WO2008065206A1 - Laboreinmalartikel für analyse und diagnostik - Google Patents

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WO2008065206A1
WO2008065206A1 PCT/EP2007/063192 EP2007063192W WO2008065206A1 WO 2008065206 A1 WO2008065206 A1 WO 2008065206A1 EP 2007063192 W EP2007063192 W EP 2007063192W WO 2008065206 A1 WO2008065206 A1 WO 2008065206A1
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nucleic acid
dna
reaction vessels
reference nucleic
reaction
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PCT/EP2007/063192
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Wolfgang Weber
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IfP Privates Institut für Produktqualität GmbH
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the invention relates to laboratory disposable articles and more particularly to reaction tubes for carrying out the chain polymerase reaction for analytical and diagnostic purposes.
  • PCR The chain polymerase reaction
  • PCR allows exponential amplification of nucleic acid molecules in vitro. PCR is used to diagnose hereditary and infectious diseases, to obtain genetic fingerprints, to clone genes, to determine paternity and much more. In food chemistry, it is used to determine the type and amount of components in a preparation, such as hazelnut, peanut, soya, fish, wheat, cereals, animal species and possibly genetically modified organisms (GMOs), the origin of the constituents and of course also for the detection of pathogenic germs such as Salmonella, Listeria and so on. Despite the many fields of application, the chain polymerase reaction is always the same in principle.
  • the analyzes differ only in the sample preparation and the type of DNA or RNA that is to be amplified, or the start oligonucleotides, also called primers, whose sequences must be complementary to the beginning or end of a DNA sequence section to be amplified.
  • the primers are annealed (DNA annealed) to a complementary nucleotide strand in the sample, if present, and the synthetically produced new double strands then contain additional starting sites for the synthesis of additional DNA strands.
  • the sensitivity and specificity of the reaction result from the length and the sequence of the primers and the outstanding accuracy of the enzymatic DNA synthesis by the DNA polymerase or the reverse transcriptase.
  • the optimal length of the primer is usually between 15 and 40 nucleotides at a melting temperature between 55 and 70 degrees Celsius.
  • the reaction mixture for the chain polymerase reaction always contains the same deoxynucleoside triphosphates (dNTPs), an aqueous buffer solution, DNA polymerase or reverse transcriptase and, as an additive, DNA or RNA of the sample to be analyzed.
  • dNTPs deoxynucleoside triphosphates
  • the thus-synthesized DNA product is usually analyzed for its length and optionally verified by enzymatic restriction. In individual cases, a sequencing of the DNA can be done.
  • nucleic acids become “unstable” or the molecules are inaccessible to reaction in the reaction vessel, which is then managed by adding a larger amount of non-specific DNA to the low-concentration specific nucleic acid,
  • this is problematic for many reasons and can lead to severe systematic errors, so it is generally recommended to retake all necessary dilution steps from a stock solution of defined concentration daily labor intensive and subject to fluctuating pipetting accuracy, which reduces reproducibility and reliability.
  • International patent application WO 2004/106549 discloses a method for preserving nucleic acids in which aqueous solutions of the nucleic acid in the presence of disaccharides and collagen, preferably trehalose and collagen, ly_o_; be philated.
  • the trehalose is essentially intended to make the nucleic acids more durable, and the collagen sticks the nucleic acid present on the vessel surface to the wall and protects it in an opaque manner.
  • International Patent Application WO 2005/103277 teaches a dry amplification mixture for the chain polymerase reaction and the technical PCR analysis, which contains DNA polymerase, deoxyribonucleosides, buffer components, water-soluble dye for DNA electrophoresis and stabilizer.
  • the PCR method comprises dissolving the dry amplification mixture in a buffer with magnesium ions and then adding primer and DNA sample to be analyzed.
  • EP-A2-1 374 827 discloses methods for stabilizing dry and semi-dry mixtures with PCR enzymes and reagents as well as kits with these dry mixes. Also at refrigerator temperatures, these mixtures are stable only for comparatively short periods of time
  • a disadvantage of the prior art is, in particular, that despite all the measures, the amounts of DNA actively present in the vessels for the PCR fluctuate, even if equal amounts of DNA have been placed in the vessels. This is presumably due to the fact that the PCR reagents, desoxy (r ⁇ bo) nucleotidr ⁇ phosphate, P ⁇ mer oligonucleotides and template RNAs or - DNAs either individually or in admixture together with the special substances or stabilizers (nonspecific DNA, gelatin, collagen, glucose, Innulm, Maltose, mannitol, dextrans, trehalose, sucrose and other disaccharides, THESITt®, polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, TRITON-X 100®, TWEEN-20®, bovine serum albumin (BSA), Phycoll, buffer salts such as Tris-HCl, KCl, DTT, etc.) are dried in the special substances or stabilizers (nonspecific DNA
  • Such dried PCR mixtures are highly hygroscopic and lose activity and efficacy upon prolonged storage due to moisture uptake. This effect is also reinforced by the addition of stabilizers such as collagen or gelatin. However, if the lyophilization takes place without the presence of glue-forming substances such as collagen or gelatin, flocs of the PCR reagents form, which can migrate in the vessels, so that no quantitative determination is possible with prepared vessels.
  • the packaging unit according to the invention for carrying out a chain polymerase reaction for analytical, diagnostic and technical purposes comprises a set of designated dry reaction vessels in the form of a storage with a number of known amounts of primer oligonucleotides which, after addition of suitable reagents, enzyme and DNA or RNA Sample in a chain polymerase reaction, start amplification of the target sequence;
  • a set of designated dry reaction vessels in the form of a bearing having a number of known amounts of primer oligonucleotides and reference nucleic acid which upon addition of fixed amounts of liquid give a concentration series of the reference nucleic acid, the reference nucleic acid containing the target sequence.
  • the two sets of designated dry reaction vessels in the form of storage are according to the invention prepared so that in the reaction vessels each aqueous solutions of known amounts of primer oligonucleotides with and without Referenznukleinklare only in the presence of 1 to 5 mmol / L trehalose under ambient pressure at a temperature of 5 to At most 30 degrees Celsius are dried over room temperature, so that the resulting pellet is completely dry, but not hygroscopic.
  • the two sets of designated dry reaction vessels in the form of a bearing are prepared in such a way that aqueous solutions of known amounts of primer oligonucleotide are respectively present in the reaction vessels.
  • the dry solutions in the prior art also contain hydroxyl-containing hydrogen bridge-forming molecules such as nonspecific DNA, gelatin, collagen, glucose, inulin, maltose, mannitol, dextranes, trehalose, sucrose and other disaccharides, in a separate step , Thesit®, polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, Triton-X 100®, Tween-20®, bovine serum albumin (BSA), Phycoll, etc., to "stabilize” the nucleic acids and oligonucleotides in the intended very low concentrations and pellet on the vessel wall to hal th.
  • hydroxyl-containing hydrogen bridge-forming molecules such as nonspecific DNA, gelatin, collagen, glucose, inulin, maltose, mannitol, dextranes, trehalose, sucrose and other disaccharides
  • the invention further lies in the combination of similarly prepared reaction vessels with primer oligonucleotides or reference nucleic acid. It is surprising that even such a low copy number of the target sequence of 100 or 1000 is stable, the aqueous solution of the reference nucleic acid is only dried in the presence of trehalose. Since the reaction vessels with the primers and the reference nucleic acid are made equal, an absolute comparability between sample and reference is given.
  • a preferred embodiment is in a packaging unit with said designated reaction vessels, wherein the volume of the aqueous solutions in the reaction vessels before drying 1 to 25 ul.
  • the concentration of the primers is between 0.1 and 100 ⁇ mol / L at 1 to 5 mmol / L trehalose.
  • the target sequence is preferably contained in an amount of 10 to 100,000 copies as genomic DNA or plasmid.
  • An amplicon can also be used. However, it has been found that amplicons are much less stable under these conditions. Presumably, exonuclease activity is regularly introduced in amplicons.
  • the copy number per reaction vessel is preferably 100 to 5,000.
  • Another embodiment relates to reaction vessels for a hot-start PCR.
  • the dried primer or the reference nucleic acid are covered with a hydrocarbon wax, which melts at 57 degrees Celsius and floating in the aqueous solution upwards. This prevents primers and nucleic acids from hybridizing with one another even at lower temperatures.
  • hot-start polymerases which become active only at temperatures above 50 degrees Celsius.
  • hot-start polymerases are much more expensive than conventional DNA polymerases and reverse transcriptases.
  • the layer of high-melting hydrocarbon wax also protects the underlying pellet with the primers and / or the reference nucleic acid from mist moisture.
  • reaction tubes are present in the kit, in which spatially separated primer oligonucleotides and reference nucleic acid in the presence of trehalose are dried on the vessel wall, that after addition of the aqueous solution with the other reagents for the chain polymerase primer oligonucleotides and reference nucleic acid are dissolved in the aqueous solution.
  • reaction vessels are preferably designed as wells of a microtiter plate.
  • Microtiter plates are commonly sold commercially as 24, 48, 96, 192 and 384 well plates.
  • the amount of the two primers in the reaction vessels is preferably 7.5 pmol
  • a chain polymerase reaction remains exponential for 12 to 400 output copies for about 30 cycles, 200 to 3200 for 25 cycles, and initially 3000 to 50,000 for no more than 20 Cycles
  • CT value Threshold Cycle
  • Cp value Cross Point
  • the packaging unit may contain one or more of the following buffer and reaction solutions, for example DNA or RNA extraction solution, proteinase K solution, gel loading buffer, nucleotide and amplification buffer (MasterMix), DNA polymerase or reverse transcriptase and, for all purposes, optimized amplification mixtures in their ready-to-use form, such as the AmpliTaqGold® MasterMix from Roche Molecular Systems, Ine, users will want to continue trusting the blends used so far, so the latter option - including MasterMix - is just here is mentioned for the sake of completeness
  • Trehalose also called mycosis
  • Trehalose is therefore a potent PCR enhancer, which lowers the melting temperature in solution and thermally stabilizes the Taq DNA polymerase (Spiess AN et al (2004) Chnical Chemistry 50 (7), 1256- 1259)
  • reaction components embedded in the wax droplet are then released to the other reaction components of the PCR reaction only after higher temperatures have been reached and the wax coating has been melted, as a result of which a mixture and ei
  • the early start of the DNA polymerase reaction at low temperatures can be avoided.
  • this method is only suitable in areas with very high numbers of samples, since embedding a portion of the reaction components in a wax drop on a polyethylene thread is complicated. A long-term durability of polymers and reference nucleic acid on the polyethylene yarn is not taught.
