WO2008110622A1 - Verfahren und testkit zum schnellen nachweis spezifischer nukleinsäuresequenzen, insbesondere zum nachweis von mutationen oder snp's - Google Patents

Verfahren und testkit zum schnellen nachweis spezifischer nukleinsäuresequenzen, insbesondere zum nachweis von mutationen oder snp's Download PDF

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WO2008110622A1
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fluorescence
detection
amplification
probes
reaction
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PCT/EP2008/053065
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Elmara Graser
Timo Hillebrand
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Aj Innuscreen Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Definitions

  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the target-specific amplification reaction is carried out, coupled with the probe hybridization reaction using fluorescence-labeled allele-specific amplification primers.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the fluorescence is detected by means of commercially available fluorescence readers.
  • a simple and inexpensive method for detecting specific nucleic acid sequences and mutative changes of the DNA sequence is the so-called RFLP analysis (Restriction Fragment Length Polymorphism).
  • RFLP analysis Restriction Fragment Length Polymorphism
  • a DNA segment containing the mutation site is amplified.
  • the PCR product is digested with an endonuclease which has its recognition sequence exactly at the mutation site.
  • the detection is carried out by means of electrophoresis.
  • the method can not be automated and does not allow parallel processing of large sample volumes.
  • a disadvantage of the method is that it is not universally applicable, since not every mutation site has a suitable nuclease recognition site. In addition, incomplete or inhibited nuclease digestion leads to false results.
  • SSCP analysis Single Strand Conformation Polymorphism
  • the method is based on the fact that the conformation of single-stranded DNA is essentially determined by the base sequence. After amplification of the target sequence to be assayed, the generated double-stranded PCR product is converted to single stranded conformation (e.g., by heating or treatment with a denaturing chemical) and then rapidly cooled on ice.
  • the single-stranded DNA is separated by native polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).
  • PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
  • This method is also suitable in principle for the detection of mutations, but is labor intensive, highly error prone and does not have an automation potential.
  • DNA sequencing Another classic method for detecting genetic alterations is DNA sequencing.
  • This widespread method is a safe method for detecting changes in specific nucleic acid sequences.
  • the disadvantage is the time required for it and the very high costs in principle.
  • High-throughput device systems cost well over € 100,000.
  • a novel method for the rapid detection of altered nucleic acid sequences is pyrosequencing. Particularly in the field of detection of SNPs, this method can be used to process a large sample volume.
  • this method is also bound to a very expensive device system and also requires a highly complex reaction chemistry.
  • a large number of work steps are necessary before the actual detection reaction can be started. This concerns the amplification of the target sequence to be investigated, their purification and subsequently the sequencing reaction.
  • PCR ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
  • a widely used method for the detection of single base changes can be achieved by means of the Light Cycler technology (Roche).
  • the company Roche developed special hybridization probes, consisting of two different oligonucleotides, each labeled with only one fluorochrome. At the 3 "end of one probe is the acceptor, the other oligonucleotide is provided at the 5" end with a donor.
  • the probes are chosen so that they both bind to the same strand of DNA, wherein the distance between acceptor and donor may only be a maximum of 1 to 5 nucleotides, so that it can come to the so-called FRET effect (fluorescence resonance energy transfer).
  • Double Dye probes which are disclosed in the patent US 5,210,015 A and US 5,487,972 A (TaqMan probes). Double Dye Probes carry two fluorochromes on a probe.
  • the reporter dye is here at the 5 "end, the quencher dye at the 3" end.
  • the 3 'end of the probe there is still a phosphate group so that the probe can not function as a primer during elongation.As long as the probe is intact, the intensity of light released is low since almost all of the light energy following the reporter's excitation due to the proximity of the quencher, it is captured and reshaped, and the emitted light from the reporter dye is "quenched", ie deleted. This FRET effect is also retained after the probe has bound to the complementary DNA strand. During the elongation phase, the polymerase hits the probe and hydrolyzes it.
  • the ability of the polymerase to hydrolyze an oligonucleotide (or probe) during strand synthesis is referred to as 5 "-3" exonuclease activity. Not all polymerases have a 5 "-3" exonuclease activity (Taq and Tth polymerase).
  • Taq and Tth polymerase This principle has been described for the Taq polymerase. The principle is called the TaqMan principle. After probe hydrolysis, the reporter dye is no longer in close proximity to the quencher. The emitted fluorescence is no longer transformed, this increase in fluorescence is measured.
  • C ⁇ value is determined.
  • C T cycle threshold
  • the C ⁇ value thus indicates a number of cycles. It is directly related to the initial amount of DNA used. If the C ⁇ value is low, the amount of DNA used is large. If the C T value is high, the initial amount of DNA is small. The C T value is therefore the basis for the quantification of a reaction. With this evaluation method, genotyping is also possible by comparing the C ⁇ values of both probes.
  • Another way to detect single base differences using Real Time PCR technology is the use of intercalating dyes (ethidium bromide, Hoechst 33258, Yo-Pro-1 or SYBR Green TM, etc.). These dyes emit, after excitation by high-energy UV light, light in the visible lower-energy wavelength range (fluorescence). If the dye is present as a free dye in the reaction mixture, the emission is very low. Only by the intercalation of the dye, ie by the incorporation into the small groove of double-stranded DNA molecules, the light emission is greatly enhanced.
  • the dyes are inexpensive and can be used universally, since in principle any PCR reaction can be followed in real time. In addition, they have a high signal strength, since each DNA molecule binds several dye molecules.
  • intercalating dyes do not distinguish between correct product and amplification artefacts (such as primer dimers or defective products). Emerging primers Dimers and other artifacts naturally also bind intercalating dyes and thus lead to a nonspecific increase in fluorescence even in negative samples. A clear differentiation between specific Amplif ⁇ kationsereignis or artifact but is absolutely necessary. To achieve this, one uses a so-called melting point analysis at the end of the actual PCR reaction. The reaction mixture is heated in 1 degree increments from 50 0 C to 95 0 C. In this process, the fluorescence is measured continuously.
  • the point at which double-stranded DNA melts is characterized by a decrease (peak) in the fluorescence of the intercalating dye, as the intercalating dye dissociates from the single-stranded DNA. If the PCR is optimally adjusted, expect a peak of melting point to be tapered. This melting point represents the specific, expected product. Differently sized products and products of different sequence have different melting points.
  • Real Time PCR methods are also suitable for the detection of single base differences to answer different question positions (mutation analysis, SNP genotyping, etc.) as well as for the specific detection of nucleic acids in general (eg pathogenicity testing ).
  • the great advantage of the method is the complexity of the analysis, i. the process of target specific amplification and the detection of e.g. Single base differences take place in a reaction vessel.
  • the real-time methods which function on the basis of the use of the illustrated different probe systems in combination of reporter and quencher, are characterized by a very high degree of diagnostic specificity. For this reason, methods of real-time PCR have become established worldwide for the treatment of molecular diagnostic issues, including the detection of mutations or SNPs.
  • the invention was therefore based on the object of developing a simple, universally usable and inexpensive method which makes it possible to detect specific nucleic acid sequences, in particular to provide a method for the detection of mutations or for SNP genotyping.
  • the object has been solved according to the features of the claims.
  • the erfmdungssiee method uses the advantages of high diagnostic sensitivity and specificity of already established fluorescence probe technologies in the field of real-time PCR methods and the advantage of being able to work on standard laboratory and existing equipment systems.
  • the previously required process of experimental work by the molecular sample preparation until the final analysis of the analysis data is reduced to a minimum.
  • the method according to the invention for rapid detection of specific nucleic acid sequences comprises the following steps:
  • the real-time PCR methods known from the prior art are always based on the continuous measurement and preparation of fluorescence signals.
  • the preparation of the continuously measured fluorescence signals is a highly complex algorithm.
  • the diagnostic result is therefore based on the preparation of the continuously measured (in real time) fluorescence, not on a so-called endpoint fluorescence determination.
  • No. 6,154,707 B1 discloses a method which enables genotyping of multiple alleles also in the form of the end point measurement of fluorescence after a 5'-exonuclease assay. The method is based on an algorithm which is based on first determining a relative fluorescence by comparison with an internal control and then comparing the unknown and genotyping samples with a specific control used for one allele.
  • the present invention makes use of a novel and universal method for allelic discrimination, which is eminently suitable for the detection of specific nucleic acid sequences, in particular for the determination of SNPs or other nucleic acid sequence changes (for example mutations).
  • the inventive method does not require real-time device systems, but requires a known thermal cycler and a device for measuring fluorescence. The purchase price of such devices is thus significantly cheaper than the necessary price for a real-time device.
  • the method according to the invention requires no optimization steps and no DNA standard samples.
  • the primers and probes can be used in any concentration, which is not possible with the AD-TaqMan ® -PCR assay. Since the method according to the invention requires no controls, it can discriminate against the alleles which carry very few mutations and for which no homozygous mutant genotypes are present.
  • the comparison with the negative controls is used in the AD-TaqMan ® -PCR assay only the contamination control.
  • the allele discrimination is based on the measurements of the negative controls (as can be seen from embodiment 2).
  • Another principal advantage of the method according to the invention compared to the known method is the freedom of probe selection. In all writings on the TaqMan ® technology -PCR- is not recommended to provide dyes having a reporter molecule or guanine to place in its vicinity. The probes must not have a G / C content above 80%. In the method according to the invention, these limitations do not play a role.
  • the method can be used for a variety of functionally quite different commercially available probe systems used for PCR hybridization methods based on Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) or other fluorescence detection methods. Possible is the use of so-called.
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • Probe systems such as e.g. TaqMan, Uniprimer, TripleHyb, Scorpions, Molecular Beacons or e.g. Terbium chelated probes.
  • different detection technologies are also used and can be analyzed by the method, such as, e.g. the use of TaqMan probes in an exonuclease assay or the use of allele-specific double-labeled primers in a standard PCR reaction.
