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Verfahren zur
schnellen quantitativen Bestimmung von Eubakterien
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Die Erfindung betrifft ein schnelles,
kostengünstiges
Verfahren zur Bestimmung der Gesamtzahl von Eubakterien sowie der
Anzahl von Eubakterien einzelner Spezies.
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Es ist bereits bekannt, Eubakterien
nachzuweisen und ihre Zahl zu erfassen. Im allgemeinen erfolgt dabei
keine Differenzierung der Bakterienspezies. Diese ist nur mittels
spezifischer weiterer, parallel oder nachfolgend durchgeführter Ansätze möglich. So
hat das Kultivieren von Eubakterien auf Nährmedien den Nachteil, daß viele
Bakterienarten gar nicht angesprochen und zum Wachstum veranlaßt werden.
Die Ursache liegt in der mangelnden Eignung der verfügbaren Nährmedien.
Viele Bakterienarten wachsen nur recht und schlecht, was auch auf
die bisher unzureichende Erforschung der Kultivierungsbedingungen
für viele
Bakterien zurückzuführen ist.
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Für
die quantitative Erfassung einzelner Bakterienspezies ist weiterhin
die Unspezifität
der Nährmedien
nachteilig. Mehrere Keimspezies wachsen mit ähnlicher Intensität und verhindern
eine Differenzierung. Es können
auch nicht alle gewünschten
Spezies erfaßt
werden, weil eben nur lebende, unbeschädigte Zellen wachsen, während die
anderen aus einem Nachweis herausfallen. Dazu kommt, daß die Stoffwechselprodukte der
einen Spezies das Wachstum der anderen stören können, so daß eine weitere Meßergebnisverfälschung Platz
greift.
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Nachteilig sind auch Zeitbedarf und
Kosten. Der Zeitbedarf resultiert aus der gegebenen Geschwindigkeit
der Zellvermehrung, die Kosten aus der Notwendigkeit der Verwendung
spezieller Substrate, dem Einhalten spezifischer Kulturbedingungen
und der Pflege der Kulturen, die apparativen und personellen Aufwand erfordert.
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Ein Teil der Bakterien darf aus Gründen erlassener
Vorschriften nur mit Testkits untersucht werden. Diese sind teuer.
Der Ausweg wäre
das Durchführen
der Arbeiten in einem zertifizierten Labor. Das ist noch teurer
und für
Routineuntersuchungen nicht mehr denkbar.
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Es ist weiterhin bekannt, Eubakterien
durch Phasenkontrast- und/oder Dunkelfeldmikroskopie nachzuweisen
und zu bestimmen.
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Das hat aber den Nachteil, daß die Identifizierung
subjektiv verfälscht
ist. Ursache dafür
ist die Beurteilung des Gesichtsfeldes im Mikroskop durch einen
zwar erfahrenen Mikrobiologen, der aber doch auf visuelle Weise
arbeitet mit den daraus resultierenden Fehlerquellen. Auf diese
Weise können
Gruppen von Bakterienspezies identifiziert werden, meist keine einzelnen
Arten. Der Grund ist in der habituellen Ähnlichkeit der Untersuchungsobjekte
zu sehen. Nachteilig ist weiterhin, daß der Analyt nur im status
quo untersucht werden kann. Das kommt daher, daß unter den Analysebedingungen
die Bakterien nicht wachsen können.
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Weiterhin sind Arbeiten bekannt geworden,
Eubakterien über
ihre Stoffwechselprodukte zu identifizieren. Allerdings sind viele
Bakterien so nicht zu erfassen. Das liegt daran, daß nur eine
begrenzte Anzahl von Stämmen
und Arten spezifisch nachweisbare Stoffwechselprodukte freisetzt.
Dies wiederum führt
dazu, daß Gruppen
von Bakterien falsch positiv erfaßt werden, weil verwandte Arten
auch ähnliche
Stoffwechselprodukte ausscheiden. Und eine Quantifizierung der Bakterien über ihre
Stoffwechselprodukte ist gleich gar nicht möglich, weil die Intensität des Stoffwechsels
weder steuerbar noch reproduzierbar ist.
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Es ist darüber hinaus bekannt, Eubakterien
mit immunologischen Methoden nachzuweisen. Diese Methoden sind teuer.
Ursache ist das notwendige Verwenden polyklonaler Antiseren oder
monoklonaler Antikörper,
die nur unter hohem Zeit- und Mitteleinsatz selbst herzustellen
oder teuer zu erwerben sind. Diese Methoden haben sich daher nicht
allgemein durchsetzen können.
Eine Quantifizierung einzelner Bakterienspezies mittels immunologischer
Methoden ist nur bedingt möglich,
da die Expression von Antigenen starken Schwankungen unterliegen
kann. Für
eine Erfassung der Gesamtbakterienzahl eignen sich immunologische
Verfahren wegen der hohen Spezifität der Antikörper prinzipiell nicht.
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Schließlich sind nukleinsäurebasierte
Methoden bekannt. Diese werden in Hybridisierungsmethoden und in
Polymerasekettenreaktion (PCR)-Verfahren unterschieden. Die Hybridisierungsmethoden
setzen die Kenntnis geeigneter, meist mehrere hundert Basenpaare
langer Zielsequenzen voraus. Bisher zeigt sich, daß die erreichte
Sensitivität
der Hybridisierungsverfahren unzureichend ist. Die Ursache liegt
darin, daß nur
die gerade vorhandene Zahl von Bakterien nachgewiesen wird und keine
Vermehrung des Analyten geschieht. Die bisher eingesetzten sekundären Verstärkungsmittel
sind störanfällig und
verhindern letztlich eine ausreichend genaue Quantifizierung. Hohe
Sensitivität
ist nur durch radioaktive Methoden zu erreichen. Die Begleitumstände aber
sind eine aufwendige Methodik und Schwierigkeiten bei der Entsorgung
der radioaktiven Abfälle.
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Die PCR setzt die Kenntnis zweier
kurzer, in geeignetem Abstand (100 bis 2000 Basenpaare) voneinander
entfernter Sequenzen für
die Primerbindung voraus. Sie ist, neben der Kultivierung, die einzige
Keimnachweismethode, bei der eine Vermehrung des Analyten erfolgt.