  • the polymers and / or the reference nucleic acid are in the presence of tungsten Halose dried on the wall of the reaction vessel, preferably in the bottom of the vessel
  • the so designated purpose prepared designated Probengefackede can then by addition of a defined amount of water and Ampltechnischsgemisch (DNA polymerase, dNTPs, Mg 2+ , T ⁇ s-HCl buffer, pH 8.0 Further steps are not necessary since the designated sample vessels already contain the primers and a given copy number of the target sequence in known amounts, protected by a glassy layer of trehalose, which completely dissolves under the conditions of a chain polymerase reaction Trehalose presumably as a solution for the few copies of the reference nucleic acid
  • the problem is that when Lyophihsieren or drying of the reagents crystallize differently and form small, non-adherent flakes which can be distributed throughout the vessel. If all reagents are pelleted at the bottom of a reaction vessel, larger amounts of salt may be required. These may affect subsequent enzymatic reactions and water According to this problem is solved so that the superfluous reagents are omitted and the oligonucleotides and Referenznukleinsauren are dried only in the presence of physiological amounts of trehalose on an inert substrate such as on a polyethylene wall. It is not all sugars are suitable, but only those that give a glassy layer when dried. At the same time, the sugar has to be rapidly dissolved in the presence of water.
  • Trehalose Trehalose is black In nature, trehalose is functionally similar to sucrose, but has other glass-centering and stabilizing properties, trehalose is naturally present in plants and fungi and also in the hemolymph of many insects. Trehalose is chemically, thermally and acidically stable and readily soluble in water, with trehalose less soluble at lower temperatures and more soluble at higher temperatures than sucrose Disacchands, however, trehalose is not hydrolyzable and it can not participate in a Maillard reaction with the amino acids or proteins. It also has a high adhesion to plastic walls
  • reaction vessels are available for the chain polymerase reaction, which can be stored for months and years at room temperature Reaction vessels can be used immediately if necessary.
  • All primers and reference nucleic acids are immediately usable and exactly in the reaction vessels before and it must be used only for the respective analysis reaction prepared sample DNA or RNA and a master mix (Ampltechnischsgemisch). But this is always necessary.
  • According to the invention eliminates the possible errors by incorrectly using or incorrectly determining the amounts of primer and reference nucleic acid.
  • vessels with a "wrong" nucleic acid or other positive and negative controls are delivered in addition to the sample vessels according to the invention.
  • Ready-to-use master or amplification mixtures can be purchased commercially from a variety of manufacturers, with different natural or genetically modified or chemically modified DNA polymerases or reverse transcriptases.
  • Typical DNA polymerases are Taq DNA polymerase, the recombinant truncated form of Taq DNA polymerase lacking 5'-3 'exoactivity (KlenTaq), a chemically modified Taq DNA polymerase for a Start PCR, or a highly accurate recombinant thermostable DNA polymerase from Pyrococcus abyssii, etc.
  • the master mixes can be multiply concentrated and be with and without magnesium ions.
  • the magnesium ions can also be added from a separate magnesium stock (for example 25 mM MgCl 2 ).
  • the master mixes may further contain compounds that increase the sample density so that the products from the chain polymerase reaction can be added directly into the wells of an analytical or quantitative agarose gel.
  • the master mix may also contain dyes, either for real-time PCR or for analysis on the agarose gel.
  • Fig. 3 is a gel electrophoresis of the amplification products in the reaction vessels according to the invention at different amounts of added hazelnut DNA and aging over 6 months at 37 0 C (sensitivity test).
  • reaction vessels made of polypropylene, in whose wells (200 .mu.l) known amounts of specific primer for hazelnut determination and as a reference nucleic acid hazelnut total DNA were dried.
  • this was a mixture of 0.75 ⁇ l of a first primer CaMAV-F3 with a concentration of 10 ⁇ mol / L, 0.75 ⁇ l of a second primer Ca-R05 with a concentration of 10 ⁇ mol / L, 2 ⁇ l of a 5 mmol / L Trehalose solution and 0.5 ⁇ l of water.
  • the prepared wells of the microtiter plate contained the primer necessary for the detection in the optimal amount for the determination of hazelnut DNA in the sample or for the negative control (checking the master mix for contamination) and for the extraction control (checking the extraction for contamination ).
  • the red labeled reaction wells contained, in addition to the primers, a hazelnut DNA in low amounts. On the one hand, they allow a positive control (functionality of the master mix), on the other hand an inhibition control (checking of the DNA isolate for inhibitors) and, thirdly, a quantification of the DNA in the sample.
  • the DNA extraction was carried out according to the CTAB method (ISO 21571, Foodstuffs
  • the isolated and purified DNA was amplified in the reaction wells of the microtiter plate. 12.5 ⁇ l of DNA extraction and 12.5 ⁇ l of AmpliTaqGoId® Master Mix from Applied Biosystems were used in the wells. This was followed by amplification of the target sequence on a thermocycler (Eppendorf Mastercycler). The cycler profile in this case was 10 minutes at 95 ° C as the initial activation of the polymerase, 15 seconds at 95 ° C and 60 seconds at 62 ° C for 45 cycles. If necessary, the assigned time value profile must be adapted.
  • amplificate (78 base pair amplificate) was then analyzed after adding loading buffer on a 2.5% agarose gel (2 to 4 ⁇ l ethidium bromide in TAE buffer) and conventional electrophoresis (10 minutes, at 3 to 6 volts / cm) and visualized the product on a transilluminator.
  • the positive reference with the target sequence had to show a band of 78 base pair length and the negative control was not allowed to show any band in this region (see FIG. 1).
  • the reaction could be considered positive. If no gang was seen, then this could only mean that there was no hazelnut DNA in the sample or that the reaction was inhibited. Inhibition could be excluded if the same DNA isolate was clearly positive in a well with the reference nucleic acid. If this was not the case, then there was an inhibition and the DNA isolate was then amplified in a larger dilution.
  • the microtiter plate according to the invention with the standardized amounts of
  • Reference and control nucleic acids as well as the optimized primer concentrations can thus be processed all case constellations at once, since the case, that also the reference nucleic acid are present in insufficient quantities due to degradation, does not occur.
  • the sequence identity of the amplificate can then be checked additionally via a restriction, for example with BamH I.
  • a restriction for example with BamH I.
  • hazelnut DNA two fragments with lengths of 20 pb and 58 pb are formed.
  • the detection limit for genomic hazelnut DNA is approximately 50 pg.
  • the present reaction was specific to each 100 ng of DNA of the following species: peanut, almonds, cashews, macadamia nuts, walnuts, pecans, pistachios, apricots, corn, soy, celery, cabbage, orange, tangerine, Brazil nut, wheat, rye, barley, oats , Spelled, buckwheat (see Fig. 1)
  • the designated reaction vessels were prepared as in Example 1 with the difference that a number of reaction vessels with reference DNA in the presence of trehalose was dried and a number of reaction vessels with reference DNA without trehalose.
  • the reaction vessels were then stored for 6 months at 37 0 C.
  • the reaction vessels were filled with 12.5 ⁇ l double-concentrated MasterMix (AmpliTaqGold® MasterMix) and 12.5 ⁇ l water for amplification, sealed and placed in the PCR cycler (Eppendorf Mastercycler).
  • the cycler profile was identical to the profile in Example 1.
  • the subsequent gel electrophoresis showed a band at 78 bp in both reaction vessels.
  • the intensity of the bands from the reaction vessels without trehalose was only about 1/3 of the band intensity of the amplificates from the reaction vessels with trehalose (see FIG. 2).
  • reaction vessels were prepared as in Example 1 and 6
  • the reaction vessels were filled with 12.5 ⁇ l double-concentrated MasterMix (AmpliTaqGold® MasterMix) and 12.5 ⁇ l DNA isolate for amplification, sealed and placed in the PCR cycler (Eppendorf Mastercycler).
  • the DNA isolates contained hazelnut DNA in the amounts 100 pg, 50 pg, 25 pg, 6.25 pg and none
  • primers are dried in the presence of 5 mmol / L trehalose, they thus retain their activity even on prolonged storage at elevated temperature.
  • CaMAV-F3 with a concentration of 50 ⁇ mol / L, 0.45 ⁇ l of a second primer Ca-R05 with a concentration of 50 ⁇ mol / L, 0.625 ⁇ l of a probe CaMAV-SI with a concentration of 10 ⁇ mol / L, a 5 mMol / L trehalose solution and 0.475ul of water.
  • this was dissolved 200 ⁇ g of genomic hazelnut DNA corresponding to 100 copies of the target sequence (amplicon sequence) each in 0.475 ⁇ l and added to the solution instead of the water. Drying was carried out for 3 hours at 4O 0 C under ambient pressure in a dry heat oven. The reaction vessels were then sealed with a foil and stored dark until used.
  • reaction vessels according to the invention can be standardized so that they permit a PCR analysis by an end point determination. This is described here for the detection of Salmonella DNA
  • PCR approach probe detection: Wells with predried primers and probe (PCRFast Salmonella, Lot RSAL_39239) were mixed with 12.5 ⁇ l MasterMix (AmpliTaq Gold® PCR MasterMix, Applied Biosystems No. 4318739). Then 12.5 ⁇ l of DNA isolates were added to the food samples, the strips were sealed and placed in the PCR thermocycler (STRATAGENE Mx 3005 P). The amplification was carried out with the following temperature profile: after 10 min. at 95 ° C followed 35 cycles with 30 sec at 95 0 C, 45 sec at 60 0 C and 30 sec at 72 ° C. The measurement of the fluorescence values (R load, excitation white light of a halogen lamp and emission measurement at 520 nm, no unit) at the end of the amplification gave the following fluorescence values in the end point determination.
  • the two experiments show that the measurement distance between the positive and negative controls or the samples was so great in the fluorescence end point determination that it was possible to easily distinguish between the presence and absence of Salmonella in the food sample without any great effort in terms of metrology.
  • the excitation was sufficient with the white light of a halogen lamp and the emission measurement at 520 nm (without unit). This allows a Salmonella analysis by means of PCR in very simply equipped laboratories.
  • reaction vessels are then advantageously used in the relevant light wave range transparent vessels, preferably made of polycarbonate.
  • reaction vessels prepared according to the invention molecular biological food analyzes can now be carried out simply and standardized. So there are innovative products available for the simple molecular biological detection of specific DNA fragments in food and feed.
  • the prepared reaction vessels can be adapted for all relevant parameters from the areas allergens, GMO, animal species and hygiene.
  • Sample conditioning protocol can be isolated. State of the art recommended and validated DNA processing kits are available and may be included with the packaging unit. After extraction of the DNA from the sample material, only two pipetting steps are necessary for processing the PCR: 12.5 ⁇ l of the sample DNA and 12.5 ⁇ l of doubly concentrated MasterMix, which already contains polymerase, nucleotides, magnesium chloride and buffer in optimal concentrations , are pipetted into the reaction vessel. The user removes the required amount of reaction vessels from the test kit and conveniently stores the unused reaction vessels. The reaction vessels are preferably arranged clearly in a rack analogous to a microtiter plate.
  • the test or the reaction vessels with the reagents can be stored for up to 2 years at 2 to 10 ° C.
  • the labeled reaction vessels additionally contain the control DNA in addition to the primers.
  • the MasterMix can be obtained from leading suppliers such as Applied Biosystems Inc.
  • the Universal MasterMix is adapted to all parameters, which means that only one MasterMix is required for the entire product line. This significantly reduces labor in the lab and makes the PCR safer and more reproducible.
  • the temperature or cycler profile is nearly identical for all parameters and specified in the test kit description. This allows various parameters to be analyzed and determined simultaneously in one go. The user is able to assemble a macrochip himself (for example simultaneous screening of the allergens soy, hazelnut and peanut or several GMO parameters side by side).
