WO2003085129A1 - Nachweis von mykobakterien in klinischem material - Google Patents

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WO2003085129A1
WO2003085129A1 PCT/EP2003/003533 EP0303533W WO03085129A1 WO 2003085129 A1 WO2003085129 A1 WO 2003085129A1 EP 0303533 W EP0303533 W EP 0303533W WO 03085129 A1 WO03085129 A1 WO 03085129A1
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mycobacteria
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Franz-Christoph Bange
Erik Christian BÖTTGER
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Cytonet Gmbh & Co. Kg
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Definitions

  • the present invention relates to a method for the specific detection of mycobacteria and for differentiating the Mycobacterium tuberculosis complex and Mycobacterium avium from other mycobacteria in clinical material.
  • Tuberculosis is a worldwide infectious disease that is chronic and costs more lives each year than any other bacterial infection.
  • Tuberculosis is particularly localized in the lungs, less often in the cervical lymph nodes, intestine or skin.
  • the very different clinical courses of tuberculosis therefore make an exact description of the disease state and a quick diagnosis necessary, especially at early stages of the disease.
  • Mycobacteri um tuberculosis and very rarely Mycobacterium bovis are generally summarized under the term "Mycobacterium tuberculosis complex”.
  • Non-tuberculous mycobacteria lead to an additional worsening in patients suffering from, for example, cystic fibrosis the clinical picture in the area of the lungs (1, 2, 16).
  • the non-tuberculous mycobacteria observed in clinical practice include: Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium marinum, Mycobacterium fortui tum, Mycobacterium chelonae and Mycobacterium abscessus (4).
  • the diagnosis of mycobacteria in clinical material should ideally allow specific detection of tuberculous and non-tuberculous mycobacteria.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Genus-specific methods are used to differentiate a mycobacterial infection from other infections.
  • Known genus-specific methods target the 16S rRNA gene or the gene of the 65 kDa “heat shock” protein.
  • a subsequent specific identification of some types of mycobacteria is carried out using conserved hybridization probes (5, 12).
  • the amplified genes are sequenced ( 6) or an analysis using restriction enzymes is carried out (15).
  • the specific DNA regions that are used for the species-specific detection of the M. tuberculosis complex by means of PCR include, for example, IS 6110, the genes of the 38 kDa protein, the genes of the MBP 64 protein and the regions mtp40 or pMTb4.
  • diagnostic kits which are mostly only suitable for diagnosing the M. tuberculosis complex.
  • kits are offered, for example, by Roche-Amplicor TM, Geneprobe TM or Abbot TM.
  • the molecular biological methods that are carried out for this purpose include, on the one hand, the duplication of the nucleic acid to be detected (target amplification), for example by means of PCR, by transcription-based isothermal DNA synthesis (TMA), by the ligase chain reaction (LCR) or by the isothermal strand displacement amplification (SDA), on the other hand the duplication of the signaling component (signal amplification), such as by the isothermal Qß replication.
  • target amplification for example by means of PCR
  • TMA transcription-based isothermal DNA synthesis
  • LCR ligase chain reaction
  • SDA isothermal strand displacement amplification
  • the l ⁇ S rRNA gene is already used for the detection and identification of various human-pathogenic mycobacteria by means of PCR (7).
  • an algorithm for the specific duplication of a 1000 bp fragment of the mycobacterial 16S rRNA by means of an unspecific primer and a genus-specific primer for mycobacteria is proposed.
  • genus-specific oligonucleotide probes are used which hybridize with the spaceted fragment.
  • species-specific hybridization probes are used, whereby the mycobacterial species M. tuberculosis complex and M. avium can be differentiated from other types of bacteria using the same amplified fragment (5).
  • DNA extracted from clinical samples contains contaminants that often lead to enzyme-based amplification, especially PCR, being inhibited.
  • detection methods known to date there is a great risk that a negative result will be obtained even though the patient actually has a mycobacterial infection.
  • existing tuberculosis is overlooked. Therefore, there has long been a need to develop a control system, the so-called "false negative" finding de excludes in the detection procedure (inhibition control).
  • fluorimetric measurements especially when used as part of the real-time PCR method, represent a fast and sensitive method for the detection of amplified gene fragments.
  • real-time fluorimetry was used to detect M. tuberculosis in expectorates using the TaqMan TM system.
  • the LightCycler TM system from Röche Molecular Biochemicals which is an embodiment of real-time PCR, has now also been used to detect M. bovis in Rinderstuhl and to detect mutations in rifampin or isoniazid resistance in M. tuberculosis (11, 13). In these two studies, the multiplied fragments were typically 200 base pairs in length. Due to the high throughput of a LightCycler TM system, it has been assumed up to now that multiplication of larger DNA fragments of mycobacteria is difficult or impossible due to the high CG nucleotide content of approx. 65% up to 75% occurring in mycobacteria.
  • genus-specific region II is from the prior art II ", known on the 16S rRNA gene of mycobacteria, whereby by means of a specific hybridization probe pair and a melting curve analysis, a large number of mycobacterial species can be distinguished from other bacterial species and other microorganisms due to a higher melting point of the probe pair (6)
  • certain types of mycobacteria such as M. triviale, M. agri, M. Xenopi or M. chitae also have a low melting point, so that, according to the prior art, the mycobacteria are clearly differentiated from non-mycobacteria, especially in a single procedural step is not possible at all.
  • the technical problem of the present invention is to provide an improved method, in particular a particularly fast and at the same time more specific detection of mycobacterial infections in clinical material of various origins and the identification of the species M. tuberculosis complex and / or M. avium in enables a common verification procedure.
  • the present invention solves the technical problem by providing a method for joint, specific detection of a mycobacterial rieninfediction and the Mycobacterium tuberculosis complex and / or Mycobacterium avium compared to other types of mycobacteria in clinical material, wherein (a) microbial DNA is extracted from the clinical material and then
  • At least one fragment of the 16S rRNA gene from the microbial DNA is amplified with a primer pair comprising the nucleotide sequences SEQ ID NO: 1 / SEQ ID NO: 5 or with two primer pairs, the one primer pair containing the nucleotide sequences SEQ ID NO: 2 / SEQ ID NO: 3 and the other pair of primers is used immediately before or after or simultaneously and the nucleotide sequences include SEQ ID NO: 4 / SEQ ID NO: 5, is amplified and then
  • the at least one amplified 16S rRNA gene fragment is detected by means of at least one pair of labeled hybridization probes which hybridize with hypervariable species-specific regions of the 16S rRNA fragment of mycobacteria, the pair of labeled hybridization probes for detection of the M. tuberculosis complex includes the nucleotide sequences SEQ ID NO: 6 / SEQ ID NO: 7 or the pair of complementary sequences thereof, and the pair of labeled hybridization probes for the detection of M.
  • avium contain the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 8 / SEQ ID NO: 9 or the pair of the complementary sequences thereof, and then, simultaneously or immediately before (d) the at least one amplified 16S rRNA gene fragment is detected by means of a pair of labeled hybridization probes which hybridizes with the genus-specific region III of the 16S rRNA fragment, the pair having the nucleotide sequences SEQ ID NO: 10 / SEQ ID NO: 11 or the pair of complementary sequences thereof, and wherein
  • steps (e) the specific detection of the mycobacteria genus, and the detection of the M. tuberculosis complex and / or of M. avium in steps (c) and (d) is carried out by means of melting curve analysis.
  • the invention therefore advantageously provides that the detection of mycobacteria as a genus together with the species-specific detection of M. tuberculosis complex is made possible in a uniform common procedure.
  • the invention also enables a common uniform specific detection of the genus Mycobacterium together with the species-specific detection of M. avium.
  • the invention also enables the joint specific detection of bacteria of the genus ycojacterium together with the species-specific detection of M. tuberculosis complex and M. avium.
  • a major advantage of the method according to the invention is that in the combined detection method used to diagnose mycobacterial infections, both an existing mycobacterial infection compared to other microbial infections and an existing tuberculosis compared to non-tuberculous infections are clear and reliable can be recognized. This proof was not possible in such an advantageous manner according to the prior art.
  • the unequivocal detection of a mycobacterial infection compared to other microbial infections takes place by analyzing the melting temperatures of the hybridization of the genus-specific hybridization probe pair, which contains the nucleotide sequences SEQ ID NO: 10 / SEQ ID NO: 11 or the pair of the complementary sequences thereof, with the Genus-specific region III of the 16S rRNA gene took place.
  • mycobacterial strains are characterized by melting temperatures of at least 55 ° C., in particular 55 ° C. and 61.5 ° C.
  • the mycobacterial strain M. chelonae can be clearly identified compared to all other mycobacterial strains, which in particular have a melting temperature of 61.5 ° C, and a mycobacterial infection by M. chelonae can be detected ,
  • the method according to the invention permits, in addition to the clear and reliable detection of a tuberculous infection, the clear and reliable detection of a non-tuberculous infection triggered by M. avium.
  • strains of the M. tuberculosis complex are distinguished by melting temperatures of at least 55 ° C., in particular 64 ° C.
  • the unequivocal detection of a tuberculous infection by M. avium takes place by analyzing the melting temperatures of the hybridization of the type-specific hybridization probe pair for M. avium, the nucleotide sequences SEQ ID NO: 8 / SEQ ID NO: 9 or the pair of complementary sequences of which includes the species-specific region of the 16S rRNA gene.
  • M. avium is characterized by melting temperatures of at least 55 ° C., in particular 6.1 ° C.
  • the above-mentioned method is preferably carried out with an internal standard according to the invention in the form of artificial plasmids, control plasmids, for identifying so-called “false-negative” findings.
  • a first part of the extracted microbial DNA complies with the aforementioned Method with steps (a) to (e) is subjected and a second part of the extracted microbial DNA in a parallel to the aforementioned method approach (a ') is mixed with at least one artificial plasmid, preferably subcloned in pGEM-T, which serves as an internal standard, the artificial plasmid comprising a genus-specific region III of the 16S rRNA with a modified nucleotide sequence, and then
  • the multiplied 16S rRNA fragments are detected by means of a pair of labeled hybridization probes which hybridize with the modified genus-specific region III, the pair of labeled hybridization probes comprising the nucleotide sequences SEQ ID NO: 10 / SEQ ID NO: 11 and where (d ') during the detection the specific detection of the 16S rRNA fragments of mycobacteria and the modified 16S rRNA fragments of the internal standard is carried out by means of melting curve analysis.
  • steps (a), (b), (c), (d) and (e) of the aforementioned method are carried out, the at least one artificial plasmid in step (a) using the total extracted microbial DNA is mixed and, after application according to step (b), the detection and melting curve analysis to detect the multiplied 16S rRNA fragments of mycobacteria and the modified 16S rRNA fragments of the internal standard, in particular simultaneously, according to steps (c ') and (d') is carried out.
  • control plasmid in the detection method according to the invention, it is advantageously possible to check the success of the amplification reaction already during the detection reaction of mycobacteria in order to obtain a reliable and clear result particularly quickly.
  • so-called “false-negative” findings in the case of inhibition of amplification are practically excluded by using the plasmid according to the invention as an internal standard.
  • the specificity and selectivity of the method according to the invention are thus significantly increased compared to the prior art.
  • the formulations “comprising a primer pair or comprising the nucleotide sequences”, “comprising a pair of hybridization probes or comprising the nucleotide sequences” or the like mean that the respective nucleotide sequences or the pair of nucleotide sequences each have the nucleotide sequences referred to / has, that is to say that these nucleotide sequences or the pair thereof consist / consist of the specifically named nucleotide sequence alone or optionally comprise / comprise further sequences.
  • Mycojacteriu-n tuberculosis complex refers to the tuberculous mycobacterial species Mycobacterium tuberculosis, in particular the strain H37Rv, and Mycobacterium bovis, in particular the R99 strain, these strains causing the disease tuberculosis, and the BCG Pasteur strain of Mycobacterium bovis.
  • the term "tubercular” describes a property which relates to Mycobacterium tuberculosis, in particular the strain H37Rv, and Mycobacterium bovis, in particular the strain R99, in the narrower sense and to the strain BCG Pasteur of Mycobacterium bovis in refers to the wider sense and causes the clinical picture of tuberculosis.
  • Mycobacterium avium is understood to mean the non-tuberculous Mycobacterium species Mycobacterium avium, in particular the strain ATCC35712, and their subspecies Mycobacterium paratuberculosis, in particular the strain Pat.6783.
  • non-tuberculous is understood to mean a property which is related to a disease other than tuberculosis and is in particular a mycobacteriosis.
  • clinical material is understood to mean clinical samples such as sputum, bronchial lavage, gastric juice, urine, stool, cerebrospinal fluid, bone marrow, blood or biopsies, in particular punctate biopsies, for example from cervical lymph nodes.
  • modified nucleotide sequence is understood to mean a nucleic acid sequence which is derived from its original sequence, ie the wild-type sequence, by exchange, inversion, deletion or addition of at least one nucleotide, including an unusual or synthetic nucleotide , in at least one nucleotide, preferably in two nucleotides.
  • modified is understood to mean a property which relates to a "modified nucleotide sequence”.
  • the amplification of the gene fragments of the 16S rRNA gene is carried out by means of the polymerase chain reaction (PCR).
  • the amplification is preferably carried out by real-time PCR (rapid cycle PCR).
  • real-time PCR rapid cycle PCR
  • the amplification is particularly preferably carried out in a LightCycler TM system from Röche Molecular Biochemicals, which is an embodiment of the real-time PCR.
  • the PCR starting mixture in addition to the polymerase, the nucleotides, the buffer solutions and the primers, also hybridization probes which specifically bind to the desired PCR amplification products are added.
  • two sequence-specific oligonucleotide probes are used, which are labeled with different dyes.
  • the sequences of the Labeled hybridization probe pairs according to the invention are selected such that they hybridize to the target sequences of the amplified DNA fragment in such a way that in particular the 3 'end of one probe is close to the 5' end of the other probe, as a result of which the two dyes be brought into close proximity to one another, in particular the distance between the two probes is between 1 and 5 nucleotides.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the FRET system quantitative measurements of the amount of amplified DNA fragments are provided by the FRET system.
  • the hybridization probes selected according to the invention can bind quantitatively, ie stoichiometrically, to the amplified fragments.
  • the quantitative hybridization is particularly dependent on the temperature and the degree of homology of the oligonucleotide probes used with the detected sequence on the amplified fragment.
  • the aforementioned fluorimetric detection of specific DNA sequences in the amplified fragments is carried out after amplification of the fragments by means of conventional PCR.
  • the fluorimetric de- tection carried out in a real-time PCR during the amplification reactions for example the increase in DNA produced can be tracked as an increase in the fluorescence signal.
  • the specific detection of species-specific and / or genus-specific regions in the amplified DNA fragment takes place after the end of the amplification reaction, the hybridization probe pair, preferably a FRET pair, being hybridized the regions to be detected, the temperature is changed in the course of a melting curve analysis, preferably continuously increased, and at the same time the fluorescence emitted as a function of the temperature is measured. In this way, a melting temperature is determined at which the hybridization probes, in particular the FRET pair used, no longer hybridize to the region of the amplified DNA fragment to be detected.
  • the essential aspect of a melting curve analysis is that if there are mismatches between the pair of hybridization probes used and the target region on the approved DNA fragment, the measured melting point is reduced.
