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Gebiet der
Erfindung
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Die
nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie
gut studierten Beobachtungsebenen sind die Gene selbst, die Übersetzung
dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im
Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet
wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten
Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung
der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem
veränderten
Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Detektion des
Methylierungszustandes genomischer DNA Proben.
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5-Methylcytosin
ist die häufigste
kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt
beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim
genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung
von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist
daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch
nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5- Methylcytosin das
gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus
geht bei einer PCR-Amplifikation
die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen,
vollständig
verloren.
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Eine
relativ neue und die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode
zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin
beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das
nach anschließender
alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem
Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin wird
dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die
ursprüngliche
DNA so umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch
sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden
kann, jetzt durch „normale" molekularbiologische
Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation
und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann.
Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll
ausgenutzt wird.
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Die
Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zechnigk,
M. et al., Eur. J. Hum. Gen. 1997, 5, 94–98) nur in der Forschung angewendet.
Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach
einer Bisulfit-Behandlung amplifziert und entweder komplett sequenziert
(Olek, A. und Walter, J., Nat. Genet. 1997, 17, 275–276) oder
einzelne Cytosin-Positionen durch eine „Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo, M. L.
und Jones, P. A., Nucl. Acids Res. 1997, 25, 2529–2531, WO-Patent
9500669) oder einen Enzymschnitt (Xiong, Z. und Laird, P. W., Nucl.
Acids. Res. 1997, 25, 2532–2534)
nachgewiesen.
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Zudem
ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek
et al., WO 99/28498).
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Weitere
Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bisulfit-Technik zum
Methylierungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind: Xiong,
Z. und Laird, P. W. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2532; Gonzalgo, M.
L. und Jones, P. A. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2529; Grigg, S.
und Clark, S. (1994), Bioassays 16, 431; Zeschnik, M. et al. (1997),
Human Molecular Genetics 6, 387; Teil, R. et al. (1994), Nucl. Acids
Res. 22, 695; Martin, V. et al. (1995), Gene 157, 261; WO 97/46705,
WO 95/15373 und WO 95/45560.
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Der
Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch
ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer
Agarose-Matrix einschließt,
dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert
nur an einzelsträngiger
DNA) verhindert und alle Fällungs-
und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek, A.
et al., Nucl. Acids. Res. 1996, 24, 5064–5066). Mit dieser Methode
können einzelne
Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht.
Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare
Länge untersucht,
eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen
Methylierungsanalysen ist nicht möglich.
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PCR
Reaktionen (Polymerase Kettenreaktionen) werden normalerweise mit
zwei spezifisch bindenden Primern durchgeführt, wobei einer komplementär zum (+)-Strang,
der andere komplementär
zum (–) Strang
des zu amplifizierenden Templates ist. Das Ziel einer solchen Amplifikation
ist es, ein bestimmtes Fragment der Templat DNA zu vervielfältigen,
das in der Regel genau definiert und in seiner Basensequenz zum großen Teil
oder vollständig
bekannt ist.
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Es
sind auch PCR Reaktionen bekannt, die mehr als zwei verschiedene
Primer einsetzen. Meist dienen sie zur Amplifikation mehrerer, ebenfalls
wenigstens zum großen
Teil in ihrer Basensequenz bekannter Fragmente gleichzeitig in einem
Gefäß. Auch
in diesem Fall binden die eingesetzten Primer spezifisch an bestimmte
Abschnitte der Templat DNA.
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Ein
Verfahren zur relativen Quantifizierung der Methylierung von Cytosin
Basen in amplifizierten Nukleinsäurefragmenten
wird in
DE 19935772
A1 beschrieben.
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In
DE 19934084 A1 und
in „An
economic method for the fluorescent labelling of PCR fragments", Schuelke, M., Nature
Biotechnology (2000) 18, 233–234
werden sogenannte „Nested-PCR-Verfahren" beschrieben, bei
denen Domänenprimer
und jeweils nachfolgend markierte Universalprimer verwendet werden.
Letztere haben die möglichst
kostengünstige
Markierung von PCR-Produkten zum Ziel, da nur ein Primer markiert
werden muss.