  • the detection is usually carried out in agarose gel with ethidium bromide. Selected parameters can also be provided in real time for processing in the block cycler.
  • Test kit The following parameters are suitable, inter alia, for the test kit according to the invention: Food allergens: hazelnut, almond, walnut, pecan, Brazil nut, Cashew, Pistachio, Groundnut, Wheat / Barley / Rye, Wheat, Celery, Mustard, Sesame, Soy, Fish, Lupine.
  • Animal species pork, beef, ruminant, mammal, chicken, turkey, duck, poultry, sheep, goat, horse, rodent, dog, cat.
  • GMO Screen 35S, Screen nos, Roundup Ready Soya (RRS), Cauliflower Mosaic Virus (CMV), Maize MON810, Maize MON863, Maize BT176, Maize BT11, Maize GA21, Maize NK 603, Maize T25, Rice LL601, Rice LL62.
  • Hygiene Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Campylobacter (jejuni, coli, lari), EHEC, Sta-phylococcus aureus, Bacillus cereus, Yersinia enterocolitica, Clostridium perfringes, Shigella flexneri.
  • reaction vessels according to the invention are: they test systems can be stored
  • Molecular biology food analyzes play an increasingly important role in quality assurance. Using the methodology, specific DNA fragments can be detected by PCR until visualization. Unresolved analytical questions can now be solved with DNA analysis. Current examples include the specific detection of apricot kernels in marzipan or specific evidence of allergy-causing substances such as mustard or celery. PCR plays just as important a role in the identification of genetically modified food as the increasing pathogen-hygienic area. This allows pathogenic germs to be detected early and quickly. Storage times until the analytical release are considerably shortened. The reaction vessels according to the invention make it possible to standardize the PCR in all areas of the food industry and research laboratories.

Abstract

Die Erfindung betrifft Laboreinmalartikel und insbesondere vorbereitete Reaktionsgefäße zur Durchführung der Kettenpolymerasereaktion für analytische und diagnostische Zwecke sowie ein Verfahren, wie geringste Menge Oligonukleotide und Referenznukleinsäuren in Reaktionsgefäßen trocken und stabil gelagert werden können. Es zeichnet sich dadurch aus, dass die Oligonukleotide und Nukleinsäuren - ohne jede weiteren Bestandteil - in Gegenwart von 1 bis 5 mM Trehalose auf die Wand des Reaktionsgefäßes aufgetrocknet wird.

Description

01/12/07 GP100071 PCOO/UMB
LABOREINMALARTIKEL FÜR ANALYSE UND DIAGNOSTIK
BETREFF DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Laboreinmalartikel und insbesondere Reaktionsgefäße zur Durchführung der Kettenpolymerasereaktion für analytische und diagnostische Zwecke.
STAND DER TECHNIK
Die Kettenpolymerasereaktion (PCR - engl.: Polymerase chain reaction) erlaubt eine exponentielle Vervielfältigung {Amplifikation) von Nukleinsäuremolekülen in vitro. Die PCR wird eingesetzt in der Diagnose von Erb- und Infektionskrankheiten, zur Erhebung genetischer Fingerabdrücke, zum Klonieren von Genen, der Bestimmung der Vaterschaft und für vieles anderes mehr. In der Lebensmittelchemie wird sie verwandt zur Bestimmung der Art und Menge der Anteile in einer Zubereitung, zum Beispiel von Hasel- nuss, Erdnuss, Soja, Fisch, Weizen, Getreide, Tierspezies und eventuell gentechnisch veränderte Organismen (GVOs), der Herkunft der Bestandteile und natürlich auch für den Nachweis pathogener Keime wie Salmonellen, Listerien und so weiter. Trotz der vielen Einsatzgebiete erfolgt die Kettenpolymerasereaktion im Prinzip stets gleich. Die Analysen unterscheiden sich im Wesentlichen nur in der Probenaufbereitung und der Art der DNA oder RNA, die es zu vervielfältigen gilt, beziehungsweise der Startoligonukleotide, auch Primer genannt, deren Sequenzen komplementär zum Anfang beziehungsweise Ende eines zu amplifizierenden DNA-Sequenzabschnitts sein müssen. Die Primer werden durch Annealing (DNA-Anlagerung) an einen komplementären Nukleotidstrang in der Probe gebunden, sofern vorhanden, und die synthetisch hergestellten neuen Doppelstränge enthalten dann weitere Startstellen für die Synthese weiterer DNA-Stränge. Die Sensitivität und Spezifität der Reaktion ergibt sich aus der Länge und der Sequenz der Primer und aus der überragenden Genauigkeit der enzymatischen DNA-Synthese durch die DNA-Polymerase beziehungsweise die reversen Transkriptase. Die optimale Länge der Primer beträgt in der Regel zwischen 15 und 40 Nukleotiden bei einer Schmelztemperatur zwischen 55 und 70 Grad Celsius. Das Reaktionsgemisch für die Kettenpolymerasereaktion enthält neben den speziellen Primern stets die gleichen Deoxynukleosidtriphosphate (dNTPs), eine wässrige Pufferlösung, DNA-Polymerase oder reverse Transkriptase und als Zusatz DNA oder RNA der zu analysierenden Probe. Nach der Kettenpolymerasereaktion wird das so synthetisierte DNA-Produkt in der Regel auf seine Länge analysiert und gegebenenfalls durch enzymatische Restriktion verifiziert. In Einzelfällen kann auch eine Sequenzierung der DNA erfolgen. Wenngleich es PCR-Vollautomaten für den analytischen und diagnostischen Bereich gibt, so sind diese nur bei ständig hoher Probenzahl wirtschaftlich zu betreiben. Insbesondere in der Lebensmittelanalytik werden aber Analysen zur vereinzelten Kontrolle oder auch stoßweise nachgefragt, wenn zum Beispiel Verdachtsmomente vorliegen. Einzel- oder Gruppenanalysen sind schwer zu automatisieren, denn für jede Fragestellung sind andere Primer und unterschiedliche Probenaufbereitungsverfahren erforderlich.
DE 198 40 531 (WO 00/12756; CA 2 342 581 ) offenbart Reaktionsbehältnisse, deren ansonsten chemisch oder biochemisch nicht-modifizierten Innenwaπdung mit vorgegebenen Mengen an Primern und gegebenenfalls bekannten Mengen einer Referenz- nukleinsäure beschichtet sind. In der Praxis erfolgt die Beschichtung der Innenwandung durch „schonendes Lyophilisieren" einer wässrigen Nukleinsäurelösung in dem Kunststoffreaktionsgefäß, so das die Nukleinsäuren an der Iπnenwandung adsorbiert werden. Da eine derartige Adsorption nicht unbedingt reversibel ist, wird weiterhin empfohlen, den spezifischen Nukleinsäuren größere Menge einer unspezifischen Trägemukleiπsäure beizumischen. Day INM et al. (1995) offenbaren in BioTechniques 18(6): 981-984 in Zusammenhang mit einer genetischen Analyse die Lagerung einer getrockneten Matrizen- DNA (Referenz-DNA) und von PCR-Startoligonukleotiden in Mikrotiterplatten. Bei der genetischen Analyse ist die Menge an DNA in der Probe bekannt beziehungsweise es kommt auf die Menge an Matrizen-DNA in dem Reaktionsgefäß nicht an. Das dort beschriebene Verfahren eignet sich nicht für quantitative Analysen oder die Bestimmung unbekannter Mengen an DNA. In vielen Bereichen der Lebensmittelanalytik und der Diagnostik ist aber die Konzentration einer bestimmten Nukleinsäure (DNA oder RNA) in der Probe genau zu ermitteln und Voraussetzung für derartige quantitative Untersuchungen ist die Verfügbarkeit eine genauen Standardverdünnungsreihe. Bei sehr niedrigen Konzentrationen von 1 bis 100000 Molekülen pro Reaktionsansatz werden aber selbst Nukleinsäuren „instabil" beziehungsweise die Moleküle sind einer Reaktion im Reaktionsgefäß nicht zugänglich. Man behilft sich dann so, dass man der niedrigkonzentrierten spe- zifischen Nukleinsäure eine größere Menge unspezifischer DNA zusetzt, die mit der zu detektierenden Nukleinsäure so gut wie keine Sequenzhomologie besitzt. Dies ist aber aus vielen Gründen problematisch und kann zu schweren systematischen Fehlern führen, so dass allgemein empfohlen wird, alle erforderlichen Verdünnungsschritte ausgehend von einer Stammlösung definierter Konzentration täglich neu vorzunehmen. Dies ist sehr arbeitsintensiv und unterliegt der schwankenden Pipettiergenauigkeit, was die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit vermindert.
Die internationale Patentanmeldung WO 2004/106549 offenbart ein Verfahren zur Haltbarmachung von Nukleinsäuren, in dem wässrigen Lösungen der Nukleinsäure in Gegenwart von Disacchariden und Kollagen, vorzugsweise Trehalose und Kollagen, ly_o_; philisiert werden. Die Trehalose soll im Wesentlichen die Nukleinsäuren haltbarer machen und das Kollagen die auf der Gefäßoberfläche vorliegende Nukleinsäure an die Wand kleben und deckend schützen. Die internationale Patentanmeldung WO 2005/103277 lehrt ein trockenes Ampli- fikationsgemisch für die Kettenpolymerasereaktion und die technische PCR-Analyse, das DNA-Polymerase, Desoxyribonukleoside, Pufferkomponenten, wasserlöslichen Farbstoff für die DNA-Elektrophorese enthalt sowie Stabilisator. D-Glucose, Disacchande wie Innulm, Sucrose, Trehalose und Maltose, sowie Polysaccharide wie D-Mannιtol, Dextrane, Phycoll, Polyvinylpyrrolidon, etc. Das PCR-Verfahren umfasst das Losen des trockenen Amplifikationsgemisch in einem Puffer mit Magnesiumionen und dann der Zusatz von Primer und zu analysierender DNA-Probe.
EP-A2-1 374 827 offenbart Verfahren zur Stabilisierung von trockenen und halbtrockenen Gemischen mit PCR-Enzymen und Reagenzien sowie Kits mit diesen Trockenmischungen Auch bei Kühlraumtemperaturen sind diese Gemischen nur über vergleichsweise kurze Zeiträume haltbar
Tomlinson JA et al beschreiben in Appl. Environ. Microbiol. (2005) 71 (11 ) 6702-10 einen Reagenziensatz, um im Feldversuch einen Krankheitserreger nachzuweisen. Sie beschreiben unter anderem Reaktionsgefäße, die bei Raumtemperatur lagerfähige lyophilisierte Echtzeit-PCR-Reagenzien enthalten; die Langzeitstabihsierung von PCR-Rea- genzmischungen durch Trehalose und einen Kit mit internen PCR-Kontrollen für Pflanzen- DNA, die den Erfolg der DNA-Extraktion belegen sollen Die Gefäße enthalten genug Reagenzien für 10 PCR- Versuche, wobei vor den Versuchen Wasser zuzusetzen ist. Klatser PR et al offenbaren in J. Clin. Microbiol. (1998) 36 (6) 1799, Figur 2 die
Langzeitstabilisierung von PCR-Reagenzmischungen durch Trehalose.