  • the regions of DNA fragments whose sequences differ only slightly, in particular by one or a few point mutations, in the nucleotide sequence are identified with hybridization probes, in particular with a FRET pair.
  • the 16S rRNA gene of mycobacteria advantageously has both conserved and highly variable regions which, for example, permit genus-specific amplification of DNA fragments using genus-specific primers.
  • the aforementioned methods of fluorescence detection are therefore used in conjunction with the melting curve analysis for the specific detection of the genus-specific region III and the hypervariable species-specific regions of the M. tuberculosis complex and M. avium on the 16S rRNA gene.
  • primer pairs are additionally shown schematically, which are used to amplify the selected species-specific or genus-specific regions.
  • the primer pair comprising the nucleotide sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 5 is used to amplify the gene-specific region III 16S rRNA gene from mycobacteria.
  • the primer pair consists of degenerate or mutated sequences or fragments thereof, each of which hybridizes with the nucleotide sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 5, from which they are derived, where in each case there is a degree of homology of at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%.
  • the 1000 bp long fragment amplified with the aforementioned primer pair contains both the conserved genus-specific region III and the highly variable species-specific regions of the M. tuberculosis complex and M. avium.
  • the additional or alternative use of two further primer pairs is also provided, a primer pair amplifying a 300 bp fragment in particular of the l ⁇ S rRNA gene from mycobacteria which contains specific regions of the M. tuberculosis complex and M. avium, this primer pair consisting of the nucleotide sequences SEQ ID NO: 2 / SEQ ID NO: 3, and the second primer pair amplifying a 100 bp long fragment of the same gene which amplifies the Contains genus-specific region III, this primer pair comprising the nucleotide sequences SEQ ID NO: 4 / SEQ ID NO: 5.
  • the two primer pairs consist of the pairs of degenerate or mutated sequences or fragments thereof, each with the nucleotide sequence pairs SEQ ID NO: 2 / SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 / SEQ ID NO: hybridize 5, of which they are derived, in each case a degree of homology of at least 90 1%, preferably at least 95%, more preferably consists of at least 98%.
  • a pair of labeled hybridization probes is used to detect the aforementioned amplified 16S rRNA fragments of mycobacteria which contain the genus-specific region III and / or the species-specific regions of the M. tuberculosis complex and M. avium of the conserved genus-specific region III, which pair contains the nucleotide sequences SEQ ID NO: 10 / SEQ ID NO: 11 or the complementary sequences thereof.
  • the detection of the aforementioned '16S rRNA fragments containing the species-specific regions is carried out with at least one pair of labeled hybridization probes, the labeled hybridization probe pairs preferably being in the form of FRET pairs.
  • the type-specific hybridization probe pairs according to the invention are used for the specific detection of the mycobacterial species M. tuberculosis complex and M.
  • the rhodamine derivative is LightCycler-Red 640; in further preferred variants of the aforementioned embodiment, the rhodamine derivative is LightCycler-Red 705; in further preferred variants of the aforementioned embodiment, the rhodamine derivative is Cy5.
  • the same donor-acceptor dyes are used for labeling the hybridization probe pairs, preferably fluorescein / LightCycler-Red 640, the melting curve analysis using the species-specific probe pair to detect mycobacteria in time or spatially separated from the melting curve analysis using one of the species-specific hybridization probe pairs for the detection of the M. tuberculosis complex or of M. avium, in particular in parallel approaches.
  • the melting curve analysis using the species-specific probe pair for the detection of mycobacteria preferably with fluorescein / LightCycler-Red 640 is marked, temporally and spatially together in an approach with melting curve analysis with one of the species-specific hybridization probe pairs, which is preferably labeled with Fluorescein / LightCycler-Red 705, for the detection of the M. tuberculosis complex or of M. avium takes place, preferably in LightCycler TM system the fluorescence of the genus-specific probe pair with one photodetector channel and the fluorescence of a species-specific probe pair with the second photodector channel is registered.
  • another object of the present invention are oligonucleotide primer pairs for the duplication of 16S rRNA fragments from extracted bacterial DNA for the specific detection of mycobacteria and for the differentiation of the Mycobacterium tuberculosis complex and Mycobacterium avium from other types of mycobacteria in clinical material, whereby a A pair of primers comprising nucleotide sequences SEQ ID NO: 2 / SEQ ID NO: 3 or a pair of degenerate or mutated nucleotide sequences or fragments thereof.
  • degenerate or mutated nucleotide sequences have the property of hybridizing in each case with the sequences SEQ ID NO: 2 / SEQ ID NO: 3, with a degree of homology of at least 90%, preferably at least 95%, particularly preferably at least 98%. , is preferred.
  • the invention also relates to a second pair of primers with a primer with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 4 or a degenerate or mutated nucleotide sequence or a fragment thereof which hybridizes with the sequence SEQ ID NO: 4, a degree of homology of at least 90%, preferably of at least 95%, particularly preferably at least 98% is preferred.
  • another object of the present invention are oligonucleotide hybridization probe pairs for the specific detection of mycobacteria and for differentiating the Mycobacterium tuberculosis complex and Mycobacterium avium from other mycobacterial species in clinical material, selected from the group consisting of the nucleotide sequences SEQ ID NO: 10 / SEQ ID NO: 11 or the pair of complementary sequences thereof, the nucleotide sequences SEQ ID NO: 6 / SEQ ID NO: 7 or the pair of complementary sequences thereof and the nucleotide sequences SEQ ID NO: 8 / SEQ ID NO: 9 or the pair of complementary sequences thereof.
  • another object of the present invention is an artificial plasmid, control plasmid, preferably obtained by subcloning the 16S rRNA gene in pGEM-T, which acts as an internal control of the amplification (inhibition control) and the specific detection of 16S -rRNA fragments of mycobacteria and contains a nucleic acid sequence of the modified genus-specific region III of the 16S rRNA gene.
  • the control plasmid according to the invention is preferably by nucleotide exchange, nucleotide addition, nucleotide deletion and / or nucleotide inversion of at least one nucleotide, preferably two nucleotides, of the wild-type nucleic acid sequence of the genus-specific region III of the 16S rRNA. Gene derived.
  • the artificial plasmid comprises the nucleotide sequence SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15, in each case one nucleotide compared to the wild-type sequence is exchanged. Particularly surprisingly, it was found that the replacement of the one nucleotide resulted in a reduction in the melting temperature of the genus-specific hybridization probes of approximately 1 ° C.
  • the artificial plasmid comprises the nucleotide sequence SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17, in each of which two nucleotides are exchanged for the wild-type sequence.
  • the replacement of the two nucleotides leads to a reduction in the melting temperature of the genus-specific hybridization probes of approximately 14.5 ° C.
  • the present invention furthermore relates to a diagnostic kit for the specific detection of a mycobacterial infection and of M. tuberculosis and M. avium in clinical material according to the methods according to the invention, the at least one polymerase, at least one, preferably all of the aforementioned primer pairs and comprises at least one, preferably all, of the aforementioned hybridization probe pairs.
  • the diagnostic kit preferably additionally comprises at least one artificial control plasmid according to the invention as an internal standard.
  • SEQ ID NO: 2 "sense" primer ("forward" primer) of the primer pair for the amplification of a 300 bp fragment of the 16S rRNA gene of mycobacteria, containing the species-specific regions of the M. tuberculosis complex and by M. avium,
  • SEQ ID NO: 3 "antisense” primer ("reverse” primer) of the primer pair for the amplification of a 300 bp fragment of the 16S rRNA gene from mycobacteria, containing the species-specific regions of the M. tuberculosis complex and by M. avium,
  • SEQ ID NO: 4 "sense" primer ("forward” primer) 'of the primer pair for the amplification of a 100 bp fragment of the 16S rRNA gene of mycobacteria, containing the genus-specific region III of the genus Mycobacterium,
  • SEQ ID NO: 5 "antisense” primer ("reverse” primer) a) of the primer pair for the amplification of a 1000 bp fragment of the 16S rRNA gene from the mycobacteria, containing the species-specific regions of the M. tuberculosis Complex and of M.
  • SEQ ID NO: 7 "sense" hybridization probe, in particular acceptor component, of the probe pair for the detection of the species-specific region of the M. tuberculosis complex
  • SEQ ID NO: 8 "antisense" hybridization probe, in particular donor component, of the probe pair for detection of the species-specific region of M. avium,
  • SEQ ID NO: 9 “sense” hybridization probe, in particular acceptor component, of the probe pair for detecting the species-specific region of M. avi um, ⁇
  • SEQ ID NO: 10 "antisense" hybridization probe, in particular donor component, of the probe pair for the detection of the genus-specific region III of the genus Mycobacterium,
  • SEQ ID NO: 11 "sense" hybridization probe, in particular acceptor component, of the probe pair for the detection of the genus-specific region III of the genus Mycobacterium,
  • SEQ ID NO: 14 modified "sense" primer ("forward" primer) for the amplification of a complete control plasmid, containing a modified genus-specific region III of the 16S rRNA gene of mycobacteria,
  • SEQ ID NO: 15 modified "antisense” primer ("reverse” primer) for the amplification of a complete control plasmid, containing a modified genus-specific region III of the 16S rRNA gene of mycobacteria,
  • SEQ ID NO: 17 modified "antisense" primer ("reverse” primer) for the amplification of a further complete control plasmid, containing a further modified genus-specific region III of the 16S rRNA gene of mycobacteria.
  • FIG. 1 Schematic representation of the 16S rRNA gene of mycobacteria (length: 1523 bp), the position of the species-specific regions, "species (A)” and “species (B)", and the genus-specific regions “genus I”, “genus II” and “genus III”, and the location and size of the means the
  • Primer pairs (1) and (5), (2) and (3) and (4) and (5) amplified fragments.
  • Figure 3 Modified 16S rRNA fragment as an internal standard (pJL6): melting curves of the hybridization of the genus-specific hybridization probes with the genus-specific region III and the modified genus-specific region III of the internal standard (pJL6) with a different number of genomes - pien of the genus-specific region III.
  • Figure 4 Modified 16S rRNA fragment as an internal standard (pJL6): melting curves of the hybridization of the genus-specific hybridization probes with the genus-specific region III and the modified genus-specific region III of the internal standard (pJL6) in the presence of different amounts of "background" DNA from E. coli.
  • Microbial DNA is purified from clinical samples consisting of sputum, bronchial lavage, gastric juice, urine, stool, cerebrospinal fluid, bone marrow, blood or punctate biopsies in a manner known per se, for example using a Qiamp TM MiniKit (company Qiagen, catalog No. 51306) , that is extracted. Chromosomal DNA is quantified using the PicoGreen TM system (Molecular Probes).
  • Microbial DNA of different cultures of microorganisms is isolated in particular for evaluating the detection methods according to the invention.
  • microbial DNA is isolated from these cultures.
  • the microbial DNA is then purified in a manner known per se, for example using a Qiamp TM MiniKit (company Qiagen, catalog no. 51306), that is to say extracted.
  • Chromosomal DNA is quantified in a manner known per se, for example using the PicoGreen TM system (Molecular Probes).
  • the primer pair a) SEQ ID NO: 1 / SEQ ID NO: 5 is used for the amplification, which amplifies a 1000 bp fragment of the 16S rRNA containing the genus-specific region III and the species-specific regions.
  • the two primer pairs b) are used simultaneously in a multiplex PCR batch, in parallel batches or at different times, the primer pair containing SEQ ID NO: 2 / SEQ ID NO: 3 being 300 bp long Fragment of the 16S rRNA containing the species-specific regions, amplified and used for the subsequent detection of the M. tuberculosis complex and / or M. avium, and wherein the primer pair containing SEQ ID NO: 4 / SEQ ID NO: 5 a 100 bp fragment of the 16S rRNA containing the genus-specific region III, amplified and used for the subsequent detection of a mycobacterial infection.
  • the pair of probes c) SEQ ID NO: 10 / SEQ ID NO: 11 or a complementary or mutated or degenerate pair thereof is used for the detection of the genus-specific region III. If the M. tuberculosis complex is only to be detected in the method according to the invention in addition to the genus-specific detection, the pair of probes d) SEQ ID NO: 6 / SEQ ID NO: 7 or their equivalents, ie mutated or complementary pairs thereof, are used. On the other hand, if only mycobacteria of the type M.
  • the probe pair e) SEQ ID NO: 8 / SEQ ID NO: 9 or their equivalents, ie mutated or complementary pairs thereof, are used. If both the M. tuberculosis complex and M. avium are to be detected together with the genus-specific region III, both probe pairs d) and e) are used in addition to the probe pair c).
  • This reaction mixture is brought into the glass capillaries of the LightCycler TM system by pulse centrifugation and the amplification according to the "hot start" principle is carried out after an initial denaturation at 95 ° C. for 10 minutes with the following steps: 1. Denaturation at 95 C for 3 seconds
  • Steps 1 to 3 are carried out cyclically a total of 50 times, with the hybridization in step 2 taking place at 68 ° C. for the first 5 cycles and the temperature being reduced to 62 ° C. in steps of 1 ° C. per cycle in the subsequent 6 cycles and is carried out at 62 ° C for the remaining cycles.
  • the rate of temperature change in all steps is 20 ° C per second.
  • the FRET-labeled hybridization probe pairs used in the reaction mixture are used to detect the amplified fragments, one hybridization probe partner in each case
  • SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8
  • SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9
  • LightCycler TM -Green 640 is associated with LightCycler TM -Green 640 as acceptor component on the 5 'terminal nucleotide.
  • the melting curve analysis carried out in the course of the detection begins with the denaturation of the amplified fragments at 95 ° C. for 30 seconds, followed by hybridization with the aforementioned FRET pairs at 38 ° C. for 30 seconds. To determine Following the melting curve of the hybridization, the temperature is then continuously increased from 38 ° C. to 80 ° C. at a rate of 0.2 ° C./sec, the fluorescence emitted by the FRET pairs being continuously recorded. Version 3.5.3 of the LightCycler "Run Profile" program is used to evaluate the fluorescence signal, with the gain of the F2 channel of the photometric detector of the LightCycler TM system being set automatically.
  • the entire 16S rRNA gene of mycobacteria (1523 bp) is first included amplified a pair of PCR primers, the “sense” primer consisting of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 12 and the “antisense” primer consisting of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 13.
  • the “sense” primer consisting of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 12
  • the “antisense” primer consisting of the nucleotide sequence SEQ ID NO: 13.
  • the genus-specific region III of the 16S rRNA contained in the artificial plasmid should differ from the wild-type nucleotide sequence of the genus-specific region III by at least one point mutation.
  • modified primer pairs are used for the multiplication of the plasmids containing the subcloned fragments, in which one or two nucleotides in the nucleotide sequences were exchanged for the wild-type nucleotide sequences ,
  • primer pairs derived from the wild-type sequence of the genus-specific region III, in particular from the region binding the acceptor component of the FRET pair according to the invention, SEQ ID NO: 11, are used for this purpose: a) Exchange of a nucleotide:
  • nucleotide sequences according to the invention of the aforementioned modified primer pairs the underlined nucleotide was replaced in each case by the wild-type sequence of the genus-specific region III.
  • control plasmids with the modified primer pairs is in each case in a "long range” PCR with a Pfu polymerase, type: "Pfu Turbo Hot Start DNA” (Stratagene) in a manner known per se in a "hot start” PCR procedure carried out with 18 cycles of the following steps:
  • Results a) The amplicons obtained are additionally purified using a gel and the point mutations can then be confirmed by sequencing.