  • the detection reactions take place in two stages.
  • the target-specific amplification reaction is carried out, coupled with the probe hybridization reaction or using fluorescently labeled allele-specific amplification primers.
  • This reaction can be performed on all commercially available PCR devices and is not limited to real-time PCR devices.
  • the detection of fluorescence is then also on commercially available fluorescence readers.
  • the inventive method uses the combination of a so-called. SpeedCyclers (Analytik Jena AG) and a fluorescence reader (SpeedScan, Anlaytik Jena AG).
  • SpeedCyclers Analytik Jena AG
  • a fluorescence reader SpeedScan, Anlaytik Jena AG
  • the advantage of this device combination is based on the patented and extremely fast amplification technology (patent) by means of the SpeedCycler, which makes it possible to realize the amplification / hybridization reaction in about 30 minutes.
  • the reaction mixtures contain e.g. the required reagents, which are also used for real-time PCR's.
  • the determination of a successful Amplif ⁇ kation or verification of an existing contamination takes place in that the signal strengths of the samples are compared with the signal strengths of the negative controls. This is done in order to exclude the samples, in which no successful Amplif ⁇ kation has taken place, from the subsequent evaluation. Is the Signal strength of the negative controls as strong as the signal strength of the samples, then there is a contamination of the samples. This also takes into account the known problem of sample contamination in PCR-based methods.
  • Genotyping is carried out by determining the quotient (K) of the end-point fluorescence of probe 1 (eg labeling for allele 1 or for the wild-type sequence) and probe 2 (eg labeling for allele 2 or one of the wild-type differing nucleic acid sequence). This measurement is completely independent of the known potential fluctuations of the PCR conditions and efficiencies of probe binding. After determining the average of the quotients (K) for the negative controls, one obtains a statement as to whether a homozygous genotype with allele 1 or a homozygous wild type is present or not, that is, whether the samples are homozygous or heterozygous.
  • the inventive method thus allows simple, rapid and reproducible the intended characterization of specific nucleic acid sequences, in particular with regard to the detection of mutations or the genotyping of SNPs.
  • the evaluation of the endpoint fluorescence values can be mapped in the form of computer software. Statistical variables (such as the standard deviation) can be easily determined. The determination of standard deviations is known to the person skilled in the art.
  • the method according to the invention does not require any internal reference samples as positive controls or as controls for the calculation of the fluorescence signals to be evaluated.
  • the inventive method allows the precise determination of mutations or the genotyping of SNPs, only taking into account the measured fluorescence maxima and fluorescence minima.
  • the inventive method can be applied to a variety of assay formats used based on the generation of fluorescence signals. In particular, the so-called TaqMan probes are very suitable for the implementation of the evidence.
  • the inventive method circumvents an existing limitation of the use of TaqMan probes.
  • Essential in the selection and design of TaqMan probes is that the reporter dye must not be bound to a guanine, since even after Exonukleaseverdau the fluorescence of the probe is deleted.
  • the GC content of the probe to be selected according to the patent US 6,154,707 Bl was between 20% and 80% and the Schmelztempera- structure of the probe does not exceed 70 0 C.
  • the reporter dye can also be coupled to a guanine, without an evaluation of the measured signals is negatively influenced by the solution of the fluorescence. The sensitivity of the method according to the invention is thus significantly higher than the method disclosed in the above patent.
  • the goal of the method according to the invention to realize the detection of mutations or the genotyping of SNPs with minimal experimental effort can be achieved by surprisingly further simple methods or means. This takes into account the complex experimental process steps, which involve the modern methods of molecular diagnostic tests in a comprehensive overall process.
  • test kit according to the invention.
  • reaction mixtures are subsequently pipetted for the described molecular-biological detection methods necessary amplification / detection reactions.
  • the detection reaction can then be started.
  • the method according to the invention makes use of a very simple means to minimize the steps required to establish the amplification / detection reactions:
  • nucleic acids can be carried out with an elution buffer, the composition of salts; including Mg 2+ ions, and optionally further additives such as BSA (bovine serum albumin), and allows it to be used directly in subsequent amplification / detection reactions.
  • an elution buffer allows efficient elution of the bound DNA and thus inevitably ensures that the components required for the subsequent amplification / detection reactions (amplification buffer, Mg 2+ ions, further PCR additives) no longer have to be separately pipetted together.
  • the molar composition of the elution buffer according to the invention can be adjusted so that subsequent dilution with water can be carried out or such a dilution is also dispensed with, ie the eluent can then be used directly in the detection reactions.
  • the dual functionality of the elution buffer according to the invention thus enables a highly efficient elution and a time and labor savings in the necessary preparation of the reaction mixture for amplification / detection reaction.
  • reaction mixtures for example by lyophilization, can be converted into a storage-stable state and can reactivate such an approach by the addition of an aqueous phase.
  • stabilization do not always take place without problems and require considerable expenditure on equipment.
  • the biological activity of enzymes is no longer or not fully realized.
  • the invention makes it possible to extremely simplify the pipetting effort in the combination of a novel elution buffer in the process of DNA isolation and using the modified plastic produced according to the invention with the components required for the amplification / detection reactions.
  • a defined volume of the elution buffer is transferred only into a plastic which is storage-stable modified with the other specific reaction components and the amplification / detection reaction is started.
  • This simplification-in combination with the method according to the invention for allelic discrimination-thus makes it possible to carry out routinely feasible, simple and extremely rapid performance of molecular diagnostic tests for the detection of mutations or for SNP genotyping.
  • a particularly efficient embodiment is the use of a SpeedCycler (Analytik Jena AG) for the extremely fast amplification / detection reaction and the subsequent measurement on a commercially available fluorescence Reader (SpeedScan, Analytik Jena AG).
  • the use of this device combination allows the execution of the tests in an extremely short time due to the extremely fast amplification reactions. All the steps required, from DNA isolation using the elution buffer according to the invention, the use of the storage-stabilized reaction plastic for the amplification / detection reaction and the execution of these reactions on a SpeedCycler / SpeedScan and the integration of the evaluation algorithm into a computer-aided software solution, allow the determination of mutations or SNPs in less than an hour.
  • the present invention can make a valuable contribution to the routine establishment of molecular genetic tests, in particular to the so-called individualized medicine, which is increasingly becoming the focus of attention.
  • the coating solution was placed on the PCR microplate and dried for about 2 hours at physiological temperature conditions of 37 ° C. After drying, the plates were taped with a sealing film and stored at RT for 4 months and tested in a comparison reaction with freshly added reaction components.
  • the example illustrates that the use of the storage stable coated reaction plastic shows no loss of activity compared to fresh added reaction components.
  • the method according to the invention was subsequently used for SNP genotyping of human DNA samples.
  • the results obtained by the method according to the invention were then sequenced for verification.
  • the results of sequencing and genotyping by means of the method according to the invention are summarized.
  • a mutation in the promoter of the human MDM2 gene (SNP 309) [Bond GL et al. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 2004 Nov 24; 119 (5): 591-602].
  • the amplification / detection reaction of the sample nucleic acids used were carried out by means of Analytik Jena AG SpeedCycler (amplification / hybridization) and SpeedScan (detection of end-point fluorescence).
  • Sense primer 5'CGC GGG AGT TCA GGG TAA-3 'Antisense primer: 5'-CCC AAT CCC GCC CAG ACT AC-3'
  • hybridization probes used were the following double-fluorescence-labeled oligonucleotides, wherein the GC content in both probes is> 80% and the melting temperature is greater than 70 ° C.: Wild type probe: 5'-FAM-GGG CCG CTT CGG CGC GGG -BHQ 1-3 'Probe Mutated: 5'-ROX-GGC CGC TGC GGC GCG-BHQ2-3'
  • the amplification / hybridization reaction took about 35 minutes at 40 performed
  • genotyping by means of the method according to the invention is listed below.
  • Step 1 Determination of a successful amplification or verification of an existing contamination.
  • sample 2 is homozygous wild type and further calculations for sample 2 need not be made since the difference between the mean of the negative controls and the quotient K of the sample 2 is larger as the difference between the maximum value and the quotient K of the sample 2 considering the standard deviation.
  • Sample 3 can in no case have a homozygous wild-type genotype and the affiliation to the other two genotype groups must be checked, since the difference between the maximum value and the quotient K of the sample 3 taking into account the standard deviation is greater than negative controls and the Quotient K of the sample 3.
  • sample 5 For sample 5:
  • Sample 5 can by no means have a homozygous wild-type genotype, and membership in the other two genotype groups must be checked, since the difference between the maximum value and the quotient K of sample 5, taking into account the standard deviation, is greater than negative controls and the quotient K of the sample 5.
  • sample 3 It follows from the comparison of the average of the negative controls with the minimum value that the sample 3 can by no means have a homozygous mutant genotype since it has already been calculated above and that it is not homozygous wild type but only can be heterozygous, since the difference between the average of the negative controls and the quotient K of the sample 3 is smaller than the difference between the minimum value and the quotient K of the sample 2 taking into account the standard deviation.
  • genotypes of the samples were defined.
  • the above calculation was performed in a logical sequence suitable for a computer algorithm.
  • genotyping was carried out on the basis of 48 different sample nucleic acids.
  • the results obtained by means of the method according to the invention were checked by means of sequencing. The comparison is shown in the following table.
  • Genotyping was carried out by the method according to the invention as follows:
  • the swabs were subsequently isolated by means of a commercially available DNA extraction kit (innuPREP DNA Mini Kit, aj Innuscreen GmbH).
  • the kit is based on the lysis of the Starting material, the subsequent binding of the DNA to the surface of a filter material (spin filter column), the washing of the bound DNA and finally the elution of the DNA by means of water or by means of a solution containing 10 mM Tris HCl.
  • the elution buffer according to the invention was used (33 mM tricine KOH, 14 mM KCl, 4.2 mM MgCl 2 , 3.5 ⁇ g / ml BSA, pH 9).