Ramachandran S et al beschreiben in IEEE (2006), Proceedings of the Ist Distπ- buted Diagnosis and Home Healthcare (D2H2) Conference, Arlington, Virginia, USA, April 2-4, 2006 in dem Artikel Dry-reagent storage for disposable lab-on-a-card diagnosis of enteric pathogens Untersuchungen zur Stabilisierung von PCR-Reagenzien mittels Trehalose Die Reagenzien befinden sich in einer mikrofluidischen Karte, wobei die Trehalose die Bildung von Pπmer-Dimeren bei der Lagerung verhindert (a.a O Seite 18, r. Spalte)
Dieser Stand der Technik stellt sich als Problem dar Nachteilig am Stand der Technik ist insbesondere, dass trotz aller Maßnahmen die in den Gefäßen für die PCR aktiv vorhandenen DNA-Mengen schwanken, selbst wenn in den Gefäßen gleiche Mengen DNA vorgelegt wurden. Dies liegt vermutlich daran, dass die PCR-Reagenzien, Desoxy(rιbo)nukleotιdtrιphosphate, Pπmer-Oligonukleotide und Matrizen-RNAs oder - DNAs entweder einzeln oder im Gemisch zusammen mit den Spezialsubstanzen oder Stabilisatoren (unspezifische DNA, Gelatine, Kollagen, Glucose, Innulm, Maltose, Mannitol, Dextrane, Trehalose, Sucrose und andere Disacchande, THESITt®, Polyethlyenglycol, Polyvinylpyrrolidon, TRITON-X 100®, TWEEN-20®, Rinderserum- albumin (BSA), Phycoll, Puffersalzen wie Tris-HCI, KCl, DTT, etc.) in den Gefäßen durch Lyophilisierung getrocknet werden. Derart getrocknete PCR-Gemische sind stark hygroskopisch und verlieren an Aktivität und Wirksamkeit bei längerer Lagerung aufgrund der Feuchtigkeitsaufnahme. Dieser Effekt wird zudem verstärkt durch den Zusatz von Stabilisatoren wie Kollagen oder Gelatine. Erfolgt die Lyophilisierung aber ohne Beisein leimbildender Substanzen wie Kollagen oder Gelatine, bilden sich Flocken der PCR-Rea- genzien, die in den Gefäßen wandern können, so dass mit vorbereiteten Gefäßen keine quantitativen Bestimmung zulassen.
Es besteht deshalb Bedarf an einem PCR-Reagenzienkit, der besonders für einen sporadischen Probenanfall geeignet ist, keine besonderen Geräte erfordert und in allen Labors sofort und ohne besondere Vorbereitungen standardmäßig von einer geschulten Person wie einer chemisch-technischen Assistentin für quantitative und analytische Untersuchungen verwendet werden kann. Es ist weiter Aufgabe der Erfindung, die Probleme des Stands der Technik zu beheben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Verpackungseinheit mit vorbereiteten Reaktionsgefäßen nach Anspruch 1 und das erfindungsgemäße Verfahren nach Anspruch 16. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind den Unteransprüchen zu entnehmen.
Die erfindungsgemäße Verpackungseinheit für die Durchführung einer Kettenpoly- merasereaktion für analytische, diagnostische und technische Zwecke, umfasst einen Satz bezeichneter trockener Reaktionsgefäße in Lagerform mit einer Reihe bekannter Mengen an Primer-Oligonukleotiden, die nach Zugabe von geeigneten Reagenzien, Enzym und DNA- oder RNA-Probe in einer Kettenpolymerasereaktion eine Amplifikation der Zielsequenz starten; einen Satz bezeichneter trockener Reaktionsgefäße in Lagerform mit einer Reihe bekannter Mengen an Primer-Oligonukleotiden und Referenznuklein- säure, die nach Zugabe fester Mengen an Flüssigkeit eine Konzentrationsreihe der Re- ferenznukleinsäure ergeben, wobei die Referenznukleinsäure die Zielsequenz enthält. Die beiden Sätze an bezeichneten trockenen Reaktionsgefäßen in Lagerform sind erfindungsgemäß so hergestellt, dass in den Reaktionsgefäßen jeweils wässrige Lösungen bekannter Mengen an Primer-Oligonukleotiden mit und ohne Referenznukleinsäure nur in Gegenwart von 1 bis 5 mMol/L Trehalose unter Umgebungsdruck bei einer Temperatur von 5 bis höchstens 30 Grad Celsius über Raumtemperatur eingetrocknet werden, so dass das resultierende Pellet vollkommen trocken, aber nicht hygroskopisch ist. In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung sind die beiden Sätze an bezeichneten trockenen Reaktionsgefäßen in Lagerform so hergestellt sind, dass in den Reaktionsgefäßen jeweils wässrige Lösungen bekannter Mengen an Primer-Oligonukleo- tiden mit und ohne Referenznukleinsäure nur in Gegenwart von 1 bis 5 mMol/L Trehalose bei Raumtemperatur unter vermindertem Umgebungsdruck von 0.1 bis 0.3 Bar schonend eingetrocknet sind und zwar so, dass das resultierende Pellet vollkommen trocken, aber nicht hygroskopisch ist, und die Trehalose nicht kristallisieren kann. Der Stand der Technik lehrt regelmäßig ein Lyophilisieren der Oligonukleotid- primer oder der Referenznukleinsäure, um deren Stabilität zu gewährleisten. Das Lyophilisieren von Nukleinsäuren oder Oligonukleotiden führt aber regelmäßig zu Flusen, so dass keine lagerfähigen Reaktionsgefäße erhalten werden. Auch bewirkt das „aktive Trocknen" oder Lyophilisieren von Puffern oder Amplifikationsgemischen regelmäßig Oberflächen- reaktionen. Es bilden sich mit den hydroxy- und anderen sauerstoffhaltigen Gruppen auf der Wand der Reaktionsgefäße enge Wasserstoffbrücken, wobei selbst Nukleinsäuren partiell unlöslich werden. Es ist dann notwendig, die Nukleinsäuren und Oligonukleotide in einem eigenen Schritt wieder von den Oberflächen abzulösen. Daher werden den Trockenlösungen im Stand der Technik auch hydroxylhaltige, wasserstoffbrückenbildende Moleküle wie unspezifische DNA, Gelatine, Kollagen, Glucose, Innulin, Maltose, Mannitol, Dextrane, Trehalose, Sucrose und andere Disaccharide, Thesit®, Polyethlyenglycol, Polyvinylpyrrolidon, Triton-X 100®, Tween-20®, Rinderserumalbumin (BSA), Phycoll, und so weiter zugesetzt, um die Nukleinsäuren und die Oligonukleotide in den vorgesehenen sehr geringen Konzentrationen zu „stabilisieren" und das Pellet auf der Gefäßwandung zu halten. Da derartige Pufferlösungen langsam und ungenügend trocken, werden diese Lösungen regelmäßig lyophilisiert, was zu hygroskopischen Pellets führt, in denen dann wiederum die Nukleinsäuren und Primer-Oligonukleotide nicht stabil sind. Die Erfinder haben entdeckt, dass ein Trocknen bei leicht erhöhter Temperatur in Gegenwart nur einer geringer Konzentration Trehalose zu sehr viel besseren Ergebnissen führt. Zu viel Trehalose oder anderer Puffersalze bewirken beim Trocknen aber eine Flockenbildung. Bei einer Trocknung unter erhöhter Temperatur über 1 bis 4 Stunden bildet sich erfindungsgemäß aber ein glasharte, auf der Oberfläche der Gefäßwandung fest anhaftende Trehaloseschicht, in der die Primer-Oligonukleotide und/oder die Referenznukleinsäure eingebunden sind. Nur bei einer derartigen Trocknung verdrängt die Tre- halose die Wassermoleküle aus den Wasserstoffbrücken derart, dass die Nukleinsäuren und Oligonukleotide in den nötigen, sehr geringen Mengen stabil sind.
Die Erfindung liegt weiterhin in der Kombination von gleichartig hergestellten Reaktionsgefäßen mit Primer-Oligonukleotiden beziehungsweise Referenznukleinsäure. Es ist überraschend, dass sogar eine so geringe Kopienzahl der Zielsequenz von 100 oder 1000 stabil ist, wird die wässrige Lösung der Referenznukleinsäure nur in Gegenwart von Trehalose eingetrocknet. Da die Reaktionsgefäße mit den Primern und der Referenznukleinsäure gleich hergestellt sind, ist eine absolute Vergleichbarkeit zwischen Probe und Referenz gegeben. Eine bevorzugte Ausführungsform liegt in einer Verpackungseinheit mit den genannten bezeichneten Reaktionsgefäßen, wobei das Volumen der wässrigen Lösungen in den Reaktionsgefäßen vor dem Eintrocknen 1 bis 25 μl. Die Konzentration der Primer liegt zwischen 0,1 und 100 μMol/L bei 1 bis 5 mMol/L Trehalose. In den Reaktionsgefäßen mit der Referenznukleinsäure ist die Zielsequenz bevorzugt in einer Menge von 10 bis 100 000 Kopien enthalten und zwar als genomische DNA oder Plasmid. Es kann auch ein Amplifikat verwendet werden. Es hat sich aber herausgestellt, dass Amplifikate unter diesen Bedingungen sehr viel weniger stabil sind. Vermutlich wird bei Amplifikaten regelmäßig eine Exonukleaseaktivität mit eingeführt. Die Kopienzahl pro Reaktionsgefäß beträgt bevorzugt 100 bis 5 000.
Eine weitere Ausführungsform betrifft Reaktionsgefäße für eine Hot-Start-PCR. Hierzu werden die eingetrockneten Primer oder die Referenznukleinsäure mit einem Kohlenwasserstoffwachs überdeckt, das bei 57 Grad Celsius schmilzt und in der wässrigen Lösung nach oben floatet. Hierdurch wird verhindert, dass Primer und Nuklein- säuren bereits bei niedrigeren Temperaturen miteinander hybridisieren. Der gleiche Effekt kann zwar auch durch Hot-Start-Polymerasen erreicht werden, die erst bei Temperaturen über 50 Grad Celsius aktiv werden. Hot-Start-Polymerasen sind aber wesentlich teurer als herkömmliche DNA-Polymerasen und Reverse Transkriptasen. Die Schicht mit dem hochschmelzenden Kohlenwasserstoffwachs schützt zudem das darunter liegende Pellet mit den Primern und/oder der Referenznukleinsäure vor Nebelfeuchtigkeit.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind in dem Kit Reaktionsgefäße vorhanden, in denen räumlich getrennt Primer-Oligonukleotide und Referenznukleinsäure in Gegenwart von Trehalose so auf die Gefäßwand aufgetrocknet sind, dass nach Zugabe der wässrigen Lösung mit den weiteren Reagenzien für die Kettenpolymerasereaktionen Primer-Oligonukleotide und Referenznukleinsäure in der wässrigen Lösung gelöst sind.