Der Keimnachweis erfolgt über
die Amplifikation der Zielsequenz (Template). Die PCR ist primär eine qualitative
Methode. Zwischen Template- und Produktmenge besteht ein extrem
nichtlinearer, von zahlreichen, experimentell schwer kontrollierbaren
Einflußgrößen bestimmter
Zusammenhang. Daher erlaubt die PCR beim Bakteriennachweis nur eine
jalnein-Antwort, bestenfalls eine halb-quantitative Abschätzung der
Keimmengen, jedoch keine Quantifizierung. Die Kombination von hoher
Sensitivität
und fehlender Quantifizierbarkeit führt leicht zu falsch-positiven
Ergebnissen. Damit ist die PCR für
den Nachweis von Bakterien oft zu empfindlich und hat sich deshalb
bisher in der Praxis nicht durchsetzen können. Die Anwesenheit von PCR-Inhibitoren
(Hemmstoffen der Taq-Polymerase) in den zu untersuchenden Proben
führt zu
einer verringerten Sensitivität
bis hin zu falsch-negativen Ergebnissen. Nur hochreine DNA ist mit
Sicherheit frei von PCR-Hemmstoffen. Proben aus Medizin, Umwelt
oder Biotechnologie enthalten oft PCR-Hemmstoffe (z. B. Blut, Eiter, Schwermetallionen).
Durch Reinigungsschritte können
ebenfalls Hemmstoffe der PCR in die Probe gelangen. Auch kann man
nie sicher sein, das verfügbare
kommerzielle Reinigungs-Kits dieses Problem lösen und alle Hemmstoffe beseitigen
bzw. keine neuen hinzufügen.
Das Problem wird einzig von Methoden der kompetitiven PCR gelöst, bei
denen der Probe eine zur bakteriellen Zielsequenz homologe oder
heterologe Kompetitor-DNA zugesetzt wird. Bei annähernd gleicher
Amplifikationseffizienz kann aus dem Verhältnis der Amplifikatmengen
von Probe und Kompetitor auf das Verhältnis der eingesetzten Templatemengen,
und aus der bekannten Kompetitortemplatemenge auf die Probentemplatemenge geschlossen
werden. Kompetitive PCR ist damit ein weniger störanfälliges und echt quantitatives Verfahren zur
DNA-, und damit auch zur Bakterienbestimmung.
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Klassische qualitative und quantitative
PCR-Methoden sind zeitaufwendig. Dies betrifft sowohl die DNA-Amplifikation
als auch den Nachweis bzw. die Quantifizierung der PCR-Produkte,
die z. B. durch Agarosegelelektrophorese, Ethidiumbromidanfärbung und
Videodensitometrie erfolgen. Für
Bakteriennachweise und -quantifizierungen, deren Ergebnisse aus
medizinischen oder, bei biotechnologischen Analysen, prozeßtechnologischen
Gründen
möglichst
schnell vorliegen müssen,
ist der Zeitbedarf von mindestens einem Arbeitstag oft unakzeptabel.
Aus der
DE 197 32
086 A1 ist eine Methode zur quantitativen Bestimmung von
Eubakterien bekannt, jedoch wird darin keine eukaryontische Kompetitor-DNA
vorgeschlagen. Auch wird keine Schmelztemperaturdifferenz zwischen
einer eukaryontischen Kompetitor-DNA und dem Amplifikat beschrieben.
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Es existieren Verfahren der "real time"-PCR, bei denen dem
PCR-Ansatz ein geeigneter Fluoreszenzfarbstoff, z. B. SYBR® Green
I, zugesetzt und die Entstehung der Amplifikate während der
PCR mittels fluoreszenzoptischer Verfahren bereits während der
PCR verfolgt wird. Damit entfällt
die der PCR nachgelagerte Analytik oder wird stark vereinfacht.
Im Falle des LightCycler® der Firma Roche Diagnostics
ist auch die PCR deutlich schneller als auf Blockthermocyclern,
weil in Glaskapillaren amplifiziert wird, die einen schnelleren
Wärmeübergang
erlauben als die sonst üblichen
Plastikröhrchen.
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Neben dem Nachweis über SYBR® Green
I (Wittwer et al., 1997) ist beim LightCycler® auch
ein Produktnachweis über
sequenzspezifische Sonden möglich.
Nach dem Prinzip des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers (FRET)
ist bei Nutzung von zwei entsprechend modifizierten Oligonukleotiden,
die als Hybridisierungssonden verwendet werden, eine sequenzspezifische
Detektion von PCR-Produkten möglich
(Wittwer et al.,1997). Bei dieser Methode binden die beiden Oligonukleotide
nebeneinander ("head-to-tail") während der Annealingphase
der PCR innerhalb der amplifizierten Sequenz. Die 5'-Sonde ist mit Fuoresznein
am 3'-Ende modifiziert,
während
die 3'-Sonde LightCycler®-Red
640 am 5'-Ende trägt. So kann
ein Signal nach geeigneter Beleuchtung erhalten werden, da das Licht
das Fluorophor der ersten Sonde (Fluoreszein) anregt. Ein Teil der absorbierten
Energie wird auf die zweite Sonde übertragen. Diese Energie regt
wiederum das LightCycler®-Red 640 an, was danach
ein meßbares
Lichtsignal einer längeren
Wellenlänge
aussendet. Obwohl diese Methode eine sehr hohe Sensitivität und Spezifität aufweist
(Eckert et al., 2000), ist die Herstellung der Sonden problematisch.
Es müssen
für jedes
Template spezifische Sonden entworfen und synthetisiert werden.
Dies ist mit hohen Kosten und großem experimentellen Aufwand
für das
Testen und Optimieren der Sonden verbunden (Morrison et al., 1998;
Steuerwald et al., 1999). Oft müssen
mehrere Sondenpaare getestet werden, bevor ein geeignetes Paar gefunden
wird. Ein Nachweisverfahren für
Bakterien mit Hilfe der "real
time"-PCR im LightCycler® wurde
von Logan et al., 2001, beschrieben. Ein quantitativer Nachweis
mit einer Kompetitor-DNA findet nicht statt. Auch wird kein eukaryontischer
Kompetitor vorgeschlagen.
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Der LightCycler® ist, über eine
kinetische Analyse der PCR, zur Quantifizierung von DNA geeignet.
Für eine
Quantifizierung von Bakterien oder zur Quantifizierung von DNA in
biologischen Proben, die PCR-Inhibitoren enthalten können, eignet
sich diese Verfahren jedoch nicht, da es nicht auf kompetitiver
PCR beruht, und damit gegenüber
Probenverunreinigungen empfindlich ist (Rupf et al. 2001, s. o.).
Kompetitive PCR auf dem LightCycler® bei
kinetischer Quantifizierung der Produkte ist prinzipiell möglich, erfordert
aber den Einsatz von zwei Paaren von Hybridisierungssonden und eine
Optimierung der Analytik hinsichtlich beider Sondenpaare. Dies ist
teuer und extrem zeitaufwendig. Wohl deshalb wurden bisher keine
quantitativen competitiven PCRs auf dem LightCycler® publiziert.
