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Das vorgestellte Verfahren dient dem spezifischen Nachweis von Nukleinsäuresequenzen und damit der molekularen Diagnostik. Das Grundprinzip des Nachweises besteht im sterischen Ausschluss einer Antikörper-Bindung durch die Hybridisierung eines Nukleinsäuretargets mit einer Nukleinsäuresonde zum Doppelstrang. Das Fluorophor der Sonde ist nach erfolgter Hybridisierung für einen fluoreszenz-löschenden Antikörper nicht mehr zugänglich. Die im System messbare Fluoreszenz ist direkt an das Vorhandensein einer zur Sonde komplementären DNA-Sequenz in der Messprobe gekoppelt.
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Stand der Forschung
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Die Gendiagnostik ist zu einem unverzichtbaren Bestandteil der modernen medizinischen Labordiagnostik, der forensischen Diagnostik, der veterinärmedizinischen Labordiagnostik oder der Lebensmittel- und Umweltdiagnostik geworden.
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Revolutioniert wurde die genetische Diagnostik mit der Erfindung der PCR-Technologie, die es gestattet, jede beliebige Nukleinsäuresequenz spezifisch zu vervielfachen.
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Diese Technologie besitzt aber neben ihren eindeutigen Vorteilen (wie Sensitivität, Spezifität) auch ihre Nachteile. Für die Durchführung der Amplifizierung werden teurere Geräte benötigt, die den schnellen Temperaturwechsel gewährleisten können, die Ergebnisse der Amplifizierung bzw. mit der Amplifizierung gekoppelten Sondenhybridisierung müssen gleichfalls mittels treuerer und aufwendig zu bedienender Labortechnik ausgewertet werden. Hierbei ist eine „einfache” Visualisierung mittels Gelelektrophorese manchmal wegen ihrer Ungenauigkeit unzureichend.
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Eine weit verbreitete Methode zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuren ist z. B. die Light Cycler Technologie (Fa. Roche). Die Firma Roche entwickelte dazu spezielle Hybridisierungssonden bestehend aus zwei verschiedenen Oligonukleotiden, die jeweils mit nur einem Fluorochrom markiert sind. Am 3'-Ende der einen Sonde befindet sich der Akzeptor, das andere Oligonukleotid ist am 5'-Ende mit einem Donor versehen. Die Sonden werden so gewählt, dass sie beide an den gleichen DNA-Strang binden, wobei der Abstand zwischen Akzeptor und Donor nur maximal 1 bis 5 Nukleotide betragen darf, damit es zum sog. FREI-Effekt kommen kann. Die Messung der Fluoreszenz erfolgt während des Annealingschrittes, wobei nur Licht dieser Wellenlänge nachweisbar ist, solange beide Sonden an die DNA gebunden sind. Der Schmelzpunkt beider Sonden sollte bei diesem System identisch sein. Durch die Verwendung zweier hybridisierender Sonden zusätzlich zu den verwendeten Primern ist die Spezifität dieses Detektionsystems äußerst hoch.
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Eine weitere Real Time PCR Anwendung zum Nachweis spezifischer Nukleinsäure-Targets kann mit sog. Double-Dye-Sonden, welche in der Patentschrift
US 5210015 und
US 5487972 offenbart sind (TagMan-Sonden), durchgeführt werden. Double-Dye-Sonden tragen zwei Fluorochrome auf einer Sonde. Der Reporterfarbstoff befindet sich hier am 5'-Ende, der Quencherfarbstoff am 3'-Ende. Zusätzlich befindet sich am 3'-Ende der Sonde eventuell noch eine Phosphatgruppe, damit die Sonde bei der Elongation nicht als Primer fungieren kann. Solange die Sonde intakt ist, ist die freigesetzte Lichtstärke gering, da fast die gesamte Lichtenergie, die nach der Anregung des Reporters entsteht, aufgrund der räumlichen Nähe vom Quencher aufgenommen und umgeformt wird. Das emittierte Licht des Reporterfarbstoffes wird „gequenched”, d. h. gelöscht. Dieser FREI-Effekt bleibt auch erhalten, nachdem die Sonde an den komplementären DNA-Strang gebunden hat. Während der Elongationsphase trifft die Polymerase auf die Sonde und hydrolysiert sie. Man bezeichnet die Fähigkeit der Polymerase, ein Oligonukleotid (bzw. eine Sonde) während der Strangsynthese zu hydrolysieren, als 5'-3'-Exonukleaseaktivität. Nicht alle Polymerasen haben eine 5'-3'-Exonukleaseaktivität (Taq- und Tth-Polymerase). Als erstes wurde dieses Prinzip für die Taq-Polymerase beschrieben. Das Prinzip wird als TagMan-Prinzip bezeichnet. Nach Sondenhydrolyse befindet sich der Reporterfarbstoff nicht mehr in räumlicher Nähe zum Quencher. Die emittierte Fluoreszenz wird jetzt nicht mehr umgeformt, dieser Fluoreszenzanstieg wird gemessen.
