaf, Ziege, Pferd, Nager, Hund, Katze. GMO: Screen 35S, Screen
nos, Roundup Ready Soja (RRS), Cauliflower Mosaic Virus (CMV), Mais
MON810, Mais MON863, Mais BT176, Mais BT11, Mais GA21, Mais NK 603,
Mais T25, Reis LL601, Reis 1162. Hygiene: Salmonella spp., Listeria monocytogenes,
Campylobacter (jejuni, coli, lari), EHEC, Sta-phylococcus aureus,
Bacillus cereus, Yersinia enterocolitica, Clostridium perfringens,
Shigella flexneri.
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Die
Vorteile der erfindungsgemäßen Reaktionsgefäße sind:
- – die
Testsysteme sind lagerbar
- – Primer
und artspezifische Positivkontrollen sind ready-to-use vorgelegt.
- – Kein
Liquidhandling von Primer und Kontrollen erforderlich
- – keine
Kontaminationsgefahr mehr
- – einfache
Erweiterung auf neue Parameter und Produkte
- – völlige Standardisierung
der PCR
- – unabhängig von
Probenaufarbeitung
- – mehrere
Parameter gleichzeitig in einem Lauf möglich
- – nur
ein einziger Universal MasterMix für alle Parameter notwendig
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Molekularbiologische
Lebensmittelanalysen spielen eine immer wichtigere Rolle in der
Qualitätssicherung.
Mit der Methodik können
spezifische DNA-Fragmente mittels der PCR bis zur Sichtbarmachung
nachgewiesen werden. Ungelöste
analytische Fragestellungen sind mit der DNA-Analyse heute eindeutig
lösbar.
Als aktuelle Beispiele sind zu nennen der spezifische Nachweis von
Aprikosenkernen in Marzipan oder spezifische Nachweise von Allergie
auslösenden
Substanzen wie Senf oder Sellerie.
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Die
PCR spielt bei der Identifizierung gentechnisch veränderter
Lebensmittel eine genauso bedeutende Rolle wie der zunehmende pathogen-hygienische
Bereich. So lassen sich pathogene Keime frühzeitig und rasch aufspüren. Lagerzeiten
bis zur analytischen Freigabe werden dadurch erheblich verkürzt. Mit
den erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßen ist
die Standardisierung der PCR in allen Bereichen der Lebensmittelwirtschaft
und Untersuchungslaboratorien möglich.