EP1451359A2 - Verfahren und integrierte vorrichtung zum nachweis von cytosinmethylierungen - Google Patents

Verfahren und integrierte vorrichtung zum nachweis von cytosinmethylierungen

Info

Publication number
EP1451359A2
EP1451359A2 EP02791612A EP02791612A EP1451359A2 EP 1451359 A2 EP1451359 A2 EP 1451359A2 EP 02791612 A EP02791612 A EP 02791612A EP 02791612 A EP02791612 A EP 02791612A EP 1451359 A2 EP1451359 A2 EP 1451359A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
die
primer
primers
und
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02791612A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kurt Berlin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Epigenomics AG
Original Assignee
Epigenomics AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Epigenomics AG filed Critical Epigenomics AG
Publication of EP1451359A2 publication Critical patent/EP1451359A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Definitions

  • the present invention describes a method for the detection of the methylation state of genomic DNA samples.
  • 5-Methylcytosine is the most common covalently modified base in the DNA of eukaryotic cells. For example, it plays a role in the regulation of transcription, in genetic imprinting and in tumorigenesis. The identification of 5-methylcytosine as a component of genetic information is therefore of considerable interest. However, 5-methylcytosine positions cannot be identified by sequencing because 5- Methylcytosine has the same base pairing behavior as cytosine. In addition, in the case of PCR amplification, the epigenetic information which the 5-methylcytosines carry is completely lost.
  • the state of the art in terms of sensitivity is defined by a method which includes the DNA to be examined in an agarose matrix, thereby preventing the diffusion and renaturation of the DNA (bisulfite only reacts on single-stranded DNA) and all precipitation and purification steps replaced by rapid dialysis (Olek, A. et al., Nucl. Acids. Res. 1996, 24, 5064-5066). With this method, individual cells can be examined, which illustrates the potential of the method. However, only individual regions up to about 3000 base pairs in length have so far been investigated, and a global examination of cells for thousands of possible methylation analyzes is not possible.
  • PCR reactions polymerase chain reactions
  • two specifically binding primers one complementary to the (+) strand, the other complementary to the (-) strand of the one to be amplified Templates is.
  • the aim of such an amplification is to reproduce a certain fragment of the Te plat DNA, which is usually precisely defined and is largely or completely known in its base sequence.
  • PCR reactions using more than two different primers are also known. In most cases, they are used for the amplification of several fragments, likewise at least largely known in their base sequence, simultaneously in one vessel. In this case too, the primers used specifically bind to certain sections of the template DNA.
  • the hybridization chamber (DE19952723) developed by Epigenomics AG carries out periodic denaturation of the DNA sample without generating a detachment of DNA already hybridized to oligomers. Because the DNA sample is thermally denatured before being applied to the array and then suddenly cooled, it is predominantly in single-stranded form when contacted with the array. This means that a large part of the otherwise double-stranded DNA sample is available for hybridizations with the oligomer array. By pumping the sample liquid back and forth, the device ensures that this process is repeated until a sufficient part of the double-stranded DNA sample has hybridized to the oligomers of the array. At the same time, this process causes mixing in the chamber during the hybridization phase.
  • Genomic DNA is obtained by standard methods from DNA from cell, tissue or other test samples. This standard methodology can be found in references such as Fritsch and Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
  • Coded particles have been used in very different areas for some time. Color-coded beads have been used for the parallel diagnosis of T and B cells (Baran and Parker, Am. J. Clin. Pathol. 1985, 83, 182-9). Beads containing radiaoactive indium have been used as indicators of the motility of the gastrointestinal tract (Dormehl et al Eur. J. Nucl. Med. 1985, 10, 283-5). Companies such as Lu inex or Illumina, who run highly parallel diagnostics with color-coded plastic beads, use 100 different different -coloured beads, to which many different probes can be attached. As a result, 100 different parameters can be queried in a reaction, which could be, for example, 100 different diagnostic tests.
  • the present invention is intended to provide a method which is particularly suitable for the detection of DNA polymorphisms and cytosine methylations in genomic DNA samples.
  • a device for analyzing DNA samples should preferably be used, which enables both the amplification of DNA fragments and the analysis of DNA polymorphisms and cytosine methylations in a vessel by means of immobilized primers and probes.
  • the object is achieved according to the invention by a method for the detection of DNA polymorphisms and cytosine methylation, the following steps being carried out: a) the DNA to be examined is obtained from a sample; b) the DNA to be examined is amplified in a polymerase reaction, a primer being in solution and a primer being bound to the surface of a solid phase, and at least one of the primers consisting of two domains, the one located at the 3 'end the DNA to be examined hybridizes, while the one located at the 5 'end does not hybridize; c) the DNA amplified in step b) is amplified again, the primers of this second amplification the domain located at the 5 'end hybridize or are identical to at least one of the first primers and these primers are provided with a detectable label for the second amplification; d) the amplificates are on oligonucleotides and / or
  • PNA oligomers hybridized, which are bound to a solid phase, which do not act as primers in the amplification, and concluded from the hybridization on sequence features or methylation ester of the DNA to be examined.
  • step a) the DNA to be examined is treated chemically and / or enzymatically after it has been obtained.
  • a particularly preferred embodiment of the method according to the invention for the detection of DNA polymorphisms and cytosine methylation is characterized in that the following steps are carried out: the DNA to be examined is obtained from a sample;
  • the DNA to be examined is treated chemically and / or enzymatically;
  • the DNA to be examined is amplified in a polymerase action, a primer being in solution and a primer being bound to the surface of a solid phase and at least one of the primers consisting of two domains, the one located at the 3 'end being attached to the DNA to be examined hybridizes, while the one located at the 5 'end does not hybridize;
  • the DNA amplified in the previous step is amplified again, the primers of this second amplification hybridizing or being identical to at least one of the first primers to the domain located at the 5 'end, and these primers being provided with a detectable label for the second amplification are; -
  • the amplificates are hybridized to oligonucleotides and / or PNA oligomers, which are bound to a solid phase, which do not function as primers in the amplification, and conclude from the hybridization on sequence features or methylation patterns of the DNA to be examined.
  • primers of the first amplification (step b) and the oligonucleotides (step d) are immobilized on the same solid phase.
  • the solid phase is flat. Furthermore, it is particularly preferred according to the invention that the solid phase is made of glass, metal, in particular gold or plastic.
  • beads are used as the solid phase, each bead being coded differently. It is particularly preferred here that the beads use fluorescent dyes and absorbents
  • Dyes via chemiluminescence, via transponders, via nuclides or via chemical labels which can be detected by mass spectrometry.
  • the surface is chemically treated in such a way that the oligonucleotides and primers can be covalently bound to it.
  • the present invention furthermore relates to a device consisting of a) a surface on which primer oligonucleotides are immobilized with their 5 'end and additionally oligonucleotides and / or PNA olig eres which cannot be extended by a polymerase; b) a chamber, the surface of which is a wall of this Chamber forms; c) a temperature control unit that controls the chamber temperature; d) a system which supplies liquids to the chamber.
  • the DNA to be examined is obtained from a sample.
  • the genomic DNA to be analyzed is preferably obtained from the usual sources for DNA, such as. B. cell lines, blood, sputum, stool, urine, brain spinal fluid, paraffin-embedded tissue, for example tissue from the eyes, intestines, kidneys, brain, heart, prostate, lungs, chest or liver, histological slides and all possible combinations of these.
