WO2004044238A1 - Mittel und verfahren zum nachweis humaner adenoviren - Google Patents

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WO2004044238A1
WO2004044238A1 PCT/EP2002/012756 EP0212756W WO2004044238A1 WO 2004044238 A1 WO2004044238 A1 WO 2004044238A1 EP 0212756 W EP0212756 W EP 0212756W WO 2004044238 A1 WO2004044238 A1 WO 2004044238A1
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WO
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dna
hadv
primers
probe
sample
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PCT/EP2002/012756
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French (fr)
Inventor
Albert Roland Heim
Patricia Pring-Akerblom
Original Assignee
Medizinische Hochschule Hannover
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Priority to PCT/EP2002/012756 priority patent/WO2004044238A1/de
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes

Definitions

  • the present invention relates to primers, probes and a kit thereof as an aid for the detection of human adenoviruses. It also concerns detection methods in which the DNA of 15 or more HAdV serotypes can be detected.
  • H.V human adenoviruses
  • diseases include acute respiratory diseases in young children, severe pneumonia, pharyngoconjunctive fever (PCF), epidemic keratoconjunctivitis (EKC), festering genital lesions, cervical inflammation, gastroenteritis and Urethritis.
  • PCF pharyngoconjunctive fever
  • EKC epidemic keratoconjunctivitis
  • festering genital lesions cervical inflammation
  • gastroenteritis gastroenteritis
  • Urethritis Especially in immunosuppressed patients such as recipients of organ or bone marrow transplants, latent infections of the polyps or the genitourinary tract originally lead to considerable exposure to HAdV of different serotypes.
  • a common way of diagnosing HAdV infections is virus isolation with subsequent typing. However, it can take up to three weeks for a cytopathic effect to develop and some types of HAdV grow slowly and ineffectively in culture or require special cell lines such as 293-Graham cells for isolation. That is why many research groups have developed PCR protocols for the detection of HAdV in clinical samples. Most of these PCRs were created as "generic protocols" for the detection of as many types of the genus HAdV as possible (Allard, A., B.AIbinsson, and G. Wadell. 2001. Rapid typing of human adnenoviruses by a general PCR combined with restriction endonueclease analysis. J Clin Microbiol.
  • HAdV serotypes either only disclose means and methods for the detection of a small number of HAdV serotypes or only describe degenerate primers for use in PCR, which actually means the use of a large number of primer pairs, each of which only in the systems described specifically binds a small number of HAdV serotypes.
  • a probe for the detection of HAdV DNA is not disclosed.
  • Primer Short DNA or RNA oligonucleotide that is the starting point of the
  • Represent DNA synthesis during the polymerase chain reaction (PCR) and completely describe its base sequence for each position in the sequence can be specified by specifying one of the bases adenine, cytosine, guanine and thymine or uracil.
  • Degenerate primer Mixture of primers which are usually combined in the textual representation in a single sequence by inserting variables at the positions of the sequence at which individual primers of the mixture differ from one another, which are appropriate for each in the primer mixture base present at the relevant point in the sequence.
  • Primer pair Two primers, one of which can specifically bind to one of the two DNA strands of a DNA, so that the region of the DNA (including the sections to which the primers bind) between these two primers is amplified by means of a PCR can.
  • Probe Nucleic acid sequence which, in a single-stranded, generally labeled form, is capable of hybridization in the form of a specific binding with complementary or the complementary related sequences and thereby enables their qualitative or quantitative determination.
  • HAdV serotypes The HAdV serotypes according to NN (2000): Adenoviridae, pp. 227-238. In: MHV Van Regenmortel, CM Fauquet, DHL Bishop, EB Carsten, MK Estes, SM Lemon, J. Maniloff, MA Mayo, DJ McGeoch, CR Pringle, and RB Wickner (Eds): Virus Taxonomy. Seventh Report of the International Committee for the Taxonomy of Viruses, Academic Press, New York, San Diego. Homology: Term for the degree of agreement between two DNA or one DNA and one RNA sequence.
  • the degree of homology (in%) corresponds to the degree (in%) of the comparison of the two sequences using the program EMBOSS :: needle (global) (settings: gap open: 10.0; gap extend: 0.5; molecule: DNA; matrix: DNAfull) identified identity.
  • the program mentioned implements the alignment algorithm by Nedeleman and Wunsch; see Needleman, SB and Wunsch, CD (1970), A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J. Mol. Biol. 48, 443-453.
  • the RNA sequence is entered by exchanging the U (for uracil) with T.
  • Quantitative detection determination of the concentration of the DNA of the HAdV viruses to be examined in samples to be determined at least relative to one another.
  • the quantitative detection preferably also allows conclusions to be drawn about the absolute concentration of the DNA mentioned.
  • the primary object of the present invention was to determine (a) primers and / or (b) probes which (a) allow specific replication and / or (b) specifically detect the DNA of a large number of different HAdV serotypes.
  • this object is achieved by labeled or unlabeled nucleic acid for specific binding to DNA of human adenoviruses (HAdV-DNA), the nucleic acid a) having the sequence SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 or SEQ ID NO. 3, b) a sequence with a homology of more than 78% to SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 or SEQ ID NO. 3 or c) is complementary to a nucleic acid according to a) or b).
  • nucleic acid e.g. Fluorescence, luminescence, coloring or radioactive labeling or enzymes that catalyze the formation of detectable reaction products, or solids such as metal particles such as magnetic bits.
  • nucleic acids according to the invention in the form of primers of SEQ ID NO. 1 and SEQ ID NO. 2 and a probe of SEQ ID NO. 3 (or the sequence complementary to it) an ensemble that can be used particularly advantageously in detection methods for the DNA of HAdV.
  • the combination of the nucleic acid according to the invention is of course SEQ ID NO. 1 with the SEQ ID NO. 3 or the SEQ ID NO.2 with the SEQ ID NO. 3 complementary sequence to primer pairs makes sense, especially if only the possibility of amplifying the DNA of all HAdV serotypes is important.
  • nucleic acids of SEQ ID NO. 1 and SEQ ID NO. 2 and the complementary nucleic acids can be used as specific probes for the detection of DNA of all HAdV serotypes.
  • nucleic acids according to the invention the sequence of which is> 78% homologous to SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 or SEQ ID NO. 3 still can specifically bind to a large number of the DNA of the HAdV serotypes. > 78% homology means, for example, in the case of SEQ ID NO. 1 that the homologous sequence at up to 5 positions of the base sequence from SEQ ID NO. 1 may differ.
  • nucleic acids according to the invention with a higher homology to the sequences of the SEQ IDs mentioned, such as those with>82%,>86%,> 91% and> 95%, each percentage being based on SEQ ID NO. 1 allows one position deviation less.
  • the nucleic acids according to the invention are preferably selected as probes or primers in such a way that they are capable of binding specifically to the DNA of> 15,> 25,> 30,> 35,> 40 or even> 45 HAdV serotypes.
  • the skilled worker can determine this ability by experiments or the database-protected sequence comparison of a nucleic acid according to the invention with the DNA of the individual HAdV serotypes. All HAdV serotypes whose sequence is known in the region of the binding portion of the nucleic acids according to the invention (that is the hexon gene) can be included in the sequence comparison.
  • Part of the invention is also a method with which nucleic acids can be determined which, as primers and probes (also), can bind specifically to a large number of the DNA of the different HAdV serotypes:
  • the genetic variability of different regions of the genomes of the already completely sequenced HAdV is analyzed using a multiple alignment of this genome data.
  • one or more highly conserved sections of approximately 20 base pairs in length are determined.
  • three highly conserved sections are determined in a range of less than 1000 (preferably less than 500, again preferably less than 200) base pairs in length.
  • a third step the genome sections or the determined area or areas with the three highly preserved sections are analyzed again with the aid of a further multiple alignment, the preferred all available HAdV sequence data, including the already known data from HAdV serotypes that have not yet been completely sequenced, are taken into account.
  • one, two or, preferably, three consensus sequences are determined with the aid of the second multiple alignment, which are selected by melting temperature calculations for the hybridization of the primer or probe sequences with the known sequences of the multiple alignment so that an effective specific probe is or primer binding to the DNA of the large number of HAdV serotypes mentioned above is to be expected.
  • the invention also relates to a method for the detection of HAdV DNA in a sample, comprising the following steps:
  • Provision of a sample which potentially contains HAdV DNA provision of a probe which can in each case bind specifically to the DNA of at least 35 different HAdV serotypes, mixing the probe with the sample,
  • the probe is selected such that it can specifically bind not only to the DNA of 35 but also to the DNA of> 40, again preferably> 45, again preferably all HAdV serotypes.
  • a nucleic acid according to the invention in particular one (a) with the sequence of SEQ ID NO. 3 (b) with a sequence with a homology> 78% to SEQ ID NO. 3 or (c) with a sequence complementary to (a) or (b).
  • the sample to be provided which potentially contains HAdV DNA, is obtained from clinical or other samples such as cell cultures, blood, plasma, serum, stool, sputum, urine, eye or nasopharyngeal smears or cerospinal fluid (CSF ) Prepared for use in a DNA amplification process, preferably a PCR:
  • the conditions which enable specific binding of the respective probe will be easily set by the person skilled in the art by varying suitable parameters, in particular by varying the temperature.
  • the amplification of DNA provided according to the invention will in most cases be carried out using the PCR method. But it can also be done in other ways, e.g. through virus replication or vector replication.
  • Detection of the amplified DNA segments to which a probe is bound can be carried out by methods such as, depending on the choice of the label of the probe and the probe itself. Northern blot, west emblot, chemiluminescence or fluorescence methods are used.
  • sequence of the steps of the method according to the invention can be adapted to the requirements and individual or the sequence of several steps can also be repeated (several times) if necessary.
  • the latter relates in particular to the steps typical of a PCR. In many cases, depending on the detection method, the probe will only be mixed with the sample after the amplification step or steps.
  • the method according to the invention has the advantage that it is possible with a single probe to prove that DNA from a group of 35 (or> 40 or> 45 or all) HAdV serotypes in the sample to be examined and thus also in the clinical sample from which the sample to be examined was obtained.
  • the probe can be used to characterize the amplified DNA regions in more detail and thus to distinguish them from (unwanted) amplified DNA regions (such as from pseudogenes or because of poor primer selection).
  • Another method according to the invention relates to the detection of HAdV DNA in a sample, with the following steps:
  • Provision of a sample which potentially contains HAdV DNA provision of at least one pair of primers which can bind specifically to the DNA of at least 25 different HAdV serotypes,
  • the pair of primers is selected such that it can bind specifically not only to the DNA of 25 but also to the DNA of> 30, again preferably> 40, again preferably all HAdV serotypes.
  • Nucleic acids according to the invention are preferably used as primers, in particular those with the sequence of SEQ ID. NO. 3 (or complementary thereto) and very particularly preferably nucleic acids (a) of SEQ ID NO. 1 and / or SEQ ID NO. 2 or (b) a sequence with a homology> 78% to SEQ ID NO. 1 or SEQ ID NO 2.
  • DNA is regularly amplified using the PCR method.
  • Other methods for in vitro amplification of nucleic acid sequences can also be used.
  • the person skilled in the art will in turn set suitable parameters, in particular the temperature, by means of the variation, the conditions which enable a specific binding of the primers to the corresponding DNA strands.
  • the detection of the amplified DNA regions can be carried out, for example, by separation in the gel in a transilluminator, by determining the concentration after falling over (as a result of which short DNA sections and individual nucleotides have been removed from the sample), or else by hybridization with probes according to the invention (see above). respectively.
  • sequence of the steps, frequency of the individual steps, preparation of the samples what has been said above applies accordingly.
  • An essential advantage of using a preferred primer pair according to the invention is that it specifically binds to the DNA of 25,> 30,>
  • the amplification conditions have to be optimized for only a few primer pairs - ideally only for one.
  • primers used, the more precisely the amplification process can be controlled, since the relevant primer concentration, which has effects on the melting temperature, among other things, is more accessible. In addition, an increasing number of primers make experimental handling more difficult.
  • More than two primers forming a first pair of primers are used when the DNA of a second group of HAdV serotypes is to be amplified and / or detected, to which one or both primers of the first pair of primers cannot bind specifically.
  • the additional primer or primers must then be selected so that they bind specifically to the DNA of the second.
  • Group HAdV serotypes enter into conditions in which the first pair of primers specifically binds to the DNA to which it can bind specifically.
  • Additional (appropriately adapted) primers are also used when more stringent conditions, such as those that allow fewer than four mismatches in primer binding, are required.
  • This enabled by the inventive method 'early evidence of infections with (at least) a virus from a group of HAdV serotypes is particularly useful for patients who are immunodeficient or - are suppressed, if necessary, of vital importance.
  • the invention further relates to a method for the detection of HAdV DNA in a sample, comprising the following steps:
  • Providing a sample that potentially contains HAdV DNA providing at least one pair of primers, each of which can specifically bind to the DNA of at least 15 different HAdV serotypes,
  • the primer pair and the probe can specifically bind not only to the DNA of 15 but also of> 20, preferably> 30, again preferably> 40, again preferably> 45 and finally preferably all HAdV serotypes.
  • advantageous primers and probes and other preferred refinements of the method according to the invention the same applies to the methods described above.
  • a particular advantage of the simultaneous use of a pair of primers and a probe, each of which can bind specifically to the same DNA of the number of different HAdV serotypes mentioned, is that for the detection of HAdV DNA according to the invention, a large number of serotypes each have three specific bindings are necessary and are generated. This significantly increases the reliability of the detection method compared to methods with only two specific bindings (PCR) or those with only one specific binding (detection by probe).
  • no degenerate primers are used for the amplification.