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Eine weitere Möglichkeit zum spezifischen Nachweis von Amplifikationsprodukten mittels Real-Time-PCR-Technologie besteht in der Nutzung von interkalierenden Farbstoffen (Ethidiumbromid, Hoechst 33258, Yo-Pro-1 oder SYBR GreenTM u. ä.). Eine klare Differenzierung zwischen spezifischem Amplifikationsereignis bzw. Artefakt ist aber zwingend notwendig. Um dies dennoch zu erreichen, nutzt man eine sog. Schmelzpunktanalyse am Ende der eigentlichen PCR-Reaktion.
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Mittels Real-Time-PCR-Anwendungen ist es darüber hinaus auch möglich, eine Quantifizierung der nachzuweisenden Targets durchzuführen.
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Ein großer Nachteil besteht allerdings darin, dass sie auf sehr teuren Geräteplattformen implementiert sind, welche den Prozess sowohl der Amplifikation als auch nachfolgenden, der Fragestellung entsprechenden optischen Detektion in einer Hardware-Lösung vereinen müssen. Weiterhin basieren viele dieser beschriebenen Nachweisverfahren immer auf der Echtzeitverfolgung des Amplifikationsprozesses. Auf dieser Strategie basierend, erfolgt auch die Aufarbeitung der gemessenen Fluoreszenzwerte im Verlauf der Amplifikationsreaktion. Dem Fachmann ist klar, dass damit verbunden auch ein enorm hoher Grad an Analysealgorithmen in Real-Time-Systeme integriert sein muss. Dies erklärt letztlich den hohen finanziellen Aufwand, der für die Nutzung von Real-Time-PCR-Systemen betrieben werden muss. Letztlich ist auch die Bedienung solcher Gerätesysteme an ein hohes Maß an Expertise gebunden.
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Neben den dargestellten Real-Time-PCR-basierten diagnostischen Nachweisen existieren aber auch alternative Varianten zum spezifischen Nachweis von Nukleinsäuren, z. B. PCR-ELISA. Bei dieser Methode wird die zu untersuchende DNA-Sequenz amplifiziert und das erzeugte DNA-Fragment nachfolgend an einer festen Phase (z. B. Mikrotiterplatte oder Streifen) kovalent immobilisiert, nachfolgend zu einem Einzelstrang denaturiert und mit einer sequenzspezifischen Sonde hybridisiert. Die erfolgreiche Anbindung der Sonde kann durch eine antikörpervermittelte Farbreaktion sichtbar gemacht werden. Eine andere Variante basiert darauf, dass man die Sonden an eine feste Phase immobilisiert und nach erfolgter Denaturierung des PCR-Produktes dieses in Kontakt mit der immobilisierten Sonde bringt. Der Nachweis eines erfolgten Hybridisierungsereignisses erfolgt in Analogie zur ersten Verfahrensvariante.
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Eine deutliche Reduktion von Arbeitsschritten wird in der Patentschrift
KR 1020060099022 A (Method and kit for rapid and Accurate detection and analysis of nucleotide sequence with naked eye by using membrane lateral flow analysis) offenbart.