  • the DNA can also already be processed or isolated.
  • the DNA to be examined is treated chemically and / or enzymatically.
  • bisulfite disulfite, hydrogen sulfite
  • the enzymatic treatment is preferably carried out using methylation-sensitive restriction enzymes which can differentiate between methylated and unmethylated DNA.
  • the DNA to be examined is amplified in a polymer laser action, with a
  • Primer is in solution and a primer is bound to the surface of a solid phase and at least one of the primers consists of two domains, the domain located at the 3 'end hybridizing to the DNA to be investigated, while the domain located at the 5' end not hybridized.
  • the amplified sections are immobilized on a solid phase via at least one primer used in the amplification.
  • the primer is preferably bound by chemical reactions (e.g. by introducing a C6 5 'amino function).
  • the 3 'domain preferably contains only bases C, A and T or bases G, A and T, as corresponds to bisulfite-treated DNA. In the 5 'domain, however, all four bases A, C, G and T are preferably included.
  • primers consisting of two domains
  • two-stage amplifications can be carried out, which particularly specifically provide a large number of fragments at the same time and which at the same time solves the problem that a large number of labeled and correspondingly expensive primers are normally used for such a complex amplification Need to become.
  • the amplification of the DNA in the two previous method steps is preferably carried out in a polymer chain reaction, preferably with a heat-resistant DNA polymerase.
  • the amplification of several DNA sections is preferably done in a reaction vessel.
  • the PCR products are preferably labeled via absorbing dyes and / or via chemiluminescence and / or via radioactive isotopes and / or via fluorescent labels.
  • the fluorescent label by a fluorescence-labeled nucleotide such.
  • B Cy5-dCTP introduced.
  • the amplificates are hybridized to oligonucleotides and / or PNA oligomers which are bound to a solid phase, which do not function as primers in the amplification, and from the hybridization conclusions are drawn about sequence features or methylation patterns of the DNA to be examined.
  • the hybridized oligonucleotides can be provided at the 3 'end with the following modifications, for example: amino, phosphate, thiophosphate, dideoxy, carboxy, dihydroxy, O-acetyl or alkyl.
  • DNA polymorphisms and cytosine methylations are analyzed in one experiment.
  • the present invention also relates to a device for the in situ amplification and analysis of DNA samples, as shown in FIG. 4. It consists of a closed and temperature-controlled hybridization chamber, a pump, a heating element and a cooling element, each of which is connected to one another by liquid-conveying conduction paths, preferably plastic tubes (DE 19952723 AI) and a commercially available slide (oligonucleotide array) on which DNA oligomers which can act as primers in a polymerase action, and PNA oligomers or DNA oligomers which cannot act as primers in a polymerase action are arranged.
  • the volume that the hybridization chamber holds when an oligomer array is inserted is particularly preferably less than 200 ⁇ l.
  • the present invention furthermore relates to a device for analyzing DNA samples.
  • This consists of at least one surface on which DNA oligomers which can act as primers in a polymerase action and PNA oligomers or DNA oligomers which cannot act as primers in a polymerase action are arranged.
  • the particularly preferred pumping of the sample liquid back and forth in the device ensures that a sufficient part of the double-stranded DNA sample hybridizes to the oligomers of the array.
  • ESR1 Acc. No. EP11141
  • PCR conditions 2 ⁇ l DNA (20 ng) (bisulfite treated); 0.4 ⁇ l Taq (2 units, Qiagen); 0.4 ⁇ l dNTP (25 each mmol / 1, MBI Fermentas) 0.25 mmol / 1 final concentration; 2 ul
  • Primer2 (12.5 pmol / ⁇ l) 0.5 pmol / ⁇ l final concentration; 5 ul 10X PCR buffer (Qiagen); 1 ⁇ l MgCl (15 mmol / 1, Qiagen)
  • the purified PCR products were used for the immobilization on glass surfaces (beads). They only differed in their 5 'modification. One product had the H 2 group at the 5 'end of the upper strand (for5 ward), the other had this group at the 5' end of the lower strand. reverse strand. During the test, double strands were bound, but after denaturing and washing, two different single strands are immobilized. The success of this binding process was determined using fluorescence measurements. First, a fluorescence signal from the beads was detected. Secondly, a decrease in the fluorescence signal of the immobilization buffer compared to a control buffer could be shown.
  • the beads were washed several times in the reaction vessels under denaturing conditions. After each denaturation step, the beads were additionally washed with 1 ml of water and some beads of each type were kept. All other beads were used for the next denaturation step (1. 5 min, 95 ° C with water; 2. 10 min, 25 ° C with 10 mM P0 4 buffer / 1% SDS; 3. 2 times 5 min, 25 ° C with 0.05 M NaOH; 4. 30 min 0.2 M NaOH / 0.1% SDS) was used. At the end the beads were dried in a vacuum and stored.
  • the DNA immobilized on the glass surfaces which was washed 4 times and denatured (see above), was used as a template for the PCR.
  • a master mix was prepared for the PCR and only one bead was added to each reaction vessel.
  • PCR conditions for 1 glass bead or 10 ng bisulfite-treated DNA as a control 0.2 ⁇ l Taq (1 unit), 0.2 ⁇ l dNTP (each 25 mM) 0.2 mM final concentration, 1 ⁇ l primer (12.5 pmol / ⁇ l) 0.5 pmol / ⁇ l final concentration; 1 ul Primer2 (12.5 pmol / ⁇ l) 0.5 pmol / ⁇ l final concentration; 2.5 ul (10x) buffer; 20.1 ul H 2 0
  • Example 2 Primer extension of an immobilized ESRI primer and amplification of the immobilized extension product with gene-specific and generic (M13 domain) PCR primers.
  • the immobilization buffer was optimized for the application of NH 2 -labeled oligonucleotides to PITC-derivatized lysine surfaces.
  • PCR was carried out in 0.2 ml reaction tubes as described above in the Eppendorf cycler; 5 primer-loaded PITC beads were placed in each reaction tube; PCR product was used as template (purified, undiluted, 5'-Cy5 labeled):
  • the primers of ESRI and MDRI with amino function were immobilized on PITC beads. All primers have an M13 domain and a gene-specific domain. After the immobilization, the beads were added to the PCR preparation without additional primer oligonucleotides using a PCR product as a template. During the cycles, the bound primers are attached to single-stranded DNA of the PCR products and extended. The success of the extension reaction is checked with this PCR. ESRI PCR product was used as a template that has no M13 domain. The primers used are specific for the extended primers (see results below). At a extension on the glass surfaces, only PCRs 3a and 4b are positive, as are controls 7a and
  • Example 3 In situ amplification of the ESRI gene and analysis of the methylation status of a CpG position on a microarray.
  • a glass slide (array) was chemically modified and the following oligonucleotides with a commercially available
  • ESRI-CG TAGGTTTTCGGGGTAGGG
  • ESR1-TG TAGGTTTTTGGGGTAGGG
  • the distribution of the oligonucleotides on the array is shown in FIG. 5.
  • the in-situ amplification was carried out in the hybridization chamber developed by Epigenomics AG.
  • 200 ⁇ l of the PCR solution 50 ng bisulfite-treated human genomic DNA, dNTPs 0.25 mM, 0.5 ⁇ M primer ESRI- BL ACAATAAAACCATCCCAAATAC or primer ESR1-BU-Ml3b CAGGAAACAGCTATGACACAATAAAACCATCCCAAATAC, 20 ⁇ l lOx reaction buffer, 5 U Taq polymerase (Qiagen, Hilden) filled in a reaction vessel (volume 500 ⁇ l) and covered with mineral oil.
  • the reaction vessel was placed in the denaturing position of the hybridization chamber and connected to the reaction (hybridization) chamber with a Teflon tube (see FIG. 4).
  • the PCR reaction was carried out by pumping the PCR solution back and forth between the denaturation position and the reaction (hybridization) chamber. This process was controlled by the following pump / temperature program (Tab. 1, steps 1-8). The PCR reaction was finished after the program steps 2-7 had been run through 38 times.
  • Step duration T-chamber pump T-Denat. Position d. PCR solution.
  • step 8 After the in-situ amplification (step 8, table 1), 400 ⁇ l hybridization buffer (6.9 x SSC, 2.7 Na-
  • Fig. 1 ESR PCR product
  • reaction vessels (Bead No. B): B1: beads after the second denaturation; B2: beads after the 3rd denaturation; B3: beads after the 4th denaturation; B4: no beads, no template;
  • Fig. 5 Schematic representation of the chip layout:
  • the black dots represent the positions of the immobilized primers (B). The location of the
  • Methylation detection oligos on the chip are represented by white dots TG oligonucleotide (TAGGTTTTTGGGGTAGGG) and gray dots CG oligonucleotide (TAGGTTTTCGGGGTAGGG) (A).