  • the exclusive use of non-degenerate primers has the particular advantage that the reaction is more predictable. For example, if the target binding section of the non-degenerate primer is known, the binding behavior, ie the melting temperature, can be calculated very precisely. In contrast, the problem with degenerate primers, if they are produced by the customary oligosynthesis processes, is that it is not clear in what ratio the actually available primer variants are present.
  • the concentration of each individual primer in a degenerate primer influences the respective melting temperature, which in turn is important for the attachment of the individual primer to the target section of the DNA.
  • the ratio of the concentrations of the primer variants actually present in a degenerate primer to one another also depends on the precise production conditions, which in turn can be different from different suppliers, so that a de-primed primer is not insignificantly different in its actual composition from that of another manufacturer can differentiate between supplied "same" degenerate primers. Of course, this has a negative impact on the reproducibility of the detection methods.
  • primer variants there are several bases that are not precisely defined, there are a large number of possible primer variants, which is true for the individual primers actually present can mean that they are present in a relatively low concentration and thus can simulate a concentration that is too low for the corresponding HAdV DNA or fail in the detection r that with a larger number of Primer variants in a degenerate primer hybridize individual primers with each other and are therefore no longer available for PCR.
  • less than 11, preferably less than 5, again preferably less than 3 mutually different primers are used for the amplification.
  • nucleic acids according to the invention are used as primers (identical to or derived from SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO ⁇ 2 or SEQ ID NO. 3, compare above) for the amplification.
  • primers meet the requirements for primers for the methods according to the invention in an outstanding manner, in particular they are able to specifically bind to the DNA of a large number of different HAdV serotypes.
  • Primer pairs from deoxynucleic acids according to the invention are selected in particular for the PCR. It is not difficult for the person skilled in the art to determine the appropriate sequence for a forward primer and the corresponding one for a reverse primer, taking into account the direction of synthesis of the DNA polymerase.
  • nucleic acids according to the invention are used as probes. It depends, among other things, on the DNA region to be amplified, which the SEQ ID NO. 1 to 3 the person skilled in the art used as the preferred basis for the probe.
  • RNA or DNA probes which are derived from SEQ ID NO. 3 were derived because then in use of primer pairs that are identified by SEQ ID NO. 1 and 2 are derived, the probe binding section lies in the amplicon. Due to the fact that the two DNA strands which comprise the binding section are complementary to one another, it is of minor importance whether the probe corresponds to or is complementary to one of the sequences described above.
  • the probes mentioned meet the requirements for probes for the methods according to the invention in a special way, in particular they are able to bind specifically to the DNA of a large number of HAdV serotypes.
  • the methods according to the invention are preferably designed such that the amplified region (amplicon) comprises ⁇ 500, preferably ⁇ 300, again preferably ⁇ 150 base pairs.
  • the detection of the amplified DNA regions takes place under real time conditions during and / or after one, several or each amplification step.
  • Under real time conditions means here that the amplification process, which regularly comprises a repeated sequence of several steps (PCR), does not have to be interrupted for the detection of the amplified DNA.
  • the term "after each amplification step” does not mean that understand that the detection must take place immediately after the end of the amplification step.
  • a probe binds specifically to template DNA and to in for in-situ detection the amplification steps preceding the amplified DNA of the HAdV serotypes to be detected. This is preferably done during the primer binding step (annealing) during the PCR.
  • the probe should be selected so that it binds to the target DNA under the same conditions as the primer.
  • a nucleic acid according to the invention derived from SEQ ID NO.3 is preferred.
  • a change in a signal for example the amplification or attenuation of fluorescence, can then be triggered and detected by the binding event.
  • the detection can also be carried out on the basis of a reaction which is only made possible by the binding of the probe to its target section of the DNA, for example the release of a dye or a quencher, for example by the nuclease activity of a DNA polymerase.
  • a method designed in this way has the advantage that labor-intensive and time-consuming steps for the detection of the amplicon, such as Ethidium bromide stained gel electrophoresis with or without residual functional enzyme digestion or additional hybridization procedures are no longer necessary.
  • a further advantage of detection under real time conditions is that in cases in which only the qualitative detection of the presence of HAdV-DNA is important, the amplification procedure can be terminated from the point in time at which a signal is present proves the corresponding DNA. This can save a lot of time.
  • highly toxic and / or carcinogenic reagents such as ethidium bromide are used in many detection methods.
  • detection under real time conditions also leads to better health protection for laboratory personnel.
  • costs for special protective devices such as protective clothing can also be saved.
  • the detection of the amplified DNA regions takes place quantitatively.
  • signals whose strength is directly dependent on the DNA concentration can be related to standard curves and thus normalized.
  • DNA detection methods that provide signals that can be measured with high-resolution devices are preferably suitable for such methods.
  • the corresponding signals can e.g. Provide probes with radioactive labeling and particularly preferably probes which, depending on the binding to the DNA, optionally after further reaction steps, generate fluorescence or chemiluminescence signals.
  • the quantification In contrast to the previously known methods, it is possible with the methods according to the invention not only the fact that a patient is burdened with one or more large numbers of HAdV serotypes, but also by quantifying the relevance of this burden. For example, a doctor will only recommend a weakening of the suppression, especially in immunosuppressed patients, if the viral load is or threatens to become a serious risk for the patient. Ultimately, the quantification, especially if it is carried out for samples of the same patient that were taken at different times, makes it easier to predict the actual outbreak of diseases based on HAdV.
  • the methods according to the invention enable the (necessary) quantification of human adenoviruses for the planning and control of gene therapies with adenovirus vectors.
  • nucleic acids according to the invention which are homologous to the sequences SEQ ID NO. 1 and / or SEQ ID NO. 2 and / or as a probe is a labeled nucleic acid according to the invention which, as described above, has the sequence SEQ ID NO. 3 is homologous or complementary to such a homolog.
  • primers and / or the mentioned probes are primers and probes that can bind to the DNA of a large number of HAdV serotypes.
  • the other advantages of the nucleic acids according to the invention mentioned above also come about when used in a method for quantification according to the invention. Wear.
  • nucleic acids with the SEQ ID NO. 1 and SEQ ID NO. 2 and a probe a labeled nucleic acid with SEQ ID NO. 3 or a sequence complementary thereto are particularly preferred embodiments of the invention described, for the reasons mentioned, nucleic acids with the SEQ ID NO. 1 and SEQ ID NO. 2 and a probe a labeled nucleic acid with SEQ ID NO. 3 or a sequence complementary thereto.
  • the use of the preferred primers and probes causes reliably 'casual DNA HAdV all serotypes can be demonstrated in clinical samples.
  • the methods according to the invention also enable the HAdV DNA contained in the sample to be quantified, even under real time conditions. Despite the need for such methods for the detection of HAdV, the experts were unable to create one due to the high sequence diversity of these viruses.
  • a TaqMan PCR method (also referred to as an “exonuclease probe” method) is used for amplification and detection (compare Holland, PM, Abramson, RD, Watson, R., and Gelfand, DH (1991): Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5 '- 3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc Natl Acad Sei USA 88, 7276-80; and Heid, CA, Stevens, J., Livak, KJ, and Williams, PM (1996): Real time quantitative PCR. Genome Res 6, 986-94; and Kricka, LJ (2002): Stains, labeis and detection strategies for nucleic aeids assays Ann Clin Biochem 39, 1-4-29).
  • the probe can be labeled in various ways, for example with FAM as the fluorescent dye at the 5 'end and TAMRA as the fluorescence quencher at the 3' end. This leads to a quenching of the fluorescence of the dye of the probe in the unbound state and to a release of the fluorescence in the bound state, for example by the separation of the reporter and quencher dye by the 5 ' -3 ' exonuclease activity of the DNA polymerase during the extension step in the PCR.
  • a probe of SEQ ID NO. 3 and primer of SEQ ID NO. 1 and SEQ ID NO. 2 used.
  • a method according to the invention designed as a TaqMan PCR method, combines all the advantages listed for the methods according to the invention and their preferred configurations in the corresponding choice of the primers:
  • the amplified DNA is detected under real time conditions during the PCR by hybridizing the DNA with a probe. - Laborious and time-consuming subsequent detection steps are no longer necessary. Good manageability
  • the TaqMan PCR method enables the detection of all known serotypes of the HAdV.
  • a quantification of the HAdV DNA contained in the sample is reliably possible with the TaqMan method.
  • the TaqMan PCR system is an established process for which the required components (devices, chemicals) are commercially available and for which there is corresponding optimization support.
  • the quantitative evaluation method analysis using the crossing points, CP is well established.
  • the detection limit is ⁇ 1.5 x 10 4 , preferably ⁇ 1.5 x 10 3 , again preferably ⁇ 1.5 x 10 2 , and finally preferably ⁇ 1.5 x 10 1 template molecules per approach (see also Table 1).
  • the primer binding (annealing) takes place at> 48 ° C., preferably at> 50 ° C., more preferably at> 53 ° C., again preferably at> 55 ° C.
  • a high (higher) temperature in the annealing phase has the advantage that the primer binding is actually specific with a high (higher) certainty.
  • the invention also includes a kit comprising a primer pair and a probe, each consisting of nucleic acids according to the invention.
  • a major advantage of such a kit is that the primer and probe are optimally matched to one another and enable the methods according to the invention to be carried out in their particularly preferred configurations.
  • nucleic acids according to the invention or a kit according to the invention for the detection of HAdV DNA is also according to the invention. This is preferably done as part of one of the methods described above. The way - as well as by the prescribed Procedure - Results obtained can then serve as the basis for a diagnosis by the doctor.
  • the invention also encompasses a method for characterizing HAdV serotypes with the following steps: detection of HAdV DNA in a sample according to one of the methods described above characterizing HAdV DNA detected in the sample
  • the DNA of more than one HAdV serotype is or was contained in the sample to be examined, it may be necessary to carry out more extensive characterizations, in particular in order to be able to assign the results of the characterization steps to the respective HAdV serotypes.
  • the person skilled in the art can, for example, use serotype-specific primers in a further PCR.
  • the advantage of the described method is that it not only basically proves the presence of HAdV, but that the subsequent characterization also determines which or which individual serotypes are actually present.
  • the method mentioned also makes it possible to identify previously unknown HAdV serotypes, since the methods according to the invention also detect the DNA of unknown HAdV serotypes and can therefore be used to discover these serotypes: if the amplified or the amplified DNA regions are not can be assigned to individual already known HAdV serotypes (eg by comparing the database after sequencing), the probability that a previously unknown HAdV serotype is present is very high (if it is not a known serotype whose DNA region is characterized corresponding base sequence is not yet found in the gene databases). Further characterizations of other DNA areas, or preferably of the potential virus itself, can possibly verify the finding that a new HAdV serotype has been found.
  • Another possibility is to screen the samples for the presence of HAdV DNA using a method according to the invention and then to carry out virus isolation and typing in the positive samples using conventional techniques, e.g. Isolation on cell cultures and, in the positive case, subsequent typing by neutralization tests, hemagglutination tests and hemagglutination inhibition tests. New types would not be satisfactorily typed using these conventional techniques and would therefore appear as a new, non-typeable adenovirus.
  • conventional techniques e.g. Isolation on cell cultures and, in the positive case, subsequent typing by neutralization tests, hemagglutination tests and hemagglutination inhibition tests.
  • New types would not be satisfactorily typed using these conventional techniques and would therefore appear as a new, non-typeable adenovirus.
  • the database numbers are: ' HAdV-2 (#NC 001405), HAdV-3 (# X76549), HAdV-4 (# AF06062), HAdV-5 (#NC 00146), HAdV-12 (# AF065065), HAdV-34 (# AB052911), HAdV-40 (# L19443), HAdV-41 (# M21163).
  • Example 1 HAdV quantification, standard plasmid and available viruses
  • a HadV-2 PCR amplicon (nt. 18856-19137 of the HAdV-2 sequence) was cloned into a pGEM-T easy plasmid vector (Promega, Madison, Wl).
  • the plasmid DNA was purified from E. coli using the nucleobond 100 kit (Macherey and Nagel, Germany) and sequencing confirmed that the cloned HadV-2 sequence was identical to the HadV-2 prototype gene bank sequence (# J01917 ) was.
  • the plasmid concentration was determined photometrically at 260 nm and converted into genome equivalents (copies per ml), since the molecular weight of the plamide was known.
  • HAdV serotypes For the test series of HAdV serotypes, A549 cells (in the case of HAdV-40 and HAdV-41 Graham 293 cells) were infected with the HAdV prototype strains. At over 50% CPE (cytopathic effect), the cells were freeze-thawed and the DNA extracted from 200 ⁇ l of the lysate with the Qiagen Blood Kit (Qiagen, Hilden, Germany).
  • a pair of primers for the amplification of the DNA of all 51 serotypes of the genus HAdV was designed as follows: Five, to date fully sequenced HAdV, type 2 (species (genus) human adenovirus C, gene bank # J01917), 5 (species human adenovirus C, # M73260), 12 (human adenovirus A species; # X73487), 17 (human adenovirus D species, # AF108105), and 40 (human adenovirus F species, gene bank # L19443) were aligned using clustalX software (version 1.8) (see Thompson, JD, DG Higgins, and TJ Gibson. 1994. CLUSTAL W: improvising the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22 (22 ): 4673-80).
  • the consensus primer sequences were calculated by calculating the melting temperatures of the interaction of the two primers with each HAdV DNA sequence with the help of the Metcalc software (compare: Schütz, E., and N. von Ahsen. 1999. Spreadsheet software for thermodynamic melting point prediction of oligonucleotide hybridization with and without mismatches. Biotechniques. 27: 1218-24.) (See Fig. 1).
  • the T m of the probe and the primer for the hybridization with the corresponding sequence of the DNA of each HAdV serotype was calculated and the reaction conditions of the real-time PCR were set in such a way that the amplification and detection of as many human pathogenic adenoviruses as possible was possible (cf. Example 3).
