DE69734904T2

DE69734904T2 - ABO-Glycosyltransferase-Sequenz-Polymorphismus

Info

Publication number: DE69734904T2
Application number: DE69734904T
Authority: DE
Inventors: Rebecca Lynne Alameda Reynolds; Gabriele Annemarie Alameda Zangenberg
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1996-01-30
Filing date: 1997-01-21
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2017-01-22
Also published as: JPH09224683A; EP0787806A3; EP0787806A2; US5763184A; DE69734904D1; EP0787806B1; JP4047410B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie und der Nucleinsäurechemie. Genauer gesagt betrifft sie Verfahren und Reagentien zum Genotypisieren von Allelen, die Glycolsyltransferase-Enzyme codieren, die die A-, B- und H-Antigen-Blutgruppen bestimmen.
Beschreibung des verwandten Stands der Technik
ABO-Typisierung ist der älteste herkömmliche Serologietest, der von Gerichtsmedizinern durchgeführt wird. Karl Landsteiner entdeckte das ABO-Typisierungssystem im Jahre 1901 und entwickelte Typisierungsverfahren zur Anwendung in Fällen, in denen die Vaterschaft fraglich war. Die Grundlage für den Test ist die Antikörperreaktivität mit A-, B- und H-Antigenen, die auf Erythrocyten und anderen Arten von Zellen (z.B. Epithelzellen) gefunden werden. Gerichtsmediziner verwenden polyclonale Antikörper gegen Typ A- und Typ B-Antigene entweder in einem direkten (Gesamtblut) oder indirekten (getrocknete Flecken) Agglutinationsassay, um A-, B-, O- und AB-Phänotypen zu unterscheiden. Normalerweise wird für das Typ H-Antigen kein Antiserum verwendet; Blut von Individuen des Typs O agglutiniert weder mit Typ A- noch mit Typ B-Antiseren. Ohne ein spezifisches Antiserum für das Typ H-Antigen kann der AA-Phänotyp nicht vom AO-Phänotyp unterschieden werden, und der BB-Phänotyp kann nicht vom BO-Phänotyp unterschieden werden.
Die molekulare Grundlage der A-, B- und H-Antigene ist bekannt. Die Antigene A und B stammen vom H-Oligosaccharid durch die Wirkung von zwei Glycosyltransferasen. Individuen mit Blut des Typs A exprimieren Transferase-A-Aktivität, die N-Acetylgalactosamin auf das H-Antigen überträgt, um so das A-Antigen zu bilden. Individuen mit Blut des Typs B exprimieren Transferase-B-Aktivität, die Galactose auf das H-Antigen überträgt, um so das B-Antigen zu bilden. Individuen mit Blut des Typs O fehlt eine funktionelle Glycosyltransferase und sie exprimieren nur das unveränderte H-Antigen auf Zelloberflächen.
Die genetische Grundlage des ABO-Glycosyltransferase-Polymorphismus ist ebenfalls bekannt. Yamamoto et al., 1990, Nature 345 (17): 229–233 berichten über die Sequenzanalyse von cDNAs, die von Individuen des bekannten Typs ABO isoliert wurden. Die cDNAs, die die A- und B-Transferasen codieren, haben eine Länge von 1062 Basenpaaren und codieren Proteine von 353 Aminosäuren. Die A- und B-Allelsequenzen unterscheiden sich von einander in 7 Nucleotiden und codieren Proteine, die sich an 4 Aminosäuren unterscheiden, was zu den unterschiedlichen Spezifitäten der A- und B-Transferasen führt. An Position 258 der codierenden Sequenz unterscheidet sich das O-Allel von den A- und B-Allelen durch eine einzige Basenpaardeletion, die auf Grund der daraus resultierenden Verschiebung des Leserahmens in der Translation bei den Nucleotiden 349–351 ein Stopcodon erzeugt. Dem verkürzten, 155 Aminosäuren langen Protein, das durch das O-Allel codiert wird, fehlt die funktionelle Domäne der Transferase.
Die Erfindung der Polymerasekettenreaktion (PCR), ein Verfahren zur Amplifizierung spezifischer Nucleinsäuresequenzen, ermöglicht den schnellen Nachweis von Nucleinsäuren, die in einer Probe in einer bisher nicht nachweisbaren geringen Menge vorhanden sind (vgl. U.S.-Patent Nrn. 4,683,195; 4,683,202 und 4,965,188). Die Analyse einer amplifizierten Nucleinsäuresequenz kann auf verschiedene Art und Weise durchgeführt werden. Beispielsweise wurde der Nachweis von ABO-Genotypen unter Verwendung von durch PCR amplifizierten Aminosäuren mittels Restriktionsenzymspaltungsmustern (vgl. Lee und Chang, 1992, J. Forensic Sciences, JFSCA 17 (5): 1269–1275; und O'Keefe und Dobrovic, 1993, Human Mutation 2: 67–70) und mittels Denaturierungsgradienten-Gelelektrophorese durchgeführt (vgl. Johnson und Hopkinson, 1992, Human Mol. Gen. 1 (5): 341–344). Der Nachweis von ABO-Genotypen unter Verwendung von Allel-spezifischer PCR- Amplifikation wurde von Ugozzoli und Wallace, 1992, Genomics 12: 670–674 beschrieben.
US-Patent 5,326,857 offenbart einen Primer zur Amplifizierung von Sequenzen des A²-Untertyps.
Bennett et al. (Biochemical und Biophysical Research Communications Bd. 206, 1, 1995, 318–325) offenbaren die besonderen Intronsequenzen von ABO-Exons.
Church et al. (Nature Genetics, Bd. 6, S. 98–104, 1994) offenbaren die Nucleotidsequenz, die mit einer Sequenz der vorliegenden Erfindung überlappt.
Olsson et al. (Biochemical und Biophysical Research Communications, Bd. 216, 2, 1995, S. 642–647) offenbaren ein Verfahren zur Identifizierung eines Allels des ABO-Locus in einer Probe, die die Nucleinsäure des ABO-Glycosyltransferase-Gens enthält, auf der Grundlage einer Reihe von Guanosinen an den Nucleotidpositionen 798–804 des Gens.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neu entdeckte Nucleotidsequenzpolymorphismen in dem ABO-Glycosyltransferase-Gen. Die bisher bestimmten O-Typ-Allele und B-Typ-Allele werden auf der Grundlage der verschiedenen Nucleinsäuresequenzen unterteilt, die an den neu entdeckten polymorphen Stellen vorhanden sind. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Reagentien zum Nachweis der neu entdeckten Allelsequenzvarianten bereit.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft eine bisher unbekannte Intronsequenz, die stromaufwärts von Nucleotidposition 239 der codierenden Sequenz des ABO-Glycosyltransferase-Gens auftritt. Die 58 Basenpaare lange Sequenz ist zwischen den ABO-Allelen konserviert mit Ausnahme der polymorphen Stellen an Position 29, 32 und 33, die neu entdeckt wurden. Eine einzelne Basenpaaränderung an der polymorphen Stelle an Nucleotidposition 29 wurde in einem herkömmlichen Untertyp des O-Allels gefunden. Eine einzelne Basenpaaränderung an der polymorphen Stelle 33 unterscheidet einen weniger häufigen Untertyp des O-Allels. Eine einzelne Basenpaaränderung an der polymorphen Stelle an Nucleotidposition 32 unterscheidet einen Untertyp des B-Allels.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Oligonucleotide, die eine Nucleotidsequenz umfassen, die mindestens 10 Nucleotide lang ist, wobei die Nucleotidsequenz in der hierin bereitgestellten neu entdeckten Intronsequenz des ABO-Glycosyltransferase-Gens enthalten ist. Diese Oligonucleotide sind als Amplifikationsprimer, Nachweissonden und positive Kontrollsequenzen von Nutzen, die zu Reaktionen zugegeben werden, um eine bekannte Zielsequenz bereitzustellen. Zur Verwendung als positive Kontrollsequenz ist das Oligonucleotid vorzugsweise in einem DNA-Vektor wie einem Plasmid enthalten.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Oligonucleotide, die exakt oder im Wesentlichen komplementär zum jeweiligen Strang einer neu entdeckten Variante des ABO-Glycosyltransferase-Gens in einer Region des Gens sind, die eine neu entdeckte polymorphe Stelle umfasst, und die exakt komplementär an der polymorphen Stelle sind. Diese Oligonucleotide sind als sequenzspezifische Amplifikationsprimer, sequenzspezifische Nachweissonden und positive Kontrollsequenzen von Nutzen, die zu Reaktionen zugegeben werden, um eine bekannte Zielsequenz bereitzustellen. Wenn es als Nachweissonde verwendet wird, ermöglicht das Oligonucleotid den Nachweis einer Sequenz einer Allelvariante durch Nucleinsäurehybridisierung. Wenn es als Amplifikationsprimer verwendet wird, ermöglicht das Oligonulceotid die sequenzspezifische Amplifikation der Nulceinsäure von einer Allelvariante. Zur Verwendung bei der sequenzspezifischen Amplifikation oder dem sequenzspezifischen Nachweis besitzt das Oligonucleotid bevorzugt eine Länge von etwa 15 bis etwa 35 Nucleotiden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis von allelischen Sequenzvarianten des ABO-Glycosyltransferase-Gens in einer Probe, die Nucleinsäure enthält, die von einem Individuum erhalten wurde, wobei die Verfahren den Nachweis des Basenpaars umfassen, das an einer oder mehreren neu entdeckten polymorphen Stellen vorhanden ist. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Basenpaar, das an einer polymorphen Stelle vorhanden ist, durch Hybridisieren der Probennucleinsäure mit einem Oligonucleotid identifiziert, das exakt oder im Wesentlichen komplementär zum jeweiligen Strang einer neu entdeckten Variante des ABO-Glycosyltransferase-Gens in einer Region des Gens ist, die die polymorphe Stelle umfasst, und an der poylmorphen Stelle exakt komplementär zur Sequenzvariante ist. Die Hybridisierung wird unter ausreichend stringenten Bedingungen durchgeführt, so dass das Oligonucleotid an die Nucleinsäure bindet, um nur dann stabile Hybridduplexe zu bilden, wenn die Probennucleinsäure die Zielallelsequenzvariante enthält. Das Vorhandensein der Allelsequenzvariante in der Probe wird durch den Nachweis des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von stabilen Hybridduplexen bestimmt, die zwischen dem Oligonucleotid und der Probennucleinsäure gebildet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Nachweis von allelischen Sequenzvarianten durchgeführt, um den Genotyp eines Individuums an dem ABO-Glycosyltransferase-Locus zu bestimmen.