  • a control plasmid is obtained by using the primers SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 according to the invention which contains a 16S rRNA fragment modified by exchanging two nucleotides. 50 copies of the control plasmid are mixed as an internal standard with different numbers of gene copies of the 16S rRNA gene from M. tuberculosis and subjected to the detection method according to Example 1. Result :
  • This internal standard can therefore also be used if • it can be expected that the number of gene copies to be detected in the clinical material will be an order of magnitude less than the number of plasmid copies used as the internal standard.
  • a control plasmid (which contains a 16S rRNA fragment modified by exchanging two nucleotides) is obtained by using the primers SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 according to the invention. 50 copies of the control plasmid and 10 gene copies of the 16S rRNA gene from M. tuberculosis are mixed with different amounts of "background" DNA from E. coli in the range from 1 pg to 200 ng and then according to the detection method Example 1 subjected. Result :
  • the detection method according to the invention in particular using this internal standard, is thus also possible if it can be expected that a large amount of foreign DNA, “background” DNA, is present in the isolated clinical material.
  • Example 3 Assessment of the performance of the detection method according to the invention on the LightCycler TM system
  • genomic DNA of the bacterial strain Mycobacterium bovis BCG of the M. tuberculosis complex is used as a “template”.
  • Example 4 Specific amplification of 16S rRNA fragments from mycobacteria (according to the invention)
  • Example 1 In a first approach according to Example 1, a 100 bp fragment of the genus-specific region III (SEQ ID NO: 4 / SEQ ID NO: 5) and a 300 bp fragment of the species-specific regions (SEQ ID NO: 2 / SEQ ID NO: 3) amplified. In a second approach according to Example 1, a 1000 bp long fragment, which contains both the genus-specific region III and the two species-specific regions, is amplified with the corresponding primer pair (SEQ ID NO: 1 / SEQ ID NO: 5).
  • the 1000 bp fragment amplified with the primer pair SEQ ID NO: 1 / SEQ ID NO: 5 is used in the detection method according to the invention (Example 1).
  • a dilution series of the M. avium genome is prepared and a melting curve analysis of the amplified fragments is carried out with the corresponding hybridization probe pairs.
  • a 1000 bp fragment of the 16S rRNA gene is amplified with the genus-specific primer pair SEQ ID NO: 1 / SEQ ID NO: 5.
  • a melting curve analysis of the amplified fragments using the hybridization probe pair SEQ ID NO: 10 / SEQ ID NO: 11, specific for the genus-specific region III, is carried out.
  • the melting point of amplified 16S rRNA fragments of the genus Corynebacterium is 43 ° C, or no hybridization signal can be detected at all.
  • genomic DNA from the microorganisms listed in Table 1 are first used, and each 1000 bp fragment is amplified.
  • a melting curve analysis of the amplicons is then carried out using the species-specific hybridization probe pair SEQ ID NO: 6 / SEQ ID NO: 7.
  • the melting temperature for the types of the M. tuberculosis complex is a uniform 64 ° C
  • the melting temperature for all non-tuberculous pathogens is between 43.5 ° C and 54 ° C, if a hybridization signal can be detected at all (Table 1) ,
  • tubercular pathogens can be selectively detected compared to all other non-tubercular pathogens.
  • genomic DNA of the microorganisms listed in Table 1 are used first and a 1000 bp long fragment is amplified in each case.
  • a melting curve analysis of the amplicons is then carried out using the species-specific hybridization probe pair SEQ ID NO: 8 / SEQ ID NO: 9. Result :
  • the melting temperature for M. avium is a uniform 61 ° C
  • the melting temperature for all other pathogens is between 43 ° C and 54 ° C, if a hybridization signal can be detected at all (Table 1).
  • the non-tuberculous M. avium pathogen can be selectively detected compared to all other pathogens.
  • Example 7 Comparative example for the specificity of the genus-specific detection by means of the genus-specific region II ("genus II")
  • Example 8 Quantitative determination of the mycobacterial content in clinical samples (according to the invention)
  • the degree of fluorescence in this wavelength range is a function of the amount of DNA present and detected in the sample under certain conditions.
  • the FRET system enables quantitative measurements of the amount of amplified DNA fragments if the selected hybridization probes bind quantitatively, ie stoichiometrically, to the amplified fragments.
  • the standard is measured separately from the samples to be examined, using at least five different concentrations to create a standard curve. If the plasmid pIJ6 is used, a concentration of the standard can be used in each sample examined.
  • the distinction between standard and "target DNA" is based on the different melting point.
  • the standard serves in particular as a control that the amplification was not inhibited by interference factors (inhibition control).
  • the FRET-labeled hybridization probe pairs used in the reaction mixture are used to detect the amplified fragments.
  • the amplification reaction proceeds as in Example 1, with the fluorescence being measured after each amplification step.
  • the optimal annealing temperature is 62 ° C.
  • the melting point analysis is carried out unaffected after completion of the amplification reaction as in Example 1 c). Table 1:

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein molekularbiologisches Verfahren zum spezifischen Nachweis von Mykobakterien und zur Differenzierung des Mycobakterium tuberculosis-Komplex und Mycobakterium avium von anderen Mykobakterien in klinischem Material mittels Amplifikationsprimer und Oligonucleotidsonden, die spezifisch für die Gattungs- und Art-spezifischen Regionen des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien sind.

Description

Nachweis von Mykobakterien in klinischem Material
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von Mykobakterien und zur Differenzierung des Mycobacterium tuberculosis- Komplex und Mycobacterium avium von anderen Myko- bakterien in klinischem Material.
Die Tuberkulose ist eine weltweit verbreitete Infektionskrankheit, die chronisch verläuft und jährlich mehr Menschen das Leben kostet als irgendeine andere bakterielle Infektion.
Die Tuberkulose ist insbesondere in der Lunge lokalisiert, seltener in Halslymphknoten, Darm oder Haut. Die sehr unterschiedlichen klinischen Verläufe der Tuberkulose machen daher eine exakte Beschreibung des Krankheitszustands und eine schnelle Diagnose insbesondere zu frühen Erkrankungsstadien notwendig.
Erreger der Tuberkulose sind die Arten: Mycobacteri um tuberculosis und sehr selten Mycobacterium bo- vis. Diese tuberkulösen Erreger werden allgemein unter dem Begriff „Mycobacterium tuberculosis- Komplex" zusammengefasst .
Eine Folgeerscheinung der chronischen Tuberkulose, die insbesondere durch Streuung der tuberkulösen Erreger im gesamten Organismus ausgelöst wird, • ist beispielsweise die Meningitis tuberculosa , die durch Lumbaipunktion diagnostiziert werden kann, wobei allein die eindeutige und frühzeitige Diagnose und die anschließende gezielte intensive Thera- pie lebensrettend sind. Weitere Folgeerscheinungen lassen sich ebenfalls nur durch eine eindeutige und frühzeitige Diagnose erkennen oder bereits verhindern: Pleuritis tuberculosa, Peritonitis tuberculosa , Hauttuberkulose, Knochentuberkulose, Gelenktu- berkulose und Urogenitaltuberkulose. Insbesondere die Urogenitaltuberkulose zeichnet sich durch einen schleichenden, symptomarmen Verlauf aus und lässt sich daher oft nicht sofort als solche erkennen, weshalb eine eindeutige und frühzeitige Diagnose bei Patienten notwendig ist.
In den meisten Industrienationen besteht sofortige Meldepflicht bei einer Erkrankung, nicht zuletzt um so schnell wie möglich eine Ausbreitung in der Bevölkerung zu verhindern. In einigen Entwicklungs- ländern wie Afrika, Asien oder Ozeanien liegt die durchschnittliche Inzidenz bei 200 jährlichen Neuerkrankungen auf 100000 Einwohner. In Westeuropa liegt die durchschnittliche Inzidenz immerhin bei 30 jährlichen Neuerkrankungen pro 100000 Einwohner, in der Bundesrepublik Deutschland bei ca. 20.
In den letzten Jahren kann ein vermehrtes Auftreten von Tuberkulose sowohl in den Entwicklungsländern als auch in den Industrienationen beobachtet werden, wobei vor allem bei immunsupprimierten HIV- Patienten dadurch regelmäßig Todesfälle verzeichnet werden (8) . Es wird angenommen, dass zur Zeit ein Drittel der Weltbevölkerung mit dem Mycobacterium tuberculosis- Komplex infiziert ist. Jedoch nicht nur wegen der allgemeinen Gefahr für große Teile der Weltbevölke- rung, sondern auch wegen des inzwischen epidemieartigen Auftretens von mehr ach-resistenten Bakterienstämmen (MDRTB) innerhalb oder außerhalb von Krankenhäusern wird die schnelle und eindeutige Diagnose zum Nachweis dieser Bakterienstämme gefor- dert (9, 14).
Durch die HIV-Epidemie der letzten Jahrzehnte als „Nährboden" zur Verbreitung von Infektionskrankheiten vermehrte sich außerdem auch das epidemiologische Auftreten von nicht-tuberkulösen Mykobakterien (4) . Bei durch nicht-tuberkulöse Mykobakterien verursachten Infektionen sind ähnlich einer „echten" Tuberkulose Organe wie Lunge, Lymphknoten im Halsbereich oder die Haut betroffen. Selten kommt es zu einer Streuung der nicht-tuberkulösen Erreger in den gesamten Organismus, wobei Folgeerscheinungen ähnlich wie bei einer „echten" Tuberkulose beobachtet werden können. Nicht-tuberkulöse Mykobakterien führen bei Patienten, die beispielsweise an zystischer Fibröse erkrankt sind, zu einer zusätzlichen Verschlechterung des Krankheitsbildes im Bereich der Lunge (1, 2, 16) .
Zu den nicht-tuberkulösen Mykobakterien, die in der klinischen Praxis beobachtet werden, zählen: Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, My- cobacterium kansasii, Mycobacterium marinum, Mycobacterium fortui tum, Mycobacterium chelonae und Mycobacterium abscessus (4) . Die Diagnostik von Mykobakterien in klinischem Material sollte idealer Weise einen spezifischen Nachweis von tuberkulösen und von nichttuberkulösen Mykobakterien erlauben.
In den letzten Jahren wurden zur klinischen Diagnose von Mykobakterien im Labor verstärkt molekularbiologische Techniken basierend auf einer Nuclein- säure-Vervielfachung, insbesondere Amplifikation, wie der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt. PCR-Verfahren zur Amplifikation einer Vielzahl verschiedener chromosomaler DNA-Fragmente wurden zur Detektion von sowohl Gattungs-spezifischen als auch von M. tuberculosis-spezifischen DNA-Regionen eingesetzt (15) .
Gattungs-spezifische Verfahren werden eingesetzt, um eine Mykobakterieninfektion gegenüber anderen Infektionen abzugrenzen. Bekannte Gattungsspezifische Verfahren zielen dabei auf das 16S- rRNA-Gen oder das Gen des 65 kDa-„heat shock"- Proteins. Eine anschließende spezifische Identifikation einiger Mykobakterienarten wird mit konservierten Hybridisierungssonden durchgeführt (5, 12) . Alternativ werden die amplifizierten Gene sequenziert (6) oder es wird eine Analyse mittels Re- striktionsenzymen durchgeführt (15) .
Zu den spezifischen DNA-Regionen, die zum Artspezifischen Nachweis des M. tuberculosis-Koiψlex mittels PCR eingesetzt werden, zählen beispielsweise IS 6110, die Gene des 38 kDa-Proteins, die Gene des MBP 64-Proteins sowie die Regionen mtp40 oder pMTb4. Abgesehen von diesen individuellen Laborverfahren existieren kommerziell erhältliche Diagnosekits, die meist ausschließlich zur Diagnose des M. tuber- cu-losis-Komplex geeignet sind. Bekannte Kits werden beispielsweise von Roche-Amplicor™, Geneprobe™ oder Abbot™ angeboten.
Die molekularbiologischen Verfahren, die zu diesem Zweck durchgeführt werden, beinhalten einerseits die Vervielfältigung der nachzuweisenden Nuclein- säure (Targetamplifikation) , beispielsweise durch die PCR, durch die Transkriptions-basierte isotherme DNA-Synthese (TMA) , durch die Ligase- Kettenreaktion (LCR) oder durch die isotherme Strangverdrängungs-Amplifikation (SDA) , anderer- seits die Vervielfältigung der signalgebenden Komponente (Signalamplifikation) , wie durch die isotherme Qß-Replikation.
Bezeichnend für die heutige Situation ist die Tatsache, dass es bis jetzt noch keine Methode gibt, die als allgemein anerkannter Diagnose-Standard akzeptiert ist. Der Nachweis von Mykobakterien mit Hilfe von molekularen Methoden wird in Deutschland inzwischen zweimal pro Jahr durch eine nationale Qualitätskontrolle überprüft. In diesen Ringversu- chen zeigten sich Schwächen bei den kommerziell erhältlichen Diagnosekits und bei verschiedenen Eigenentwicklungen, vor allen bei der Anwendung mit stark verdünnten Proben. Es wird davon ausgegangen, dass es sich hierbei um systematische Schwächen der jeweils zugrunde liegenden Nachweisreaktionen handelt. Daher werden alle bisher bestehenden Methoden als unbefriedigend und deshalb verbesserungswürdig angesehen.
Weitere wesentliche Nachteile der kommerziell erhältlichen Verfahren sind insbesondere (a) eine fehlende Möglichkeit der Unterscheidung zwischen dem Mycobacterium tuberculosis-Komplex und nichttuberkulösen Mykobakterien, (b) eine mögliche unspezifische Inhibition der Amplifikationsreaktion im Nachweisverfahren bei klinischen Proben, (c) ei- ne lange Untersuchungsdauer (über mehrere Stunden) und (d) eine Beschränkung des einsetzbaren klinischen Materials insbesondere auf Proben aus dem Respirationstrakt .
Das lβS-rRNA-Gen wird bereits zum Nachweis und zur Identifizierung verschiedener humanpathogener Mykobakterien mittels PCR eingesetzt (7) . Basierend auf diesem 16S-rRNA-Nachweissystem wird ein Algorithmus zur spezifischen Vervielfältigung eines 1000 bp Fragments der mykobakteriellen 16S-rRNA mittels ei- nes unspezifischen Primers und eines Gattungsspezifischen Primers für Mykobakterien vorgeschlagen. Zur Bestätigung, ob das richtige Fragment vervielfältigt wird, werden dabei Gattungs-spezifische Oligonucleotidsonden eingesetzt, die mit dem a pli- fizierten Fragment hybridisieren. Im weiteren Verlauf werden Art-spezifische Hybridisierungssonden eingesetzt, wobei anhand desselben amplifizierten Fragments die Mykobakterienarten M. tuberculosis- Komplex und M. avium gegenüber anderen Bakterienar- ten unterschieden werden können (5) . Wesentliche Nachteile dieser mehrstufigen Verfahren bestehen darin, dass diese Nachweisverfahren auf zum Teil aufwändigen Hybridisierungsverfahren basieren und den Einsatz hochqualifizierter Personen erfordert. Darüber hinaus müssen diese Nachweisverfahren mindestens über Nacht angesetzt werden; ein Ergebnis steht also frühestens am nächsten Tag nach Probenbereitstellung zur Verfügung (5, 6) . Patienten müssen bis zum Vorliegen der Untersuchungsergebnisse meist stationär aufgenommen werden. Für die klinische Routinediagnose sind diese Verfahren daher nur sehr bedingt einsetzbar.