  • the TaqMan PCR was carried out using the LightCycler (LC, Röche Diagnostics, Mannheim, Germany) in closed glass capillaries with a total reaction volume of 20 ⁇ l.
  • the FastStart Hybridization Kit (Röche) was used to create a PCR master mix.
  • Primers adenoquant 1 (AQ1, SEQ ID NO. 1) and. Were used as HAdV-specific primers.
  • Adenoquant 2 (AQ2, SEQ ID NO. 2) is used.
  • the probe (AP, SEQ ID NO. 3) was labeled with FAM (carboxyfluoreseein) as the fluorescent dye at the 5'end and TAMRA (carboxytetramethylrhodamine) as the fluorescent quencher at the 3'end.
  • oligonucleotides were synthesized, labeled and purified by Eurogentec (Seraing, Belgium).
  • the probe, primer and magnesium chloride were added to the master mix so that the final concentrations of the probe were 0.4 mM, each primer 0.5 mM and magnesium chloride 3 mM was.
  • heat-labile uracil-DNA glycosylase UNG, 1 U / reaction; Röche, Mannheim, Germany
  • 8 ⁇ l of the master mix and 12 ⁇ l of the DNA template solution were filled into each capillary. The closed capillaries were centrifuged in a microcentrifuge and placed in the LC.
  • reaction conditions were as follows: 5 minutes at 35 ° C for the uracil DNA glycosylase incubation, followed by 10 minutes at 95 ° C to activate the "hot start" Taq polymerase. 45 cycles resulting from the denaturation
  • the denaturation step at 95 ° C. for 3 seconds, the annealing step at 55 ° C. for 10 seconds and the extension step at 65 ° C. for 60 seconds were carried out Extension step was 0.5 ° C per second.
  • the fluorescence data were recorded at the end of each extension step in channel F1 (recording type "single") of the LC apparatus.
  • the tubes were cooled down to 30 ° C and disposed of without opening the capillaries.
  • Real time PCR (TaqMan PCR) gave positive results for all prototype strains of the genus HAdV, including the recently isolated and proposed new types HAdV-50 and HAdV-51.
  • the crossing point (CP) values of ⁇ 20 were low for all prototype strains, which indicates effective amplification and sensitive detection.
  • twelve clinical isolations of HAdV of different serotypes were tested by the TaqMan PCR and all isolations were positive with low CP values ( ⁇ 20).
  • HAdV-DNA concentrations of the serial dilution of the plasmid were set as standard and the HAdV-DNA concentrations of each point were automatically determined by the LC software (version 3.5c) assuming a semilogarithmic relationship between the crossing points and the HAdV DNA concentration calculated.
  • Calculated HAdV-DNA concentration and SD of calculated concentrations indicate a dynamic range of HAdV-DNA quantification of at least six orders of magnitude (1.5 x 10 8 to 1.5 x 10 2 copies of HAdV-DNA), low virus DNA concentrations such as 1.5 x 10 1 copies can also be quantified, but with a higher standard deviation (compare Table 1).
  • a multiplex PCR which amplifies the fiber gene region, was carried out with positive HAdV DNA samples (according to the TaqMan method described in Example 3) in order to enable identification of the respective HAdV serotype (compare: Xu, W ., MC McDonough, and DD Erdman. 2000. Species-specific identification of human adenoviruses by a multiplex PCR assay. J Clin Microbiol. 38 (11): 4114-20).
  • amplicons were directly sequenced with rhodium-labeled dideoxynucleotide chain terminators (DNA Sequencing Kit, ABI, Foster City, CA) on an ABI-Prism 310 automatic sequencer.
  • HAdV serotypes were identified from clinical samples without virus isolation being necessary. These included HAdV of serotypes 1, 3, 4, 5, 7, 37, 40, 41 and various viruses of the genus HAdV-D, including a serotype that has not yet been sequenced.
  • Example 5 Comparison of the Tag Man PCR method with conventional PCR methods
  • the 234 clinical samples were EDTA blood (58), serum and plasma (60), throat swabs and / or irrigation (21), combined nasopharyngeal smears (5), eye smears (17), cerebrospinal fluid (26), stool (22 ), Bronchoalveolar irrigation and tracheal aspirate (12), as well as 13 other materials, e.g. pericardial, pleural and peritoneal fluids, urine and biopsies of lymph nodes and intestine (13).
  • the results of conventional PCR and TaqMan PCR were the same (38 positive samples and 162 negative samples). 34 samples had different results between the two test approaches.
  • the TaqMan PCR was positive with high CP values (CP> 37, which means less than 150 copies of HAdV DNA per approach), while the conventional PCR was negative. This shows that the TaqMan PCR method is more sensitive than the conventional PCR method described.

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Abstract

Beschrieben werden markierte oder unmarkierte Nukleinsäure zum spezifischen Binden an DNA humaner Adenoviren (HAdV-DNA), wobei die Nukleinsäure a) die Sequenz SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 3 besitzt, b) eine Sequenz mit einer Homologie von mehr als 78% zu SEQ ID. NO. 1, SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 3 besitzt oder c) komplementär zu einer Nukleinsäure nach a) oder b) ist. Beschrieben werden zudem Verfahren zum Nachweis von HAdV-DNA.

Description

Medizinische Hochschule Hannover Carl-Neuberg-Straße 1 , 30623 Hannover
Mittel und Verfahren zum Nachweis humaner Adenoviren
Die vorliegende Erfindung betrifft Primer, Sonden sowie ein Kit daraus als Hilfsmittel für den Nachweis humaner Adenoviren. Sie betrifft auch Nachweisverfahren, bei denen die DNA von 15 oder mehr HAdV-Serotypen erfasst werden können.
Die 6 Spezies (früher Subgeneri) der humanen Adenoviren (HAdV) mit ihren 51 Serotypen sind mit einer Vielzahl von Krankheiten assoziiert, die alle Organsysteme betreffen können (vergleiche Wadell, G., A. Allard, and H. Hierholzer. 1999. Adenovirus, p. 970-981. In P. R. Murray, E. J. Baron, M. A. Pfaller, C. A. Tenover, and R. A. Yolken (ed.), Manual of Clinical Microbiology. ASM Press, Washington, D.C.). Beispiele für solche Krankheiten sind akute Atemwegserkrankungen bei kleinen Kindern, schwere Lungenentzündungen, pharyngokonjunktives Fieber (PCF), epidemische Keratokonjunktivitis (EKC), eiternde Genitallesionen, Gebärmutterhalsentzündung, Gastroenteritis und Harnleiterentzündung. Insbesondere bei immunsupprimierten Patienten wie z.B. Empfängern von Organ- oder Knochenmarkstransplantationen führen ursprünglich latente Infektionen der Polypen oder des Urogenitaltraktes zu erheblichen Belastungen mit HAdV verschiedener Serotypen.
Ein üblicher Weg für die Diagnose von HAdV-Infektionen ist die Virus- Isolierung mit nachfolgender Typisierung. Es kann aber bis zu drei Wochen dauern, bis sich ein cytopathischer Effekt entwickelt und einige HAdV-Typen wachsen langsam und ineffektiv in Kultur oder benötigen spezielle Zelllinien wie 293-Graham-Zellen zur Isolierung. Deshalb haben viele Forschergruppen PCR-Protokolle für den Nachweis von HAdV in klinischen Proben entwickelt. Die meisten dieser PCRs wurden als „generische Protokolle" zum Nachweis von möglichst allen Typen des Genus HAdV erstellt (Allard, A., B.AIbinsson, and G. Wadell. 2001. Rapid typing of human adnenoviruses by a general PCR combined with restriction endonueclease analysis. J Clin Microbiol. 39(2):498- 505; Echavarria, M., M. Forman, J. Ticehurst, J. S. Dumler, and P. Charache.1998. PCR method for detection of adenovirus in urine of healthy and human immunodeficiency virus-infected individuals. J Clin Microbiol. 36(11):3323-6; Pring-Akerblom, P., and T. Adrian. 1994. Type- and group- specific polymerase chain reaction for adenovirus detection. Res Virol. 145(1 ):25-35).
Die genannten Schriften offenbaren entweder nur Mittel und Verfahren zum Nachweis einer geringen Zahl von HAdV-Serotypen oder beschreiben für den Einsatz in der PCR nur degenerierte Primer, was tatsächlich die Verwendung einer Vielzahl von Primerpaaren bedeutet, von denen jedes einzelne in den beschriebenen Systemen jeweils nur eine geringe Zahl von HAdV-Serotypen spezifisch bindet. Eine Sonde zum Nachweis von HAdV-DNA ist nicht offenbart.
Im Rahmen des vorliegenden Textes gelten folgende Definitionen:
Primer: Kurzes DNA- oder RNA-Oligonukleotid, das den Anfangspunkt der
DNA-Synthese während der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) darstellen und desen Basenabfolge für jede Position der Sequenz vollständig beschrieben werden kann durch die Angabe jeweils einer der Basen Adenin, Cytosin, Gua- nin und Thymin bzw. Uracil.
Degenerierter Primer: Gemisch von Primern, die in der textlichen Wiedergabe üblicherweise in einer einzigen Sequenz zusammengefasst werden, indem an den Positionen der Sequenz, an denen einzelne der Primer des Gemisches zu einander verschieden sind, Variablen eingefügt sind, die für jede im Primer- gemisch an der betreffenden Stelle der Sequenz vorhandene Base stehen können.
Primerpaar: Zwei Primer, von denen je einer an je einen der zwei DNA- Stränge einer DNA spezifisch binden kann, so dass mittels einer PCR der zwischen diesen beiden Primern liegende Bereich der DNA (einschließlich der Abschnitte, an die die Primer binden) amplifiziert werden kann.
Sonde: Nukleinsäuresequenz, die in einzelsträngiger, in der Regel markierter Form, zur Hybridisierung in Form einer spezifischen Bindung mit komplementären oder den komplementären verwandten Sequenzen befähigt ist und dadurch deren qualitative oder quantitative Bestimmung ermöglicht.
Spezifische Bindung: Hybridisierung einer Sonde oder eines Primers mit einer Nukleinsaure mit nicht mehr als 20% Fehlpaarungen (mismatches) zwischen den Basen von Sonde oder Primer und der besagten Nukleinsaure.
Fehlpaarungen: Basenpaarungen, die nicht aus der Kombination von (a) Cytosin (C) und Guanin (G) oder (b) Adenin (A) und Thymin (T) oder (c) Adenin (A) und Uracil (U) (letzteres für den Fall der DNA RNA-Hybride) gebildet sind.
Alle bzw. alle bekannten HAdV-Serotypen: Die HAdV-Serotypen gemäß N.N. (2000): Adenoviridae, pp. 227-238. In: M. H. V. Van Regenmortel, C. M. Fau- quet, D. H. L. Bishop, E. B. Carsten, M. K. Estes, S. M. Lemon, J. Maniloff, M. A. Mayo, D. J. McGeoch, C. R. Pringle, and R. B. Wickner (Eds): Virus Taxo- nomy. Seventh Report of the International Committee for the Taxonomy of Viruses, Academic Press, New York, San Diego. Homologie: Bezeichnung für den Grad der Übereinstimmung von zwei DNA- oder einer DNA- und einer RNA-Sequenz. Der Grad der Homologie (in %) entspricht dem Grad (in %) der durch den Vergleich der beiden Sequenzen mit Hilfe des Programmes EMBOSS::needle (global) (Einstellungen: Gap O- pen: 10.0; Gap Extend: 0.5; Molecule: DNA; Matrix: DNAfull) ermittelten Identität. (Das genannte Programm implementiert den Alignieralgorithmus von Nee- dleman and Wunsch; vergleiche Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970), A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins.J. Mol. Biol. 48, 443-453.) Für den Vergleich von RNA- mit DNA-Sequenzen erfolgt dabei die Eingabe der RNA-Sequenz unter Austausch des U (für Uracil) durch T.
Komplementär: Komplementärität zwischen den Sequenzen zweier Nuklein- säuren besteht dann, wenn diese ohne Fehlpaarung miteinander hybridisiert werden können. Für DNA- / RNA-Hybride gelten A - T- und A - U-Paarungen dabei nicht als Fehlpaarung.
Quantitative Detektion: Ermittlung der Konzentration der DNA zu untersu- chender HAdV-Viren in Proben zumindest relativ zueinander zu ermittelt. Bevorzugt erlaubt die quantitative Detektion (Quantifikation) auch den Rück- schluss auf die absolute Konzentration der genannten DNA.
Charakterisieren: Durchführung eines oder mehrerer informationsbeschaffen- der Schritte, die (a) eine Zuordnung von DNA zu dem Organismus oder Virus ermöglichen, aus dem sie stammt, oder (b) zu dem Resultat führen, dass für eine Zuordnung der DNA zum Herkunftsorganismus bzw. -virus noch nicht genügend Informationen im Stand der Technik vorhanden sind.
Ein aus medizinischer und molekularbiologischer Sicht enorm störendes technisches Problem für den gleichzeitigen Nachweis von DNA-Material, das aus einer größeren Zahl von HAdV-Serotypen stammen kann, ist die hohe Se- quenzdiversität der HAdV. Diese macht es nämlich nahezu unmöglich, in den Genomen der HAdV-Serotypen Regionen zu finden, die jeweils eine spezifi- sche Bindung einzelner PCR-Primer und/oder Sonden an eine größere Zahl von HAdV-DNA-Sequenzen unterschiedlicher Serotypen ermöglichen.