Das Vorhandensein von stabilen Hybridduplexen kann mittels jeglicher im Stand der Technik bekannter Verfahren durchgeführt werden. Verschiedene Nachweisassayformate sind wohl bekannt und sie verwenden nachweisbare Marker, die entweder an die Zielnucleinsäure oder die Oligonucleotidsonde gebunden sind, um den Nachweis von Hybridduplexen zu ermöglichen. Typischerweise werden die Hybridisierungsduplexe von nicht hybridisierter Nucleinsäure getrennt und die an die Duplexe gebundenen Marker werden dann nachgewiesen. Alternativ kann eine Amplifikationsreaktion unter Verwendung des Oligonucleotids als einen der Primer unter Bedingungen durchgeführt werden, so dass die Amplifikation nur dann auftritt, wenn eine stabile Hybridisierungsduplex vorhanden ist. Das Vorhandensein von amplifizierter DNA dient als Indikator für das Vorhandensein von stabilen Hybridduplexen und folglich das Vorhandensein der Zielsequenz in der Probe.
Wenn ausreichend Nucleinsäure in der Probe vorhanden ist, kann der Nachweis durch Oligonucleotidsondenhybridisierung ohne vorherige Amplifikation der Zielsequenz durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die Probe jedoch amplifizierte Nucleinsäuren, wobei eine Region des ABO-Glycosyltransferase-Gens, das die Sondenhybridisierungsregion umfasst, amplifiziert wird. Jegliches der bekannten Verfahren zur Erhöhung der Kopienzahl einer Region einer Nucleinsäure in vitro kann zum Amplifizieren der Nucleinsäure verwendet werden. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist das bevorzugt Amplifikationsverfahren. Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Amplifizieren einer Region des ABO-Glycosyltransferase-Gens, wobei das Verfahren das Durchführen einer Amplifikationsreaktion unter Verwendung eines Oligonucleotidprimers umfasst, der an die hier bereitgestellte neu entdeckte Intronsequenz hybridisiert.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Kits, die für das Bestimmen des ABO-Genotyps eines Individuums von Nutzen sind. Diese Kits haben viele verschiedene Formen und umfassen eine oder mehrere Sonden, und in einer Ausführungsform umfassen sie eine Reihe von Sonden, die ausreichen, um den ABO-Genotyp zu bestimmen. Die Kits können ebenfalls ein oder mehrere Amplifikationsreagentien, z.B. Primer, Polymerase, Puffer und Nucleosidtriphosphate, umfassen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft gerichtsmedizinische Verfahren zur Bestimmung des wahrscheinlichen Ursprungs einer biologischen Probe. Die Entdeckung zusätzlicher Allele verbessert die Unterscheidungsfähigkeit der ABO-DNA-Typisierungsmethode wesentlich und wird wichtige Auswirkungen auf die gerichtsmedizinischen Methoden haben.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Zum besseren Verständnis der Erfindung sind nachstehend mehrere Begriffe erklärt.
Die Begriffe „ABO-Glycosyltransferase-Gen", „ABO-Glycosyltransferase-Locus", „ABO-Gen" und „ABO-Locus" beziehen sich auf die genomische Nucleinsäuresequenz, die die translatierten Sequenzen, die das ABO-Glycosyltransferase-Protein codieren, und die untranslatierten intervenierenden Sequenzen einschließt. Die Nucleotidsequenz des Gens, wie hierin verwendet, umfasst sowohl codierende Regionen, die als Exons bezeichnet werden, als auch intervenierende, nicht-codierende Regionen, die als Introns bezeichnet werden.
Der Begriff „Allele" bezieht sich auf Varianten der Nucleotidsequenz eines Gens.
Ein ABO-Glycosyltransferase-Gen-„A"-Allel bezieht sich auf Sequenzvarianten, die ein Protein codieren, das N-Acetylgalactosaminosyltransferase-Aktivität besitzt. Ein „B"-Allel bezieht sich auf Sequenzvarianten, die ein Protein codieren, das Galactosyltransferase-Aktivität besitzt. Ein „O"-Allel bezieht sich auf Sequenzvarianten des ABO-Gens, die ein Protein codieren, dem Glycosyltransferase-Aktivität fehlt. Ein „O"-Allel enthält eine einzelne Basenpaardeletion an Position 258 in Bezug auf die A- und B-Allele, was auf Grund der daraus resultierenden Verschiebung des Leserahmens der Translation ein Stop-Codon an den Nucleotiden 349–351 erzeugt. Dem verkürzten 155 Aminosäuren langen Protein, das von dem O-Allel codiert wird, fehlt die funktionelle Domäne der Transferase.
Der Ausdruck „Genotyp" bezieht sich auf die Beschreibung der Allele eines Gens, das in einem Individuum oder einer Probe enthalten ist.
Der Ausdruck „polymorph" und „Polymorphismus", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Bedingung, unter der zwei oder mehr Varianten einer spezifischen genomischen Sequenz in einer Population gefunden werden können. Die polymorphe Region oder polymorphen Stellen beziehen sich auf die Region der Nucleinsäure, in der ein Polymorphismus auftritt.
Die Ausdrücke „Nucleinsäure" und „Oligonucleotid" beziehen sich auf Primer, Sonden und nachzuweisende Oligomerfragmente und sollen sich allgemein auf Polydesoxyribonucleotide (enthaltend 2-Desoxy-D-ribose), auf Polyribonucleotide (enthaltend D-Ribose) und auf jegliche andere Art von Polynucleotid, das ein N-Glycosid einer Purin- oder Pyrimidinbase oder einer modifizierten Purin- oder Pyrimidinbase ist, beziehen. Es gibt keine beabsichtigte Unterscheidung hinsichtlich der Länge zwischen den Ausdrücken „Nucleinsäure" und „Oligonucleotid", und diese Ausdrücke werden austauschbar verwendet. Diese Ausdrücke beziehen sich nur auf die Primärstruktur des Moleküls. Daher schliefen diese Ausdrücke doppel- und einzelsträngige DNA sowie doppel- und einzelsträngige RNA ein.
Oligonucleotide können mit jedem geeigneten Verfahren hergestellt werden, einschließlich zum Beispiel Clonierung und Restriktion von geeigneten Sequenzen und direkte chemische Synthese mit einem Verfahren wie dem Phosphotriester-Verfahren nach Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68: 90–99; dem Phosphodiester-Verfahren von Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68: 109–151; dem Diethylphosphoramidit-Verfahren von Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859–1862; und dem Verfahren mit festem Träger aus dem US-Patent Nr. 4,458,066. Ein Überblick über Syntheseverfahren wird von Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1 (3): 165–187 bereitgestellt. Verfahren zum Einbau eines Oligonucleotids in einen DNA-Vektor wie zum Beispiel zur Verwendung als positive Kontrollzielsequenz sind im Stand der Technik wohl bekannt und in den hierin zitierten Referenzen beschrieben.
Der Ausdruck „Hybridisierung" bezieht sich auf die Bildung einer Duplexstruktur durch zwei einzelsträngige Nucleinsäuren auf Grund der komplementären Basenpaarung. Die Hybridisierung kann zwischen exakt komplementären Nucleinsäuresträngen oder zwischen Nucleinsäuresträngen auftreten, die kleinere Regionen von Fehlpaarungen enthalten. Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck „im Wesentlichen komplementär" auf Sequenzen, die mit Ausnahme von kleinen Regionen von Fehlpaarungen komplementär sind, wobei die Gesamtzahl von fehlgepaarten Nucleotiden nicht mehr als etwa 3 ist. Bedingungen, unter denen nur exakt komplementäre Nucleinsäurestränge hybridisieren werden, werden als „stringente" oder „sequenzspezifische" Hybridisierungsbedingungen bezeichnet. Stabile Duplexe mit im Wesentlichen komplementären Nucleinsäuren können unter weniger stringenten Hybridisierungsbedingungen erzielt werden. Die Fachleute auf dem Gebiet der Nucleinsäuretechnologie können die Duplexstabilität empirisch unter Berücksichtigung einer Reihe von Variablen einschließlich zum Beispiel der Länge und der Basenpaarkonzentration der Oligonucleotide, Ionenstärke und Auftreten von fehlgepaarten Basenpaaren bestimmen. Eine Computersoftware zum Errechnen der Duplexstabilität ist im Handel von National Biosciences, Inc. (Plymouth, MN); OLIGO Version 5 erhältlich.
