WO2006108205A2 - Verfahren zur detektion von nukleinsäurefragmenten - Google Patents

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WO2006108205A2
WO2006108205A2 PCT/AT2006/000148 AT2006000148W WO2006108205A2 WO 2006108205 A2 WO2006108205 A2 WO 2006108205A2 AT 2006000148 W AT2006000148 W AT 2006000148W WO 2006108205 A2 WO2006108205 A2 WO 2006108205A2
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a method for the internal control of nucleic acid amplifications.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Internal controls are used to demonstrate any PCR inhibition, serve to demonstrate the successful course of amplification, and give false negative results, e.g. due to inhibitors.
  • inhibitors can be caused by poor purification of the sample, for example residual ethanol, protein residual particles, on the other hand by poor handling, e.g. Glove powder or tree pollen, enter the reaction vessel.
  • both the amplification product and the internal control are detected at at least two different wavelengths.
  • a TaqMan probe 5 '-FAM-N x -TAMRA-3' and a control probe 5'-TET-N x -TAMRA-3 ' are marked for genotyping.
  • a passive dye such as the dye ROX, is often used to compute volume fluctuations. It can be seen that many measurement wavelengths of a real-time cycler are used very quickly.
  • there are many real-time cyclers on the market that only measure at one detection wavelength, usually at FAM / SybrGreen I (530 nm).
  • a melting curve of the reaction mixture is recorded (see eg Siraj AK, Clinical Cancer Research 8: 3832-3840 (2002)).
  • the analysis of the melting curve after the PCR is actually no real-time analysis, but is a post-PCR method, such as an agarose gel or hybridization analysis, since it comes to the superposition of the individual product formations during the amplification.
  • a variety of qualitative and quantitative PCR analyzers are available on the market, the most important of which are the ABI Prism 7000 series, the Roche Light Cycler, the BioRad iCycler and the Corbett Rotor genes.
  • the instruments can measure the fluorescence intensity only at one wavelength, which is usually the FAM / Sybr Green channel (530nm), or quantify in six channels. These devices thus allow the measurement of several labeled with different fluorescent dyes nucleic acids (eg amplification products of samples to be analyzed and internal controls).
  • J Clin Microbiol 37 (3) (1999): 724-8) relates to a method for the detection of JC polyomar virus (JCV), in which a non-competitive or a competitive internal control can be used.
  • the non-competitive internal control which is a ⁇ -lactamase construct from E. coli, is co-amplified for the detection reaction of JCV in a sample.
  • the amplification product of the internal control is not detected during the amplification itself, recording an amplification curve but in an end point detection.
  • the present invention relates to a method for the detection and / or quantitative determination of at least one nucleic acid fragment of a nucleic acid amplification comprising the steps: a) providing a sample optionally comprising at least a first nucleic acid, b) contacting the sample with a specific amount of a first for the c) adding a certain amount of at least one second nucleic acid as internal control and at least one second primer pair to the sample specific for the second nucleic acid, d) amplifying the mixture from c) over a number of nucleic acid amplification cycles, wherein at least an amplified nucleic acid fragment of the at least one first and / or the at least one second nucleic acid is labeled with one or more fluorescent dyes, e) recording an amplification curve by measuring the fluorescence intensities of the N nucleic acid amplification cycles at one wavelength and correlating the fluorescence intensities against the number of nucleic acid amplification cycles; f) determining a threshold cycle and
  • the method according to the invention can be used for any type of sample, if in this sample a nucleic acid is present, which can be amplified with the aid of a specific primer pair.
  • unknown samples can also be analyzed to determine if a particular nucleic acid is present in that sample.
  • the method according to the invention is suitable not only for the detection of a nucleic acid fragment but also for the quantitative determination of this fragment, for example on the basis of the threshold value cycle.
  • the sample which optionally comprises a first nucleic acid (in the case of unknown samples, the absence of such a nucleic acid is not excluded)
  • at least one second nucleic acid and primers specific for this second nucleic acid are added during the process.
  • This second nucleic acid serves as an internal control to determine if the nucleic acid amplification works in and of itself under the given reaction conditions, thus allowing false negative results to be excluded if amplification of a fragment of the internal control can be detected.
  • the fragments are labeled in the course of the amplification with a fluorophore. The measured fluo- _
  • Resence ideally increases to the same extent as the amount of amplification product in the reaction mixture.
  • the fluorescence values thus obtained can be correlated against the number of amplification cycles, resulting in an amplification curve.
  • the threshold cycle, the fluorescence maximum value and the efficiency of the nucleic acid amplification can be determined by methods known to the person skilled in the art. These parameters can be used to characterize the amplification and to determine the amount of the first nucleic acid present in the sample.
  • the amplification of the first nucleic acid can be determined, provided that both amplification reactions under the same conditions.
  • the threshold value of the amplification of the first and the second nucleic acid at least 10%, preferably at least 20%, in particular at least 30%, above or below the threshold value of the internal control amplification and / or if the fluorescence maximum value of the amplification of the first and the second nucleic acid at least 10%, preferably at least 20%, in particular at least 30%, above the fluorescence maximum value of the amplification of the internal control and / or if the efficiency of the amplification of the first and the second nucleic acid is at least 0.1 points, preferably at least 0.2 points, in particular At least 0.3 points above the efficiency of the internal control amplification, then at least one second nucleic acid fragment was amplified during the reaction.
  • the amount of internal control and corresponding primers is typically selected such that the threshold, the fluorescence peak, and / or the internal control amplification efficiency differ significantly from the values of first nucleic acid amplification.
  • the primer concentration of a PCR which is able to amplify very small copy numbers of target sequences is diluted to half and one-quarter of the optimal concentration and the threshold value is determined in each case.
  • the optimum primer concentration can be considered as the amount where the amplification of less than 5 copies is possible, and the threshold cycle at that copy number is at least 5 cycles prior to the appearance of primer dimers or other by-products. The reduction of the primer concentration leads to dramatic efficiency reduction. Thereafter, the concentration of the second nucleic acid is reduced to reach the desired threshold.
  • the amplification curve of an internal control and thus also the parameters derived therefrom change by the amplification of another nucleic acid in such a way that even a slight deviation thereof can be concluded from the amplification of a further nucleic acid fragment.
  • the amplification curve of the internal control can be determined by the sole amplification of the same.
  • provision of a sample refers to all methods which are known to the person skilled in the art, to isolate and, if appropriate, to prepare samples which comprise or potentially comprise a nucleic acid or a nucleic acid fragment to be determined. Extraction from a sample, accumulation of microorganisms to be determined from a sample, etc.
  • the samples can be used directly in a method according to the invention (eg Sambrook, J., and Russell, DW, (2001) Molecular Cloning, ColD Spring Harbor, New York).
  • a “specific primer pair” for a nucleic acid is a primer pair (comprising at least one forward primer and at least one reverse primer) which is capable of "specific” binding to said nucleic acid molecule under nucleic acid amplification conditions (eg PCR conditions) and thus defining the size of the nucleic acid fragment to be amplified.
  • nucleic acid amplification conditions eg PCR conditions
  • Specific binding may be achieved when the primers of the primer pair with the nucleic acid have an identity (ie, match the nucleic acid sequence of the forward primer and the reverse complement nucleic acid sequence of the reverse primer with the nucleic acid to be amplified upon superposition of the nucleic acid with the primers in which individual nucleotides of the primers (eg 20%) can be replaced by universal bases, such as eg inosine) of at least 70%, preferably of at least 80%, in particular of at least 90%.
  • identity ie, match the nucleic acid sequence of the forward primer and the reverse complement nucleic acid sequence of the reverse primer with the nucleic acid to be amplified upon superposition of the nucleic acid with the primers in which individual nucleotides of the primers (eg 20%) can be replaced by universal bases, such as eg inosine) of at least 70%, preferably of at least 80%, in particular of at least 90%.
  • the "fluorescence maximum value” is the highest fluorescence value above the threshold value, which is measured in the course of a nucleic acid amplification at one wavelength Since a plateau generally forms in the course of an amplification reaction after the exponential phase, an average value of the fluorescence values can also be determined
  • the value set, which is output by a device independently of the type of excitation in a channel is defined by “monochrome” or "at one wavelength”.
  • Roche's Light Cycler similar to the Idaho cycler
  • measure monochrome is thus meant the evaluation of the data of a single channel (i.e., a single wavelength), for example FAM, taking into account possible correction tables which improve the measurement in the respective channel.
  • the "threshold cycle” (C ⁇ , "threshold cycle”) expresses the number of cycles at which, for the first time, a significant increase in fluorescence is detected over background noise and can be used to quantitate nucleic acid amplification.
  • C ⁇ The “threshold cycle” expresses the number of cycles at which, for the first time, a significant increase in fluorescence is detected over background noise and can be used to quantitate nucleic acid amplification.
  • the quantification of the DNA amount is not based on absolute amounts of nucleic acid amplification product, but on the kinetics of the amplification reaction.
  • the C ⁇ value is taken as the amplification is exponential at this point in time and there are no limiting factors in this phase of the amplification reaction, such as primer or nucleotide deficiency, decreasing polymerase enzyme activity or inhibition of the reaction by the reaction Occurrence of certain products, gives.
  • known template amounts can be amplified in each amplification run, so that one can compare which template amount is obtained at which C ⁇ value. From this, a standard amplification curve can be created, on the basis of which - - From a certain C ⁇ value can be concluded on a Nukleinkladrzent- tion in the sample.
  • the purine-pyrimidine ratio of the individual bases of the primers, the degree of homology or identity of the primers to the target sequence, the annealing temperature, the length of the primers and the nucleic acid fragment to be amplified are important determinants of functionality a nucleic acid amplification.
  • E nucleic acid amplification Efficiency
  • the efficiency as well as the threshold cycle of a nucleic acid amplification are by changing certain parameters, such as primer concentration, DNA amount, primer length, change of one or more bases at the 3 'end of a primer (without losing the specificity of the primer), length of the ampli - fiz ists., two-stage PCR with primer for isothermal PCR, controllable (see, eg, Kubista M et al (2001) Genomics and Proteomics Technologies.) Proceedings of SPIE, Vol. 4264, pp. 53- - - -
  • labeling is the process in which a nucleic acid prepared, for example, by a nucleic acid amplification, directly (eg with an intercalating dye such as Sybr Green) or indirectly (eg via a nucleic acid probe containing a fluorescent dye labeled) is provided with a dye, preferably a fluorescent dye.
  • label refers to the process of binding a dye, preferably a fluorescent dye, to a probe, in particular to a nucleic acid probe which binds specifically to a further nucleic acid in order to finally "indirectly” label it.
  • the dye provided with the probe is called a "label”. Therefore, according to the present invention, “labeling” refers to all those processes in which an (amplified) nucleic acid is provided with a dye or with a (specific) "label”.
  • a further aspect of the present invention relates to a method for detecting an inhibition of a nucleic acid amplification of at least one nucleic acid fragment comprising the steps a) to g) as cited above, wherein the inhibition of the nucleic acid amplification is detected when the fluorescence maximum value of the amplification of the mixture from c) at least 10% below the maximum fluorescence value of an amplification of the second nucleic acid fragment with the primer pair specific for the second nucleic acid and / or the efficiency of amplification of the mixture of c) at least 0.1 points below the efficiency of amplification of the second nucleic acid fragment with that for the second nucleic acid specific primer pair.
  • the amplification curve from step e) can essentially (with respect to efficiency, threshold cycle and / or fluorescence maximum value) coincide with the amplification curve of the second nucleic acid, whereby no amplification of the nucleic acid fragment of the first nucleic acid is detected, which could indicate that no first sample is present in the sample Nucleic acid and in the sample and in the reaction mixture c) no inhibitors - -
  • the anaplication curve from step e) can essentially correspond to the amplification curve of the first nucleic acid, which likewise means that no inhibitors can be present in the reaction vessel. If it is not possible to take up an amplification curve, the reaction is essentially inhibited to 100%, but using the amplification curve (eg reduced maximum fluorescence value, shifted threshold cycle, reduced efficiency in comparison to a non-inhibited amplification curve), for example, a 50% Inhibition can be detected.