Aus dem Stand der Technik ist daher bisher kein für den klinischen Routineeinsatz geeignetes Verfahren bekannt, das sich insbesondere durch einfache Anwendung auszeichnet und womit es gelingt, M. tuber- culosis und M. avium schneller und spezifisch in klinischem Material wie Sputum, Bronchial-Lavage, Magensaft, Urin, Stuhl, Knochenmark, Blut oder Bi- opsien, insbesondere Punktatbiopsien, nachzuweisen und im gleichen Verfahren eine Mykobakterieninfek- tion eindeutig von anderen mikrobiellen Infektionen abzugrenzen.
DNA extrahiert aus klinischen Proben enthält Verunreinigungen, die oft dazu führen, dass die Enzymbasierte Amplifikation, insbesondere die PCR, ge- hemmt wird. So besteht bei den bisher bekannten Nachweisverfahren die große Gefahr, dass ein negatives Ergebnis erhalten wird, obwohl tatsächlich eine Mykobakterieninfektion beim Patienten vorliegt. Im schlimmsten Fall wird dadurch eine beste- hende Tuberkulose übersehen. Es besteht daher seit langem auch das Bedürfnis, ein Kontrollsystem zu entwickeln, das sogenannte „falsch-negative" Befun- de im Nachweisverfahren ausschließt (Inhibitionskontrolle) .
Es ist bekannt, dass der Einsatz der Echtzeit-PCR (Rapid-Cycle-PCR) , die beispielsweise mit einem Luft-temperierten System ausgestattet ist und somit wesentlich geringere Transitionszeiten gegenüber einer herkömmlichen PCR aufweist, zu einer deutlich verminderten Zeit bis zum Nachweis von beispielsweise M. tuberculosis führt (2) .
Darüber hinaus stellen fluorimetrische Messungen, insbesondere, wenn sie Rahmen des Echtzeit-PCR- Verfahren eingesetzt werden, eine schnelle und empfindliche Methode zum Nachweis von amplifizierten Genfragmenten dar. ,. In (3) wurde eine Echtzeit- Fluorimetrie zum Nachweis von M. tuberculosis in Expectoraten unter Verwendung des TaqMan™-Systems eingesetzt.
Das LightCycler™-System der Firma Röche Molecular Biochemicals, das eine Ausgestaltung der Echtzeit- PCR ist, wurde inzwischen ebenfalls zum Nachweis -von M. bovis in Rinderstuhl sowie zum Nachweis von Rifampin- oder Isoniazid-Resistenz-bedingten Mutationen in M. tuberculosis eingesetzt (11, 13) . In diesen beiden Studien waren die vervielfachten Fragmente typischerweise 200 Basenpaare lang. Aufgrund des hohen Durchsatzes eines LightCycler™- Systems wird nämlich bisher davon ausgegangen, dass eine Vervielfachung von größeren DNA-Fragmenten von Mykobakterien aufgrund des in Mykobakterien vorkom- menden hohen CG-Nukleotidgehaltes von ca. 65 % bis zu 75 % schwierig bis unmöglich ist. Ausgehend vom Stand der Technik besteht ein wesentlicher Nachteil der bisher bekannten Nachweisreaktionen darin, dass Mykobakterieninfektionen in klinischem Material bisher noch nicht eindeutig gegen- über nicht-mykobakteriellen Infektionen abgegrenzt werden können: Aus den Stand der Technik ist die Gattungs-spezifische Region II, „genus II", auf dem 16S-rRNA-Gen von Mykobakterien bekannt, wobei mittels eines spezifischen Hybridisierungssonden-Paars und einer Schmelzkurvenanalyse eine Vielzahl von Mykobakterienarten aufgrund eines höheren Schmelzpunktes des Sonden-Paars von anderen Bakterien- Arten und anderen Mikroorganismen unterschieden werden können (6) . Jedoch weisen auch bestimmte My- kobakterienarten wie M. triviale, M. agri , M. Xeno- pi oder M. chitae einen niedrigen Schmelzpunkt auf, so dass nach dem Stand der Technik eine eindeutige Abgrenzung der Mykobakterien von Nicht- Mykobakterien, insbesondere in einem einzigen Ver- fahrensschritt, gar nicht möglich ist.
Vor diesem Hintergrund liegt das technische Problem der vorliegenden Erfindung darin, ein verbessertes Verfahren bereitzustellen, das insbesondere einen besonders schnellen und gleichzeitig spezifischeren Nachweis von Mykobakterieninfektionen in klinischem Material verschiedenen Ursprungs und die Identifizierung der Arten M. tuberculosis-Komplex und/oder M. avium in einem gemeinsamen Nachweisverfahren ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung löst das technische Problem durch die Bereitstellung eines Verfahrens zum gemeinsamen, spezifischen Nachweis einer Mykobakte- rieninfektion und des Mycobacterium tuberculosis- Komplex und/oder von Mycobacterium avium gegenüber anderen Mykobakterienarten in klinischem Material, wobei (a) mikrobielle DNA aus dem klinischen Material extrahiert wird und anschließend
(b) mindestens ein Fragment des 16S-rRNA-Gens aus der mikrobiellen DNA mit einem Primerpaar umfassend die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5 amplifiziert wird oder mit zwei Primerpaaren, wobei das eine Primerpaar die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3 umfasst und das andere Primerpaar unmittelbar davor oder danach oder gleichzeitig eingesetzt wird und die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5 umfasst, amplifiziert wird und anschließend
(c) das mindestens eine amplifizierte 16S-rRNA- Genfragment mittels mindestens eines Paares mar- kierter Hybridisierungssonden, die mit hypervariablen Art-spezifischen Regionen des 16S-rRNA- Fragments von Mykobakterien hybridisieren, detek- tiert wird, wobei das Paar markierter Hybridisierungssonden zum Nachweis des M. tuberculosis- Komplex die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 7 oder das Paar der komplementären Sequenzen davon beinhaltet und wobei das Paar der markierten Hybridisierungssonden zum Nachweis von M. avium die Nucleotidsequenzen von SEQ ID NO: 8 /SEQ ID NO: 9 oder das Paar der komplementären Sequenzen davon beinhaltet, und anschließend, gleichzeitig oder zeitlich unmittelbar davor (d) das mindestens eine amplifizierte 16S-rRNA- Genfragment mittels eines Paars markierter Hybridisierungssonden, das mit der Gattungs-spezifischen Region III des 16S-rRNA-Fragments hybridisiert, de- tektiert wird, wobei das Paar die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11 oder das Paar der komplementären Sequenzen davon beinhaltet, und wobei
(e) der spezifische Nachweis der Mykobakterien- Gattung, und der Nachweis des M. tuberculosis- Komplex und/oder von M. avium in den Schritten (c) und (d) mittels Schmelzkurvenanalyse erfolgt.
Die Erfindung sieht vorteilhafterweise also vor, dass in einem einheitlichen gemeinsamen Verfahrens- gang der Nachweis von Mykobakterien als Gattung zusammen mit dem Art-spezifischen Nachweis von M. tuberculosis-Komplex ermöglicht wird. Die Erfindung ermöglicht auch einen gemeinsamen einheitlichen spezifischen Nachweis der Gattung Mycobacterium zu- sammen mit dem Art-spezifischen Nachweis von M. a- vium. Schließlich ermöglicht die Erfindung auch den gemeinsamen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung ycojacterium zusammen mit dem Artspezifischen Nachweis von M. tuberculosis-Komplex und von M. avium .
Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass in dem eingesetzten kombinierten Nachweisverfahren zur Diagnose von Mykobakterieninfektionen sowohl eine bestehende Mykobakterienin- fektion gegenüber anderen mikrobiellen Infektion als auch eine bestehende Tuberkulose gegenüber nicht-tuberkulösen Infektionen eindeutig und sicher erkannt werden kann. Dieser Nachweis war in so vorteilhafter Weise nach dem Stand der Technik nicht möglich.
Der eindeutige Nachweis einer Mykobakterieninfekti- on gegenüber anderen mikrobiellen Infektionen findet erfindungsgemäß durch Analyse der Schmelztemperaturen der Hybridisierung des Gattungsspezifischen Hybridisierungssonden-Paars, das die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11 oder das Paar der komplementären Sequenzen davon beinhaltet, mit der Gattungs-spezifischen Region III des 16S-rRNA-Gens statt. In den erfindungsgemäßen Nachweisverfahren zeichnen sich Mykobakterienstämme durch Schmelztemperaturen von mindestens 55°C, ins- besondere von 55°C und 61,5°C aus. In einer weiteren Variante dieses Nachweisverfahrens kann bei Auftreten der Schmelztemperatur von 55 °C der Myko- bakterienstamm M. chelonae eindeutig gegenüber allen anderen Mykobakterienstämmen, die insbesondere eine Schmelztemperatur von 61,5°C aufweisen, identifiziert und eine Mykobakterieninfektion durch M. chelonae nachgewiesen werden.
Als weiterer Vorteil erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren neben dem eindeutigen und sicheren Nach- weis einer tuberkulösen Infektion den eindeutigen und sicheren Nachweis einer nicht-tuberkulösen Infektion ausgelöst durch M. avium .
Der eindeutige Nachweis einer tuberkulösen Infektion durch Stämme des M. tuberculosis-Komplex findet erfindungsgemäß durch Analyse der Schmelztemperaturen der Hybridisierung des Art-spezifischen Hybri- disierungssonden-Paars für den M. tuberculosis- Komplex, das die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 7 oder das Paar der komplementären Sequenzen davon beinhaltet, mit der Art- spezifischen Region des 16S-rRNA-Gens statt. In den erfindungsgemäßen Nachweisverfahren zeichnen sich Stämme des M. tuberculosis-Komplex durch Schmelztemperaturen von mindestens 55°C, insbesondere von 64°C aus.
Der eindeutige Nachweis einer tuberkulösen Infektion durch M. avium findet erfindungsgemäß durch Analyse der Schmelztemperaturen der Hybridisierung des Art-spezifischen Hybridisierungssonden-Paars für M. avium, das die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 8/SEQ ID NO: 9 oder das Paar der komplementären Sequenzen davon beinhaltet, mit der Artspezifischen Region des 16S-rRNA-Gens statt. In den erfindungsgemäßen Nachweisverfahren zeichnet sich M. avium durch Schmelztemperaturen von mindestens 55°C, insbesondere von 6.1°C aus.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird das vorgenannte Verfahren mit einem erfindungsgemäßen internen Standard in Form von künstlichen Plasmiden, Kon- trollplasmiden,- zur Identifizierung sogenannter „falsch-negativer" Befunde durchgeführt. In einer Variante ist dazu vorgesehen, dass ein erster Teil der extrahierten mikrobiellen DNA dem vorgenannten Verfahren mit den Schritten (a) bis (e) unterzogen wird und ein zweiter Teil der extrahierten mikro- biellen DNA in einem zum vorgenannten Verfahren parallelen Ansatz (a') mit mindestens einem künstlichen Plasmid vorzugsweise subcloniert in pGEM-T, das als interner Standard dient, vermischt wird, wobei das künstliche Plasmid eine Gattungs-spezifische Region III der 16S-rRNA mit einer modifizierten Nucleotidse- quenz umfasst, und anschließend
(b' ) Fragmente der modifizierten 16S-rRNA-Gene mittels mindestens eines Primerpaares ausgewählt aus der Gruppe der Primerpaare bestehend aus den Nucle- otidsequenz-Paaren SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5 vervielfacht werden und anschließend
(c' ) die vervielfachten 16S-rRNA-Fragmente mittels eines Paars markierter Hybridisierungssonden detek- tiert werden, die mit der modifizierten Gattungsspezifischen Region III hybridisieren, wobei das Paar der markierten Hybridisierungssonden die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11 umfasst und wobei (d' ) während der Detektion der spezifische Nachweis der 16S-rRNA-Fragmente von Mykobakterien und der modifizierten 16S-rRNA-Fragmente des internen Standards mittels Schmelzkurvenanalyse erfolgt.
In einer weiteren bevorzugten Variante des erfin- dungsgemäßen Verfahrens werden die Schritte (a) , (b) , (c) , (d) und (e) des vorgenannten Verfahrens durchgeführt, wobei das mindestens eine künstliche Plasmid in Schritt (a) mit der gesamten extrahierten mikrobiellen DNA vermischt wird und nach A pli- fikation gemäß Schritt (b) die Detektion und Schmelzkurvenanalyse zum Nachweis der vervielfachten 16S-rRNA-Fragmente von Mykobakterien und der modifizierten 16S-rRNA-Fragmente des internen Standards, insbesondere gleichzeitig, gemäß der Schritte (c' ) und (d' ) durchgeführt wird.
Durch den Einsatz eines Kontrollplasmids im erfin- dungsgemäßen Nachweisverfahren gelingt es vorteilhaft, den Erfolg der Amplifikationsreaktion bereits während der Nachweisreaktion von Mykobakterien zu kontrollieren, um damit besonders schnell ein sicheres und eindeutiges Ergebnis zu erhalten. Insbe- sondere sogenannte „falsch-negative" Befunde bei Hemmung der Amplifikation sind durch Verwendung des erfindungsgemäßen Plasmids als interner Standard praktisch ausgeschlossen. Damit sind Spezifität und Selektivität des erfindungsgemäßen Verfahrens ge- genüber dem Stand der Technik deutlich erhöht..
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter den Formulierungen „Primerpaar beinhaltend oder umfassend die Nucleotidsequenzen", „ein Paar Hybridisierungssonden beinhaltend oder umfassend die Nucleotidsequenzen" oder ähnlichen verstanden, dass die jeweiligen Nucleotidsequenzen oder das Paar von Nucleotidsequenzen jeweils die in Bezug genommenen Nucleotidsequenzen aufweisen/aufweist, das heißt, dass diese Nucleotidsequenzen oder das Paar davon aus den konkret genannten Nucleotidse- quenz allein bestehen/besteht oder gegebenenfalls weitere Sequenzen umfassen/umfasst .