Primäre Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, (a) Primer und/oder (b) Sonden zu ermitteln, die (a) eine spezifische Vervielfältigung und/oder (b) den spezifischen Nachweis der DNA einer größeren Zahl unterschiedlicher HAdV-Serotypen ermöglichen.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch markierte oder unmarkierte Nukleinsaure zum spezifischen Binden an DNA humaner Adenoviren (HAdV- DNA), wobei die Nukleinsaure a) die Sequenz SEQ ID NO. 1 , SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 3 besitzt, b) eine Sequenz mit einer Homologie von mehr als 78% zu SEQ ID NO. 1 , SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 3 besitzt oder c) komplementär zu einer Nukleinsaure nach a) oder b) ist.
Für die Markierung der Nukleinsaure stehen dem Fachmann eine Reihe von Möglichkeiten zur Verfügung wie z.B. Fluoreszenz-, Lumineszenz-, Färb-, oder radioaktive Markierung oder Enzyme, die die Bildung nachweisbarer Reakti- onsprodukte katalysieren, oder Feststoffe wie beispielsweise Metallpartikel wie magnetische Bits.
Überrachenderweise hat sich gezeigt, dass bei Einsatz von Primern der SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO. 2 als Primerpaar in einer PCR die Amplifikation von DNA aller HAdV-Serotypeή aufgrund spezifischer Bindung der Primer erreich/ wird. Noch erstaunlicher ist es, dass zudem in dem von den Primern begrenz¬ ten Bereich auf der DNA jedes Serotypen ein Abschnitt vorhanden ist, an den eine Sonde der SEQ ID NO. 3 (oder einer zu SEQ ID No. 3 komplementären Sequenz) spezifisch binden kann. Es hat sjch zudem bei der Verwendung der genannten Nukleinsäuren als Primer und Sonde herausgeste.lt, dass diese unter stringenten Bedingungen (>50 °C, bevorzugt >55 °C) in der Lagesind, an die DNA von 45, bevorzugt allen derzeit bekannten HAdV-Serotype1"1 spezi¬ fisch zu binden. Ebenso überraschend ist die Tatsache, dass trotz der hohen Sequenzdiversi- tät der DNA der HadV-Serotypen die drei konservierten Abschnitte, an die die genannten Primer und Sonden binden, bei sämtlichen in diesem Bereich bereits sequenzierten HAdV-Serotypen in einem verhältnismäßig kurzen Bereich von weniger als 150 Basen liegen.
Dementsprechend ist die Kombination von erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in Form von Primern der SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO. 2 und einer Sonde der SEQ ID NO. 3 (oder der dazu komplementären Sequenz) ein in Nach- weisverfahren für die DNA von HAdV besonders vorteilhaft einsetzbares Ensemble.
Zusätzlich erstaunlich war, dass in der Praxis die genannten Primer und die Sonde sogar noch bei Anlagerungstemperaturen, die größer als die berechne- te theoretische Schmelztemperatur der Primer mit ihren Bindungsabschnitten auf der DNA einzelner HAdV-Serotypen sind, zur Anlagerung befähigt waren und damit auch die Amplifikation der DNA dieser Serotypen zuverlässig ermöglichen bzw. die DNA nachweisen konnten (vergleiche Fig. 1, multiples Alignment, sowie Beispiele).
Selbstverständlich ist in manchen Fällen auch die Kombination der erfindungsgemäßen Nukleinsaure der SEQ ID NO. 1 mit der der SEQ ID NO. 3 oder der SEQ ID NO.2 mit der zu SEQ ID NO. 3 komplementären Sequenz zu Primerpaaren sinnvoll, insbesondere wenn es nur auf die Möglichkeit der Amplifikation der DNA aller HAdV-Serotypen ankommt.
Ebenso, können (bei entsprechender Markierung) die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO. 2 sowie die dazu komplementären Nukleinsäuren als spezifische Sonden für den Nachweis von DNA aller HAdV-Serotypen verwendet werden.
Oft ist es in der medizinischen Praxis nicht notwendig, die DNA aller HAdV- Serotypen zu amplifizieren oder nachzuweisen.. Experimente, Überlegungen und Berechnungen haben insoweit ergeben, dass erfindungsgemäße Nuklein- säuren, deren Sequenz eine Homologie > 78% zu den SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 3 besitzt, noch immer an eine große Zahl der DNA der HAdV-Serotypen spezifisch binden können. >78% Homologie bedeutet dabei z.B. im Falle der SEQ ID NO. 1 , dass die homologe Sequenz an bis zu 5 Positionen der Basenabfolge von der SEQ ID NO. 1 abweichen kann. Bevorzugt sind selbstverständlich erfindungsgemäße Nukleinsäuren, mit einer höheren Homologie zu den Sequenzen der genannten SEQ IDs wie etwa solche mit > 82%, > 86%, > 91% und > 95%, wobei jede Prozentangabe bezogen auf SEQ ID NO. 1 eine Positionsabweichung weniger zulässt.
Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren als Sonde oder Primer so ausgewählt, dass sie befähigt sind, spezifisch an die DNA von > 15, > 25, > 30, > 35, > 40 oder sogar > 45 HAdV-Serotypen zu binden. Diese Fähigkeit kann der Fachmann durch Experimente oder den datenbankgeschützten Sequenzvergleich einer erfindungsgemäßen Nukleinsaure mit der DNA der einzelnen HAdV-Serotypen ermitteln. In den Sequenzvergleich können dabei alle HAdV-Serotypen einbezogen werden, deren Sequenz im Bereich des Bindungsabschnittes der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren (das ist das Hexon-Gen) bekannt ist.
Bestandteil der Erfindung ist auch ein Verfahren, mit dem Nukleinsäuren ermittelt werden können, die als Primer und Sonden (ebenfalls) an eine große Zahl der DNA der unterschiedlichen HAdV-Serotypen spezifisch binden können:
- Dazu wird in einem ersten Schritt die genetische Variabilität verschiedener Regionen der Genome der bereits komplett sequenzierten HAdV mit Hilfe eines multiplen Alignments dieser Genomdaten analysiert.
- In einem zweiten Schritt wird einer oder werden mehrere hoch konservierte Abschnitte von ca. 20 Basenpaaren Länge bestimmt. In einer bevorzugten Ausführung werden dabei drei hochkonservierte Abschnitte in einem Bereich von weniger als 1000 (bevorzugt weniger als 500, wiederum bevorzugt weniger als 200) Basenpaaren Länge ermittelt.
- In einem dritten Schritt erfolgt eine erneute Analyse des oder der ermittelten Genomabschnitte bzw. des ermittelten Bereiches mit den drei hochkonservier- ten Abschnitten mit Hilfe eines weiteren multiplen Alignments, das Vorzugs- weise sämtliche verfügbaren HAdV-Sequenzdaten, also auch die bereits bekannten Daten von HAdV-Serotypen, die noch nicht vollständig sequenziert sind, berücksichtigt. - In einem letzten Schritt werden mit Hilfe des zweiten multiplen Alignments eine, zwei oder bevorzugt drei Konsensussequenzen ermittelt, die durch Schmelztemperaturberechnungen für die Hybridisierung der Primer- bzw. Sondensequenzen mit den bekannten Sequenzen des multiplen Alignments so gewählt werden, dass eine effektive spezifische Sonden- bzw. Primerbindung an die DNA der oben genannten großen Zahl von HAdV-Serotypen zu erwarten ist.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweis von HAdV-DNA in einer Probe, mit folgenden Schritten:
Bereitstellen einer Probe, die potentiell HAdV-DNA enthält, - Bereitstellen einer Sonde, die jeweils spezifisch an die DNA von zumindest 35 unterschiedlichen HAdV-Serotypen binden kann, Vermischen der Sonde mit der Probe,
Amplifizieren von Bereichen jeder der in der Probe tatsächlich enthaltenen DNA der 35 HAdV-Serotypen, so dass der Abschnitt, an den die genannte Sonde spezifisch binden kann, mit amplifiziert wird,
Einstellen von Bedingungen, die eine spezifische Bindung der Sonde an Abschnitte der amplifizierten Bereiche ermöglichen, Detektieren amplifizierter DNA-Abschnitte, an die eine Sonde gebunden ist.
Bevorzugt ist, dass die Sonde so ausgewählt ist, dass sie nicht nur an die DNA von 35 sondern an die DNA von > 40, wiederum bevorzugt > 45, wiederum bevorzugt allen HAdV-Serotypen spezifisch binden kann.
Bevorzugt wird dabei als Sonde eine erfindungsgemäße Nukleinsaure, insbesondere .eine (a) mit der Sequenz der SEQ ID NO. 3 (b) mit einer Sequenz mit einer Homologie > 78 % zu SEQ ID NO. 3 oder (c) mit einer zu (a) oder (b) komplementären Sequenz verwendet. Die bereitzustellende Probe, die potentiell HAdV-DNA enthält, wird mit dem Fachmann geläufigen Methoden aus klinischen oder anderen Proben wie z.B. Zellkulturen, Blut, Plasma, Serum, Stuhl, Sputum, Urin, äugen- oder nasopha- ryngealen Abstrichen oder cerospinaler Flüssigkeit (CSF) für den Einsatz in einem DNA-Amplifikationsverfahren, bevorzugt einer PCR vorbereitet: Die Bedingungen, die eine spezifische Bindung der jeweiligen Sonde ermöglichen, wird der Fachmann leicht über die Variation geeigneter Parameter, insbesondere über die Variation der Temperatur einstellen.
Die erfindungsgemäß vorgesehene Amplifikation von DNA wird in den meisten Fällen über das PCR- Verfahren erfolgen. Sie kann aber auch auf anderen Wegen erfolgen, z.B. durch Virusvermehrung oder Vektorvervielfältigung.
Die Detektion der amplifizierten DNA-Abschnitte, an die eine Sonde gebunden ist, kann je nach Wahl der Markierung der Sonde und der Sonde selbst durch Verfahren wie z.B. Northernblot-, Westemblot-, Chemolumineszenz- oder Fluoreszenz-Verfahren erfolgen.
Es ist zu betonen, dass die Reihenfolge der Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens den Erfordernissen angepasst werden kann und einzelne oder die Abfolge mehrerer Schritte auch gegebenenfalls (mehrfach) wiederholt werden können. Letzteres betrifft insbesondere die für eine PCR typischen Schritte. Das Vermischen der Sonde mit der Probe wird in vielen Fällen - abhängig vom Nachweisverfahren - erst nach dem oder den Amplifizierungsschritten erfolgen.
Das erfindungsgemäße Verfahren bietet den Vorteil, dass mit einer einzigen Sonde der Nachweis möglich ist, dass DNA aus einer Gruppe von 35 (bzw. > 40 bzw. > 45 bzw. allen) HAdV-Serotypen in der zu untersuchenden Probe und damit auch in der klinischen Probe, aus der die zu untersuchende Probe gewonnen worden ist, vorhanden ist. Insbesondere kann die Sonde dazu verwendet werden, die amplifizierte DNA-Bereiche näher zu charakterisieren und sie damit von (ungewollt) mitamplifizierten DNA-Bereichen (wie z.B. aus Pseudogenen oder aufgrund schlechter Primerwahl) zu unterscheiden. Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren betrifft einen Nachweis von HAdV- DNA in einer Probe, mit folgenden Schritten:
Bereitstellen einer Probe, die potentiell HAdV-DNA enthält, - Bereitstellen zumindest eines Primerpaares, das jeweils spezifisch an die DNA von zumindest 25 unterschiedlichen HAdV-Serotypen binden kann,
Vermischen des zumindest einen Primerpaares mit der Probe, Einstellen von Bedingungen, die eine spezifische Bindung je eines der Phmer an je einen der DNA-Stränge jedes einzelnen der besagten 25
HAdV-Typen ermöglichen,
Amplifizieren der durch das zumindest eine Primerpaar begrenzten Bereiche jeder der in der Probe tatsächlich enthaltenen DNA der 25 HAdV-Serotypen, - Detektieren amplifizierter DNA-Bereiche
Bevorzugt ist, dass das Primerpaar so ausgewählt ist, dass es nicht nur an die DNA von 25 sondern an die DNA von > 30, wiederum bevorzugt > 40, wiederum bevorzugt allen HAdV-Serotypen spezifisch binden kann.
Bevorzugt werden dabei als Primer erfindungsgemäße Nukleinsäuren verwendet, insbesondere solche mit der Sequenz der SEQ ID. NO. 3 (oder dazu komplementäre) und ganz besonders bevorzugt Nukleinsäuren (a) der SEQ ID NO. 1 und/oder SEQ ID NO. 2 oder (b) einer Sequenz mit einer Homologie > 78 % zu SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO 2.
Die Amplifikation von DNA hierbei erfolgt regelmäßig über das PCR- Verfahren. Andere Verfahren zur in vitro Amplifikation von Nukleinsäurese- quenzen können auch angewendet werden.
Die Bedingungen, die eine spezifische Bindung der Primer an die entsprechenden DNA-Stränge ermöglichen, wird der Fachmann wiederum über die Variation geeignete Parameter, insbesondere die Temperatur, einstellen. Die Detektion der amplifizierten DNA-Bereiche kann beispielsweise durch Auftrennung im Gel in einem Transilluminator, durch Konzentrationsbestimmung nach Umfallen (wodurch kurze DNA-Abschnitte und Einzel-Nukleotide aus der Probe entfernt wurden) oder aber auch durch Hybridisierung mit insbesondere erfindungsgemäßen Sonden (siehe oben) erfolgen. Hinsichtlich weiterer Einzelheiten (z.B. Reihenfolge der Schritte, Häufigkeit der Einzelschritte, Vorbereitung der Proben) gilt das oben Gesagte entsprechend.