  • the DNA was eluted from the spin filter column after addition of 500 ⁇ l of the eluent.
  • the eluted DNA was then used directly for the amplification / detection reaction.
  • the reaction plastic was prepared as described under Example 1 and coated with the following components:
  • the coating solution was placed on the PCR microplate and dried for approximately 2 hours at physiological temperature conditions of 37 ° C.
  • Sense primer 5'-GCC TCT GGG CTA ATA GGA CTA CTT C-3 '
  • Antisense primer 5 '-TTT CTG AAA GGT TAC TTC AAG GAC AA-3'
  • hybridization probes used were the following double-fluorescence-labeled oligonucleotides: Probe wild-type: 5'-FAM-ACC TGT ATT CCT CGC CT-BHQ 1-3 '

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Testkit zum schnellen Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen, insbesondere zum Nachweis von Mutationen oder SNP's (SNP = Single nucleotid polymorphism), wobei die Nachweisreaktion zweistufig erfolgt. In einem ersten Schritt erfolgt die targetspezifische Amplifikationsreaktion, gekoppelt mit der Sondenhybridisierungsreaktion unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten allelspezifischen Amplifikations-Primern. Im zweiten Schritt erfolgt der Nachweis der Fluoreszenz mittels handelsüblichen Fluoreszenz-Readern. Die Genotypisierung erfolgt aus dem Quotienten der Endpunktfluoreszenz der Proben und der Negativkontrollen.

Description

Verfahren und Testkit zum schnellen Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen, insbesondere zum Nachweis von Mutationen oder SNP's
Beschreibung
[0001] Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Testkit zum schnellen Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen, insbesondere zum Nachweis von Mutationen oder SNP's (SNP = Single Nucleotid Polymorphism), wobei die Nachweisreaktion zweistufig erfolgt. In einem ersten Schritt erfolgt die targetspezifische Amplifikationsreaktion, gekoppelt mit der Sondenhybridisie- rungsreaktion unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten allelspezifischen Amplifikations- Primern. Diese Reaktion kann auf allen handelsüblichen PCR-Geräten (PCR = Polymerase Chain Reaction) erfolgen und ist nicht auf Real-Time PCR-Geräte begrenzt. Im zweiten Schritt erfolgt der Nachweis der Fluoreszenz mittels handelsüblichen Fluoreszenz-Readern.
Stand der Technik
[0002] Gendiagnostik ist zu einem unverzichtbaren Bestandteil der modernen Labordiagnostik und Grundlagenforschung in der Medizin geworden. Zugehörigkeit zu den Risikogruppen der Erkrankungen des Stoffwechsels, der Blutbildung bzw. onkologischen Erkrankungen und die Therapieempfehlungen bei diesen Erkrankungen sind nur einige Beispiele der angewandten Mutationsdiagnostik.
[0003] Im Laufe der vergangenen Jahre wurden für diese Zwecke eine Vielzahl von Methoden entwickelt, die es gestatten, veränderte Nukleinsäuresequenzen, insbesondere von Einzelbasen- Veränderungen, zu detektieren.
[0004] Eine einfache und preiswerte Methode zum Nachweis von spezifischen Nukleinsäuresequenzen und von mutativen Veränderungen der DNA Sequenz ist die sog. RFLP -Analyse (Restriction Fragment Length Polymorphism). Ein DNA-Abschnitt, der die Mutationsstelle bein- haltet, wird amplifiziert. Anschließend wird das PCR-Produkt mit einer Endonuklease verdaut, die ihre Erkennungssequenz genau an der Mutationsstelle hat. Der Nachweis erfolgt mittels E- lektrophorese. Das Verfahren ist allerdings nicht automatisierbar und erlaubt keine parallele Bearbeitung großer Probenumfänge. [0005] Nachteilig ist die Methode dahingehend, dass sie nicht universell einsetzbar ist, da nicht jede Mutationsstelle eine passende Nuklease-Erkennungsstelle besitzt. Darüber hinaus führt ein unvollständiger oder gehemmter Nukleaseverdau zu falschen Ergebnissen.
[0006] Eine weitere Methode zum Nachweis von Mutationen, welche relativ preiswert durch- führbar ist, ist die sog. SSCP Analyse (Single Strand Conformation Polymorphism). Die Methode beruht darauf, dass die Konformation einzelsträngiger DNA wesentlich durch die Basensequenz bestimmt wird. Nach Amplifϊkation der zu untersuchenden Zielsequenz wird das erzeugte dop- pelsträngige PCR-Produkt in die Einzelstrang- Konformation überführt (z.B. durch Erhitzung oder Behandlung mit einer denaturierenden Chemikalie) und anschließend auf Eis schnell abge- kühlt.
[0007] Die Einzelstrang-DNA wird mittels nativer Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) aufgetrennt. Bei Vorliegen einer Mutation verändert sich das Migrationsverhalten im Gel. Das Ergebnis wird nach Färbung des Gels visualisiert. Auch dieses Verfahren ist prinzipiell zum Nachweis von Mutationen geeignet, ist aber arbeitsintensiv, stark fehlerträchtig und verfügt nicht über ein Automatisierungspotenzial.
[0008] Weitere Methoden zum Nachweis von Einzelbasenveränderungen sind die Temperaturgradienten-Gelelektrophorese, die Denaturierende-Gradienten-Gel-Elektrophorese oder Heteroduplex- Analysen. [0009] All diese Methoden sind klassische Verfahren, welche in Forschungslaboren zum Nach- weis von genetischen Veränderungen eingesetzt wurden und werden.
[0010] Ein weiteres klassisches Verfahren zum Nachweis von genetischen Veränderungen ist die DNA Sequenzierung. Diese weitverbreitete Methode ist ein sicheres Verfahren zum Nachweis von Veränderungen spezifischer Nukleinsäuresequenzen. Nachteilig ist der dafür benötige Zeitaufwand sowie die prinzipiell sehr hohen Kosten. Hochdurchsatzfähige Gerätesysteme kosten weit mehr als 100.000 €. Eine neuartige Methode zum schnellen Nachweis von veränderten Nukleinsäuresequenzen ist das Pyrosequencing. Besonders im Bereich der Detektion von SNP 's kann mit diesem Verfahren ein hohes Probenaufkommen bearbeitet werden. Allerdings ist auch dieses Verfahren an ein sehr teures Gerätesystem gebunden und bedarf darüber hinaus auch einer hochkomplexen Reaktionschemie. Darüber hinaus sind, wie auch bei der klassischen DNA Sequenzie- rung, eine Vielzahl von Arbeitsschritten notwendig, bevor die eigentliche Nachweisreaktion gestartet werden kann. Dies betrifft die Amplifikation der zu untersuchenden Zielsequenz, deren Aufreinigung und nachfolgend die Sequenzierungsreaktion. [0011] Eine weitere Möglichkeit zum Nachweis von Einzelbasenveränderungen ist der sog. PCR-ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Bei dieser Methode wird die zu untersuchende DNA-Sequenz ebenfalls wieder amplifϊziert und das erzeugte DNA-Fragment nachfolgend an einer festen Phase (z.B. Mikrotiterplatte) kovalent immobilisiert, nachfolgend zu einem Einzelstrang denaturiert und mit einer allelspezifϊschen Sonde hybridisiert. Die erfolgreiche Anbindung der Sonde kann durch eine antikörpervermittelte Farbreaktion sichtbar gemacht werden. Aber auch dieses Verfahren beinhaltet sehr viele experimentelle Arbeitsschritte und ist darüber hinaus auch störanfällig. Vorteil eines solchen Verfahrens ist, dass die dafür benötigten Gerätesysteme preiswerter als z.B. Sequenzierungsautomaten sind. [0012] Seit einigen Jahren erfolgte auch eine Reihe von methodischen Entwicklungen zur Bestimmung von Einzelbasenunterschieden mittels der Bio-Chiptechnologien. Hierbei soll auf erzeugten kleinformatigen DNA-Rastern (z.B. basierend aus zuvor amplifϊzierten PCR-Produkten) mittels spezifischer Hybridisierungsreaktionen mit markierten Oligonukleotiden ein hochparalleler Nachweis von Einzelbasenveränderungen möglich sein. Diese Technologie ist wiederum ex- trem teuer und beinhaltet auch das notwendige Abarbeiten einer Vielzahl von Reaktionsschritten. Darüber hinaus ist eine umfangreiche experimentelle Expertise notwendig, so dass die Arbeiten nicht in diagnostischen Routinelabors durchgeführt werden können. Diese Verfahren sind mit Sicherheit auch nicht dafür geeignet, auch geringe Probenzahlen effizient und preislich attraktiv zu bestimmen. [0013] Eine prinzipiell sehr schnelle und ohne großen experimentellen Aufwand realisierbare Möglichkeit zum Nachweis von Einzelbasendifferenzen kann mittels der sog. Real Time PCR- Methoden erreicht werden. Im Unterschied zu den bereits kurz beschriebenen Methoden erfolgt hierbei die Nachweiseaktion als integratives Verfahren, dass heißt, die Amplifikationsreaktion ist mit der eigentlichen Nachweisreaktion direkt gekoppelt. Damit kann der benötigte experimentelle Aufwand deutlich reduziert werden. Auch eignen sich Real Time PCR Methoden für die Untersuchung von einzelnen Proben wie auch zur Untersuchung von Proben im hohen Durchsatzbereich.
[0014] Die Durchführung von Nachweisen von Einzelbasenveränderungen mittels Real Time PCR kann dabei auf verschiedenen Wegen erfolgen. Die Unterschiede betreffen dabei zum einen das eingesetzte Gerätesystem sowie die Verwendung unterschiedlicher Sondensysteme zum spezifischen Nachweis der Zielsequenz.