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter dem Begriff „Mycojacteriu-n tuberculosis- Komplex" die tuberkulösen Mykobakterienarten Mycobacterium tuberculosis , insbesondere der Stamm H37Rv, und Mycobacterium bovis , insbesondere der Stamm R99, wobei diese Stämme Erreger der Krankheit Tuberkulose sind, sowie der Stamm BCG Pasteur des Mycobacterium bovis verstanden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „tuberkulös" eine Eigenschaft beschrieben, die sich auf Mycobacterium tuberculosis , insbesondere den Stamm H37Rv, und Mycobacterium bovis, insbesondere den Stamm R99, im engeren Sinne sowie auf den Stamm BCG Pasteur des Mycobacterium bovis im weiteren Sinne bezieht und das Krankheitsbild der Tuberkulose bewirkt.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter der Bezeichnung „Mycobacterium avium" die nicht-tuberkulösen Mykobakterienarten Mycobacterium avium, insbesondere der Stamm ATCC35712, und deren Unterart Mycobacterium paratuberculosis, insbesondere der Stamm Pat.6783, verstanden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „nicht-tuberkulös" eine Eigenschaft verstanden, die im Zusammenhang mit einer anderen Erkrankung als der Tuberkulose steht und insbesondere eine Mykobakteriose ist.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer- den unter klinischem Material klinische Proben wie Sputum, Bronchiallavage, Magensaft, Urin, Stuhl, Liquor, Knochenmark, Blut oder Biopsien, insbesondere Punktat-Biopsien, beispielsweise aus Halslymphknoten, verstanden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „modifizierte Nucleotidsequenz" eine Nucleinsäuresequenz verstanden, die sich durch Austausch, Inversion, Deletion oder Addition von mindestens einem Nucleotid, auch einem ungewöhnlichen oder synthetischen Nucleotid, von ihrer ursprünglichen Sequenz, d.h. der Wildtyp-Sequenz, in mindestens einem Nucleotid, bevorzugt in zwei Nuc-. leotiden, unterscheidet. In diesem Zusammenhang wird unter dem Begriff „modifiziert" eine Eigenschaft verstanden, die sich auf eine „modifizierte Nucleotidsequenz" bezieht.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorgenannten Verfahren wird die Amplifikation der Genfrag- mente des 16S-rRNA-Gens mittels Polymerase- Kettenreaktion (PCR) durchgeführt. Bevorzugt wird die Amplifikation mittels Echtzeit-PCR (Rapid- Cycle-PCR) durchgeführt. Im Echtzeit-PCR Verfahren ist es möglich, die Vervielfachung der PCR-Produkte in Echtzeit Amplifikations-Zyklus für Amplifikati- ons-Zyklus zu beobachten. Besonders bevorzugt wird die Amplifikation in einem LightCycler™-System der Firma Röche Molecular Biochemicals durchgeführt, das eine Ausgestaltung der Echtzeit-PCR ist.
Zu diesem Zweck werden insbesondere der PCR- Ausgangsmischung neben der Polymerase, den Nucleo- tiden, den Pufferlösungen und den Primern auch Hybridisierungssonden zugegeben, die spezifisch an die gewünschten PCR-Amplifikationsprodukte binden. Dabei werden insbesondere zwei Sequenz-spezifische Oligonucleotidsonden verwendet, die mit verschiedenen Farbstoffen markiert sind. Die Sequenzen der erfindungsgemäßen markierten Hybridisierungssonden- Paare sind so ausgewählt, dass sie auf eine Weise an die Zielsequenzen des amplifizierten DNA- Fragments hybridisieren, dass insbesondere das 3'- Ende der einen Sonde dicht bei dem 5' -Ende der anderen Sonde liegt, wodurch die beiden Farbstoffe in unmittelbare Nachbarschaft zueinander gebracht werden, insbesondere beträgt der Abstand zwischen den beiden Sonden zwischen 1 und 5 Nucleotide. Insbe- sondere kommt es zu einem Fluoreszenz-Resonanz- Energietransfer (FRET) zwischen den beiden Farbstoffen der Hybridisierungssonden und damit zu einer Verschiebung des Fluoreszenzspektrums, wobei das Maß an Fluoreszenz in diesem Wellenlängenbe- reich eine Funktion der Menge an detektierter DNA ist.
Durch das FRET-System sind erfindungsgemäß quantitative Messungen der Menge amplifizierter DNA- Fragmente vorgesehen. Die erfindungsgemäßen ausge- wählten Hybridisierungssonden können quantitativ, also stöchiometrisch, an die amplifizierten Fragmente binden. Dabei ist die quantitative Hybridisierung insbesondere abhängig von der Temperatur und dem Homologiegrad der verwendeten Oligo- nucleotidsonden mit der detektierten Sequenz auf dem amplifizierten Fragment.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die vorgenannte fluorimetrische Detektion spezifischer DNA-Sequenzen in den amplifizierten Fragmenten nach einer Amplifikation der Fragmente mittels herkömmlicher PCR durchgeführt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die fluorimetrische De- tektion in einer Echtzeit-PCR während der Amplifi- kationsreaktionen durchgeführt, wobei beispielsweise die Zunahme an produzierter DNA als Zunahme im Fluoreszenzsignal verfolgt werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform des vorgenannten erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die spezifische Detektion Art-spezifischer und/oder Gat- tungs-spezifischer Regionen im amplifizierten DNA- Fragment nach Beendigung der Amplifikationsreakti- on, wobei nach Hybridisierung des Hybridisierungssonden-Paars, bevorzugt eines FRET-Paars an die zu detektierenden Regionen die Temperatur im Rahmen einer Schmelzkurvenanalyse verändert wird, bevorzugt kontinuierlich erhöht wird, und gleichzeitig die in Abhängigkeit von der Temperatur emittierte Fluoreszenz gemessen wird. Auf diese Weise wird eine Schmelztemperatur bestimmt, bei der die Hybridisierungssonden, insbesondere das eingesetzte FRET- Paar, gerade nicht mehr an die zu detektierende Re- gion des amplifizierten DNA-Fragments hybridisieren. Der wesentliche Aspekt einer Schmelzkurvenanalyse besteht darin, dass es bei Auftreten von Fehl- •paarungen zwischen dem eingesetzten Hybridisie- rungssonden-Paar und der Zielregion auf dem a pli- fizierten DNA-Fragment zu einer Reduktion des gemessenen Schmelzpunktes kommt. Auf diese Weise werden erfindungsgemäß mit Hybridisierungssonden, insbesondere mit einem FRET-Paar, die Regionen von DNA-Fragmenten identifiziert, deren Sequenzen sich voneinander nur geringfügig, insbesondere durch eine oder wenige Punktmutationen, in der Nucleotidsequenz unterscheiden. In vorteilhafter Weise besitzt das 16S-rRNA-Gen von Mykobakterien sowohl konservierte als auch hochvariable Regionen, die beispielsweise eine Gattungsspezifische Amplifikation von DNA-Fragmenten mit- tels Gattungs-spezifischer Primer erlaubt. Erfindungsgemäß werden daher die vorgenannten Verfahren der Fluoreszenzdetektion in Verbindung mit der Schmelzkurvenanalyse zum spezifischen Nachweis der Gattungs-spezifischen Region III und der hypervari- ablen Art-spezifischen Regionen des M. tuberculosis-Komplex und M. avium auf dem 16S-rRNA-Gen eingesetzt.
Aus dem Stand der Technik ist bekannt, dass myko- bakterielle 16S-rRNA-Gene jeweils zwei Art- spezifische und zwei Gattungs-spezifische Regionen enthalten, siehe Figur 1: ,species (A) ' und , spe- cies (B) ' beziehungsweise , genus II' und ,genus I'. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine dritte Gattungs-spezifische Region auf dem 16S- rRNA-Gen beschrieben, siehe Figur 1: , genus III' (erfindungsgemäß) .
In Figur 1 sind zusätzlich schematisch die Primerpaare dargestellt, die zur Amplifikation der ausgewählten Art-spezifischen beziehungsweise Gattungs- spezifischen Regionen verwendet werden.
Erfindungsgemäß wird zur Amplifikation der Gat- tungs-spezifischen Region III 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien das Primerpaar umfassend die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 5 eingesetzt. In einer bevorzugten Variante besteht das Primerpaar aus degenerierten oder mutierten Sequenzen oder Fragmenten davon, die jeweils mit den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 5 hybridisieren, wovon sie abgeleitet sind, wobei jeweils ein Homologiegrad von mindestens 90 %, bevorzugt von mindestens 95 %, besonders bevorzugt von mindestens 98 % besteht.
Das mit den vorgenannten Primerpaar amplifizierte 1000 bp lange Fragment enthält sowohl die konservierte Gattungs-spezifische Region III als auch die hochvariablen Art-spezifischen Regionen des M. tuberculosis-Komplex und M. avium .
Als besonders überraschend wurde mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gefunden, dass insbesondere mit dem LightCycler™-System - im Gegensatz zur gängigen Lehrmeinung - eine effektive Amplifikation dieses 1000 bp Fragments und der erfindungsgemäße Nachweis der Gattungs- und Art-spezifischen Regionen auf diesem Fragment erzielt werden konnte, obwohl dieses Fragment aus Mykobakterien einen hohen GC-Gehalt besitzt. Erfindungsgemäß bevorzugt kann daher mittels eines einzigen amplifizierten Frag- ments des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien ein Gat- tungs-spezifischer Nachweis einer Mykobakterienin- fektion gegenüber anderen mikrobiellen Infektionen und der Art-spezifische Nachweis des M. tuberculosis-Komplex und M. avium durchgeführt werden.
Erfindungsgemäß ist außerdem die zusätzliche oder alternative Verwendung von zwei weiteren Primerpaaren vorgesehen, wobei ein Primerpaar ein insbeson- dere 300 bp langes Fragment des lβS-rRNA-Gens von Mykobakterien amplifiziert, das die Art- spezifischen Regionen des M. tuberculosis-Komplex und M. avium enthält, wobei dieses Primerpaar aus den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3 besteht, und das zweite Primerpaar ein 100 bp lan- ges Fragment desselben Gens amplifiziert, das die Gattungs-spezifische Region III enthält, wobei dieses Primerpaar die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5 umfasst. In einer bevorzugten Variante bestehen die zwei Primerpaare aus den Paa- ren degenerierter oder mutierter Sequenzen oder Fragmenten davon, die jeweils mit den Nucleotidse- quenz-Paaren SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5 hybridisieren, wovon sie abgeleitet sind, wobei jeweils ein Homologiegrad von mindestens 901 %, bevorzugt von mindestens 95 %, besonders bevorzugt von mindestens 98 % besteht.
Erfindungsgemäß wird zur Detektion der vorgenannten amplifizierten 16S-rRNA-Fragmente von Mykobakterien, die die Gattungs-spezifische Region III und/oder die Art-spezifischen Regionen des M. tuberculosis-Komplex und M. avium enthalten, ein Paar markierter Hybridisierungssonden eingesetzt, das mit der konservierten Gattungs-spezifischen Region III hybridisiert, wobei dieses Paar die Nucleotid- Sequenzen SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11 oder die komplementären Sequenzen davon beinhaltet. Bevorzugt wird dabei das Hybridisierungssonden-Paar als FRET- Paar ausgeführt, wobei die Hybridisierungssonde mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 10 oder der komple- mentären Sequenz davon als Donor-Komponente (= Anker-Sonde) ausgeführt ist, die vorzugsweise am 3'- terminalen Nucleotid mit einem Farbstoff, vorzugsweise mit einem Fluoreszenz-Farbstoff, besonders bevorzugt mit Fluorescein assoziiert ist, und die zweite Hybridisierungssonde bestehend aus der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 11 oder der komplementären Sequenz davon als Akzeptor-Komponente (= Sensor- Sonde) ausgeführt ist, die vorzugsweise am 5'- terminalen Nucleotid mit einem weiteren Farbstoff, vorzugsweise mit einem Rhodamin-Derivat assoziiert ist.
Erfindungsgemäß wird die Detektion der vorgenannten die Art-spezifischen Regionen enthaltenden' 16S- rRNA-Fragmente mit mindestens einem Paar markierter Hybridisierungssonden durchgeführt, wobei bevorzugt die markierten Hybridisierungssonden-Paare als FRET-Paare ausgeführt sind. Dabei werden analog zum Vorgenannten zur spezifischen Detektion der Mykobakterienarten M. tuberculosis-Komplex und M. avium die erfindungsgemäßen Art-spezifischen Hybridisierungssonden-Paare eingesetzt, wobei jeweils ein Hybridisierungssonden-Partner (SEQ ID NO: 6 oder das Komplement beziehungsweise SEQ ID NO: 8 oder das Komplement) als Donor-Komponente (= Anker- Sonde) ausgeführt ist, die vorzugsweise am 3'- terminalen Nucleotid mit einem Farbstoff, vorzugsweise mit einem Fluoreszenz-Farbstoff, besonders bevorzugt mit Fluorescein assoziiert ist und der jeweils andere Hybridisierungssonden-Partner (SEQ ID NO. 7 oder Komplement beziehungsweise SEQ ID NO: 9 oder Komplement) als Akzeptor-Komponente (= Sensor-Sonde) ausgeführt ist, die vorzugsweise am 5' -terminalen Nucleotid mit einem weiteren Farbstoff, vorzugsweise mit einem Rhodamin-Derivat assoziiert ist. In bevorzugten Varianten der vorgenannten Ausführungsformen ist das Rhodamin-Derivat LightCycler- Red 640; in weiteren bevorzugten Varianten der vorgenannten Ausführungsform ist das Rhodamin-Derivat LightCycler-Red 705; in weiteren bevorzugten Varianten der vorgenannten Ausführungsform ist das Rhodamin-Derivat Cy5.
In einer Variante des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens werden zur Markierung der Hybridisie- rungssonden-Paare jeweils dieselben Donor-Akzeptor- Farbstoffe verwendet, bevorzugt Fluores- cein/LightCycler-Red 640, wobei die Schmelzkurvenanalyse mit dem Gattungs-spezifischen Sonden-Paar zum Nachweis von Mykobakterien zeitlich oder räum- lieh getrennt von der Schmelzkurvenanalyse mit einem der Art-spezifischen Hybridisierungssonden- Paare zum Nachweis des M. tuberculosis-Komplex oder von M. avium insbesondere in jeweils parallelen Ansätzen erfolgt.
In einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens werden zur Markierung der Hybri- disierungssonden-Paare jeweils verschiedene Donor- Akzeptor-Farbstoffe verwendet, wobei die Schmelzkurvenanalyse mit dem Gattungs-spezifischen Sonden- Paar zum Nachweis von Mykobakterien, das bevorzugt mit Fluorescein/LightCycler-Red 640 markiert ist, zeitlich und räumlich zusammen in einem Ansatz mit der Schmelzkurvenanalyse mit einem der Art- spezifischen Hybridisierungssonden-Paare, das be- vorzugt mit Fluorescein/LightCycler-Red 705 markiert ist, zum Nachweis des M. tuberculosis-Komplex oder von M. avium erfolgt, wobei bevorzugt im LightCycler™-System die Fluoreszenz des Gattungs- spezifischen Sonden-Paars mit einem Photodetektor- Kanal und die Fluoreszenz eines Art-spezifischen Sonden-Paars mit dem zweiten Photodektor-Kanal re- gistriert wird.
In diesem Zusammenhang sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung Oligonucleotidprimer- Paare zur Vervielfältigung von 16S-rRNA-Fragmenten aus extrahierter bakterieller DNA zum spezifischen Nachweis von Mykobakterien und zur Unterscheidung des Mycobacterium tuberculosis-Komplex und Mycobacterium avium von anderen Mykobakterienarten in klinischem Material, wobei ein Primerpaar die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3 oder ein Paar degenerierter oder mutierter Nucleotidsequenzen oder Fragmente davon umfasst. Die degenerierten oder mutierten Nucleotidsequenzen haben die Eigenschaft, jeweils mit den Sequenzen SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3 zu hybridisieren, wobei jeweils ein Homo- logiegrad von mindestens 90 %, bevorzugt von mindestens 95 %, besonders bevorzugt von mindestens 98 %, bevorzugt ist.