Ein wesentlicher Vorteil des Einsatzes eines bevorzugten erfindungsgemäßen Primerpaares, liegt darin, dass dieses spezifisch an die DNA von 25 , > 30, >
40, oder sogar von allen HAdV-Serotypen binden kann. Dementsprechend müssen die Amplifikationsbedingungen für nur wenige Primerpaare - idealerweise nur für Eines - optimiert werden.
Je weniger Primer eingesetzt werden, desto genauer ist der Amplifikationsvor- gang beherrschbar, da die jeweils relevante Primerkonzentration, die unter anderem Auswirkungen auf die Schmelztemperatur besitzt, besser zugänglich ist. Außerdem erschwert eine steigende Zahl von Primern die experimentelle Handhabbarkeit.
Der Einsatz von mehr als zwei ein erstes Primerpaar bildenden Primern erfolgt, wenn die DNA einer zweiten Gruppe HAdV-Serotypen amplifiziert und/oder nachgewiesen werden soll, an die ein oder beide Primer des ersten Primerpaares nicht spezifisch binden können. Der zusätzliche oder die zusätz- liehen Primer müssen dann so gewählt werden, dass sie eine spezifische Bindung an die DNA der zweiten . Gruppe HAdV-Serotypen unter Bedingungen eingehen, bei denen auch das erste Primerpaar spezifisch an die DNA bindet, an die es spezifisch binden kann.
Der Einsatz weiterer (entsprechend angepasster) Primer erfolgt auch dann, wenn stringentere Bedingungen, etwa solche, die weniger als vier Fehlpaarungen bei der Primerbindung zulassen, benötigt werden. Das durch die erfindungsgemäßen Verfahren' ermöglichte frühzeitige Nachweisen eines Befalls mit (wenigstens) einem Virus aus einer Gruppe von HAdV-Serotypen ist insbesondere für Patienten, die immundefizient oder - supprimiert sind, von ggf. lebenswichtiger Bedeutung.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Nachweis von HAdV-DNA in einer Probe, mit folgenden Schritten:
Bereitstellen einer Probe, die potentiell HAdV-DNA enthält, Bereitstellen zumindest eines Primerpaares, das jeweils spezifisch an die DNA von zumindest 15 unterschiedlichen HAdV-Serotypen binden kann,
Bereitstellen einer Sonde, die jeweils spezifisch in den durch das zumindest eine Primerpaar begrenzten Bereichen an die DNA der gleichen zumindest 15 unterschiedlichen HAdV-Serotypen binden kann, - Vermischen des zumindest einen Primerpaares mit der Probe,
Vermischen der Sonde mit der Probe,
Einstellen von Bedingungen, die eine spezifische Bindung je eines der Primer an je einen der DNA-Stränge jedes einzelnen der besagten 15 HAdV-Typen ermöglichen, - Amplifizieren der durch das zumindest eine Primerpaar begrenzten Bereiche jeder der in der Probe tatsächlich enthaltenen DNA der 15 HAdV-Serotypen,
Einstellen von Bedingungen, die eine spezifische Bindung der Sonde an Abschnitte der amplifizierten Bereiche ermöglichen, - Detektieren amplifizierter DNA-Abschnitte, an die eine Sonde gebunden ist.
Dabei ist bevorzugt, dass das Primerpaar und die Sonde nicht nur an die DNA von 15 sondern von > 20, bevorzugt > 30, wiederum bevorzugt > 40, erneut bevorzugt > 45 und schließlich bevorzugt allen HAdV-Serotypen spezifisch binden kann. Für Einzelheiten zu den genannten Schritten, vorteilhafte Primer und Sonden sowie sonstige bevorzugte Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Verfahrens gilt das bei den vorbeschriebenen Verfahren Erwähnte. Ein besonderer Vorteil des gleichzeitigen Verwendens eines Primerpaares und einer Sonde, die jeweils spezifisch an die gleiche DNA der genannten Anzahl unterschiedlicher HAdV-Serotypen binden können, liegt darin, dass zum erfindungsgemäßen Nachweis von HAdV-DNA einer Vielzahl von Seroty- pen jeweils drei spezifische Bindungen notwendig sind und erzeugt werden. Dies erhöht die Zuverlässigkeit des Nachweisverfahrens erheblich gegenüber Verfahren mit nur zwei spezifischen Bindungen (PCR) oder solchen mit nur einer spezifischen Bindung (Nachweis per Sonde).
In bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren werden zum Amplifizieren keine degenerierten Primer verwendet. Der ausschließliche Einsatz nicht- degenerierter Primer bietet insbesondere den Vorteil, dass die Reaktion besser berechenbar ist. So kann man bei bekanntem Ziel-Bindungsabschnitt des nicht-degenerierten Primers das Bindungsverhalten, d.h. die Schmelztempera- tur sehr exakt berechnen. Demgegenüber besteht bei degenerierten Primern, wenn sie nach den üblichen Oligosyntheseverfahren hergestellt werden, das Problem, dass nicht klar ist, in welchem Verhältnis die tatsächlich vorhandenen Primervarianten vorliegen. Dabei beeinflusst die Konzentration jedes einzelnen Primers in einem degenerierten Primer die jeweilige Schmelztempera- tur, welche wiederum wichtig für die Anlagerung des einzelnen Primers an den Zielabschnitt der DNA ist. Das Verhältnis der Konzentrationen der tatsächlich in einem degenerierten Primer vorhandenen Primervarianten zueinander ist zudem von den genauen Herstellungsbedingungen abhängig, die wiederum bei unterschiedlichen Anbietern unterschiedlich sein können, so dass ein de- generierter Primer sich in seiner tatsächlichen Zusammensetzung nicht unwesentlich von dem von einem anderen Hersteller gelieferten „gleichen" degenerierten Primer unterscheiden kann. Dies hat natürlich einen negativen Einfluss auf die Reproduzierbarkeit der Nachweisverfahren. Außerdem kommt es bei mehreren nicht genau definierten Basen innerhalb des degenerierten Primers zu einer Vielzahl von möglichen Primer-Varianten, was für die einzelnen tatsächlich vorliegenden Primer bedeuten kann, dass sie in verhältnismäßig geringer Konzentration vorliegen und so für die ihnen entsprechende HAdV-DNA eine zu geringe Konzentration vortäuschen oder im Nachweis versagen können. Als weiteres Risiko besteht die Gefahr, dass bei einer größeren Zahl von Primer-Varianten in einem degenerierten Primer einzelne Primer miteinander hybridisieren und somit für die PCR gar nicht mehr zur Verfügung stehen.
In bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren werden zum Amplifizieren we- niger als 11, bevorzugt weniger als 5, wiederum bevorzugt weniger als 3 zu einander verschiedene Primer eingesetzt.
Die Verwendung einer nur geringen Zahl von Primern führt zu einer besseren Berechenbarkeit des gesamten Anlagerungs- und Amplifikationsprozesses, insbesondere dann, wenn die Zielsequenzen (die Bindungsabschnitte) auf der nachzuweisenden DNA bekannt sind. Des weiteren treffen die oben beschriebenen Nachteile degenerierter Primer für Primer im Sinne der hier gültigen Definition auch dann nicht zu, wenn mehrere Primer eingesetzt werden.
In bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren werden - wie erwähnt - erfindungsgemäße Nukleinsäuren als Primer (identisch mit oder abgeleitet von SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO^2 oder SEQ ID NO. 3, vergleiche oben) zum Amplifizieren eingesetzt werden. Diese Primer erfüllen die Anforderung an Primer für die erfindungsgemäßen Verfahren in hervorragender Weise, insbe- sondere sind sie in der Lage, spezifisch an die DNA einer großen Zahl unterschiedlicher HAdV-Serotypen zu binden. Insbesondere für die PCR werden Primerpaare aus erfindungsgemäßen Desoxynukleinsäuren ausgewählt. Dabei fällt es dem Fachmann nicht schwer, unter Berücksichtigung der Syntheserichtung der DNA-Polymerase die jeweils sinnvolle Sequenz für einen For- ward- und die entsprechende für einen Reversprimer zu bestimmen.
In bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren werden - wie erwähnt - erfindungsgemäße Nukleinsäuren (identisch mit oder abgeleitet von SEQ ID NO. 1 , SEQ ID NO.2 oder SEQ ID NO. 3, vergleiche oben) als Sonden eingesetzt. Dabei ist es unter anderem abhängig von dem zu amplifizierenden DNA- Bereich, welche der SEQ ID NO. 1 bis 3 der Fachmann als bevorzugte Grundlage für die Sonde verwendet.
Besonders bevorzugt in diesem Zusammenhang sind RNA- oder DNA- Sonden, die von der SEQ ID NO. 3 abgeleitet wurden, weil dann bei Einsatz von Primerpaaren, die von SEQ ID NO. 1 und 2 abgeleitet sind, der Sondenbindungsabschnitt im Amplikon liegt. Dabei ist es aufgrund der Tatsache, dass die beiden DNA-Stränge, die den Bindungsabschnitt umfassen, komplementär zueinander sind, nur von untergeordneter Bedeutung, ob die Sonde einer der oben beschriebenen Sequenzen entspricht, oder komplementär zu dieser ist.
Die genannten Sonden erfüllen die Anforderung an Sonden für die erfindungsgemäßen Verfahren in besonderer Weise, insbesondere sind sie in der Lage spezifisch an die DNA einer großen Zahl von HAdV-Serotypen zu bin- den.
Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Verfahren so gestaltet, dass der amplifizierte Bereich (Amplikon) < 500, bevorzugt < 300, wiederum bevorzugt < 150 Basenpaare umfasst.
Vorteile eines Amplikons von geringer Größe bestehen im Vergleich mit größeren Amplikons insbesondere darin, dass die PCR schneller erfolgen kann, nur der Einsatz einer geringeren Menge an Nukleotiden notwendig und die Genauigkeit der DNA-Vervielfältigung erhöht ist.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Detektion der amplifizierten DNA-Bereiche unter real time Bedingungen während und/oder nach einem, mehreren oder jedem Amplifika- tionsschritt.
„Unter real time Bedingungen" bedeutet hierbei, dass das Amplifikationsver- fahren, das regelmäßig eine wiederholte Abfolge von mehreren Schritten umfasst (PCR) für die Detektion der amplifizierten DNA nicht unterbrochen werden muss. Dabei ist unter dem Terminus „nach jedem Amplifikationsschritt" nicht zu verstehen, dass unmittelbar nach Beendigung des Amplifikati- onsschrittes die Detektion erfolgen muss.
In bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren bindet eine Sonde für die in-Situ-Detektion spezifisch an Template-DNA und an in den vorangehenden Amplifizierungsschritten vervielfältigte DNA der nachzuweisenden HAdV-Serotypen. Dies geschieht bevorzugt während des Primer- bindungsschrittes (annealing) während der PCR. Dabei ist die Sonde so zu wählen, dass sie bei gleichen Bedingungen wie die Primer an die Ziel-DNA bindet. Bevorzugt ist dabei eine erfindungsgemäße, von der SEQ ID NO.3 abgeleitete Nukleinsaure. Durch das Bindungsereignis kann dann eine Veränderung eines Signales z.B. die Verstärkung oder Abschwächung von Fluoreszenz ausgelöst und detektiert werden. Die Detektion kann aber auch aufgrund einer erst durch die Bindung der Sonde an ihren Zielabschnitt der DNA ermög- lichten Reaktion wie z.B. dem Freisetzen eines Farbstoffes oder eines Quen- chers z.B. durch die Nuklease-Aktivität einer DNA-Polymerase erfolgen.
Ein so gestaltetes Verfahren bietet den Vorteil, dass arbeitsintensive und zeitverbrauchende Schritte für die Detektion des Amplikons wie z.B. Ethidium- Bromid gefärbte Gelelektrophorese mit oder ohne Restnktionsenzymverdau oder zusätzliche Hybridisierungsprozeduren nicht mehr notwendig sind.
Darüber hinaus verlangen Detektionsmethoden, die nicht unter real time Bedingungen durchgeführt werden, in der Regel ein offenes Hantieren mit PCR- Produkten, was ein hohes Risiko von Kontamination in sich birgt: Die äußerst empfindlichen PCR-Verfahren können im Extremfall bereits bei der Verschleppung von nur einem Molekül DNA in nachfolgende PCR-Ansätze zu falschen positiven Ergebnissen führen. Eine solche Verschleppung kann bereits durch die Luft erfolgen. Dementsprechend sind in Laboren die Sicherungsmaßnah- men gegen Kontamination umso aufwendiger, je mehr mit Nukleinsäuren offen hantiert werden muss.
Ein weiterer Vorteil der Detektion unter real time Bedingungen besteht darin, dass in Fällen, in denen es lediglich auf einen qualitativen Nachweis des Vor- handenseins von HAdV-DNA ankommt, die Amplifikationsprozedur ab dem Zeitpunkt abgebrochen werden kann, ab dem ein Signal vorliegt, das den Nachweis der entsprechenden DNA erbringt. Dies kann zu erheblicher Zeiteinsparung führen. Darüber hinaus werden in vielen Nachweisverfahren hoch toxische und/oder krebserregende Reagenzien wie z.B. Ethidium-Bromid eingesetzt. Somit führt eine Detektion unter real time Bedingungen auch zu einem besseren Gesundheitsschutz des Laborpersonals. Zudem können auch Kosten für spezielle Schutzeinrichtungen wie z.B. Schutzkleidung gespart werden.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der vorgeschilderten Verfahren erfolgt die Detektion der amplifizierten DNA-Bereiche quantitativ.
Für den relativen Vergleich detektierter DNA-Konzentrationen zueinander stehen dem Fachmann Methoden wie z.B. die Messung der UV-Transmission in einem Transilluminator nach der Trennung in einem Ethidium-Bromid gefärbten Gel oder auch densiometrische Auswertungen von Aufnahmen entsprechender Gele zur Verfügung.