Stults et al., 2001, beschreiben den quantitativen Nachweis von
Eubakterien durch TagMan®-PCR. Zur Quantifizierung
werden jedoch externe Standards verwendet, jedoch keine eukaryontische
Kompetitor-DNA. Auch wird kein interkalierender Fluoreszenzfarbstoff
sondern es werden Fluoreszenzfarbstoff-markierte Primer oder Sonden
verwendet.
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Die Erfindung hat das Ziel, eine
einfache, schnelle und kostengünstige
Methodik anzugeben, nach der Eubakterien, deren DNA oder RNA auf
dem LightCycler® sicher,
d. h. auch in biologischen Proben, die PCR-Inhibitoren enthalten
können,
quantitativ bestimmt werden können.
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Die Aufgabe ist darin zu sehen, in
Ausgangsproben völlig
unterschiedlicher Herkunft, zum Beispiel in humanem Gewebe, in Blut,
in Sputum, in Speichel aber auch in Lebensmitteln (z. B. Bier),
Abwasser, Kompostabluft und dergleichen nach eventueller Aufreinigung
der Proben Eubakterien mit Hilfe der "real time"-PCR-Technologie quantitativ zu bestimmen.
Die Bestimmung soll schnell erfolgen, Hybridisierungssonden nicht
erforderlich sein.
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Dabei soll eine Gesamtbestimmung
der Bakterien ebenso möglich
sein wie der Einzelnachweis und die entsprechende Bestimmung einzelner
Bakterienspezies. Jedermann soll den Bakterientest durchführen können, unabhängig von
der Pathogenität
der nachzuweisenden Erreger.
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Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch
gelöst,
daß wie
folgt verfahren wird.
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Von den verschiedenen methodischen
Varianten der quantitativen PCR wird die kompetitive gPCR mit heterologem
inneren Standard als Grundlage gewählt. Eine solche gPCR-Methode
wird zur Bestimmung der Gesamtbakterienzahl verwendet (Verfahren
zur quantitativen Bestimmung von Eubakterien in ihrer Summe). Dazu
werden zu hochkonservierten Teilsequenzen in den 16S rRNA-Genen
von Eubakterien zwei komplementäre
PCR-Primer (Vorwärts-
und Rückwärts-Primer)
synthetisiert. Mit diesen Primern ist ein PCR-Nachweis von Eubakterien
unterschiedlicher Spezies möglich
(Rupf et al., 1999a). Dagegen werden mit Archae-Bakterien und Eukaryonten
keine Amplifikate erhalten. Zur Gewinnung des heterologen Kompetitors
wird eine eukaryontische DNA-Sequenz, die den 16S rDNA-Sequenzen
völlig
unähnlich
ist und einen um 2-3 °C
vom Schmelzpunkt der Amplifikate der Eubakterien-DNA verschiedenen
Schmelzpunkt aufweist, so in die Multikloningstelle eines geeigneten
Plasmids kloniert, daß flankierend
leicht die Bindungsstellen für
die zur Amplifizierung der bakteriellen DNA verwendeten Primer eingebaut
werden können.
Dies geschieht, indem vor bzw. hinter dem eukaryontischen Insert
durch Verdau mit jeweils zwei Restriktasen, die im Plasmid nur einmal
schneiden, das Plasmid geöffnet
wird und nacheinander jeweils ein Hybrid aus Primer und komplementärem Primer, verlängert um
die Basen, die die aus den Restriktionsverdauen resultierenden Basenüberhänge ausfüllen und jeweils
5'-seitig phosphoryliert,
gerichtet einkloniert wird. Mit Hilfe von M13-Primern, die außerhalb
der einklonierten Primerbindungs stellen binden, kann mittels PCR
unter Verwendung dieser Plasmide Kompetitor-DNA hergestellt werden,
die z. B. durch UV-Spektrometrie, quantifiziert werden kann. Die
Konstruktion dieser Kompetitoren ist beispielhaft für die Kompetitoren
für die
Quantifizierung von Eubakterien und von Streptococcus mutans in 1 dargestellt.
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Bei Zugabe bekannter Mengen dieses
Kompetitors zu bakterienhaltigen Proben oder Proben, die Bakterien-DNA
oder mittels reverser Transkriptase aus bakterieller Total-RNA erzeugte
cDNA enthalten, und anschließender
PCR mit dem Vorwärts-
und dem Rückwärts-Primer
wird ein Amplifikatgemisch erhalten, dessen Zusammensetzung aus
PCR-Produkt von Bakterien-DNA und PCR-Produkt vom Kompetitor proportional
zum Verhältnis
der Moleküle
von Bakterien-DNA
und Kompetitor in der Probe ist. Nach Erstellen von Eichkurven, bei
denen bekannte Mengen des Kompetitors gegen eine jeweils konstante,
bekannte Anzahl von Bakterien-DNA oder Bakterienzellen titriert
wird, kann aus dem für
eine unbekannte Probe ermittelten Mengenverhältnis von Proben- und Kompetitor-Amplifikat
und der bekannten Menge zugesetzten Kompetitors die in der Probe
vorhandene Anzahl von Bakterien-DNA-Molekülen bzw. Bakterienzellen bestimmt
werden. Da die DNA-Menge pro Zelle konstant ist und die mittlere
Kopienzahl der 16S rDNA-Gene von Eubakterien bekannt ist (3,6; Klappenbach
et al., 2001), erlaubt das Ergebnis eine Ermittlung der Zellzahl
auch komplexer Bakteriengemische, die in ihrer Genauigkeit von keiner
bekannten Methode übertroffen
wird.