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Hierbei wird ein Lateral-Flow-Verfahren genutzt, um Nukleinsäuren zu detektieren. Auch dieses Verfahren bedient sich der Technologie der Hybridisierung von Nukleinsäuren an einer festen Phase. Vorteilhaft ist, dass es sich bei einem Lateral-Flow-Verfahren um eine kleines handliches Testformat handelt (Streifentest).
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Alle diese Verfahren nutzen eine enzymatische Vervielfaltigungsreaktion und basieren nicht auf einer direkten Nachweisreaktion einer spezifischen Nukleinsäure. Dabei muss berücksichtigt werden, dass eine Amplifizierungsreaktion immer zeitaufwendig ist und im Falle des Nachweises von RNA sogar zusätzlich noch die Umschreibung der RNA in die komplementäre DNA benötigt wird.
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Daraus kann abgeleitet werden, dass bei einer Vielzahl von Anwendungen ein direkter Nachweis einer Zielnukleinsäure, also ein Nachweis ohne eine Amplifizierungsreaktion, deutlich schneller und einfacher sein könnte. Damit verbunden könnte der benötigte gerätetechnische Aufwand deutlich reduziert werden, ebenso wie die Reagenzienkosten sowie der Arbeitsaufwand. Das bekannte Problem von Kreuzkontaminationen während durchzuführender Amplifizierungsreaktionen würde nicht gegeben sein.
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Insbesondere für Nachweisreaktionen, bei denen es nicht nur um den Nachweis weniger Kopien an nachzuweisenden Molekülen geht, könnten auch ohne Amplifizierungsreaktionen diagnostisch nachgewiesen werden (z. B. ribosomale RNA's, mitochondriale RNA's und DNA's, – Plasmidmoleküle, nichtkodierende repetitive Sequenzen u. s. w.).
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Das molekularbiologische Nachweise auch ohne Amplifikationsreaktionen erfolgreich eingesetzt werden können, wird in der Patentschrift (
WO 2006125050 20061123 ) offenbart.
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Diese Patentschrift beschreibt einen sensitiven DNA-Nachweis ohne eine Amplifikation in Form eines Bio-Barkode-Assays. Das dargestellte Verfahren ist aber sehr aufwendig und bedarf sowohl einer Vorrichtung zur Trennung der an das Zielmolekül gebundenen Nanopartikel von nicht an das Zielmolekül gebundenen Nanopartikeln und weiterhin ein Reading-Out-System zur Signalauswertung. Weitere Verfahren zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuren ohne Amplifizierungsreaktionen basieren auf klassischen Hybridisierungstechniken von an Membranen gebundenen Nukleinsäuren. Diese Verfahren sind zeit- und arbeitsaufwendig und können somit nicht für eine alternative Routinediagnostik eingesetzt werden (Dot Blots, Southern Blots, etc.). Dies betrifft auch die Anwendung von Biochip-Technologien. Auch hier ist der gerätetechnische Aufwand immens und diese Technologie nicht universell einsetzbar und oftmals auch nur für die Untersuchung von Genexpressionsmustern (Untersuchung von RNA) nicht aber für den diagnostischen Nachweis von z. B. pathogenen Mikroorganismen (auf der Basis von DNA) einsetzbar.
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Aufgabe der Erfindung
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Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, die Nachteile der oben beschriebenen Lösungen zu beseitigen.
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Lösung der Aufgabe
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Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst. Erfindungsgemäß wurde mit der vorliegenden Erfindung ein universell nutzbares Verfahren zum spezifischen Nachweis von Targetnukleinsäuren bereitgestellt, das sehr schnell durchfürbar sowie einfach ist und darüber hinaus keine teuren Gerätesysteme benötigt. Das Verfahren eignet sich als molekulargenetischer Schnelltest und trägt den Vorgaben der diagnostischen Spezifitätssicherung Rechnung. Entscheidend dabei ist, dass die Unterscheidung zwischen einer gebundenen und einer ungebundenen Sonde ohne zusätzliche Wasch- und Separationsschritte stattfindet und damit das Problem der Patentschrift
WO 2006125050 20061123 löst.