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Eine
Beschreibung von PCR Reaktionen mittels Primern, die auf einer Oberfläche immobilisiert
werden findet sich in „Solid
phase DNA amplification: characterisation of primer attachment and
amplification mechanisms",
Adessi, C., Nucleic Acids Res. (2000) 28 (20) e87.
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In „Solid
phase PCR with hybridisation and time-resolved fluorometry for detection
of HLA-B27", Sjöroos, M.,
Clinical Chemistry (2001) 47, 498–504 werden Hybridisierungen
mit entsprechenden Sonden zum Nachweis der an einer Festphase erzeugten
Amplifikate durchgeführt.
Nachteilig ist jedoch, dass hierbei verhältnismäßig viel DNA-Probe benötigt wird.
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Die
von der Firma Epigenomics AG entwickelte Hybridisierungskammer (
DE 19952723 ) führt ein
periodisches Denaturieren der DNA-Probe durch, ohne eine Ablösung bereits
an Oligomere hybridisierter DNA zu erzeugen. Dadurch, daß die DNA-Probe
vor dem Aufbringen auf den Array thermisch denaturiert und dann plötzlich abgekühlt wird,
liegt sie bei Kontaktierung mit dem Array überwiegend in einzelsträngiger Form
vor. Damit steht ein großer
Teil der ansonsten doppelsträngigen
DNA-Probe für
Hybridisierungen mit dem Oligomer-Array zur Verfügung. Durch Hin- und Herpumpen
der Probenflüssigkeit
stellt die Vorrichtung sicher, daß dieser Vorgang so häufig wiederholt
wird, bis ein ausreichender Teil der doppelsträngigen DNA-Probe an die Oligomere
des Arrays hybridisiert hat. Zugleich findet durch diesen Prozeß ein Mischen
in der Kammer während
der Hybridisierungsphase statt.
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Eine Übersicht über den
Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung läßt sich
aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics
(Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999), der dort
zitierten Literatur und dem US-Patent 5994065 über Methoden zur Herstellung
von festen Trägern
für Zielmoleküle wie Oligonukleotide
entnehmen. Neben Desoxyribonucleic Acids (DNA) können auch Peptide Nucleic Acids
(PNA) auf der Oberfläche
von Oligomer-Arrays fixiert werden.
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In
situ Amplifikationen sind in der Literatur zahlreich beschrieben
(Tsongalis, G. J. und Silvermann L. M., Ann. Clin. Lab. Sci 1994,
24, 436–440).
In situ Reaktionen sind jedoch bisher dadurch gekennzeichnet, dass
PCR und Hybridisierung in getrennten Reaktionsgefäßen erfolgen.
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Genomische
DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zell-, Gewebe- oder
sonstigen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet
sich in Referenzen wie Fritsch und Maniatis eds., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 1989.
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Kodierte
Partikel (Beads) finden schon seit einiger Zeit in sehr unterschiedlichen
Gebieten ihre Anwendung. Farbkodierte Beads sind zur parallelen
Diagnostik von T- und B-Zellen eingesetzt worden (Baran und Parker,
Am. J.
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Clin.
Pathol. 1985, 83, 182–9).
Mit radiaoaktivem Indium versetzte Beads sind als Indikatoren der
Motilität
des gastrointestalen Trakts verwendet worden (Dormehl et al Eur.
J. Nucl. Med. 1985, 10, 283–5).
Firmen wie Luminex oder Illumina, die mit farbkodierten Kunststoffkügelchen
hoch-parallele Diagnostik betreiben, verwenden 100 ver schieden farbmarkierte
Beads, an denen entsprechend viele verschiedene Sonden angebracht
werden können.
Dadurch können
in einer Reaktion 100 verschiedene Parameter abgefragt werden, was z.B.
100 verschiedene diagnostische Tests sein könnten.