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

The invention relates to a method for detecting DNA polymorphisms and cytosine methylation, consisting of the following steps: a) DNA is extracted from a sample for analysis; b) if a cytosine methylation analysis is carried out, the DNA is chemically and/or enzymatically treated; c) the DNA is amplified in a polymerase reaction using a dissolved primer, and another primer is attached to the surface of a solid phase. At least one of the primers consists of two domains. The domain located at the 3' end hybridizes with the DNA, whereas the domain located at the 5' end does not hybridize; d) the DNA amplified in step c) is amplified once again. The primers of the second amplification hybridize with the domain located at the 5' end of at least one of the first primers or are identical therewith. The primers used for the second amplification contain a detectable marker; e) the amplified substances are hybridized with oligonucleotides and/or PNA oligomers that are bound to a solid phase which does not act as a primer during amplification. Sequential features or methylation patterns are detected by means of the hybridization.

Description

Verfahren und Integrierte Vorrichtung zum Nachweis von
Cy osinmethy1ierungen
Gebiet der Erfindung
Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im
Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß μnd Charakter der Methylierung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar . Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylierungs- uster einzelner Gene oder des Genoms.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Detektion des Methylierungszustandes genomischer DNA Proben.
Stand der Technik
5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5- Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR- Amplifikation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.
Eine relativ neue und die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5- Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5- Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden kann, jetzt durch „normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt wird.
Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zechnigk, M. et al., Eur. J. Hum. Gen. 1997, 5, 94-98) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifziert und entweder komplett sequenziert (Olek, A. und Walter, J., Nat. Genet. 1997, 17, 275-276) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine „Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo, M. L. und Jones, P. A., Nucl. Acids Res. 1997, 25, 2529-2531, WO-Patent
9500669) oder einen Enzymschnitt (Xiong, Z. und Laird, P. W., Nucl. Acids. Res. 1997, 25, 2532-2534) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99/28498).
Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bi- sulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen
Genen befassen, sind: Xiong, Z. und Laird, P. W. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2532; Gonzalgo, M. L. und Jones, P. A. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2529; Grigg, S. und Clark, S. (1994), Bioassays 16, 431; Zeschnik, M. et al. (1997), Human Molecular Genetics 6, 387; Teil, R. et al. (1994), Nucl. Acids Res. 22, 695; Martin, V. et al. (1995), Gene 157, 261; WO 97/46705, WO 95/15373 und WO 95/45560.
Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek, A. et al . , Nucl. Acids. Res. 1996, 24, 5064-5066) . Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regio- nen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen Methylierungsanalysen ist nicht möglich.
PCR Reaktionen (Polymerase Kettenreaktionen) werden nor- malerweise mit zwei spezifisch bindenden Primern durchgeführt, wobei einer komplementär zum (+) -Strang, der andere komplementär zum (-) Strang des zu amplifizierenden Templates ist. Das Ziel einer solchen Amplifikation ist es, ein bestimmtes Fragment der Te plat DNA zu vervielfältigen, das in der Regel genau definiert und in seiner Basensequenz zum großen Teil oder vollständig bekannt ist.
Es sind auch PCR Reaktionen bekannt, die mehr als zwei verschiedene Primer einsetzen. Meist dienen sie zur Amplifikation mehrerer, ebenfalls wenigstens zum großen Teil in ihrer Basensequenz bekannter Fragmente gleichzeitig in einem Gefäß. Auch in diesem Fall binden die eingesetzten Primer spezifisch an bestimmte Abschnitte der Templat DNA.
Die von der Firma Epigenomics AG entwickelte Hybridisie- rungskammer (DE19952723) führt ein periodisches Denaturieren der DNA-Probe durch, ohne eine Ablösung bereits an Oligomere hybridisierter DNA zu erzeugen. Dadurch, daß die DNA-Probe vor dem Aufbringen auf den Array thermisch denaturiert und dann plötzlich abgekühlt wird, liegt sie bei Kontaktierung mit dem Array überwiegend in ein- zelsträngiger Form vor. Damit steht ein großer Teil der ansonsten doppelsträngigen DNA-Probe für Hybridisierungen mit dem Oligomer-Array zur Verfügung. Durch Hin- und Her- pumpen der Probenflüssigkeit stellt die Vorrichtung sicher, daß dieser Vorgang so häufig wiederholt wird, bis ein ausreichender Teil der doppelsträngigen DNA-Probe an die Oligomere des Arrays hybridisiert hat. Zugleich findet durch diesen Prozeß ein Mischen in der Kammer während der Hybridisierungsphase statt. Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung läßt sich aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Ge- netics Supplement, Volume 21, January 1999), der dort zitierten Literatur und dem US-Patent 5994065 über Methoden zur Herstellung von festen Trägern für Zielmoleküle wie Oligonukleotide entnehmen. Neben Desoxyribonucleic Acids (DNA) können auch Peptide Nucleic Acids (PNA) auf der 0- berflache von Oligomer-Arrays fixiert werden.
In situ Aplifikationen sind in der Literatur zahlreich beschrieben (Tsongalis, G. J. und Silvermann L. M., Ann. Clin. Lab. Sei 1994, 24, 436-440) . In situ Reaktionen sind jedoch bisher dadurch gekennzeichnet, dass PCR und Hybridisierung in getrennten Reaktionsgefäßen erfolgen.
Genomische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zeil-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laborato- ry Manual, 1989.
Kodierte Partikel (Beads) finden schon seit einiger Zeit in sehr unterschiedlichen Gebieten ihre Anwendung. Farb- kodierte Beads sind zur parallelen Diagnostik von T- und B-Zellen eingesetzt worden (Baran und Parker, Am. J. Clin. Pathol. 1985, 83, 182-9) . Mit radiaoaktive Indium versetzte Beads sind als Indikatoren der Motilität des gastrointestalen Trakts verwendet worden (Dormehl et al Eur. J. Nucl. Med. 1985, 10, 283-5). Firmen wie Lu inex oder Illumina, die mit farbkodierten Kunststoffkügelchen hoch-parallele Diagnostik betreiben, verwenden 100 ver- schieden -farbmarkierte Beads, an denen entsprechend viele verschiedene Sonden angebracht werden können. Dadurch können in einer Reaktion 100 verschiedene Parameter abgefragt werden, was z.B. 100 verschiedene diagnostische Tests sein könnten.
Aufgabenstellung
Die vorliegende Erfindung soll ein Verfahren bereitstel- len, welches sich zum Nachweis von DNA-Polymorphismen und Cytosin-Methylierungen in genomischen DNA-Proben besonders eignet. Zur Durchführung des Verfahrens soll bevorzugt eine Vorrichtung zur Analyse von DNA Proben verwendet werden, die sowohl die Amplifikation von DNA Fragmen- ten und die Analyse von DNA-Polymorphismen und Cytosin- Methylierungen in einem Gefäß mittels immobilisierter Primer und Sonden ermöglicht.
Beschreibung