Stringente, sequenzspezifische Hybridisierungsbedinqungen, unter denen ein Olignucleotid nur mit der exakt komplementären Zielsequenz hybridisieren wird, sind im Stand der Technik wohl bekannt (vgl. z.B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und werden unter verschiedenen Umständen unterschiedlich sein. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so gewählt, dass sie etwa 5°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert sind. Der Tm ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert), bei dem 50% der Basenpaare dissoziiert sind. Eine Lockerung der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen wird es ermöglichen, dass Sequenzfehlpaarungen toleriert werden; der Grad einer tolerierten Fehlpaarung kann durch eine geeignete Anpassung der Hybridisierungsbedingungen kontrolliert werden.
Der Ausdruck „Sonde" bezieht sich auf ein Oligonucleotid, das unter geeigneten Bedingungen selektiv an eine Zielnucleinsäure binden kann. Die Sonde wird eine „Hybridisierungsregion", die exakt oder im Wesentlichen komplementär zur Zielsequenz ist, enthalten und wird an einer polymorphen Stelle exakt komplementär zur Zielsequenz sein. Ein Hybridisierungsassay, der unter Verwendung der Sonde unter ausreichend stringenten Hybridisierungsbedingungen durchgeführt wird, ermöglicht den selektiven Nachweis von spezifischen Zielsequenzen. Zur Verwendung in einem Hybridisierungsassay für die Unterscheidung von einzelnen Nucleotidunterschieden in der Sequenz hat die Sondenhybridisierungsregion bevorzugt eine Länge von etwa 15 bis etwa 35 Nucleotiden. Ein Fachmann wird erkennen, dass im Allgemeinen das exakte Komplement einer beliebigen Sonde als Sonde ebenso nutzvoll ist. Ein Sondenoligonucleotid kann entweder komplett aus der Hybridisierungsregion bestehen oder kann zusätzliche Merkmale enthalten, die den Nachweis oder die Immobilisierung der Sonde ermöglichen, die jedoch die Hybridisierungscharakteristika der Hybridisierungsregion nicht wesentlich ändern. Beispielsweise kann die Sondenhybridisierungsregion an einen poly-T-„Schwanz" gebunden sein, der zur Immobilisierung der Sonde an einen festen Träger zur Verwendung in einem Umkehr-Dot-Blot-Assay verwendet wird.
Der Ausdruck „Primer" bezieht sich auf ein Oligonucleotid, das als Anfangspunkt einer DNA-Synthese unter Bedingungen dienen kann, unter denen die Synthese eines Primerverlängerungsprodukts, das zu einem Nucleinsäurestrang komplementär ist, induziert wird, d.h. in Anwesenheit von vier verschiedenen Nucleosidtriphosphaten und einem Mittel zur Polymerisation (d.h. DNA-Polymerase oder reverse Transkriptase) in einem geeigneten Puffer und bei einer geeigneten Temperatur. Ein Primer ist bevorzugt ein einzelsträngiges Oligodesoxyribonucleotid. Der Primer wird eine „Hybridisierungsregion" enthalten, die exakt oder im Wesentlichen komplementär zur Zielsequenz ist, und wird an einer polymorphen Stelle exakt komplementär zur Zielsequenz sein. Eine Amplifikation, die unter Verwendung des Primers durchgeführt wird, wobei die Primerverlängerung unter ausreichend stringenten Hybridisierungsbedingungen durchgeführt wird, erlaubt die selektive Amplifikation einer spezifischen Zielsequenz. Zur Verwendung in sequenzspezifischen Amplifikationen zur Unterscheidung von einzelnen Nucleotidänderungen in einer Sequenz hat die Primerhybridisierungsregion bevorzugt eine Länge von etwa 15 bis etwa 35 Nucleotiden. Da die Primerverlängerung am 3'-Ende des Olignucleotids auftritt, befindet sich die polymorphe Stelle bevorzugt am 3'-Ende des Primers, um die Sequenzunterscheidung leichter zu gestalten. Ein Primeroligonucleotid kann entweder ganz aus der Hybridisierungsregion bestehen oder zusätzliche Merkmale enthalten, die den Nachweis, die Immobilisierung oder die Manipulation des amplifizierten Produkts ermöglichen, die jedoch die grundlegende Eigenschaft des Primers, also die Funktion als Startpunkt der DNA-Synthese, nicht ändern. Zum Beispiel kann zur Erleichterung der Clonierung des amplifizierten Produkts eine kurze Nucleotidsequenz, die eine Restriktionsenzym-Schnittstelle enthält, an das 5'-Ende des Primers gebunden sein.
Der Ausdruck „Zielregion" bezieht sich auf eine zu analysierende Nucleinsäure und schließt gewöhnlich eine polymorphe Region ein.
Herkömmliche Techniken der Molekularbiologie und Nucleinsäurechemie, die dem Fachmann wohl bekannt sind, sind in der Literatur vollständig beschrieben. Vgl. zum Beispiel Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning – A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, Hrsg., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames und S. J. Higgins, Hrsg., 1984); und eine Reihe Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.).
Nucleotidsequenz des ABO-Glycotransferase-Gens
Die Nucleotidsequenz einer Region des ABO-Glycosyltransferase-Gens wird als SEQ ID NO: 1 bereitgestellt und ist in einer 5'- zu 3'-Orientierung in Tabelle 1, nachstehend, gezeigt. Die Basenbezeichnungen, die in SEQ ID NO: 1 verwendet wurden, lauten wie folgt: A = Adenin; C = Cytosin; G = Guanin; T = Thymin; R = Adenin oder Guanin; Y = Cytosin oder Thymin. Die Region, die aus den Positionen 1–58 der SEQ ID NO: 1 besteht, die kursiv geschrieben ist, ist eine Intronregion. Die Positionen 59–161 von SEQ ID NO: 1 entsprechen den Nucleotiden 239–341 der gesamten codierenden Sequenz des O-Allels und die Nucleotide 239–257 und 259–342 der gesamten codierenden Sequenz der A- und B-Allele. Die polymorphen Stellen innerhalb des O-Allels („R" an Positionen 29, 32 und 113; „Y" an Position 33) sind unterstrichen. Drei polymorphe Stellen an Positionen 29, 32 und 33 von SEQ ID NO: 1 wurden neu entdeckt.
Obwohl nur ein Strang der Nucleinsäure des O-Allels in Tabelle 1 gezeigt ist, werden die Fachleute erkennen, dass SEQ ID NO: 1 eine Region einer doppelsträngigen genomischen Nucleinsäure identifiziert und dass die Sequenzen beider Stränge durch die bereitgestellte Sequenzinformation vollständig spezifiziert sind. Zur erleichterten Darstellung werden komplementäre Basenpaare doppelsträngiger genomischer DNA durch einen Bindestrich getrennt gezeigt. Das erste Nucleotid eines komplementären Paars bezieht sich auf das in dem Einzelstrang vorhandene Nucleotid, das in Tabelle 1 gezeigt ist.
Tabelle 1 Teil-Nucleotidteilsequenz des ABO-Glycosyltransferase-Gens (SEQ ID NO: 1)
Wie oben festgestellt, enthält das O-Allel eine einzelne Basenpaardeletion in Bezug auf die codierende Sequenz der A- und B-Allele an Nucleotidposition 258 der codierenden Sequenz. Die A- und B-Allele enthalten ein zusätzliches G:C-Basenpaar zwischen Positionen 77 und 78 von SEQ ID NO: 1, was Nucleotid 258 der codierenden Sequenz der A- und B-Allele entspricht. Folglich entsprechen Basen 78–161 von SEQ ID NO: 1 den Nucleotidpositionen 258–341 der codierenden Sequenz der O-Allele und den Nucleotidpositionen 259–342 der codierenden Sequenz der A- und B-Allele.
Sieben Nucleotidsequenzvarianten (Allele) des ABO-Glycosyltransferase-Gens wurden beobachtet, die durch bestimmte an den polymorphen Stellen innerhalb von SEQ ID NO: 1 vorhandene Basenpaare unterschieden werden. Diese sieben Allele werden hierin als O₁, O₂, O₃, O₄, A, B₁ und B₂ bezeichnet. Die hierin verwendeten Allelbezeichnungen sind in der nachstehenden Tabelle 2 in Bezug auf die bestimmten an den polymorphen Stellen an Positionen 29, 32, 33 und 113 vorhandenen Basenpaare und das Vorhandensein oder Abwesenheit eines zusätzlichen G:C-Basenpaars zwischen Positionen 77 und 78 von SEQ ID NO: 1 (bezeichnet als „G:C?" in Tabelle 2) definiert. Die Positionen der polymorphen Stellen sind in Bezug auf SEQ ID NO: 1 nummeriert.
Tabelle 2 ABO-Glycosyltransferase-Allele
Der A:T/G:C-Polymorphismus, der in der Intronsequenz an Position 29 von SEQ ID NO: 1 vorhanden ist, unterteilt die O-Allele in zwei Gruppen: die O₁- und O₄-Allele, die beide ein A:T-Basenpaar an Position 29 enthalten, und die O₂- und O₃-Allele, die beide ein G:C-Basenpaar an Position 29 enthalten. Somit stellen Regionen von SEQ ID NO: 1, die Position 29 umfassen, neue Nucleinsäurezielsequenzen, die zur Unterscheidung zwischen den O-Allelen verwendet werden können, bereit. Die entsprechende Position in den Intronsequenzen der A- und B-Allele ist nicht polymorph und enthält ein G:C-Basenpaar.