Die Erfindung betrifft auch ein zweites Primerpaar mit einem Primer mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 4 oder einer degenerierten oder mutierten Nucleotidsequenz oder ein Fragment davon, das mit der Sequenz SEQ ID NO: 4 hybridisiert, wobei ein Homologiegrad von mindestens 90 %, bevorzugt von mindestens 95 %, besonders bevorzugt von mindestens 98 % bevorzugt ist. In diesem Zusammenhang sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung Oligonucleotid- Hybridisierungssonden-Paare zum spezifischen Nachweis von Mykobakterien und zur Unterscheidung des Mycobacterium tuberculosis-Komplex und Mycobacterium avium von anderen Mykobakterienarten in klinischem Material, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11 oder dem Paar der komplementären Sequenzen davon, den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 7 oder dem Paar der komplementären Sequenzen davon und den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 8/SEQ ID NO: 9 oder dem Paar der komplementären Sequenzen davon.
In diesem Zusammenhang ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein künstliches Plasmid, Kontrollplasmid, vorzugsweise erhalten durch Subc- lonierung des 16S-rRNA-Gens in pGEM-T, das als interne Kontrolle der Amplifikation (Inhibiti- onskontrolle) und des spezifischen Nachweises von 16S-rRNA-Fragmenten von Mykobakterien dient und eine Nucleinsäuresequenz der modifizierten Gattungsspezifischen Region III des 16S-rRNA-Gens enthält. Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Kontroll- plasmid durch Nucleotid-Äustausch, Nucleotid- Addition, Nucleotid-Deletion und/oder Nucleotid- Inversion mindestens eines Nucleotids, bevorzugt zweier Nucleotide von der Wildtyp-Nuclein- säuresequenz der Gattungs-spezifischen Region III des 16S-rRNA-Gens abgeleitet. In einer weiteren Variante umfasst das künstliche Plasmid die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 14 oder SEQ ID NO: 15, worin jeweils ein Nucleotid gegenüber der Wildtyp-Sequenz ausgetauscht ist. Besonders überraschend wurde dabei gefunden, dass durch den Ersatz des einen Nuc- leotids eine Reduktion der Schmelztemperatur der Gattungs-spezifischen Hybridisierungssonden von un- gefähr 1°C eintritt.
In einer weiteren besonders bevorzugten Variante umfasst das künstliche Plasmid die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 16 oder SEQ ID NO: 17, worin jeweils zwei Nucleotide gegenüber der Wildtyp-Sequenz aus- getauscht sind. Besonders überraschend wurde dabei gefunden, dass durch den Ersatz der zwei Nucleotide eine Reduktion der Schmelztemperatur der Gattungsspezifischen Hybridisierungssonden von ungefähr 14,5°C eintritt. Dies erlaubt vorteilhafter Weise den gleichzeitigen Einsatz der modifizierten 16S- rRNA zusammen mit der nachzuweisenden Wildtyρ-16S- rRNA in einem Ansatz zur Schmelzkurvenanalyse, insbesondere mittels des erfindungsgemäßen Gattungsspezifischen Hybridisierungssonden-Paars, da ihre Schmelztemperaturen unterscheidbar weit auseinanderliegen und somit das nachzuweisende Wildtyp-16S- rRNA-Fragment unbeeinflusst vom internen Standard detektiert und erkannt werden kann.
In diesem Zusammenhang ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Diagnosekit zum spezifischen Nachweis einer Mykobakterieninfektion und von M. tuberculosis und M. avium in klinischem Material gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren, das mindestens eine Polymerase, mindestens eines, vor- zugsweise alle der vorgenannten Primerpaare und mindestens eines, vorzugsweise alle der vorgenannten Hybridisierungssonden-Paare umfasst. Erfin- dungsgemäß bevorzugt umfasst das Diagnosekit zusätzlich mindestens ein erfindungsgemäßes künstliches Kontrollplasmid als internen Standard.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
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Die Erfindung wird anhand des Sequenzprotokolls, das die Sequenzen Nr. 1 bis 17 enthält, anhand der Figuren 1 bis 4 sowie anhand der Beispiele 1 bis 8 näher erläutert.
SEQ ID NO: 1 - "sense"-Primer („forward"-Primer) des Primer-Paares zur Amplifikation eines 1000 bp- Fragments des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien, enthaltend die Art-spezifische Regionen des M. tuberculosis-Komplex und von M. avium und die Gattungsspezifische Region III der Gattung Mycobacterium,
SEQ ID NO: 2 - "sense"-Primer („forward"-Primer) des Primer-Paares zur Amplifikation eines 300 bp- Fragments des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien, enthaltend die Art-spezifische Regionen des M. tuberculosis-Komplex und von M. avium,
SEQ ID NO: 3 - "antisense"-Primer („reverse"- Primer) des Primer-Paares zur Amplifikation eines 300 bp-Fragments des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien, enthaltend die Art-spezifische Regionen des M. tuberculosis-Komplex und von M. avium,
SEQ ID NO: 4 - "sense"-Primer („forward"-Primer)' des Primer-Paares zur Amplifikation eines 100 bp- Fragments des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien, enthaltend die Gattungs-spezifische Region III der Gattung Mycobacterium,
SEQ ID NO: 5 - "antisense"-Primer („reverse"- Primer) a) des Primer-Paares zur Amplifikation eines 1000 bp-Fragments des 16S-rRNA-Gens vom Mykobakterien, enthaltend die Art-spezifische Regionen des M. tuberculosis-Komplex und von M. avium und die Gattungs-spezifische Region III der Gattung Mycobacterium, und b) des Primer-Paares zur Amplifikation eines 100 bp-Fragments des 16S-rRNA-Gens vom Mykobakterien, enthaltend die Gattungs-spezifische Region III der Gattung Mycobacterium, SEQ ID NO: 6 - "antisense"-Hybridisierungssonde, insbesondere Donor-Komponente, des Sondenpaars zur Detektion der Art-spezifischen Region des M. tuberculosis-Komplex,
SEQ ID NO: 7 - "sense"-Hybridisierungssonde, insbesondere Akzeptor-Komponente, des Sondenpaars zur Detektion der Art-spezifischen Region des M. tuberculosis-Komplex,
SEQ ID NO: 8 - "antisense"-Hybridisierungssonde, insbesondere Donor-Komponente, des Sondenpaars zur Detektion der Art-spezifischen Region von M. avium,
SEQ ID NO: 9 - "sense"-Hybridisierungssonde, insbe-- sondere Akzeptor-Komponente, des Sondenpaars zur Detektion der Art-spezifischen Region von M. avi um, ■
SEQ ID NO: 10 - "antisense"-Hybridisierungssonde, insbesondere Donor-Komponente, des Sondenpaars zur Detektion der Gattungs-spezifischen Region III der Gattung Mycobacterium,
SEQ ID NO: 11 - "sense"-Hybridisierungssonde, ins- besondere Akzeptor-Komponente, des Sondenpaars zur Detektion der Gattungs-spezifischen Region III der Gattung Mycobacterium,
SEQ ID NO: 12 - "sense"-Primer („forward"-Primer) des Primer-Paares zur Amplifikation des kompletten 16S-rRNA-Gens (1523 bp) von Mykobakterien,
SEQ ID NO: 13 - "antisense"-Primer („reverse"- Primer) des Primer-Paares zur Amplifikation zur Amplifikation des kompletten 16S-rRNA-Gens (1523 bp) von Mykobakterien,
SEQ ID NO: 14 - modifizierter "sense"-Primer („for- ward"-Primer) zur Amplifikation eines kompletten Kontrollplasmids, enthaltend eine modifizierte Gattungs-spezifische Region III des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien,
SEQ ID NO: 15 - modifizierter "antisense"-Primer („reverse"-Primer) zur Amplifikation eines komplet- ten Kontrollplasmids, enthaltend eine modifizierte Gattungs-spezifische Region III des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien,
SEQ ID NO: 16 - modifizierter "sense"-Primer („for- ward"-Primer) zur Amplifikation eines weiteren kom- pletten Kontrollplasmids, enthaltend eine weitere modifizierte Gattungs-spezifische Region III des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien,
SEQ ID NO: 17 - modifizierter "antisense"-Primer („reverse"-Primer) zur Amplifikation eines weiteren kompletten Kontrollplasmids, enthaltend eine weitere modifizierte Gattungs-spezifische Region III des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Ausführungsbeispiele und den dazugehörigen Figuren näher erläutert:
Die Figuren zeigen:
Figur 1: Schematische Darstellung des 16S-rRNA~ Gens von Mykobakterien (Länge: 1523 bp) , der Position der Art-spezifischen Regionen, „species (A) " und „species (B) ", sowie der Gattungs-spezifischen Regionen „genus I", „genus II" und „genus III", sowie der Lage und Größe der mittels der
Primer-Paare (1) und (5), (2) und (3) sowie (4) und (5) amplifizierten Fragmente .
Figur 2: Sensitivität des Art-spezifischen Nach- weises des M. tuberculosis-Komplexes :
Schmelzkurven der Hybridisierung der erfindungsgemäßen Art-spezifischen Hybridisierungssonden mit der Art-spezifischen Region des M. tuberculosis- Komplexes im amplifizierten 1000 bp-
Fragment der 16S-rRNA von Mykobakterien.
Figur 3: Modifiziertes 16S-rRNA-Fragment als interner Standard (pJL6) : Schmelzkurven der Hybridisierung der Gattungs- spezifischen Hybridisierungssonden mit der Gattungs-spezifischen Region III und der modifizierten Gattungs-spezifischen Region III des internen Standards (pJL6) bei unterschiedlicher Anzahl an Genomko- pien der nachzuweisenden Gattungsspezifischen Region III.
Figur 4: Modifiziertes 16S-rRNA-Fragment als interner Standard (pJL6) : Schmelzkurven der Hybridisierung der Gattungs- spezifischen Hybridisierungssonden mit der Gattungs-spezifischen Region III und der modifizierten Gattungs-spezifischen Region III des internen Standards (pJL6) in Gegenwart unterschiedlicher Menge an „Hintergrund"-DNA aus E. coli .
Beispiel 1:
a) DNA-Isolierung aus klinischem Material
Mikrobielle DNA wird aus klinischen Proben bestehend aus Sputum, Bronchiallavage, Magensaft, Urin, Stuhl, Liquor, Knochenmark, Blut oder Punktat- Biopsien in an sich bekannter Weise zum Beispiel mittels eines Qiamp™ MiniKit (Firma Qiagen, Katalog-Nr. 51306) aufgereinigt, das heißt extrahiert. Chromosomale DNA wird dabei mittels PicoGreen™- System (Firma Molecular Probes) quantifiziert.
Verschiedene Anzahlen genomischer Kopien pro Nachweis-Ansatz (siehe unten) werden durch Molekulargewichtsberechnungen und die Durchführung von Verdünnungsreihen erhalten.
a' ) DNA-Isolierung aus Kulturisolaten
Insbesondere zur Evaluation der erfindungsgemäßen Nachweisverfahren wird mikrobielle DNA verschiedener Kulturen von Mikroorganismen, zum Beispiel der in Tabelle 1 aufgeführten Organismen, isoliert. Insbesondere zur Anwendung der erfindungsgemäßen Nachweisverfahren auf aus Patienten-Proben gewonnenen (Bouillon-) Kulturen von zu diagnostizierenden Mikroorganismen wird mikrobielle DNA aus diesen Kulturen isoliert. Anschließend wird die mikrobielle DNA in an sich bekannter Weise zum Beispiel mittels eines Qiamp™ MiniKit (Firma Qiagen, Katalog-Nr. 51306) aufgereinigt, das heißt extrahiert. Chromosomale DNA wird dabei in an sich bekannter Weise zum Beispiel mittels PicoGreen™-System (Firma Molecular Probes) quantifiziert.
b) PCR-Amplifikation
Zur Amplifikation in einer optimierten LightCyc- ler™-PCR (siehe Beispiel 3) wird ein Ansatz beinhaltend die fertig erhältliche Mischung „LightCyc- ler™ Faststart DNA Master Hybridisation Probes" (Katalog-Nr. 239272, Firma Röche Molecular Bioche- micals) gewählt.
Es wird folgende Reaktionsmischung für die Light- Cycler™-Reaktion hergestellt:
• Taq Polymerase
• Reaktionspuffer
• Desoxi-Nucleosid-Triphosphat-Mischung (dNTP) » 3 mmol/1 MgCl2
• Primer-Paar a) oder b) je Primer: 18 pmol, entsprechend 1,1 μmol/1 Endkonzentration : a) Primer-Paar SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5 oder b) Primer-Paar SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3 und Primer-Paar SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5 Erfindungsgemäß wird zur Amplifikation das Primer-Paar a) SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5 eingesetzt, das ein 1000 bp langes Fragment der 16S-rRNA, enthaltend die Gattungs-spezifische Region III und die Art-spezifischen Regionen, amplifiziert.
Alternativ werden erfindungsgemäß die beiden Primer-Paare b) gleichzeitig in einem Mu- litplex-PCR-Ansatz, in parallelen Ansätzen oder zeitlich getrennt eingesetzt, wobei das Primer-Paar enthaltend SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3 ein 300 bp langes Fragment der 16S-rRNA, enthaltend die Art-spezifischen Regionen, amplifiziert und zum anschließenden Nachweis des M. tuberculosis-Komplex und/oder von M. avium dient, und wobei das Primer-Paar enthaltend SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5 ein 100 bp langes Fragment der 16S-rRNA, enthaltend die Gattungs-spezifische Region III, amplifiziert und zum anschließenden Nachweis einer Mykobakte- rieninfektion dient. Oligonucleotid-FRET-Sonden-Paare c) bis e) je Sonde: 2 pmol, entsprechend 120 nmol/1 Endkonzentration: c) SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11 zur Detektion der Gattungs-spezifischen Region III, d) SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 7 zur Detektion der Art-spezifischen Region des M. tuberculosis-Komplex, e) SEQ ID NO: 8/SEQ ID NO: 9 zur Detektion der Art-spezifischen Region von M. avium Erfindungsgemäß wird das Sondenpaar c) SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11 oder ein komplementäres oder mutiertes oder degeneriertes Paar davon zur Detektion der Gattungs-spezifischen Region III eingesetzt. Soll im erfindungsgemäßen Verfahren lediglich zusätzlich zu der Gattungsspezifischen Detektion der M. tuberculosis- Komplex detektiert werden, wird das Sondenpaar d) SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 7 beziehungsweise deren Äquivalente, das heißt mutierte oder komplementäre Paare davon, eingesetzt. Sollen dagegen zusätzlich zur Gattungs-spezifischen Detektion lediglich Mykobakterien der Art M. avium nachgewiesen werden, wird das Sondenpaar e) SEQ ID NO: 8/SEQ ID NO: 9 beziehungsweise deren Äquivalente, das heißt mutierte oder komplementäre Paare davon, eingesetzt. Sollen gemeinsam mit der Gattungs-spezifischen Region III sowohl der M. tuberculosis-Komplex also auch M. avium nachgewiesen werden, werden neben dem Sondenpaar c) entsprechend beide Sondenpaare d) und e) eingesetzt.
Diese Reaktionsmischung wird durch Puls- Zentrifugation in die Glaskapillaren des LightCyc- ler™-Systems verbracht und die Amplifikation nach dem „Hot Start"-Prinzip nach einer anfänglichen Denaturierung bei 95 °C für 10 Minuten mit den folgenden Schritten durchgeführt: 1. Denaturierung bei 95 C für 3 Sekunden
2. Primer-Hybridisierung bei Temperaturen von 68°C bis 62°C für 2 Sekunden („touch-down- annealing") 3. Polymerisation bei 72 °C für 40 Sekunden.