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Die Bestimmung der Mengenverhältnisse
der bei der kompetitiven "real
time"-PCR erhaltenen PCR-Produkte
von Bakterien- und Kompetitor-DNA erfolgt erfindungsgemäß durch
die Ermittlung der Flächenverhältnisse
der Peaks, die bei der der PCR folgenden Schmelzkurvenanalyse erhalten
werden. Die Peakflächen
werden mit der Geräteinternen
Software des LightCycler®s ermittelt, können nach
Export der Schmelzkurvendatenliste aber auch mit jeder anderen,
zur Integration von Flächen
unter Kurven geeigneten Software (z. B. Excel Microsoft) oder Peakfit
(Jandel Scientific)) bestimmt werden. Die Bestimmung der Mengenverhältnisse
der bei der kompetitiven "real
time"-PCR erhaltenen
PCR-Produkte aus dem Flächenverhältnis der Schmelzkurvenpeaks
ist neu, da vom Gerätehersteller
(Roche Diagnostics) die Schmelzkurvenanalyse ausschließlich zur
qualitativen Charakterisierung der PCR-Produkte (Ermittlung der
Temperatur, bei dem die Schmelzkurven ihr Maximum haben = "Schmelzpunkt" der Amplifikate)
empfohlen wird. Eine quantitative Analyse der Schmelzkurven wird
von Roche Diagnostics nicht empfohlen, weil nicht für sinnvoll
erachtet. Die Ursache dafür
liegt in dem Umstand begründet,
daß, obgleich
die Schmelzkurven aus der ersten Ableitung der Fluoreszenz gegen
die Temperatur entstehen und dementsprechend die Peakfläche eines
Amplifikates zu seiner Menge proportional ist, die Fläche des
Schmelzkurvenpeaks von PCR-Ansatz zu PCR-Ansatz auch bei bestmöglicher
Kontrolle der Reaktionsbedingungen nicht reproduzierbar ist. Die
Erfindung geht davon aus, daß demgegenüber in ein
und demselben PCR-Ansatz das Verhältnis der Menge von zwei Amplifikaten
(Proben-DNA und Kompetitor-DNA) mit hinreichend unterschiedlichem
Schmelzpunkt proportional zum Verhältnis der Peakflächen der
Schmelzkurven der Amplifikate sein sollte. Das Verhältnis der
Peakflächen
der Schmelzkurven der Amplifikate ist leicht durch Integration der
Schmelzkurvenpeaks zu ermitteln. Um die Bakterienzahl bzw. die Menge
bakterieller DNA in unbekannten Proben ermitteln zu können ist
es somit nötig,
Eichdaten zu gewinnen, die den Zusammenhang von Peakflächenverhältnis der
Amplifikate von Kompetitor- und Proben-DNA und initialem Verhältnis der
Template-DNA-Mengen
von Kompetitor und Proben-DNA über
einen weiten Bereich bekannter Proben-DNA-Mengen wiedergeben. Dazu werden bekannte
Mengen bakterieller DNA mit Verdünnungsreihen
des eubakterienspezifischen Kompetitors koamplifiziert und die Schmelzkurvenpeakverhältnisse
der Amplifikate bestimmt. Aus den logarithmisch aufgetragenen Eichdaten
(log (Kompetitor-DNA)/(Proben-DNA)
gegen log (Kompetitoramplifikatpeakfläche/Probenamplifikatpeakfläche)) wird
mittels linearer Regression (z. B. mittels Excel (Microsoft) oder
Sigmaplot (Jandel Scientific)) an die Gleichung
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log (Kompetitor-DNA)/(Proben-DNA)
= n log (Kompetitoramplifikatpeakfläche/Probenamplifikatpeakfläche)- k
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(Bestimmung der Parameter n und k)
eine Eichkurve erhalten. Nun kann der DNA-Gehalt unbekannter, experimentell
identisch behandelter Proben wie folgt berechnet werden:
Moleküle Proben-DNA
=10 (log (Moleküle Kompetitor-DNA) + k –n log (Kompetitoramplifikatpeakfläche/Probenamplifikatpeakfläche)
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Die quantitative Bestimmung einzelner
Bakterienspezies erfolgt mit analogen Methoden der kompetitiven
PCR. Abweichend zum obigen Vorgehen werden dabei durch Datenbankanalyse
gerade speziesspezifische Teilsequenzen im 16S rRNA-Gen des jeweiligen
Bakteriums gesucht und zwei dazu komplementäre PCR-Primer (Vorwärts- und
Rückwärts-Primer)
synthetisiert. Die Spezifität
dieser Primer wird in PCR überprüft, die
PCR-Bedingungen entsprechend optimiert. Der Schmelzpunkt des bakterienspeziesspezifischen PCR-Produktes
wird so gewählt,
daß er
2-3 °C verschieden
von dem des bereits für
die Bestimmung der Gesamtbakterienzahl synthetisierten Kompetitors
ist. Dieser kann dann nach Einklonieren der Bindungsstellen für die bei
der speziesspezifischen PCR verwendeten Primer als bakterienspezifischer
Kompetitor verwendet werden (siehe 1).
Dieses Vorgehen wird bevorzugt, da so mit geringstem Aufwand speziesspezifische
Kompetitoren gewonnen werden können.
Wenn die Schmelzpunkte von bakterienspeziesspezifischem PCR-Produkt
und dem für
die Gesamtbakterienbestimmung verwendeten heterologen Kompetitor
näher als
2°C beieinander
liegen muß ein
neuer heterologer Kompetitor entworfen und synthetisiert werden,
der eine andere, eukaryontische oder prokaryontische, von der des
Zielbakteriums verschiedene, DNA-Sequenz enthält, deren Schmelzpunkt 2-3 °C verschieden
von dem des speziesspezifischen PCR-Produktes ist. Die Synthese
von Plasmiden, die als Template für die Synthese des heterologen
Kompetitors dienen geschieht analog zu dem für die Gesamtbakterienbestimmung
beschriebenen Verfahren mit dem Unterschied, daß die Bindungsstellen für die bei
der speziesspezifischen PCR verwendeten Primer einkloniert werden.
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Mit Hilfe von M13-Primern, die außerhalb
der einklonierten Primerbindungsstellen binden, kann mittels PCR
unter Verwendung dieser Plasmide speziesspezifische Kompetitor-DNA
hergestellt werden, die z. B. durch UV-Spektrometrie, quantifiziert
werden kann. Bei Zugabe bekannter Mengen dieses Kompetitors zu bakterienhaltigen
Proben und anschließender
PCR mit dem Vorwärts-
und dem Rückwärts-Primer
wird ein Amplifikatgemisch erhalten, dessen Zusammensetzung aus
PCR-Produkt von Bakterien-DNA und PCR-Produkt vom Kompetitor proportional
zum Verhältnis
der Moleküle
von Bakterien-DNA und Kompetitor in der Probe ist. Nach Erstellen
von Eichkurven, bei denen bekannte Mengen des Kompetitors gegen
eine jeweils konstante, bekannte Anzahl von Zellen der jeweiligen
Bakterienspezies titriert wird, kann aus dem für eine unbekannte Probe ermittelten
Mengenverhältnis
von Proben- und Kompetitor-Amplifikat
und der bekannten Menge zugesetzten Kompetitors die in der Probe
vorhandene Bakterienzahl dieser Spezies bestimmt werden, da die DNA-Menge
pro Zelle konstant ist und die Kopienzahl der 16S rRNA-Gene für viele
Eubakterienspezies exakt bekannt ist. Für den Fall, daß die Kopienzahl
der 16S rRNA-Gene für
die gegebene Bakterienspezies nicht bekannt ist, wird der Mittelwert
von 3,6 angenommen Dies erlaubt eine Ermittlung der Zellzahl der
Bakterienspezies, die in ihrer Genauigkeit von keiner bekannten
Methode übertroffen
wird.