  • the amplification curve eg reduced maximum fluorescence value, shifted threshold cycle, reduced efficiency in comparison to a non-inhibited amplification curve
  • At least one melting temperature of the at least one nucleic acid fragment is determined by taking a melting curve after nucleic acid amplification.
  • the reaction mixture may be subjected to a melting curve analysis after amplification.
  • the fluorescent label is reversible by increasing the temperature above the melting point of the double-stranded DNA fragments (eg, using DNA intercalating substances)
  • the change in fluorescence versus temperature is correlated.
  • the amplified nucleic acid fragments by comparison with known melting curves (that of the amplified nucleic acid fragment of the first nucleic acid with that amplified nucleic acid fragment of the second nucleic acid) and, for example, determine whether both reactions have occurred around primer dimers or other non-specific products.
  • the amplified nucleic acid fragments have preferably a melting temperature which is substantially at least 1 ° C, preferably at least 2 0 C more preferably at least 4 0 C, in particular at least 6 ° C, differ.
  • the nucleic acid is preferably DNA and / or RNA, in particular mRNA. According to the invention, all known types of nucleic acids can be used.
  • the nucleic acid amplification technique is a polymerase chain reaction (PCR) technique, selected from the group consisting of real-time PCR, nested PCR, inverse _
  • PCR polymerase chain reaction
  • PCR reverse transcriptase PCR
  • RT-PCR reverse transcriptase PCR
  • the process of the invention can be used in a variety of polymerase chain reaction techniques. However, it is a prerequisite that fluorescence can be measured essentially at each cycle and that an amplification curve can be derived therefrom.
  • real-time polymerase chain reaction real time PCR
  • Real-time PCR also combines DNA amplification with the detection of products in a reaction vessel. Such an amplification of a nucleic acid drastically reduces the risk of contamination because the reaction vessel no longer has to be opened after the chain reaction.
  • the PCR is carried out as asymmetric PCR.
  • one of the primers used in the PCR is added in excess. Under these reaction conditions, there is a selective amplification of a strand. If the forward primer is in excess, the strand rather than the opposite strand is amplified.
  • This approach is particularly advantageous if the PCR product after amplification is to be used for hybridizations (e.g., hybridization to a solid phase). The presence of single strands eliminates the need for denaturing the PCR product prior to hybridization.
  • the real-time PCR is preferably selected from the group consisting of TaqMan PCR, Sybr Green PCR, molecular Beakon PCR, Light Up PCR, HybProbe PCR and combinations thereof.
  • various real-time PCR techniques can be used, with real-time PCR with TaqMan, LightUp, HybProbe and molecular beacon probes and Sybr Green being preferred.
  • the combination of the various PCR techniques for example Sybr Green labeling with TaqMan labeling makes it possible to increase the number of amplified nucleic acid fragments to be detected or quantified in a sample.
  • the at least one amplified nucleic acid fragment is mixed with a nucleic acid-intercalating sub- punch, eg Sybr Green 1 or ethidium bromide, with at least one dye-labeled nucleic acid probe, eg with a TaqMan probe or with a molecular beacon ("molecular beacon").
  • a nucleic acid-intercalating sub- punch eg Sybr Green 1 or ethidium bromide
  • at least one dye-labeled nucleic acid probe eg with a TaqMan probe or with a molecular beacon ("molecular beacon").
  • the detection methods in nucleic acid amplification techniques are either specific, ie primer dimers or unspecific products are not detected, or nonspecific, any double-stranded DNA is detected (selective detection).
  • selective detection For the selective detection of nucleic acids, in particular of double-stranded DNA, predominantly interfering dyes are used in molecular biology which are able to be incorporated into the nucleic acids.
  • Such dyes are, for example, ethidium bromide and the less toxic Sybr Green (see, for example, Wittwer CT et al., (1997) Biotechniques 22: 176-81; Ponchel F et al. (2003) BMC Biotechnology 3:18) or else thiazole orange (TO ), Oxazole yellow (YO).
  • Sybr Green ethidium bromide and the less toxic Sybr Green
  • TO thiazole orange
  • Oxazole yellow YO
  • These dyes, especially Sybr Green are used not only for nucleic acid staining in gels, such as agarose gels, but also in the context of nucleic acid amplification techniques, such as real-time PCR.
  • the emission of fluorescent light when these dyes are intercalated in double-stranded DNA, allows real-time PCR to detect the formation of amplification products directly after their generation by means of a fluorometer.
  • the intensity of the fluorescence signal is proportional to the amount of double-stranded DNA in the sample. Since this method of detecting DNA is selective and non-specific (ie, DNA can not be specifically detected due to its nucleic acid sequence), it is possible to further characterize the product after the end of the PCR amplification by means of melting curves, and non-specific amplification products, which are described in US Pat usually having a melting point other than the main product.
  • intercalating dyes are very well suited to follow the amplification of nucleic acid fragments directly, although it should be noted that the melting points can vary by +/- I 0 C depending on the analysis run.
  • Intercalating dyes in particular Sybr Green 1, are used for single-plex reactions, but when coupled with a melting point analysis, it can also be used in multi- plex reactions can be used (see eg Siraj AK, Clinical Cancer Research 8: 3832-3840 (2002)).
  • sequence-specific probes are used. These can be on the one hand TaqMan probes, light-up probes, hybridization probes or molecular beakons.
  • TaqMan probes (see eg Heid CA et al. (1996) Genome Res. 6: 986-94), for example, are characterized in that the probe which specifically binds to the amplification product is reacted with a reporter dye (fluorophore) and a quencher on the probe 5'- and 3 'end is provided.
  • a reporter dye fluorophore
  • the detection of amplification products by means of hybridization probes is also based on the FRET ("fluorescence resonance energy transfer") principle.
  • a first probe is labeled with a donor fluorochrome (e.g., fluorescein) at the 3 'end and a second probe with an acceptor dye (e.g., Cy5, LC Red 640) at the 5' end.
  • Both probes are selected to hybridize to the amplicon such that the modified ends of the probes on the amplicon are separated by a single base on the same DNA strand.
  • the energy delivered by the donor excites the acceptor dye of the second probe, the latter eventually emitting fluorescence at a longer wavelength.
  • the ratio between donor fluorescence and acceptor fluorescence increases in the course of a nucleic acid amplification and is proportional to the amplified amount of DNA.
  • molecular beacons can be used for the specific detection of amplification products (see, for example, Abravaya K et al. (2003) Clin Chem Lab Med. 41: 468-74).
  • Molecular beacons are hybridization probes that have a stem and a loop and are modified with a fluorescent dye at one end and a quencher at the other end.
  • the loop portion of the probe is complementary to the template and the two end portions are complementary to one another, forming a hairpin-like structure. If the probe is not _
  • the fluorophore and quencher When hybridized to the template, the fluorophore and quencher are in the immediate vicinity, whereby the fluorescence is essentially completely suppressed. Once the probe hybridizes to the template under optimized conditions, the fluorescence-suppressing effect of the quencher is removed. Due to the high thermostability of the formed hairpin structure, molecular beakons have high hybridization specificity, thereby further allowing for differences in nucleotide sequence to one nucleotide (suitability for mutation analysis and detection of single nucleotide polymorphisms ("single nucleotide polymorphism ", SNP)).
  • HybProbe probes are also useful in the practice of the present invention (See, for example, Härder TC et al., J. Clin. Microbiol. (2001) 39: 4413-4419). Furthermore, light-up probes are also suitable in the method according to the invention, as described for example in Kubista M et al. (Genomics and Proteomics Technologies, Proceedings of SPIE (2001), Vol. 4264, pp. 53-58), Svanvik N et al. (Anal Biochem (2000) 287: 179-182) and Isacsson J et al. (Mol Cell Probes (2000) 14: 321-328).
  • the polymerase chain reaction technique is a 2-stage polymerase chain reaction technique.
  • a 2-stage polymerase chain reaction technique is characterized by the annealing and elongation temperatures being identical. Therefore, such PCR techniques require only two temperature levels for the amplification of a nucleic refragments to catalyze (a denaturation temperature, for example 94 0 C and an annealing / elongation temperature).
  • a denaturation temperature for example 94 0 C and an annealing / elongation temperature.
  • a prerequisite for carrying out a 2-stage PCR is that the polymerase used has sufficient amplification efficiency at the annealing temperature.
  • sequence-specific probes are, for example, TaqMan probes which are preferably 6-carboxyfluorescein, tetrachloro- ⁇ -carboxy-fluorescein, 2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluorescein or hexachloro-6-carboxy- Fluorescein as a dye and 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine may have as a quencher.
  • the amplification of the second nucleic acid refragments have a lower efficiency than the amplification of the first nucleic acid fragment.
  • the efficiency of nucleic acid amplification has a direct impact on the threshold cycle: the lower the efficiency, the larger the threshold cycle.
  • the amplification of the second nucleic acid has a lower efficiency.
  • the amplification of the second nucleic acid fragment preferably has an efficiency of not more than 1.8, preferably not more than 1.4, more preferably not more than 1.3, in particular not more than 1.1.
  • the amplification of the second nucleic acid fragment preferably has a threshold cycle of at least 30, particularly preferably of at least 40, in particular of at least 50.
  • the curves differ at least in one feature.
  • These features include above all the threshold cycle mentioned above, the maximum fluorescence value and the efficiency.
  • the distinction of the curves based on the threshold value cycle has proven particularly suitable.
  • the threshold cycle is dependent on several factors, such as primer concentration (see, for example, Kubista M et al., (2001) Genomics and Proteomics Technologies, Proceedings of SPIE, Vol. 4264, pp. 53-58), with a low primer concentration to one higher threshold cycle leads than a high concentration.
  • nucleic acid amplification is usually optimized for a threshold cycle of about 25 to 45, a higher threshold cycle of, for example, 45 would be particularly well suited to determining if the amplification of the first nucleic acid amplification functioned or did not work. If, for example, the amplification curve of a sample had a threshold cycle which corresponds to that of the amplification of the second nucleic acid, this indicates that possibly no first nucleic acid was present in the sample. Furthermore, the threshold cycle can also be used to determine the concentration of the first nucleic acid in the sample. - -
  • the amount of the first pair of primers in the mixture c) is 0.05 to 2 ⁇ M, preferably 0.075 to 1.5 ⁇ M, in particular 0.1 to 1 ⁇ M.
  • the amount of the second primer pair is, according to a preferred embodiment, less than 90%, preferably less than 70%, more preferably less than 50%, in particular less than 30%, 20%, 15%, 10% or 7.5% of the amount of the first Primer pair.
  • the amount of primer used in a nucleic acid amplification affects the efficiency of an amplification reaction, reducing the efficiency of the reaction in both too low and too high amounts of primer.
  • a standard series can be amplified with different concentrations of primers, wherein for each primer concentration the efficiency of the nucleic acid amplification is e.g. determined by an amplification curve. It has been found that, above all, a smaller amount of the primer pair, which is specific for the second nucleic acid (as an internal control), leads to a surprisingly good result compared to the primer pair specific for the first nucleic acid.
  • the amount of second nucleic acid used can be very small.
  • Vorzusgweise is the amount of at least one second nucleic acid between 10 and 10 6 molecules, preferably between 100 and 100,000 molecules, in particular between 1000 and 10,000 molecules. Because of the small amount of template, amplification takes more cycles to reach the threshold of fluorescence and enter the exponential phase of amplification.
  • any nucleic acid can be used as an internal control, provided that correspondingly specific primers for the amplification of a fragment thereof are used.
  • - - are or can be determined.
  • the forward primer has the nucleic acid sequence 5'-ACCAAGAAATAAAAATGCGCTTCCCAAf-T-S '.
  • the reverse primer has the nucleic acid sequence 5'-CAGCTGCTGTAATCACCCAGTCGATAAATG-3 '.
  • any sample comprising a nucleic acid selected from the group consisting of viruses, animal and plant organisms, bacteria, preferably mycobacteria, in particular Mycobacterium paratuberculosis, Listeria, Salmonella, Campylobacter, and combinations thereof can be investigated.
  • a nucleic acid selected from the group consisting of viruses, animal and plant organisms, bacteria, preferably mycobacteria, in particular Mycobacterium paratuberculosis, Listeria, Salmonella, Campylobacter, and combinations thereof can be investigated.