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Überraschenderweise wird das Problem dadurch gelöst, dass man für die spezifische Nachweisreaktion einer Targetnukleinsäure in einem Reaktionsansatz eine Fluoreszenzmarkierte DNA-Sonde (komplementär zur nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz) und einen den Fluorophor bindenden und dabei dessen Fluoreszenz löschenden Antikörper einsetzt. Das erfindungsgemäße Verfahren realisiert sich über den sterischen Ausschluss der Antikörper-Bindung durch die Hybridisierung von Probe und Sonde zu einem Doppelstrang. Der Fluorophor der Sonde ist nach erfolgter Hybridisierung für den Fluoreszenz-löschenden Antikörper nicht mehr zugänglich – im Ergebnis dieses Effektes bleibt die Fluoreszenz des Fluorophors erhalten. Im Gegensatz hierzu wird der Fluorophor einer nicht hybridisierten Sonde durch den Antikörper gebunden und dabei dessen Fluoreszenz gelöscht. Damit ist die im System messbare Fluoreszenz direkt an das Vorhandensein einer zur Sonde komplementären DNA-Sequenz in der Messprobe gekoppelt. Das beschriebene Verfahren gliedert sich in die folgenden Prozessschritte:
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A. Bereitstellung eines einzelsträngigen Target-Nukleinsäure-Moleküls:
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Die zu testenden Nukleinsäuren liegen vollständig oder partiell als Einzelstrang-Nukleinsäure vor (z. B. diverse RNA-Moleküle, einzelsträngige Virusgenome, asymmetrisch amplifizierte DNA's, cDNA's etc.). Die Nukleinsäuremoleküle, die doppelsträngig vorliegen, müssen für die Sondenhybridisierung mittels laborüblichen Techniken (z. B. Erhitzung, denaturierende Substanzen etc.) in die Einzelstrang-Form überführt werden.
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B. Hybridisierung mit einer sequenzspezifischen Sonde, an welche mindestens ein Fluorophor gekoppelt ist:
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Die Targetnukleinsäure wird mit einer definierten Menge der fluorophorgekoppelten Sonde in Kontakt gebracht und bei einer für eine spezifische Hybridisierung berechneten Temperatur inkubiert.
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C. Nachweis des Hybridisierungsereignisses:
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Das Hybridisierungsereignis (und damit der Nachweis der gesuchten Zielnukleinsäure) wird mittels eines Antikörpers, welcher in der erfindungsgemäßen Ausführung gleichzeitig den Fluorophor bindet und dessen Fluoreszenz quencht, nachgewiesen. Das Fluorophor auf der mit der Targetsequenz hybridisierten Sonde ist für die Antikörperbindung sterisch verhindert und kann daher von dem Antikörper nicht gequencht werden. Die Bindung des Antikörpers an das Fluorophor ist durch die Hybridisierung von Targetsequenz und Sonde sterisch behindert und daher eine Löschung der Fluoreszenz ausgeschlossen.
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Dieser Prozess kann mittels der Messung der Fluoreszenzintensität der Probe im Vergleich zu den Negativ- und Positiv-Kontrollen (Initialpunktmessung vs. Endpunktmessung) qualitativ und quantitativ ausgewertet werden. Auch die Nutzung eines im System mitgeführten Standards ist möglich.
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Das oben beschriebene Verfahren kann sowohl manuell als auch automatisiert durchgeführt werden.
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Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann jeder Typ an Nukleinsäure nicht nur spezifisch detektiert, sondern auch quantifiziert werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann sowohl eine aus dem Probenmaterial isolierte Nukleinsäureprobe direkt bestimmt werden (also ohne Amplikationsreaktion auf der Basis von PCR oder NASBA etc.), als auch ein initiativ amplifiziertes oder in einer anderer Weise in vitro verändertes (z. B. durch die cDNA-Synthese) generiertes Nukleinsäuremolekül.