[0015] Eine weit verbreitete Methode zum Nachweis von Einzelbasenveränderungen kann mittels der Light Cycler Technologie (Fa. Roche) erreicht werden. [0016] Die Firma Roche entwickelte dazu spezielle Hybridisierungssonden, bestehend aus zwei verschiedenen Oligonukleotiden, die jeweils mit nur einem Fluorochrom markiert sind. Am 3"- Ende der einen Sonde befindet sich der Akzeptor, das andere Oligonukleotid ist am 5 "-Ende mit einem Donor versehen. Die Sonden werden so gewählt, dass sie beide an den gleichen DNA Strang binden, wobei der Abstand zwischen Akzeptor und Donor nur maximal 1 bis 5 Nukleotide betragen darf, damit es zum sog FRET-Effekt (Fluorescence Resonance Energy Transfer) kommen kann.
[0017] Die Messung der Fluoreszenz erfolgt während des Annealingschrittes, wobei nur Licht dieser Wellenlänge nachweisbar ist, solange beide Sonden an die DNA gebunden sind. Der Schmelzpunkt beider Sonden sollte bei diesem System identisch sein. Durch die Verwendung zweier hybridisierender Sonden zusätzlich zu den verwendeten Primern ist die Spezifität dieses Detektionsystems äußerst hoch. Nachteilig gestaltet sich das schwierige Sonden-Design. Darüber hinaus ist wiederum ein extrem teures Gerätesystem für die Durchführung der Nachweisreaktionen notwendig. [0018] Eine weitere Real Time PCR Anwendung zum Nachweis von Einzelbasenveränderungen kann mit sog. Double Dye Sonden, welche in der Patentschrift US 5,210,015 A und US 5,487,972 A offenbart sind (TaqMan-Sonden), durchgeführt werden. Double Dye Sonden tragen zwei Fluorochrome auf einer Sonde. Der Reporterfarbstoff befindet sich hier am 5 "-Ende, der Quencherfarbstoff am 3 "-Ende. Zusätzlich befindet sich am 3 "-Ende der Sonde noch eine Phosphatgruppe, damit die Sonde bei der Elongation nicht als Primer fungieren kann. Solange die Sonde intakt ist, ist die freigesetzte Lichtstärke gering, da fast die gesamte Lichtenergie, die nach der Anregung des Reporters entsteht, aufgrund der räumlichen Nähe vom Quencher aufgenommen und umgeformt wird. Das emittierte Licht des Reporterfarbstoffes wird „gequenched", d.h. gelöscht. Dieser FRET-Effekt bleibt auch erhalten, nachdem die Sonde an den komplementären DNA-Strang gebunden hat. Während der Elongationsphase trifft die Polymerase auf die Sonde und hydrolysiert sie. Man bezeichnet die Fähigkeit der Polymerase, ein Oligonukleotid (bzw. eine Sonde) während der Strangsynthese zu hydrolysieren, als 5 "-3" Exonukleaseaktivität. Nicht alle Polymerasen haben eine 5 "-3" Exonukleaseaktivität (T aq- und Tth-Polymerase). Als erstes wurde dieses Prinzip für die Taq-Polymerase beschrieben. Das Prinzip wird als TaqMan-Prinzip bezeichnet. Nach Sondenhydrolyse befindet sich der Reporterfarbstoff nicht mehr in räumlicher Nähe zum Quencher. Die emittierte Fluoreszenz wird jetzt nicht mehr umgeformt, dieser Fluoreszenzanstieg wird gemessen.
[0019] Für jede angesetzte Sonde wird daher ein sog. Cτ-Wert ermittelt. Der Schnittpunkt zwischen der Fluoreszenz der Probe und dem Schwellenwert (Hintergrundfluoreszenz) projiziert auf die Abszisse wird als Cycle-threshold (CT) bezeichnet und stellt den niedrigsten messbaren positiven Wert der PCR dar. Der Cτ-Wert gibt also eine Zyklenanzahl an. Er steht in direkter Beziehung zur Ausgangsmenge der eingesetzten DNA. Ist der Cτ-Wert niedrig, ist die eingesetzte Menge DNA groß. Ist der CT- Wert hoch, so ist die Ausgangsmenge an DNA klein. Der CT- Wert ist daher Grundlage für die Quantifizierung einer Reaktion. Mit dieser Auswertungsmethode ist auch eine Genotypisierung möglich, indem man die Cτ-Werte beider Sonden vergleicht. [0020] Eine weitere Möglichkeit zum Nachweis von Einzelbasenunterschieden mittels Real Time PCR Technologie besteht in der Nutzung von interkalierenden Farbstoffen (Ethidiumbromid, Hoechst 33258, Yo-Pro-1 oder SYBR Green™ u.a.). Diese Farbstoffe emittieren, nach Anregung durch energiereiches UV-Licht, Licht im sichtbaren energieärmeren Wellenlängenbereich (Fluoreszenz). Liegt der Farbstoff als freier Farbstoff im Reaktionsgemisch vor, ist die Emission sehr gering. Erst durch die Interkalierung des Farbstoffs, d.h. durch die Einlagerung in die kleine Furche doppelsträngiger DNA-Moleküle wird die Lichtemission stark verstärkt. Die Farbstoffe sind preiswert und universell verwendbar, da mit ihnen prinzipiell jede PCR-Reaktion in Echtzeit ver- folgt werden kann. Außerdem haben sie eine hohe Signalstärke, da jedes DNA-Molekül mehrere Farbstoffmoleküle bindet. Aus den Vorteilen resultiert aber auch ein extremer applikativer Nachteil: Durch interkalierende Farbstoffe kann man prinzipiell nicht zwischen korrektem Produkt und Amplifϊkations-Artefakten (wie z.B. Primer Dimeren oder Fehlprodukten) unterscheiden. Entstehende Primer Dimere und andere Artefakte binden naturgemäß ebenfalls interkalierende Farb- Stoffe und führen somit zu einem unspezifischen Anstieg der Fluoreszenz auch in negativen Proben. Eine klare Differenzierung zwischen spezifischem Amplifϊkationsereignis bzw. Artefakt ist aber zwingend notwendig. Um dies dennoch zu erreichen, nutzt man eine sog. Schmelzpunktanalyse am Ende der eigentlichen PCR-Reaktion. Das Reaktionsgemisch wird dabei in 1 Grad- Schritten von 500C auf 95 0C erhitzt. Bei diesem Prozess wird kontinuierlich die Fluoreszenz gemessen. Der Punkt, an dem doppelsträngige DNA schmilzt, ist durch einen Abfall (Peak) der Fluoreszenz des interkalierenden Farbstoffes gekennzeichnet, da der interkalierenden Farbstoff von der einzelsträngigen DNA dissoziiert. Wenn die PCR optimal eingestellt ist, sollte ein Schmelzpunktpeak zu erwarten sein, der spitz zuläuft. Dieser Schmelzpunkt stellt das spezifische, zu erwartende Produkt dar. Unterschiedlich große Produkte und Produkte anderer Sequenz haben unterschiedliche Schmelzpunkte.
[0021] Trägt man die Fluoreszenz gegen die Temperatur graphisch auf, so kann man den Fluoreszenzabfall beider Produkte als zwei getrennte Schmelzpunkte wahrnehmen. Damit gewinnt dieses System an Spezifität und erlaubt es, ein spezifisches Amplifϊkations-Produkt von Artefak- ten zu unterscheiden. Auf diese Weise ist es möglich, auch zwischen homozygot (ein Peak) und heterozygot (zwei Peaks) zu unterscheiden.
[0022] Wie schon erwähnt und dem Fachmann bekannt, eignen sich Real Time PCR Methoden auch für den Nachweis von Einzelbasenunterschieden zur Beantwortung unterschiedlicher Frage- Stellungen (Mutationsanalyse, SNP-Genotypisierung etc.) als auch zum spezifischen Nachweis von Nukleinsäuren im Allgemeinen (z.B. Pathogenitätstestung). Der große Vorteil der Methode besteht in der Komplexität der Analyse, d.h. der Vorgang der targetspezifischen Amplifikation und der Nachweis von z.B. Einzelbasenunterschieden erfolgen in einem Reaktionsgefäß. Insbesondere die Real Time Verfahren, welche auf der Basis der Verwendung der dargestellten unter- schiedlichen Sondensysteme in Kombination von Reporter und Quencher fungieren, zeichnen sich durch ein sehr hohes Maß an diagnostischer Spezifität aus. Aus diesem Grund haben sich Methoden der Real Time PCR weltweit für die Bearbeitung molekulardiagnostischer Fragestellungen, auch für den Nachweis von Mutationen oder SNPs, durchgesetzt. Gemeinsam ist aber auch allen diesen Verfahren, dass sie auf sehr teuren Geräteplattformen implementiert sind, wel- che den Prozess sowohl der Amplifikation als auch nachfolgenden, der Fragestellung entsprechenden optischen Detektion in einer Hardware-Lösung vereinen müssen. Weiterhin basieren viele dieser beschriebenen Nachweisverfahren immer auf der Echtzeitverfolgung des Amplifika- tionsprozesses. Auf dieser Strategie basierend, erfolgt auch die Aufarbeitung der gemessenen Fluoreszenzwerte im Verlauf der Amplifikationsreaktion. Dem Fachmann ist klar, dass damit verbunden auch ein enorm hoher Grad an Analysealgorithmen in Real Time Systeme integriert sein muss. Dies erklärt letztlich den hohen finanziellen Aufwand, der für die Nutzung von Real Time PCR Systemen investiert werden muss.
[0023] Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zu Grunde, ein einfaches, universell nutzbares und preiswertes Verfahren zu entwickeln, welches es gestattet, spezifische Nukleinsäuresequen- zen zu detektieren, insbesondere ein Verfahren zum Nachweis von Mutationen oder zur SNP Genotypisierung bereitzustellen.