Die Schritte 1 bis 3 werden insgesamt 50 mal zyklisch abgearbeitet, wobei für die ersten 5 Zyklen die Hybridisierung in Schritt 2 bei 68 °C erfolgt und bei den nachfolgenden 6 Zyklen die Temperatur auf 62 °C in Schritten von 1°C pro Zyklus reduziert wird und für die restlichen Zyklen bei 62 °C durchgeführt wird. Die Rate der Temperaturänderung liegt bei allen Schritten bei 20 °C pro Sekunde.
c) Detektion und Schmelzkurvenanalyse:
Zur Detektion der amplifizierten Fragmente werden die in der Reaktionsmischung eingesetzten FRET- markierten Hybridisierungssonden-Paare verwendet, wobei jeweils ein Hybridisierungssonden-Partner
(SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6 beziehungsweise SEQ ID NO: 8) als Donor-Komponente am 3' -terminalen Nucleotid mit Fluorescein assoziiert ist, und der jeweils andere Hybridisierungssonden-Partner (SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 7 beziehungsweise SEQ ID NO: 9) als Akzeptor-Komponente am 5' -terminalen Nucleotid mit LightCycler™-Green 640 assoziiert ist.
Die im Verlauf der Detektion erfolgende Schmelzkurvenanalyse beginnt mit der Denaturierung der amplifizierten Fragmente bei 95 °C für 30 Sekunden, worauf eine Hybridisierung mit den vorgenannten FRET- Paaren bei 38 °C für 30 Sekunden folgt. Zur Bestim- mung der Schmelzkurve der Hybridisierung wird die Temperatur anschließend kontinuierlich von 38 °C auf 80 °C mit einer Rate von 0,2°C/sec erhöht, wobei die von den FRET-Paaren emittierte Fluoreszenz kontinu- ierlich aufgezeichnet wird. Zur Auswertung des Fluoreszenzsignals wird das LightCycler-„Run Profile"- Programm in der Version 3.5.3 eingesetzt, wobei die Verstärkung des F2-Kanals des photometrischen Detektors des LightCycler™-Systems automatisch einge- stellt wird.
Beispiel 2: Künstliches Plasmid als interner Standard
a) Bereitstellung eines Kontrollplasmids (erfin- dungsgemäß)
Um einen internen Standard zur Kontrolle der erfolgreichen selektiven Amplifikation der gewünschten Fragmente des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien gemäß Beispiel 1 zur Verfügung zu haben (Inhibiti- onskontrolle) , wird zunächst das gesamte 16S-rRNA- Gen von Mykobakterien (1523 bp) mit einem PCR- Primerpaar amplifiziert, wobei der „sense"-Primer aus der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 12 und der „an- tisense"-Primer aus der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 13 besteht. Zur Amplifikation werden 40 Zyklen der folgenden Schritte durchgeführt:
1. Denaturierung bei 95°C
2. Primer-Hybridisierung bei 56,5°C
3. Polymerisation bei 72 °C. Anschließend werden die amplifizierten Fragmente in an sich bekannter Weise zum Beispiel in pGEM-T (Firma Promega) subcloniert.
Um das künstliche Plasmid als internen Standard einsetzen zu können, soll sich die im künstlichen Plasmid (=pIJ6) enthaltene Gattungs-spezifische Region III der 16S-rRNA durch mindestens eine Punktmutation von der Wildtyp-Nucleotidsequenz der Gattungs-spezifischen Region III unterschieden. Um mindestens eine gezielte Punktmutation in die Gattungs-spezifische Region III des 16S-rRNA-Fragments einzuführen, werden zur Vervielfältigung der die subclonierten Fragmente enthaltenden Plasmide modifizierte Primerpaare eingesetzt, bei denen jeweils ein oder zwei Nucleotide in den Nucleotidsequenzen gegenüber den Wildtyp-Nucleotidsequenzen ausgetauscht wurden.
Dazu werden folgende Primerpaare, abgeleitet von der Wildtyp-Sequenz der Gattungs-spezifischen Regi- on III, insbesondere von der die Akzeptor- Komponente des erfindungsgemäßen FRET-Paars, SEQ ID NO: 11, bindenden Region verwendet: a) Austausch eines Nucleotids:
„forward"-Primer: (SEQ ID NO: 14) 5'- GGC TTG ACA TGC ACA GGA CGC -3'
„reverse"-Primer: (SEQ ID NO: 15)
5'- GCG TCC TGT GCA TGT CAA GCC -3' b) Austausch von zwei Nucleotiden:
„forward"-Primer: (SEQ ID NO: 16) 5'- GGT TTG ACA TAC AC GGA CGC -3' „reverse"-Primer: (SEQ ID NO: 17)
5'- GCG TCC AGT GTA TGT CAA ACC -3'
In den erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen der vorgenannten modifizierten Primerpaare wurde jeweils das unterstrichene Nucleotid gegenüber der Wildtyp-Sequenz der Gattungs-spezifischen Region III ersetzt.
Die Vervielfachung der Kontrollplasmide mit den mo- difizierten Primerpaaren wird jeweils in einer „long range"-PCR mit einer Pfu-Polymerase, Typ: „Pfu Turbo Hot Start DNA" (Firma Stratagene) in an sich bekannter Weise in einem „Hot Start" PCR- Verfahren durchgeführt mit jeweils 18 Zyklen der folgenden Schritte:
1. Denaturierung bei 95°C
2. Primer-Hybridisierung bei 50°C
3. Polymerisation bei 68 °C.
Ergebnisse: a) Die erhaltenen Amplicons werden zusätzlich über ein Gel aufgereinigt und die Punktmutationen können anschließend werden mittels Sequenzierung bestätigt werden.
b) Der Ersatz des Nucleotids 'T' mit dem Nucleotid 'C am 3' -Ende der die Akzeptor-Komponente des FRET-Paars bindenden Region der Gattungsspezifischen Region III führt zu einer Reduktion der Schmelztemperatur von ungefähr 1°C. c) Wird am 5'-Ende das Nucleotid 'G' mit dem Nucleotid 'A' und vier Nucleotide entfernt davon das Nucleotid 'A' mit dem Nucleotid 'T' ersetzt, kommt es zu einer signifikanten Reduktion der Schmelztem- peratur um cirka 14,5°C.
Als besonders überraschend wird gefunden, dass eine zwei Nucleotide umfassende Modifikation der die Akzeptor-Komponente des FRET-Paars bindenden Region der Gattungs-spezifischen Region III ausreicht, um eine Differenzierung der so modifizierten 16S-rRNA, enthalten in einem künstlichen Plasmid, von der Wildtyp-16S-rRNA zu unterscheiden. Die Verwendung des erfindungsgemäßen modifizierten 16S-rRNA-Frag- ments als interner Standard, enthalten in einem künstlichen Plasmid, im erfindungsgemäßen Verfahren gemäß Beispiel 1 ist somit besonders vorteilhaft zur Kontrolle der Amplifikation und zur Verifikation des Nachweises einer Mykobakterieninfektion.
b) Zweckmäßigkeit des Kontrollplasmids bei geringer Menge von Proben-Genom
In einem weiteren Experiment wird zunächst, wie unter a) beschrieben, durch Einsatz der erfindungsgemäßen Primer SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17 ein Kontrollplasmid erhalten, das ein durch Austausch zweier Nucleotide modifiziertes 16S-rRNA-Fragment enthält. Jeweils 50 Kopien des Kontrollplasmids werden als interner Standard mit verschiedenen Anzahlen von Genkopien des 16S-rRNA-Gens von M. tuberculosis gemischt und dem Nachweisverfahren gemäß Beispiel 1 unterzogen. Ergebnis :
In Gegenwart von 50 Kopien des internen Standards konnten bereits 10 Genkopien des 16S-rRNA-Fragments von M. tuberculosis eindeutig mittels Schmelzkur- venanalyse nachgewiesen werden. Bei einer Anzahl von 5 Genkopien ist das dabei erhaltene Fluoreszenzsignal zwar nicht mit einfachen statistischen Mitteln auswertbar, jedoch lässt sich in der Schmelzkurvenschar in Figur 3 eine deutliche Spitze bei der entsprechenden Schmelztemperatur nachweisen.
Die Verwendung dieses internen Standards ist somit auch dann möglich, • wenn zu erwarten ist, dass die Anzahl an nachzuweisenden Genkopien im klinischen Material um eine Größenordnung geringer ist als die Zahl der als interner Standard eingesetzten Plas- midkopien.
c) Zweckmäßigkeit des Kontrollplasmids in Gegenwart von „Hintergrund"-DNA
In einem weiteren Experiment wird zunächst, wie un- ter a) beschrieben, durch Einsatz der erfindungsgemäßen Primer SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17 ein Kontrollplasmid ( erhalten, das ein durch Austausch zweier Nucleotide modifiziertes 16S-rRNA-Fragment enthält. Jeweils 50 Kopien des Kontrollplasmids und 10 Genkopien des 16S-rRNA-Gens von M. tuberculosis werden mit unterschiedlichen Mengen an „Hinter- grund"-DNA von E. coli im Bereich von 1 pg bis 200 ng versetzt und anschließend dem Nachweisver- fahren gemäß Beispiel 1 unterzogen. Ergebnis :
In Gegenwart von bis zu 200 ng fremder DNA, sogenannter „Hintergrund"-DNA, pro Ansatz konnten 10 Genkopien des 16S-rRNA-Fragments von M. tuberculo- sis noch eindeutig mittels Schmelzkurvenanalyse nachgewiesen werden (Figur 4) .
Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren, insbesondere unter Verwendung dieses internen Standards, ist somit auch dann möglich, wenn zu erwarten ist, dass im isolierten klinischen Material eine große Menge an fremder DNA, "Hintergrund"-DNA, vorhanden ist.
Beispiel 3: Beurteilung der Leistungsfähigkeit des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens auf dem Light- Cycler™-System
Zur Untersuchung der auf dem LightCycler™-System basierten Amplifikation und Hybridisierung (siehe Beispiel 1) wird als „Template" genomische DNA des Bakterienstammes Mycobacterium bovis BCG des M. tu- jberculosis-Komplex verwendet.
Verschiedene Anzahlen genomischer Kopien pro PCR- Reaktion werden durch Molekulargewichtsberechnungen und die Durchführung von Verdünnungsreihen erhalten.
Folgende Parameter wurden für die kombinierte Amplifikations- und Hybridisierungsreaktion eingesetzt:
- MgCl2-Konzentration 3 mmol/1 - Primerkonzentration: 18 pmol pro Reaktion, entspricht einer Endkonzentration von 1,1 μmol/1
- „Hot Start"-Tag Polymerase des Typs „Light- Cycler™ FastStart DNA Master SYBR Greenl"
(Katalog-Nr. 3003230)
Polymerisationszeit: 40 Sekunden
- Hybridisierungszeit : 3 Sekunden
- Hybridisierungstemperatur : 62 °C, bei schritt- weiser Reduzierung ausgehend von 68 °C nach 5
Zyklen mit 1°C pro Zyklus.
Ergebnisse:
Eine Zahl von 5 Genomkopien kann reproduzierbar in
Verdünnungsreihen nachgewiesen werden.
Sowohl der Einsatz einer „Hot Start"-Polymerase als auch die zyklusweise Reduktion der Hybridisierungstemperatur verhindert die Bildung von Primer- Dimeren und die erhöht die Sensitivität der Amplifikation.
Beispiel 4: Spezifische Amplifikation von 16S-rRNA- Fragmenten von Mykobakterien (erfindungsgemäß)
In einem ersten Ansatz gemäß Beispiel 1 wird mit den entsprechenden erfindungsgemäßen Primerpaaren ein jeweils 100 bp langes Fragment der Gattungsspezifischen Region III (SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5) und ein 300 bp langes Fragment der Art-spezifischen Regionen (SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3) amplifiziert. In einem zweiten Ansatz gemäß Beispiel 1 wird ein 1000 bp langes Fragment, das sowohl die Gattungsspezifische Region III als auch die beiden Artspezifischen Regionen enthält, mit dem entsprechen- 5 den Primerpaar (SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5) amplifiziert.
Anschließend wird die Sensitivität des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens gemäß Beispiel 1 getestet.
10 Ergebnis:
Überraschenderweise ergibt sich, dass das 1000 bp lange Fragment gegenüber den beiden 100 bp und 300 bp langen Fragmenten dieselbe Sensitivität des Nachweises besitzt. Dieses Ergebnis steht im Gegen-
15. satz zu dem Vorurteil aus dem Stand der Technik, wonach es aufgrund des hohen CG-Nucleotidgehalts im 16S-rRNΑ-Gen von Mykobakterien zu unspezifischen Störungen bei dem Nachweisverfahren gemäß Beispiel 1 in einem LightCycler™-System kommt.
20
Beispiel 5: Sensitivität des erfindungsgemäßen NachweisVerfahrens
Zur Überprüfung der Sensitivität wird im erfindungsgemäßen Nachweisverfahren (Beispiel 1) das mit 25 dem Primer-Paar SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5 amplifi- zierte 1000 bp-Fragment eingesetzt. a) Sensitivität des Nachweises der Gattungsspezifischen Region III
Zunächst wird eine Verdünnungsreihe des Genoms von M. bovis BCG aus dem M. tuberculosis-Komplex wird erstellt, die jeweils 5, 50, 500 beziehungsweise 5000 Genomkopien enthält.
In weiteren Ansätzen werden Verdünnungsreihen weiterer tuberkulöser und nicht-tuberkulöser Mykobakterienarten untersucht.
Ergebnisse: a) Bereits bei 5 Genomkopien lässt sich eindeutig eine Schmelzkurve bestimmen, wobei der Schmelzpunkt der Gattungs-spezifischen Region III für alle Mykobakterienarten bei mindestens 55 °C liegt. Bei M. chelonae liegt der Schmelzpunkt bei 55 °C, bei allen anderen Mykobakterienarten bei 61,5°C.
b) Darüber hinaus zeigt sich, dass bei einer Vielzahl anderer Mykobakterienarten, beispielsweise von M. tuberculosis , M. bovis, M. avium, M. intracellu- lare, M. para tuberculosis, M. kansasii , M. marinum, M. abcessus, M. fortui tum, ein eindeutiger Nachweis der Gattungs-spezifischen Region III bei einer Zahl von 5 Genomkopien erfolgen kann.
b) Sensitivität des Nachweises von M. tuberculosis
Gemäß a) wird eine Verdünnungsreihe des M. tubercu- losis-Genoms erstellt, die jeweils 5, 50, 500 beziehungsweise 5000 Kopien enthält. Ergebnis :
Bereits bei 5 Genomkopien kann die Schmelzkurve der Art-spezifischen Region von M. tuberculosis eindeutig bestimmt werden (Figur 2) . Dabei liegt der er- mittelte Schmelzpunkt bei 64°C (Tabelle 1).
c) Sensitivität des Nachweises von M. avium
Entsprechend a) und b) wird eine Verdünnungsreihe des Genoms von M. avium angefertigt und mit den entsprechenden Hybridisierungssonden-Paaren eine Schmelzkurvenanalyse der amplifizierten Fragmente durchgeführt .
Ergebnis:
Bereits ausgehend von 5 Genomkopien ist eine Schmelzkurvenanalyse des Amplicons möglich, wobei ein Schmelzpunkt von 61,0°C festgestellt wird (Tabelle 1) .