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zum Nachweis von DNA-Polymorphismen und Cytosin-Methylierung gelöst, wobei man die folgenden Schritte ausgeführt: a) man gewinnt die zu untersuchende DNA aus einer Probe; b) die zu untersuchende DNA wird in einer Polymeraserak- tion amplifiziert, wobei ein Primer in Lösung vorliegt und ein Primer an die Oberfläche einer Festphase gebunden ist und wobei mindestens einer der Primer aus zwei Domänen besteht, wobei die am 3 '-Ende befindliche an die zu untersuchende DNA hybridisiert, während die am 5 '-Ende befindliche nicht hybridisiert; c) die in Schritt b) amplifizierte DNA wird erneut amplifiziert, wobei die Primer dieser zweiten Amplifikation an die am 5 '-Ende befindliche Domäne mindestens eines der ersten Primer hybridisieren oder zu ihr identisch sind und wobei diese Primer für die zweite Amplifikation mit einer nachweisbaren Markierung versehen sind; d) die Amplifikate werden an Oligonukleotide und/oder
PNA-Oligomere hybridisiert, welche an eine Festphase gebunden sind, die in der Amplifikation nicht als Primer fungieren, und aus der Hybridisierung auf Sequenzmerkmale oder Methylierungs uster der zu untersuchenden DNA ge- schlössen.
Besonders bevorzugt ist es erfindungsgemäß, dass man in Schritt a) die zu untersuchende DNA nach der Gewinnung chemisch und/oder enzy atisch behandelt.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis von DNA-Polymorphismen und Cytosin-Methylierung ist dadurch gekennzeichnet, dass man die folgenden Schritte ausgeführt: - man gewinnt die zu untersuchende DNA aus einer Probe;
- die zu untersuchende DNA wird, falls eine Cytosin- Methylierungsanalyse durchgeführt werden soll, chemisch und/oder enzymatisch behandelt;
- die zu untersuchende DNA wird in einer Polymeraserakti- on amplifiziert, wobei ein Primer in Lösung vorliegt und ein Primer an die Oberfläche einer Festphase gebunden ist und wobei mindestens einer der Primer aus zwei Domänen besteht, wobei die am 3 '-Ende befindliche an die zu untersuchende DNA hybridisiert, während die am 5 '-Ende be- findlich nicht hybridisiert;
- die im vorherigen Schritt amplifizierte DNA wird erneut amplifiziert, wobei die Primer dieser zweiten Amplifikation an die am 5 '-Ende befindliche Domäne mindestens eines der ersten Primer hybridisieren oder zu ihr identisch sind und wobei diese Primer für die zweite Amplifikation mit einer nachweisbaren Markierung versehen sind; - die Amplifikate werden an Oligonukleotide und/oder PNA- Oligomere hybridisiert, welche an eine Festphase gebunden sind, die in der Amplifikation nicht als Primer fungieren, und aus der Hybridisierung auf Sequenzmerkmale oder Methylierungsmuster der zu untersuchenden DNA geschlossen.
Bevorzugt ist weiterhin, dass die Primer der ersten Amplifikation (Schritt b) und die Oligonukleotide (Schritt d) auf derselben Festphase immobilisiert sind.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ferner, dass die Festphase eben ist. Weiterhin ist erfindungsgemäß besonders bevorzugt, dass die Festphase aus Glas, Metall, inbesondere Gold oder Kunststoff ist.
Besonders bevorzugt ist auch, dass Beads als Festphase verwendet werden, wobei jeder Bead unterschiedlich codiert ist. Hierbei ist insbeondere bevorzugt, dass die Beads über Fluoreszenzfarbstoffe, über absorbierende
Farbstoffe, über Chemiluminiszenz, über Transponder, über Nuklide codiert sind oder über chemische Markierungen, welche sich massenspektrometrisch nachweisen lassen.
Ganz besonders bevorzugt ist es erfindungsgemäß, dass die Oberfläche derart chemisch behandelt ist, dass die Oligonukleotide und Primer kovalent daran gebunden werden können.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine Vorrichtung, bestehend aus a) einer Oberfläche, auf welcher Primeroligonukleotide mit ihrem 5 ' -Ende immobilisiert sind und zusätzlich Oligonukleotide und/oder PNA-Oligo ere, welche von einer Po- lymerase nicht verlängert werden können; b) einer Kammer, wobei die Oberfläche eine Wand dieser Kammer bildet; c) einer Temperierungseinheit, welche die Kammertemperatur steuert; d) einem System, welches der Kammer Flüssigkeiten zu- führt .
Beschrieben wird somit ein Verfahren zum Nachweis von DNA-Polymorphismen und Cytosin-Methylierungen, dadurch gekennzeichnet, dass die folgenden Schritte ausgeführt werden:
Im ersten Verfahrensschritt wird die zu untersuchende DNA aus einer Probe gewonnen.
Die zu analysierende genomische DNA wird bevorzugt aus den üblichen Quellen für DNA erhalten, wie z. B. Zelllinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks- Flüssigkeit, in Paraffin einbettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prosta- ta, Lunge, Brust oder Leber, histologische Objektträger und alle möglichen Kombinationen hiervon. Die DNA kann auch bereits aufgearbeitet oder isoliert vorliegen.
Im optionalen zweiten Verfahrensschritt wird die zu un- tersuchende DNA, falls eine Cytosin-Methylierungsanalyse durchgeführt werden soll, chemisch und/oder enzymatisch behandelt.
Die chemische Behandlung der eingesetzten DNA erfolgt be- vorzugt mit Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit) derart, dass alle nicht an der 5-Position der Base methylierten Cytosine so verändert werden, dass eine hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche Base entsteht, während die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben.
Die enzymatische Behandlung erfolgt bevorzugt mit methy- lierungssensitiven Restriktionsenzymen, die zwischen me- thylierter und nicht methylierter DNA unterscheiden können.
Im nächsten Verfahrensschritt wird die zu untersuchende DNA in einer Polymeraseraktion amplifiziert, wobei ein
Primer in Lösung vorliegt und ein Primer an die Oberfläche einer Festphase gebunden ist und wobei mindestens einer der Primer aus zwei Domänen besteht, wobei die am 3'- Ende befindliche Domäne an die zu untersuchende DNA hybridisiert, während die am 5 ' -Ende befindliche Domäne nicht hybridisiert.
Die Immobilisierung der amplifizierten Abschnitte auf einer Festphase, erfolgt über zumindest einen in der Ampli- fikation verwendeten Primer. Die Bindung des Primers erfolgt vorzugsweise durch chemische Reaktionen (z.B. durch die Einführung einer C6 5 ' -Aminofunktion) .
Vorzugsweise werden bei der vorliegenden Erfindung Do ä- nenprimer verwendet, die selbst nicht methylierungsspezi- fisch sind, sondern vielmehr nur spezifisch sind für die chemisch (Bisulfit) behandelte DNA. Dies wird auch durch deren bevorzugte Sequenzzusammensetzung deutlich. In der 3 'Domäne sind bevorzugt entweder nur die Basen C, A und T oder aber die Basen G, A und T enthalten, wie es bisul- fitbehandleter DNA entspricht. In der 5 ' Domäne hingegen sind bevozugt alle vier Basen A, C, G und T enthalten. Mit den aus zwei Domänen bestehenden Primern können besonders spezifische zwei-Stufen-Amplifikationen durchgeführt werden, die besonders spezifisch eine Vielzahl von Fragmenten gleichzeitig bereitstellen und die zugleich das Problem löst, dass normalerweise eine Vielzahl von markierten und entsprechend teuren Primern für eine solche komplexe Amplifikation eingesetzt werden müssen.
Im weiteren Verfahrensschritt wird die im vorherigen
Schritt amplifizierte DNA erneut amplifiziert, wobei die Primer dieser zweiten Amplifikation an die am 5 '-Ende befindliche Domäne mindestens eines der ersten Primer hybridisieren oder zu ihr identisch sind und wobei diese Primer für die zweite Amplifikation mit einer nachweisbaren Markierung versehen sind.
Die Amplifikation der DNA in den beiden vorherigen Verfahrensschritten erfolgt vorzugsweise in einer Polymera- sekettenreaktion, bevorzugt mit einer hitzebeständigen DNA-Polymerase. Die Amplifikation von mehreren DNA- Abschnitten wird vorzugsweise in einem Reaktionsgefäß gemacht .
Die Markierung der PCR-Produkte erfolgt bevorzugt über absorbierende Farbstoffe und/oder über Chemilumineszenz und/oder über radioaktive Isotope und/oder über Fluoreszenzmarkierungen.
Vorzugsweise wird der Fluoreszenzmarker durch ein fluoreszenzmarkiertes Nukleotid wie z. B. Cy5-dCTP eingeführt . Im weiteren Verfahrensschritt werden die Amplifikate an Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere hybridisiert, welche an eine Festphase gebunden sind, die in der Amplifi- kation nicht als Primer fungieren, und aus der Hybridisierung auf Sequenzmerkmale oder Methylierungsmuster der zu untersuchenden DNA geschlossen.