  • the sample comprises at least a first nucleic acid from Mycobacterium paratuberculosis which is amplified with a forward primer having the nucleic acid sequence 5'-CCGC-TAATTGAGAGATGCGATTGG-3 'and with a reverse primer having the nucleic acid sequence 5'-GTGCCACAACCACCTCCGTAACCG-3'.
  • the mixture subjected to nucleic acid amplification from step c) or the optionally amplified nucleic acid fragments from step d) is detected by a hybridization method.
  • an amplified nucleic acid fragment according to the invention can also be provided by hybridization methods.
  • an amplified fragment is synthesized via the sequence-specific addition of complementary, labeled (for example nonradioactive (see, for example, Kessler C. (ed.) Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules, Springer Verlag Heidelberg (1992) or radioactive) nucleic acid probes respectively.
  • complementary, labeled for example nonradioactive (see, for example, Kessler C. (ed.) Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules, Springer Verlag Heidelberg (1992) or radioactive
  • the nucleic acids to be analyzed are preferably immobilized on a solid support and brought into contact under stringent conditions with the corresponding probes.
  • FIG. 1 shows a plot of a real-time PCR analysis of M. paratuberculosis (positive control, AOI) and several internal controls (Chlamydia DNA: BOI, COI, DOI, EOI, FOI, GOI), the fluorescence values (FAM -490) were correlated against the number of PCR cycles.
  • Fig. 2 shows a melting curve for determining whether the amplified product corresponds to the product to be amplified, wherein the fluorescence values (FAM-490) were plotted against the temperature.
  • ferromagnetic beads (ChemiCell, SIMAG-MP / TCL) suspension are deposited on the magnet (MagnetOn 4T, Aureon Biosystems, # M010104), resuspended in ImI MES, the supernatant removed from the magnet and incubated with 25mg carbodiimide (Sigma, # E7750 ) in 1 ml of MES buffer for 15 minutes on rotamix (RMl at 15 rpm). The beads are washed with ImI MOPS buffer and spiked for 2 hours at RMI with 900 ⁇ l of antibody in MOPS buffer (QED Bioscience, 18101-18104).
  • StabilZyme AP Sudmodics, SAOl-100
  • the beads are washed 2x with ImI TPBS and Ix with 1 ml of StabilZyme.
  • the beads are taken up in 20 ml of StabilZyme (final concentration of 10 mg beads / ml) and stored in the refrigerator.
  • sperm DNA was added to the samples.
  • the subsequent melting curve gave a melting temperature - - of 79 0 C for the product of Internal Control and 8 ⁇ ° C for the product of M. paratuberculosis PCR.
  • 2 ml of raw milk is mixed with 20 ⁇ l of the bead suspension and incubated for 120 minutes while rotating the tubes. Thereafter, the beads are deposited on the magnet and washed 4 times with CT wash solution by respective deposition on the magnet.
  • the bead-bacterium complex is distilled in 20 ⁇ l. Water resuspended, 20 min. heated to 95 ° C, then the beads deposited on the magnet and transfer the supernatant into a fresh tube.
  • Hybridization test A: Preparation of the solid phase Streptavidin from Boehringer Mannheim is diluted to a concentration of 2 ⁇ g / ml in PBS and the wells of white MoxiSorp microplates (Nunc, species N ° 437-591) are incubated at 4 ° C. overnight coated with 100 ⁇ L. The plate is tapped, washed with TPBS and bound with lOO ⁇ L / well of a solution of 3 pmol / 100 ⁇ L biotinylated capture oligonucleotide (Biotin-TCATTGTCCAGATCA for M. paratuberculosis and biotin-AGCATACTTTGATGCAT for internal control) in TPBS, washed, dried and sealed ,
  • TPBS and 5 ⁇ l of amplicon are incubated for 15 minutes at room temperature and rotated at 500 rpm, washed 4 times with TPBS, incubated for 15 minutes with 50 ⁇ l anti-FAM-HRP at 500 rpm, washed 4 times with TPBS, 15 min with KPL TMB in the dark incubated at room temperature and stopped with 50 ⁇ L 1 NH 2 SO 4 .
  • a highly sensitive and highly specific PCR for the detection of M. paratuberculosis DNA has been developed and shown that even after 80 cycles no primer dimers occur. The specificity was further increased with these primers in a touch-down PCR.
  • an internal control was included, which is reduced in efficiency by low concentration of the primer and thus reached only at high number of cycles, the threshold and the product itself the efficiency and optionally the signal level on negative samples indicates that the amplification was not inhibited.
  • the concentration of the dye can be varied or increased during measurements with SybrGreen I.
  • This concept of efficiency modification by different primer concentrations and monochrome detection is also particularly well suited for gene analysis, because, for example, point mutations such as factor V Leiden in the heterozygous case wild type and mutation type are present in the same amount on the genome, thus the target concentration is the same, and can be distinguished by the efficiency.
  • more than two amplicons can also be determined if the primer concentrations are adjusted properly.
  • the threshold cycle shifts by about 3 cycles when the primer is diluted to one-half and by about 10 cycles when diluted to one-quarter.
  • the concentration of Sybr Green I should be adapted to this, because as far as enough dye is available, the products can also be distinguished by the signal height.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion einer Nukleinsäureamplifikation mindestens eines Nukleinsäurefragments unter Verwendung einer internen Kontrolle, wobei die Detektion des amplif izierten Fragments bei einer Wellenlänge erfolgt.

Description

Verfahren zur Detektion von Nukleinsäurefraqmenten
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur internen Kontrolle von Nukleinsäureamplifikationen.
Die interne Kontrolle einer Nukleinsäureamplifikation, insbesondere einer Polymerasekettenreaktion (PCR) beziehungsweise Echtzeit-PCR, stellt eine störungsfreie PCR-Amplifikation sicher. Interne Kontrollen werden zum Aufzeigen etwaiger PCR-Inhi- bitionen eingesetzt, dienen dazu den erfolgreichen Ablauf der Amplifikation aufzuzeigen und falsch negative Ergebnisse z.B. aufgrund von Inhibitoren zu vermeiden. Derartige Inhibitoren können einerseits durch mangelhafte Aufreinigung der Probe, zum Beispiel Restbestand Ethanol, Proteinrestpartikel, andererseits durch mangelhafte Handhabung, z.B. Handschuhpuder oder Baum- Pollen, in das Reaktionsgefäß gelangen.
In der Echtzeit-PC beispielsweis wird sowohl das Amplifika- tionsprodukt als auch die interne Kontrolle bei zumindest zwei verschiedenen Wellenlängen detektiert. Für Gentypisierung wird dabei z.B. eine TaqMan Sonde 5 '-FAM-Nx-TAMRA-3 ' und eine Kontrollsonde 5'-TET-Nx-TAMRA-3' markiert. Zusätzlich dient oft auch noch zum rechnerischen Ausgleich von Volumsschwankungen ein passiver Farbstoff, wie z.B. der Farbstoff ROX. Daraus ist ersichtlich, dass sehr schnell viele Mess-Wellenlängen eines Real- Time Cyclers genutzt werden. Zudem sind viele Real-Time Cycler am Markt, die überhaupt nur bei einer Detektions-Wellenlänge messen, zumeist bei FAM/SybrGreen I (530 nm) . Um die amplifi- zierten Nukleinsäurefragmente, die mit SybrGreen I detektiert werden, näher zu charakterisieren, wird eine Schmelzkurve des Reaktionsansatzes aufgenommen (siehe z.B. Siraj AK, Clinical Cancer Research 8:3832-3840 (2002)). Die Analyse der Schmelzkurve nach der PCR stellt dabei eigentlich keine Real-Time Analyse dar, sondern ist eine Post-PCR-Methode, wie eine Agarose-Gel- oder Hybridisierungsanalyse, da es zur Überlagerung der einzelnen Produktbildungen während der Amplifikation kommt.
Am Markt ist eine Vielzahl von Analysegeräten für qualitative und quantitative PCR erhältlich, von denen die wichtigsten die ABI Prism 7000er Serie, der Light Cycler von Roche, der iCy- cler von BioRad und der Corbett Rotor-Gene sind. Die Instrumente können die Fluoreszenzintensität je nach Ausstattung entweder nur bei einer Wellenlänge messen, dies ist meist der FAM/Sybr- Green-Kanal (530nm) , oder auch in sechs Kanälen quantifizieren. Diese Geräte erlauben somit die Messung mehrerer mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markierter Nukleinsäuren (z.B. Am- plifikationsprodukten von zu analysierenden Proben und internen Kontrollen) . Um die hohen Anschaffungskosten solcher Geräte und um die hohen Kosten der Reagentien, die bei einem Verfahren, welches auf einem derartigen Gerät durchgeführt wird (verschiedene Fluorophore) , zu reduzieren, wäre ein alternatives und kostengünstigeres Verfahren wünschenswert, welches erlaubt eine Probe gemeinsam mit einer internen Kontrolle mit Hilfe einer Nu- kleinsäureamplifikationstechnik zu analysieren, bei der nur ein Fluorophor eingesetzt wird. Dadurch wäre es möglich Geräte einzusetzen, die in der Lage sind nur bei einer Emissionswellenlänge zu messen.
In Rosenstraus et al. (J Clin Microbiol. 36(1) (1998): 191- 7) wird die Verwendung von internen Kontrollen bei PCR-Verfahren geoffenbart. Dabei werden die amplifizierten Nukleinsäuremolekü- Ie der internen Kontrolle mittels Target-spezifischen Oligonu- kleotiden an magnetische Mikropartikel gebunden und mittels „avidin-horseradish peroxidase^ detektiert, wobei das Target und die interne Kontrolle in zwei getrennten Isolier- und Detek- tionsschritten, d.h. mit einer Target- und einer internen Kontroll-spezifischen an den Partikeln gebundenen Oligonukleotiden, bestimmt wurden. Somit werden im Zuge dieses Verfahrens, die am- plifizierten Produkte nach Abschluss der Amplifikationsreaktion markiert und detektiert.
Die Publikation von Garcia de Viedma D. et al . (J Clin Microbiol 37(3) (1999) :724-8) betrifft ein Verfahren zur Detektion von JC-Polyomarvirus (JCV) , bei dem eine nicht-kompetitive bzw. eine kompetitive interne Kontrolle eingesetzt werden kann. Die nicht-kompetitive interne Kontrolle, die ein ß-Laktamase-Kon- strukt aus E. coli darstellt, wird zur Detektionsreaktion von JCV in einer Probe ko-amplifiziert . Das Amplifikationsprodukt der internen Kontrolle wird nicht während der Amplifikation selbst unter Aufnahme einer Amplifikationskurve sondern in einer End- punkt-Detektion detektiert.
In Englund S. et al. (Vet Microbiol. 81(3) (2001): 257-71) wird die Detektion von Mycobakterium avium subspec. paratubercu- losis in einer Gewebeprobe mittels einer nested PCR beschrieben, wobei die Insertionssequenz IS900 von Mycobakterium paratubercu- losis amplifiziert wird.
Kehle J. et al . (45. Arbeitstagung Deutsche Veterinärmedi¬ zinische Gesellschaft 28. September bis 1. Oktober 2004) beschreiben ein Verfahren zum automatischen Nachweis von Mycobacterium paratuberculosis in Tankmilch.
Somit ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine interne Kontrolle zur Verwendung in Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäurefragmenten zur Verfügung zu stellen, die es ermöglicht einfach und schnell die Amplifikation eines Nukle- insäurefragments aus einer Probe festzustellen.