Beispiel 6: Spezifität des erfindungsgemäßen NachweisVerfahrens
a) Spezifität der Amplifikations-Primer
Aus den Mikroorganismen aus Tabelle 1 wird pro Ansatz jeweils 2,5 ng genomische DNA, entsprechend 500000 Genomkopien, extrahiert und in das erfindungsgemäße Nachweisverfahren eingesetzt.
Wie in Beispiel 5 wird dabei mit dem Gattungsspezifischen Primerpaar SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5 ein 1000 bp langes Fragment des 16S-rRNA-Gens amplifiziert . Ergebnisse : a) Bei sämtlichen untersuchten Mykobakterienarten findet Amplifikation statt.
b) Das eingesetzte Primer-Paar zeigt eine fast vollständige Gattungs-Spezifität für Mykobakterien:
Ausgewählt aus der Vielzahl verschiedener bakterieller und pilzlicher Mikroorganismen findet lediglich bei der Gattung Corynebakterium eine Amplifikation des 16S-rRNA-Gens statt.
b) Spezifität des Gattungs-spezifischen Nachweises
Eine Schmelzkurvenanalyse der in amplifizierten Fragmente mittels des erfindungsgemäßen Hybridisierungssonden-Paars SEQ ID NO: 10 /SEQ ID NO: 11, spezifisch für die Gattungs-spezifische Region III, wird durchgeführt.
Ergebnisse (Tabelle 1) : a) Sämtliche Mykobakterienarten weisen einen Schmelzpunkt von mindestens 55 °C auf.
b) Bei M. chelonae liegt der Schmelzpunkt bei 55 °C, bei allen anderen Mykobakterienarten bei 61,5°C.
c) Der Schmelzpunkt bei amplifizierten 16S-rRNA- Fragmenten der Gattung Corynebakterium liegt bei 43 °C, beziehungsweise es kann überhaupt kein Hybri- disierungssignal detektiert werden.
d) Mittels des erfindungsgemäßen Gattungsspezifischen Nachweisverfahrens lassen sich sämtliche Mykobakterienarten eindeutig gegenüber anderen Mikroorganismen identifizieren. c) Spezifität des Nachweises des M. tuberculosis- Komplex
Entsprechend a) werden zunächst jeweils 2,5 ng genomischer DNA der in Tabelle 1 aufgelisteten Mikro- Organismen eingesetzt und jeweils ein 1000 bp langes Fragment amplifiziert.
Anschließend wird mit dem Art-spezifischen Hybridi- sierungssonden-Paar SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 7 eine Schmelzkurvenanalyse der Amplicons durchgeführt.
Ergebnis:
Während die Schmelztemperatur bei den Arten des M. tuberculosis-Komplex bei einheitlich 64 °C liegt, beträgt die Schmelztemperatur für alle nichttuberkulösen Erreger zwischen 43,5°C und 54 °C, falls überhaupt ein Hybridisierungssignal detek- tiert werden kann (Tabelle 1) .
Mittels des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens lassen sich tuberkulöse Erreger gegenüber allen anderen nicht-tuberkulösen Erregern selektiv nachwei- sen.
d) Spezifität des Nachweises des M. avium
Entsprechend a) werden zunächst jeweils 2,5 ng genomischer DNA der in Tabelle 1 aufgelisteten Mikroorganismen eingesetzt und jeweils ein 1000 bp lan- ges Fragment amplifiziert.
Anschließend wird mit dem Art-spezifischen Hybridi- sierungssonden-Paar SEQ ID NO: 8/SEQ ID NO: 9 eine Schmelzkurvenanalyse der Amplicons durchgeführt. Ergebnis :
Während die Schmelztemperatur bei M. avium bei einheitlich 61°C liegt, beträgt die Schmelztemperatur für alle anderen Erreger zwischen 43 °C und 54 °C, falls überhaupt ein Hybridisierungssignal detek- tiert werden kann (Tabelle 1) .
Mittels des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens lässt sich der nicht-tuberkulöse Erreger M. avium gegenüber allen anderen Erregern selektiv nachwei- sen.
Beispiel 7: Vergleichsbeispiel zur Spezifität des Gattungs-spezifischen Nachweises mittels der Gattungs-spezifischen Region II („genus II")
Im Gegensatz zum vorstehenden erfindungsgemäßen Beispiel 6 b) werden zur Schmelzkurvenanalyse des gemäß 6 a) amplifizierten 1000 bp-Fragments des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien aus Tabelle 1 die aus dem Stand der Technik bekannten Hybridisie- rungssonden verwendet, die für die Gattungs- spezifische Region II selektiv sind (siehe Figur 1: , genus II' ) .
In Tabelle 1 sind die Ergebnisse der Schmelzkurvenanalyse dargestellt: Während ein Großteil der un- tersuchten Mykobakterienarten einen Schmelzpunkt von 60,5°C besitzt, ist bei den Mykobakterienarten M. triviale, M. chitae, M. xenopi und M. agri der Schmelzpunkt gegenüber den anderen Mykobakterienarten erniedrigt (Tabelle 1) . Außerdem werden auch bei der Gattung Cornyebakterium Amplifikate detek- tiert .
Ergebnis :
Die gefundenen Schmelzpunkte von M. triviale, M. chitae, M. xenopi , M. agri und allen anderen Mykobakterienarten lassen sich statistisch nicht von den gefundenen Schmelzpunkten der CorynebakteriumArten trennen. Ein eindeutiger Nachweis einer Myko- bakterieninfektion gegenüber zum Beispiel einer In- fektion mit Corynebakterien ist mittels der Gattungsspezifischen Region II nicht möglich.
Beispiel 8: Quantitative Bestimmung des Gehalts an Mykobakterien in klinischen Proben (erfindungsge- maß)
In dem erfindungsgemäß eingesetzten FRET-System ist unter bestimmten Bedingungen das Maß an Fluoreszenz in diesem Wellenlängenbereich eine Funktion der Menge an in der Probe vorhandenen und detektierten DNA. Durch das FRET-System sind quantitative Messungen der Menge amplifizierter DNA-Fragmente möglich, wenn die ausgewählten Hybridisierungssonden quantitativ, also stöchiometrisch, an die amplifizierten Fragmente binden.
Zur Quantifizierung von „Target"-DNA, wird diese mit einer bekannten DNA-Konzentration eines Standards verglichen. Dazu eignet sich das clonierte 16S rRNA-Gen im pGEM-T oder auch das erfindungsgemäß einsetzbare Kontrollplasmid (pIJ6) . Die Fluoreszenz wird bei dieser Methode nach jedem der insgesamt 50 Amplifikationszyklen gemessen. Bei einer hohen Konzentration des Standards erscheint ein Fluoreszenzsignal beispielsweise bereits nach 20 Zyklen. Eine niedrige Konzentration führt erst nach beispielsweise 35 Zyklen zu einem Signal.
Der Standard wird zum einen getrennt von den zu untersuchenden Proben gemessen, wobei wenigstens fünf verschiedene Konzentrationen verwendet werden, um eine Standardkurve zu erstellen. Wird das Plasmid pIJ6 verwendet, kann jeweils eine Konzentration des Standards in jeder untersuchten Probe verwendet werden. Die Unterscheidung zwischen Standard und „Target-DNA" erfolgt über den unterschiedlichen Schmelzpunkt. Der Standard dient insbesondere gleichzeitig als Kontrolle, dass die Amplifikation nicht durch Störfaktoren inhibiert wurde (Inhibitionskontrolle) .
Zur Detektion der amplifizierten Fragmente werden die in der Reaktionsmischung eingesetzten FRET- markierten Hybridisierungssonden-Paare verwendet. Die Amplifikationsreaktion läuft wie in Beispiel 1, wobei nach jedem Amplifikationsschritt die Fluoreszenz gemessen wird. Die optimale „Annealing,,- Temperatur liegt bei 62 °C. Die Schmelzpunktanalyse wird unbeeinträchtigt nach Abschluss der Amplifikationsreaktion wie in Beispiel 1 c) durchgeführt. Tabelle 1:
Figure imgf000056_0001
Figure imgf000057_0001
') A: Amplifikation des 16S-rRNA-Fragments mit den erfindungsgemäßen Gattungs-spezifischen Primern +: Amplifikation erfolgt -: Amplifikation nicht erfolgt

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zum gemeinsamen und jeweils spezifischen Nachweis einer Mykobakterieninfektion, des Mycobacterium tuberculosis-Komplex und/oder von Mycobacterium avium in klinischem Material u - fassend die Schritte
a) Extraktion von mikrobieller DNA aus klinischem Material,
b) Vervielfachung von mindestens einem Fragment des 16S-rRNA-Gens aus der extrahierten DNA mit- tels eines Primerpaares umfassend die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5 oder mittels zweier Primerpaare, wobei das eine Primerpaar die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3 umfasst und das andere Primer- paar die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5 umfasst,
c) Detektion der Gattungs-spezifischen Region des vervielfachten 16S-rRNA-Fragments von Mykobakterien mittels eines Paares markierter Hybridi- sierungssonden, wobei das Paar die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11 umfasst,
d) Detektion der Art-spezifischen Region des vervielfachten 16S-rRNA-Fragments von Mykobakterien mittels eines Paares markierter Hybridi- sierungssonden, wobei zum Nachweis des Mycobacterium tuberculosis-Komplex das Paar die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 7 oder die komplementären Sequenzen davon umfasst und wobei zum Nachweis von Mycobacterium avium das Paar die Nucleotidsequenzen von SEQ ID NO: 8/SEQ ID NO: 9 oder die komplementären Sequenzen davon umfasst, und
e) wobei der gemeinsame, jeweils spezifische Nachweis von Mykobakterien und des Mycobacterium tuberculosis-Komplex und/oder von Mycobacterium avium während der Detektion gemäß der Schritte c) und d) mittels Schmelzkurvenanalyse erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch.1, wobei die extrahierte mikrobielle DNA in Verfahrensschritt a) mit mindestens einem künstlichen Plasmid, die als interner Standard dient, vermischt wird, wobei das künstliche Plasmid eine Gattungs-spezifische Re- gion III der 16S-rRNA von Mykobakterien oder Teile davon umfasst, welche in ihrer Nucleotidsequenz modifiziert wurde, und wobei eine Schmelzkurvenanalyse zum spezifischen Nachweis der vervielfachten 16S-rRNA-Fragmente von Myko- bakterien und der modifizierten 16S-rRNA- Fragmente des künstlichen Plasmids durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die extrahierte mikrobielle DNA aufgeteilt wird und ein erster Teil davon im Verfahren nach den Schritten a) bis e) von Anspruch 1 weiterbehandelt und ein zweiter Teil einem parallelen Verfahren unterzogen wird, umfassend die Schritte
a ') Vermischen der extrahierten mikrobiellen DNA mit mindestens einem künstlichen Plasmid als inter- ner Standard, wobei das künstliche Plasmide eine Gattungs-spezifische Region III der 16S-rRNA von Mykobakterien oder Teile davon umfasst, welche in ihrer Nucleotidsequenz modifiziert wurde,
b' ) Vervielfachung der 16S-rRNA-Fragmente mittels mindestens einem Primerpaar ausgewählt aus der Gruppe umfassend die Nucleotidsequenzen-Paare SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5,
c') Detektion der vervielfachten 16S-rRNA-Fragmente mittels eines Paars markierter Hybridisierungssonden, die mit der Gattungs-spezifischen Region III des 16S-rRNA-Fragments von Mykobakterien hybridisieren, wobei das Paar die Nucleotidse- quenzen SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11 oder die komplementären Sequenzen davon umfasst, und
d') wobei zum spezifischen Nachweis der vervielfachten 16S-rRNA-Fragmente von Mykobakterien und der modifizierten 16S-rRNA-Fragmente des min- destens einen künstlichen Plasmids während der Detektion gemäß Schritt c' ) eine Schmelzkurvenanalyse erfolgt.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Vervielfachung der Genfragmente mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) als Echtzeit-PCR, bevor- zugt mittels LightCycler™-System, durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Detektion während oder nach der Vervielfachung der 16S-rRNA-Fragmente erfolgt.
7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Detektion mittels Echtzeit-PCR, besonders bevorzugt mittels LightCycler™-System erfolgt.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprü- ehe, wobei die Detektion mittels Fluoreszenznachweis durchgeführt wird und wobei die markierten Hybridisierungssonden-Paare als Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Paar ausgebildet sind.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Schmelzkurvenanalyse im Anschluss an die Vervielfachung der 16S-rRNA-Fragmente mittels Echtzeit-PCR, bevorzugt mittels Light- Cycler™-System, erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Detektion als quantitative Messung durchgeführt wird.
11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das klinische Material ausgewählt ist aus der Gruppe klinischer Proben bestehend aus Sputum, Bronchiallavage, Magensaft, Urin, Stuhl, Liquor, Knochenmark, Blut und Biopsien.
12. Oligonucleotid-Primerpaar, welches die Nuclein- säuren mit den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3 aufweist.
13. Oligonucleotid-Primer, welcher die Nucleinsäu- ren mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 4 aufweist.
14. Oligonucleotid-Hybridisierungssonden-Paar, welches die Nucleinsäuren mit den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 oder mit den komplementären Sequenzen davon aufweist.
15. Oligonucleotid-Hybridisierungssonden-Paar, welches die Nucleinsäuren mit den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 oder mit den komplementären Sequenzen davon aufweist.
16. Oligonucleotid-Hybridisierungssonden-Paar, welches die Nucleinsäuren mit den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 oder mit den komplementären Sequenzen davon aufweist.
17. Künstliches Plasmid einsetzbar als interne Kon- trolle der Vervielfachung und des Nachweises von
16S-rRNA-Fragmenten von Mykobakterien, umfassend modifizierte Sequenzen der Gattungs-spezifischen
Region III des 16S-rRNA-Gens .
18. Künstliches Plasmid nach Anspruch 17, wobei das künstliche Plasmid mindestens einen/eine Nucleo- tid-Austausch, -Addition, -Deletion und/oder - Inversion gegenüber der Wildtyp-Sequenz der Gat- tungs-spezifischen Region III des 16S-rRNA-Gens aufweist.
19. Künstliches Plasmid nach Anspruch 17 oder 18, umfassend die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 14 o- der SEQ ID NO: 15.
20. Künstliches Plasmid nach Anspruch 17 oder 18, umfassend die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 16 o- der SEQ ID NO: 17.
21. Diagnose-Kit zum spezifischen Nachweis einer
Mykobakterieninfektion und des Myco-acteriu-n tu- jberculosis-Komplex und von Mycobacterium avium in klinischem Material gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 umfassend:
a) mindestens eine Polymerase,
b) mindestens ein Primerpaar gemäß Anspruch 12,
c) mindestens ein Primerpaar enthaltend einen Primer gemäß Anspruch 13, das die Gattungsspezifische Region III von Mykobakterien amplifiziert.
d) ein Hybridisierungssonden-Paar gemäß Anspruch 16 zur Detektion der Gattungs-spezifischen Region III, e) mindestens ein Hybridisierungssonden-Paar gemäß den Ansprüchen 14 bis 15 zur Detektion der Art-spezifischen Regionen.
22. Diagnose-Kit nach Anspruch 21, beinhaltend ein künstliches Plasmid gemäß einem der Ansprüche 17 bis 20.
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