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Die
vorliegende Erfindung soll ein Verfahren bereitstellen, welches
sich zum Nachweis von DNA-Polymorphismen und Cytosin-Methylierungen
in genomischen DNA-Proben besonders eignet. Zur Durchführung des
Verfahrens soll bevorzugt eine Vorrichtung zur Analyse von DNA Proben
verwendet werden, die sowohl die Amplifikation von DNA Fragmenten
und die Analyse von DNA-Polymorphismen und Cytosin-Methylierungen in
einem Gefäß mittels
immobilisierter Primer und Sonden ermöglicht.
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Beschreibung
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Beschrieben
wird ein Verfahren zum Nachweis von DNA-Polymorphismen und Cytosin-Methylierungen,
dadurch gekennzeichnet, dass die folgenden Schritte ausgeführt werden:
Im
ersten Verfahrensschritt wird die zu untersuchende DNA aus einer
Probe gewonnen.
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Die
zu analysierende genomische DNA wird bevorzugt aus den üblichen
Quellen für
DNA erhalten, wie z. B. Zelllinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit,
in Paraffin einbettetes Gewebe, beispiels weise Gewebe von Augen,
Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische
Objektträger
und alle möglichen
Kombinationen hiervon. Die DNA kann auch bereits aufgearbeitet oder isoliert
vorliegen.
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Die
zu untersuchende DNA wird besonders bevorzugt nach der Gewinnung
chemisch und/oder enzymatisch behandelt.
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Die
chemische Behandlung der eingesetzten DNA erfolgt bevorzugt mit
Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit) derart, dass alle nicht an
der 5-Position der Base methylierten Cytosine so verändert werden,
dass eine hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche
Base entsteht, während
die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben.
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Die
enzymatische Behandlung erfolgt bevorzugt mit methylierungssensitiven
Restriktionsenzymen, die zwischen methylierter und nicht methylierter
DNA unterscheiden können.
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Im
zweiten Verfahrensschritt wird die zu untersuchende DNA in einer
Polymeraseraktion amplifiziert, wobei ein Primer in Lösung vorliegt
und ein Primer an die Oberfläche
einer Festphase gebunden ist und wobei mindestens einer der Primer
aus zwei Domänen
besteht, wobei die am 3'-Ende befindliche
Domäne
an die zu untersuchende DNA hybridisiert, während die am 5'-Ende befindliche
Domäne
nicht hybridisiert.
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Die
Immobilisierung der amplifizierten Abschnitte auf einer Festphase,
erfolgt über
zumindest einen in der Amplifikation verwendeten Primer. Die Bindung
des Primers er folgt vorzugsweise durch chemische Reaktionen (z.B.
durch die Einführung
einer C6 5'-Aminofunktion).
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Vorzugsweise
werden bei der vorliegenden Erfindung Domänenprimer verwendet, die selbst
nicht methylierungsspezifisch sind, sondern vielmehr nur spezifisch
sind für
die chemisch (Bisulfit) behandelte DNA. Dies wird auch durch deren
bevorzugte Sequenzzusammensetzung deutlich. In der 3'Domäne sind
bevorzugt entweder nur die Basen C, A und T oder aber die Basen
G, A und T enthalten, wie es bisulfitbehandleter DNA entspricht.
In der 5'Domäne hingegen
sind bevorzugt alle vier Basen A, C, G und T enthalten.
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Mit
den aus zwei Domänen
bestehenden Primern können
besonders spezifische zwei-Stufen-Amplifikationen durchgeführt werden,
die besonders spezifisch eine Vielzahl von Fragmenten gleichzeitig
bereitstellen und die zugleich das Problem löst, dass normalerweise eine
Vielzahl von markierten und entsprechend teuren Primern für eine solche
komplexe Amplifikation eingesetzt werden müssen.
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Im
dritten Verfahrensschritt wird die im 3. Schritt amplifizierte DNA
erneut amplifiziert, wobei die Primer dieser zweiten Amplifikation
an die am 5'-Ende
befindliche Domäne
mindestens eines der ersten Primer hybridisieren oder zu ihr identisch
sind und wobei diese Primer für
die zweite Amplifikation mit einer nachweisbaren Markierung versehen
sind.
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Die
Amplifikation der DNA im dritten und vierten Verfahrensschritt erfolgt
vorzugsweise in einer Polymerasekettenreaktion, bevorzugt mit einer
hitzebeständigen
DNA- Polymerase.
