WO2012016936A1 - Nachweis spezifischer nukleinsäuresequenzen mittels fluoreszenz - quenching - Google Patents

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WO2012016936A1
WO2012016936A1 PCT/EP2011/063174 EP2011063174W WO2012016936A1 WO 2012016936 A1 WO2012016936 A1 WO 2012016936A1 EP 2011063174 W EP2011063174 W EP 2011063174W WO 2012016936 A1 WO2012016936 A1 WO 2012016936A1
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nucleic acid
probe
fluorescence
detection
fluorophore
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PCT/EP2011/063174
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French (fr)
Inventor
Frank Sellrie
Timo Hillebrand
Original Assignee
Aj Innuscreen Gmbh
Universität Potsdam
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens

Definitions

  • PROOF OF SPECIFIC NUCLEIC ACID SEQUENCES BY FLUORESCENCE - QUENCHING
  • the presented method is used for the specific detection of nucleic acid sequences and thus of molecular diagnostics.
  • the basic principle of the detection consists in the sterical exclusion of an antibody binding by the hybridization of a nucleic acid target with a nucleic acid probe to the double strand.
  • the fluorophore of the probe is no longer accessible after hybridization for a fluorescence-quenching antibody.
  • the measurable fluorescence in the system is directly coupled to the presence of a complementary to the probe DNA sequence in the sample.
  • Genetic diagnostics has become an indispensable part of modern medical laboratory diagnostics, forensic diagnostics, veterinary laboratory diagnostics or food and environmental diagnostics.
  • a widely used method for detecting specific nucleic acids is, for example, the light cycler technology (Roche).
  • the Roche company developed special hybridization probes consisting of two different oligonucleotides, each labeled with only one fluorochrome. At the 3-end of one probe is the acceptor, the other oligonucleotide is provided at the 5-end with a donor.
  • the probes are chosen so that they both bind to the same strand of DNA, the distance between acceptor and donor may only be a maximum of 1 to 5 nucleotides, so that it to so-called FRET effect can come.
  • the measurement of the fluorescence takes place during the annealing step, whereby only light of this wavelength is detectable as long as both probes are bound to the DNA.
  • the melting point of both probes should be identical in this system.
  • Double-dye probes which are disclosed in the patent US 5210015 and US 5487972 (TaqMan probes). Double-dye probes carry two fluorochromes on a probe. The reporter dye is here at the 5 - end, the quencher color fabric at the 3 - end. In addition, there may still be a phosphate group on the 3-end of the probe, so that the probe can not function as a primer during elongation. As long as the probe is intact, the intensity of light released is small, since almost all of the light energy produced by the reporter's excitation is absorbed and transformed by the quencher due to its proximity.
  • the emitted light from the reporter dye is "quenched,” ie, quenched
  • This FRET effect is also retained after the probe has bound to the complementary DNA strand
  • the polymerase hits the probe and hydrolyzes it polymerase to hydrolyze an oligonucleotide (or probe) during strand synthesis as S ' -S ' exonuclease activity.
  • S ' -S ' exonuclease activity Not all polymerases have S ' -S ' exonuclease activity (Taq and Tth polymerase)
  • Taq and Tth polymerase This principle is described for the Taq polymerase principle, which is called the TaqMan principle: After probe hydrolysis, the reporter dye is no longer in close proximity to the quencher and the emitted fluorescence is no longer transformed, and this increase in fluorescence is measured.
  • Another possibility for the specific detection of amplification products by means of real-time PCR technology is the use of intercalating dyes (ethidium bromide, Hoechst 33258, Yo-Pro-1 or SYBR Green TM and the like).
  • intercalating dyes ethidium bromide, Hoechst 33258, Yo-Pro-1 or SYBR Green TM and the like.
  • a clear differentiation between specific amplification event or artifact is absolutely necessary.
  • PCR-ELISA PCR-ELISA
  • the DNA sequence to be tested is amplified and the generated DNA fragment subsequently covalently immobilized on a solid phase (e.g., microtiter plate or strip), subsequently denatured into a single strand and hybridized with a sequence-specific probe.
  • a solid phase e.g., microtiter plate or strip
  • the successful attachment of the probe can be visualized by an anticorrosive color reaction.
  • Another variant is based on immobilizing the probes to a solid phase and, after denaturing the PCR product, bringing it into contact with the immobilized probe. The proof of a successful hybridization event is analogous to the first variant of the method.
  • a lateral flow method is used to detect nucleic acids. This method also uses the technology of hybridization of nucleic acids to a solid phase. It is advantageous that a lateral flow method is a small, handy test format (strip test).
  • RNAs e.g., ribosomal RNAs, mitochondrial RNA's and DNA's, plasmid molecules, non-coding repetitive sequences, etc.
  • This patent describes a sensitive DNA detection without amplification in the form of a bio-barcode assay.
  • the process shown is very complicated and requires both a device for separating the nanoparticles bound to the target molecule from nanoparticles not bound to the target molecule and furthermore a reading-out system for signal evaluation.