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Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren steht ein extrem einfaches und universelles Nachweisverfahren für spezifische Nukleinsäuren zur Verfügung. Im Unterschied zu Real-Time-PCR-Verfahren erfolgt die Detektion des spezifischen Nachweissignals nicht mittels FREI-Effektes (
EP 0972 848 A2 ), sondern durch eine Bindung des fluoreszenzquenchenden Antikörpers. Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich auch von der Patentschrift (
EP 0 826 066 B1 ), welche ebenfalls eine Kombination von PCR und Hybridisierung darstellt. Auch bei diesem Verfahren wird wiederum ein durch FREI-Effekt vermitteltes Fluoreszenzsignal detektiert. Dieses entsteht während des Amplifikationsvorganges durch die Hybridisierung einer Sonde, die eine niedrigere Annealingtemperatur hat, als die Primer. Die Freisetzung der Fluoreszenz erfolgt dabei nicht durch Hydrolyse der Sonde in Folge der Exonukleaseaktivität der Polymerase, sondern dadurch, dass bei der Hybridisierung die sekundäre Struktur der Sonde aufgelöst wird und die Fluoreszenz weniger gequencht wird.
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Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist erstmals ein extrem einfaches, schnelles und universelles Verfahren zum spezifischen Nachweis und zur Quantifizierung von Nukleinsäuren verfügbar, welches gerätetechnisch lediglich einen Fluoreszenzreader benötigt. Damit stellt das erfindungsgemäße Verfahren ein Testformat dar, welches prinzipiell auch unter Feldbedingungen realisiert werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung spezifischer Nukleinsäuresequenzen erlaubt die Testdurchführung in nicht einmal einer Stunde. Das Verfahren eignet sich in hervorragender Weise auch für den Nachweis von Zielnukleinsäuren ohne vorangegangene Amplifizierungsreaktion, also direkt für den Nachweis von Nukleinsäuren einer Probe.(DNA oder RNA).
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen Bestimmung mindestens einer spezifischen Nukleinsäure-Sequenz (Zielsequenz) umfasst die Schritte
- • Hybridisierung mit mindestens einer zu der Zielsequenz ganz oder partiell komplementären Sonde und
- • Nachweis der Hybridisierungsreaktion mittels eines Fluoreszenz-löschenden Antikörpers,
- • Auswertung des Hybridisierungs-Ereignisses mittels Fluoreszenz-Messung
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Die Hybridisierung zum Doppelstrang verhindert sterisch die Bindung des Fluoreszenz löschenden Antikörpers. Infolge dieses Bindungsausschlusses bleibt die Fluoreszenz der Sonde erhalten. Nicht hybridisierte Sonden werden durch den Binder (z. B. Antikörper) gebunden und dabei wird deren Fluoreszenz gelöscht.
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Möglich ist die Durchführung einer Endpunkt-Fluoreszenz-Messung zum Nachweis und zur Konzentrationsbestimmung der spezifischen Nukleinsäure-Sequenz in der Messprobe.
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Die Nachweisreaktion erfolgt frei von Separation-Schritten in einem Ansatz. Die nachzuweisende Zielsequenz kann eine beliebige Nukleinsäure, insbesondere DNA oder RNA, sein. Es ist auch möglich, dass die Zielsequenz ein Amplifikationsprodukt ist.
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Die Sonde ist eine zur Zielsequenz ganz oder teilweise komplementäre Nukleotid-Sequenz, die mindestens ein Fluorophor enthält. Das oder die Fluorophore können in Form eines derivatisierten Nukleotids in der Sonde enthalten sein. Als Fluorophor jedes Fluorophor verwendet werden kann, insbesondere Fluoreszein.
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Die Erfindung soll nachfolgend anahnd eines Beispiels näher erläutert werden, ohne sie auf dieses Beispiel zu reduzieren.