[0024] Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst. Das erfmdungs- gemäße Verfahren nutzt dabei die Vorteile der hohen diagnostischen Sensitivität und Spezifität, von bereits etablierter Fluoreszenz-Sonden-Technologien aus dem Bereich von Real time PCR Methoden und den Vorteil, auf laborüblichen und vorhandenen Gerätesystemen arbeiten zu können. Darüber wird der bisher notwendige Prozess der experimentellen Arbeiten von der moleku- laren Probenvorbereitung bis hin zur finalen Auswertung der Analysedaten auf ein Minimum reduziert.
[0025] Das erfindungsgemäße Verfahren zum schnellen Nachweis spezifischer Nukleinsäurese- quenzen umfasst die folgenden Schritte:
1. Isolierung der Nukleinsäuren
2. Amplifikation der spezifischen Targetsequenz, gekoppelt mit der Sondenhybridisierungsreak- tion unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten allelspezifischen Amplifikations-Sonden 3. Endpunktmessung der Fluoreszenz ohne Referenzfarbstoffe zur Relativierung der Reaktionsschwankungen und ohne den Vergleich zu bereits genotypisierten Standardproben
4. Vergleich der Endpunktmessung der Fluoreszenz mit Negativ- Kontrollen (Proben, welche die Sonden, aber keine DNA enthalten),
5. Bestimmung der Genotypisierung aus dem Quotient der Endpunktfluoreszenz der Sonden.
[0026] Wie schon aufgeführt, basieren die nach dem Stand der Technik bekannten Real-Time- PCR-Methoden immer auf der kontinuierlichen Messung und Aufbereitung von Fluoreszenzsignalen. Die Aufbereitung der kontinuierlich gemessenen Fluoreszenzsignale ist dabei ein hochkomplexer Algorithmus. Das diagnostische Ergebnis basiert also auf der Aufbereitung der konti- nuierlich (in Echtzeit) gemessenen Fluoreszenz, nicht auf einer sog. Endpunktfluoreszenzbe- stimmung.
[0027] Bei der Nutzung der sog. Light Cycler Technologie ist eine Endpunktfluoreszenzmessung nicht möglich, da der FRET- Effekt ausschließlich während der Sondenanlagerung gemessen werden kann. [0028] Eine Endpunktmessung ist auch bei der Nutzung von interkalierenden Farbstoffen wegen ihrer schon beschriebenen Unspezifität der Fluoreszenz nur begrenzt möglich. Darüber hinaus ist die Differenzierung zwischen unterschiedlichen Allelen ohne die beschriebene Schmelzpunktmessung nicht möglich. [0029] In der Patentschrift US 6, 154,707 Bl wird eine Methode offenbart, die eine Genotypisie- rung von multiplen Allelen auch in Form der Endpunktmessung von Fluoreszenz nach einem 5'- Exonuklease Assay ermöglicht. Dem Verfahren liegt ein Algorithmus zu Grunde, der darauf basiert, dass zunächst eine relative Fluoreszenz durch einen Vergleich mit einer internen Kontrolle bestimmt wird und anschließend die unbekannten und zu genotypisierenden Proben mit jeweils einer für ein Allel eingesetzten spezifischen Kontrolle verglichen werden. Das bedeutet, das Ver- fahren benötigt und berücksichtigt passive interne Referenzstoffe sowie jeweils Positiv- Kontrollen, welche den zu definierenden Allelen entsprechen müssen. Die internen Kontrollen sind notwendig, um Fehler der Amplifikationskonditionen (z.B. Pipettierfehler, Hemmung der Amplifϊkation, Bindungseffizienzen der Sonden usw.) zu kompensieren. In: Mol. Pathol. (1999) 52 (5) 295 :-9 (Shi M.M. u.p.: High throughput genotyping for the detection of a single nucleotide polymorphism in NAD(P)H quinone oxidoreductase (DT diaphorase) using TaqMan probes) wurde die in US 6,154,707 Bl patentierte Methode wissenschaftlich beschrieben.
[0030] Die vorliegende Erfindung bedient sich eines neuartigen und universellen Verfahrens zur Alleldiskriminierung, das sich hervorragend zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen, insbesondere zur Bestimmung von SNP's oder anderen Nukleinsäuresequenzveränderungen (z.B. Mutationen), eignet. Das erfindungsgemäße Verfahren benötigt keine Real-Time Gerätesysteme, sondern benötigt einen an sich bekannten Thermocycler und ein Gerät zur Messung einer Fluoreszenz. Der Anschaffungspreis diesbezüglicher Geräte ist damit deutlich preiswerter als der notwendige Preis für ein Real-Time Gerät.
[0031] Das erfindungsgemäße Verfahren bedient sich dabei nicht der in der Patentschrift US 6,154,707 Bl und in Mol. Pathol. (1999) 52 (5) 295:-9 (AD-TaqMan®-PCR-Assay) benötigten internen Kontrollen bzw. Referenzproben. Wie in Mol. Pathol. (1999) 52 (5) 295:-9 beschrieben wurde (Seite 297) erfordert das Assay Kalibrierungsschritte, für die bereits genotypisierte homozygote Wildtyp- und mutante Proben, die als Standards dienen.
[0032] Das erfindungsgemäße Verfahren dagegen benötigt keine Optimierungsschritte und keine DNA-Standardproben. Die Primer und Sonden können in beliebiger Konzentration angesetzt werden, was bei dem AD-TaqMan®-PCR-Assay nicht möglich ist. Da das erfindungsgemäße Verfahren keine Kontrollen benötigt, können damit die Allele diskriminiert werden, die sehr sel- tene Mutationen tragen und für die keine homozygot mutanten Genotypen vorhanden sind.
[0033] Der Vergleich mit der Negativkontrollen dient im AD-TaqMan®-PCR- Assay lediglich der Kontaminationskontrolle. Im erfindungsgemäßen Verfahren basiert die Allel-Diskriminierung auf den Messungen der Negativkontrollen (wie es aus dem Ausführungsbeispiel 2 ersichtlich wird). Ein weiterer prinzipieller Vorteil der erfindungsgemäßen Methodik im Vergleich zum bekannten Verfahren besteht in der Freiheit der Sondenauswahl. In sämtlichen Schriften zur TaqMan®-PCR- Technologie wird davon abgeraten, Reporterfarbstoffe mit einem Guanin- Molekül zu versehen bzw. in seiner Nähe zu platzieren. Die Sonden dürfen keinen G/C-Gehalt über 80% aufweisen. Im erfindungsgemäßen Verfahren spielen diese Begrenzungen keine Rolle. [0034] Das Verfahren kann für eine Vielzahl funktional ganz verschiedener kommerziell verfügbarer Sondensysteme, die für PCR-Hybridisierungsverfahren eingesetzt werden und auf einem Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) bzw. anderen Fluoreszenzdetektionsverfahren basieren, verwendet werden. Möglich ist die Verwendung von sog. kommerziell angebotenen
Sondensystemen wie z.B. TaqMan , Uniprimer , TripleHyb , Scorpions , Molecular Bea- cons oder z.B. Terbium Chelat Sonden. Daraus resultiert auch, dass unterschiedliche Detekti- onstechnologien ebenfalls eingesetzt werden und mittels des Verfahrens analysiert werden können, wie z.B. die Anwendung von TaqMan-Sonden in einem Exonuklease Assay oder die Nut- zung allelspezifischer doppelmarkierter Primer in einer Standard-PCR-Reaktion.
[0035] Die Nachweisreaktionen erfolgen zweistufig. In einem ersten Schritt erfolgt die targetspezifische Amplifikationsreaktion, gekoppelt mit der Sondenhybridisierungsreaktion oder unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten allelspezifischen Amplifϊkations-Primern. Diese Reakti- on kann auf allen handelsüblichen PCR-Geräten erfolgen und ist nicht auf Real-Time-PCR Geräte begrenzt. Der Nachweis der Fluoreszenz erfolgt dann ebenfalls auf handelsüblichen Fluoreszenz-Readern.
[0036] Vorzugsweise bedient sich das erfindungsgemäße Verfahren der Kombination eines sog. SpeedCyclers (Analytik Jena AG) und eines Fluoreszenz-Readers (SpeedScan; Anlaytik Jena AG). Der Vorteil dieser Gerätekombination basiert auf der patentierten und extrem schnellen Amplifϊkationstechnologie (patent) mittels des SpeedCyclers, die es erlaubt, die Amplifikations/ Hybridisierungsreaktion in ca. 30 min zu realisieren.
[0037] Die Reaktionsansätze enthalten z.B. die an sich benötigten Reagenzien, welche auch für Real-Time-PCR' s eingesetzt werden.
[0038] Bei jedem Ansatz wird eine statistisch relevante Anzahl (3-10) von DNA- freien Negativkontrollen mitgeführt. Anhand dieser Kontrollproben kann einerseits die Kontaminationsfreiheit des Ansatzes gewährleistet werden, andererseits werden die Proben für die Berechnung benötigt.
[0039] Die Feststellung einer erfolgreichen Amplifϊkation bzw. Überprüfung einer vorliegenden Kontamination erfolgt dadurch, dass die Signalstärken der Proben mit den Signalstärken der Negativkontrollen verglichen werden. Dies geschieht, um die Proben, bei welchen keine erfolgreiche Amplifϊkation stattgefunden hat, aus der nachfolgenden Auswertung auszuschließen. Ist die Signalstärke der Negativkontrollen so stark wie die Signalstärke der Proben, dann liegt eine Kontamination der Proben vor. Damit wird das bekannte Problem der Probenkontamination bei PCR- basierten Verfahren ebenfalls berücksichtigt.