  • Other methods of detecting specific nucleic acids without amplification reactions are based on classical hybridization techniques of membrane-bound nucleic acids. These procedures are time-consuming and labor-intensive and thus can not be used for alternative routine diagnostics (dot blots, Southern blots, etc.).
  • This also applies to the application of biochip technologies. Again, the equipment is immense and this technology is not universally applicable and often only for the study of Genexpressionsmustern (study of RNA) but not for the diagnostic detection of e.g. pathogenic microorganisms (based on DNA) can be used.
  • the object of the invention was to eliminate the disadvantages of the solutions described above.
  • a universally usable method for the specific detection of target nucleic acids has been provided which can be carried out very quickly and is simple and moreover requires no expensive instrument systems.
  • the method is suitable as a molecular genetic rapid test and takes into account the requirements of diagnostic specificity assurance. It is crucial that the distinction between a bound and an unbound probe without additional washing and separation steps takes place and thus solves the problem of the patent WO 2006125050 20061123.
  • the problem is solved by using for the specific detection reaction of a target nucleic acid in a reaction mixture, a fluorescence-labeled DNA probe (complementary to the nucleic acid sequence to be detected) and a fluorophore-binding while its fluorescence-quenching antibody.
  • the inventive method is realized by the sterical exclusion of antibody binding by the hybridization of sample and probe to a double strand.
  • the fluorophore of the probe is no longer accessible after the hybridization for the fluorescence-quenching antibody - as a result of this effect, the fluorescence of the fluorophore is retained.
  • the fluorophore of an unhybridized probe is bound by the antibody, thereby quenching its fluorescence.
  • the fluorescence measurable in the system is directly coupled to the presence of a DNA sequence complementary to the probe in the measurement sample.
  • the nucleic acids to be tested are present completely or partially as single-stranded nucleic acid (eg various RNA molecules, single-stranded viral genomes, asymmetrically amplified DNA's, cDNA's, etc.).
  • the nucleic acid molecules which are present in double strands must be converted into the single-stranded form for probe hybridization by means of laboratory-standard techniques (eg heating, denaturing substances, etc.).
  • B. Hybridization with a sequence-specific probe to which at least one fluorophore is coupled :
  • the target nucleic acid is contacted with a defined amount of the fluorophore-coupled probe and incubated at a temperature calculated for a specific hybridization.
  • the hybridization event (and thus the detection of the target nucleic acid sought) by means of an antibody which simultaneously binds the fluorophore in the embodiment of the invention and the fluorescence quenches detected.
  • the fluorophore on the probe hybridized to the target sequence is sterically hindered for antibody binding and thus can not be quenched by the antibody.
  • the binding of the antibody to the fluorophore is hindered by the hybridization of target sequence and probe steric and therefore excludes a quenching of fluorescence.
  • This process can be qualitatively and quantitatively evaluated by measuring the fluorescence intensity of the sample compared to the negative and positive controls (initial point measurement vs. end point measurement). It is also possible to use a standard that is included in the system.
  • the quencher may be not only a self-quenching antibody, but also a fluorophore-binding antibody which has been made such by conjugation with a quenching molecule (e.g., BHQ 1).
  • a quenching molecule e.g., BHQ 1.
  • antibodies are suitable, but also other binding molecules (recombinant antibodies, aptamers, intercalins).
  • the steric exclusion of antibody binding (fluorescence quenching) may also be possible by other hybridizing molecules except DNA (PNA, RNA, perhaps also proteins).
  • the method described above can be carried out both manually and automatically.
  • each type of nucleic acid can not only be detected specifically, but also quantified.
  • both a nucleic acid sample isolated from the sample material can be determined directly (ie without an amplification reaction on the basis of PCR or NASBA etc.), as well as an amplified or in vitro modified (eg by the cDNA synthesis ) generated nucleic acid molecule.
  • the detection of the specific detection signal does not take place by means of FRET effect (EP 0972 848 A2), but rather by a binding of the fluorescence-quenching antibody.
  • the method according to the invention also differs from the patent (EP 0 826 066 B1), which also represents a combination of PCR and hybridization. In this method as well, a fluorescence signal mediated by the FRET effect is detected. This arises during the amplification process by the hybridization of a probe having a lower annealing temperature than the primers.
  • the release of the fluorescence is not effected by hydrolysis of the probe as a result of the exonuclease activity of the polymerase, but by the fact that in the hybridization, the secondary structure of the probe is resolved and the fluorescence is less quenched.
  • the inventive method is a test format, which can be realized in principle under field conditions.
  • the method according to the invention for detecting and quantifying specific nucleic acid sequences allows the test to be carried out in less than one hour.
  • the method is suitable in excellent Also for the detection of target nucleic acids without previous amplification reaction, ie directly for the detection of nucleic acids of a sample. (DNA or RNA).
  • the method according to the invention for the quantitative determination of at least one specific nucleic acid sequence comprises the steps
  • Hybridization to the double strand sterically prevents the binding of the fluorescence-quenching antibody. As a result of this binding exclusion, the fluorescence of the probe is retained. Unhybridized probes are bound by the binder (e.g., antibody) and their fluorescence is quenched.
  • the binder e.g., antibody
  • the detection reaction takes place free of separation steps in one batch.