Die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten wird vorzugsweise in einem
Reaktionsgefäß gemacht.
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Die
Markierung der PCR-Produkte erfolgt bevorzugt über absorbierende Farbstoffe
und/oder über Chemilumineszenz
und/oder über
radioaktive Isotope und/oder über
Fluoreszenzmarkierungen.
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Vorzugsweise
wird der Fluoreszenzmarker durch ein fluoreszenzmarkiertes Nukleotid
wie z. B. Cy5-dCTP eingeführt.
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Im
vierten Verfahrensschritt werden die Amplifikate an Oligonukleotide
und/oder PNA-Oligomere hybridisiert, welche an eine Festphase gebunden
sind, die in der Amplifikation nicht als Primer fungieren, und aus der
Hybridisierung auf Sequenzmerkmale oder Methylierungsmuster der
zu untersuchenden DNA geschlossen.
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Die
hybridisierten Oligonukleotide können
am 3'-Ende beispielsweise
mit folgenden Modifikationen versehen sein: Amino, Phosphat, Thiophosphat,
Didesoxy, Carboxy, Dihydroxy, O-Acetyl oder Alkyl.
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In
einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens werden DNA-Polymorphismen
und Cytosin-Methylierungen in einem Experiment analysiert.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist ferner eine wie in
4 schematisierte Vorrichtung zur in situ
Amplifikation und Analyse von DNA Proben. Sie besteht aus einer kation
und Analyse von DNA Proben. Sie besteht aus einer geschlossenen
und temperierbaren Hybridisierungskammer, einer Pumpe, einem Heizelement
und einem Kühlelement,
die jeweils miteinander durch Flüssigkeit
fördernde
Leitungswege, bevorzugt Kunststoffschläuche verbunden sind (
DE 19952723 A1 )
und einem handelsüblichen
Objektträger
(Oligonukleotid-Array), auf dem DNA-Oligomere, die als Primer in
einer Polymeraseraktion fungieren können, und PNA-Oligomere oder
DNA-Oligomere, die nicht als Primer in einer Polymeraseraktion fungieren
können,
angeordnet sind.
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Besonders
bevorzugt beträgt
das Volumen, das die Hybridisierungskammer bei eingelegtem Oligomer-Array
faßt,
weniger als 200 μl.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist weiterhin eine Vorrichtung zur Analyse
von DNA Proben. Diese besteht mindestens aus einer Oberfläche, auf
der DNA-Oligomere, die als Primer in einer Polymeraseraktion fungieren
können,
und PNA-Oligomere oder DNA-Oligomere, die nicht als Primer in einer
Polymeraseraktion fungieren können,
angeordnet sind.
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Das
besonders bevorzugte Hin- und Herpumpen der Probenflüssigkeit
in der Vorrichtung stellt sicher, daß ein ausreichender Teil der
doppelsträngigen
DNA-Probe an die Oligomere des Arrays hybridisiert.
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Die
folgenden Beispiele erläutern
die Erfindung:
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Beispiel 1: Amplifikation
immobilisierter DNA-Fragmente
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Herstellung
des ESR1 (Acc. No. EP11141) PCR-Produkts Die DNA Fragmente, von
denen nur ein Strang verwendet wird, werden für eine kovalente Bindung mit
Isothiocyanatgruppen auf der benutzten Lysinoberfläche mit
einer Aminomodifikationen am 5'-Ende
versehen. Die entsprechenden PCR Produkte müssen mit Fluoreszenzmarkern
zur Kontrolle des Bindungsvorgangs versehen werden, wobei die Glasoberflächen auf
das Vorhandensein eines Fluoreszenzsignals geprüft werden.