[0040] Die Genotypisierung (Alleldiskriminierung) erfolgt durch Ermittlung des Quotienten (K) der Endpunktfluoreszenz der Sonde 1 (z.B. Markierung für das Allel 1 oder für die Wildtypsequenz) und der Sonde 2 (z. B. Markierung für Allel 2 oder eine vom Wildtyp abweichende Nuk- leinsäuresequenz). Dieser Messwert ist dabei völlig unabhängig von den bekannten potentiellen Schwankungen der PCR Konditionen und Effizienzen der Sondenbindung. [0041] Nach Ermittlung des Mittelwertes der Quotienten (K) für die Negativkontrollen erhält man eine Aussage darüber, ob ein homozygoter Genotyp mit Allel 1 vor bzw. ein homozygoter Wildtyp vorliegt oder nicht, das heißt ob die Proben homozygot oder heterozygot sind.
[0042] Aus dem Vergleich jeder einzelnen Probe mit dem Maximalwert und Minimumwert der Quotienten alle Messergebnisse sowie dem Mittelwert der Negativkontrollen erhält man eine Aussage darüber, ob die Probe homozygot für das Allel 1 bzw. homozygot für den Wildtyp oder heterozygot (Vorliegen von Allel 1 und Allel 2) oder homozygot mutiert ist.
[0043] Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt damit, einfach, schnell und reproduzierbar die beabsichtigte Charakterisierung spezifischer Nukleinsäuresequenzen insbesondere in Hinblick auf den Nachweis von Mutationen bzw. der Genotypisierung von SNP's.
[0044] Die Auswertung der Endpunktfluoreszenzwerte kann in Form einer Computersoftware abgebildet werden. Dabei können statistische Größen (wie z.B. die Standardabweichung) leicht ermittelt werden. Die Ermittlung von Standardabweichungen ist dem Fachmann bekannt. [0045] Das erfindungsgemäße Verfahren benötigt keinerlei interne Refferenzproben als Positivkontrollen oder als Kontrollen für die Berechnung der auszuwertenden Fluoreszenzsignalen. [0046] Das erfmdungsgemäße Verfahren erlaubt die präzise Bestimmung von Mutationen oder die Genotypisierung von SNP's, lediglich unter Berücksichtigung der gemessenen Fluoreszenz- maxima und Fluoreszenzminima. [0047] Das erfmdungsgemäße Verfahren kann auf eine Vielzahl von eingesetzten Assay- Formaten auf der Basis der Erzeugung von Fluoreszenzsignalen angewendet werden. Insbesondere eignen sich die sog TaqMan-Sonden sehr gut für die Durchführung der Nachweise. Erstaunlicherweise umgeht das erfmdungsgemäße Verfahren eine bestehende Limitation der Anwendung von TaqMan-Sonden. [0048] Essentiell bei der Auswahl und dem Design von TaqMan-Sonden ist, dass der Reporterfarbstoff nicht an ein Guanin gebunden werden darf, da selbst nach Exonukleaseverdau die Fluoreszenz der Sonde gelöscht wird. Darüber hinaus sollte der GC- Gehalt der auszuwählenden Sonden gemäß der Patentschrift US 6,154,707 Bl zwischen 20 % und 80 % und die Schmelztempera- tur der Sonde nicht über 700C liegen. Mittels des erfmdungsgemäßen Verfahrens können z.B. TaqMan-Sonden ausgewählt werden, deren GC-Gehalt größer ist als in der Patentschrift US 6,154,707 Bl ausgewiesen. Darüber hinaus kann der Reporterfarbstoff auch an ein Guanin gekoppelt werden, ohne das eine Auswertung der gemessenen Signale negativ durch die Lösung der Fluoreszenz beeinflusst wird. Die Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens ist damit deutlich höher als das in der obigen Patentschrift offenbarte Verfahren.
[0049] Die Zielstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens, den Nachweis von Mutationen oder die Geno typisierung von SNP 's mit geringsten experimentellen Aufwand zu realisieren, kann durch überraschenderweise weitere einfache Verfahren bzw. Mittel erreicht werden. Damit wird den komplexen experimentellen Verfahrensschritten, welche die modernen Methoden molekulardiagnostischer Tests in einem übergreifenden Gesamtprozess beinhalten, Rechnung getragen.
[0050] Dem Fachmann ist bekannt, dass die Bestimmung von z.B. heriditären Mutationen oder die Genotypisierung von SNP's auf folgenden Schritten beruht:
1. Isolierung der genomischen DNA des Probanden (z.B. aus Abstrichen der Mundschleimhaut).
2. Amplifϊkation/ Detektion der zu untersuchenden Sequenzabschnitte.
[0051] Dafür sind eine Vielzahl von Arbeitsschritten notwendig, insbesondere bedarf der Ansatz der Reaktionen für die Amplifikations/ Detektions- Reaktionen der Pipettierung einer Vielzahl von Reaktionskomponenten.
[0052] Zur Vereinfachung dieser Arbeitsschritte wird erfindungsgemäßen ein Testkit bereit ge- stellt.
[0053] Dem Fachmann ist bekannt, dass moderne Methoden der Isolierung von genomischer DNA, z.B. aus Abstrichen der Mundschleimhaut, darauf basieren, dass die zu isolierende Nukleinsäure an eine mineralische feste Phase gebunden, gewaschen und letztlich mit einem sog. Niedrigsalzpuffer (z.B. Tris HCl) oder Wasser von der mineralischen Phase abgelöst wird. Das Ablösen der gebundenen Nukleinsäuren unter diesen Konditionen ist Stand der Technik (z.B. DE 41 39664 Al, US 5,234,809 Bl, WO-A 95/34569 Bl, EP 1 135479 Al, DE 4321 904 Al). [0054] Die in diesen Elutionspuffern vorliegenden Nukleinsäuren werden dann für den weiteren Analyseprozess eingesetzt.
[0055] Für die beschriebenen molekularbiologischen Nachweisverfahren notwendigen Amplifi- kations/ Detektions- Reaktionen werden nachfolgend die sog. Reaktionsansätze pipettiert. Dies bedeutet das Zusammenbringen von unterschiedlichen Reaktionspuffern sowie Komponenten und der isolierten und zu untersuchenden Probanden-DNA. [0056] Benötigt werden z.B. Primer, fluoreszensmarkierte Sonden, dNTP's; Amplifϊkationspuf- fer; Magnesiumchlorid, Polymerase und ggf. weitere Additive.
[0057] Nach exakter quantitativer Zusammenführung dieser Komponenten kann dann die Nachweisreaktion gestartet werden.
[0058] Das erfindungsgemäße Verfahren bedient sich ganz einfacher Mittel, um die benötigen Schritte zur Erstellung der Amplifϊkations/ Detektions- Reaktionen zu minimieren:
[0059] Überraschenderweise zeigt sich, dass die Elution von an mineralische feste Phasen gebundene Nukleinsäuren mit einem Elutionspuffer erfolgen kann, dessen Zusammensetzung aus Salzen; einschließlich Mg 2+ Ionen, sowie ggf. weiteren Additiven wie BSA (Bovine Serum Albumin), besteht und es erlaubt, direkt in nachfolgenden Amplifikations/ Detektions- Reaktionen eingesetzt zu werden. Ein solcher Elutionspuffer erlaubt eine effiziente Elution der gebundenen DNA und bewirkt damit erfreulicherweise, dass die für die nachfolgende Amplifikations/ Detektions- Reaktionen benötigten Komponenten (Amplifkationspuffer, Mg2+ Ionen, weitere PCR- Additive) nicht mehr separat zusammen-pipettiert werden müssen. Dabei kann die molare Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Elutionspuffers so eingestellt werden, dass nachfolgend eine Verdünnung mit Wasser erfolgen kann oder auf eine solche Verdünnung auch verzichtet wird, d.h. das Elutionsmittel kann dann direkt in die Nachweisreaktionen eingesetzt werden. [0060] Die duale Funktionalität des erfindungsgemäßen Elutionspuffers ermöglicht damit eine hocheffiziente Elution und eine Zeit- und Arbeitsaufwandersparnis bei der notwendigen Herstellung des Reaktionsansatzes für Amplifikations/ Detektions- Reaktion.
[0061] Eine weitere Vereinfachung wird dadurch erreicht, dass man die noch benötigten weiteren Reaktionskomponenten wie dNTP's, Primer, ggf. Sonden und Polymerasen in eine lagerstabile Form überfuhrt. Dem Fachmann ist bekannt, dass man Reaktionsansätze z.B. mittels Lyophilisa- tion in einen lagerstabilen Zustand überführen und einen solchen Ansatz durch die Zugabe einer wässrigen Phase wieder aktivieren kann. Es ist aber auch bekannt, dass solche Art von Stabilisierungen nicht immer problemlos erfolgen und einen erheblichen apparativen Aufwand benötigen. Darüber hinaus existieren insbesondere bei der Lyophilisation von Reaktionsansätzen Probleme mit einer Übertrocknung in deren Folge die biologische Aktivität von Enzymen sich nicht mehr oder nicht in vollem Umfange realisiert.
[0062] Dies betrifft auch Prozesse einer direkten Eintrocknung unter Wärmezuführung, bei welchen generell hohe Temperaturen eingesetzt werden. Einem solchen Ansatz liegt natürlicherweise die Erkenntnis zu Grunde, dass z.B. die biologische Aktivität von Proteinen an die Gegenwart von Wasser gebunden ist. Daraus folgt der Schluss, dass die Stabilisierung von biologisch aktiven Reaktionsmischungen durch den schnellen Entzug von Wasser erreicht werden kann. Dies bedeutet, dass für die Eintrocknung von Reaktionsansätzen immer hohe Temperaturen eingesetzt werden, damit dieser Prozess zeitlich schnell realisiert wird. Überraschenderweise zeigt sich aber, dass der Wasserentzug von zu stabilisierenden Reaktionskomponenten (Polymerase; dNTP's, Primer und ggf. Sonden) auch unter physiologischen Temperaturen und daraus resultierend einen längeren Zeitraum benötigend, funktioniert.
[0063] Mit dem erfmdungsgemäßen einfachen Eintrocknungsverfahren unter physiologischen Temperaturen (300C - 400C) kann somit mit einfachen Mitteln (z.B. Trockenschrank) eine funk- tionell aktive Reaktionsplastik hergestellt werden. Diese Plastik ist dann unter Umgebungstemperaturen monatelang ohne Verlust der Reaktionseffizienz zu lagern.