Ferner ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit welchem es ermöglicht wird Inhibitionseffekte im Zuge einer Nukleinsäuream- plifikation zu detektieren.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Detektion und/oder quantitativen Bestimmung mindestens eines Nu- kleinsäurefragments einer Nukleinsäureamplifikation umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer Probe gegebenenfalls umfassend mindestens eine erste Nukleinsäure, b) Inkontaktbringen der Probe mit einer bestimmten Menge eines ersten für die erste Nukleinsäure spezifischen Primerpaars, c) Zugeben einer bestimmten Menge mindestens einer zweiten Nukleinsäure als interne Kontrolle und mindestens eines zweiten für die zweite Nukleinsäure spezifischen Primerpaars zur Probe, d) Amplifizieren des Gemisches aus c) über eine Anzahl von Nukleinsäureamplifikations-Zyklen, bei der mindestens ein ampli- fiziertes Nukleinsäurefragment der mindestens einen ersten und/oder der mindestens einen zweiten Nukleinsäure mit einem oder mehreren fluoreszierenden Farbstoffen markiert wird, e) Aufnehmen einer Amplifikationskurve durch Messen der Fluoreszenzintensitäten der Nukleinsäureamplifikations-Zyklen bei einer Wellenlänge und Korrelieren der Fluoreszenzintensitäten gegen die Anzahl der Nukleinsäureamplifikations-Zyklen f) Bestimmen eines Schwellenwertzyklus und/oder eines Fluoreszenzmaximalwertes der Amplifikationkurve und/oder einer Effizienz der Amplifikation, g) Vergleichen des Schwellenwertzyklus und/oder des Fluoreszenzmaximalwertes und/oder der Effizienz aus f) mit dem Schwellenwertzyklus und/oder dem Fluoreszenzmaximalwert und/oder der Effizienz einer Amplifikation mit der bestimmten Menge des zweiten Nukleinsäurefragments mit dem für die zweite Nukleinsäure spezifischen Primerpaar, wobei die Nukleinsäureamplifikation des mindestens einen Nukleinsäurefragments der ersten Nukleinsäure der Probe detektiert wird, wenn der Schwellenwertzyklus der Amplifikation des Gemisches aus c) mindestens 10% über oder unter dem Schwellenwertzyklus der Amplifikation des zweiten Nukleinsäurefragments mit dem für die zweite Nukleinsäure spezifischen Primerpaar ist und/oder der Fluoreszenzmaximalwert der Amplifikation des Gemisches aus c) mindestens 10% über dem Fluoreszenzmaximalwert der Amplifikation des zweiten Nukleinsäurefragments mit dem für die zweite Nukleinsäure spezifischen Primerpaar ist und/oder die Effizienz der Amplifikation des Gemisches aus c) mindestens 0,1 Punkte über der Effizienz der Amplifikation des zweiten Nukleinsäurefragments mit dem für die zweite Nukleinsäure spezifischen Primerpaar ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann für jegliche Art von Probe verwendet werden, sofern in dieser Probe eine Nukleinsäure vorhanden ist, die mit Hilfe eines spezifischen Primerpaars am- plifiziert werden kann. Selbstverständlich können auch unbekannte Proben analysiert werden, um festzustellen, ob eine bestimmte Nukleinsäure in dieser Probe vorhanden ist. Ferner eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur zur Detektion eines Nukleinsäurefragments sondern auch zur quantitativen Bestimmung dieses Fragments beispielsweise anhand des Schwellenwertzyklus.
Zur Probe, welche gegebenenfalls eine erste Nukleinsäure um- fasst (bei unbekannten Proben ist die Abwesenheit einer derartigen Nukleinsäure nicht ausgeschlossen) , wird im Zuge des Verfahrens mindestens eine zweite Nukleinsäure und für diese zweite Nukleinsäure spezifische Primer dazugegeben. Diese zweite Nukleinsäure dient als interne Kontrolle, um festzstellen, ob die Nukleinsäureamplifikation unter den gegebenen Reaktionsbedingungen an und für sich funktioniert, womit falsch negative Ergebnisse ausgeschlossen werden können, wenn die Amplifikation eines Fragments der internen Kontrolle festgestellt werden kann. Um die amplifizierten Nukleinsäurefragmente z.B. mit Hilfe eines Fluorometers zu detektieren, werden die Fragmente im Zuge der Amplifikation mit einem Fluorophor markiert. Die gemessene Fluo- _
reszenz nimmt dabei idealerweise im selben Ausmass zu wie die Menge an Amplifikationsprodukt in der Reaktionsmischung. Die dadurch erhaltenen Fluoreszenzwerte können gegen die Anzahl der Amplifikationszyklen korreliert werden, wodurch sich eine Ampli- fikationskurve ergibt. Mit Hilfe einer Amplifikationskurve kann der Schwellenwertzyklus, der Fluoreszenzmaximalwert und die Effizienz der Nukleinsäureamplifikation nach dem Fachmann bekannten Verfahren bestimmt werden. Diese Parameter können zur Charakterisierung der Amplifikation und zur Bestimmung der Menge an vorhandener erster Nukleinsäure in der Probe herangezogen werden. Durch Vergleich der Amplifikationskurve und den daraus ermittelten Parametern einer Amplifikation einer ersten (aus der Probe stammenden) und einer zweiten (interne Kontrolle) Nukleinsäure mit einer Amplifikationskurve einer Amplifikation der zweiten Nukleinsäure kann die Amplifikation der ersten Nukleinsäure festgestellt werden, sofern beide Amplifikationsre- aktionen unter denselben Bedingungen durchgeführt wurden. Denn wenn der Schwellenwert der Amplifikation der ersten und der zweiten Nukleinsäure mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, insbesondere mindestens 30%, über oder unter dem Schwellenwert der Amplifikation der internen Kontrolle und/oder wenn der Fluoreszenzmaximalwert der Amplifikation der ersten und der zweiten Nukleinsäure mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, insbesondere mindestens 30%, über dem Fluoreszenzmaximalwert der Amplifikation der internen Kontrolle und/oder wenn die Effizienz der Amplifikation der ersten und der zweiten Nukleinsäure mindestens 0,1 Punkte, vorzugsweise mindestens 0,2 Punkte, insbesondere mindestens 0,3 Punkte, über der Effizienz der Amplifikation der internen Kontrolle liegt, dann wurde mindestens ein zweites Nukleinsäurefragment während der Reaktion amplifiziert . Die Menge der internen Kontrolle und der entsprechenden Primer wird in der Regel so gewählt, dass sich der Schwellenwert, der Fluoreszenzmaximalwert und/oder die Effizienz der Amplifikation der internen Kontrolle signifikant von den Werten einer Amplifikation der ersten Nukleinsäure unterscheidet. Hierzu wird die Primerkonzentration einer PCR, welche imstande ist sehr kleine Kopienzahlen an Targetsequenzen zu am- plifizieren, auf die Hälfte und ein Viertel der optimalen Konzentration verdünnt und jeweils der Schwellenwert bestimmt. Als optimale Primerkonzentration kann jene Menge angesehen werden, bei der die Amplifizierung von weniger als 5 Kopien möglich ist, und der Schwellenwertzyklus bei dieser Kopienanzahl mindestens 5 Zyklen vor dem Erscheinen von Primerdimeren oder anderen Nebenprodukten liegt. Die Reduktion der Primerkonzentration führt zu dramatischer Effizienzreduktion. Danach wird die Konzentration der zweiten Nukleinsäure insofern reduziert, um den gewünschten Schwellwert zu erreichen. Erfindungsgemäß hat sich gezeigt, dass sich die Amplifikationkurve einer internen Kontrolle und somit auch die daraus ableitbaren Parameter durch die Amplifikation einer weiteren Nukleinsäure derart ändert, dass bereits eine geringe Abweichung derselben auf die Amplifikation eines weiteren Nukleinsäurefragments schließen lässt. Die Amplifikations- kurve der internen Kontrolle kann durch die alleinige Amplifikation derselbigen bestimmt werden.
„Bereitstellen einer Probe" bezieht sich erfindungsgemäß auf alle Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, Proben, die eine zu bestimmende Nukleinsäure oder ein zu bestimmendes Nukleinsäu- refragment umfassen oder potentiell umfassen, zu isolieren und gegebenenfalls aufzubereiten. Verfahren zur Isolierung sind beispielsweise DNA-Extraktion aus einer Probe, Anreicherung von zu bestimmenden Mikroorganismen aus einer Probe und dergleichen. Selbstverständlich können die Proben direkt in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden (z.B. Sambrook, J., and Russell, D.W., (2001) Molecular Cloning, CoId Spring Harbor, New York) .
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein für eine Nukleinsäure „spezifisches Primerpaar" ein Primerpaar (umfassend zumindest einen Vorwärtsprimer und zumindest einen Rückwarts- primer) , welches an dem genannten Nukleinsäuremolekül unter Nu- kleinsäureamplifikationsbedingungen (z.B. PCR-Bedingungen) „spezifisch" zu binden vermag und damit die Größe des zu amplifi- zierenden Nukleinsäurefragments definiert. Eine spezifische Bindung kann zustande kommen, wenn die Primer des Primerpaars mit der Nukleinsäure eine Identität (d.h. Übereinstimmung der Nukleinsäure-Sequenz des Vorwärtsprimers und der revers-komple- mentären Nukleinsäure-Sequenz des Rückwärtsprimers mit der zu amplifizierenden Nukleinsäure bei Überlagerung der Nukleinsäure mit den Primern, wobei einzelne Nukleotide der Primer (z.B. 20%) durch Universalbasen, wie z.B. Inosin, ersetzt werden können) von zumindest 70%, vorzugsweise von zumindest 80%, insbesondere _ _ von zumindest 90%, aufweist.
Der „Fluoreszenzmaximalwert" ist erfindungsgemäß der höchste über dem Schwellenwert liegende Fluoreszenzwert, der im Zuge einer Nukleinsäureamplifikation bei einer Wellenlänge gemessen wird. Da sich im Zuge einer Amplifikationsreaktion nach der ex- ponentiellen Phase in der Regel ein Plateau bildet, kann auch ein Mittelwert der Fluoreszenzwerte in diesem Plateau als Fluoreszenzmaximalwert definiert werden. Unter "monochrom" bzw. „bei einer Wellenlänge" messen wird erfindungsgemäß das Werteset, welches von einem Gerät unabhängig von der Art der Anregung in einem Kanal ausgegeben wird definiert. Z.B. hat der Light Cycler von Roche (ähnlich dem Idaho Cycler) eine einzige Anregungs-LED bei einer Wellenlänge und drei Messkanäle bei drei verschiedenen Wellenlängen, die als FAM, LC640 und LC705 bezeichnet werden. Unter „monochrom messen" wird somit die Auswertung der Daten eines einzigen Kanals (d.h. einer einzigen Wellenlänge), zum Beispiel FAM unter Einbezug möglicher Korrekturtabellen, welche die Messung in dem jeweiligen Kanal verbessern, verstanden.
Der „Schwellenwertzyklus" (Cτ, „threshold cycle") drückt die Zyklenzahl aus, bei der zum ersten Mal ein signifikanter Anstieg der Fluoreszenz über das Grundrauschen ermittelt wird und kann zur Quantifizierung einer Nukleinsäureamplifikation verwendet werden. Am Anfang einer Amplifikationsreaktion wird nur die Basis- oder Hintergrundfluoreszenz gemessen, da die Fluoreszenz aufgrund der geringen Templatekonzentration im Reaktionsgefäß während der ersten Amplifikations-Zyklen normalerweise nicht de- tektierbar ist. Die Quantifizierung der DNA-Menge beruht nicht auf absoluten Mengen an Nukleinsäureamplifikationsprodukt, sondern auf der Kinetik der Amplifikationsreaktion. Dafür nimmt man als Richtlinie den Cτ-Wert, da zu diesem Zeitpunkt die Amplifika- tion exponentiell ist und es in dieser Phase der Amplifikationsreaktion keine limitierenden Faktoren, wie Primer- oder Nukleo- tidmangel, nachlassende Enzymaktivität der Polymerase oder Inhibition der Reaktion durch das Auftreten bestimmter Produkte, gibt. Parallel dazu können in jedem Amplifikations-Lauf bekannte Templatemengen amplifiziert werden, sodass man vergleichen kann, welche Templatemenge man bei welchem Cτ-Wert erhält. Daraus lässt sich eine Standardamplifikationskurve erstellen, anhand derer - - man aus einem bestimmten Cτ-Wert auf eine Nukleinsäurekonzentra- tion in der Probe schließen kann.