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PCR
Bedingungen: 2 μl
DNA (20 ng)(Bisulfit behandelt); 0,4 μl Taq (2 Einheiten); 0,4 μl dNTP (jeweils 25
mmol/l) 0,25 mmol/l Endkonzentration; 2 μl Primer1 (12,5 pmol/μl) 0,5 pmol/μl Endkonzentration;
2 μl Primer2
(12,5 pmol/μl)
0,5 pmol/μl
Endkonzentration; 5 μl
10 × PCR
Puffer; 1 μl
MgCl (15 mmol/l) 2,0 mmol/l Mg2+ Endkonzentration;
1 μl dATP
Fluorescin (0,05 mmol/l) 0,5 μmol/l
Endkonzentration und 36,2 μl
ddH2O
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PCR-Programm:
95°C für 15:00
min; 95°C
für 1:00
min; 55 °C
für 0:45
min; 72°C
für 1:15
min; Zyklen: 40; 72°C
für 10:00
min; 4°C
für den
Endpunkt Primeroligonukleotide
(siehe auch Fig. 1)
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Immobilisierung der PCR-Produkte
auf Oberflächen
(Beads)
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Die
gereinigten PCR-Produkte wurden für die Immobilisierung auf Glasoberflächen (Beads)
verwendet. Sie unterschieden sich nur in ihrer 5'-Modifikation. Ein Produkt hatte die
NH2 Gruppe am 5'-Ende des oberen Strangs (forward),
das andere hatte diese Gruppe am 5'-Ende des unteren Strangs (reverse).
Während
der Versuchsdurchführung
wurden Doppelstränge
gebunden, nach dem Denaturieren und Waschen werden jedoch zwei verschiedene
Einzelstränge
immobilisiert. Der Erfolg dieses Bindungsvorgangs wurde über Fluorenzenzmessungen
bestimmt. Erstens konnte ein Fluoreszenssignal der Beads nachgewiesen
werden. Zweitens konnte eine Abnahme des Fluoreszenssignals des
Immobilisierungspuffers gegenüber
einem Kontrollpuffer gezeigt werden.
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18 μl gereinigtes
PCR Produkt wurde zu 28 μl
Immobilisierungspuffer (0,5 molares EDTA; 2,1% Methylimidazol; 0,06
Tween®)
gegeben. Dann wurden 23 μl
der Mischung zu 42 mg PITC (Phenylendiisothiocyanat) modifizierten
Beads (n = 30) in Reaktionsgefäße gegeben
und bei 28 °C über Nacht
inkubiert. Danach wurde mit 1% Ammoniaklösung für 20 min desaktiviert.
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Immobilisierung der PCR-Produkte
auf verschiedenen Oberflächen
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In
einem Vergleichsexperiment wurden die unterschiedlichen Bindungseigenschaften
von Amino modifiziertem und unmodifiziertem PCR Produkt untersucht.
Dabei wurde die Spezifität
für drei
verschiedene Oberflächen
getestet: Lysin modifizierte, Isothiocyanat (PITC) modifizierte
und mit Primern beladene und deaktivierte Glassoberflächen.
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40 μl gereinigtes
PCR-Produkt (∼0,25
pmol/μl)
wurden mit 50 μl
Immobilisierungspuffer gemischt, 42 mg Beads (n = 30) wurden in
ein Reaktionsgefäß gegegen,
30 μl des
Gemisches zugegeben und bei 28 °C zwei
Nächte
inkubiert.
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Denaturierung
des immobilisierten PCR-Produkts
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Die
Beads wurden mehrere Male in den Reaktionsgefäßen unter Denaturierungsbedingungen
gewaschen. Nach jedem Denaturierungs-schritt wurden die Beads zusätzlich mit
1 ml Wasser gewaschen und einige Beads von jedem Typ aufbewahrt.
Alle anderen Beads wurden für
den nächsten
Denatu rierungsschritt (1. 5 min, 95 °C mit Wasser; 2. 10 min, 25 °C mit 10
mmol/l PO4-Puffer/1 % SDS; 3. 2 mal 5 min
25 °C mit
0,05 mol/l NaOH; 4. 30 min 0,2 mol/l NaOH/0,1 SDS) verwendet. Am
Ende wurden die Beads im Vakuum getrocknet und aufbewahrt.
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PCR und Reamplifikation
der an die Glasoberfläche
gebundenen DNA-Fragmente
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Die
auf die Glasoberflächen
immobilisierte DNA; die 4 Mal gewaschen und denaturiert wurde (siehe oben),
wurde für
die PCR als Templat verwendet. Für
die PCR wurde ein Mastermix hergestellt und nur ein Bead in jedes
Reaktionsgefäß gegeben.