Aus praktischen Gründen sind die Reaktionsgefäße bevorzugt als Vertiefungen einer Mikrotiterplatte ausgebildet. Mikrotiterplatten werden im Handel üblicherweise als Platten mit 24, 48, 96, 192 und 384 Vertiefungen angeboten. Die Menge der beiden Primer in den Reaktionsgefäßen ist bevorzugt auf 7,5 pMol
(2,5pmol bis 15pmol) normiert und die Menge an Referenznukleinsäure auf 100 oder 1000 Kopien der Zielsequenz. In der ersten Phase der Amplifikation ist nämlich die Matrizenmenge (Zielsequenz) begrenzt und die Wahrscheinlichkeit, dass sich Matrize, Primer und Polymerase treffen, suboptimal, während in der dritten Phase der Amplifi- kation die Menge der Produkte (DNA, Pyrophosphat, Monophosphatnukleotide) derart ansteigt, dass es zur Hemmung durch diese kommt, häufiger Produktfragmente miteinander hybridisieren, die Substrate langsam verbraucht werden und letztlich die Poly¬ merasen und Nukleotide durch die Hitze langsam zerstört werden. Ein exponentieller und somit bei Verwendung von Fluoreszenzen für die Realtime-PCR quantifizierbarer Anstieg tritt nur in der Phase dazwischen auf Exponentiell bleibt eine Kettenpolymerasereaktion bei 12 bis 400 Ausgangskopien für ca 30 Zyklen, bei 200 bis 3200 für 25 Zyklen und bei anfänglich 3000 bis 50 000 für höchstens 20 Zyklen Um immer am Anfang der exponentiellen Phase messen zu können, wird häufig der CT-Wert (Threshold Cycle = "Schwellenwert-Zyklus") bzw der Cp-Wert (Crossing Point) verwendet, der den Zyklus beschreibt, an dem die Fluoreszenz erstmalig signifikant über die Hintergrund-Fluoreszenz ansteigt
Daneben kann die Verpackungseinheit enthalten ein oder mehrerer folgender Puffer- und Reaktionslosungen, zum Beispiel DNA- oder RNA-Extraktionslosung, Proteιnase-K-Losung, Gelladepuffer, Nukleotid- und Amplrfikationspuffer (MasterMix), DNA-Polymerase oder reverse Transkriptase Da aber kommerziell höchst ausgereifte und für alle möglichen Zwecke optimierte Amplifikationsgemische in fertiger Form zur Verfugung stehen, wie zum Beispiel der AmpliTaqGold® MasterMix von Roche Molecular Systems, Ine, werden die Anwender den bisher verwendeten Gemischen weiter vertrauen wollen, so dass die letztgenannte Option - einschließlich MasterMix - hier nur aus der Gründen der Vollständigkeit erwähnt ist
Eriindungsgemaß befinden sich nur Pπmer-Oligonukleotide und Referenznuklein- saure auf der Innenwand des Reaktionsraums beziehungsweise des Reaktionsgefaßes und zwar eingebettet in einem Film aus Trehalose. Trehalose (auch Mykose genannt) ist ein nicht-reduzierender Zweifachzucker, der aus zwei α-1 ,1 -glykosidisch verknüpften D- Glucose-Molekulen besteht, die mit Proteinen und Nukleotiden Wasserstoffbrucken eingehen können, siehe Colaco C et al (1992) in Bio/Technology 10, 1007-101 1 Trehalose ist daher ein starker PCR-Enhancer, der in Losung die Schmelztemperatur absenkt und andererseits die Taq-DNA-Polymerase thermisch stabilisiert (Spiess AN et al (2004) Chnical Chemistry 50(7), 1256-1259) Es wird ferner gelehrt, in einer Hot-Start- PCR einen Teil der Reaktionskomponenten in Gegenwart von Trehalose einzutrocknen und mit einem Wachs, das bei ca 57°C schmilzt, zu ummanteln (siehe Kaijalainen et al (1993), Nucleic Acids Res , 21(12) 2959-2960) Die in dem Wachstropfen eingebetteten Reaktionskomponenten werden dann zu den anderen Reaktionskomponenten des PCR- Ansatzes erst nach Erreichen höherer Temperaturen und Schmelzen des Wachsuber- zuges freigesetzt, wodurch ein Mispπming und ein zu früher Start der DNA-Polymerase- reaktion bei niedrigen Temperaturen vermieden werden kann Dieses Verfahren eignet sich aber nur in Bereichen mit sehr hohen Probenzahlen, da das Einbetten eines Teils der Reaktionskomponenten in einem Wachstropfen auf einem Polyethylenfaden kompliziert ist Eine Langzeit-Haltbarkeit von Pπmern und Referenznukleinsaure auf dem Polyethylenfaden wird nicht gelehrt Im Gegensatz zur Wachstropfen-Technologie werden erfindungsgemaß die Pπmer und/oder die Referenznukleinsaure in Gegenwart von Tre- halose auf die Wand des Reaktionsgefaßes getrocknet, bevorzugt im Boden des Gefäßes Die so zweckspezifisch vorbereiteten bezeichneten Probengefaße können dann durch Zugabe einer definierten Menge Wasser und Amplifikationsgemisch (DNA- Polymerase, dNTPs, Mg2+, Tπs-HCI-Puffer, pH 8,0) aktiviert werden Weitere Schritte sind nicht erforderlich, da die bezeichneten Probengefaße bereits die Primer und eine vorgegebene Kopienzahl der Zielsequenz in bekannten Mengen enthalten, geschützt von einer glasartigen Schicht Trehalose, die unter den Bedingungen einer Kettenpolymerase- reaktion aber völlig in Losung gehen Dabei wirkt die Trehalose vermutlich als Losungshilfe für die wenigen Kopien der Referenznukleinsaure Es ist zwar bekannt, in einem Reaktionsgefaß die für eine Enzymreaktion notwendigen Reagenzien vorzugeben und gegebenenfalls die Reagenzien auf die Oberflache des Probengefaßes aufzutrocknen Problematisch ist aber, dass beim Lyophihsieren oder Trocknen der Reagenzien diese unterschiedlich auskristallisieren und kleinteihge, nicht auf der Oberflache anhaftende Flocken bilden, die sich überall im Gefäß verteilen können Mochte man alle Reagenzien als Pellet am Boden eines Reaktionsgefaßes binden, so sind größere Salzmengen erforderlich Diese können zum einen nachfolgende enzymatische Reaktionen beeinträchtigen und zum anderen Wasser ziehen wodurch die Stabilität der einzelnen Reagenzien nicht mehr gewährleistet ist Erfindungs- gemaß wird dieses Problem so gelost, dass die überflüssige Reagenzien weggelassen werden und die Oligonukleotide und Referenznukleinsauren nur in Gegenwart physiologischer Mengen Trehalose auf einem inerten Substrat wie auf einer Polyethylenwand aufgetrocknet werden Es sind nicht alle Zucker geeignet, sondern nur solche, die beim Trocknen eine glasartige Schicht ergeben Gleichzeitig muss der Zucker in Gegenwart von Wasser rasch in Losung gehen Diese Anforderungen werden ideal gelost durch Trehalose Trehalose ist schwach hygroskopisch und besitzt einen vergleichsweise hohen Geher- und Glasubergangspunkt Trehalose schützt in der Natur die Zellen vor Verletzungen durch Eiskristalle bei Frost oder Tiefkuhlprozessen und auch bei Trockenheit In gewisser Weise ist Trehalose funktionell gleichartig zu Saccharose, besitzt aber andere Glaspunkt- und Stabihsierungs- eigenschaften Trehalose kommt naturlich in Pflanzen und Pilzen und auch in der Hamo- lymphe vieler Insekten vor Trehalose ist chemisch, thermisch und gegenüber Saure stabil und in Wasser rasch löslich, wobei bei niedrigen Temperaturen Trehalose weniger und bei höheren Temperaturen starker löslich ist als Saccharose Im Gegensatz zu den Disacchanden ist Trehalose aber nicht hydrolysierbar und sie kann nicht an einer Maillard- Reaktion mit den Aminosäuren oder Proteinen teilnehmen Auch besitzt sie eine hohe Klebkraft auf Kunststoffwandungen
Dadurch stehen Reaktionsgefaße für die Kettenpolymerasereaktion zur Verfugung, welche über Monate und Jahre bei Raumtemperatur gelagert werden können Die Reaktionsgefäße können bei Bedarf sofort verwandt werden. Damit können auch kleinere und mittlere Laboren mit diskontinuierlichem oder sporadischen Probenanfall analytische oder quantitative PCR-Analysen sofort und ohne größeren Aufwand manuell abarbeiten. Alle Primer und Referenznukleinsäuren liegen sofort verwendbar und exakt in den Reaktionsgefäßen vor und es müssen nur für die jeweilige Analysereaktion aufbereitete Proben-DNA oder -RNA und ein Mastermix (Amplifikationsgemisch) eingesetzt werden. Dies ist aber immer notwendig. Erfindungsgemäß entfallen die möglichen Fehler durch ein Falschansetzen oder Falschbestimmen der Mengen an Primer und Referenznukleinsäure. In einer bevorzugten Ausführungsform werden neben den erfindungsgemäßen Probengefäßen auch Gefäße mit einer „falschen" Nukleinsäure oder weiteren positiven und negativen Kontrollen ausgeliefert.
Gebrauchsfertige Master- oder Amplifikationsgemische können von einer Vielzahl Hersteller kommerziell erworben werden, mit unterschiedlichen natürlichen oder gentechnisch veränderten oder chemisch modifizierten DNA-Polymerasen oder reversen Transkriptasen. Typisch eingesetzte DNA-Polymerasen sind die Taq-DNA-Polymerase, die rekombinante trunkierte Form der Taq-DNA-Polymerase, der die 5'-3'-Exoaktivität (KlenTaq) fehlt, eine chemisch modifizierte Taq-DNA-Polymerase für eine Hot-Start-PCR, oder eine hochgenaue rekombinante thermostabile DNA-Polymerase aus Pyrococcus abyssii, etc. Die Mastermixe können mehrfach konzentriert sein und mit und ohne Magnesiumionen sein. Das heißt, die Magnesiumionen können auch aus einem eigenen Magnesiumstock (bspw. 25mM MgCI2) zugesetzt werden. Die Mastermixe können ferner Verbindungen enthalten, welche die Probendichte erhöhen, so dass die Produkte aus der Kettenpolymerasereaktion direkt in die Vertiefungen eines analytischen oder quantitativen Agarosegels gegeben werden können. Der Mastermix kann ferner Farbstoffe enthalten, entweder für eine Real-Time-PCR oder für Analyse auf dem Agarosegel.
BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Weitere Aufgaben, Vorteile und Lösungen der Erfindungen sind den nachfolgenden Beispielen und den Abbildungen zu entnehmen. Es zeigt:
Fig.1 eine Gelelektrophorese der Amplifikationsprodukte in bezeichneten Reaktionsgefäßen mit unterschiedlichen Proben und Referenznukleinsäuren gemäß der Erfindung
Fig. 2 eine Gelelektrophorese der Amplifikationsprodukte in bezeichneten Reaktionsgefäßen mit herkömmlich und erfindungsgemäß hergestellten Trockenproben der Referenznukleinsäure in einem Alterungsversuch von 6 Monaten bei 370C (Ver- gleich des Alterungsverhaltens); Fig. 3 eine Gelelektrophese der Amplifikationsprodukte in erfindungsgemäß hergestellten Reaktionsgefäßen bei unterschiedlichen Mengen an zugesetzter Haselnuss-DNA und Alterung über 6 Monate bei 370C (Sensitivitätsversuch).