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Die Bestimmung der Mengenverhältnisse
der bei der "real
time"-PCR erhaltenen
PCR-Produkte von Bakterien- und Kompetitor-DNA erfolgt analog zu
dem für
die Gesamtbakterienbestimmung beschriebenen Verfahren durch die
Ermittlung der Flächenverhältnisse
der Peaks, die bei der der PCR folgenden Schmelzkurvenanalyse erhalten
werden. Zur Erstellung von Eichkurven werden bekannte Mengen DNA
der jeweiligen Spezies mit Verdünnungsreihen
des speziesspezifischen Kompetitors koamplifiziert und die Schmelzkurvenpeakverhältnisse
der Amplifikate bestimmt. Aus den logarithmisch aufgetragenen Eichdaten
(log (Kompetitor-DNA)/(Proben-DNA) gegen log (Kompetitoramplifikatpeakfläche/Probenamplifikatpeakfläche)) werden, wie
oben für
Eubakterien beschrieben, die Parameter n und k erhalten. Nun kann
der Gehalt an Bakterien der jeweiligen Spezies, bzw. deren DNA,
in unbekannten, experimentell identisch behandelten Proben, ebenfalls analog
zur oben beschriebenen Methode für
Eubakterien, ermittelt werden.
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Spezies-spezifische Methoden der
kompetitiven "real-time"-PCR wurden bisher
für mehrere
zahn- und zahnbetterkrankungsrelevante pathogene Bakterien entwickelt.
Sie eignen sich jedoch prinzipiell zur Quantifizierung aller Eubakterien,
für die
16S rRNA-Gensequenzen bekannt sind.
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Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren
in Ausführungsbeispielen
erläutert.
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1. Verfahren
zur quantitativen Bestimmung von Eubakterien in ihrer Summe
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Vorwärtsprimer (Eubactfo): ACTACGTGCCAGCAGCC
(SEQ ID NO 1) Rückwärtsprimer
(Eubactre): GGACTACCAGGGTATCTAATCC (SEQ ID NO 2) Oligonukleotid
1: AATTACTACGTGCCAGCAGCCGTAC (SEQ ID NO 3) Oligonukleotid 2: GGCTGCTGGCACGTAGT
(SEQ ID NO 4) Oligonukleotid 3: AGCTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGCA (SEQ
ID NO 5) Oligonukleotid 4: GGATTAGATACCCTGGTAGTCC (SEQ ID NO 6) M13-Vorwärtsprimer
(M13fo): GTAAAACGACGGCCAGT (SEQ ID NO 7) M13-Rückwärtsprimer (M13re): AACAGCTATGACCATGA
(SEQ ID NO 8)
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1.1. Synthese des heterologen
Kompetitors:
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Zur Herstellung des heterologen Kompetitors
muß eine
DNA ausgewählt
werden, die einen deutlich (um 2-3 °C) anderen Schmelzpunkt als
die PCR-Produkte der Ziel-DNAs der Bakterien besitzt. Um diesen Kompetitor
problemlos auch für
die Quantifizierung anderer Prokaryonten einsetzen zu können, bietet
es sich an, eine eukaryontische DNA-Sequenz zu wählen. Ein cDNA-Fragment der Menschenleber-Fruktose-l,6-bisphosphatase
cDNA (228 Bp), das in dem Vektor pGEM-T (Promega) kloniert vorliegt
(Plasmid pHmfbp), wird für
diesen Zweck verwendet. Um diese DNA als Template für die Synthese
des Kompetitors benutzen zu können,
müssen
zunächst
die Sequenzen der Primer, die zur Amplifizierung der bakteriellen
Ziel-DNAs dienen, an 5'-und
3'-seitig des Menschenleber-FBPase-cDNA-Fragments
in den Vektor gerichtet eingebaut werden. Um die Bindungsstelle
des Vorwärtsprimers
einzubauen wird das Plasmid mit den Restriktionsenzymen EcoRI und KpnI
geschnitten und dephosphoryliert, während zwei Oligonucleotide,
von denen eines dem Vorwärtsprimer entspricht,
der 5'-seitig um
die durch EcoRI und 3'-seitig
um die durch KpnI erzeugten 4-Basen-Überhänge verlängert wurde (Oligonukleotid
1), das andere zum Vorwärtsprimer
komplementär
ist (Oligonukleotid 2), phosphoryliert und hybridisiert werden.
Es folgt eine Ligation des linearisierten Plasmids mit dem Oligonucleotidhybrid
unter Verwendung von T4-DNA-Ligase. Die Bindungsstelle des Rückwärtsprimers
wird nach dem Verdau des zuvor erhaltenen Plasmids mit PstI und
Hind III mittels der gleichen Methode eingebaut (Oligonukleotide 3
und 4). Mit M13-Vorwärts-
und -Rückwärtsprimer
wird im Blockthermocycler eine PCR unter Verwendung des so gewonnenen
Plasmids pLCCEubact, dessen Sequenz vorher mittels DNA-Sequenzierung überprüft wurde, als
Template durchgeführt.
Die Klonierungsstrategie ist in 1,
linker Teil, dargestellt.
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Reaktionsbedingungen:
Ansatzvolumen:
50 μl
Primerkonzentration:
je 40 pmol/Ansatz
dNTPs: je 2,5 nmol/Ansatz
Magnesiumchlorid:
0,1 μmol/Ansatz
Puffer:
5 μl 10 × Taq-Puffer
Template:
1 ng pLCCEubact
Taq-Polymerase: 1.25 E Ampli-Taq Gold (Applied
Biosystems)
Thermocycler: GeneAmp 2400 (Applied Biosystems)
Temperaturprofil:
initiale Denaturierung: 10 min 95 °C
Zyklen: Denaturierung:
1 min 95 °C
Annealing:
1 min. 55 °C
Extension:
1 min 72 °C
Anzahl:
35
Final Extension: 10 min 72°C
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Nach Reinigung mittels PCR-Purification-Kit
(Qiagen) und analytischer Agarosegelelektrophorese mit Ethidiumbromidanfärbung und
Durchlichtfluoreszenzkontrolle der Homogenität und des Molekulargewichtes des
PCR-Produktes wird die DNA-Konzentration des Kompetitors durch Absorptionsmessung
bei 260 nm ermittelt.