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Ausführungsbeispiel
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Materialien:
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- 1. Fluorophor-markierte Oligonukleotid-Sonde (im folgenden als Sonde bezeichnet)
- 2. Fluorophor-bindender und dessen Fluoreszenz löschender Antikörper (im folgenden als Antikörper bezeichnet)
- 3. Nachzuweisender zu Sonde komplementärer DNA-Einzelstrang (im folgenden als Template bezeichnet)
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Durchführung:
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- 1. Vereinen von Template und Sonde
- 2. Hybridisierung zum Doppelstrang bei geeigneter Temperatur
- 3. Zugabe des Antikörpers
- 4. Fluoreszenz-Messung
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2 zeigt eine schematische Darstellung des Funktionsprinzips:
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In 3 steigt die Fluoreszenz mit zunehmender Konzentration des Templates an. Nach Hybridisierung von Sonde und Template zum Doppelstrang ist das Fluorophor nicht länger für eine Bindung durch den Antikörper zugänglich – somit bleibt auch dessen Fluoreszenz unverändert erhalten.
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Erfolgt in Abwesenheit des Templates eine Bindung der Fluorophor-markierten Sonde, so wird die Fluoreszenz des Fluorophors gelöscht.
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Es existieren Fluoreszenz-löschende Antikörper für:
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- a) Fluorescein (F. Sellrie, A. Warsinke, B. Micheel (2006) Homogeneous indirect fluorescence quenching immunoassay for the determination of low molecular weight substances. Anal Bioanal Chem. 386 (2): 206–10.)
- b) Europium-Kryptat (EuTBP) (F. Sellrie, M. Beck, N. Hildebrandt, B. Micheel (2010) A homogeneous time-resolved fluoroimmunoassay (TR-FIA) using antibody mediated luminescence quenching Anal. Methods DOI: 10.1039/c0ay00306a.
- c) Terbium-Chelat
- d) 5-TAMRA (Rhodamin B)
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Arbeiten zum Fluorophor tC°
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tC° – tricyclic fluorescent cytidine analog, veröffentlicht in:
P. Sandin, et al., Nucleic Acids Res., 2008, 36, 157–167.
P. Sandin, et al., Nucleic Acids Res., 2005, 33, 5019–5025.
K. C. Engman, et al., Nucleic Acids Res., 2004, 32, 5087–5095.
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tC° – wird als Fluorophor analog zum Cytosin in den Doppelstrang eingebaut und bildet eine Basenpaarung zum Guanin aus.
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In 4 ist zu erkennen, dass für tC° der Ausschluß der Antikörperbindung nach erfolgter Hybridisierung von Sonde und Template erfolgreich demonstriert werden konnte.
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Definitionen
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Sonde
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Unter dem Begriff ”Sonde” wird im Sinne der Erfindung verstanden:
Ein Oligonukleotid, welches ganz oder partiell zu einer Targetnukleinsäure komplementär ist und mit mindestens einem Fluorophor versehen ist.
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Die Erfindung soll anhand der 1 näher erläutert werden, ohne die Erfindung auf dieses Beispiel zu reduzieren.
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1 zeigt die DNA-Analytik mittels Fluoreszenz-Löschung durch einen sequenzspezifisch bindenden monoklonalen Antikörper – schematische Darstellung der Prozessschritte.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- US 5210015 [0006]
- US 5487972 [0006]
- KR 1020060099022 A [0011]
- WO 2006125050 [0016, 0019]
- WO 20061123 [0016, 0019]
- EP 0972848 A2 [0027]
- EP 0826066 B1 [0027]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- F. Sellrie, A. Warsinke, B. Micheel (2006) Homogeneous indirect fluorescence quenching immunoassay for the determination of low molecular weight substances. Anal Bioanal Chem. 386 (2): 206–10 [0038]
- F. Sellrie, M. Beck, N. Hildebrandt, B. Micheel (2010) A homogeneous time-resolved fluoroimmunoassay (TR-FIA) using antibody mediated luminescence quenching Anal. Methods DOI: 10.1039/c0ay00306a [0038]
- P. Sandin, et al., Nucleic Acids Res., 2008, 36, 157–167 [0039]
- P. Sandin, et al., Nucleic Acids Res., 2005, 33, 5019–5025 [0039]
- K. C. Engman, et al., Nucleic Acids Res., 2004, 32, 5087–5095 [0039]