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PCR
Bedingungen für
1 Glasbead bzw. 10 ng Bisulfit behandelte DNA als Kontrolle: 0.2 μl Taq (1
Einheit), 0,2 μl
dNTP (jeweils 25 mmol/l) 0,2 mmol/l Endkonzentration, 1 μl Primer1
(12,5 pmol/μl)
0,5 pmol/μl
Endkonzentration; 1 μl
Primer2 (12,5 pmol/μl)
0,5 pmol/μl
Endkonzentration; 2,5 μl
(10×)
Puffer; 20,1 μl
H2O
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Primer:
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- ER1-B-U AGGAGGGGGAATTAARTAGA
- ER1-B-L ACAATAAAACCATCCCAAATAC
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Programm:
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95°C/15:00;
95°C/1:00;
55°C/0:45;
72°C/1:15;
cycles: 40; 72°C/10:00;
4°C/Endpunkt
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Beispiel 2: Primerverlängerung
eines immobilisierten ESR1-Primers und Amplifikation des immobilisierten
Ver längerungsprodukts
mit Gen-spezifischen und generischen (M13 Domäne) PCR-Primern.
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Die
folgenden aminomodifizierten Primer wurden auf PITC modifizierte
Glasbeads gebunden:
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Der
Immobilisierungspuffer wurde optimiert für das Auftragen von NH2 markierten Oligonukleotiden auf PITC derivatisierte
Lysinoberflächen.
Hier wurde der Puffer für
die Immobilisierung in den gleichen Konzentrationen verwendet: 0,5
molares EDTA; 2,1% Methylimidazol; 0,06% Tween, Verwendung von 14 μl(Puffer)
+ 7 μl (DNA/Oligonukleotid)
Lösung,
5 pmol/μl
Oligonukleotid Endkonzentration
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21 μl der Mischung
wurden zu 42 mg PITC modifizierten Beads (n = 30) in Reaktionsgefäße gegeben und
bei 28 °C über Nacht
inkubiert. Danach wurde mit 1% Anmmoniaklösung für 15 min deaktiviert. Nach
dem Entfernen der Lösung
wurden die Beads getrocknet und unter Vakuum aufbewahrt.
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Die
PCR wurde in 0,2 ml Reaktionsgefäßen wie
oben beschrieben im Eppendorf Cycler durchgeführt; 5 Primer beladene PITC-Beads
wurden in jedes Reaktionsgefäß gegeben;
als Templat wurde PCR-Produkt verwendet (gereinigt, unverdünnt, 5'-Cy5 markiert):
5
Beads; 1 μl
gereinigtes PCR-Produkt; 0,2 μl
Taq (1 Einheit); 0,2 μl
dNTP (jeweils 25 mmol/l) 0,2 mmol/l Endkonzentration; 2,5 μl (10×) Puffer;
22,1 μl
H2O
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Programm:
95°C/15:00;
95°C/1:00;
55 °C/0:45;
72°C/1:15;
Zyklen: 40; 72°C/10:00;
4°C/Endkonzentration
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Waschen
(Puffer: 1 × PBS
und 0,1% SDS) und denaturieren der Beads mit verlängerten
Primern.
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Vorgehen:
0,2 ml Reaktionsgefäße im Cycler
bei 96°C;
Zugabe von 100μl
1 × PBS/0,1%
SDS im Reaktionsgefäß, 5 min
Reaktionszeit, Reinigung der Beads, alte Lösung verwerfen und erneut 100 μl zugeben, diesen
Schritt 4 Mal wiederholen; abschließend wurden die Beads 2 Mal
mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet.
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Zur Überprüfung der
spezifischen Verlängerung
wurden auch 2 Sorten Beads eingesetzt, auf denen Primeroligonukleotide
immobilisiert waren, die nicht komplementär zum verwendeten Templat waren
und deshalb nicht verlängert
wurden.