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1.2. Synthese der Standard-Proben-DNA
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Zur Herstellung der Standard-Proben-DNA
wird mit Hilfe von Vorwärts-
und Rückwärtsprimer
und unter Verwendung von Escherichia coli-DNA im Blockthermocycler
eine PCR durchgeführt.
Reaktionsbedingungen:
Ansatzvolumen: 50 μl
Primerkonzentration:
je 40 pmol/Ansatz
dNTPs: je 2,5 nmol/Ansatz
Magnesiumchlorid:
0,1 μmol/Ansatz
Puffer:
5 μl 10 × Taq-Puffer
Template:
1 ng E. coli DNA
Taq-Polymerase: 1.25 E Ampli-Taq Gold (Applied
Biosystems)
Thermocycler: GeneAmp 2400 (Applied Biosystems)
Temperaturprofil:
initiale Denaturierung: 10 min 95 °C
Zyklen: Denaturierung:
1 min 95 °C
Annealing
und Extension: 1 min 66 °C
Anzahl:
35
Final Extension: 10 min 66 °C
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Das PCR-Produkt wird in pGEM-T (Promega)
kloniert. Mit M13-Vorwärts-
und – Rückwärtsprimer
wird im Blockthermocycler eine PCR unter Verwendung des so gewonnenen
Plasmids pEubact, dessen Sequenz vorher mittels DNA-Sequenzierung überprüft wurde,
als Template durchgeführt.
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Reaktionsbedingungen:
wie unter 1.1.
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Nach Reinigung mittels PCR-Purification-Kit
(Qiagen) und analytischer Agarosegelelektrophorese mit Ethidiumbromidanfärbung und
Durchlichtfluoreszenzkontrolle der Homogenität und des Molekulargewichtes des
PCR-Produktes wird die DNA-Konzentration der Standard-Proben-DNA
durch Absorptionsmessung bei 260 nm ermittelt.
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1.3. Ermittlung einer
Eichkurve
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Um Eichkurven zu erhalten werden
im LightCycler® Serien
von PCRs unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimer durchgeführt, bei
denen jeweils bekannte Mengen Standard-Proben-DNA mit unterschiedlichen bekannten
Mengen des Kompetitors in Gegenwart von SYBR® Green
I koamplifiziert werden.
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Reaktionsbedingungen:
Ansatzvolumen:
20 μl
Primerkonzentration:
je 0,5 μmol/l
LightCycler® DNA
Master SYBR® Green
I (Roche Diagnostics): 2 μl
Magnesiumchlorid:
6 mmol/l
Template: Kompetitor- und Standard-Proben DNA unterschiedliche,
bekannte Mengen: 2-4 μl
Taq-Polymerase:
1.25 E Ampli-Taq (Applied Biosystems)
Thermocycler: LightCycler® (Roche
Diagnostics)
Temperaturprofil: initiale Denaturierung: 0 Sek.
94 °C
Zyklen:
Denaturierung: 0 Sek. 94 °C
Annealing:
10 Sek. 55 °C
Extension:
20 Sek. 72 °C
Temperature
transition: 20 °C/Sek.
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Anzahl: 45
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1.4. Analyse der PCR-Produkte
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Die Schmelzkurvenanalyse erfolgt
mittels kontinuierlicher Fluoreszenzmessung zwischen 65 und 94 °C bei einer
Transitionsrate von 0,1 °C/Sekunde.
Die Schmelzkurvenmaxima dienen der Identifizierung der Peaks der
Amplifikate von Kompetitor (85,5 °C)
und Standard-Proben-DNA (88,5 °C).
Die Integration der Schmelzkurvenpeaks erfolgt mit Hilfe der LightCycler®-Software.
Die Flächen
der Peaks der Amplifikate von Kompetitor und Standard-Proben-DNA
werden durcheinander dividiert.
-
1.5. Erstellen der Eichkurven
-
Logarithmische Auftragung der Eichdaten
(log (Kompetitor-DNA)/(Proben-DNA) gegen log (Kompetitoramplifikatpeakfläche/Probenamplifikatpeakfläche)). Ein
Beispiel ist in 2 gezeigt.
Mittels linearer Regression an die Gleichung log (Kompetitor-DNA)/(Proben-DNA)
= n log (Kompetitoramplifikatpeakfläche/Probenamplifikatpeakfläche) – k erfolgte
die Bestimmung der Parameter n und k, die zur Ermittlung der Eichgerade
dienten.
-
1.6. Quantitative Bestimmung von
Eubakterien wie unter 1.3, aber anstelle der Standard-Proben-DNA 2 μl bakterienhaltige
Probe.
-
Analyse der PCR-Produkte
wie unter 1.4.
-
Ermittlung des Quotienten der Flächen der
Schmelzkurvenpeaks der Amplifikate von Kompetitor und Bakterien-DNA
nach Koamplifikation der Probe mit mehreren bekannten Kompetitormengen
analog zu 1.5, jedoch unter Verwendung der Probe anstelle der Standard-Proben-DNA.
-
Ermittlung der
Bakterien-DNA-Menge der Probe aus
-
Moleküle Bakterien-DNA = 10 (log (Moleküle
Kompetitor-DNA) + k – n
log (Kompetitoramplifikatpeakfläche/Probenampfifikatpeakfläche)
-
Bildung des Mittelwertes aller auswertbaren
(innerhalb der Eichkurve liegenden) Einzelergebnisse.
-
Ermittlung der Gesamtbakterienzahl
durch Division des Ergebnisses durch 3,6 (mittlere Kopienzahl der
16S rRNA-Gene der Eubakterien).
-
Beispiel: Mit der zum Patent angemeldeten
kompetitiven "real
time"-PCR-Methodik
wurde in Suspensionen zweier humaner Stuhlproben der totale Bakteriengehalt
zu 2.4 × 109 und 0.7 × 109 Zellen/ml
bestimmt. Mittels konventioneller kompetitiver PCR (nach Rupf et
al., 1999a) wurden 3.4 × 109 and 1 × 109 Zellen/ml gefunden. Die Übereinstimmung
der Ergebnisse ist befriedigend.