Die hybridisierten Oligonukleotide können am 3 ' -Ende bei- spielsweise mit folgenden Modifikationen versehen sein: Amino, Phosphat, Thiophosphat, Didesoxy, Carboxy, Di- hydroxy, O-Acetyl oder Alkyl.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens werden DNA-Polymorphismen und Cytosin-Methylierungen in einem Experiment analysiert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine wie in Fig. 4 schematisierte Vorrichtung zur in situ Amplifi- kation und Analyse von DNA Proben. Sie besteht aus einer geschlossenen und temperierbaren Hybridisierungskammer, einer Pumpe, einem Heizelement und einem Kühlelement, die jeweils miteinander durch Flüssigkeit fördernde Leitungswege, bevorzugt Kunststoffschlauche verbunden sind (DE 19952723 AI) und einem handelsüblichen Objektträger (Oligonukleotid-Array) , auf dem DNA-Oligomere, die als Primer in einer Poly eraseraktion fungieren können, und PNA-Oligomere oder DNA-Oligomere, die nicht als Primer in einer Polymeraseraktion fungieren können, angeordnet sind. Besonders bevorzugt beträgt das Volumen, das die Hybridi- sierungskammer bei eingelegtem Oligomer-Array faßt, weniger als 200 μl.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin eine Vorrichtung zur Analyse von DNA Proben. Diese besteht mindestens aus einer Oberfläche, auf der DNA-Oligomere, die als Primer in einer Polymeraseraktion fungieren können, und PNA-Oligomere oder DNA-Oligomere, die nicht als Primer in einer Polymeraseraktion fungieren können, angeordnet sind.
Das besonders bevorzugte Hin- und Herpumpen der Probenflüssigkeit in der Vorrichtung stellt sicher, daß ein ausreichender Teil der doppelsträngigen DNA-Probe an die Oligomere des Arrays hybridisiert.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:
Beispiel 1: Amplifikation immobilisierter DNA-Fragmente
Herstellung des ESR1 (Acc. No. EP11141) PCR-Produkts Die DNA Fragmente, von denen nur ein Strang verwendet wird, werden für eine kovalente Bindung mit Isothiocya- natgruppen auf der benutzten Lysinoberflache mit einer
Aminomodifikationen am 5 ' -Ende versehen. Die entsprechenden PCR Produkte müssen mit Fluoreszenzmarkern zur Kontrolle des Bindungsvorgangs versehen werden, wobei die Glasoberflächen auf das Vorhandensein eines Fluoreszenz- signals geprüft werden.
PCR Bedingungen: 2 μl DNA (20 ng) (Bisulfit behandelt); 0.4 μl Taq (2 units, Qiagen) ; 0,4 μl dNTP (jeweils 25 mmol/1, MBI Fermentas) 0,25 mmol/1 Endkonzentration; 2 μl
Primerl (12,5 pmol/μl) 0,5 pmol/μl Endkonzentration; 2 μl
Primer2 (12,5 pmol/μl) 0,5 pmol/μl Endkonzentration; 5 μl lOx PCR Puffer (Qiagen) ; 1 μl MgCl (15 mmol/1, Qiagen)
2,0 mmol/1 Mg Endkonzentration; 1 μl dATP Fluorescin (0,05 mmol/1) 0,5 μmol/1 Endkonzentration und 36,2 μl ddH20
PCR-Programm: 95°C für 15:00 min; 95°C für 1:00 min; 55 .0 °C für 0:45 min; 72°C für 1:15 min; Zyklen: 40; 72°C für 10:00 min; 4°C für den Endpunkt
*U markiert den oberen Strang (forward) , L markiert
L5 den unteren Strang (reverse)
**A markiert die Primer mit der Aminomodifikation am 5 ' -Ende
Immobilisierung der PCR-Produkte auf Oberflächen (Beads)
20
Die gereinigten PCR-Produkte wurden für die Immobilisierung auf Glasoberflächen (Beads) verwendet. Sie unterschieden sich nur in ihrer 5 ' -Modifikation. Ein Produkt hatte die H2 Gruppe am 5 ' -Ende des oberen Strangs (for5 ward), das andere hatte diese Gruppe am 5 ' -Ende des unte- ren Strangs (reverse) . Während der Versuchsdurchführung wurden Doppelstränge gebunden, nach dem Denaturieren und Waschen werden jedoch zwei verschiedene Einzelstränge immobilisiert. Der Erfolg dieses Bindungsvorgangs wurde ü- ber Fluorenzenzmessungen bestimmt. Erstens konnte ein Fluoreszenssignal der Beads nachgewiesen werden. Zweitens konnte eine Abnahme des Fluoreszenssignals des Immobilisierungspuffers gegenüber einem Kontrollpuffer gezeigt werden.
18 μl gereinigtes PCR Produkt wurde zu 28 μl Immobilisierungspuffer (0,5 molares EDTA; 2,1% Methylimidazol; 0,06% Tween) gegeben. Dann wurden 23 μl der Mischung zu 42 mg PITC (Phenylendiisothiocyanat) modifizierten Beads (n=30) in Reaktionsgefäße gegeben und bei 28 °C über
Nacht inkubiert. Danach wurde mit 1% Ammoniaklösung für 20 min desaktiviert .
Immobilisierung der PCR-Produkte auf verschiedenen Oberflächen
In einem Vergleichsexperiment wurden die unterschiedlichen Bindungseigenschaften von Amino modifiziertem und unmodifiziertem PCR Produkt untersucht. Dabei wurde die Spezifität für drei verschiedene Oberflächen getestet: Lysin modifizierte, Isothiocyanat (PITC) modifizierte und mit Primern beladene und deaktivierte Glassoberflächen.
40 μl gereinigtes PCR-Produkt (~0, 25 pmol/μl) wurden mit 50 μl Immobilisierungspuffer gemischt, 42 mg Beads (n=30) wurden in ein Reaktionsgefäß gegegen, 30 μl des Gemisches zugegeben und bei 28 °C zwei Nächte inkubiert.
Denaturierung des immobilisierten PCR-Produkts
Die Beads wurden mehrere Male in den Reaktionsgefäßen unter Denaturierungsbedingungen gewaschen. Nach jedem Dena- turierungs-schritt wurden die Beads zusätzlich mit 1 ml Wasser gewaschen und einige Beads von jedem Typ aufbewahrt. Alle anderen Beads wurden für den nächsten Denatu- rierungsschritt (1. 5 min , 95 °C mit Wasser; 2. 10 min , 25 °C mit 10 mM P04 -Puffer/ 1 % SDS; 3. 2 mal 5 min , 25 °C mit 0,05 m NaOH; 4. 30 min 0,2 M NaOH / 0,1 % SDS) verwendet. Am Ende wurden die Beads im Vakuum getrocknet und aufbewahrt.
PCR und Reamplifikation der an die Glasoberfläche gebundenen DNA-Fragmente
Die auf die Glasoberflächen immobilisierte DNA, die 4 Mal gewaschen und denaturiert wurde (siehe oben) , wurde für die PCR als Templat verwendet. Für die PCR wurde ein Mastermix hergestellt und nur ein Bead in jedes Reaktionsgefäß gegeben.
PCR Bedingungen für 1 Glasbead bzw. 10 ng Bisulfit behandelte DNA als Kontrolle: 0.2 μl Taq (1 Einheit), 0,2 μl dNTP (jeweils 25 mM) 0,2 mM Endkonzentration, 1 μl Primerl (12,5 pmol/μl) 0,5 pmol/μl Endkonzentration; 1 μl Primer2 (12,5 pmol/μl) 0,5 pmol/μl Endkonzentration; 2,5 μl (lOx) Puffer; 20,1 μl H20
Primer:
ER1-B-U AGGAGGGGGAATTAAATAGA
ER1-B-L ACAATAAAACCATCCCAAATAC
Programm:
95°C/15:00; 95°C/1:00; 55 °C/0:45; 72°C/1:15; cycles:40;
72°C/10:00; 4°C/Endpunkt
Beispiel 2: Primerverlängerung eines immobilisierten ESRl-Primers und Amplifikation des immobilisierten Verlängerungsprodukts mit Gen-spezifischen und generischen (M13 Domäne) PCR-Primern.
Die folgenden aminomodifizierten Primer wurden auf PITC modifizierte Glasbeads gebunden:
R75 MDR1-B-U-M13a-AGTAAAACGACGGCCAGTTAAGTATGTTGAAGAAAGATTATTGTAG 5 ' -Amino
R76 MDR1-B-L-M13b-ACAGGAAACAGCTATGACTAAAΑACTATCCCATAATAACTCCCAAC 5' -Amino
R77 ER1-B-U-M13a-A GTAAAACGACGGCCAGTAGGAGGGGGAATTAAATAGA 5 ' -Amino
R78 ER1-B-L-M13b-A CAGGAAACAGCTATGACACAATAAAACCATCCCAAATAC 5 ' -Amino
Der Immobilisierungspuffer wurde optimiert für das Auftragen von NH2 markierten Oligonukleotiden auf PITC deri- vatisierte Lysinoberflachen. Hier wurde der Puffer für die Immobilisierung in den gleichen Konzentrationen ver- wendet: 0,5 molares EDTA; 2,1% Methyli idazol; 0,06% Tween, Verwendung von 14 μl (Puffer) + 7 μl (DNA/Oligonukleotid) Lösung, 5 pmol/μl Oligonukleotid Endkonzentration 21 μl der Mischung wurden zu 42 mg PITC modifizierten Beads (n=30) in Reaktionsgefäße gegeben und bei 28 °C ü- ber Nacht inkubiert. Danach wurde mit 1% Anmmoniaklösung für 15 min deaktiviert. Nach dem Entfernen der Lösung wurden die Beads getrocknet und unter Vakuum aufbewahrt.
Die PCR wurde in 0,2 ml Reaktionsgefäßen wie oben beschrieben im Eppendorf Cycler durchgeführt; 5 Primer be- ladene PITC-Beads wurden in jedes Reaktionsgefäß gegeben; als Templat wurde PCR-Produkt verwendet (gereinigt, unverdünnt, 5'-Cy5 markiert):
5 Beads; 1 μl gereinigtes PCR-Produkt; 0,2 μl Taq (1 unit); 0,2 μl dNTP (jeweils 25 mM) 0,2 mM Endkonzentration; 2,5 μl (lOx) Puffer; 22,1 μl H20