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1
Bead von jedem Reaktionsgefäß wurde
verwendet zum Scannen der Cy5 und Cy3 Signale. Es wurde erwartet,
dass die Cy5 Signale von Bead 1–4
(nur Bead 1–4
wurden mit dem Cy5 PCR-Produkt kontaktiert) verschwinden würden. Bei
erfolgreicher Verlängerung
auf dem Bead sind Cy3 Signale detektierbar, auch nach stringenter
Denaturierung. Die gescannten Bilder hierzu sind unten abgebildet.
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PCR zur Überprüfung der
gebundenen verlängerten
Primer nach dem Waschen
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Die
Primer von ESR1 und MDR1 mit Aminofunktion wurden auf PITC Beads
immobilisiert. Alle Primer haben eine M13 Domäne und eine genspezifische
Domäne.
Nach der Immobilisierung wurden die Beads ohne zusätzliche
Primeroligonukleotide in Lösung
zur PCR Präparation
gegeben mit einem PCR Produkt als Templat. Während der Zyklen werden die
gebundenen Primer an einzelsträngige
DNA der PCR Produkte angelagert und verlängert. Mit dieser PCR wird
der Erfolg der Verlängerungsreaktion überprüft. ESR1
PCR Produkt wurde als Templat verwendet, das keine M13 Domäne aufweist.
Die verwendeten Primer sind spezifisch für die verlängerten Primer (Ergebnisse
siehe unten). Bei einer erfolgten Verlängerung auf den Glasoberflächen sind
nur die PCRs 3a und 4b positiv, ebenso die Kontrollen 7a und 7b.
Nur diese Reaktionsgefäße beinhalten
Templat für
die entsprechenden Primer.
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PCR Bedingungen:
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- 1 Bead; 0.2 μl
Taq;
- 0,2 μl
dNTP (jeweils 25 mmol/l) 0,2 mmol/l Endkonzentration;
- 1 μl
Primer1 (12,5 pmol/μl)
0,5 pmol/μl
Endkonzentration;
- 1 μl
Primer2 (12,5 pmol/μl)
0,5 pmol/μl
Endkonzentration;
- 2,5 μl
Puffer; 20, 1 H2O
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Primer:
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- R61 M13-a GTAAAACGACGGCCAGT
- R63 M13-b CAGGAAACAGCTATGAC
- R83 ESR1-B-U AGGAGGGGGAATTAAATAGA
- R84 ESR1-B-L ACAATAAAACCATCCCAAATAC
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Templat:
-
1
Bead von der Verlängerung
nach der Denaturierung wurde für
den jeweiligen Versuch verwendet.
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Programm:
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95°C/15:00;
95°C/1:00;
55 °C/0:45;
72°C/1:15;
Zyklen: 40; 72°C/10:00;
4°C/Endpunkt
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Immobilisierte
Primeroligonukleotide auf Glasbeads wie im vorangehenden Experiment
beschrieben.
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Agarosegel
(aufgetragen jeweils 5μl)
zu den PCR Ansätzen
mit Bead Nr. 1–7:
siehe 3
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Beispiel 3: In situ-Amplifikation
des Gens ESR1 und Analyse des Methylierungsstatus einer CpG Position
auf einem Mikroarray.
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1. Herstellung
des Mikroarrays
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Ein
Glasobjektträger
(Array) wurde chemisch modifiziert und folgende Oligonukleotide
mit einem handelsüblichen
Spotter in vierfacher Redundanz auf den Array aufgetragen und mit
dem 5'-Ende kovalent
an die Oberfläche
gebunden
- a) Das Oligonukleotid ESR1-B-U-M13a
GTAAACGACGGCCAGTAGGAGGGGGAATTAAATAGA, dessen kursiv gedruckte Nukleotide
mit dem zu amplifizierenden ESR1 Amplifikat (Position (1–20) übereinstimmen.
- b) Die Oligonukleotide ESR1-CG (TAGGTTTTCGGGGTAGGG) und ESR1-TG
(TAGGTTTTTGGGGTAGGG) für
die Bestimmung des Methylierungsstatus des CpG an Position 457–474 des
ERS1-Amplifikats.