Der in der Intronsequenz an Position 32 von SEQ ID NO: 1 vorhandene A:T/G:C-Polymorphismus unterteilt die B-Allele in B₁ (A:T)- und B₂ (G:C)-Allele. Somit stellen die Regionen von SEQ ID NO: 1, die Position 32 umfassen, neue Nucleinsäurezielsequenzen bereit, die zur Unterscheidung zwischen den B-Allelen verwendet werden können. Die entsprechende Position in den Intronsequenzen der A- und O-Allele ist nicht polymorph und enthält ein A:T-Basenpaar.
Der in der Intronsequenz an Position 33 von SEQ ID NO: 1 vorhandene C:G/T:A-Polymorphismus unterteilt die O-Allele in zwei Gruppen: die O₁-, O₂- und O₃-Allele, die alle an Position 33 ein C:G-Basenpaar enthalten, und das O₄-Allel, das ein T:A-Basenpaar an Position 33 enthält. Somit stellen Regionen von SEQ ID NO: 1, die Position 33 umfassen, neue Nucleinsäurezielsequenzen bereit, die zur Identifizierung der O₄-Allele verwendet werden können. Die entsprechende Position in den Intronsequenzen der A- und B-Allele ist nicht polymorph und enthält ein C:G-Basenpaar.
Die Intronsequenzen an Positionen 1–27 und 34–58 von SEQ ID NO: 1 sind unter den ABO-Allelen konserviert. Diese Regionen stellten neue Nucleinsäurezielsequenzen zum Nachweis oder zur Amplifikation des ABO-Glycosyltransferase-Gens ungeachtet des Alleltyps bereit.
Der G:C/A:T-Polymorphismus, der in der codierenden Sequenz an Position 113 von SEQ ID NO: 1 vorhanden ist, unterscheidet das O₂-Allel von den O₁-, O₃- und O₄-Allelen und unterscheidet ebenso die A- von den B-Allelen. O₁-, O₃- und O₄-Allele enthalten ein G:C-Basenpaar an Position 113 und B-Allele enthalten ein G:C-Basenpaar an der entsprechenden Position. O₂-Allele enthalten ein A:T-Basenpaar an Position 113, und A-Allele enthalten ein A:T-Basenpaar an der entsprechenden Position. Somit können Regionen, die Position 113 umfassen, zur Unterscheidung von A- und O₂-Allelen, die beide ein A:T-Basenpaar enthalten, von B-, O₁, O₃- und O₄-Allelen, die alle ein G:C-Basenpaar enthalten, verwendet werden.
Bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung werden allelische Sequenzvarianten durch Nachweisen der Basenpaare identifiziert, die an einer oder mehreren der vorstehend beschriebenen polymorphen Stellen vorhanden sind. Die vorhandenen Basenpaare können durch Sequenzieren einer Region des Gens, das eine oder mehrere polymorphe Stellen umfasst, oder durch jegliche Mittel bestimmt werden, die unter Sequenzvariationen unterscheiden. Zum Beispiel können Veränderungen in der Mobilität, die durch Gelelektrophorese gemessen werden, zur Unterscheidung von allelischen Sequenzen verwendet werden. Die bevorzugten Hybridisierungsnachweisverfahren basieren auf dem Unterschied in der Stabilität von Hybridisierungsduplexen, die zwischen der Allelnucleinsäure und den Primer- oder Sondenoligonucleotiden gebildet werden, die sich im Komplementaritätsgrad unterscheiden. Unter genügend stringenten Hybridisierungsbedingungen werden nur Duplexe, die zwischen dem Sonden- oder dem Primeroligonucleotid und den Zielsequenzen gebildet werden, stabil sein. Das Vorhandensein stabiler Hybridisierungsduplexe kann mit einem beliebigen aus einer Anzahl von wohl bekannten Verfahren, wie der Verwendung von markierten Sonden oder der Fähigkeit, die für die Amplifikationsreaktion notwendige Primerverlängerung durchzuführen, nachgewiesen werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Nucleotid, das an einer bestimmten polymorphen Stelle vorhanden ist, durch Hybridisierung unter sequenzspezifischen Hybridisierungsbedingungen mit einem Oligonucleotid, das exakt komplementär zu einer Zielregion von SEQ ID NO: 1 ist, oder dem Komplement von SEQ ID NO: 1 identifiziert, das die polymorphe Stelle umfasst. Unter sequenzspezifischen Hybridisierungsbedingungen wird ein Oligonucleotid, das exakt komplementär zu einer Allelvariante in einer Region ist, die eine polymorphe Stelle umfasst, nur an die Allelvariante hybridisieren. Daher sind Oligonucleotide, die bevorzugt eine Länge von etwa 15 bis etwa 35 Nucleotiden haben, die exakt komplementär zu einer Allelsequenz in einer Region sind, die eine polymorphe Stelle umfassen, im Rahmen der Erfindung.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das an einer bestimmten polymorphen Stelle vorhandene Nucleotid durch Hybridisierung unter ausreichend stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einem Oligonucleotid, das im Wesentlichen komplementär zu einer Zielsequenz von SEQ ID NO: 1 ist, d.h. das nicht mehr als etwa 3 Fehlpaarungen enthält, oder dem Komplement von SEQ ID NO: 1 identifiziert, das die polymorphe Stelle umfasst, und das exakt komplementär zur Zielsequenz an irgendwelchen polymorphen Stellen ist. Da Fehlpaarungen, die an nicht-polymorphen Stellen auftreten, Fehlpaarungen mit allen Allelsequenzen sind, ist der Unterschied in der Anzahl von Fehlpaarungen in einer Duplex, die mit der Zielsequenz gebildet wurde, und Fehlpaarungen in einer Duplex, die mit der entsprechenden Nicht-Zielallelsequenz gebildet wurde, der gleiche, als wenn ein Olignucleotid, das genau komplementär zur Zielsequenz ist, verwendet wird. In dieser Ausführungsform werden die Hybridisierungsbedingungen ausreichend gelockert, um die Bildung von stabilen Duplexen mit der Zielsequenz zu erlauben, während eine ausreichende Stringenz beibehalten wird, um die Bildung stabiler Duplexe mit Nicht-Zielsequenzen auszuschließen. Unter derartig ausreichend stringenten Hybridisierungsbedingungen wird ein Oligonucleotid, das im Wesentlichen komplementär zu einer Allelvariante in einer Region ist, die eine polymorphe Stelle umfasst, die exakt komplementär zur Zielsequenz an irgendwelchen polymorphen Stellen ist, nur mit der Allelvariante hybridisieren. Daher sind Oligonucleotide, die bevorzugt eine Länge von etwa 15 bis etwa 35 Nucleotiden haben, die im Wesentlichen komplementär zu einer Allelsequenz in einer Region sind, die eine polymorphe Stelle umfasst, und die exakt komplementär zur Allelsequenz an irgendwelchen polymorphen Stellen sind, im Rahmen der Erfindung.
Die Verwendung von eher im Wesentlichen als exakt komplementären Oligonucleotiden kann in Assayformaten wünschenswert sein, bei denen die Optimierung der Hybridisierungsbedingungen eingeschränkt ist. Zum Beispiel werden in einem typischen immobilisierten Sondenassayformat, wie nachstehend beschrieben, vielfache Sonden auf einem einzigen festen Träger immobilisiert. Die Hybridisierungen werden gleichzeitig durch Inkontaktbringen des festen Trägers mit einer Lösung durchgeführt, die die Ziel-DNA enthält. Weil die einzelnen Hybridisierungen unter identischen Bedingungen durchgeführt werden, können die Hybridisierungsbedingungen nicht getrennt von einander für jede Sonde optimiert werden. Daher werden Sondensequenzen so ausgewählt, dass die Sonden-/Zielduplexstabilität unter den gleichen Hybridisierungsbedingungen ähnlich ist. Da Fehlpaarungen die Stabilität der Sonden-/Zielhybridisierungsduplex verringern und dadurch die Hybridisierungsbedingungen ändern, die zur Bereitstellung ausreichender Stringenz für den Assay notwendig sind, kann der Einbau von Fehlpaarungen in den Aufbau einer Sonde zur Anpassung der Duplexstabilität verwendet werden, wenn das Assayformat das Anpassen der Hybridisierungsbedingungen ausschließt. Die Wirkung einer bestimmten eingebauten Fehlpaarung auf die Duplexstabilität ist wohl bekannt und die Duplexstabilität kann routinemäßig sowohl geschätzt als auch empirisch, wie vorstehend beschrieben, bestimmt werden.
Bevorzugte Oligonucleotidsonden
Der nachzuweisende Polymorphismus besteht aus einzelnen Basenpaarunterschieden. Einzelne Basenunterschiede in der Sequenz können durch differentielle Hybridisierung von Oligonucleotidsonden nachgewiesen werden. Die Sondenhybridisierungssequenz und die sequenzspezifischen Hybridisierungsbedingungen werden so ausgewählt, dass eine einzelne Fehlpaarung an der polymorphen Stelle die Hybridisierungsduplex ausreichend destabilisiert, so dass es letztendlich nicht gebildet wird. Somit wird in den Verfahren der vorliegenden Erfindung das an einer bestimmten polymorphen Stelle vorhandene Nucleotid durch Hybridisierung unter ausreichend stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Oligonucleotidsonde, die eine Hybridisierungsregion enthält, die im Wesentlichen komplementär zu einer Zielregion von SEQ ID NO: 1 ist, oder dem Komplement von SEQ ID NO: 1, wobei die Zielregion die polymorphe Stelle umfasst, und exakt komplementär an der polymorphen Stelle ist, identifiziert. Die Hybridisierungsbedingungen hängen von der exakten Größe und Sequenz der Sonde ab und können empirisch unter Verwendung der hierin und im Stand der Technik bereitgestellten Anweisungen ausgewählt werden. Die Verwendung von Oligonucleotidsonden zum Nachweis von einzelnen Basenpaarunterschieden in einer Sequenz ist in Conner et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 278–282 beschrieben.