Programm: 95°C/15:00; 95°C/1:00; 55 °C/0:45; 72°C/1:15; Zyklen: 40; 72°C/10:00; 4°C/Endkonzentration
Waschen (Puffer: 1 x PBS und 0,1 % SDS) und denaturieren der Beads mit verlängerten Primern.
Vorgehen: 0,2 ml Reaktionsgefäße im Cycler bei 96°C; Zugabe von lOOμl lxPBS/0,1% SDS im Reaktionsgefäß, 5 min Reaktionszeit, Reinigung der Beads, alte Lösung verwerfen und erneut 100 μl zugeben, diesen Schritt 4 Mal wiederholen; abschließend wurden die Beads 2 Mal mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Zur Überprüfung der spezifischen Verlängerung wurden auch 2 Sorten Beads eingesetzt, auf denen Primeroligonukleoti- de immobilisiert waren, die nicht komplementär zum verwendeten Templat waren und deshalb nicht verlängert wur- den.
1 Bead von jedem Reaktionsgefäß wurde verwendet zum Scannen der Cy5 und Cy3 Signale. Es wurde erwartet, dass die Cy5 Signale von Bead 1-4 (nur Bead 1-4 wurden mit dem Cy5 PCR-Produkt kontaktiert) verschwinden würden. Bei erfolgreicher Verlängerung auf dem Bead sind Cy3 Signale detek- tierbar, auch nach stringenter Denaturierung. Die gescannten Bilder hierzu sind unten abgebildet.
PCR zur Überprüfung der gebundenen verlängerten Primer nach dem Waschen
Die Primer von ESRl und MDRl mit Aminofunktion wurden auf PITC Beads immobilisiert. Alle Primer haben eine M13 Do- mäne und eine genspezifische Domäne. Nach der Immobilisierung wurden die Beads ohne zusätzliche Primeroligo- nukleotide in Lösung zur PCR Präparation gegeben mit einem PCR Produkt als Templat. Während der Zyklen werden die gebundenen Primer an einzelsträngige DNA der PCR Pro- dukte angelagert und verlängert. Mit dieser PCR wird der Erfolg der Verlängerungsreaktion überprüft. ESRl PCR Produkt wurde als Templat verwendet, das keine M13 Domäne aufweist. Die verwendeten Primer sind spezifisch für die verlängerten Primer (Ergebnisse siehe unten) . Bei einer erfolgten Verlängerung auf den Glasoberflächen sind nur die PCRs 3a und 4b positiv, ebenso die Kontrollen 7a und
7b. Nur diese Reaktionsgefäße beinhalten Templat für die entsprechenden Primer.
PCR Bedingungen:
1 Bead; 0.2 μl Taq;
0,2 μl dNTP (jeweils 25 mM) 0,2 mM Endkonzentration;
1 μl Primerl (12,5 pmol/μl) 0,5 pmol/μl Endkonzentration;
1 μl Primer2 (12,5 pmol/μl) 0,5 pmol/μl Endkonzentration;
2,5 μl Puffer; 20,1 H20
Primer:
R61 M13-a GTAAAACGACGGCCAGT
R63 M13-b CAGGAAACAGCTATGAC
R83 ESR1-B-U AGGAGGGGGAATTAAATAGA
R84 ESR1-B-L ACAATAAAACCATCCCAAATAC
Templat:
1 Bead von der Verlängerung nach der Denaturierung wurde für den jeweiligen Versuch verwendet.
Programm: 95°C/15:00; 95°C/1:00; 55 °C/0:45; 72°C/1:15; Zyklen:40; 72°C/10:00; 4°C/Endpunkt
Immobilisierte Primeroligonukleotide auf Glasbeads wie im vorangehenden Experiment beschrieben.
Reaktionsgefäße :
Agarosegel (aufgetragen jeweils 5μl) zu den PCR Ansätzen mit Bead Nr. 1-7: siehe Fig. 3
Beispiel 3: In situ-Amplifikation des Gens ESRl und Analyse des Methylierungsstatus einer CpG Position auf einem Mikroarray.
1. Herstellung des Mikroarrays
Ein Glasobjektträger (Array) wurde chemisch modifiziert und folgende Oligonukleotide mit einem handelsüblichen
Spotter in vierfacher Redundanz auf den Array aufgetragen und mit dem 5 ' -Ende kovalent an die Oberfläche gebunden:
a) Das Oligonukleotid ESRl-B-U-M13a
GTAAACGACGGCCAGTAGGAGGGGGAATTAAATAGA, dessen kursiv gedruckte Nukleotide mit dem zu amplifizierenden ESRl Amplifikat (Position (1-20) übereinstimmen.
b) Die Oligonukleotide ESRl-CG (TAGGTTTTCGGGGTAGGG) und ESR1-TG (TAGGTTTTTGGGGTAGGG) für die Bestimmung des Methylierungsstatus des CpG an Position 457-474 des ERSl-Amplifikats . c) Die Bisulfitsequenz des ESRl Gens (Acc. No. EP11141) ist nachfolgend dargestellt:
AGGAGGGGGAATTAAATAGAAAGAGAGATAAATAGAGATATATCGGAGTTTGGTACG GGGTATATAAGGTAGTATATTAGAGAAAGTCGGTTTTTGGATTCGTTTTTCGCGTTT ATTTTAAGTTTAGTTTTTTTTGGGTTATTTTTAGTAGATTTTCGTGCGTTTTCGTTT TTTGGTCGTGAAATTTAGTTTTTATTTAGTAGCGACGATAAGTAAAGTAAAGTTTAG GGAAGTTGTTTTTTGGGATGTTTAAATCGAGTTGTGTTTGGAGTGATGTTTAAGTTA ATGTTAGGGTAAGGTAATAGTTTTTGGTCGTTTTTTAGTATTTTTGTAATGTATATG AGTTCGGGAGATTAGTATTTAAAGTTGGAGGTTCGGGAGTTTAGGAGTTGGCGGAGG GCGTTCGTTTTGGGATTGTATTTGTTTTCGTCGGGTCGTTCGGTTTTATCGGATTCG TAGGTTTTCGGGGTAGGGTCGGGGTTAGAGTTCGCGTGTCGGCGGGATATGCGTTGC GTCGTTTTTAATTTCGGGTTGTGTTTTTTTTTTAGGTGGTTCGTCGGTTTTTGAGTT TTTTGTTTTGCGGGGATACGGTTTGTATTTTGTTCGCGGTTACGGATTATGATTATG ATTTTTTATATTAAAGTATTTGGGATGGTTTTATTGT
Die Verteilung der Oligonukleotide auf dem Array ist in Fig. 5 dargestellt.
2. Insitu-Amplifikation von ESRl
Die Insitu-Amplifikation wurde in der von der Epigenomics AG entwickelten Hybridisierungskammer durchgeführt. Hierzu wurden 200 μl der PCR-Lsg. (50 ng Bisulfit behandelte humane genomische DNA, dNTPs 0,25 mM, 0,5 μM Primer ESRl- B-L ACAATAAAACCATCCCAAATAC oder Primer ESR1-B-U-Ml3b CAGGAAACAGCTATGACACAATAAAACCATCCCAAATAC, 20 μl lOx Reaktionpuffer, 5 U Taq-Polymerase (Qiagen, Hilden) in ein Reaktionsgefäß (Volumen 500μl) gefüllt und mit Mineralöl überschichtet. Das Reaktionsgefäß wurde in die Denaturie- rungsposition der Hybridisierungskammer gestellt und mit einem Teflonschlauch mit der Reaktions (Hybridisierungs) - kammer verbunden (s. Fig. 4). Die PCR-Reaktion erfolgte durch ein Hinundherpumpen der PCR-Lösung zwischen Denatu- rierungsposition und der Reaktions- (Hybridisierungs-) - kammer. Dieser Vorgang wurde durch folgendes Pump/Temperaturprogramm gesteuert (Tab. 1, Schritt 1-8). Die PCR-Reaktion war beendet, nachdem die Programmschritte 2-7 38mal durchlaufen waren.
Tabelle: 1 Pumpen und Temperaturprogramm
Schritt Dauer T-Kammer Pumpe T-Denat. Position d. PCR- -Lsg.
1 15min 55°C aus 96°C D
2 lsec 55°C ein 96°C D->K
3 1min 55°C aus 96°C K
4 3min 70°C aus 96°C K
5 1min 96°C aus 96°C K
Schritt 2-5, 5mal wiederholen
6 lsec 55°C ein 96°C ' K->D
7 1min 55°C aus 96°C D
8 lsec 55°C ein 96°C D->K
9 1min 55°C aus 96°C K
10 3min 70°C aus 96°C K
11 15min 70°C aus 96°C K
12 lsec 70°C ein 25°C K->D
Schritt 6-10, 38mal wiederholen
8 oo 38°C aus 25°C D
PAUSE
Zugabe des Hybridisierungspuffers
9 3min 40°C aus 96°G D
10 lsec 40°C ein 96°C D->K
11 5min 40°C ein 96°C K<->K
12 lsec 40°C ein 96°C K->D
Schritt 9-12, 70mal wiederholen 3. Analyse des Methylierungsstatus
Nach der Insitu-Amplifikation (Schritt 8, Tab. 1) werden 400 μl Hybridisierungspuffer (6,9 x SSC, 2,7 Na-
Laurylsarccosinat) zum PCR-Ansatz im Reaktionsgefäß (De- naturierungsposition) pipettiert und der Hybridisie- rungsprozess gestartet (Schritt 9, Tab. 1). Nach 70 Wiederholungen der Schritte 9-12 wird die Hybridisierung be- endet und die Arrays werden gewaschen. Die getrockneten Arrays wurden in eine Fluoreszensscanner analysiert und der Methylierungsstatus nach einer bekannten Methode bestimmt (Model F., Adorjan P., Olek, A. , Piepenbrock, C, Bioinformatics . 2001, 17, Suppll : 157-64) .
Kurze Beschreibung der Figuren:
Fig. 1: ESR PCR-Produkt
M = Größenmarker, 1 = PCR Set 1, 2 = PCR Set 2
Fig. 2: Reaktionsgefäße (Bead Nr. B) : Bl: Beads nach der 2. Denaturierung; B2 : Beads nach der 3. Denaturierung; B3: Beads nach der 4. Denaturierung; B4 : keine Beads, kein Templat;
B5: keine Beads, 1 μl Bisulfit DNA
Fig. 3:
Die Serie a zeigt die PCR Ansätze mit dem Kontrollset für Bead Nr. 3. Da die Kontrolle 6a (Templat ohne M13 Domäne) negativ ist und die Kontrolle 7a (Templat mit M13 Domäne) positiv ist, kann auf eine erfolgreiche Verlängerung geschlossen werden. An der Kontrolle 6b kann man sehen, dass die verwendeten Primeroligonukleotide auch Templat ohne M13 Domäme reamplifizieren. Fig. 4: P Pumpe T Schläuche K Reaktionskammer
D Denaturierungsposition C Chip
Fig. 5: Schematische Darstellung des Chip Layouts:
Die schwarzen Punkte stellen die Positionen der immobilisierten Primer da (B) . Die Lage der
Methylierungsdetektionsoligos auf dem Chip werden durch weiße Punkte TG-Oligonukleotid (TAGGTTTTTGGGGTAGGG) und graue Punkte CG-Oligonukleotid (TAGGTTTTCGGGGTAGGG) dargestellt (A) .