  • the target sequence to be detected can be any nucleic acid, in particular DNA or RNA. It is also possible that the target sequence is an amplification product.
  • the inventive method works so well that it is surprisingly possible to perform a titration of the DNA strand to be detected (template). Thus, the detection of 0.1 ⁇ template is well possible.
  • probe and antibody together as a solution to the template and then to hybridize.
  • the measuring principle will be even easier.
  • the probe is a nucleotide sequence which is completely or partially complementary to the target sequence and contains at least one fluorophore.
  • the fluorophore (s) may be in the form a derivatized nucleotide may be contained in the probe.
  • any fluorophore can be used, in particular fluorescein and 5-TAMRA (5-carboxyteramethylrhodamine).
  • a probe Fluorophore-labeled oligonucleotide probe
  • Antibody Fluorophore-Binding and Fluorescence-Deleting Antibody
  • Figure 1 shows the DNA analysis by means of fluorescence quenching by a sequence-specific binding monoclonal antibody - schematic representation of the test principle and the process steps.
  • Figure 3 shows the increase in fluorescence as a function of the concentration of the PCR sample (PCR sample with target sequence from native DNA (black) - PCR sample without target sequence (white).
  • fluorescence-quenching antibodies for: a) fluorescein (F. Sellrie, A. Warsinke, B. Micheel (2006) Homogeneous indirect fluorescence quenching immunoassay for the determination of low molecular weight substances.) Anal Bioanal. Chem. 386 (2 ): 206-10.) B) Europium Cryptate (EuTBP)
  • probe is understood to mean an oligonucleotide which is wholly or partially complementary to a target nucleic acid and is provided with at least one fluorophore.

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Abstract

Die Erfindung betrifft den Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen mittels Fluoreszenzlöschung. Das Grundprinzip des Nachweises besteht im sterischen Ausschluss einer Antikörper-Bindung durch die Hybridisierung eines Nukleinsäuretargets mit einer Nukleinsäuresonde zum Doppelstrang. Das Fluorophor der Sonde ist nach erfolgter Hybridisierung für einen fluoreszenz-löschenden Antikörper nicht mehr zugänglich. Die im System messbare Fluoreszenz ist direkt an das Vorhandensein einer zur Sonde komplementären DNA-Sequenz in der Messprobe gekoppelt.

Description

NACHWEIS SPEZIFISCHER NUKLEINSÄURESEQUENZEN MITTELS FLUORESZENZ - QUENCHING
Beschreibung
[0001] Das vorgestellte Verfahren dient dem spezifischen Nachweis von Nukleinsäuresequenzen und damit der molekularen Diagnostik. Das Grundprinzip des Nachweises besteht im sterischen Ausschluss einer Antikörper-Bindung durch die Hybridisierung eines Nukleinsäuretargets mit einer Nukleinsäuresonde zum Doppelstrang. Das Fluorophor der Sonde ist nach erfolgter Hybridisierung für einen fluoreszenz-löschenden Antikörper nicht mehr zugänglich. Die im System messbare Fluoreszenz ist direkt an das Vorhandensein einer zur Sonde komplementären DNA-Sequenz in der Messprobe gekoppelt.
Stand der Forschung
[0002] Die Gendiagnostik ist zu einem unverzichtbaren Bestandteil der modernen medizinischen Labordiagnostik, der forensischen Diagnostik, der veterinärmedizinischen Labordiagnostik oder der Lebensmittel- und Umweltdiagnostik geworden.
[0003] Revolutioniert wurde die genetische Diagnostik mit der Erfindung der PCR- Technologie, die es gestattet, jede beliebige Nukleinsäuresequenz spezifisch zu vervielfachen.
[0004] Diese Technologie besitzt aber neben ihren eindeutigen Vorteilen (wie Sensitivität, Spezifität) auch ihre Nachteile. Für die Durchführung der Amplifizierung werden teurere Geräte benötigt, die den schnellen Temperaturwechsel gewährleisten können, die Ergebnisse der Amplifizierung bzw. mit der Amplifizierung gekoppelten Sondenhybridisierung müssen gleichfalls mittels treuerer und aufwendig zu bedienender Labortechnik ausgewertet werden. Hierbei ist eine„einfache" Visualisierung mittels Gelelektrophorese manchmal wegen ihrer Ungenauigkeit unzureichend.
[0005] Eine weit verbreitete Methode zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuren ist z.B. die Light Cycler Technologie (Fa. Roche). Die Firma Roche entwickelte dazu spezielle Hybridisierungssonden bestehend aus zwei verschiedenen Oligonukleotiden, die jeweils mit nur einem Fluorochrom markiert sind. Am 3 -Ende der einen Sonde befindet sich der Akzeptor, das andere Oligonukleotid ist am 5 -Ende mit einem Donor versehen. Die Sonden werden so gewählt, dass sie beide an den gleichen DNA- Strang binden, wobei der Abstand zwischen Akzeptor und Donor nur maximal 1 bis 5 Nukleotide betragen darf, damit es zum sog. FRET-Effekt kommen kann. Die Messung der Fluoreszenz erfolgt während des Annealingschrittes, wobei nur Licht dieser Wellenlänge nachweisbar ist, solange beide Sonden an die DNA gebunden sind. Der Schmelzpunkt beider Sonden sollte bei diesem System identisch sein. Durch die Verwendung zweier hybridisierender Sonden zusätzlich zu den verwendeten Primern ist die Spezifität dieses Detektionsystems äußerst hoch.