Es ist in Fachkreisen hinreichend bekannt, dass das Purin- Pyrimidin-Verhältnis der einzelnen Basen der Primer, der Grad der Homologie bzw. Identität der Primer zur Zielsequenz, die Annealingtemperatur, die Länge der Primer und des zu amplifi- zierenden Nukleinsäurefragments wichtige Determinanten der Funktionalität einer Nukleinsäureamplifikation sind. All diese Faktoren haben Einfluss auf die „Effizienz" einer Nukleinsäureamplifiktaion, welche als Maß für eine optimale Nukleinsäureamplifikation herangezogen werden kann. Die Effizienz (E) kann zwischen 1,00, d.h. keine weitere Amplifikation neuer Nukleinsäureamplifikationsprodukte, und 2,00 liegen, was einer Verdoppelung der Nukleinsäureamplifikationsprodukte bedeutet. Es lässt sich z.B. in einer real-time PCR bestimmen, wobei diese Effizienz mit unterschiedlichen Methoden ermittelt werden kann (siehe u.a. Pfaffl, MW (2004) BlOspektrum 1/04:92-95; Ramakers, C. et al. (2003) Neurosci. Lett. 339: 62-66, Liu, W., and Saint, D.A. (2002) Biochem. Biophys. Res . Commun. 294: 347-353). Dabei wird häufig eine Standardamplifikationskurve erstellt, für welche eine Verdünnungsreihe (z.B. 1:1, 1:4, 1:16, 1:64, etc.) der eingesetzten zu amplifizierenden Nukleinsäure-Menge analysiert wird, um somit die Amplifikationsrate bei unterschiedlichen Nu- kleinsäure-Konzentrationen zu vergleichen. Die Effizienz E der Reaktion lässt sich dann aus der Steigung der Amplifikationskur- ve („slope") nach E=10"1/Slope berechnen. Eine optimale Effizienz ergibt sich, wenn die Anzahl der Nukleinsäureamplifikationsprodukte in jedem Zyklus verdoppelt wird. Tatsächlich beträgt die Effizienz einer Nukleinsäureamplifikation in der exponentiellen Phase unter optimierten Reaktionsbedingungen im Bereich von 1,7 bis 1,9, wobei es dennoch zu Schwankungen im Bereich von ca. 1,5 bis 2,0 und darüber kommen kann.
Die Effizienz wie auch der Schwellenwertzyklus einer Nukleinsäureamplifikation sind durch die Änderung bestimmter Parameter, wie z.B. Primerkonzentration, DNA-Menge, Primerlänge, Änderung einer oder mehrerer Basen am 3 ' -Ende eines Primers (ohne die Spezifität des Primers zu verlieren) , Länge des Ampli- fizierungsprodukts, Zwei-Stufen PCR mit Primer für isotherme PCR, steuerbar (siehe z.B. Kubista M et al. (2001) Genomics and Proteomics Technologies. Proceedings of SPIE, Vol. 4264, pp. 53- — —
58) .
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird als "Markieren" jener Vorgang bezeichnet, bei dem eine Nukleinsäure, die beispielsweise durch eine Nukleinsäureamplifikation hergestellt wurde, direkt (z.B. mit einem interkalierenden Farbstoff wie Sybr Green) oder indirekt (z.B. über eine Nukleinsäuresonde, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff gelabelt ist) mit einem Farbstoff, vorzugsweise einem Fluoreszenzfarbstoff, versehen wird. "Labein" bezieht sich hingegen erfindungsgemäß auf den Vorgang der Bindung eines Farbstoffs, vorzugsweise eines Fluoreszenzfarbstoffs, an eine Sonde, insbesondere an eine Nukleinsäure- Sonde, die spezifisch an eine weitere Nukleinsäure bindet, um diese schließlich "indirekt" zu "markieren". Die mit dem Farbstoff versehene Sonde wird als "Label" bezeichnet. Daher werden gemäß der vorliegenden Erfindung unter "Markieren" all jene Vorgänge bezeichnet, bei denen eine (amplifizierte) Nukleinsäure mit einem Farbstoff bzw. mit einem (spezifischen) "Label" versehen wird.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion einer Inhibition einer Nukleinsäuream- plifikation mindestens eines Nukleinsäurefragments umfassend die Schritte a) bis g) wie oben angeführt, wobei die Inhibition der Nukleinsäureamplifikation detektiert wird, wenn der Fluoreszenzmaximalwert der Amplifikation des Gemisches aus c) mindestens 10% unter dem Fluoreszenzmaximalwert einer Amplifikation des zweiten Nukleinsäurefragments mit dem für die zweite Nukleinsäure spezifischen Primerpaar ist und/oder die Effizienz der Ampli- fikation des Gemisches aus c) mindestens 0,1 Punkte unter der Effizienz einer Amplifikation des zweiten Nukleinsäurefragments mit dem für die zweite Nukleinsäure spezifischen Primerpaar ist.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es weiters möglich die Inhibition einer Nukleinsäureamplifikationsreaktion durch die Zugabe einer internen Kontrolle zu bestimmen. Dabei kann die Amplifikationskurve aus Schritt e) im Wesentlichen (bezüglich Effizienz, Schwellenwertzyklus und/oder Fluoreszenzmaximalwert) mit der Amplifikationskurve der zweiten Nukleinsäure übereinstimmen, wodurch keine Amplifikation des Nukleinsäurefragments der ersten Nukleinsäure detektiert wird, was darauf hindeuten könnte, dass in der Probe keine erste Nukleinsäure und in der Probe und im Reaktionsgemisch c) keine Inhibitoren vor- - -
handen sind. Ferner kann die Anaplifikationskurve aus Schritt e) im Wesentlichen mit der Amplifikationskurve der ersten Nukleinsäure übereinstimmen, wodurch ebenfalls keine Inhibitoren im Reaktionsgefäß vorhanden sein können. Sollte es nicht möglich sein eine Amplifikationskurve aufzunehmen wird die Reaktion im Wesentlichen zu 100% inhibiert, wobei jedoch anhand der Amplifi- kationskurve (z.B. reduzierter Fluoreszenzmaximalwert, verschobener Schwellenwertzyklus, reduzierte Effizienz im Vergleich zu einer nicht-inhibierten Amplifikationskurve) auch beispielsweise eine 50%ige Inhibition festgestellt werden kann.
Vorzugsweise wird zumindest eine Schmelztemperatur des mindestens einen Nukleinsäurefragments durch das Aufnehmen einer Schmelzkurve nach der Nukleinsäureamplifikation bestimmt.
Um die bei der Amplifikation amplifizierten Nukleinsäu- refragmente näher zu charakterisieren, kann das Reaktionsgemisch nach der Amplifikation einer Schmelzkurven-Analyse unterzogen werden. Bei diesem Verfahrensschritt wird, sofern die Fluoreszenzmarkierung durch die Erhöhung der Temperatur über den Schmelzpunkt der doppelsträngigen DNA-Fragmente reversibel ist (z.B. bei der Verwendung von DNA-interkalierenden Substanzen), die Änderung der Fluoreszenz gegen die Temperatur korreliert. Somit wird es am Ende der Amplifikationsreaktion ermöglicht die amplifizierten Nukleinsäurefragmente durch Vergleich mit bekannten Schmelzkurven (jene des amplifizierten Nukleinsäurefragments der ersten Nukleinsäure mit jenem amplifizierten Nukleinsäu- refragment der zweiten Nukleinsäure) zu identifizieren und beispielsweise feststellen, ob beide Reaktionen vonstatten gegangen sind um Primer-Dimere oder andere unspezifische Produkte zu unterscheiden. Die amplifizierten Nukleinsäurefragmente weisen vorzugsweise eine Schmelztemperatur auf, die sich im Wesentlichen um mindestens 1°C, vorzugsweise um mindestens 20C, noch bevorzugter um mindestens 40C, insbesondere um mindestens 6°C, unterscheiden .
Die Nukleinsäure ist vorzugsweise DNA und/oder RNA, insbesondere mRNA. Erfindungsgemäß können alle bekannten Arten von Nukleinsäuren eingesetzt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäureamplifikationstechnik eine Polymerasekettenreaktionstechnik (PCR-Technik) , wobei diese ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Echtzeit PCR, verschachtelter PCR („nested PCR") , inverser _
PCR, reverser Transkriptase PCR (RT-PCR) , asymmetrischer PCR und Kombinationen davon, ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einer Vielzahl von Polymeraskettenreaktionstechniken eingesetzt werden. Voraussetzung ist jedoch, dass eine Fluoreszenz im Wesentlichen bei jedem Zyklus gemessen und daraus eine Amplifikationskurve abgeleitet werden kann. Insbesondere Echtzeit Polymerasekettenre- aktion ("Real Time Polymerase Chain Reaction", real time PCR) eignet sich besonders gut, da die qualitative und quantitative Analyse sehr schnell und ohne Gel-Analysen und Hybridisierungs- tests zum Nachweis der Produkte vonstatten geht. Ferner kombiniert die Echtzeit PCR die DNA Amplifizierung mit der Detekti- on der Produkte in einem Reaktionsgefäß. Eine derartige Amplifi- kation einer Nukleinsäure setzt das Kontaminationsrisiko drastisch herab, weil das Reaktionsgefäß nach der Kettenreaktion nicht mehr geöffnet werden muss.
Vorzugsweise wird die PCR als asymmetrische PCR durchgeführt. Bei der asymmetrischen PCR wird einer der in der PCR eingesetzten Primer im Überschuss zugesetzt. Unter diesen Reaktionsbedingungen kommt es zu einer selektiven Amplifikation eines Stranges. Befindet sich der forward Primer im Überschuss wird der Strang und nicht der Gegenstrang vermehrt amplifiziert . Diese Vorgehensweise ist vor allem dann von Vorteil, wenn das PCR-Produkt nach der Amplifikation für Hybridisierungen (z.B. Hybridisierung an einer festen Phase) verwendet werden soll. Durch das Vorhandensein von Einzelsträngen ist ein Denaturieren des PCR-Produkts vor der Hybridisierung nicht mehr notwendig.
Die Echtzeit PCR ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TaqMan PCR, Sybr Green PCR, molekularer Beakon PCR, LightUp PCR, HybProbe PCR und Kombinationen davon.
Erfindungsgemäß können verschiedene Echtzeit PCR Techniken bzw. Methoden angewendet werden, wobei Echtzeit PCR mit TaqMan, LightUp, HybProbe und molekularen Beakon Sonden und mit Sybr Green bevorzugt sind. Vor allem durch die Kombination der verschiedenen PCR Techniken (z.B. Sybr Green Markierung mit TaqMan Markierung) wird es ermöglicht die Anzahl der zu detektierenden bzw. quantitativ zu bestimmenden amplifizierten Nukleinsäu- refragmente in einer Probe zu erhöhen.
Vorzugsweise wird das mindestens eine amplifizierte Nukle- insäurefragment mit einer Nukleinsäure-interkalierenden Sub- stanz, z.B. Sybr Green 1 oder Ethidiumbromid, mit mindestens einer Farbstoff-markierten Nukleinsäure-Sonde, z.B. mit einer TaqMan-Sonde oder mit einem molekularen Beakon ("molecular bea- con" ) , markiert.
Grundsätzlich sind die Detektionsarten in Nukleinsäureampli- fikationstechniken, insbesondere in der Real Time PCR (siehe z.B. Bustin SA., J MoI Endocrinol . (2000) 25:169-193), entweder spezifisch, das heißt Primer Dimere oder unspezifische Produkte werden nicht detektiert, oder unspezifisch, jegliche doppel- strängige DNA wird nachgewiesen (selektiver Nachweis) . Zur selektiven Detektion von Nukleinsäuren, insbesondere von doppel- strängiger DNA, werden in der Molekularbiologie vorwiegend in- terkalierende Farbstoffe verwendet, die in der Lage sind sich in die Nukleinsäuren einzulagern. Derartige Farbstoffe sind beispielsweise Ethidiumbromid und das weniger toxische Sybr Green (siehe z.B. Wittwer CT et al. (1997) Biotechniques 22:176-81; Ponchel F et al . (2003) BMC Biotechnology 3:18) oder aber auch Thiazol Orange (TO) , Oxazol Gelb (YO) . Diese Farbstoffe, insbesondere Sybr Green, werden nicht nur zur Nukleinsäurefärbung in Gelen, wie z.B. Agarosegelen, verwendet, sondern auch im Zuge von Nukleinsäureamplifikationstechniken, wie Echtzeit-PCR. Die Emission von fluoreszierendem Licht, wenn diese Farbstoffe in doppelsträngiger DNA interkaliert sind, erlaubt es im Rahmen einer Echtzeit-PCR die Bildung von Amplifikationsprodukten direkt nach deren Erzeugung mittels eines Fluorometers zu detek- tieren. Die Intensität des Fluoreszenzsignals ist dabei propro- tional zur Menge an doppelsträngiger DNA in der Probe. Da diese Methode DNA zu detektieren selektiv und nicht spezifisch ist (d.h. es kann DNA nicht aufgrund dessen Nukleinsäuresequenz spezifisch detektiert werden) , ist es möglich das Produkt nach dem Ende der PCR-Amplifikation mittels Schmelzkurven näher zu charakterisieren und nicht-spezifische Amplifikationsprodukte, welche in der Regel einen anderen Schmelzpunkt als das Hauptprodukt aufweisen, zu identifizieren. Daher sind interkalierende Farbstoffe sehr gut geeignet, die Amplifikation von Nukleinsäu- refragmenten direkt zu verfolgen, wobei allerdings zu beachten ist, dass die Schmelzpunkte je nach Analyse-Lauf um +/- I0C variieren können. Interkalierende Farbstoffe, insbesondere Sybr Green 1, werden für Singleplex Reaktionen eingesetzt, wobei bei Kopplung mit einer Schmelzpunkt-Analyse kann es auch in Multi- - - plex Reaktionen verwendet werden (siehe z.B. Siraj AK, Clinical Cancer Research 8:3832-3840 (2002)).