EINGEHENDE BESCHREIBUNG VON AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG.
BEISPIELE
BEISPIEL 1 Test zum Nachweis von Haselnuss (Corylus Avellana) in Lebensmitteln
Die bezeichneten Reaktionsgefäße aus Polypropylen, in deren Vertiefungen (200 μl) bekannte Mengen spezifische Primer für die Haselnussbestimmung und als Referenznukleinsäure Haselnuss-Gesamt-DNA aufgetrocknet waren. Pro Reaktionsgefäß war dies eine Mischung aus 0,75 μl eines ersten Primers CaMAV-F3 mit einer Konzentration von 10μMol/L, 0,75 μl eines zweiten Primers Ca-R05 mit einer Konzentration von 10μMol/L, 2 μl einer 5 mMol/L Trehaloselösung und 0,5μl Wasser. Bei der Referenznukleinsäure waren dies 200 pg genomische Haselnuss-DNA, entsprechend 100 Kopien der Zielsequenz (Amplikonsequenz), sowie das 5- und 10-fache davon, jeweils in 0,5 μl gelöst und anstelle des Wassers der Lösung zugesetzt. Die Trockπuπgsdauer betrug 3 Stunden bei 40°C unter Umgebungsdruck. Die Trocknung erfolgte in einem trockenen Wärmeofen. Die Reaktionsgefäße wurden bis zur Verwendung verschlossen. Es wurden keine weiteren PCR-Sonden für eine RealTime-PCR aufgetrocknet, selbst wenn dies an dieser Stelle möglich wäre. Am Ende enthielten die vorbereiteten Vertiefungen der Mikrotiterplatte die für den Nachweis notwendigen Primer in der optimalen Menge für die Bestimmung von Haselnuss-DNA in der Probe bzw. für die Negativkontrolle (Überprüfung des Mastermixes auf Kontamination) und für die Extraktionskontrolle (Überprüfung der Extraktion auf Kontamination). Die rotmarkierten Reaktionsvertiefungen enthielten zusätzlich zu den Primern noch eine Haselnuss-DNA in niedrigen Mengen. Sie erlauben damit zum einen eine Positivkontrolle (Funktionsfähigkeit des Mastermixes), zum anderen eine Inhibitionskontrolle (Überprüfung des DNA-Isolats auf Inhibitoren) und zum dritten eine Quantifizierung der DNA in der Probe. Die DNA-Extraktion erfolgte nach dem CTAB-Ve rfahren (ISO 21571 , Foodstuffs -
Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Methods for nucleic acid extraction) mit anschließender Reinigung über eine Silicamatrix. Hierzu wurden die Proben homogenisiert, jeweils 1 g in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen einwogen, 10 ml CTAB-Extraktionslösung (2% Cetyltrimethyl- ammoniumbromid, 1 ,4 Mol/L NaCI, 0,02 M EDTA, 0,1 Mol/L Tris-HCI, pH 8,0) und 50 μl Proteinase-K (10 mg/ml) zugegeben, gemischt und für mindestens 90 Minuten bei 60 0C unter Schütteln inkubiert. Es wurde jeweils 1 ml Flüssigkeit abgenommen, diese 5 Minuten bei 17.000 x g zentrifugiert, dann hiervon 750 μl Überstand mit 300 μl Chloroform/Isoamylalkohol „Ready Red™ (MB Biomedicals, Illkirch, Frankreich) extrahiert. Es folgte eine weitere Zentrifugation von 5 Minuten bei 17.000 x g. 500 μl wässriger Überstand wurden dann mit 300 μl Isopropanol versetzt, gemischt und die ausfallende DNA 10 Minuten mit 17.000 x g pelletiert. Das Pellet wurde mit 500 μl 70%igen Ethanol gewaschen und erneut 5 Minuten durch 17.000 x g pelletiert. Der Überstand wurde abgenommen, das DNA-Pellet an Luft kurz trocknen gelassen und dann in 100 μl Wasser gelöst (eventuell durch Ultraschallbehandlung). Die weitere DNA-Aufreinigung erfolgt mit dem QIAquick® PCR-Purification-Kit von
Qiagen GmbH, Hilden, DE. Zu 100 μl DNA-Extrakt wurden 500 μl PB-Puffer (Qiagen GmbH) zugegeben, gut durchmischt, die Lösung auf die Säule gegeben, und die Säule 1 Minute bei 17.000 x g zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen, 750 μl PE-Puffer (Qiagen GmbH) auf die Säule gegeben und 30 Sekunden bei 17.000 x g zentrifugiert. Der Durchfluss wurde wieder verworfen und die Säule ohne weitere Beladung nochmals für 30 Sekunden bei 17.000 x g zentrifugiert. Das Auffangröhrchen wurde verworfen und die Säule in ein neues Reaktionsgefäß eingesetzt. Nach Beladen der Säule mit 250 μl EB- Puffer wurde diese 1 Minute bei 17.000 x g zentrifugiert, die Säule verworfen und das Eluat für die PCR verwendet. Alle Arbeiten erfolgten unter den üblichen Schutzmaß- nahmen. Zur Vermeidung von Verschleppungen empfiehlt es sich neben Schutzkleidung Mikropipetten mit Filterspitzen zu verwenden.
Die isolierte und gereinigte DNA wurde in den Reaktionsvertiefungen der Mikrotiterplatte amplifiziert. In den Vertiefungen wurden 12,5 μl DNA-Extraktion und 12,5 μl 2 x AmpliTaqGoId® Mastermix von Applied Biosystems eingesetzt. Es folgte eine Amplifikation der Zielsequenz auf einem Thermocycler (Eppendorf Mastercycler). Das Cycler-Profil im vorliegenden Fall betrug 10 Minuten bei 95°C als initiale Aktivierung der Polymerase, 15 Sekunden bei 95°C und 60 Sekunden bei 62°C für 45 Zyklen. Gegebenenfalls muss das vergebene Zeitwertprofil angepasst werden. 5μl Amplifikat (78- Basenpaar-Amplifikat) wurde dann nach Zugabe Ladepuffer auf einem 2,5%-igem Agarosegel (2 bis 4 μl Ethidiumbromid in TAE-Puffer) und üblicher Elektrophorese (10 Minuten, bei 3 bis 6 Volt/cm) analysiert und das Produkt auf einem Transilluminator sichtbar gemacht.
Für ein korrektes Analysenergebnis musste im vorliegenden Fall die positive Referenz mit der Zielsequenz eine Bande von 78 Basepaar Länge zeigen und die Negativkontrolle durfte keine Bande in diesem Bereich zeigen (siehe Fig. 1 ). War bei der Probe eine Bande in gleicher Höhe wie bei der Referenz zu sehen, so konnte die Reaktion als positiv gewertet werden. War keine Bande zu sehen, so konnte dies dann nur bedeuten, dass keine Haselnuss-DNA in der Probe vorhanden oder dass die Reaktion inhibiert war. Eine Inhibition konnte man ausschließen, wenn das gleiche DNA-Isolat in einer Vertiefung mit der Referenznukleinsäure eindeutig positiv war. War dies nicht der Fall, so lag eine Inhibition vor und das DNA-Isolat wurde dann in einer größeren Verdünnung amplifiziert. Auf der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte mit den genormten Mengen an
Referenz- und Kontrollnukleinsäuren sowie den optimierten Primer-Konzentrationen können so alle Fallkonstellationen auf einmal abgearbeitet werden, da der Fall, dass auch die Referenznukleinsäure in ungenügenden Mengen wegen Abbaus vorliegen, nicht vorkommt. Die Sequenzidentität des Amplifikats kann dann zusätzlich über eine Restriktion, bspw. mit BamH I überprüft werden. Im Fall der Haselnuss-DNA entstehen hierbei zwei Fragmente mit Längen von 20 pb und 58 pb. Die Nachweisgrenze für genomische Haselnuss-DNA liegt bei ca. 50 pg. Die vorliegende Reaktion war spezifisch gegenüber jeweils 100 ng DNA folgender Spezies: Erdnuss, Mandel, Cashewnüsse, Macadamianüsse, Walnüsse, Pekanüsse, Pistazien, Aprikose, Mais, Soja, Sellerie, Kohl, Apfelsine, Mandarine, Paranuss, Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Dinkel, Buchweizen (siehe Fig 1.)
Über den Intensitätsabgleich mit den Referenznukleinsäure ist ferner eine Quantifizierung der positiven Proben-DNA möglich.
BEISPIEL 2 Alterung und relative Sensitität bei Trocknung mit und ohne Trehalose Stresstests zur Beurteilung der Lagerfähigkeit/Stabilität/Ausbeute
Die bezeichneten Reaktionsgefäße wurden wie in Beispiel 1 hergestellt mit dem Unterschied, dass eine Anzahl Reaktionsgefäße mit Referenz-DNA in Gegenwart von Trehalose getrocknet wurde und eine Zahl an Reaktionsgefäßen mit Referenz-DNA ohne Trehalose. Die Reaktionsgefäße wurden dann 6 Monate bei 370C gelagert. Die Reaktionsgefäße wurden zur Amplifikation mit 12,5μl zweifach konzentrierten MasterMix (AmpliTaqGold® MasterMix) und 12,5μl Wasser gefüllt, verschlossen und in den PCR- Cycler (Eppendorf Mastercycler) gestellt. Das Cyclerrpofil war identisch mit dem Profil in Beispiel 1. Die anschließende Gelelektrophorese zeigte bei beiden Reaktionsgefäßen eine Bande bei 78 bp. Allerdings betrug die Intensität der Banden aus den Reaktionsgefäßen ohne Trehalose nur ca 1/3 der Bandenintensität der Amplifikate aus den Reaktionsgefäßen mit Trehalose (siehe Figur 2).
Dies bedeutet, dass bei längerer Lagerung die Reaktionsgefäße, in denen Primer und Referenz-DNA nicht in der Gegenwart von Trehalose getrocknet wurde, eine deutlich geringere Ausbeute in der Amplifikation liefern und somit eine geringere Sensitivität besitzen. BEISPIEL 3 Sensitivität nach Lagerung bei 37° C
Die bezeichneten Reaktionsgefäße wurden hergestellt wie in Beispiel 1 und 6
Monate bei 37°C gelagert. Die Reaktionsgefäße wurden zur Amplifikation mit 12,5μl zwei- fach konzentriertem MasterMix (AmpliTaqGold® MasterMix) und 12,5μl DNA-Isolat gefüllt, verschlossen und in den PCR-Cycler (Eppendorf Mastercycler) gestellt. Die DNA-Isolate enthielten Haselnuss-DNA in den Mengen 100 pg, 50 pg, 25 pg, 6,25 pg und keine
Haselnuss-DNA. Das Cyclerprofil war wiederum identisch mit dem Profil in Beispiel 1. Die
Gelelektrophorese zeigte eine Amplifikation eines 78bp langen Fragmentes in allen Reak- tionsgefäßen, ausgenommen dem, das keine Haselnuss-DNA enthielt (siehe Figur 3)
Werden die Primer in der Gegenwart von 5 mMol/L Trehalose getrocknet, behalten sie somit ihre Aktivität auch bei längerer Lagerung bei erhöhter Temperatur.