[0006] Eine weitere Real Time PCR Anwendung zum Nachweis spezifischer Nukleinsäure- Targets kann mit sog. Double-Dye-Sonden, welche in der Patentschrift US 5210015 und US 5487972 offenbart sind (TaqMan-Sonden), durchgeführt werden. Double-Dye-Sonden tragen zwei Fluorochrome auf einer Sonde. Der Reporterfarbstoff befindet sich hier am 5 - Ende, der Quencherfarb Stoff am 3 -Ende. Zusätzlich befindet sich am 3 -Ende der Sonde eventuell noch eine Phosphatgruppe, damit die Sonde bei der Elongation nicht als Primer fungieren kann. Solange die Sonde intakt ist, ist die freigesetzte Lichtstärke gering, da fast die gesamte Lichtenergie, die nach der Anregung des Reporters entsteht, aufgrund der räumlichen Nähe vom Quencher aufgenommen und umgeformt wird. Das emittierte Licht des Reporterfarbstoffes wird „gequenched", d.h. gelöscht. Dieser FRET-Effekt bleibt auch erhalten, nachdem die Sonde an den komplementären DNA-Strang gebunden hat. Während der Elongationsphase trifft die Polymerase auf die Sonde und hydrolysiert sie. Man bezeichnet die Fähigkeit der Polymerase, ein Oligonukleotid (bzw. eine Sonde) während der Strangsynthese zu hydrolysieren, als S'-S'-Exonukleaseaktivität. Nicht alle Polymerasen haben eine S'-S'-Exonukleaseaktivität (Taq- und Tth-Polymerase). Als erstes wurde dieses Prinzip für die Taq-Polymerase beschrieben. Das Prinzip wird als TaqMan-Prinzip bezeichnet. Nach Sondenhydrolyse befindet sich der Reporterfarb Stoff nicht mehr in räumlicher Nähe zum Quencher. Die emittierte Fluoreszenz wird jetzt nicht mehr umgeformt, dieser Fluoreszenzanstieg wird gemessen.
[0007] Eine weitere Möglichkeit zum spezifischen Nachweis von Amplifikationsprodukten mittels Real-Time-PCR-Technologie besteht in der Nutzung von interkalierenden Farbstoffen (Ethidiumbromid, Hoechst 33258, Yo-Pro-1 oder SYBR Green™ u.ä.). Eine klare Differenzierung zwischen spezifischem Amplifikationsereignis bzw. Artefakt ist aber zwingend notwendig. Um dies dennoch zu erreichen, nutzt man eine sog. Schmelzpunktanalyse am Ende der eigentlichen PCR- Reaktion.
[0008] Mittels Real-Time-PCR-Anwendungen ist es darüber hinaus auch möglich, eine Quantifizierung der nachzuweisenden Targets durchzuführen. [0009] Ein großer Nachteil besteht allerdings darin, dass sie auf sehr teuren Geräteplattformen implementiert sind, welche den Prozess sowohl der Amplifikation als auch nachfolgenden, der Fragestellung entsprechenden optischen Detektion in einer Hardware- Lösung vereinen müssen. Weiterhin basieren viele dieser beschriebenen Nachweisverfahren immer auf der Echtzeitverfolgung des Amplifikationsprozesses. Auf dieser Strategie basierend, erfolgt auch die Aufarbeitung der gemessenen Fluoreszenzwerte im Verlauf der Amplifikationsreaktion. Dem Fachmann ist klar, dass damit verbunden auch ein enorm hoher Grad an Analysealgorithmen in Real- Time- Systeme integriert sein muss. Dies erklärt letztlich den hohen finanziellen Aufwand, der für die Nutzung von Real-Time-PCR- Systemen betrieben werden muss. Letztlich ist auch die Bedienung solcher Gerätesysteme an ein hohes Maß an Expertise gebunden.
[0010] Neben den dargestellten Real-Time-PCR-basierten diagnostischen Nachweisen existieren aber auch alternative Varianten zum spezifischen Nachweis von Nukleinsäuren, z.B. PCR-ELISA. Bei dieser Methode wird die zu untersuchende DNA-Sequenz amplifiziert und das erzeugte DNA-Fragment nachfolgend an einer festen Phase (z.B. Mikrotiterplatte oder Streifen) kovalent immobilisiert, nachfolgend zu einem Einzelstrang denaturiert und mit einer sequenzspezifischen Sonde hybridisiert. Die erfolgreiche Anbindung der Sonde kann durch eine antikö ervermittelte Farbreaktion sichtbar gemacht werden. Eine andere Variante basiert darauf, dass man die Sonden an eine feste Phase immobilisiert und nach erfolgter Denaturierung des PCR-Produktes dieses in Kontakt mit der immobilisierten Sonde bringt. Der Nachweis eines erfolgten Hybridisierungsereignisses erfolgt in Analogie zur ersten Verfahrensvariante.