Um die Bildung eines spezifischen Amplifikationsproduktes zu detektieren, werden Sequenz-spezifische Sonden verwendet. Dies können einerseits TaqMan Sonden, Light-up Sonden, Hy- bridisierungssonden oder molekulare Beakons sein. TaqMan Sonden (siehe z.B. Heid CA et al . (1996) Genome Res . 6:986-94) beispielsweise zeichnen sich dadurch aus, dass die am Amplifika- tionsprodukt spezifisch bindende Sonde mit einem Reporter-Farbstoff (Fluorophor) und einem Quencher an dem 5'- und 3 ' -Ende versehen ist. Aufgrund der 5 '-3' Nukleaseaktivität der Taq (Thermus aquaticus) DNA Polymerase wird der Quencher aus der unmittelbaren Nähe des Reporter-Farbstoffs entfernt und die Fluoreszenz des Farbstoffs nimmt proportional zur Menge des Ampli- kons zu. Ein in der Praxis häufig verwendetes Reporter-Farb- stoff-Quencher-System ist beispielsweise FAM ( 6-carboxyfluo- rescein) und TAMRA ( 6-carboxy-tetramethyl-rhodamin) . FAM wird dabei vom Instrument angeregt und überträgt die Energie (FRET = Fluorescence Energy Transfer) auf TAMRA, dessen Fluoreszenz auch gemessen wird, wobei an der Detektionswellenlänge von TAMRA der Hintergrund von FAM sehr klein ist. Neben Fluorophoren als Quencher werden heute auch sogenannte Dunkel-Quencher benutzt, welche nicht fluoresceinieren, dabei wird nur die Aufhebung der Löschung von zum Beispiel FAM gemessen. Beispiele derartiger Farbstoffe sind neben FAM TET, HEX und JOE, Beispiele von weiteren Quenchern neben TAMRA sind DABCYL und DABSYL. Als Quencher können erfindungsgemäß auch Metallpartikel, insbesondere Goldpartikel (z.B. Fan C. et al. Proc Natl Acad Sei USA (2003) 100:6297-301), verwendet werden.
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Tabelle 1 : Auswahl von fluoreszierenden Farbstoffen, die bei der TaqMan PCR eingesetzt werden (R = Reporter, Q = Quencher, P = Passiver Referenzfarbstoff)
Figure imgf000015_0001
Auch die Detektion von Amplifizierungsprodukten mittels Hy- bridisierungssonden beruht auf dem FRET ("fluorescence resonance energy transfer") Prinzip. Dabei wird eine erste Sonde mit einem Donor-Fluorochrom (z.B. Fluoreszein) am 3 ' -Ende und eine zweite Sonde mit einem Akzeptor-Farbstoff (z.B. Cy5, LC Red 640) am 5 ' -Ende markiert. Beide Sonden sind so ausgewählt, dass diese am Amplikon derart hybridisieren, dass die modifizierten Enden der Sonden am Amplikon nur durch eine einzige Base am selben DNA- Strang getrennt sind. In dieser Position regt die vom Donor abgegebene Energie den Akzeptor-Farbstoff der zweiten Sonde an, wobei letzterer schließlich Fluoreszenz bei einer längerem Wellenlänge emittiert. Das Verhältnis zwischen Donor-Fluoreszenz und Akzeptor-Fluoreszenz nimmt im Laufe einer Nukleinsäureampli- fikation zu und ist proportional zur amplifizierten DNA-Menge.
Ferner können zur spezifischen Detektion von Amplifi- zierungsprodukten sog. molekulare Beakons ("molecular beacons") verwendet werden (siehe z.B. Abravaya K et al. (2003) Clin Chem Lab Med. 41:468-74). Molekulare Beakons sind Hybridisirungsson- den, die einen Stamm ("stem") und eine Schleife ("loop") aufweisen und an einem Ende mit einem Fluoreszenz-Farbstoff und am anderen Ende mit einem Quencher modifiziert sind. Der Schleifen- Abschnitt der Sonde ist komplementär mit dem Template und die beiden Endabschnitte sind zueinander komplementär, so dass sich eine Haarnadel-artige Struktur ausbildet. Wenn die Sonde nicht _
am Template hybridisiert vorliegt befinden sich Fluorophor und Quencher in unmittelbarer Nähe, wodurch die Fluoreszenz im Wesentlichen zur Gänze unterdrückt wird. Sobald die Sonde auf das Template unter optimierten Bedingungen hybridisiert, wird der Fluoreszenz-unterdrückende Effekt des Quenchers aufgehoben. Aufgrund der hohen Thermostabilität der gebildeten Haarnadel- Struktur, weisen molekulare Beakons eine hohe Hybridisierungs- spezifität auf, wodurch es ferner ermöglicht wird Unterschiede in der Nukleotid-Sequenz bis auf ein Nukleotid festzustellen (Eignung zur Mutationsanalyse und zur Detektion von einzelnen Nukleotid Polymorphismen ("single nucleotide polymorphism" , SNP) ) .
Erfindungsgemäß eignen sich auch HybProbe Sonden zur Ausführung der vorliegenden Erfindung (siehe z.B. Härder TC et al. J. Clin. Microbiol. (2001) 39: 4413-4419) . Weiters sind im erfindungsgemäßen Verfahren auch Light-up Sonden geeignet, wie diese beispielsweise in Kubista M et al. (Genomics and Proteo- mics Technologies. Proceedings of SPIE (2001), Vol. 4264, pp. 53-58), Svanvik N et al. (Anal Biochem (2000) 287:179-182) und Isacsson J et al. (Mol Cell Probes (2000) 14:321-328) beschrieben sind.
Vorzugsweise ist die Polymerasekettenreaktionstechnik eine 2-Stufen Polymerasekettenreaktionstechnik.
Eine 2-Stufen Polyrαerasekettenreaktionstechnik zeichnet sich dadurch aus, dass die Annealing- und die Elongationstemperatur ident sind. Daher benötigen derartige PCR-Techniken lediglich zwei Temperaturstufen um die Amplifikation eines Nukleinsäu- refragments zu katalysieren (eine Denaturierungstemperatur, z.B. 940C, und eine Annealing-/Elongationstemperatur) . Voraussetzung zur Durchführung einer 2-Stufen PCR ist, dass die verwendete Polymerase bei der Annealingtemperatur ausreichende Amplifika- tionseffizienz aufweist.
Die Detektion mehrerer amplifizierter Nukleinsäurefragmente wird idealerweise mit Hilfe von Sequenz-spezifischen Sonden durchgeführt. Derartige Sonden sind beispielsweise TaqMan-Son- den, welche vorzugsweise 6-Carboxy-Fluorescein, Tetrachloro-β- carboxy-fluorescein, 2, 7-Dimethoxy-4, 5-dichloro-6-carboxyfluo- rescein oder Hexachloro-6-carboxy-fluorescein als Farbstoff und 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin als Quencher aufweisen können.
Vorzugsweise weist die Amplifikation des zweiten Nukleinsäu- refragments eine geringere Effizienz als die Amplifikation des ersten Nukleinsäurefragments auf.
Die Effizienz einer Nukleinsäureamplifikation hat direkte Auswirkungen auf den Schwellenwertzyklus: je niedriger die Effizienz desto größer der Schwellenwertzyklus. Um die Amplifikation der ersten und der zweiten Nukleinsäure von der Amplifikation der zweiten Nukleinsäure zu unterscheiden, weist die Amplifikation der zweiten Nukleinsäure eine geringere Effizienz auf.
Die Amplifikation des zweiten Nukleinsäurefragments weist vorzugsweise eine Effizienz von maximal 1,8, vorzugsweise von maximal 1,4, noch bevorzugter von maximal 1,3, insbesondere von maximal 1,1, auf.
Vorzugsweise weist die Amplifikation des zweiten Nukleinsäurefragments einen Schwellenwertzyklus von mindestens 30, besonders bevorzugt von mindestens 40, insbesondere von mindestens 50, auf.
Um die Amplifikationskurven mindestens zweier Nukleinsäureamplifikationen zu unterscheiden, ist es notwendig, dass sich die Kurven zumindest in einem Merkmal unterscheiden. Zu diesen Merkmalen zählen vor allem der eingangs erwähnte Schwellenwertzyklus, der Fluoreszenzmaximalwert und die Effizienz. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens hat sich vor allem die Unterscheidung der Kurven anhand des Schwellenwertzyklus als besonders geeignet erwiesen. Der Schwellenwertzyklus ist von mehreren Faktoren, wie z.B. der Primerkonzentration (siehe z.B. Kubista M et al . (2001) Genomics and Proteomics Technologies. Proceedings of SPIE, Vol. 4264, pp. 53-58) , abhängig, wobei eine geringe Primerkonzentration zu einem höheren Schwellenwertzyklus führt als eine hohe Konzentration. Da eine Nukleinsäureamplifikation in der Regel auf einen Schwellenwertzyklus von ca. 25 bis 45 hinoptimiert wird, würde sich ein höherer Schwellenwertzyklus von z.B. 45 besonders gut eignen, um festzustellen, ob die Amplifikation der ersten Nukleinsäureamplifikation funktionierte oder nicht funktionierte. Würde beispielsweise die Amplifikationskurve einer Probe einen Schwellenwertzyklus aufweisen, der jenem der Amplifikation der zweiten Nukleinsäure entspricht, weist dies darauf hin, dass in der Probe eventuell keine erste Nukleinsäure vorhanden war. Ferner kann der Schwellenwertzyklus auch zur Konzentrationbestimmung der ersten in der Probe befindlichen Nukleinsäure herange- - -
zogen werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Menge des ersten Primerpaars im Gemisch c) 0,05 bis 2 μM, vorzugsweise 0,075 bis 1,5 μM, insbesondere 0,1 bis 1 μM.
Diese Konzentrationen des ersten Primerpaars haben sich als besonders gut in dem erfindungsgemäßen Verfahren erwiesen.
Die Menge des zweiten Primerpaars beträgt gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weniger als 90%, vorzugsweise weniger als 70%, besonders bevorzugt weniger als 50%, insbesondere weniger als 30%, 20%, 15%, 10% oder 7.5%, der Menge des ersten Primerpaars .
Die in einer Nukleinsäureamplifikation eingesetzte Menge an Primer beeinflusst die Effizienz einer Amplifikationsreaktion, wobei sich die Effizienz der Reaktion sowohl bei zu geringen als auch bei zu hohen Mengen an Primer reduziert. Um die optimale Primerkonzentration im Reaktionsgemisch zu bestimmen, kann eine Standardreihe mit verschiedenen Konzentrationen an Primern am- plifiziert werden, wobei für jede Primerkonzentration die Effizienz der Nukleinsäureamplifikation z.B. anhand einer Amplifika- tionskurve bestimmt wird. Dabei hat sich ergeben, dass vor allem eine geringere Menge an dem Primerpaar, welches für die zweite Nukleinsäure (als interne Kontrolle) spezifisch ist, im Vergleich zu dem für die erste Nukleinsäure spezifischen Primerpaar zu einem überraschend guten Ergebnis führt.