Um Rückschlüsse auf die absolute DNA-Konzentration innerhalb einer Probe zu ermöglichen, können Signale, deren Stärke direkt abhängig von der DNA- Konzentration ist, auf Standardkurven bezogen und damit normalisiert werden. Für solche Verfahren eignen sich bevorzugt DNA-Nachweisverfahren, die Signale liefern, die mit hochauflösenden Geräten gemessen werden können. Die entsprechenden Signale können z.B. Sonden mit radioaktiver Markierung und besonders bevorzugt Sonden liefern, die abhängig von der Bindung an die DNA, gegebenenfalls nach weiteren Reaktionsschritten, Fluoreszenz- oder Chemolumineszenz-Signale erzeugen.
Die Ergebnisse konventioneller PCRs sind nur qualitativ (positiv/negativ). Eine Quantifizierung von Adenovirus-DNA-Konzentrationen wird aber in der Forschung für das Verständnis der Kinetik und Pathophysiologie von Adenoviru- sinfektionen benötigt. Auch für grundlegende Erkenntnisse über die Viren selbst, wie z.B. Virusreplikation und Wirkmechanismen von Medikamenten ist eine Quantifizierung notwendig. Dieses Bedürfnis befriedigen die erfindungsgemäßen Verfahren in besonderer Weise, da - anders als bei den bisher bekannten quantitativen Verfahren für HAdV - nicht nur einer oder wenige, sondern eine größere Zahl von HAdV-Serotypen (in bevorzugten Verfahrensges- taitungen sogar alle) erfasst werden. Damit sind entsprechend gestaltete er- findungsgemäße Verfahren insbesondere für den Einsatz in klinischen Studien geeignet.
Bislang ist keine Therapiekontrolle bei der Behandlung von Adenovirus- Infektionen möglich (wie z.B. bei der Anwendung spezifischer Virostatika oder der Reduktion von immunsuppressiver Therapie). Auch dieses Problem wird durch quantitative erfindungsgemäße Detektionsverfahren gelöst, da diese in hochreproduzierbarer Weise die Quantifizierung der HAdV-Belastung von klinischen Proben nach deren geeigneter Vorbehandlung ermöglichen.
Nicht nur eine Therapiekontrolle, sondern auch die Entscheidung, eine Therapie einzuleiten wird durch die Quantifizierung erleichtert: Anders als bei den bisher bekannten ist es mit den erfindungsgemäßen Verfahren möglich, nicht nur die Tatsache der Belastung eines Patienten mit einem oder mehreren ei- ner großen Zahl von HAdV-Serotypen festzustellen, sondern über die Quantifizierung auch die Relevanz dieser Belastung. So wird ein Arzt insbesondere bei immunsupprimierten Patienten nur dann zu einer Abschwächung der Sup- pression raten, wenn die Virusbelastung eine ernsthafte Gefahr für den Patienten ist oder zu werden droht. Letztendlich ist über die Quantifizierung, ins- besondere wenn sie für Proben des selben Patienten durchgeführt wird, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten genommen wurden, eine Vorhersage des tatsächlichen Ausbruches von auf HAdV beruhenden Krankheiten erleichtert.
Die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen darüber hinaus die (notwen- dige) Quantifizierung von humanen Adenoviren für die Planung und Kontrolle von Gentherapien mit Adenovirus-Vektoren.
Gemäß einer weiteren, besonders bevorzugten Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verfahren werden als Primer erfindungsgemäße Nukleinsäuren, die wie oben beschrieben homolog zu den Sequenzen SEQ ID NO. 1 und/oder SEQ ID NO. 2 sind und/oder als Sonde eine erfindungsgemäße markierte Nukleinsaure, die wie oben beschrieben der Sequenz SEQ ID NO. 3 homolog oder zu einer solchen homologen komplementär ist, verwendet. r
Der Vorteil des Einsatzes der genannten Primer und/oder der genannten Sonden besteht darin, dass es sich dabei um Primer und Sonden handelt, die an die DNA einer Vielzahl von HAdV-Serotypen binden können. Auch die anderen oben genannten Vorteile der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kommen beim Einsatz in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Quantifizierung zum . Tragen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der beschriebenen Erfindung werden dabei aus den genannten Gründen als Primer(paar) Nukleinsäu- ren mit der SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO. 2 und eine Sonde eine markierte Nukleinsaure mit der SEQ ID NO. 3 oder einer dazu komplementären Sequenz verwendet.
Die Verwendung der bevorzugten Primer und Sonden führt dazu, dass zuver- ' lässig die DNA aller HAdV-Serotypen in klinischen Proben nachgewiesen werden kann. Dabei ermöglichen erfindungsgemäße Verfahren wie aufgeführt auch die Quantifizierung - sogar unter real time Bedingungen - der in der Probe enthaltenen HAdV-DNA. Trotz des Bedarfs an solchen Verfahren für die Detektion von HAdV war es der Fachwelt aufgrund der hohen Sequenzdi- versität dieser Viren nicht gelungen, ein solches zu erstellen.
In einer ganz besonders bevorzugten Äusführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren (ggf. in ihren bevorzugten Ausgestaltungen) wird ein TaqMan PCR-Verfahren (auch als „exonuclease probe" Verfahren bezeichnet) zur Amplifikation und Detektion verwendet (vergleiche Holland, P. M., Abramson, R. D., Watson, R., and Gelfand, D. H. (1991): Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5' — 3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc Natl Acad Sei U S A 88, 7276-80; und Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., and Williams, P. M. (1996): Real time quantita- tive PCR. Genome Res 6, 986-94; sowie Kricka, L. J. (2002): Stains, labeis and detection strategies for nucleic aeids assays. Ann Clin Biochem 39, 1 4- 29).
Bislang wurden eine Reihe, (zum Teil generische) TaqMan PCR-Verfahren für verschiedene humane patogene Viren beschrieben. Diese Verfahren zeichnen sich durch eine Reihe von Vorteilen aus. Eine Übertragung dieses Prinzips auf den (gleichzeitigen) Nachweis einer großen Zahl von HAdV-Serotypen war allerdings bislang aufgrund der geschilderten Sequenzdiversität dieser Viren noch nicht gelungen, ist aber mit den Erkenntnissen der vorliegenden Erfin- düng jetzt möglich geworden.
Die Sonde kann dabei auf verschiedene Weise markiert werden, beispielsweise mit FAM als Fluoreszenzfarbstoff am 5'Ende und TAMRA als Fluoreszenz- quencher am 3Εnde. Dies führt zu einer Quenchung der Fluoreszenz des Farbstoffes der Sonde im ungebundenen Zustand und zu einer Freisetzung der Fluoreszenz im gebundenen Zustand z.B. durch die Trennung des Reporter- und des Quencherfarbstoffes durch die 5'-3'-Exonukleaseaktivität der DNA-Polymerase während des Verlängerungsschrittes in der PCR.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden hierbei eine Sonde der SEQ ID NO. 3 und Primer der SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO. 2 verwendet.
Ein als TaqMan PCR-Verfahren ausgestaltetes erfindungsgemäßes Verfahren vereint bei der entsprechenden Wahl der Primer alle zu den erfindungsgemäßen Verfahren und deren bevorzugten Ausgestaltungen aufgezählte Vorteilen in sich:
Die Detektion der amplifizierten DNA erfolgt unter real time Bedingungen während der PCR durch Hybridisierung der DNA mit einer Sonde. - Arbeits- und zeitaufwendige nachfolgende Detektionsschritte sind nicht mehr notwendig. Gute Handhabbarkeit
Eine Kontamination nachfolgender PCR-Ansätze durch amplifizierte DNA ist durch das TaqMan-Prinzip so gut wie ausgeschlossen, da kein offenes Hantieren mit PCR-Produkten notwendig ist.
Bei einer geeigneten, erfindungsgemäßen Wahl der Primer und der Sonde ermöglicht das TaqMan PCR-Verfahren den Nachweis sämtlicher bekannter Serotypen der HAdV. Eine Quantifizierung der in der Probe enthaltenen HAdV-DNA ist mit dem TaqMan Verfahren zuverlässig möglich. Darüber hinaus stellt das TaqMan PCR-System ein etabliertes Verfahren dar, für das die benötigten Komponenten (Geräte, Chemikalien) kommerziell erhältlich sind und zu dem es entsprechenden Optimierungssupport gibt. Insbesondere ist das quantitative Auswertungsverfahren (Analyse über die Crossing-Points, CP) gut etabliert.
Als weiterer Vorteil ist die gegenüber den konventionellen PCR-Verfahren höhere Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen TaqMan-Verfahrens zu nennen. Die Nachweisgrenze liegt dabei je nach Ausgestaltung des Verfahrens bei ≤1,5 x 104, bevorzugt < 1 ,5 x 103, wiederum bevorzugt < 1,5 x 102, und schließlich bevorzugt <1 ,5 x 101 Template-Molekülen pro Ansatz (vergleiche dazu auch Tabelle 1).
Gemäß weiteren bevorzugten Ausgestaltungen der beschriebenen Verfahren erfolgt die Primer-Bindung (annealing) bei >48 °C, bevorzugt bei >50 °C, weiter bevorzugt bei >53 °C, wiederum bevorzugt bei >55 °C.
Eine hohe (höhere) Temperatur in der annealing-Phase bietet den Vorteil, dass die Primer-Bindung mit hoher (höherer) Sicherheit tatsächlich spezifisch ist.
Die Erfindung umfasst auch ein Kit, umfassend Primerpaar und Sonde, jeweils bestehend aus erfindungsgemäßen Nukleinsäuren.
Ein wesentlicher Vorteil eines solchen Kits besteht darin, dass Primer und Sonde optimal auf einander abgestimmt sind und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren in ihren besonders bevorzugten Ausgestaltungen ermöglichen.
Ebenfalls erfindungsgemäß ist die Verwendung einer oder mehrerer erfindungsgemäßer Nukleinsäuren oder eines erfindungsgemäßen Kits zum Nachweis von HAdV-DNA. Dies geschieht vorzugsweise im Rahmen eines der vorbeschriebenen Verfahren. Die so - wie auch durch die vorgeschriebenen Verfahren - erhaltenen Ergebnisse können sodann als Grundlage für eine Diagnose durch den Arzt dienen.
Damit sind dem Arzt Daten in die Hand gegeben, die es ihm ermöglichen, fundierte Entscheidungen über die Notwendigkeit und die Art von Therapieanwendungen bezüglich der HAdV zu treffen.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zum Charakterisieren von HAdV- Serotypen mit folgenden Schritten: - Nachweis von HAdV-DNA in einer Probe gemäß einem der vorbeschriebenen Verfahren Charakterisieren in der Probe nachgewiesener HAdV-DNA
Zum Charakterisieren nachgewiesener HAdV-DNA stehen dem Fachmann eine Reihe von Möglichkeiten zur Verfügung. So kann er z.B. über Restriktions-Fragment-Analyse, insbesondere aber durch vollständiges - oder Ansequenzieren der in der Probe enthaltenen DNA, diese einer der sechs humanen Adenovirus-Spezies oder sogar einem bekannten HAdV-Serotypen zuordnen.
Eine Vorgehensweise ist die unten beschriebene molekulare Charakterisierung von PCR-positiven Proben durch Multiplex PCR und Sequenzierung (vergleiche Beispiel 4).
Für den Fall, dass die DNA von mehr als einem HAdV-Serotypen in der zu untersuchenden Probe enthalten ist bzw. war, kann es notwendig sein, umfassendere Charakterisierungen vorzunehmen, insbesondere um die Resultate der Charakterisierungsschritte den jeweiligen HAdV-Serotypen zuordnen zu können. Dazu kann der Fachmann beispielsweise Serotyp-spezifische Primer in einer weiteren PCR einsetzen.
Vorteil des geschilderten Verfahrens ist, dass damit nicht nur grundsätzlich die Anwesenheit von HAdV nachgewiesen wird, sondern durch die nachfolgende Charakterisierung auch bestimmt wird, welcher oder welche einzelnen Seroty- pen tatsächlich vorliegen. Durch das genannte Verfahren ist es auch möglich, bisher unbekannte HAdV- Serotypen zu identifizieren, da die erfindungsgemäßen Verfahren auch die DNA unbekannter HAdV-Serotypen erfassen und damit zur Entdeckung dieser Serotypen verwendet werden können: Falls sich der amplifizierte oder die amplifizierten DNA-Bereiche nicht einzelnen schon bekannten HAdV- Serotypen zuordnen lassen (z.B. durch Datenbankvergleich nach Sequenzierung), so ist die Wahrscheinlichkeit, dass ein bislang unbekannter HAdV- Serotyp vorliegt, sehr hoch (wenn es sich nicht um einen bereits bekannten Serotypen handelt, dessen dem charakterisierten DNA-Bereich korrespondierende Basensequenz noch nicht in den Gendatenbanken zu finden ist). Weitere Charakterisierungen anderer DNA-Bereiche, bzw. bevorzugt des potentiellen Virus selbst, können gegebenenfalls die Erkenntniss verifizieren, dass ein neuer HAdV-Serotyp gefunden wurde.
Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Proben mit einem erfindungsgemäßen Verfahren auf die Anwesenheit von HAdV-DNA zu screenen und dann bei den positiven Proben eine Virusisolation und Typisierung mit konventionellen Techniken vorzunehmen wie z.B. Isolation auf Zellkulturen und im positi- ven Fall anschließende Typisierung durch Neutralisationtests, Hämagglutina- tionstests und Hämagglutinationsinhibitionstests. Neue Typen würden sich mit diesen konventionellen Techniken nicht zufriedenstellend typisieren lassen und deshalb als neues, nicht typisierbares Adenovirus erscheinen.
Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung werden nachfolgend anhand der Figuren und der Beispiele näher erläutert.