[0011] Eine deutliche Reduktion von Arbeitsschritten wird in der Patentschrift KR 1020060099022 A (Method and kit for rapid and Accurate detection and analysis of nucleotide sequence with naked eye by using membrane lateral flow analysis) offenbart.
[0012] Hierbei wird ein Lateral-Flow- Verfahren genutzt, um Nukleinsäuren zu detektieren. Auch dieses Verfahren bedient sich der Technologie der Hybridisierung von Nukleinsäuren an einer festen Phase. Vorteilhaft ist, dass es sich bei einem Lateral-Flow- Verfahren um eine kleines handliches Testformat handelt (Streifentest).
[0013] Alle diese Verfahren nutzen eine enzymatische Vervielfältigungsreaktion und basieren nicht auf einer direkten Nachweisreaktion einer spezifischen Nukleinsäure. Dabei muss berücksichtigt werden, dass eine Amplifizierungsreaktion immer zeitaufwendig ist und im Falle des Nachweises von RNA sogar zusätzlich noch die Umschreibung der RNA in die komplementäre DNA benötigt wird.
[0014] Daraus kann abgeleitet werden, dass bei einer Vielzahl von Anwendungen ein direkter Nachweis einer Zielnukleinsäure, also ein Nachweis ohne eine Amplifizierungsreaktion, deutlich schneller und einfacher sein könnte. Damit verbunden könnte der benötigte gerätetechnische Aufwand deutlich reduziert werden, ebenso wie die Reagenzienkosten sowie der Arbeitsaufwand. Das bekannte Problem von Kreuzkontaminationen während durchzuführender Amplifizierungsreaktionen würde nicht gegeben sein.
[0015] Insbesondere für Nachweisreaktionen, bei denen es nicht nur um den Nachweis weniger Kopien an nachzuweisenden Molekülen geht, könnten auch ohne Amplifizierungsreaktionen diagnostisch nachgewiesen werden (z.B. ribosomale RNA's, mitochondriale RNA's und DNA's, - Plasmidmoleküle, nichtkodierende repetitive Sequenzen usw.).
Das molekularbiologische Nachweise auch ohne Amplifikationsreaktionen erfolgreich eingesetzt werden können, wird in der Patentschrift (WO 2006125050 20061123) offenbart.
[0016] Diese Patentschrift beschreibt einen sensitiven DNA-Nachweis ohne eine Amplifikation in Form eines Bio-Barkode-Assays. Das dargestellte Verfahren ist aber sehr aufwendig und bedarf sowohl einer Vorrichtung zur Trennung der an das Zielmolekül gebundenen Nanopartikel von nicht an das Zielmolekül gebundenen Nanopartikeln und weiterhin ein Reading-Out-System zur Signalauswertung. Weitere Verfahren zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuren ohne Amplifizierungsreaktionen basieren auf klassischen Hybridisierungstechniken von an Membranen gebundenen Nukleinsäuren. Diese Verfahren sind zeit- und arbeitsaufwendig und können somit nicht für eine alternative Routinediagnostik eingesetzt werden (Dot Blots, Southern Blots, etc.). Dies betrifft auch die Anwendung von Biochip-Technologien. Auch hier ist der gerätetechnische Aufwand immens und diese Technologie nicht universell einsetzbar und oftmals auch nur für die Untersuchung von Genexpressionsmustern (Untersuchung von RNA) nicht aber für den diagnostischen Nachweis von z.B. pathogenen Mikroorganismen (auf der Basis von DNA) einsetzbar.
Aufgabe der Erfindung
[0017] Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, die Nachteile der oben beschriebenen Lösungen zu beseitigen. Lösung der Aufgabe
[0018] Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst. Erfindungsgemäß wurde mit der vorliegenden Erfindung ein universell nutzbares Verfahren zum spezifischen Nachweis von Targetnukleinsäuren bereitgestellt, das sehr schnell durchführbar sowie einfach ist und darüber hinaus keine teuren Gerätesysteme benötigt. Das Verfahren eignet sich als molekulargenetischer Schnelltest und trägt den Vorgaben der diagnostischen Spezifitätssicherung Rechnung. Entscheidend dabei ist, dass die Unterscheidung zwischen einer gebundenen und einer ungebundenen Sonde ohne zusätzliche Wasch- und Separationsschritte stattfindet und damit das Problem der Patentschrift WO 2006125050 20061123 löst.