-
2. Verfahren
zur quantitativen Bestimmung von Eubakterien einer Spezies am Beispiel
der Bestimmungsmethode für
Streptococcus mutans
-
Vorwärtsprimer (Strmufo): GGTCAGGAAAGTCTGGAGTAA
(SEQ ID NO 9) Rückwärtsprimer
(Strmure): GCGTTAGCTCCGGCACTAAGCC (SEQ ID NO 10) Oligonukleotid
1: AATTGGTCAGGAAAGTCTGGAGTAAAAGGCTAGTAC (SEQ ID NO 11) Oligonukleotid
2: TAGCCTTTTACTCCAGACTTTCCTGACC (SEQ ID NO 12) Oligonukleotid 3:
AGCTGCGTTAGCTCCGGCACTAAGCCTGCA (SEQ ID NO 13) Oligonukleotid 4: GGCTTAGTGCCGGAGCTAACG
(SEQ ID NO 14) M13-Vorwärtsprimer
(M13fo): GTAAAACGACGGCCAGT (SEQ ID NO 7) M13-Rückwärtsprimer (M13re): AACAGCTATGACCATGA
(SEQ ID NO 8)
-
2.1. Synthese des heterologen
Kompetitors:
-
Zur Herstellung des heterologen Kompetitors
werden in das Plasmid pHmfbp (siehe 1.1.) die Bindungsstellen der
S. mutans-spezifischen Vorwärts-
und Rückwärtsprimer
eingebaut. Dabei wird wie unter 1.1. beschrieben vorgegangen. Es
entsteht das Plasmid pLCCStrmu, dessen Sequenz mittels DNA-Sequenzierung überprüft wurde.
Mit M13-Vorwärts-
und Rückwärtsprimer
und pLCCStrmu als Template wird eine PCR durchgeführt. Die
Konstruktion des S. mutans-spezifischen Kompetitors ist in 1, rechter Teil, dargestellt.
-
Reaktionsbedingungen:
wie unter 1.1.
-
Nach Reinigung mittels PCR-Purification-Kit
(Qiagen) und analytischer Agarosegelelektrophorese mit Ethidiumbromidanfärbung und
Durchlichtfluoreszenzkontrolle der Homogenität und des Molekulargewichtes des
PCR-Produktes wird die DNA-Konzentration des Kompetitors durch Absorptionsmessung
bei 260 nm ermittelt.
-
2.2. Synthese der Standard-Proben-DNA
-
Zur Herstellung der Standard-Proben-DNA
wird mit Hilfe von Vorwärts-
und Rückwärtsprimer
und unter Verwendung von S. mutans-DNA im Blockthermocycler eine
PCR durchgeführt.
Reaktionsbedingungen: wie unter 1.2.
-
Das PCR-Produkt wird in pGEM-T (Promega)
kloniert. Mit M13-Vorwärts-
und – Rückwärtsprimer
wird im Blockthermocycler eine PCR unter Verwendung des so gewonnenen
Plasmids pStrmu, dessen Sequenz vorher mittels DNA-Sequenzierung überprüft wurde,
als Template durchgeführt.
-
Reaktionsbedingungen:
wie unter 1.1.
-
Nach Reinigung mittels PCR-Purification-Kit
(Qiagen) und analytischer Agarosegelelektrophorese mit Ethidiumbromidanfärbung und
Durchlichtfluoreszenzkontrolle der Homogenität und des Molekulargewichtes des
PCR-Produktes wird die DNA-Konzentration der Standard-Proben-DNA
durch Absorptionsmessung bei 260 nm ermittelt.
-
2.3. Ermittlung einer
Eichkurve
-
Um Eichkurven zu erhalten werden
im LightCycler® Serien
von PCRs unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimer durchgeführt, bei
denen jeweils bekannte Mengen Standard- Proben-DNA mit unterschiedlichen bekannten
Mengen des Kompetitors in Gegenwart von SYBR® Green
I koamplifiziert werden.
-
Reaktionsbedingungen:
wie unter 1.3.
-
3 zeigt
beispielhaft die Schmelzkurven, die bei Koamplifikation gleicher
Molekülzahlen
(105) von für S. mutans-spezifischem Kompetitor
und Standard-Proben-DNA erhalten wurden. Es ist mit bloßem Auge zu
erkennen (und wird durch Integration bestätigt), daß die Amplifikate von Kompetitor
und Standard-Proben-DNA Peaks etwa gleicher Flächen liefern.
-
2.4. Analyse der PCR-Produkte
-
Die Schmelzkurvenanalyse erfolgt
mittels kontinuierlicher Fluoreszenzmessung zwischen 65 und 94 °C bei einer
Transitionsrate von 0,1 °C/Sekunde.
Die Schmelzkurvenmaxima dienen der Identifizierung der Peaks der
Amplifikate von Kompetitor (85,5 °C)und
Standard-Proben-DNA (89,5 °C).
Die Integration der Schmelzkurvenpeaks erfolgt mit Hilfe der LightCycler®-Software.
Die Flächen
der Peaks der Amplifikate von Kompetitor und Standard-Proben-DNA
werden durcheinander dividiert.
-
2.5. Erstellen der Eichkurven
-
Logarithmische Auftragung der Eichdaten
(log (Kompetitor-DNA)/(Proben-DNA) gegen log (Kompetitoramplifikatpeakfläche/Probenamplifikatpeakfläche)). Ein
Beispiel ist in 4 gezeigt.
Mittels linearer Regression an die Gleichung log (Kompetitor-DNA)/(Proben-DNA)
= n log (Kompetitoramplifikatpeakfläche/Probenamplifikatpeakfläche) – k erfolgte
die Bestimmung der Parameter n und k, die zur Ermittlung der Eichgerade
dienten.
-
2.6. Quantitative Bestimmung von
Eubakterien wie unter 2.3, aber anstelle der Standard-Proben-DNA 2 μl S. mutans-haltige
Probe.
-
Analyse der PCR-Produkte
wie unter 2.4.
-
Ermittlung des Quotienten der Flächen der
Schmelzkurvenpeaks der Amplifikate von Kompetitor und Bakterien-DNA
nach Koamplifikation der Probe mit mehreren bekannten Kompetitormengen
analog zu 2.5, jedoch unter Verwendung der Probe anstelle der Standard-Proben-DNA.
-
Ermittlung der S. mutans-DNA-Menge
der Probe aus
-
Moleküle S. mutans-DNA = 10 (log (Moleküle
Kompetitor-DNA) + k – n
log (Kompetitoramplifikatpeakfläche/Probenamplifikatpeakfläche)
-
Bildung des Mittelwertes aller auswertbaren
(innerhalb der Eichkurve liegenden) Einzelergebnisse.
-
Ermittlung der S. mutans-Zellzahl
durch Division des Ergebnisses durch 5 (Kopienzahl der 16S rRNA-Gene
in S. mutans).