Um die Effizienz und den Schwellenwertzyklus der Amplifika- tion der zweiten Nukleinsäure zu reduzieren bzw. zu erhöhen, kann die Menge an eingesetzter zweiter Nukleinsäure sehr gering sein. Vorzusgweise beträgt die Menge der mindestens einen zweiten Nukleinsäure zwischen 10 und 106 Molekülen, vorzugsweise zwischen 100 und 100000 Molekülen, insbesondere zwischen 1000 und 10000 Molekülen. Aufgrund der geringen Menge an Template benötigt die Amplifikation mehr Zyklen, um den Schwellenwert der Fluoreszenz zu erreichen und in die exponentielle Phase der Amplifikation einzutreten.
Besonders vorteilhaft hat sich erfindungsgemäß der Einsatz einer Chlamydia Nukleinsäure als zweite Nukleinsäure bzw. interne Kontrolle erwiesen.
Erfindungsgemäße kann jedoch jede Nukleinsäure als interne Kontrolle eingesetzt werden, vorausgesetzt dass entsprechend spezifische Primer zur Amplifikation eines Fragments daraus be- - - kannt sind bzw. bestimmt werden können.
Vorzugsweise weist der vorwärts gerichtete Primer die Nukle- insäuresequenz 5'-ACCAAGAAATAAAAATGCGCTTCCCAAf-T-S' auf.
Der rückwärts gerichtete Primer weist gemäß einer bevorzugten Ausführungsform die Nukleinsäuresequenz 5'-CAGCTGCTGTAATCAC- CCAGTCGATAAATG-3 ' auf .
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann jegliche Probe umfassend eine Nukleinsäure, welche ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Viren, tierischen und pflanzlichen Organismen, Bakterien, vorzugsweise Mykobakterien, insbesondere Mycobacterium paratuberculosis, Listerien, Salmonellen, Campylobacter, und Kombinationen davon sind, untersucht werden.
Vorzugsweise umfasst die Probe mindestens eine erste Nukleinsäure aus Mycobacterium paratuberculosis, welche mit einem vorwärts gerichteten Primer mit der Nukleinsäuresequenz 5 ' -CCGC- TAATTGAGAGATGCGATTGG-3 ' und mit einem rückwärts gerichteten Primer mit der Nukleinsäuresequenz 5'-GTGCCACAACCACCTCCGTAACCG- 3' amplifiziert wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das einer Nu- kleinsäureamplifikation unterworfene Gemisch aus Schritt c) oder die gegebenenfalls amplifizierten Nukleinsäurefragmente aus Schritt d) mit einer Hybridisierungsmethode detektiert.
Der Nachweis eines amplifizierten Nukleinsäurefragments kann erfindungsgemäß auch durch Hybridisierungsmethoden erbracht werden. Bei derartigen Methoden wird ein amplifiziertes Fragment über die sequenzspezifische Anlagerung von komplementären, markierten (z.B. nichtradioaktiv (siehe beispielsweise Kessler C. (ed.) Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules . Springer Verlag Heidelberg (1992) ) oder radioaktiv) Nukleinsäu- re-Sonden erfolgen. Die zu analysierenden Nukleinsäuren werden dabei vorzugsweise auf einen festen Träger immobilisiert und unter stringenten Bedingungen mit den entsprechenden Sonden in Kontakt gebracht. Eine ausführliche Anleitung bezüglich Hybridisierung von Nukleinsäuren kann beispielsweise in Tijssen "Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes", "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (ed. Elsevier N. Y./ 1993) und "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausübet, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York; 1997) gefunden werden. Ein Überblick über Methoden und Verfahren zum Nachweis von Nukle- - -
insäuren mittels Hybridisierungstechniken kann in Lottspeich F et al. gefunden werden (Lottspeich F. und Zorbas H, "Bioanalytik" Seite 635-671, Spektrum Verlag; 1998) .
Die vorliegende Erfindung wird weiters durch die folgenden Figuren und das folgende Beispiel näher erläutert, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.
Fig. 1 zeigt einen Plot einer Echtzeit-PCR-Analyse von M. paratuberculosis (positiv-Kontrolle, AOl) und mehreren internen Kontrollen (Chlamydia-DNA: BOl, COl, DOl, EOl, FOl, GOl), wobei die Fluoreszenzwerte (FAM-490) gegen die Anzahl der PCR-Zyklen korreliert wurden.
Fig. 2 zeigt eine Schmelzkurve zur Feststellung, ob das am- plifizierte Produkt dem zu amplifizerenden Produkt entspricht, wobei die Fluoreszenzwerte (FAM-490) gegen die Temperatur ge- plottet wurde.
Beispiele :
I. Herstellung von Ferromagnetisehen Beads zur Isolierung- von M. paratuberculosis
0,8 ml Ferromagnetische Beads (ChemiCell, SIMAG-MP/TCL) Suspension werden am Magneten (MagnetOn 4T, Aureon Biosystems, #M010104) abgeschieden, in ImI MES resuspendiert, am Magneten der Überstand abgenommen und mit 25mg Carbodiimid (Sigma, #E7750) in 1ml MES-Puffer 15 Minuten am Rotamix (RMl bei 15rpm) aktiviert. Die Beads werden mit ImI MOPS-Puffer gewaschen und mit 900μl Antikörper in MOPS-Puffer (QED Bioscience, 18101- 18104) 2 Stunden am RMl gedreht. Danach werden 4ml StabilZyme AP (Surmodics, SAOl-100) zugesetzt und über Nacht am RMl gedreht. Durch Abscheiden der Beads am Magneten, Resuspendieren und erneutes Abscheiden werden die Beads 2x mit ImI TPBS und Ix mit 1ml StabilZyme gewaschen. Zuletzt werden die Beads in 20 ml StabilZyme aufgenommen (Endkonzentration von 10mg Beads/ml) und im Kühlschrank gelagert.
II. Herstellung von PCR-Grade M. paratuberculosis DNA ImI einer Suspension von M. paratuberculosis in Rohmilch
(Andiatec, Stuttgart) wird mit lOμl der Bead-Suspension versetzt und 30 Minuten unter zeitweiligem Schütteln inkubiert. Danach werden die Beads am Magneten abgeschieden und 4 mal mit CT- Waschlösung durch jeweiliges Abscheiden am Magneten gewaschen. Der Bead-Bakterien-Komplex wird in 50μl dest. Wasser resuspendiert, 10 min. bei 950C erhitzt, danach die Beads am Magneten - - abgeschieden und der Überstand in ein frisches Röhrchen übertragen.
JII. Real-Time PCR mit SybrGreen und DNA Lösung und interner Kontrolle
Iμl eine Verdünnungsreihe der aus Punkt 2 isolierten DNA-Lösung wurde mit 4pmol/20μl MP139U24: δ'-CCGCTAATTGAGAGATGCGATTGG- 3' und 4pmol/20μl mit dem Primer MP219L24:
5'-GTGCCACAACCACCTCCGTAACCG-S' in Ix SybrGreen Supermix von Bio- Rad am iCycler mit 20μl Gesamtvolumen amplifiziert und real-time analysiert. In allen Proben war zudem lμl einer 10"δ Verdünnung des Amplikons einer Chlamydia PCR auf dem Chlamydia trachomatis cryptic plasmid pLGV440 (NCBI-Zugangsnummer X06707) sowie die Primer C4235U29 5'-ACCAAGAAATAAAAATGCGCTTCCCAAAT-S' und C4283L30 5'-CAGCTGCTGTAATCACCCAGTCGATAAATG-S' bei einer Konzentration von lpmol/20μl.
Um die Robustheit zu demonstrieren, wurde zudem zu den Proben Hering Sperm DNA zugesetzt.
PCR-Parameter:
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000021_0002
Die anschließende Schmelzkurve ergab eine Schmelztemperatur - - von 790C für das Produkt der Internen Kontrolle und 8β°C für das Produkt der M. paratuberculosis PCR.
IV. Screening von Rohmilchyroben auf M. oaratuberculosis mit SybrGreen und interner Kontrolle
2ml Rohmilch wird mit 20μl der Bead-Suspension versetzt und 120 Minuten unter Drehen der Tubes inkubiert. Danach werden die Beads am Magneten abgeschieden und 4 mal mit CT-Waschlösung durch jeweiliges Abscheiden am Magneten gewaschen. Der Bead-Bak- terien-Komplex wird in 20μl dest. Wasser resuspendiert, 20 min. auf 95°C erhitzt, danach die Beads am Magneten abgeschieden und der Überstand in ein frisches Röhrchen übertragen. lOμl der isolierten Lösung wurde mit 10pmol/50μl MP139U24: 5'-CCGCTAATTGAGAGATGCGATTGG-S' und 10pmol/50μl mit dem Primer MP219L24: 5'-GTGCCACAACCACCTCCGTAACCG-S' in Ix SybrGreen Supermix von BioRad am iCycler mit 50μl Gesamtvolumen amplifiziert und real-time analysiert. In allen Proben war zudem Iμl einer 10"6 Verdünnung des Amplikons einer Chlamydia PCR sowie die Primer C4235U29 5'-ACCAAGAAATAAAAATGCGCTTCCCAAAT-S' und C4283L30 5'-CAGCTGCTGTAATCACCCAGTCGATAAATG-3I bei einer Konzentration von 2, 5pmol/50μl . Als positiv Kontrolle wurde M. paratuberculosis DNA in Wasser verwendet.
PCR-Parameter:
Figure imgf000022_0001
Ergebnisse (Schwellenwertzyklus - „threshold cycle"):
Figure imgf000022_0002
- -
Figure imgf000023_0001
Es ist zu beachten, dass die einzelnen Ansätze eindeutige Resultate lieferten. In den Proben wurde Ämplifikationsprodukt der internen Kontrolle nach Cycle 45 und das positive Amplifika- tionsprodukt vor dem Cycle 45 gebildet. Zudem kann die interne Kontrolle vom anderen Produkt über die Signalhöhe bei vollständiger Reaktion oder den Anstieg, das heißt die Effizienz, unterschieden werden. Dies wurde dadurch erreicht, dass die Primer in stark unterschiedlichen Konzentrationen angeboten wurden und dadurch die Effizienz der einzelnen Amplifikationen variierte, was zu unterschiedlichen Schwellenwertzyklen führt. Die effizienzreduzierte interne Kontrolle ist äußerst anfällig auf Inhibitoren und stellt daher eine sehr gute interne Kontrolle dar.
Zusätzlich wurde eine Schmelzkurve erstellt, wobei bei den negativen Proben die interne Kontrolle mit einem Schmelzpunkt von 78, 50C nachgewiesen, die Positiv-Kontrolle und eine Probe zeigten das Produkt der M. paratuberculosis PCR, welches bei 85,5°C schmolz.
V. Asymetrische Real-Time PCR mit SybrGreen, interner Kontrolle und Hybridisieruncrs-Read-out lμl einer Verdünnungsreihe der aus Beispiel II isolierten DNA-Lösung wurde mit 4pmol/20μl MP139U24: 5'-CCGCTAATTGAGAGATGC- GATTGG-3' sowie 2pmol/20μl 5 ' -Fluorescein-CCGCTAATTGAGAGATGC- GATTGG-3' und 4pmol/20μl mit dem Primer MP219L24: 5'-GTGCCACAACCACCTCCGTAACCG-S' in Ix SybrGreen Supermix von Bio- Rad am iCycler mit 20μl Gesamtvolumen amplifiziert und real-time analysiert. In allen Proben war zudem lμl einer IGT7 Verdünnung des Amplikons einer Chlamydia PCR auf dem Chlamydia trachomatis cryptic plasmid pLGV440 (NCBI-Zugangsnummer X06707) sowie die Primer C4235U29 5'-ACCAAGAAATAAAAATGCGCTTCCCAAAT-S' und C4283L30 5'-CAGCTGCTGTAATCACCCAGTCGATAAATG-S' bei einer Konzentration von lpmol/20μl und der Fluoresceinierte Primer 5'- Flurescein-AC- CAÄGAΑATAAAAATGCGCTTCCCAAAT-3 ' bei einer Konzentration von - -
0,5pmol/20μL.