[0019] Überraschenderweise wird das Problem dadurch gelöst, dass man für die spezifische Nachweisreaktion einer Targetnukleinsäure in einem Reaktionsansatz eine Fluoreszenzmarkierte DNA-Sonde (komplementär zur nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz) und einen den Fluorophor bindenden und dabei dessen Fluoreszenz löschenden Antikörper einsetzt. Das erfindungsgemäße Verfahren realisiert sich über den sterischen Ausschluss der Antikörper- Bindung durch die Hybridisierung von Probe und Sonde zu einem Doppelstrang. Der Fluorophor der Sonde ist nach erfolgter Hybridisierung für den Fluoreszenz-löschenden Antikörper nicht mehr zugänglich - im Ergebnis dieses Effektes bleibt die Fluoreszenz des Fluorophors erhalten. Im Gegensatz hierzu wird der Fluorophor einer nicht hybridisierten Sonde durch den Antikörper gebunden und dabei dessen Fluoreszenz gelöscht. Damit ist die im System messbare Fluoreszenz direkt an das Vorhandensein einer zur Sonde komplementären DNA-Sequenz in der Messprobe gekoppelt. Das beschriebene Verfahren gliedert sich in die folgenden Prozessschritte:
A. Bereitstellung eines einzelsträngigen Target-Nukleinsäure-Moleküls :
[0020] Die zu testenden Nukleinsäuren liegen vollständig oder partiell als Einzelstrang- Nukleinsäure vor (z.B. diverse RNA- Moleküle, einzel strängige Virusgenome, asymmetrisch amplifizierte DNA's, cDNA's etc.). Die Nukleinsäuremoleküle, die doppel strängig vorliegen, müssen für die Sondenhybridisierung mittels laborüblichen Techniken (z.B. Erhitzung, denaturierende Substanzen etc.) in die Einzelstrang- Form überführt werden. B. Hybridisierung mit einer sequenzspezifischen Sonde, an welche mindestens ein Fluorophor gekoppelt ist:
[0021] Die Targetnukleinsäure wird mit einer definierten Menge der fluorophorgekoppelten Sonde in Kontakt gebracht und bei einer für eine spezifische Hybridisierung berechneten Temperatur inkubiert.
C. Nachweis des Hybridisierungsereignisses:
[0022] Das Hybridisierungsereignis (und damit der Nachweis der gesuchten Zielnukleinsäure) wird mittels eines Antikörpers, welcher in der erfindungsgemäßen Ausführung gleichzeitig den Fluorophor bindet und dessen Fluoreszenz quencht, nachgewiesen. Das Fluorophor auf der mit der Targetsequenz hybridisierten Sonde ist für die Antikörperbindung sterisch verhindert und kann daher von dem Antikörper nicht gequencht werden. Die Bindung des Antikörpers an das Fluorophor ist durch die Hybridisierung von Targetsequenz und Sonde sterisch behindert und daher eine Löschung der Fluoreszenz ausgeschlossen.
[0023] Dieser Prozess kann mittels der Messung der Fluoreszenzintensität der Probe im Vergleich zu den Negativ- und Positiv- Kontrollen (Initialpunktmessung vs. Endpunktmessung) qualitativ und quantitativ ausgewertet werden. Auch die Nutzung eines im System mitgeführten Standards ist möglich.
[0024] Der Quencher kann nicht nur ein von sich aus quenchender Antikörper sein, sondern auch ein das Fluorophor bindender Antikörper, der durch Konjugation mit einem quenchendem Molekül (z.B. BHQ 1) erst zu einem solchen gemacht wurde.
[0025] Es ist möglich, parallele multiplexe Messungen durchzuführen, d.h. zwei oder mehr mit unterschiedlichen Fluorophoren markierte Sonden werden parallel in einem Ansatz zum Nachweis der entsprechenden Templates eingesetzt.
[0026] Nicht nur Antikörper sind geeignet, sondern auch andere bindende Moleküle (rekombinante Antikörper, Aptamere, Intercaline). [0027] Der sterische Ausschluss der Antikörper-Bindung (Fluorszenz-Quenching) kann auch durch andere hybridisierende Moleküle außer DNA möglich sein (PNA, RNA vielleicht auch Proteine).
[0028] Das oben beschriebene Verfahren kann sowohl manuell als auch automatisiert durchgeführt werden.
[0029] Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann jeder Typ an Nukleinsäure nicht nur spezifisch detektiert, sondern auch quantifiziert werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann sowohl eine aus dem Probenmaterial isolierte Nukleinsäureprobe direkt bestimmt werden (also ohne Amplikationsreaktion auf der Basis von PCR oder NASBA etc.), als auch ein initiativ amplifiziertes oder in einer anderer Weise in vitro verändertes (z.B. durch die cDNA- Synthese) generiertes Nukleinsäuremolekül.
[0030] Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren steht ein extrem einfaches und universelles Nachweisverfahren für spezifische Nukleinsäuren zur Verfügung. Im Unterschied zu Real- Time-PCR- Verfahren erfolgt die Detektion des spezifischen Nachweissignals nicht mittels FRET -Effektes (EP 0972 848 A2), sondern durch eine Bindung des fluoreszenzquenchenden Antikörpers. Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich auch von der Patentschrift (EP 0 826 066 B l), welche ebenfalls eine Kombination von PCR und Hybridisierung darstellt. Auch bei diesem Verfahren wird wiederum ein durch FRET -Effekt vermitteltes Fluoreszenzsignal detektiert. Dieses entsteht während des Amplifikationsvorganges durch die Hybridisierung einer Sonde, die eine niedrigere Annealingtemperatur hat, als die Primer. Die Freisetzung der Fluoreszenz erfolgt dabei nicht durch Hydrolyse der Sonde in Folge der Exonukleaseaktivität der Polymerase, sondern dadurch, dass bei der Hybridisierung die sekundäre Struktur der Sonde aufgelöst wird und die Fluoreszenz weniger gequencht wird.