- c) Die Bisulfitsequenz des ESR1 Gens (Acc. No. EP11141) ist
nachfolgend dargestellt
-
Die
Verteilung der Oligonukleotide auf dem Array ist in 5 dargestellt.
-
2. Insitu-Amplifikation
von ESR1
-
Die
Insitu-Amplifikation wurde in der von der Epigenomics AG entwickelten
Hybridisierungskammer durchgeführt.
Hierzu wurden 200 μl
der PCR-Lsg. (50 ng Bisulfit behandelte humane genomische DNA; dNTPs 0,25
mmol/l, 0,5 μmol/l
Primer ESR1-B-L ACAATAAAACCATCCCAAATAC oder Primer ESR1-B-U-M13b CAGGAAACAGCTATGACACAATAAAACCATCCCAAATAC,
20 μl 10 × Reaktionpuffer
5 E Taq-Polymerase in ein Reaktionsgefäß (Volumen 500μl) gefüllt und
mit Mineralöl überschichtet.
Das Reaktionsgefäß wurde
in die Denaturierungsposition der Hybridisierungskammer gestellt
und mit einem Teflonschlauch mit der Reaktions(Hybridisierungs)kammer
verbunden (s. 4). Die
PCR-Reaktion erfolgte durch ein Hinundherpumpen der PCR-Lösung zwischen
Denaturierungsposition und der Reaktions-(Hybridisierungs-)kammer.
Dieser Vorgang wurde durch folgendes Pump/Temperaturprogramm gesteuert
(Tab. 1, Schritt 1–8).
Die PCR-Reaktion war beendet, nachdem die Programmschritte 2–7 38mal
durchlaufen waren.
-
Tabelle:
1 Pumpen und Temperaturprogramm
-
3. Analyse des Methylierungsstatus
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Nach
der Insitu-Amplifikation (Schritt 8, Tab. 1) werden 400 μl Hybridisierungspuffer
(6,9 × SSC,
2,7 Na-Laurylsarccosinat)
zum PCR-Ansatz im Reaktionsgefäß (Denaturierungsposition)
pipettiert und der Hybridisierungsprozess gestartet (Schritt 9,
Tab. 1). Nach 70 Wiederholungen der Schritte 9–12 wird die Hybridisierung
beendet und die Arrays werden gewaschen. Die getrockneten Arrays
wurden in eine Fluoreszensscanner analysiert und der Methylierungsstatus
nach einer bekannten Methode bestimmt (Model F., Adorjan P., Olek, A.,
Piepenbrock, C., Bioinformatics. 2001, 17, Suppl1: 157–64).
-
Kurze Beschreibung der
Figuren:
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1: ESR PCR-Produkt
M
= Größenmarker,
1 = PCR Set 1, 2 = PCR Set 2
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2: Reaktionsgefäße (Bead
Nr. B):
B1: Beads nach der 2. Denaturierung;
B2: Beads
nach der 3. Denaturierung;
B3: Beads nach der 4. Denaturierung;
B4:
keine Beads, kein Templat;
B5: keine Beads, 1 μl Bisulfit
DNA
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3. Die Serie a zeigt die
PCR Ansätze
mit dem Kontrollset für
Bead Nr. 3. Da die Kontrolle 6a (Templat ohne M13 Domäne) negativ
ist und die Kontrolle 7a (Templat mit M13 Domäne) positiv
ist, kann auf eine erfolgreiche Verlängerung geschlossen werden.
An der Kontrolle 6b kann man sehen, dass die verwendeten Primeroligonukleotide
auch Templat ohne M13 Domäme
reamplifizieren.
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4:
P Pumpe
T Schläuche
K
Reaktionskammer
D Denaturierungsposition
C Chip
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5: Schematische Darstellung
des Chip Layouts:
Die schwarzen Punkte stellen die Positionen
der immobilisierten Primer da (B). Die Lage der Methylierungsdetektionsoligos
auf dem Chip werden durch weiße
Punkte TG- Oligonukleotid
(TAGGTTTTTGGGGTAGGG) und graue Punkte CG-Oligonukleotid (TAGGTTTTCGGGGTAGGG)
dargestellt (A).