-
Beispiel: Tabelle 1 faßt die Ergebnisse
der vergleichenden Quantifizierung von S. mutans Zellen in zwei
verschiedenen Flüssigkulturen
und drei verschiedenen humanen Speichelproben zusammen. Die Quantifizierung
erfolgte mittels konventioneller kompetitiver S. mutansspezifischer
PCR (Rupf et al., 1999b), konventioneller "real time"-PCR mit kinetischer Analyse (ohne Kompetitor)
und kompetitiver "real
time"-PCR. Es ist
zu erkennen, daß im
Falle reinkultivierter Zellen alle drei Methoden gut überreinstimmende
Ergebnisse liefern, während
im Falle der Speichelproben nur die kompetitiven Methoden anwendbar
sind, während
die konventionelle "real
time"-PCR versagt,
wahrscheinlich wegen im Speichel vorhandener PCR-Inhibitoren. Die kompetitive "real time"-PCR ist dabei wesentlich
schneller (Gesamtzeitbedarf 2,5 Std.) als die konventionelle kompetitive
PCR (Gesamtzeitbedarf 8 Stunden).
-
3. Weitere Verfahren
zur quantitativen Bestimmung von Eubakterien einer Spezies
-
Analog zu dem unter 2. beschriebenen
Verfahren wurden spezies-spezifische Verfahren der Quantifizierung
von DNA bzw. Zellen mittels kompetitiver "real time"-PCR für Streptococcus sobrinus, Actinobacillus actinomycetemcomitans,
Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Eikenella corrodens,
Fusobacterium nucleatum, Bacteroides forsythus und Treponema denticola
entwickelt.
-
Literatur:
- Eckert, C., Landt,
0., Tabe, T., Seeger, K., Beyermann, B., Proba, J. und Henze, G.
(2000) Potential of LightCycler® technology
for quantification of minimal residual disease in childhood acute
lymphoblastic leukemia. Leukemia 14, 316-323.
- Klappenbach, J.A., P.R. Saxman, J.R. Cole und T.M. Schmidt (2001)
rrndb: the ribosomal RNA operon copy number database. Nucleic Acids
Res. 29: 181-184.
- Logan, J. M. J., Edwards, K. J., Saunders, N. A. und Stanley,
J. (2001) Rapid identification of Campylobacter spp. by melting
peak analysis of biprobes in real-time PCR. J. Clin. Microbiol.
39(6), 2227-2232.
- Morrison, T.B., Weis, J.J. und Wittwer, C.T. (1998) Quantification
of low copy transcripts by continuous SYBR
®-Green
I monitoring during amplification. BioTechniques 24, 954-962.
- Rupf, S., Merte, K. und Eschrich, K. (1999a) Quantification
of Bacteria in Oral Samples by Competitive Polymerase Chain Reaction.
J. Dent. Res. 78, 850-856.
- Rupf, S., Kneist, S., Merte, K. und Eschrich, K. (1999b) Quantitative
determination of Streptococcus mutans by using competitive polymerase
chain reaction. Eur. J. Oral Sci. 107, 75-81 (1999).
- Steuerwald, N., Cohen, J., Herrera, R.J. und Brenner, C.A. (1999)
Analysis of gene expression in single oocytes and embryos by real-time
rapid cycle fluorescence monitored RT-PCR. Mol. Hum. Reprod. 5(11), 1034-1039.
- Stults, J. R., Snoyenbos-West, 0., Methe, B., Lovley, D. R.
und Chancler, D. P. (2001) Application of the 5' fluorogenic exonuclease assay (Tagman)
for quantitative ribosomal DNA and rRNA analysis in sediments. Applied
and Environmetal Microbiology 67(6), 2781-2789.
- Wittwer, C.T., Herrmann, M.G., Moss, A.A. und Rasmussen, R.P.
(1997) Continuous fluorescence monitoring of rapid-cycle DNA amplification.
BioTechniques 22, 130-138.
-
Tabelle
1. Quantifizierung von S. mutans mit Hilfe konventioneller kompetitiver
PCR, konventioneller "real-time"-PCR (kinetische
Analyse, ohne Kompetitor) und vorteilhafter kompetitiver "real time" PCR; 3fache Bestimmung ± Standardabweichung.
-
Legende zu den
Abbildungen
-
1 Klonierungsstrategie
zur Herstellung der heterologen Kompetitoren für die kompetitive „real time"-PCR. Eubactfo, Eubactre,
Strmufo, Strmure: PCR-Primer (siehe Text); pHmfbp: Fragment der
cDNA der Fruktose-l,6-bisphosphatase des menschlichen Muskels, kloniert
in pGEM-T (Promega); fbp: 228 Bp-Fragment der cDNA der Muskel-Fruktose-l,6-bisphosphatase.
-
2 Eichkurven
der kompetitiven „real
time"-PCR zur Quantifizierung
von Eubakterien in ihrer Summe. Verschiedene bekannte Mengen Proben-DNA
wurden mit seriellen Verdünnungen
der Kompetitor-DNA (heterologer, eubakterienspezifischer Kompetitor,
siehe 1.1.) im LightCycler® koamplifiziert. Logarithmisch
sind das initiale Verhältnis
von Kompetitor- zu Proben-DNA gegen das Verhältnis der Peakflächen der
Amplifikate von Kompetitor und Probe aufgetragen. Mittels linearer
Regression wurden die Parameter der unter 1.5. angegebenen Gleichung
bestimmt: n = 4,1, k = –1,54.
-
3 Schmelzkurven
nach Koamplifikation gleicher molarer Mengen von Proben- und Kompetitor-DNA.
104 Moleküle S. mutans-spezifischer Kompetitor
und S. mutans-Wildtyp 16S DNA wurden im LightCycler® koamplifiziert.
Schmelzkurvenpeaks des Probenamplifikates (A), des Kompetitoramplifikates
(B) und von Primerdimeren in der Negativkontrolle (ohne Template)
(C).
-
4 Eichkurven
der kompetitiven „real
time"-PCR zur Quantifizierung
von S. mutans in ihrer Summe. Verschiedene bekannte Mengen Proben-DNA
wurden mit seriellen Verdünnungen
der Kompetitor-DNA (heterologer, S. mutans-spezifischer Kompetitor,
siehe 2.1.) im LightCycler® koamplifiziert. Logarithmisch
sind das initiale Verhältnis
von Kompetitor- zu
Proben-DNA gegen das Verhältnis
der Peakflächen
der Amplifikate von Kompetitor und Probe aufgetragen. Mittels linearer
Regression wurden die Parameter der unter 2.5. angegebenen Gleichung
bestimmt: n = 2,6, k = –0,55.
-
Sequenzprotokoll:
-
-
Erklärung
-
Die in maschinenlesbarer Form aufgezeichneten
Angaben sind mit dem geschriebenen Sequenzprotokoll identisch.