[0031] Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist erstmals ein extrem einfaches, schnelles und universelles Verfahren zum spezifischen Nachweis und zur Quantifizierung von Nukleinsäuren verfügbar, welches gerätetechnisch lediglich einen Fluoreszenzreader benötigt. Damit stellt das erfindungsgemäße Verfahren ein Testformat dar, welches prinzipiell auch unter Feldbedingungen realisiert werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung spezifischer Nukleinsäuresequenzen erlaubt die Testdurchführung in nicht einmal einer Stunde. Das Verfahren eignet sich in hervorragender Weise auch für den Nachweis von Zielnukleinsäuren ohne vorangegangene Amplifizierungsreaktion, also direkt für den Nachweis von Nukleinsäuren einer Probe. (DNA oder RNA).
[0032] Das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen Bestimmung mindestens einer spezifischen Nukleinsäure- Sequenz (Zielsequenz) umfasst die Schritte
Hybridisierung mit mindestens einer zu der Zielsequenz ganz oder partiell komplementären Sonde und
Nachweis der Hybridisierungsreaktion mittels eines Fluoreszenz- löschenden Antikörpers,
Auswertung des Hybridisierungs- Ereignisses mittels Fluoreszenz- Messung
[0033] Die Hybridisierung zum Doppelstrang verhindert sterisch die Bindung des Fluoreszenz löschenden Antikörpers. Infolge dieses Bindungsausschlusses bleibt die Fluoreszenz der Sonde erhalten. Nicht hybridisierte Sonden werden durch den Binder (z.B. Antikörper) gebunden und dabei wird deren Fluoreszenz gelöscht.
[0034] Möglich ist die Durchführung einer Endpunkt-Fluoressenz-Messung zum Nachweis und zur Konzentrationsbestimmung der spezifischen Nukleinsäure- Sequenz in der Messprobe.
[0035] Die Nachweisreaktion erfolgt frei von Separation- Schritten in einem Ansatz. Die nachzuweisende Zielsequenz kann eine beliebige Nukleinsäure, insbesondere DNA oder RNA, sein. Es ist auch möglich, dass die Zielsequenz ein Amplifikationsprodukt ist.
[0036] Das erfindungsgemäße Verfahren funktioniert so gut, dass es überraschenderweise möglich ist, auch eine Titration des nachzuweisenden DNA-Strangs (Template) durchzuführen. Damit ist der Nachweis von 0,1 μΜ Template gut möglich.
[0037] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist es möglich, Sonde und Antikörper gemeinsam als eine Lösung zum Template zu geben und dann zu hybridisieren. Das Messprinzip wird dadurch noch einfacher.
[0038] Die Sonde ist eine zur Zielsequenz ganz oder teilweise komplementäre Nukleotid- Sequenz, die mindestens ein Fluorophor enthält. Das oder die Fluorophore können in Form eines derivatisierten Nukleotids in der Sonde enthalten sein. Als Fluorophor jedes Fluorophor verwendet werden kann, insbesondere Fluoreszein und 5-TAMRA (5-Carboxy- teramethylrhodamin) .
[0039] Die Erfindung soll nachfolgend anhand eines Beispiels näher erläutert werden, ohne sie auf dieses Beispiel zu reduzieren.
Ausführungsbeispiel
Materialien:
1. Fluorophor-markierte Oligonukleotid-Sonde (im folgenden als Sonde bezeichnet)
2. Fluorophor-bindender und dessen Fluoreszenz löschender Antikörper (im folgenden als Antikörper bezeichnet)
3. Nachzuweisender zu Sonde komplementärer DNA-Einzel sträng (im folgenden als Template bezeichnet)
Durchführung:
1. Vereinen von Template und Sonde
2. Hybridisierung zum Doppelstrang bei geeigneter Temperatur
3. Zugabe des Antikörpers
4. Fluoreszenz-Messung
Erklärung zu den Figuren:
[0040] Figur 1 zeigt die DNA- Analytik mittels Fluoreszenz-Löschung durch einen sequenzspezifisch bindenden monoklonalen Antikörper - schematische Darstellung des Testprinzips sowie der Prozessschritte .
[0041] In Figur 2 steigt die Fluoreszenz mit zunehmender Konzentration des Templates an. Nach Hybridisierung von Sonde und Template zum Doppelstrang ist das Fluorophor nicht länger für eine Bindung durch den Antikörper zugänglich - somit bleibt auch dessen Fluoreszenz unverändert erhalten. Zu erkennen ist die Erhöhung der Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Konzentration der Zielsequenz (Oligonukleotid).