[0064] Die Erfindung ermöglicht letztlich, in der Kombination eines neuartigen Elutionspuffers im Prozess der DNA Isolierung und unter Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten modifizierten Plastik mit den für die Amplifikations/ Detektions-Reaktionen benötigten Komponenten eine extreme Vereinfachung des Pipettieraufwandes. Nach Elution der DNA wird ein definiertes Volumen des Elutionspuffers nur noch in eine mit den weiteren spezifischen Reaktionskomponenten lagerstabil modifizierte Plastik überführt und die Amplifikations/ Detektions-Reaktion gestartet. [0065] Diese Vereinfachung - in Kombination mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Allel- diskriminierung - ermöglicht damit eine routinemäßig durchführbare, einfache und extrem schnelle Durchführung von molekulardiagnostischen Tests zum Nachweis von Mutationen bzw. zur SNP-Genotypisierung. Eine besonders effiziente Ausführungsvariante besteht in der Nutzung eines SpeedCyclers (Analytik Jena AG) für die extrem schnelle Amplifikations/ Detektions- Reaktion und der nachfolgenden Messung auf einem kommerziell verfügbaren Fluoreszenz- Reader (SpeedScan; Analytik Jena AG). Die Nutzung dieser Gerätekombination erlaubt auf Grund der extrem schnellen Amplifikationsreaktionen die Durchführung der Tests in extrem kurzer Zeit. Alle benötigten Schritte, von der DNA Isolierung unter Nutzung des erfindungsgemäßen Elutionspuffers, der Nutzung der lagerstabilisierten Reaktionsplastik für die Amplifϊkations/ De- tektions-Reaktion und der Durchführung dieser Reaktionen auf einem SpeedCycler/ SpeedScan und die Integration des Auswertealgorithmus in eine computergestützte Software-Lösung, erlauben die Bestimmung von Mutationen oder von SNP's in weniger als einer Stunde. Dabei können parallel in Abhängigkeit von der verwendeten Reaktionsplastik bis zu 96 Proben analysiert werden. Alle notwendigen Handling- Schritte sind auf ein Minimum reduziert. Darüber hinaus sind die durchzuführenden Assays auch auf Grund der nur noch sehr geringen Mengen benötigter Reaktionschemie auch deutlich preiswerter als die zur Zeit auf den schon ausführlich beschriebenen Real- Time- Systemen durchführbaren Tests.
[0066] Damit kann die vorliegende Erfindung einen wertvollen Beitrag zur routinemäßigen Etablierung von molekulargenetischen Tests, insbesondere auf die immer mehr in den Fokus rücken- de sog. individualisierte Medizin, leisten.
[0067] Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Dabei stellen die Beispiele keine Limitierung der Anwendung der Erfindung dar.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1
Herstellung lagerstabil beschichteter Reaktionsplastik und Verwendung der Plastik in einem Lagerversuch zur Amplifϊkation einer humanspezifischen Targetsequenz
A. Herstellung der beschichteten Reaktionsplastik
[0068] Als Plastik wurden sog. 36-Well-Mikroplatten (Analytik Jena AG) eingesetzt. [0069] Pro Well erfolgte die Zugabe folgender Komponenten:
1. Ligandmodifϊzierte Hot-Start Taq DNA Polymerase
2. dNTP's (Desoxyribonukleotide)
3. Primer (sense und antisense) [0070] Das Totalvolumen der Reaktionsmischung betrug 2,5 μl.
[0071] Die Beschichtungslösung wurde auf die PCR-Mikroplatte gebracht und für ca. 2h bei physiologischen Temperaturbedingungen von 37°C getrocknet. [0072] Nach erfolgter Eintrocknung wurden die Platten mit einer Sealingfolie abgeklebt und bei RT für 4 Monate gelagert und in einer Vergleichsreaktion mit frisch zugegebenen Reaktionskomponenten getestet.
B. Amplifϊkation einer humanspezifischen Targetsequenz
[0073] Die Amplifϊkationsreaktion erfolgte mittels eines SpeedCyclers (Analytik Jena AG).
Ansätze:
"Frisch": 1 μl DNA (human)
1,5 μl Amplifkationspuffer, inkl. Magnesiumchlorid (1Ox)
0,3 μl dNTP's (12,5 mM, jeweils)
0,1 μl Primer (sense; 50 pmol)
0,1 μl Primer (antisense; 50 pmol) 0,75 units Taq Polymerase
[0074] Auffüllen mit Wasser auf Finalvolumen von 15 μl.
"Lagerstabil beschichtete Mikroplatte": 1 μl DNA (human)
1,5 μl Amplifkationspuffer, inkl. Magnesiumchlorid (1Ox) [0075] Auffüllen mit Wasser auf Finalvolumen von 15 μl.
[0076] Nach Durchführung der Amplifϊkations- Reaktion mittels eines SpeedCyclers wurden die Amplifϊkationsprodukte auf einem Agarosegel ausgewertet (Figur 1).
Spuren:
1 : DNA Marker
2 - 7: Amplifikationsprodukte unter Verwendung der lagerstabil beschichteten Reaktionsplastik 8 - 13: Amplifikationsprodukte unter Verwendung frisch zugegebener Reaktionskomponenten
[0077] Das Beispiel illustriert, dass die Verwendung der lagerstabil beschichteten Reaktionsplastik keinerlei Aktivitätsverlust im Vergleich zu frisch zugegeben Reaktionskomponenten zeigt.
Beispiel 2
SNP- Genotypisierung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens und Vergleich der Ergebnisse mittels DNA Sequenzierung
[0078] Der erfindungsgemäße Verfahren wurde nachfolgend für eine SNP- Genotypisierung humaner DNA Proben eingesetzt. Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Ergebnisse wurden anschließend zur Verifizierung sequenziert. Die Ergebnisse der Sequenzierung und der Genotypisierung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens sind zusammengefasst dargestellt.
[0079] Für die Genotypisierung wurde eine Mutation im Promoter des humanen MDM2-Gens (SNP 309) [Bond GL et al. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 2004 Nov 24; 119(5):591-602] ausgewählt. [0080] Die Amplifikations/ Detektions-Reaktion der eingesetzten Probennukleinsäuren erfolgten mittels der Geräte der Analytik Jena AG SpeedCycler (Amplifϊkation/ Hybridisierung) und SpeedScan (Detektion der Endpunktfluoreszenz).
[0081] Als Primer für die Amplifϊkation wurden folgende Oligonukleotide eingesetzt: [0082] Sense-Primer: 5 '-CGC GGG AGT TCA GGG TAA-3 ' [0083] Antisenseprimer: 5'-CCC AAT CCC GCC CAG ACT AC-3'
[0084] Als Hybridisierungssonden dienten die folgenden doppelt fluoreszenzmarkierten Oligonukleotide, wobei der GC-Anteil bei beiden Sonden > 80% sind und die Schmelztemperatur größer 70 0C liegt: [0085] Sonde Wildtyp: 5'-FAM-GGG CCG CTT CGG CGC GGG-BHQ 1-3' [0086] Sonde Mutiert: 5'-ROX-GGC CGC TGC GGC GCG-BHQ2-3'
[0087] Die Amplifikations/Hybridiserungs- Reaktion benötigte ca. 35 min bei durchgeführten 40
Amplifikationszyklen.
[0088] Die Detektion für jeweils 36 Proben benötigte ca. 2 min. [0089] Exemplarisch für alle 3 möglichen Allellvarianten ist nachfolgend die Genotypisierung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens aufgeführt.
[0090] Die Fluoreszenz der Proben für Markierung der Sonde 1 (FAM) und der Sonde 2 (ROX) wurde mit dem Endpunkt-Fluoreszenzreader SpeedScan (Analytik Jena AG) gemessen. Die Messergebnisse sind in der nachfolgender Tabelle dargestellt:
Figure imgf000018_0001
[0091] Als erstes werden die nötigen statistischen Größen für die Messplatte berechnet:
Schritt 1 : Feststellung einer erfolgreichen Amplifϊkation bzw. Überprüfung einer vorliegenden Kontamination.
Für Probe 2: FAM 2210 > 542+63,6
ROX 1442 > 642+104,9
Für Probe 3: FAM 1342 > 542+63,6 ROX 1449 > 642+104,9
Für Probe 5: FAM 1131 > 542+63,6
ROX 1999 > 642+104,9
[0092] Hiermit ist bestätigt, dass in jeder der drei Proben eine erfolgreiche Amplifϊzierung statt- gefunden hat.
Schritt 2: Genotypisierung (Alleldiskriminierung)
1. Berechnung eines Quotienten (K) zwischen dem Messergebnis der Sonde 1 (FAM) und der
Sonde 2 (ROX)
Figure imgf000018_0002
Figure imgf000019_0001
2. Der Vergleich des Höchstwertes (MAX) mit dem Mittelwert der Negativkontrollen unter Berücksichtigung der Standardabweichung der Negativkontrollen ergab, dass sich auf der Platte die Proben mit dem Genotyp Homozygot Wildtyp befinden, weil der Höchstwert größer ist als der Mittelwert der Negativkontrollen unter Berücksichtigung der Standardabweichung.
3. Feststellung des es (MIN) für die Quotienten aller Messergebnisse.
MIN =
4. Vergleich des Minimumwertes (MIN) mit dem Mittelwert der Negativkontrollen minus die Standardabweichung der Negativkontrollen ergab, sich auf der Platte die Proben mit dem Genotyp Homozygot mutant befinden, weil der Minimumwert kleiner ist als der Mittelwert der Negativkontrollen unter Berücksichtigung der Standardabweichung.