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis von DNA-Polymorphismen und Cy- tosin-Methylierung, dadurch gekennzeichnet, dass man die folgenden Schritte ausgeführt: a) man gewinnt die zu untersuchende DNA aus einer Probe; b) die zu untersuchende DNA wird in einer Polymerase- raktion amplifiziert, wobei ein Primer in Lösung vorliegt und ein Primer an die Oberfläche einer Festphase gebunden ist und wobei mindestens einer der Primer aus zwei Domänen besteht, wobei die am 3 '-Ende befindliche an die zu untersuchende DNA hybridisiert, während die am 5 '-Ende befindliche nicht hybridisiert; c) die in Schritt c) amplifizierte DNA wird erneut amplifiziert, wobei die Primer dieser zweiten Amplifikation an die am 5 '-Ende befindliche Domäne indes- tens eines der ersten Primer hybridisieren oder zu ihr identisch sind und wobei diese Primer für die zweite Amplifikation mit einer nachweisbaren Markierung versehen sind; d) die Amplifikate werden an Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere hybridisiert, welche an eine Festphase gebunden sind, die in der Amplifikation nicht als Primer fungieren, und aus der Hybridisierung auf Sequenzmerkmale oder Methylierungsmuster der zu untersuchenden DNA geschlossen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in Schritt a) die zu untersuchende DNA nach der Gewinnung chemisch und/oder enzymatisch behandelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, dass die Primer der ersten Amplifikation (Schritt b) und die Oligonukleotide (Schritt d) auf derselben Festphase immobilisiert sind.
4. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphase eben ist.
5. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphase aus Glas,
Metall, inbesondere Gold oder Kunststoff ist.
6. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Beads als Festphase ver- wendet werden, wobei jeder Bead unterschiedlich codiert ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Beads über Fluoreszenzfarbstoffe, über ab- sorbierende Farbstoffe, über Chemiluminiszenz, über
Transponder, über Nuklide codiert sind oder über chemische Markierungen, welche sich massenspektro- metrisch nachweisen lassen.
8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 5-7, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche derart chemisch behandelt ist, dass die Oligonukleotide und Primer kovalent daran gebunden werden können.
9. Vorrichtung, bestehend aus a) einer Oberfläche, auf welcher Primeroligonukleotide mit ihrem 5'-Ende immobilisiert sind und zusätzlich Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere, welche von einer Polymerase nicht verlängert werden können; b) einer Kammer, wobei die Oberfläche eine Wand dieser Kammer bildet; c) einer Temperierungseinheit, welche die Kammertemperatur steuert; d) einem System, welches der Kammer Flüssigkeiten zuführt .
EP02791612A 2001-12-05 2002-12-05 Verfahren und integrierte vorrichtung zum nachweis von cytosinmethylierungen Withdrawn EP1451359A2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10160983 2001-12-05
DE10160983A DE10160983B4 (de) 2001-12-05 2001-12-05 Verfahren und Integrierte Vorrichtung zum Nachweis von Cytosinmethylierungen
PCT/DE2002/004507 WO2003054224A2 (de) 2001-12-05 2002-12-05 Verfahren und integrierte vorrichtung zum nachweis von cytosinmethylierungen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1451359A2 true EP1451359A2 (de) 2004-09-01