Fig. 1 stellt das multiple Alignment eines Teils der Hexon-Gensequenzen verschiedener HAdV-Serotypen und die Konsensus-Sequenzen der PCR-Primer (AQ1 , SEQ ID NO. 1 ; AQ2, SEQ ID NO. 2) und der Sonde AP (SEQ ID NO. 3) dar. Die Schmelztemperaturen (Tm der Bindung von AQ1 und AQ2 sowie AP) an jede Sequenz wurden unter Berücksichtigung der Fehlpaarungen (mismat- ches) zwischen der Konsensussequenz und der jeweiligen HAdV-Sequenz ermittelt. Die Basennummerierung erfolgte aufgrund der HAdV-2-Sequenz. Die Datenbanknummern sind:' HAdV-2 (#NC 001405), HAdV-3 (#X76549), HAdV-4 (#AF06062), HAdV-5 (#NC 00146), HAdV-12 (#AF065065), HAdV-34 (#AB052911), HAdV-40 (#L19443), HAdV-41 (#M21163).
Fig. 2 stellt den Anstieg der Fluoreszenz gegenüber der Zyklen-Zahl dar. Drei unterschiedliche Template-Konzentrationen (A, B: 1 ,5 x 107 Kopien pro Lauf; C, D: 1,5 x 104 Kopien pro Lauf; E, F: 1,5 x 101 Kopien pro Lauf) wurden getestet mit (B, D, F) und ohne 500 ng humaner DNA (A, C, E). Der Fluoreszenzanstieg über den Schwellenwert (Crossing Point, CP) wurde anders als die End-Fluoreszenz nicht durch die humane DNA beeinflusst.
Beispiel 1 : HAdV-Quantifizierung, Standardplasmid und zur Verfügung stehende Viren
Zur Präparation eines Standards für die Positiv-Kontrollen wurde ein HadV-2- PCR-Amplikon (nt. 18856-19137 der HAdV-2-Sequenz) in einen pGEM-T Easy plasmid vector (Promega, Madison, Wl) einkloniert. Die Plasmid-DNA wurde aus E.coli unter Verwendung des Nukleobond 100 Kit (Macherey und Nagel, Deutschland) aufgereinigt und durch Sequenzierung wurde bestätigt, dass die klonierte HadV-2-Sequenz identisch mit der HadV-2-Prototyp- Genbanksequenz (#J01917) war. Die Plasmidkonzentration wurde photometrisch bei 260 nm bestimmt und in Genom-Äquivalenten (Kopien pro ml) umgerechnet, da das Molekulargewicht des Plamides bekannt war.
Für die Testreihe der HAdV-Serotypen wurden A549-Zellen (im Fall von HAdV-40 und HAdV-41 Graham 293-Zellen) mit den HAdV-Prototypstämmen infiziert. Bei über 50 % CPE (zytopathischer Effekt) wurden die Zellen gefriergetaut und die DNA aus 200 μl des Lysates mit dem Qiagen Blood Kit (Qia- gen, Hilden, Deutschland) extrahiert. Prototypvirusstämme des Deutschen Nationalreferenz-Laboratoriums (Typen HAdV-1 bis -21, -23, -25, -27, -28, -30 bis -41, -43) und der American Type Culture Collection (Manassas, VA) (HAdV-3, -5, -7, -12, -18, -22, -24, -26, -29, -30, -35, -36, -42, -44 bis -49 und der vorgeschlagenen Typen -50 und -51 ) wurden getestet. Beispiel 2: Design von Primern und Sonde
Ein Primerpaar für die Amplifikation der DNA aller 51 Serotypen des Genus HAdV wurde folgendermaßen entworfen: Fünf, bislang vollständig sequenzier- te HAdV, Typ 2 (Spezies (Genus) humaner Adenovirus C, Genbank #J01917), 5 (Spezies humaner Adenovirus C, #M73260), 12 (Spezies humaner Adenovirus A; #X73487), 17 (Spezies humaner Adenovirus D, #AF108105), and 40 (Spezies humaner Adenovirus F, Genbank #L19443) wurden unter Verwendung der clustalX Software (Version 1.8) in ein Alignment gebracht (vergleiche Thompson, J. D., D. G. Higgins, and T. J. Gibson. 1994. CLUSTAL W: impro- ving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22(22):4673-80).
Mehrere hochkonservierte Regionen, die nicht nur die spezifische Anlagerung der Primer sondern auch der markierten Sonde ermöglichen, wurden im He- xon-Gen identifiziert. Da zusätzliche Daten über die Hexon-Gensequenz verschiedener HAdV-Typen verfügbar sind, wurde ein multiples Alignment des Hexon-Genes unter Einschluss von Sequenzen aller sechs HAdV-Generi er- zeugt und für die Primererstellung verwendet (vergleiche Fig. 1). Die Primer wurden gemäß den Richtlinien für TaqMan PCR (vergleiche: Sequence detection Systems quantitative assay design and optimization; www.appliedbiosys- tems.com, application note #77101-006) so ausgewählt, dass der von ihnen begrenzte Bereich einen dritten hochkonservierten Abschnitt umfasst, der als Bindungsstelle für die Sonde dienen kann.
Trotz der Selektion konservierter Regionen gibt es kleinere Sequenzdiversitä- ten in den Bindungsabschnitten der Primer und der Sonde. Um die maximale Zahl der Fehlpaarungen auszugleichen, wurden die Konsensus- Primersequenzen durch Berechnung der Schmelztemperaturen der Interaktion beider Primer mit jeder HAdV-DNA-Sequenz mit der Hilfe der Metcalc Software (vergleiche: Schütz, E., and N. von Ahsen. 1999. Spreadsheet Software for thermodynamic melting point prediction of oligonucleotide hybridization with and without mismatches. Biotechniques. 27:1218-24.) entworfen (verglei- ehe Fig. 1). Eine Amplifikationsreihe in einer konventionellen PCR für die DNA von 51 HAdV, die alle Serotypen (einschließlich der vorgeschlagenen Typen 50 und 51) einschloss, zeigte, dass das Primerpaar (AQ1 und AQ2) in der Lage war, DNA-Bereiche aller humanen Adenoviren zu amplifizieren.
Gegenüber der konventionellen PCR benötigt die Real-Time-Detektion der PCR-Amplikons mit einer TaqMan-Sonde die fast vollständige Hybridisierung einer doppelt fluoreszenzmarkierten Sonde, um den Abbau der Sonde durch die Nuklease-Aktivität der Taq-Polymerase zu erreichen. Die Sonde wurde nach den Richtlinien für TaqMan-Sonden (vergleiche: Sequence detection Systems quantitative assay design and optimization; www.appliedbiosys- tems.com, application note #77101-006) erstellt und die Zahl von Fehlpaarungen bei der Bindung an die DNA jedes HAdV-Serotypes des multiplen A- lignments wurde auf ähnlichem Wege wie bei den Primern minimiert (vergleiche Fig. 1). Die Tm der Sonde und der Primer für die Hybridisierung mit der entsprechenden Sequenz der DNA jedes HAdV-Serotypen wurde berechnet und die Reaktionsbedingungen der Real time PCR wurden so eingestellt, dass die Amplifikation und Detektion möglichst aller humanen pathogenen Adenovi- ren ermöglicht wurde (vergleiche Beispiel 3).
Beispiel 3: Durchführung derTagMan PCR
Die TaqMan PCR wurde mit Hilfe des LightCycler (LC, Röche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) in verschlossenen Glaskapillaren mit einem Gesamt- reaktionsvolumen von 20 μl durchgeführt. Das FastStart Hybridization Kit (Röche) wurde für die Erstellung eines PCR-Mastermixes verwendet. Als HAdV- spezifische Primer wurden Primer Adenoquant 1 (AQ1, SEQ ID NO. 1) und . Adenoquant 2 (AQ2, SEQ ID NO. 2) verwendet. Die Sonde (AP, SEQ ID NO. 3) wurde mit FAM (Carboxyfluoreseein) als Fluoreszenzfarbstoff am 5'Ende und TAMRA (Carboxytetramethylrhodamin) als Fluoreszenz-Quencher am 3'Ende markiert. Alle Oligonukleotide wurden synthetisiert, markiert und gereinigt durch Eurogentec (Seraing, Belgien). Die Sonde, die Primer und Magnesiumchlorid wurden so zum Mastermix hinzufügt, dass die Endkonzentratio- nen der Sonde 0,4 mM, jedes Primers 0,5 mM und von Magnesiumchlorid 3 mM betrug. Darüber hinaus wurde hitzelabile Uracil-DNA Glycosylase (UNG, 1 U/Reaktion; Röche, Mannheim, Deutschland) dem Mastermix hinzugefügt. 8 μl des Mastermixes und 12 μl der DNA-Templatelösung wurden in jede Kapillare gefüllt. Die verschlossenen Kapillaren wurden in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert und in den LC platziert.
Die Reaktionsbedingungen waren folgendermaßen: 5 Minuten bei 35 °C für die Uracil-DNA-Glycosylase-Inkubation, gefolgt von 10 Minuten bei 95 °C, um die „hot start" Taq-Polymerase zu aktivieren. 45 Zyklen, die aus dem Denatu- rierungsschritt (denaturation) bei 95 °C für 3 Sekunden, dem Anlagerungsschritt (annealing) bei 55 °C für 10 Sekunden und dem Verlängerungsschritt (extension) bei 65 °C für 60 Sekunden bestanden, wurden durchgeführt. Die Temperatursteigerungsgeschwindigkeit zwischen dem Anlagerungs- und dem Verlängerungsschritt betrug 0,5 °C pro Sekunde.
Die Fluoreszenzdaten wurden am Ende jeden Verlängerungsschrittes im Kanal F1 (Aufnahmeart „Single") der LC-Apparatur aufgenommen. Der Crossing Point (CP), die Zyklenzahl, die mit dem Anstieg der Fluoreszenz über einen Schwellenwert korrespondiert, wurde automatisch durch die LightCycler Soft- wäre (Version 3.5c, Einstellung: proportionale Basislinienabgleichung, Schwellenwert = Basislinie + 6 SD der Basislinie, Sollwertberechnung mit zwei Punkten) berechnet. Nach dem letzten Zyklus wurden die Röhrchen auf 30 °C heruntergekühlt und entsorgt, ohne die Kapillaren zu öffnen.
Nachweis der HAdV-Serotypen mit der TaqMan PCR:
Die Real time PCR (TaqMan PCR) ergab positive Ergebnisse für alle Prototypen-Stämme des Genus HAdV, einschließlich der kürzlich isolierten und vorgeschlagenen neuen Typen HAdV-50 und HAdV-51. Dabei waren die Cros- sing Point (CP) Werte von < 20 für alle Prototypen-Stämme gering, was eine effektive Amplifikation und eine sensitive Detektion indiziert. Darüber hinaus wurden zwölf klinische Isolierungen von HAdV unterschiedlicher Serotypen durch die TaqMan PCR getestet und alle Isolierungen waren mit geringen CP- Werten (< 20) positiv. Demgegenüber war die Real time PCR mit 100 ng hu- maner DNA, die aus Zellkulturen (MRC5) oder aus dem Blut eines gesunden Erwachsenen als Template isoliert worden waren, stets negativ (n = 38).
Sensitivität und dynamischer Bereich der Quanitfikation:
Eine Plasmid-DNA, die eine Teilsequenz des HAdV-2-Hexon-Gens enthielt, wurde serienverdünnt und als Template für das PCR-Verfahren (1 ,5 x 108 bis 1 ,5 x 10"1 HAdV-2-Genom-Äquivalente (Kopien) pro Ansatz) in je zehn wiederholten Ansätzen zur Untersuchung der Sensitivität der TaqMan PCR eingesetzt. Eine so geringe Zahl wie 1,5 x 101 Kopien wurden zuverlässig nachgewiesen (n = 10), während 1 ,5 x 10° Kopien nur noch gelegentlich detektiert werden konnte (4 von 10 Ansätzen) und höhere Verdünnungen waren negativ, ebenso wie die Negativ-Kontrollen, die nur destilliertes Wasser enthielten (vergleiche Tabelle 1).
Tabelle 1
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Tabelle 1: Versuchsvariabilität der HAdV TaqMan PCR, bestimmt durch ver- schiedene Ansätze an verschiedenen Tagen nd: nicht bestimmt Die Serienverdünnung der Plasmid-DNA wurde auch zur Bestimmung des dynamischen Bereiches der Quantifikation verwendet. Die Versuchsvariabilität (Standardabweichung der CP-Werte) war gering, z.B. 2,7 % für 1 ,5 x 107 Ko- pien pro Ansatz und 1 ,1 % für 1 ,5 x 104 Kopien pro Ansatz. Tabelle 1 gibt die Durchschnitts-CP und die Standardabweichung (SD) der in zehn verschiedenen Ansätzen an verschiedenen Tagen ermittelten CP wieder. Die Regressionsanalyse der Crossing Points gegen log HAdV-DNA-Konzentration ergab einen sehr hohen Korrelations-Koeffizienten (0,99 bis 1 ,0) für den Konzentra- tionsbereieh zwischen 1 ,5 x 101 bis 1 ,5 x 108 Kopien HAdV-DNA pro Ansatz. Die daraus resultierenden Regressionsgraden (n = 10) hatten ein Gefälle von -3,5 (SD = 0,075), was auf eine effektive Amplifikation der Adenovirus DNA der Probe hinwies (Verfielfältigung der DNA um den Faktor 1 ,93 pro Zyklus).