Aufgrund der Nähe der polymorphen Stellen an Positionen 29, 32 und 33 können Sonden, die die Positionen 29 bis 33 umfassen, zum Nachweis des Musters von Basenpaaren verwendet werden, die an Positionen 29, 32 und 33 vorhanden sind. Wie in Tabelle 2 gesehen, enthalten alle sieben Allele eine der vier unterschiedlichen Sequenzvarianten in der Region von Position 29 bis Position 33. Somit sind unter Verwendung einer Sonde zum Nachweis jeder möglichen Kombination von Basenpaaren vier Sonden zum positiven Nachweis jeder Allelsequenz innerhalb der Region, die die Positionen 29 bis 33 umfasst, ausreichend. Ein beispielhafter Satz von vier Sonden, die zur Bestimmung des an Positionen 29, 32 und 33 in jedem Allel vorhandenen Basenpaares ausreichend sind, ist in den Beispielen bereitgestellt.
Die proportionale Veränderung in der Stabilität zwischen einem perfekt gepaarten Hybridisierungsduplex und einer Hybridisierungsduplex mit einer einzelnen Fehlpaarung hängt von der Länge der hybridisierten Oligonucleotide ab. Duplexe, die mit kürzeren Sondensequenzen gebildet wurden, sind durch das Vorhandensein einer Fehlpaarung proportional mehr destabilisiert. In der Praxis sind Oligonucleotide mit einer Länge von zwischen etwa 15 und etwa 35 Nucleotiden zum sequenzspezifischen Nachweis bevorzugt. Weiterhin destabilisiert eine Fehlpaarung an irgendeinem Ende die Hybridisierungsduplex weniger als eine Fehlpaarung, die in der Mitte auftritt, da die Enden eines hybridisierten Oligonucleotids aufgrund thermischer Energie eine ständige zufällige Abspaltung und Wiederanbindung durchlaufen. Bevorzugt wird die Sondensequenz zur Unterscheidung einer einzelnen Basenpaarveränderung in der Zielsequenz ausgewählt, die an die Zielsequenz hybridisiert, so dass die polymorphe Stelle in der inneren Region der Sonde auftritt.
Die vorstehenden Kriterien zur Auswahl einer Sondensequenz, die an SEQ ID NO: 1 hybridisiert, gelten für die Hybridisierungsregion einer Sonde, d.h. den Teil der Sonde, der an der Hybridisierung mit der Zielsequenz beteiligt ist. Eine Sonde kann an eine zusätzliche Nucleinsäuresequenz gebunden sein, wie einen poly-T-Schwanz, der zur Immobilisierung der Sonde verwendet wird, ohne die Hybridisierungseigenschaften der Sonde deutlich zu verändern. Ein Fachmann wird erkennen, dass zur Verwendung in den vorliegenden Verfahren eine Sonde, die an eine zusätzliche Nucleinsäuresequenz gebunden ist, die zur Zielsequenz nicht komplementär und somit nicht an der Hybridisierung beteiligt ist, im Wesentlichen gleich wie die ungebundene Sonde ist.
Bevorzugte Oligonucleotidamplifikationsprimer
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren zur Bestimmung des ABO-Genotyps die Amplifikation einer Nucleinsäuresequenz des ABO-Gens, die polymorphe Stellen enthält, die Identifizierung des Nucleotids, das an jeder polymorphen Stelle vorhanden ist, unter Verwendung von Oligonucleotisonden unter sequenzspezifischen Hybridisierungsbedingunen, und die Folgerung des ABO-Genotyps aus dem Bindungsmuster der Sonden an die amplifizierten Zielsequenzen. In dieser Ausführungsform wird die Amplifikation zur Bereitstellung ausreichender Nucleinsäure zur Analyse durch Sondenhybridisierung durchgeführt. Somit sind die Primer so ausgelegt, dass eine Region des ABO-Gens, das die polymorphe Stelle(n) umfasst, ungeachtet des in der Probe vorhandenen Allels amplifiziert wird. Eine allelunabhängige Amplifikation wird unter Verwendung von Primern erreicht, die an konservierte Regionen des ABO-Gens hybridisieren.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine sequenzspezifische Amplifikation unter Verwendung eines Primers durchgeführt, der an eine Region des ABO-Gens hybridisiert, das eine polymorphe Stelle umfasst. Die Amplifikationsbedingungen werden so ausgewählt, dass eine Amplifikation nur dann auftritt, wenn die Sequenz des Zielallels in der Probe vorhanden ist. Auf diese Weise wird das vorhandene Nucleotid durch das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Amplifikationsprodukts identifiziert; keine zusätzliche Sequenzanalyse des amplifizierten Produkts ist notwendig. Der Nachweis des amplifizierten Produkts kann durch jegliche im Stand der Technik wohl bekannte Verfahren wie die Analyse durch Gelelektrophorese durchgeführt werden.
Die Hybridisierungsspezifität der Primer ist eine entscheidende Eigenschaft der Primer, was eine sequenzspezifische Amplifikation ermöglicht. Im Allgemeinen ist das 3'-Ende, das die Primerverlängerungsstelle ist, für die Spezifität des Primers entscheidender, da eine Fehlpaarung am 3'-Ende das 3'-Ende destabilisieren kann und die Primerverlängerung beeinflussen kann, sogar wenn das 5'-Ende des Primers an die Zielsequenz hybridisiert ist. Daher ist es für die Unterscheidung von einzelnen Nucleotidveränderungen in der Sequenz bevorzugt, dass die Primersequenz an die Zielsequenz hybridisiert, so dass die polymorphe Stelle am oder in der Nähe des 3'-Endes des Primers hybridisiert. Allelspezifische Amplifikation und Wirkungen von Primer-Fehlpaarungen sind in Ugozzoli et al., 1991, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 42–48; Kwok et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 999–1005; und Kwok et al., 1994, PCR Methods and Applications 3: S: 39–47 beschrieben.
Eine zusätzliche Sequenz, die eine Restriktionsenzymschnittstelle (Restriktionsschnittstellen) enthält, kann am 5'-Ende eines Primers hinzugefügt werden, ohne die Fähigkeit des Primers zur Verlängerung zu beeinflussen. Die Restriktionsschnittstelle, die in das amplifizierte Produkt eingebaut ist, erleichtert das Clonieren des amplifizierten Produkts zur Verwendung zum Beispiel bei der Sequenzierung (vgl. US-Patent Nr. 4,683,195). Typischerweise können Sequenzen, die zwischen etwa 2 und etwa 10 Basen lang sind und die nicht komplementär zur Zielsequenz sind, an das 5'-Ende der Primerhybridisierungsregion angefügt werden, ohne die Fähigkeit der Primer zur Katalysierung der spezifischen Amplifikation von ABO-Allelen deutlich zu verändern. Die genaue Länge und Sequenz der angefügten terminalen 5'-Sequenzen wird durch die gewünschte Restriktionsschnittstelle bestimmt. Ein Fachmann wird erkennen, dass eine geringe Optimierung der Amplifikationsbedingungen abhängig von der zugegebenen Sequenz notwendig sein kann. Jedoch wird ein Fachmann auch erkennen, dass zur Verwendung bei den vorliegenden Verfahren ein Primer, der mit einer zusätzlichen Sequenz am 5'-Ende verlängert wurde, die eine Restriktionsenzymschnittstelle enthält, im Wesentlichen gleich wie ein nicht verlängerter Primer ist.
Amplifikations- und Nachweisverfahren
Jegliche Art von Gewebe, das ABO-Nucleinsäure enthält, kann zur Bestimmung des ABO-Genotyps eines Individuums verwendet werden. Einfache und schnelle Verfahren zur Vorbereitung der Proben für die PCR sind in Higuchi, 1989, in PCR Technology (Erlich Hrsg., Stockton Press, New York) beschrieben. Ein bevorzugtes Verfahren ist das Chelex-Extraktionsverfahren, das in Singer-Sam et al., 1989, Amplifications 3: 11, und Walsh et al., 1991, BioTechniques 10 (4): 506–513 beschrieben ist. Da die Genotypisierungsverfahren der vorliegenden Erfindung amplifizierte Nucleinsäuren verwenden können und da das PCR-Verfahren extrem geringe Mengen an Nucleinsäure amplifizieren kann, kann der ABO-Genotyp sogar von Proben bestimmt werden, die nur einige wenige Kopien des ABO-Gens enthalten. Zum Beispiel enthält sogar das Wurzelende eines einzelnen Haares genügend DNA für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, wie durch die DQalpha-DNA-Typisierungsverfahren gezeigt wird, die von Higuchi et al., 1988, Nature 332: 543–546 beschrieben sind. Die Möglichkeit, dass einzelne Spermien zur DNA-Typisierung verwendet werden können, ist bei Li et al., 1988, Nature 335: 441–417 gezeigt.
Das Amplifikationsverfahren der Polymerasekettenreaktion (PCR) ist im Stand der Technik wohl bekannt und in den US-Patent Nrn. 4,683,195; 4,683,202 und 4,965,188 beschrieben. Händler wie Perkin Elmer (Norwalk, CT) vertreiben PCR-Reagentien und veröffentlichen PCR-Protokolle. Eine Zusammenfassung der PCR ist nachstehend gezeigt.