Dieses Beispiel wurde gewählt, um die umfassende Nutzbarkeit des Verfahrens aufzuzeigen, weil Fluorescein im Sybr-Green Kanal die Messung stören sollte, andere Labels können noch vorteilhafter sein, wenn es um eine Markierung für anschließenden Hy- bridisierungsassay geht. Dadurch kann der selbe Assay in Echtzeit Ablesung und Hybridisierungstest verwendet werden. Dies ist dann sinnvoll wenn ein Anwender noch kein Real-time Gerät besitzt. Dann wird der selbe Assay mit Hybridisierung ausgelesen und bei Anschaffung eines real time cyclers braucht nicht neu validiert zu werden, weil der Hybridisierungstest und der real time read out die gleiche Sensitivität haben.
PCR-Parameter:
Figure imgf000024_0001
Hybridisierungstest: A: Herstellung der Festphase Streptavidin von Boehringer Mannheim, wird in PBS auf eine Konzentration von 2μg/mL verdünnt und die Näpfchen von Weißen Ma- xiSorp Microplatten (Nunc, Art-N°437-591) werden über Nacht bei 4°C mit lOOμL beschichtet. Die Platte wird ausgeklopft, mit TPBS gewaschen und mit lOOμL/Well einer Lösung von 3pmol/100μL bioti- nyliertem capture oligonucleotide (Biotin-TCATTGTCCAGATCA für M. Paratuberculosis und Biotin-AGCATACTTTGATGCAT für die interne Kontrolle) in TPBS gebunden, gewaschen, getrocknet und eingeschweißt .
B: Hybridisierung ohne Denaturierung
50μL TPBS und 5μL Amplicon werden 15 min bei Raumtemperatur und Drehen bei 500 rpm inkubiert, 4 x mit TPBS gewaschen, 15 min mit 50μL anti-FAM-HRP bei 500 rpm inkubiert, 4 x mit TPBS gewaschen, 15 min mit KPL TMB im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert und mit 50μL 1 N H2SO4 gestoppt. Messung der optischen Dichte bei 450-620nm. - -
Ergebnisse
Figure imgf000025_0001
VI. Diskussion:
Eine hochsensitive und hochspezifische PCR zum Nachweis von M. paratuberculosis DNA wurde entwickelt und gezeigt, dass auch nach 80 Cycles keine Primerdimere auftreten. Die Spezifität wurde weiters mit diesen Primern in einer Touch-Down-PCR erhöht. Um die Auswertung der Real-Time PCR bei nur einer Messwellenlänge eines Real Time Cyclers zu ermöglichen, wurde eine interne Kontrolle einbezogen, die in der Effizienz durch niedrige Konzentration der Primer herabgesetzt ist und dadurch erst bei hoher Zyklenzahl der Schwellenwert erreicht und vom eigentlichen Produkt über die Effizienz und gegebenenfalls über die Signalhöhe bei negativen Proben anzeigt, dass die Amplifizierung nicht inhibiert war. Um mehrere Produkte gut quantifizieren zu können, kann bei Messungen mit SybrGreen I die Konzentration des Farbstoffs variiert bzw. erhöht werden.
Dieses Konzept der Effizienz-Abwandlung durch unterschiedliche Primerkonzentrationen und monochrome Detektion eignet sich auch besonders gut für Gen-Analysen, weil zum Beispiel bei Punktmutationen wie Faktor V Leiden im heterozygoten Fall wild typ und mutation typ in gleicher Menge am Genom vorhanden sind, damit die Targetkonzentration gleich ist, und über die Effizienz unterschieden werden können.
Eine Übersicht zur Effizienzberechnung, anhand mathematischer Algorithmen innerhalb einer einzelnen experimentellen - -
Probe findet sich in M.W. Pfaffl ("Neue Ansätze zur exakten mRNA Quantifizierung", Biospektrum, 1/04, 10. Jahrgang). Darin wird auch aufgezeigt was ein Fachmann unter Signalhöhe versteht - die Fluoreszenzdifferenz zwischen Hintergrundfluoreszenz welche anhand einer Regression angepasst wird, wobei bereits ein Produkt darin enthalten sein kann, und Plateauphase, welche auch über eine Regression angepasst werden kann.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können auch mehr als zwei Amplikons zu bestimmt werden, sofern die Primerkon- zentratioήen sachgemäß eingestellt werden. In diesem Beispiel verschiebt sich der Schwellenwertzyklus um rund 3 Zyklen bei Verdünnung der Primer auf die Hälfte und um rund 10 Zyklen bei Verdünnung auf ein Viertel. In vielen Fällen sollte hiezu die Konzentration von Sybr Green I angepasst werden denn so ferne genügend Farbstoff zur Verfügung steht, können die Produkte auch über die Signalhöhe unterschieden werden.
Bei Verwendung spezifischer Sonden, wie TaqMan oder Molekular Beakons und Geräten, die bei mehreren Wellenlängen messen, erhöht sich die Zahl der zu bestimmenden Produkte drastisch durch Anwendung dieses Konzepts.

Claims

Patentansprüche :
1. Verfahren zur Detektion mindestens eines Nukleinsäurefrag- ments einer Nukleinsäureamplifikation umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer Probe gegebenenfalls umfassend mindestens eine erste Nukleinsäure, b) Inkontaktbringen der Probe mit einer bestimmten Menge eines ersten für die erste Nukleinsäure spezifischen Primerpaars, c) Zugeben einer bestimmten Menge mindestens einer zweiten Nukleinsäure als interne Kontrolle und eines zweiten für die zweite Nukleinsäure spezifischen Primerpaars zur Probe, d) Amplifizieren des Gemisches aus c) über eine Anzahl von Nukleinsäureamplifikations-Zyklen, bei der mindestens ein ampli- fiziertes Nukleinsäurefragment der mindestens einen ersten und/oder der mindestens einen zweiten Nukleinsäure mit einem oder mehreren fluoreszierenden Farbstoffen markiert wird, e) Aufnehmen einer Amplifikationskurve durch Messen der Fluoreszenzintensitäten der Nukleinsäureamplifikations-Zyklen bei einer Wellenlänge und Korrelieren der Fluoreszenzintensitäten gegen die Anzahl der Nukleinsäureamplifikations-Zyklen, f) Bestimmen eines Schwellenwertzyklus und/oder eines Fluoreszenzmaximalwertes der Amplifikationkurve und/oder einer Effizienz der Amplifikation, g) Vergleichen des Schwellenwertzyklus und/oder des Fluoreszenzmaximalwertes und/oder der Effizienz aus f) mit dem Schwellenwertzyklus und/oder dem Fluoreszenzmaximalwert und/oder der Effizienz einer Amplifikation mit der bestimmten Menge des zweiten Nukleinsäurefragments mit dem für die zweite Nukleinsäure spezifischen Primerpaar, wobei die Nukleinsäureamplifikation des mindestens einen Nukleinsäurefragments der ersten Nukleinsäure der Probe detektiert wird, wenn der Schwellenwertzyklus der Amplifikation des Gemisches aus c) mindestens 10% über oder unter dem Schwellenwertzyklus der Amplifikation des zweiten Nukleinsäurefragments mit dem für die zweite Nukleinsäure spezifischen Primerpaar ist und/oder der Fluoreszenzmaximalwert der Amplifikation des Gemisches aus c) mindestens 10% über dem Fluoreszenzmaximalwert der Amplifikation des zweiten Nukleinsäurefragments mit dem für die zweite Nukleinsäure spezifischen Primerpaar ist und/oder die Effizienz der Amplifikation des Gemisches aus c) mindestens 0,1 Punkte über der Effizienz der Amplifikation des zweiten Nukle- insäurefragments mit dem für die zweite Nukleinsäure spezifischen Primerpaar ist.
2. Verfahren zur Detektion einer Inhibition einer Nukleinsäu- reamplifikation mindestens eines Nukleinsäurefragments umfassend die Schritte a) bis g) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Inhibition der Nukleinsäureamplifikation detektiert wird, wenn der Fluoreszenzmaximalwert der Amplifikation des Gemisches aus c) mindestens 10% unter dem Fluoreszenzmaximalwert einer Amplifikation des zweiten Nukleinsäurefragments mit dem für die zweite Nukleinsäure spezifischen Primerpaar ist und/oder die Effizienz der Amplifikation des Gemisches aus c) mindestens 0,1 Punkte unter der Effizienz einer Amplifikation des zweiten Nukleinsäurefragments mit dem für die zweite Nukleinsäure spezifischen Primerpaar ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eine Schmelztemperatur des mindestens einen Nu- kleinsäurefragments durch das Aufnehmen einer Schmelzkurve nach der Nukleinsäureamplifikation bestimmt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure DNA und/oder RNA, insbesondere mRNA, ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäureamplifikationstechnik eine PoIy- merasekettenreaktionstechnik ist .
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerasekettenreaktionstechnik (PCR-Technik) , ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Echtzeit PCR, verschachtelte PCR
(„nested PCR"), inverser PCR, reverse Transkriptase PCR (RT- PCR), asymmetrische PCR und Kombinationen davon, ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Echtzeit PCR ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TaqMan PCR, Sybr Green PCR, molekularer Beakon PCR, LightUp PCR, HybProbe PCR und Kombinationen davon, ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerasekettenreaktionstechnik eine 2- Stufen Polymerasekettenreaktionstechnik ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation des zweiten Nukleinsäurefrag- ments eine geringere Effizienz als die Amplifikation des ersten Nukleinsäurefragments aufweist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation des zweiten Nukleinsäurefragments eine Effizienz von maximal 1,8, vorzugsweise von maximal 1,4, noch bevorzugter von maximal 1,3, insbesondere von maximal 1,1, aufweist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge des ersten Primerpaars 0,05 bis 2 μM, vorzugsweise 0,075 bis 1,5 μM, insbesondere 0,1 bis 1 μM, beträgt .
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge des zweiten Primerpaars weniger als 90%, vorzugsweise weniger als 70%, besonders bevorzugt weniger als 50%, insbesondere weniger als 30%, der Menge des ersten Primerpaars beträgt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine amplifizierte Nukleinsäu- refragment mit einer Nukleinsäure-interkalierenden Substanz, insbesondere Sybr Green 1 oder Ethidiumbromid, mit mindestens einer Farbstoff-markierten Nukleinsäure-Sonde, mit einer TaqMan- Sonde oder mit einem molekularen Beakon ("molecular beacon") markiert wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge der mindestens einen zweiten Nukleinsäure zwischen 10 und 106 Molekülen, vorzugsweise zwischen 100 und 100000 Molekülen, insbesondere zwischen 1000 und 10000 Mole- külen, beträgt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine zweite Nukleinsäure eine Chlamydia Nukleinsäure ist.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der vorwärts gerichtete Primer die Nukleinsäuresequenz 5 ' -ACCAAGAAA- TAAAAATGCGCTTCCCAAAT-3 ' aufweist.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass der rückwärts gerichtete Primer die Nukleinsäuresequenz
5 ' -CAGCTGCTGTAATCACCCAGTCGATAAATG-3 ' , aufweist .
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine erste Nukleinsäure von einem Mikroorganismus stammt, der ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Viren, tierischen und pflanzlichen Organismen, Bakterien, vorzugsweise Mykobakterien, insbesondere Mycobacterium paratu- berculosis, Listerien, Salmonellen, Campylobacter, und Kombinationen davon ist.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mindestens eine erste Nukleinsäure aus Mycobacterium paratuberculosis umfasst oder möglicherweise um- fasst .
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der vorwärts gerichtete Primer eine Nukleinsäuresequenz 5 ' -CCGC- TAATTGAGAGATGCGATTGG-3' aufweist.
21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass der rückwärts gerichtete Primer eine Nukleinsäuresequenz
5 ' -GTGCCACAACCACCTCCGTAACCG-3 ' aufweist .
22. Verfahren nach einen der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das einer Nukleinsäureamplifikation unterworfene Gemisch aus Schritt c) oder die gegebenenfalls amplifizierten Nukleinsäurefragmente aus Schritt d) mit einer Hybridisierungs- methode detektiert werden.
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