BEISPIEL 4 Anwendung in der einer Echtzeit-PCR Pro Reaktionsgefäß wurde eine Mischung aus 0,45ul eines ersten Primers
CaMAV-F3 mit einer Konzentration von 50uMol/L, 0,45ul eines zweiten Primers Ca-R05 mit einer Konzentration von 50uMol/L, 0,625ul einer Sonde CaMAV-SI mit einer Konzentration von 10uMol/L, 2ul einer 5mMol/L Trehaloselösung und 0,475ul Wasser. Bei der Referenznukleinsäure waren dies 200 pg genomische Haselnuss-DNA, entsprechend 100 Kopien der Zielsequenz (Amplikonsequenz) jeweils in 0,475 ul gelöst und anstelle des Wassers der Lösung zugesetzt. Die Trocknung erfolgte 3 Stunden bei 4O0C unter Umgebungsdruck in einem trockenen Wärmeofen. Die Reaktionsgefäße wurden danach mit einer Folie verschlossen und bis zur Verwendung dunkel gelagert.
Für die Amplifikation wurden 12,5p! Universal MasterMix® von Applied Biosystems und 12,5ul DNA-Isolat pro Reaktionsgefäß zugegeben und die Reaktionsgefäße in ein Realtime-PCR-Gerät (SDS 7500 von Applied Biosystems) gestellt. Amplifiziert wurde mit dem gleichen Temperaturprofil wie in Beispiel 1.
Als Matrize wurde ein Haselnuss-DNA-Isolat in verschiedenen Konzentrationen zugegeben. Die Kopienzahlen pro Reaktionsgefäß lagen dabei zwischen 20 und 100 000 Kopien. Jede Kopienzahl wurde in Triplikaten amplifiziert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I gezeigt: TABELLE 1
Echtzeit-PCR in erfindungsgemaß vorbereiteten Reaktionsgefaßen
Figure imgf000016_0001
Die erhaltenen Ct-Werte zeigen eine gute Lineantat über den gesamten Kopienzahlenbereich
BEISPIEL 5 Anwendung in einer Fluoreszenz-Endpunktbestimmung
Die erfindungsgemaßen Reaktionsgefaße sind so normierbar, dass sie eine PCR- Analyse durch einer Endpunktbestimmung erlauben Die sei hier für den Nachweis von Salmonellen-DNA beschrieben
25 g (ml) Lebensmittelprobe wurden in sterilen Stomacher-Beutel eingewogen, 1 10 (w/v) mit 225 ml gepufferten Peptonwasser verdünnt und 18 h bei 37°C vorgebrutet Es folgte eine selektive Vermehrung der Salmonellen Hierzu wurde 0,1 mL Vorbrut in ein Kulturrohrchen mit 10 ml RVS-Bouillon überfuhrt und 5 bis 6 h bei 42 0C inkubiert Für die DNA-Extraktion wurde 1 ml der selektiven Kultur 5 min bei 10 000 g zentπfugiert, der Überstand abgenommen, das Pellet in 0,2 ml 0,1 x TE-Puffer resuspendiert und 10 min auf 95°C erhitzt Nach Abkühlen der Probe wurde 5 min bei 14 000xg zentrifugiert und der Überstand mit der DNA direkt und in kleinen Verdünnungen in die PCR eingesetzt Für die PCR mit SYBR-Green-Fluoreszenzendpunkt-Bestimmung wurden die
Kavitaten einer MTB mit vorgetrockneten Pπmern bzw Referenz-DNA (PCRFast Salmonellen, Lot TSAL_39531 ) mit 12,5μl MasterMix (Power SYBR® Green PCR MasterMix, Applied Biosystems Nr 4367659) versetzt Dann wurden 12,5 μl der DNA- Isolate der Lebensmittelproben und der Verdünnungen zugegeben, die Streifen verschlossen und in den PCR-Thermocycler gestellt (STRATAGENE Mx 3005 P) Die Amphfikation erfolgte mit dem Temperaturprofil 10 mm bei 950C, gefolgt von 30 Zyklen mit 15 sec bei 95 °C und 60 sec bei 67 0C Die Messung der Fluoreszenz nach dem letztem Zyklus (R Last /Fluoreszenz- Endpunktbestimmung, Anregung Weißlicht einer Halogenlampe und Emissionsmessung bei 520 nm, keine Einheit) am Ende der Amplifikation gab folgende Werte.
TABELLE 2
Figure imgf000017_0001
PCR-Ansatz (Sondendetektion): Kavitäten mit vorgetrockneten Primern und Sonde (PCRFast Salmonellen, Lot RSAL_39239) wurden mit 12,5μl MasterMix (AmpliTaq Gold® PCR MasterMix, Applied Biosystems Nr. 4318739) versetzt. Dann wurden 12,5 μl DNA- Isolate der Lebensmittelproben zugegeben, die Streifen verschlossen und in den PCR- Thermocycler gestellt (STRATAGENE Mx 3005 P). Die Amplifikation erfolgte mit folgendem Temperaturprofil: nach 10 min. bei 95°C folgten 35 Zyklen mit 30 sec bei 950C, 45 sec bei 60 0C und 30 sec bei 72 °C. Die Messung der Fluoreszenzwerte (R Last, Anregung Weißlicht einer Halogenlampe und Emissionsmessung bei 520 nm, keine Einheit) am Ende der Amplifikation gab in der Endpunktbestimmung folgende Fluoreszenzwerte.
TABELLE 3
Figure imgf000018_0001
Die beiden Versuche zeigen, dass der Messabstand bei der Fluoreszenz- Endpunktbestimmung zwischen der Positiv- und Negativkontrolle bzw. den Proben jeweils so groß war, dass ohne Weiteres und ohne großen messtechnischen Aufwand zwischen der Gegenwart und Abwesenheit von Salmonellen in der Lebensmittelprobe unterschieden werden konnte. Für die Messung genügte die Anregung mit dem Weißlicht einer Halogenlampe und die Emissionsmessung bei 520 nm (ohne Einheit). Damit kann eine Salmonellen-Analyse mittels PCR in sehr einfach ausgestatteten Labors erfolgen. Als Reaktionsgefäße werden dann günstigerweise im relevanten Lichtwellenbereich transparente Gefäße verwendet, bevorzugt aus Polycarbonat.
Zusammenfassung
Mit den erfindungsgemäß vorbereiteten Reaktionsgefäßen sind somit molekularbiologische Lebensmittelanalysen nun einfach und standardisiert durchführbar. Es stehen also innovative Produkte zur Verfügung für den einfachen molekularbiologischen Nachweis von spezifischen DNA-Fragmenten in Lebensmitteln und Futtermitteln. Die vorbereiteten Reaktionsgefäße könnend adaptiert werden für alle relevante Parameter aus den Bereichen Allergene, GMO, Tierarten und Hygiene.
In den erfindungsgemäßen PCR-Reaktionsgefäßen sind nämlich die wichtigsten
Schlüsselreagenzien gebrauchsfertig in optimalen Mengen vorgelegt: Spezifische Primersequenzen sowie die erforderlichen artspezifischen Positivkontrollen. Es entfallen somit alle aufwendigen Pipettierschritte und Qualitätssicherungsmaßen zur Vermeidung eventuell auftretender Kontaminationen während der PCR-Durchführung. Die in den Reaktionsgefäßen enthaltenen artspezifischen DNA-Kontrollen ermöglichen die einwandfreie Überprüfung der PCR, wie die Mitführung einer Positivkontrolle (Über- prüfung der Funktionalität des Master-Mixes) und die Prüfung auf inhibitorische Effekte (Inhibitionskontrolle) in der extrahierten Proben-DNA. Gleichzeitig ermöglicht die Testanordnung auch die Negativkontrolle (Wasserkontrolle) und die Überprüfung einer kontaminationsfreien Extraktion (Extraktionskontrolle). Diese Kontrollen sind dem Analyten gleichgestellt und erlauben eine praxisnahe Inhibitionskontrolle der Matrix. Es muss nur mehr die DNA wird aus der Probe nach einem standardisierten
Probenaufarbeitungsprotokoll isoliert werden. Im Stand der Technik empfohlene und validierte DNA-Aufarbeitungskits stehen zur Verfügung und können der Verpackungseinheit beigelegt werden. Nach der Extraktion der DNA aus dem Probenmaterial sind für die Abarbeitung der PCR nur noch zwei Pipettierschritte notwendig: 12,5 ul der Proben- DNA sowie 12,5 ul doppelt konzentrierter MasterMix, der bereits Polymerase, Nukleotide, Magnesiumchlorid und Puffer in optimalen Konzentrationen enthält, werden in das Reaktionsgefäß pipettiert. Der Anwender entnimmt aus dem Testkit die hierfür benötigte Menge an Reaktionsgefäßen und lagert die nicht benötigten Reaktionsgefäße bequem wieder ein. Die Reaktionsgefäße sind bevorzugt übersichtlich in einem Rack analog einer Mikrotiterplatte angeordnet.
Der Test bzw. die Reaktionsgefäße mit den Reagenzien sind bis zu 2 Jahre bei 2 bis 10°C lagerbar. Die gekennzeichneten Reaktionsgefäße enthalten neben den Primem zusätzlich die Kontroll-DNA. Der MasterMix kann über führende Anbieter wie Applied Biosystems Inc. bezogen werden. Der Universal MasterMix ist an alle Parameter adaptiert, das heißt für die gesamte Produktlinie ist nur noch ein MasterMix erforderlich. Das reduziert den Arbeitsaufwand im Labor erheblich und macht die PCR sicherer und reproduzierbarer.
Das Temperatur- bzw. Cyclerprofil ist annähernd für alle Parameter identisch und in der Testkitbeschreibung vorgegeben. Dadurch können verschiedene Parameter gleichzeitig in einem Durchgang analysiert und bestimmt werden. Der Anwender ist in der Lage, selbst einen Makrochip zusammenzustellen (zum Beispiel gleichzeitiges Screenen der Allergene Soja, Haselnuss und Erdnuss oder mehrere GMO Parameter nebeneinander).
Die Detektion erfolgt in der Regel im Agarosegel mit Ethidiumbromid. Ausgewählte Parameter können auch in Echtzeit zur Abarbeitung im Blockcycler vorgesehen sein.