In jedem Zyklus einer PCR-Amplifikation wird eine doppelsträngige Zielsequenz denaturiert, Primer werden an jedem Strang der denaturierten Zielsequenz angelagert und die Primer werden durch das Wirken einer DNA-Polymerase verlängert. Das Verfahren wird normalerweise zwischen 25 und 40 Mal wiederholt. Die zwei Primer lagern sich an die gegenüberliegenden Enden der Zielnucleinsäuresequenz in solchen Orientierungen an, dass das Verlängerungsprodukt eines jeden Primers eine komplementäre Kopie der Zielsequenz ist und, wenn es von seinem Komplement abgetrennt wird, mit dem anderen Primer hybridisieren kann. Wenn jeder Zyklus zu 100% wirksam wäre, würde er zu einer Verdopplung der Zahl der vorhandenen Zielsequenzen führen.
Aufgrund der enormen Amplifikationsmöglichkeiten durch das PCR-Verfahren können niedrige Spiegel an DNA-Verunreinigungen aus Proben mit hohen DNA-Spiegeln, positive Kontrollmatrizen, oder aus vorangegangenen Amplifikationen zu einem PCR-Produkt führen, sogar in Abwesenheit von gezielt zugegebener Matrizen-DNA. Laborausrüstung und Labortechniken, die die Kreuzverunreinigung minimieren werden, werden in Kwok und Higuchi, 1989, Nature 339: 237–238 und Kwok und Orrego, in: Innis et al., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., San Diego, CA diskutiert. Enzymatische Verfahren zur Verringerung des Problems der Verunreinigung einer PCR durch die amplifizierte Nucleinsäure aus vorangegangenen Reaktionen sind in der PCT-Patentveröffentlichung Seriennummer US 91/05210 und US-Patent Nrn. 5,418,149 und 5,035,996 beschrieben.
Amplifikationsreaktionsgemische werden typischerweise bei Raumtemperatur, also weit unter der Temperatur zubereitet, die notwendig ist, um die Primerhybridisierungsspezifität sicherzustellen. Eine nicht-spezifische Amplifikation kann auftreten, weil bei Raumtemperatur die Primer nicht spezifisch an andere, nur teilweise komplementäre Nucleinsäuresequenzen binden und die Synthese von ungewünschten Nucleinsäuresequenzen beginnen können. Diese neu synthetisierten, ungewünschten Sequenzen können mit der gewünschten Zielsequenz während der Amplifikationsreaktion konkurrieren und können die Wirksamkeit der Amplifikation der gewünschten Sequenz deutlich verringern. Eine nicht-spezifische Amplifikation kann unter Verwendung eines „Hot Starts" verringert werden, wobei die Primerverlängerung verhindert wird, bis die Temperatur ausreichend ist, um die notwendige Hybridisierungsspezifität bereitzustellen.
Bei einem Hot-Start-Verfahren werden ein oder mehrere Reagentien von dem Reaktionsgemisch zurückgehalten, bis die Temperatur ausreichend erhöht ist, um die notwendige Hybridisierungsspezifität bereitzustellen. Hot-Start-Verfahren, die ein hitzeinstabiles Material wie Wachs verwenden, um die Reaktionsbestandteile abzutrennen oder zu maskieren, sind in US-Patent Nr. 5,411,876 und Chou et al., 1992, Nucleic Acids Research 20 (7): 1717–1723 beschrieben. In einem anderen Hot-Start-Verfahren wird eine reversibel inaktivierte DNA-Polymerase verwendet, die die Primerverlängerung nicht katalysiert, bis sie durch eine Inkubation bei hoher Temperatur vor oder als erster Schritt der Amplifikation aktiviert wird. Ein Beispiel einer derartigen reversibel inaktivierten DNA-Polymerase ist AmpliTaq^TMGOLD (siehe den Artikel von Birch et al., 1996, Nature 381: 445–446). Eine nicht-spezifische Amplifikation kann ebenfalls durch den enzymatischen Abbau von Verlängerungsprodukten verringert werden, die vor dem anfänglichen Hochtemperaturschritt der Amplifikation gebildet wurden, wie im US-Patent Nr. 5,418,149 beschrieben.
Obwohl die Polymerasekettenreaktion das bevorzugte Amplifikationsverfahren ist, kann die Amplifikation von Zielsequenzen in einer Probe durch irgendein bekanntes Verfahren wie die Ligasekettenreaktion (Wu und Wallace 1988, Genomics 4: 560–569), das TAS-Amplifikationssystem (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Sci. USA 86: 1173–1177) und selbsterhaltende Sequenzreplikation (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Sci. USA 87: 1874–1878; und WO 92/08800 erreicht werden, wobei jedes der Verfahren eine ausreichende Amplifikation bereitstellt, so dass die Zielsequenz nachgewiesen werden kann. Alternativ können Verfahren verwendet werden, die die Sonde auf nachweisbare Spiegel amplifiziert, wie die Qβ-Replikase-Amplifikation (Kramer und Lizardi, 1989, Nature 339: 401–402 und Lomeli et al., 1989, Clin. Chem. 35: 1826–1831). Einen Überblick über bekannte Amplifikationsverfahren wird in Abramson und Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology 4: 41–47 bereitgestellt.
Das oder die ABO-Allel(e), das/die in der Probe vorhanden ist/sind, kann/können durch sequenzspezifische Amplifikation oder durch vorherige Amplifikation einer Region des Allels und anschließende Identifikation der vorhandenen Nucleotidsequenz durch Analysieren der Sequenz der amplifizierten Region identifiziert werden. Eine Sequenzanalyse kann mit jeglichen Mitteln durchgeführt werden, mit denen die Sequenzvariationen unterschieden werden können, die in der amplifizierten Nucleinsäure gefunden wurden. Eine Sequenzanalyse wird bevorzugt durch Hybridisierung mit Oligonucleotidsonden der vorliegenden Erfindung durchgeführt, obwohl andere Verfahren verwendet werden können, wie direkte Sequenzierung der amplifizierten Nucleinsäuresequenz und Nachweis von Veränderungen in der durch Gelelektrophorese gemessenen Mobilität. Geeignete Assayformate zum Nachweis von Hybriden, die zwischen den Sonden und der Nucleinsäuresequenzen gebildet wurden, in einer Probe sind im Stand der Technik bekannt und schließen das Dot-Blot-Assayformat und immobilisierte Sondenassayformate, wie den Umkehr-Dot-Blot-Assay ein. Dot-Blot- und Umkehr-Dot-Blot-Assayformate sind in US-Patent Nrn. 5,310,893; 5,451,512 und 5,468,613 beschrieben.
In einem Dot-Blot-Format wird eine amplifizierte Ziel-DNA auf einem festen Träger wie einer Nylonmembran immobilisiert. Der Membran-Ziel-Komplex wird mit einer markierten Sonde unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen inkubiert, die nicht-hybridisierte Sonde wird durch Waschen unter geeignet stringenten Bedingungen entfernt und die Membran wird auf das Vorhandensein einer gebundenen Sonde untersucht. Ein bevorzugter Dot-Blot-Nachweisassay ist in den Beispielen beschrieben.
Beim Umkehr-Dot-Blot-Format werden die Sonden auf einem festen Träger wie eine Nylonmembran oder eine Mikrotiterplatte immobilisiert. Die Ziel-DNA wird typischerweise während der Amplifikation durch den Einbau von markierten Primern markiert. Ein oder beide Primer können markiert sein. Der Membran-Sonden-Komplex wird mit der markierten amplifizierten Ziel-DNA unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen inkubiert, nicht-hybridisierte Ziel-DNA wird durch Waschen unter geeignet stringenten Bedingungen entfernt und die Membran wird auf das Vorhandensein von gebundener Ziel-DNA untersucht.
Ein weiteres geeignetes Assayverfahren, das als 5'-Nuclease-Assay bezeichnet wird, ist im US-Patent Nr. 5,210,015 und in Holland, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276–7280 beschrieben, wobei die markierten Nachweissonden während des PCR-Amplifikationsverfahrens zugegeben werden. Die Sonden werden modifiziert, um zu verhindern, dass die Sonden als Primer für die DNA-Synthese agieren. Jegliche Sonde, die an Ziel-DNA während jedes Syntheseschritts hybridisiert, d.h. während der Primerverlängerung, wird durch die 5'- bis 3'-Exonucleaseaktivität der DNA-Polymerase, zum Beispiel Taq-DNA-Polymerase, abgebaut. Das Abbauprodukt von der Sonde wird anschließend nachgewiesen. Somit zeigt das Vorhandensein des Sondenabbauprodukts sowohl an, dass es zu einer Hybridisierung zwischen der Sonde und der Ziel-DNA gekommen ist, als auch dass die Amplifikationsreaktion aufgetreten ist. Oligonucleotide, die so modifiziert wurden, dass sie als Sonden in den Verfahren des vorstehend genannten '015-Patents fungieren, sind innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Verfahren. zum Nachweis des Abbaus der Sonde, der gleichzeitig mit der Amplifikation auftritt, sind im '015-Patent und in den US-Patent Nrn. 5,491,063 und 5,571,673 beschrieben.