In Weiteren Experimenten wurden die HAdV-DNA-Konzentrationen der Serienverdünnung des Plasmides als Standard gesetzt und HAdV-DNA- Konzentrationen jedes Punktes automatisch durch die LC-Software (Version 3.5c) unter der Annahme einer semilogarithmischen Relation zwischen den Crossing Points und der HAdV-DNA-Konzentration berechnet. Berechnete HAdV-DNA-Konzentration und SD von berechneten Konzentrationen weisen auf einen dynamischen Bereich der HAdV-DNA-Quantifikation von wenigstens sechs Größenordnungen (1 ,5 x 108 bis 1 ,5 x 102 Kopien HAdV-DNA), hin, niedrige Virus-DNA-Konzentrationen wie 1 ,5 x 101 Kopien können ebenfalls quantifiziert werden, allerdings mit einer höheren Standardabweichung (ver-. gleiche Tabelle 1).
Das Versetzen der Serienverdünnung des HAdV-Templates mit humaner genomischer DNA (500 ng pro Ansatz) beeinflusste nicht die Sensitivität und Quantifikation des HAdV-DNA-Nachweises, da der Anstieg der Fluoreszenz über den Schwellenwert (CP-Wert) durch die hDNA unbeeinflusst war (vergleiche Fig. 2). Anders als die CP-Werte weisen die Endpunkt- Fluoreszenzdaten auf negativen Einfluss von 500 ng humaner DNA auf die Amplifikation von HAdV-DNA (vergleiche Fig. 2). Beispiel 4: Charakterisierung von in den Proben enthaltenen HAdV-DNA durch molekulares Typisieren .
Eine Multiplex-PCR, die die Fiber-Gen-Region amplifiziert, wurde mit positiven HAdV-DNA-Proben (nach dem im Beispiel 3 geschilderte TaqMan Verfahren) durchgeführt, um eine Identifikation des jeweiligen HAdV-Serotypen zu ermöglichen (vergleiche: Xu, W., M. C. McDonough, and D. D. Erdman. 2000. Spe- cies-specific identification of human adenoviruses by a multiplex PCR assay. J Clin Microbiol. 38(11):4114-20). Zusätzlich wurden Amplikons direkt mit Rho- daminmarkierten Didesoxynukleotid-Kettenterminatoren (DNA Sequencing Kit, ABI, Foster City, CA) auf einem ABI-Prism 310 automatic sequencer sequenziert.
Sowohl die Amplifikation des Hexon-Genes (vergleiche: Allard, A., B. Albins- son, and G. Wadell. 1992. Detection of adenovirus in stools from healthy per- sons and patients with diarrhea by two-step polymerase chain reaction. J Med Virol. 37(2):149-57; Xu, W., M. C. McDonough, and D. D. Erdman. 2000. Spe- cies-specific identification of human adenoviruses by a multiplex PCR assay. J Clin Microbiol. 38(11):4114-20) als auch das Sequenzieren ermöglichen die Identifikation des HAdV-Serotypen, in einigen Fällen unter Verwendung von BLAST- und F AST A-Prog rammen, wenn hinreichende Sequenzdaten in Gendatenbanken zur Verfügung stehen. Da die Hexon-Gen-Regionen vieler HAdV-Serotypen noch nicht sequenziert wurden, ermöglicht deren Sequenzierung zwar nicht die Identifikation dieser HAdV-Serotypen, aber durch multiple Alignments mit Datenbanksequenzen und Clustering-Identifikation wird die Identifizierung leicht auf der Ebene des Genus (Spezies) ermöglicht.
Mit den genannten Verfahren (TaqMan PCR, Charakterisierung/Typisierung) konnten aus klinischen Proben eine Vielzahl von HAdV-Serotypen identifiziert werden, ohne dass eine Virusisolierung notwendig gewesen wäre. Dazu gehörten unter anderem HAdV der Serotypen 1 , 3, 4, 5, 7, 37, 40, 41 und ver- schiedene Viren des Genus HAdV-D einschließlich eines Serotypes, der bisher noch nicht sequenziert worden ist. Beispiel 5: Vergleich des Tag Man PCR Verfahrens mit konventionellen PCR Verfahren
234 Patientenproben wurden unter Verwendung von TaqMan (vergleiche Bei- spiel 3) und konventionellen PCR-Protokollen untersucht. Nach der DNA- Extraktion aus den Proben wurde das DNA enthaltende Eluat für die konventionelle und die TaqMan PCR geteilt. Das konventionelle Adenovirus-PCR- Protokoll wurde mit den generischen Primern hexldeg und hex2deg sowie Amplifikationsbedingungen wie in Allard, A., B. Albinsson, and G. Wadell. 1992. Detection of adenovirus in stools from healthy persons and patients with diarrhea by two-step polymerase chain reaction. J Med Virol. 37(2): 149-57 und Wadell, G., A. Allard, and H. Hierholzer. 1999. Adenovirus, p. 970-981. In P. R. Murray, E. J. Baron, M. A. Pfaller, C. A. Tenover, and R. A. Yolken (ed.), Manual of Clinical Microbiology. ASM Press, Washington, D.C. beschrieben durchgeführt. Das Protokoll wurde leicht durch Verwendung eines fertigen Mastermixes mit „hot start"-DNA-Polymerase (Qiagen HotStarTaq Master Mix) modifiziert.
Zusätzlich wurden alle Proben mit von TaqMan zu konventioneller PCR ver- schiedenen Resultaten mit einem weiteren konventionellen PCR-Verfahren unter Verwendung der generischen Adenovirus-Primer Ad-1 und Ad-2 wie in Xu, W.„ M. C. McDonough, and D. D. Erdman. 2000. Species-specific identification of human adenoviruses by a multiplex PCR assay. J Clin Microbiol. 38(11):4114-20 beschrieben überprüft. Nach der Amplifikation wurde eine Gel- Elektrophorese der PCR-Produkte (10 μl) auf 2 %igen Agarose-Gelen durchgeführt, die mit Ethidium-Bromid gefärbt wurden. Die Visualisierung der Ergebnisse erfolgte durch UV-Illumination.
Die 234 klinischen Proben waren EDTA-Blut (58), Serum und Plasma (60), Rachenabstriche und/oder -Spülungen (21), kombinierte Nasopharyngale Abstriche (5), Augenabstriche (17), cerebrospinale Flüssigkeit (26), Stuhl (22), Bronchoalveoläre Spülungen und Luftröhrenaspirate (12), sowie 13 andere Materialien, z.B. pericardiale, pleurale und peritoneale Flüssigkeiten, Urin und Biopsien von Lymphknoten und Darm (13). Bei 200 Proben stimmten die Ergebnisse von konventioneller PCR und TaqMan PCR überein (38 positive Proben und 162 negative Proben). 34 Proben hatten unterschiedliche Ergebnisse zwischen beiden Versuchsansätzen. In den 33 dieser Proben war die TaqMan PCR positiv mit hohen CP-Werten (CP > 37, was näherungsweise weniger als 150 Kopien HAdV-DNA pro Ansatz bedeutet), während die konventionelle PCR negativ war. Dies zeigt, dass das TaqMan PCR-Verfahren verglichen mit dem beschriebenen konventionellen PCR-Verfahren eine höhere Sensitivität aufweist.
Nur eine einzige Probe (EDTA-Blut) war im konventionellen PCR-Verfahren positiv (dünne Bande auf dem Agarose-Gel) und negativ im TaqMan PCR- Verfahren. Dieses positive Resultat wurde durch Multiplex-PCR bestätigt und der Virus stellte sich als ein Virus des Genus HAdV-D heraus. Damit wies das beschriebene TaqMan PCR-Verfahren in 70 von 71 positiven Proben die HAdV-DNA nach, während dies mit der konventionellen PCR nur in 38 der 71 Proben gelang.
Dabei konnten mit dem TaqMan PCR-Verfahren aus allen Probematerialtypen einzelne Proben als positiv nachgewiesen werden, bei den „anderen Materia- lien" allerdings nur in Proben aus Lymphknotenbiopsie und aus Peritonealflüs- sigkeit Geweils eine positive Probe). Letzteres heißt aber nicht, dass ein Nachweis aus den anderen Probearten nicht grundsätzlich möglich wäre.

Claims

Ansprüche
1. Markierte oder unmarkierte Nukleinsaure zum spezifischen Binden an DNA humaner Adenoviren (HAdV-DNA), wobei die Nukleinsaure a) die Sequenz SEQ ID NO. 1 , SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 3 besitzt, b) eine Sequenz' mit einer Homologie von mehr als 78% zu SEQ ID NO. 1 , SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 3 besitzt oder c) komplementär zu einer Nukleinsaure nach a) oder b) ist.
2. Verfahren zum Nachweis von HAdV-DNA in einer Probe, mit folgenden Schritten:
Bereitstellen einer Probe, die potentiell HAdV-DNA enthält, Bereitstellen einer Sonde, die jeweils spezifisch an die DNA von zumindest 35 unterschiedlichen HAdV-Serotypen binden kann, - Vermischen der Sonde mit der Probe,
Amplifizieren von Bereichen jeder der in der Probe tatsächlich enthaltenen DNA der 35 HAdV-Serotypen, so dass der Abschnitt, an den die genannte Sonde spezifisch binden kann, mit amplifiziert wird, Einstellen von Bedingungen, die eine spezifische Bindung der Sonde an Abschnitte der amplifizierten Bereiche ermöglichen,
Detektieren amplifizierter DNA-Abschnitte, an die eine Sonde gebunden ist.
3. Verfahren zum Nachweis von HAdV-DNA in einer Probe, mit folgenden Schritten:
Bereitstellen einer Probe, die potentiell HAdV-DNA enthält, Bereitstellen zumindest eines Primerpaares, das jeweils spezifisch an die DNA von zumindest 25 unterschiedlichen HAdV-Serotypen binden kann, - Vermischen des zumindest einen Primerpaares mit der Probe,
Einstellen von Bedingungen, die eine spezifische Bindung je eines der Primer an je einen der DNA-Stränge jedes einzelnen der besagten 25 HAdV-Typen ermöglichen, Amplifizieren der durch das zumindest eine Primerpaar begrenzten Bereiche jeder der in der Probe tatsächlich enthaltenen DNA der 25 HAdV-Serotypen, Detektieren amplifizierter DNA-Bereiche.
4. Verfahren zum Nachweis von HAdV-DNA in einer Probe, mit folgenden ' Schritten:
Bereitstellen einer Probe, die potentiell HAdV-DNA enthält, Bereitstellen zumindest eines Primerpaares, das jeweils spezifisch an die DNA von zumindest 15 unterschiedlichen HAdV-Serotypen binden kann,
Bereitstellen einer Sonde, die jeweils spezifisch in den durch das zumindest eine Primerpaar begrenzten Bereichen an die DNA von den gleichen zumindest 15 unterschiedlichen HAdV-Serotypen binden kann,
Vermischen des zumindest einen Primerpaares mit der Probe, Vermischen der Sonde mit der Probe,
Einstellen von Bedingungen, die eine spezifische Bindung je eines der Primer an je einen der DNA-Stränge jedes einzelnen der besagten 15 HAdV-Typen ermöglichen,
Amplifizieren der durch das zumindest eine Primerpaar begrenzten Bereiche jeder der in der. Probe tatsächlich enthaltenen DNA der 15 HAdV-Serotypen, Einstellen von Bedingungen, die eine spezifische Bindung der Sonde an Abschnitte der amplifizierten Bereiche ermöglichen,
Detektieren amplifizierter DNA-Abschnitte, an die eine Sonde gebunden ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2-4, dadurch gekennzeichnet, dass zum Amplifizieren keine degenerierten Primer verwendet werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2-5, dadurch gekennzeichnet, dass zum Amplifizieren weniger als 11 , bevorzugt weniger als 5, wiederum bevorzugt weniger als 3 zu einander verschiedene Primer eingesetzt werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2-6, dadurch gekennzeichnet, dass Nukleinsäuren gemäß Anspruch 1 als Primer zum Amplifizieren eingesetzt werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2-7, dadurch gekennzeichnet, dass als Sonde eine Nukleinsaure gemäß Anspruch 1 eingesetzt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2-8, dadurch gekennzeichnet, dass der amplifizierte Bereich ≤500, bevorzugt <300 wiederum bevorzugt ≤150 Ba- senpaare umfasst.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2-9, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion der amplifizierten DNA-Bereiche unter real time Bedingungen (a) während und/oder (b) nach einem, mehreren oder jedem Amplifikati- onsschritt erfolgt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2-10, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion der amplifizierten DNA-Bereiche quantitativ erfolgt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 2-11 , dadurch gekennzeichnet, dass als Primer Nukleinsäuren, die nach Anspruch 1 homolog zu den Sequenzen SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO. 2 sind und/oder als Sonde eine markierte Nukleinsaure, die nach Anspruch 1 zu der Sequenz SEQ ID NO. 3 homolog oder zu einer solchen homologen komplementär ist, verwendet werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2-12, dadurch gekennzeichnet, dass ein TaqMan PCR-Verfahren zur Amplifikation und Detektion verwendet wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 2-13, dadurch gekennzeichnet, dass im Amplifikationsschritt die Primerbindung (annealing) bei > 48 °C, bevorzugt bei > 50 °C, weiter bevorzugt bei > 53 °C, wiederum bevorzugt bei > 55 °C erfolgt.
15. Kit, umfassend Primerpaar und Sonde, jeweils bestehend aus Nukleinsäuren gemäß Anspruch 1.
16. Verwendung einer oder mehrerer Nukleinsäuren gemäß Anspruch 1 oder eines Kits gemäß Anspruch 15 zum Nachweis von HAdV-DNA.
17. Verfahren zum Charakterisieren von HAdV-Serotypen mit folgenden Schritten:
Nachweis von HAdV-DNA in einer Probe gemäß einem der Ansprüche 2-14
Charakterisieren in der Probe enthaltener nachgewiesener HAdV-DNA
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