Folgende Parameter bieten sich unter anderem für den erfindungsgemäßen Testkit an: Lebensmittel-Allergene: Haselnuss, Mandel, Walnuss, Pekannuss, Paranuss, Cashew, Pistazie, Erdπuss, Weizen/Gerste/Roggen, Weizen, Sellerie, Senf, Sesam, Soja, Fisch, Lupine. Tierarten: Schwein, Rind, Wiederkäuer, Säugetier, Huhn, Pute, Ente, Geflügel, Schaf, Ziege, Pferd, Nager, Hund, Katze. GMO: Screen 35S, Screen nos, Roundup Ready Soja (RRS), Cauliflower Mosaic Virus (CMV), Mais MON810, Mais MON863, Mais BT176, Mais BT11 , Mais GA21 , Mais NK 603, Mais T25, Reis LL601 , Reis LL62. Hygiene: Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Campylobacter (jejuni, coli, lari), EHEC, Sta-phylococcus aureus, Bacillus cereus, Yersinia enterocolitica, Clostridium perfringeπs, Shigella flexneri.
Die Vorteile der erfindungsgemäßen Reaktionsgefäße sind: • sie Testsysteme sind lagerbar
Primer und artspezifische Positivkontrollen sind ready-to-use vorgelegt.
Kein Liquidhandling von Primer und Kontrollen erforderlich keine Kontaminationsgefahr mehr einfache Erweiterung auf neue Parameter und Produkte • völlige Standardisierung der PCR unabhängig von Probenaufarbeitung • mehrere Parameter gleichzeitig in einem Lauf möglich nur ein einziger Universal MasterMix für alle Parameter notwendig
Molekularbiologische Lebensmittelanalysen spielen eine immer wichtigere Rolle in der Qualitätssicherung. Mit der Methodik können spezifische DNA-Fragmente mittels der PCR bis zur Sichtbarmachung nachgewiesen werden. Ungelöste analytische Fragestellungen sind mit der DNA-Analyse heute eindeutig lösbar. Als aktuelle Beispiele sind zu nennen der spezifische Nachweis von Aprikosenkernen in Marzipan oder spezifische Nachweise von Allergie auslösenden Substanzen wie Senf oder Sellerie. Die PCR spielt bei der Identifizierung gentechnisch veränderter Lebensmittel eine genauso bedeutende Rolle wie der zunehmende pathogen-hygienische Bereich. So lassen sich pathogene Keime frühzeitig und rasch aufspüren. Lagerzeiten bis zur analytischen Freigabe werden dadurch erheblich verkürzt. Mit den erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßen ist die Standardisierung der PCR in allen Bereichen der Lebens- mittelwirtschaft und Untersuchungslaboratorien möglich.

Claims

01/12/07 19 GP100071 PCOO/UMBPATENTANSPRÜCHE
1. Verpackungseinheit oder Kit für die Durchführung einer Kettenpolymerasereaktion für analytische, diagnostische und technische Zwecke, umfassend einen Satz bezeichneter trockener Reaktionsgefäße in Lagerform mit einer
Reihe bekannter Mengen an Primer-Oligonukleotiden, die nach Zugabe von geeigneten Reagenzien, Enzym und DNA- oder RNA-Probe in einer Kettenpolymerasereaktion eine Amplifikation der Zielsequenz starten; einen Satz bezeichneter trockener Reaktionsgefäße in Lagerform mit einer Reihe bekannter Mengen an Primer-Oligonukleotiden und Referenznukleinsäure, die nach Zugabe fester Mengen an Flüssigkeit eine Konzentrationsreihe der Referenznukleinsäure ergeben, wobei die Referenznukleinsäure die Zielsequenz enthält, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Sätze an bezeichneten trocke- nen Reaktionsgefäßen in Lagerform so hergestellt sind, dass in den Reaktionsgefäßen jeweils wässrige Lösungen bekannter Mengen an Primer-Oligonukleotiden und/oder Referenznukleinsäure nur in Gegenwart von 1 bis 5 mMol/L Trehalose unter Umgebungsdruck bei einer Temperatur von 5 bis höchstens 30 Grad Celsius über Raumtemperatur eingetrocknet werden, so dass das resultierende Pellet vollkommen trocken, aber nicht hygroskopisch ist.
2. Verpackungseinheit oder Kit für die Durchführung einer Kettenpolymerasereaktion für analytische, diagnostische und technische Zwecke, umfassend einen Satz bezeichneter trockener Reaktionsgefäße in Lagerform mit einer Reihe bekannter Mengen an Primer-Oligonukleotiden, die nach Zugabe von geeigneten Reagenzien, Enzym und DNA- oder RNA-Probe in einer Kettenpolymerasereaktion eine Amplifikation der Zielsequenz starten; einen Satz bezeichneter trockener Reaktionsgefäße in Lagerform mit einer
Reihe bekannter Mengen an Primer-Oligonukleotiden und Referenznukleinsäure, die nach Zugabe fester Mengen an Flüssigkeit eine Konzentrationsreihe der
Referenznukleinsäure ergeben, wobei die Referenznukleinsäure die Zielsequenz enthält, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Sätze an bezeichneten trockenen Reaktionsgefäßen in Lagerform so hergestellt sind, dass in den Reaktions- gefäßen jeweils wässrige Lösungen bekannter Mengen an Primer-Oligonukleotiden und/oder Referenznukleinsäure nur in Gegenwart von 1 bis 5 mMol/L Trehalose bei Raumtemperatur unter vermindertem Umgebungsdruck von 0.1 bis 0.3 Bar schonend eingetrocknet werden, so dass das resultierende Pellet vollkommen trocken, aber nicht hygroskopisch ist.
3. Kit nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Volumen der wässrigen Lösungen in den Reaktionsgefäßen vor dem Eintrocknen 1 bis 25 μl ist und die Mengen an Primer zwischen 0,1 und 20 nMol/L
4. Kit nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei in den Reaktionsgefäßen mit der Referenznukleinsäure die Zielsequenz in einer Menge von 10 bis 10 000 Kopien enthalten ist, bevorzugt als genomische DNA, oder Plasmid.
5. Kit nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das trockene Pellet auf der Gefäßwand von einem Kohlenwasserstoffwachs überdeckt ist, das bei 57 Grad Celsius zu schmelzen beginnt und in wässriger Lösung nach oben floatet.
6. Kit nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei zudem Reaktionsgefäße vorhanden sind, in denen räumlich getrennt Primer-Oligonukleotide und Referenznukleinsäure in Gegenwart von Trehalose so auf die Gefäßwand aufgetrocknet sind, dass nach Zugabe der wässrigen Lösung mit den weiteren Reagenzien für die Kettenpolymerasereaktionen Primer-Oligonukleotide und Referenznukleinsäure in der wässrigen Lösung gelöst sind.
7. Kit nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Reaktionsgefäße Vertiefungen einer Mikrotiterplatte sind.
8. Kit nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Menge der beiden Primer in den Reaktionsgefäßen auf 7,5 bis 15 pMol normiert ist und die Menge an
Referenz-Nukleinsäure auf 100 oder 1000 Kopien der Zielsequenz.
9. Kit nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, zudem enthaltend ein oder mehrere folgender Puffer- und Reaktionslösungen: DNA- oder RNA-Extraktionslösung, Proteinase-K-Lösung, Gelladepuffer, Nukleotid- und Amplifikationspuffer, DNA-
Polymerase, AmpliTaqGold MasterMix®.
10. Kit nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Reaktionsgefäße für eine RealTime-PCR markierte FRET-Sonden wie Hybridisierungsonden (LightCycler®- Sonden), Hydrolyse-Sonden (TaqMan®-Sonden), Molecular Beacons, Scorpion-
Primer oder Lux®-Primer enthalten.
11. Kit nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, der vorbereitet ist zur Durchführung einer PCR in Gegenwart eines inkalierenden Fluoreszenzfarbstoffs, der mit der gebildeten Doppelstrang-DNA einen DNA-Fluoreszenzfarbstoff-Komplex bildet, welcher über seine spezifische Fluroeszenzemission quantifizierbar ist
12 Kit nach Anspruch 11 , wobei der fluoreszierende Farbstoffe ausgewählt ist aus der Gruppe SYBR-Green®, SYBR Gold, SYBR Safe, YO (Oxazole Yellow), TO
(Thiazole Orange) und PicoGreen®.
13 Kit nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Mengen an Primer-Ohgonukleotiden und Referenznukleinsaure mit der Zielsequenz in dem Satz bezeichneter trockener Reaktionsgefäße in Lagerform so vorgelegt sind, dass nach einer vorbestimmten
Zahl an PCR-Zyklen in Gegenwart des interkalierendes Fluoreszenzfarbstoff eine visuell oder einfach bestimmbare Zielgröße für die spezifische Fluoreszenzemission des DNA-Fluoreszenzfarbstoff-Komplexes erhalten wird.
14 Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei die Reaktionsgefaße transparent sind für die Absorptions- und Emissionsfrequenz des interkaherenden Fluoreszenzfarbstoffes
15 Verfahren zur Durchfuhrung einer Kettenpolymerasereaktion für analytische, diagnostische und technische Zwecke, umfassend die Verwendung eines Satzes bezeichneter trockener Reaktionsgefäße in Lagerform mit einer Reihe bekannter Mengen an Pπmer-Oligonukleotiden, die nach Zugabe von geeigneten Reagenzien, Enzym und DNA- oder RNA-Probe in einer Kettenpolymerasereaktion eine Amplifikation der Zielsequenz starten; eines Satzes bezeichneter trockener Reaktionsgefaße in Lagerform mit einer Reihe bekannter Mengen an
Referenznukleinsaure und Primer-Oligonukleotiden, die nach Zugabe fester Mengen an Flüssigkeit eine Konzentrationsreihe der Referenznukleinsaure ergeben, wobei die beiden Sätze an bezeichneten trockenen Reaktionsgefaßen in Lagerform so hergestellt sind, dass in den Reaktionsgefäßen jeweils wässrige Losungen bekannter Mengen an Pπmer-Oligonukleotiden mit und ohne
Referenznukleinsaure im Wesentlichen ausschließlich in Gegenwart von 1 bis 5 mMol/L Trehalose unter Umgebungsdruck bei einer Temperatur von 5 bis höchstens 30 Grad Celsius über Raumtemperatur eingetrocknet werden, so dass das resultierende Pellet vollkommen trocken, aber nicht hygroskopisch ist
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Mengen an Primer-Ohgonukleotiden und Referenznukleinsaure, welche die Zielsequenz enthält, in dem Satz bezeichneter trockener Reaktionsgefäße in Lagerform mit bekannten Mengen an Pπmer- Oligonukleotiden und Referenznukleinsaure so vorgelegt werden, dass in Gegenwart einer bekannten Menge an inkalierendem Fluoreszenzfarbstoff und einer vorbestimmten Zahl an PCR-Zyklen eine visuell oder einfach bestimmbare Zielgröße für die spezifische Fluoreszenzemission des DNA-Fluoreszenzfarbstoff- Komplexes erhalten wird, und Bestimmen nach Durchführen der vorbestimmten Zahl an PCR-Zyklen, ob die spezifische Fluoreszenzemission des DNA-
Fluoreszenzfarbstoff-Komplexes in dem Reaktionsgefäß mit der Probe und in dem Reaktionsgefäß mit der Referenznukleinsäure die Zielgröße erreicht.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Bestimmung der spezifischen Fluoreszenzemission des DNA-Fluoreszenzfarbstoff-Komplexes mit einem mobilen Fluoreszenzmessgerät erfolgt.
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