5. Vergleich jeder einzelnen Probe mit dem Maximalwert, Minimumwert und dem Mittelwert der Negativkontrollen
Für Probe 2:
[0093] Aus dem Vergleich des Mittelwerts der Negativkontrollen mit dem Maximalwert folgt, dass Probe 2 Homozygot Wildtyp ist und weitere Berechnungen für die Probe 2 müssen nicht durchgeführt werden, da die Differenz aus dem Mittelwert der Negativkontrollen und dem Quotienten K der Probe 2 größer ist als die Differenz aus dem Maximalwert und dem Quotienten K der Probe 2 unter Berücksichtigung der Standardabweichung.
Für Probe 3 :
[0094] Probe 3 kann auf keinen Fall einen homozygot Wildtyp Genotyp haben und die Zugehörigkeit zu den zwei anderen Genotypgruppen muss überprüft werden muss, da die Differenz aus dem Maximalwert und dem Quotienten K der Probe 3 unter Berücksichtigung der Standardabweichung größer ist als Negativkontrollen und dem Quotienten K der Probe 3. Für Probe 5 :
[0095] Probe 5 kann auf keinen Fall einen homozygot Wildtyp Genotyp haben und die Zugehörigkeit zu den zwei anderen Genotypgruppen muss überprüft werden muss, da die Differenz aus dem Maximalwert und dem Quotienten K der Probe 5 unter Berücksichtigung der Standardab- weichung größer ist als Negativkontrollen und dem Quotienten K der Probe 5.
Weitere Untersuchungen der Proben 3 und 5 :
Für Probe 3 : [0096] Aus dem Vergleich des Mittelwerts der Negativkontrollen mit dem Minimalwert folgt, dass die Probe 3 auf keinen Fall einen homozygot mutanten Genotyp haben kann, da es oben schon berechnet wurde und dass sie auch nicht homozygot Wildtyp ist, sondern nur heterozygot sein kann, da die Differenz aus dem Mittelwert der Negativkontrollen und dem Quotienten K der Probe 3 kleiner ist als die Differenz aus dem Minimalwert und dem Quotienten K der Probe 2 unter Berücksichtigung der Standardabweichung.
Für Probe 5 :
[0097] Aus dem Vergleich des Mittelwerts der Negativkontrollen mit dem Minimalwert folgt, dass die Probe 5 einen homozygot mutanten Genotyp hat, da die Differenz aus dem Mittelwert der Negativkontrollen und dem Quotienten K der Probe 5 größer ist als die Differenz aus dem Minimalwert und dem Quotienten K der Probe 5 unter Berücksichtigung der Standardabweichung.
[0098] Damit wurden die Genotypen der Proben definiert. Die oben durchgeführte Berechnung wurde in einem logischen Ablauf durchgeführt, der für einen Computeralgorithmus geeignet ist.
[0099] Zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit der erfindungsgemäßen Methodik erfolgte die Genotypisierung anhand von 48 verschiedenen Proben-Nukleinsäuren. Die mittels der erfindungsgemäßen Methodik erhaltenen Ergebnisse wurden mittels Sequenzierung überprüft. Der Vergleich ist in der nachfolgenden Tabelle dargestellt.
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Beispiel 3
Genotypisierung des Gens Faktor V Leiden (G1691A; Alhenc-Gelos M. et al. Unexplained thrombosis and factor V Leiden mutation.Lancet; 1994) mittels des erfϊndungsgemäßen Verfah- rens
[0100] Die Genotypisierung wurde mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens wie folgt durchgeführt:
1. DNA Isolierung aus Mundschleimhautabstrichen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Elutionspuffers
[0101] Die Tupfer wurden nachfolgend mittels eines kommerziell angebotenen DNA Extraktions Kits ( innuPREP DNA Mini Kit; aj Innuscreen GmbH) isoliert. Der Kit basiert auf der Lyse des Ausgangsmaterials, der nachfolgenden Bindung der DNA an die Oberfläche eins Filtermaterials (Spin Filter Säule), dem Waschen der gebundenen DNA und abschließend der Elution der DNA mittels Wasser bzw. mittels einer Lösung enthaltend 10 mM Tris HCl. Anstelle des im Kit enthaltenen Elutionsmittels wurde der erfindungsgemäße Elutionspuffer eingesetzt (33 mM Tricin- KOH, 14 mM KCl, 4,2 mM MgCl2, 3,5 μg/ml BSA; pH 9). Die DNA wurde nach Zugabe von 500 μl des Elutionsmittels von der Spin Filter Säule eluiert. Die eluierte DNA wurde dann direkt für die Amplifϊkations/ Detektions- Reaktion eingesetzt.
2. Amplifkations/ Detektions- Reaktion unter Verwendung der lagerstabil beschichteten Plastik
[0102] Die Reaktionsplastik wurde wie unter Beispiel 1 beschrieben hergestellt und mit folgenden Komponenten beschichtet:
1. Ligandmodifϊzierte Hot-Start Taq DNA Polymerase 2. dNTP's
3. Primer (sense und antisense)
Die Beschichtungslösung wurde auf die PCR-Mikroplatte gebracht und für ca. 2h bei physiologischen Temperaturbedingungen von 37°C getrocknet.
[0103] Als Primer für die Amplifikation wurden folgende Oligonukleotide eingesetzt: [0104] Sense-Primer: 5 '-GCC TCT GGG CTA ATA GGA CTA CTT C-3 '
[0105] Antisenseprimer: 5 '-TTT CTG AAA GGT TAC TTC AAG GAC AA-3 '
[0106] Von der mittels des neuartigen Elutionspuffers eluierten DNA wurden 10 μl direkt auf die beschichteten PCR-Platten überführt. Als einzige Reaktionskomponente wurden nachfolgend noch die fluoreszenzmarkierten Hybridisierungssonden zugegeben.
[0107] Als Hybridisierungssonden dienten die folgenden doppelt fluoreszenzmarkierten Oligonukleotide: [0108] Sonde Wildtyp: 5'-FAM-ACC TGT ATT CCT CGC CT-BHQ 1-3'
[0109] Sonde Mutiert: 5 '-ROX-ACC TGT ATT CCT TGC CT-BHQ2-3 ' [0110] Nach Durchführung der Amplifϊkations/ Detektions- Reaktion mittels SpeedCycler und SpeedScan (Analytik Jena AG) erfolgte die Auswertung der gemessenen Endpunktfluoreszenz mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens. [Olli] Die Messergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle dargestellt:
Figure imgf000024_0001
[0112] Nachdem die im Beispiel 2 beschriebenen Berechnung durchgeführt wurden, konnten die Proben wie folgt genotypisiert werden:
MWneα = 1,79 STABWneα = 0,19
Figure imgf000024_0002
[0113] Das gesamte Verfahren erlaubt die Genotypisierung von multiplen Proben begonnen mit der Isolierung der Probanden DNA bis zur finalen Auswertung nunmehr in weniger als einer Stunde.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zum schnellen Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen, insbesondere zum Nachweis von Mutationen oder SNP's, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Isolierung der Nukleinsäuren b) Amplifϊkation der spezifischen Targetsequenz, gekoppelt mit der Sondenhybridisierungs- reaktion unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten allelspezifischen Amplifϊkations-Sonden c) Endpunktmessung der Fluoreszenz ohne Referenzfarbstoffe zur Relativierung der Reaktionsschwankungen und ohne den Vergleich zu bereits genotypisierten Standardproben d) Vergleich der Endpunktmessung der Fluoreszenz mit Negativ- Kontrollen (Proben, welche die Sonden, aber keine DNA enthalten), e) Bestimmung der Genotypisierung aus dem Quotient der Endpunktfluoreszenz der Sonden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für die Amplifϊkation der spezifi- sehen Targetsequenz derselbe Puffer verwendet wir wie für die im letzten Schritt der Isolierung der Nukleinsäuren.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswertung der Endpunktfluoreszenzwerte und damit die Bestimmung der Genotypisierung mittels einer Computersoftware erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifizierung auf einem an sich bekannten Thermocycler und die Messung der Endpunkt-Fluoreszenz mittels eines an sich bekannten Fluoreszenz-Readers durchgeführt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei jedem Ansatz eine statistisch relevante Anzahl (3-10) von DNA- freien Negativkontrollen mitgeführt wird und anhand dieser Kontrollproben einerseits die Kontaminationsfreiheit des Ansatzes kontrolliert und andererseits werden die Proben für die Bestimmung der Genotypisierung dienen.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Genotypisierung aus dem Quotienten der Endpunktfluoreszenz zwischen den Proben und den Negativkontrollen erfolgt.
7. Testkit zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend: • einen Puffer für die Amplifϊzierung der spezifischen Targetsequenz, der gleichzeitig im letzten Schritt der Isolierung der Nukleinsäuren verwendet wird
• Polymerase für die Amplifϊzierung der spezifischen Targetsequenz
• dNTP's
• mindestens 2 Primer (sense und antisense)
• fluoreszensmarkierte Oligonuleotide (Sonden)
8. Testkit nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer einen Bestandteil wie Tri- cin-KOH, Bicin oder Tris, einfach positiv geladene Kationen wie K + und zweifach positiv gela- dene Kationen Mg2+ enthält.
9. Testkit nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer zusätzlich BSA enthält.
10. Testkit nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Polymerase, die dNTP's und Primer in einer lagerstabilen Form auf Reaktionsgefäßen befinden.
11. Testkit nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Dual-Probe-Sonden (Taqman) handelt, bei denen der Reporterfarbstoff auch an ein endständiges Guanin gekoppelt werden kann.
12. Testkit nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der GC-Anteil der Sonden auch größer als 80% sein kann.
13. Testkit nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Schmelztemperatur der Sonden auch größer als 700C sein kann.
14. Verwendung des Verfahrens gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 oder des Testkits gemäß den Ansprüchen 7 bis 13 zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen, insbesondere zum Nachweis von Mutationen oder SNP 's, die auf einem Fluoreszenzdetektionsverfahren basieren.
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