Die vorstehend beschriebenen Assay-Formate verwenden typischerweise markierte Oligonucleotide, um den Nachweis von Hybridduplexen zu erleichtern. Oligonucleotide können durch Einbau eines durch spektroskopische, fotochemische, biochemische, immunochemische oder chemische Mittel nachweisbaren Markers markiert werden. Nützliche Marker schließen ³²P, Fluoreszenzfarbstoffe Elektronendichtereagentien, Enzyme (wie gewöhnlich in ELISAs verwendet), Biotin oder Haptene und Proteine ein, für die Antiseren oder monoclonale Antikörper verfügbar sind. Markierte erfindungsgemäße Oligonucleotide können unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Techniken zur Synthese von Oligonucleotiden synthetisiert und markiert werden.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Dot-Blot-Assay unter Verwendung von mit Biotin markierten Sonden durchgeführt, wie in Levenson und Chang, 1989, in PCR Protocols: A Guide to Methods und Applications (Innis et al., Hrsg., Academic Press, San Diego), Seiten 99–112 beschrieben. Nach der Hybridisierung der immobilisierten Ziel-DNA mit den biotinylierten Sonden unter sequenzspezifischen Bedingungen, werden Sonden, die weiterhin gebunden sind, durch anfängliches Binden von Biotin an Avidin-Meerrettich-Peroxidase (A-HRP) oder Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase (SA-HRP) nachgewiesen, die anschließend durch Durchführen einer Reaktion nachgewiesen werden, bei der das HRP eine Farbveränderung eines Chromogens katalysiert.
In alternativen Verfahren der ABO-Typisierung basierend auf sequenzspezifischer Amplifikation, benötigt die Identifikation des Vorhandenseins einer spezifischen Sequenz nur den Nachweis des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von amplifizierten Zielsequenzen. Verfahren zum Nachweis von amplifizierten Zielsequenzen sind im Stand der Technik wohl bekannt. Zum Beispiel wurden Gelelektrophorese (vgl. Sambrook et al., 1989, vorstehend) und vorstehend beschriebene Sondenhybridisierungsassays verbreitet verwendet, um das Vorhandensein von Nucleinsäuren nachzuweisen.
Ein alternatives Verfahren zum Nachweis der Amplifikation von Nucleinsäure durch Untersuchung des Anstiegs der gesamten Menge an doppelsträngiger DNA in dem Reaktionsgemisch ist in Higuchi et al., 1992, Bio/Technology 10: 413–417; Higuchi et al., 1993, Bio/Technology 11: 106–1030; und den Europäischen Patentveröffentlichungen Nr. 487,218 und 512,334 beschrieben. Der Nachweis von doppelsträngiger Ziel-DNA beruht auf der gestiegenen Fluoreszenz, die Ethidiumbromid (EtBr) und andere DNA bindende Marker zeigen, wenn sie an doppelsträngige DNA gebunden sind. Der Anstieg von doppelsträngiger DNA, der aus der Synthese von Zielsequenzen hervorgeht, führt zu einem nachweisbaren Anstieg der Fluoreszenz.
Egal welches Verfahren zur Bestimmung, welche erfindungsgemäße Oligonucleotide selektiv an ABO-Allelsequenzen in einer Probe hybridisieren, verwendet wird, schließt das zentrale Merkmal des Typisierungsverfahrens die Identifikation von in der Probe vorhandenen ABO-Allelen durch den Nachweis der vorhandenen Sequenzvarianten ein. Die spezifische Anwendung wird festlegen, welche Sonden in einem Panel verwendet werden. Wenn zum Beispiel nur das Vorhandensein oder die Abwesenheit eines bestimmten Allels von Interesse ist, kann eine einzelne Sonde, die für ein bestimmtes Allel spezifisch ist, angemessen sein.
Dem Fachmann wird klar sein, dass Sätze von sequenzspezifischen Sonden ausgewählt werden können, die eher Klassen von Allelen identifizieren, als einzeln jedes Allel zu identifizieren. Bei einigen Anwendungen ist die Identifikation aller Allele nicht notwendig. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Beispiel können zum Nachweis von Allelvarianten verwendet werden, die durch serologische Verfahren nicht zu unterscheiden sind. Jedoch kann es bei Anwendungen, bei denen nur der serologische Typ nachgewiesen werden soll, wünschenswert sein, einen Satz von Sonden zu verwenden, der zwischen den Sätzen von Allelen unterscheidet, die jedem serologischen Typ entsprechen, der aber nicht zwischen den Allelen innerhalb jedes serologischen Typs unterscheidet. Die Verwendung eines solchen Sondensatzes kann eine deutliche Verringerung der benötigten Zahl der Sonden ermöglichen.
Die DNA-Typisierung von ABO-Allelen durch die vorliegenden Verfahren ist für viele verschiedene Zwecke von Nutzen, einschließlich der Bluttypisierung für Blutbanken und für die individuelle Identifikation. Zum Beispiel spielen DNA-Typisierungsverfahren jetzt eine bedeutende Rolle auf dem wichtigen Gebiet der individuellen Identifikation egal ob zur Aufklärung von Verbrechen, wenn die Identität eines Kriminellen oder eines Opfers durch Verknüpfung eines Individuums mit den am Tatort eines Verbrechens zurückgelassenen Beweisen aufgestellt wird, oder zur Klärung anderer Fragen nicht krimineller Natur, wenn biologisches Material zur Bestimmung der Mutter- oder Vaterschaft eines Individuums verwendet wird (vgl. zum Beispiel Reynolds und Sensabaugh 1991, Anal. Chem. 63: 2–15). Die Unterscheidungskraft eines DNA-Genotypisierungsassays hängt von der Zahl und der Häufigkeit von an einem Locus gefundenen Allelen ab. Die Entdeckung eines zusätzlichen ABO-Locuspolymorphismus, der die bisher definierten O-Allele unterteilt, verbessert zusammen mit den hierin bereitgestellten Verfahren und Reagentien zum Nachweis neu entdeckter Allele wesentlich die Unterscheidungskraft eines ABO-DNA- Typisierungsassays und verbessert dadurch dessen Nutzen für eine individuelle Identifikation.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Kits, Einheiten mit mehrfachen Behältern, die nützliche Bestandteile zum Durchführen des vorliegenden Verfahrens umfassen. Ein nützlicher Kit kann für die ABO-Allele spezifische Oligonucleotidsonden enthalten. In einigen Fällen können die Sonden an eine geeignete Trägermembran gebunden sein. Der Kit kann auch Primer zur PCR-Amplifikation enthalten, da derartige Primer für die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung nützlich sind. Diese Primer werden eine polymorphe Region des ABO-Locus amplifizieren. Andere wahlweise Bestandteile des Kits schließen zum Beispiel ein Mittel zum Katalysieren der Synthese von Primerverlängerungsprodukten, die Substratnucleosidtriphosphate, Mittel, die als Marker verwendet werden (zum Beispiel ein Avidinenzymkonjugat und Enzymsubstrat und Chromogen, wenn der Marker Biotin ist), die für die PCR oder Hybridisierungsreakionen geeigneten Puffer sowie Anleitungen zum Durchführen der vorliegenden Erfindung ein.
Die nachstehend dargestellten Beispiele der vorliegenden Erfindung sind nur zum Zwecke der Veranschaulichung bereitgestellt und schränken den Umfang der Erfindung nicht ein. Zahlreiche Ausführungsformen der Erfindung innerhalb des Umfangs der Patentansprüche, die den Beispielen folgen, werden sich den Durchschnittsfachleuten durch das Lesen des vorstehenden Textes und der nachfolgenden Beispiele ergeben.
Beispiel 1
ABO-Amplifikation
Die Amplifikation einer Region des ABO-Glycosyltransferase-Gens von menschlichen genomischen DNA-Proben ist nachstehend beschrieben.
Amplifikationsprimer
Die Amplifikation einer Region des ABO-Glycosyltransferase-Gens entsprechend den Nucleotiden 2–161 von SEQ ID NO: 1, die die hierin beschriebenen polymorphen Stellen umfasst, wurde unter Verwendung der nachstehend gezeigten Primer durchgeführt.
GZ23 SEQ ID NO: 2 5'-ATGTGGGTGGCACCCTGC
GZ21 SEQ ID NO: 3 5'-GGTGGTGTTCTGGAGCCTGAA
Der stromaufwärts gelegene Primer GZ23 (SEQ ID NO: 2) hybridisiert an eine Region des Introns an Positionen 2–19 von SEQ ID NO: 1. Der stromabwärts gelegene Primer GZ21 (SEQ ID NO: 3) hybridisiert an eine Region der codierenden Sequenz an Positionen 141–161 von SEQ ID NO: 1. Zusammen katalysieren diese Primer die Amplifikation eines 160 Nucleotide langen Produkts von den O-Allelen und des entsprechenden 161 Nucleotide langen Produkts von den A- und B-Allelen. Beide Primerhybridisierungsregionen sind unter den ABO-Allelen konserviert. Somit ermöglichen die Primer die Amplifikation einer Nucleinsäuresequenz von jedem ABO-Allel unter den gleichen Bedingungen
Amplifikation
Jede PCR-Amplifikation wurde in einem gesamten Reaktionsvolumen von 100 μl durchgeführt. Die Endkonzentrationen des Reagens lauteten wie folgt:
2 ng gereinigte menschliche genomische DNA
jeweils 200 nM jedes Primers
jeweils 200 μM dNTP
50 mM KCl
10 mM Tris-HCl, pH 8,3
2,5 mM MgCl₂
2,5 Einheiten Taq DNA-Polymerase
Amplifikationsreaktionen wurden in einem DNA-Thermal-Cycler 480, der von Perkin Elmer (Norwalk, CT) vertrieben wird, programmiert auf 32 Amplifikationszyklen (Denaturieren, Anlagern und Verlängern), gefolgt von einer abschließenden Inkubation (Halten) durchgeführt. Zur Verhinderung der Verdampfung des Reagens wurden 2 Tropfen Mineralöl zu jedem Reaktionsröhrchen zugegeben. Das verwendete spezifische Temperaturkreislaufprofil ist nachstehend gezeigt.