Biotez(Lumiprobe)-TAMRA-Sonde - Verdünnungsreihe Template
Sonde Biotez 26445-21
Template metabion 00205B23-0147C01
Antikörper G71-DC7
Sonde Template Antikörper Counts 592 nm
0, 1 μΜ μΜ 0, 1 μΜ Ansatz 1 Ansatz 2 Ansatz 3 Mittelwert
+ - - 55 27 36 39
+ - - 8219 8480 7248 7982
+ - + 325 297 247 290
+ 0,267 + 8484 7534 8737 8252
+ 0, 133 + 7738 7149 6716 7201
+ 0,067 + 5672 5431 4865 5323
+ 0,033 + 2958 3012 2850 2940
+ 0,017 + 1582 1636 1645 1621
+ 0,008 + 947 786 1001 911
+ 0,004 + 717 620 568 635
[0042] Figur 3 zeigt die Erhöhung der Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Konzentration der PCR-Probe(PCR-Probe mit Zielsequenz aus nativer DNA (schwarz) - PCR-Probe ohne Ziel sequenz (weiß).
[0043] Figur 4 (A bis C) zeigt den reproduzierbaren Effekt des Verfahrens
Ansatz: 75 μΐ Sonde
+ 75 μΐ Template
150 μΐ
Ablauf: 1. ) Sonde + Template Messung: Ex. 541 nm
2. ) Hybridisierung 40°C 20 min Em. 550 - 650 nm
3. ) Zugabe Antikörper Materialien:
Figure imgf000013_0001
[0044] Erfolgt in Abwesenheit des Templates eine Bindung der Fluorophor-markierten Sonde durch den Antikörper, so wird die Fluoreszenz des Fluorophors gelöscht.
[0045] Es existieren Fluoreszenz-löschende Antikörper für: a) Fluorescein (F. Sellrie, A. Warsinke, B. Micheel (2006) Homogeneous indirect fluorescence quenching immunoassay for the determination of low molecular weight substances. Anal Bioanal Chem. 386(2):206-10.) b) Europium-Kryptat (EuTBP)
F. Sellrie, M. Beck, N. Hildebrandt, B. Micheel (2010) A homogeneous time-resolved fluoroimmunoassay (TR-FIA) using antibody mediated luminescence quenching. Analytical Methods, 2 : 1298-1301. c) Terbium-Chelat
d) 5- TAMRA (5-Carboxy-tetramethylrhodamin)
Definitionen
Sonde
[0046] Unter dem Begriff "Sonde" wird im Sinne der Erfindung verstanden: Ein Oligonukleotid, welches ganz oder partiell zu einer Targetnukleinsäure komplementär ist und mit mindestens einem Fluorophor versehen ist.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung mindestens einer spezifischen Nukleinsäure-Sequenz (Zielsequenz) mit den Schritten:
a) Hybridisierung der einzel strängigen Ziel-Nukleinsäure mit mindestens einer Sonde, die mit mindestens einem Fluorophor markiert ist
b) gleichzeitige oder nachfolgende Zugabe eines den Fluorophor bindenden und dessen Fluoreszenz löschenden Bindungsmoleküls
c) Nachweis des Hybridisierungs-Ereignisses durch Messung der Fluoreszenz, wobei nicht-hybridisierte Sonde durch das Bindungsmolekül (Binder) gebunden und dabei dessen Fluoreszenz gelöscht wird und hybridisierte Sonde aufgrund der Hybridisierung und der damit verbundenen steri sehen Hinderung nicht durch den Binder gebunden wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich bei dem Bindungsmolekül um einen Antikörper handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sowohl zur qualitativen als auch zur quantitativen Bestimmung der Ziel-Nukleinsäure dient.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde zu der spezifischen Nukleinsäure-Sequenz (Zielsequenz) ganz oder partiell komplementär ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis der spezifischen Nukleinsäure-Sequenz und die Konzentrationsbestimmung der spezifischen Nukleinsäure-Sequenz in der Messprobe durch Endpunkt-Fluoressenz- Messung erfolgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis der spezifischen Nukleinsäure-Sequenz und die Konzentrationsbestimmung der spezifischen Nukleinsäure-Sequenz in der Messprobe durch Titration erfolgt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der zu bestimmenden spezifischen Nukleinsäure-Sequenz um RNA, einzel strängige Virusgenome, asymmetrisch amplifizierte DNA's, cDNA's oder doppel strängig vorliegende Nukleinsäuremoleküle, die in die Einzelstrang- Form überführt wurden, handelt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielsequenz ein Amplifikationsprodukt ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das oder die Fluorophore in Form eines derivatisierten Nukleotids in der Sonde enthalten sind.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass als Fluorophor Fluoreszein oder 5-TAMRA (5-Carboxy-teramethylrhodamin) verwendet wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Binder ein monoklonaler Antikörper ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung der Fluoreszenz mittels eines Fluoreszenz-Readers erfolgt.
13. Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorangegangenen Ansprüche, umfassend:
a) mindestens eine Sonde, die mit mindestens einem Fluorophor markiert ist
b) einen den Fluorophor bindenden und dessen Fluoreszenz löschenden Antikörper c) ein Gerät zur Messung der Fluoreszenz.
14. Automat zur automatisierten Durchführung des Testkits nach Anspruch 13 zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12.
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