Family

ID=7708910

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP02791612A Withdrawn EP1451359A2 (de) 2001-12-05 2002-12-05 Verfahren und integrierte vorrichtung zum nachweis von cytosinmethylierungen

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1451359A2 (de)
AU (1) AU2002357968A1 (de)
DE (1) DE10160983B4 (de)
WO (1) WO2003054224A2 (de)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10236406C1 (de) * 2002-08-02 2003-12-24 Epigenomics Ag Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren mit geringer Komplexität
ES2281743T3 (es) * 2003-12-16 2007-10-01 Bayer Healthcare Llc Ensayo para detectar el estado de metilacion por extension con iniciadores especificos de metilacion (mspe).
WO2007032748A1 (en) * 2005-09-15 2007-03-22 Agency For Science, Technology & Research Method for detecting dna methylation
AT502549B1 (de) 2005-10-07 2007-06-15 Anagnostics Bioanalysis Gmbh Vorrichtung zur analyse von flüssigen proben

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5629158A (en) * 1989-03-22 1997-05-13 Cemu Bitecknik Ab Solid phase diagnosis of medical conditions
WO1993004199A2 (en) * 1991-08-20 1993-03-04 Scientific Generics Limited Methods of detecting or quantitating nucleic acids and of producing labelled immobilised nucleic acids
DE69232753T2 (de) * 1991-11-01 2003-05-15 Diatech Pty Ltd Feststoff-phase erweiterungsverfahren
US6310354B1 (en) * 1996-12-03 2001-10-30 Erkki Soini Method and a device for monitoring nucleic acid amplification reactions
EP1923471B1 (de) * 1999-04-20 2012-12-19 Illumina, Inc. Erkennung von Nukleinsäurereaktionen auf Bead-Arrays
DE19934084A1 (de) * 1999-07-15 2001-01-18 Universitaetsklinikum Charite Verfahren und Testbesteck zur Markierung von DNA-Fragmenten während einer PCR-Reaktion
DE19935772C2 (de) * 1999-07-26 2002-11-07 Epigenomics Ag Verfahren zur relativen Quantifizierung der Methylierung von Cytosin Basen in DNA-Proben
DE19952723C2 (de) * 1999-10-26 2002-10-31 Epigenomics Ag Vorrichtung und Verfahren zur Hybridisierung doppelsträngiger DNA-Proben an Oligomer-Arrays
JP4860869B2 (ja) * 1999-12-29 2012-01-25 オックスフォード ジーン テクノロジー アイピー リミティド 固相支持体上の複数のポリヌクレオチドを増幅し、検出する方法
DE10010280B4 (de) * 2000-02-25 2006-08-10 Epigenomics Ag Verfahren zur Detektion von Cytosin-Methylierung in DNA Proben

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO03054224A2 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003054224A2 (de) 2003-07-03
DE10160983B4 (de) 2004-12-09
AU2002357968A1 (en) 2003-07-09
WO2003054224A3 (de) 2003-10-30
DE10160983A1 (de) 2003-06-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1423533B1 (de) Verfahren zum nachweis von cytosin-methylierung mit hoher sensitivität
DE10056802B4 (de) Verfahren zur Detektion von Methylierungszuständen zur toxikologischen Diagnostik
WO2001077384A2 (de) DETEKTION VON SNPs UND CYTOSIN-METHYLIERUNGEN
WO1999028498A2 (de) Verfahren zur herstellung komplexer dna-methylierungs-fingerabdrücke
DE10112515A1 (de) Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungsmustern mit hoher Sensitivität
DE102005034628B4 (de) Verfahren zur Untersuchung von Cytosin-Methylierungen in DNA
DE10151055A1 (de) Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in CpG Inseln
DE10132212B4 (de) Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung durch vergleichende Analyse der Einzelstränge von Amplifikaten
EP1228247B1 (de) Verfahren zur kontrollierbaren durchführung komplexer pcr-amplifikationen
DE10119468A1 (de) Mikroarray-Verfahren zur Anreicherung von DNA-Fragmenten aus komplexen Mischungen
EP1292711B1 (de) Verfahren zur hochparallelen analyse von polymorphismen
DE10128508A1 (de) Verfahren und Nukleinsäuren für die Differenzierung von Prostata-Tumoren
EP1853724B1 (de) Verfahren zur untersuchung von cytosin-methylierungen in dna
EP1228246B1 (de) Verfahren zur unterscheidung von 5-position methylierungsänderungen
DE10160983B4 (de) Verfahren und Integrierte Vorrichtung zum Nachweis von Cytosinmethylierungen
EP1320632B1 (de) Verfahren zur altersbestimmung von individuen
DE10392538B4 (de) Verfahren zur Analyse von methylierten Nukleinsäuren
DE10013847A1 (de) Oligonukleotide oder PNA-Oligomere und Verfahren zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes genomischer DNA
EP1412524A2 (de) Nachweis spezifischer dinukleotide in dna-proben durch fluoreszenzresonanztransfer (fret)
EP1711628B1 (de) Verfahren zur kalibrierung und kontrolle von methylierungsanalyse-methoden mit hilfe von nicht-methylierter dna
DE10021204A1 (de) Verfahren zur hochparallelen Analyse von Polymorphismen
DE10065814B4 (de) Verfahren für die simultane Amplifikation vieler Sequenzen in einer PCR-Reaktion und deren Markierung
DE10044543A1 (de) Verfahren zur Bestimmung des Methylierungsgrades von bestimmten Cytosinen in genomischer DNA im Sequenzkontext 5&#39;-CpG-3&#39;
DE602005005333T2 (de) Verfahren zum Nachweis von homologen Sequenzen, welche sich durch eine Base unterscheiden, auf einem Mikroarray
DE20121978U1 (de) Nukleinsäuren für die Analyse von Astrocytomen

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20040629

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE SI SK TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: AL LT LV MK RO

RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: EPIGENOMICS AG

17Q First examination report despatched

Effective date: 20061106

GRAP Despatch of communication of intention to grant a patent

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR1

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20080403