Wärmekreislaufzeiten und Temperaturen
Gelelektrophoretischer Naweis
Amplifizierte DNA wurde durch eine Agarosegelelektrophorese zur Bestimmung, ob eine Amplifikation stattgefunden hat, nachgewiesen. Ein Agarosegel (100 ml 3% NuSieve und 1,5% SeaChem) und 0,5 × TBE (0,045 M Tris-Borat und 0,001 M Dinatrium-EDTA) Laufpuffer wurden verwendet. Ethidiumbromid (0,5 μg/ml) wurde sowohl zu dem Gel als auch zu dem Laufpuffer zugegeben. Die Elektrophorese wurde bei 100 Volt etwa eine Stunde lang durchgeführt. Das Gel wurde kurz in Wasser entfärbt und die mit Ethidiumbromid gefärbten DNA-Banden wurden unter Verwendung von UV-Bestrahlung sichtbar gemacht.
Die Gelelektrophoreseanalyse bestätigte die erfolgreiche Amplifikation der Zielnucleinsäuresequenz von den Beispielen, die menschliche genomische DNA enthielten.
Beispiel 2
Sondenhybridisierungsassay im Dot-Blot-Format
Die Sondenhybridisierung wurde in einem Dot-Blot-Format zum Nachweis des/der in den Proben genomischer Nucleinsäure vorhandenen Allels/Allele durchgeführt. In dem Dot-Blot-Format wurde ein kleiner Teil der amplifizierten Nucleinsäure denaturiert, auf ein Nylonfilter aufgebracht und wie nachstehend beschrieben immobilisiert. Der Filter wurde anschließend in eine Lösung getaucht, die die markierte Sonde enthielt, um die Hybridisierung zu ermöglichen. Eine ungebundene Sonde wurde durch Waschen unter sequenzspezifischen Hybridisierungsbedingungen entfernt und die an die immobilisierte Zielnucleinsäure gebundenen Sonden wurden nachgewiesen. Sonden, die für die Hybridisierung verwendet wurden, wurden mit Biotin wie in Levenson und Chang, 1989, in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., Hrsg. Academic Press, San Diego), Seiten 92–112 zum nicht-isotopischen Nachweis markiert. Die Details des Assays sind nachstehend beschrieben.
Nachweissonden
Sonden, die zur Identifizierung der in der amplifizierten ABO-Nucleinsäure vorhandenen allelischen Sequenzvarianten verwendet werden, sind nachstehend beschrieben. Die speziellen Nucleotide innerhalb der Sondensequenz, die an eine polymorphe Stelle hybridisieren, sind unterstrichen. Sonden, die an den in Tabelle 1 gezeigten Nucleinsäurestrang hybridisieren, sind mit Stern gekennzeichnet; alle anderen Sonden hybridisieren an das Komplement des in Tabelle 1 gezeigten Strangs. Alle Sondenoligonucleotide sind in 5'- zu 3'-Orientierung gezeigt.
Das an der polymorphen Stelle an Position 29 von SEQ ID NO: 1 vorhandene Basenpaar wurde unter Verwendung der Sonden GZ26 (SEQ ID NO: 4) und GZ27 (SEQ ID NO: 5) identifiziert. Die Hybridisierungsregionen dieser Sonden umfassen ebenfalls die polymorphen Positionen 32 und 33. Die Sonde GZ26 (SEQ ID NO: 4) ist für O₁-Allele, die ein A:T-Basenpaar an Positionen 29 und 32 und ein C:G-Basenpaar an Position 33 haben, spezifisch. Die Sonde GZ27 (SEQ ID NO: 5) ist spezifisch für O₂-, A- und B₁-Allele, die alle ein G:C-Basenpaar an Position 29, ein A:T-Basenpaar an Position 32 und ein C:G-Basenpaar an Position 33 besitzen. Keine der Sonden hybridisiert an das B₂-Allel, das ein G:C-Basenpaar an Position 32 hat, oder an das O₄-Allel, das ein T:A-Basenpaar an Position 33 hat.
GZ26 (SEQ ID NO: 4) 5'-AGCTCCATATGACCGCAC
GZ27* (SEQ ID NO: 5) 5'-CGTGCGGTCACATGGA
Zur Unterscheidung der O-Allele von den A- und B-Allelen werden Sonden verwendet, die an eine Region des ABO-Glycosyltransferase-Gens hybridisieren, das die Lage des zusätzlichen G:C-Basenpaars umfasst, das die A- und B-Allele von den O-Allelen unterscheidet. Die Sonde GZ29 (SEQ ID NO: 6) ist spezifisch für O-Allele. Die Sonde GZ30 (SEQ ID NO: 7) ist spezifisch für A- und B-Allele, die ein zusätzliches G:C-Basenpaar besitzen, entsprechend einer Position zwischen Positionen 77 und 78 von SEQ ID NO: 1.
GZ29 (SEQ ID NO: 6) GGTACCCCTTGGCTGG
GZ30 (SEQ ID NO: 7) GTGACCCCTTGGCTGG
Das an der polymorphen Stelle an Position 113 von SEQ ID NO: 1 vorhandene Nucleotid wurde unter Verwendung der Sonden GZ33 (SEQ ID NO: 8) und GZ34 (SEQ ID NO: 9) identifiziert. Die Sonde GZ33 (SEQ ID NO: 8) ist spezifisch für O₂- und A-Allele, die ein A:T-Basenpaar an Position 113 besitzen. Die Sonde GZ34 (SEQ ID NO: 9) ist spezifisch für O₁-, O₃-, O₄- und B-Allele, die ein G:C-Basenpaar an Position 113 besitzen.
GZ33 (SEQ ID NO: 8) GGAGGGCACATTCAACAT
GZ34* (SEQ ID NO: 9) GATGTTGAACGTGCCCTC
Beispiel 3, nachstehend, beschreibt die Verwendung des vorstehend beschriebenen Satzes von sechs Sonden zur Klassifizierung von Allelen in einen Untersatz von sieben nachstehend beschriebenen Allelen. Alle Allele wurden als O₁-, O₂-, A- oder B-Allele klassifiziert. Als die in Beispiel 3 beschriebene Bestimmung des Genotyps durchgeführt wurde, wurden nur O₁-, O₂-, A- und B-Allele beobachtet. Die Existenz von zusätzlichen Allelen wurde durch das Auftreten unerwarteter Hybridisierungsergebnisse angezeigt. Eine nachfolgende Sequenzierung führte zur Entdeckung des Polymorphismus an Position 32, der die B-Allele unterteilt, des Polymorphismus an Position 33, der das O₄-Allel identifiziert, und der Kombination von Basenpaaren an Positionen 29 und 113, die das O₃-Allel identifiziert. Da die B₂-, O₃- und O₄-Allele relativ ungewöhnlich sind, könnte es noch wünschenswert sein, Allele als O₁-, O₂-, A- oder B-Allele zu klassifizieren. Wenn die Polymorphismen an Position 32 und 33 nicht nachgewiesen werden, werden die Subtypen der B-Allele nicht unterschieden und das O₄-Allel wird nicht vom O₁-Allel unterschieden, aber das O₃-Allel ist noch immer zu unterscheiden. Der Nachweis nur der Polymorphismen an Positionen 29, 77–78 (Deletion) und 113 durch Sondenhybridisierung ermöglicht die Identifikation aller diploider Genotypen mit der Ausnahme, dass die O₃,A- und O₂,B₁-Genotypen zu identischen Hybridisierungsergebnissen führen.
Die Genotypisierung, bei der alle sieben Allen unterschieden werden, kann unter Verwendung von zusätzlichen zu den vorstehend beschriebenen Sonden durchgeführt werden, um die an Positionen 32 und 33 vorhandenen Basenpaare zu identifizieren. Durch die Nähe der polymorphen Stellen an Position 29, 32 und 33 kann das vorhandene Basenpaar unter Verwendung von Sonden nachgewiesen werden, die an eine Region hybridisieren, die Positionen 29–33 umfasst, und die ein spezifisches Muster von Basenpaaren an Positionen 29, 32 und 33 nachweisen. Da alle Allele eine von vier Sequenzvarianten innerhalb der Region enthalten, die Positionen 29–33 umfasst, sind vier Sonden, von den jede Positionen 29–33 umfasst und an eine unterscheidbare Sequenzvariante hybridisiert, zur Bestimmung der an Positionen 29, 32 und 33 vorhandenen Basenpaare in jedem Allel ausreichend. Die vorstehend beschriebenen Sonden GZ26 (SEQ ID NO: 4) und GZ27 (SEQ ID NO: 5) weisen zwei der vier Sequenzvarianten nach. Die Sonde GZ26 (SEQ ID NO: 4) weist Allele nach, die ein A:T-Basenpaar an Position 29 und 32 und ein C:G-Basenpaar an Position 33 besitzen. Die Sonde GZ27 (SEQ ID NO: 5) weist Allele nach, die ein G:C-Basenpaar an Position 29, ein A:T-Basenpaar an Position 32 und ein C:G-Basenpaar an Position 33 besitzen. Die nachstehenden Sonden P1 (SEQ ID NO: 10) und P2 (SEQ ID NO: 11) weisen die anderen zwei Sequenzvarianten nach. Die Sonde P1 (SEQ ID NO: 10) weist Allele nach, die ein A:T-Basenpaar an Position 29 und ein A:T-Basenpaar an Position 32 und ein T:A-Basenpaar an Position 33 besitzen. Die Sonde P2 (SEQ ID NO: 11) weist Allele nach, die ein G:C-Basenpaar an Positionen 29 und 32 und ein C:G-Basenpaar an Position 33 besitzen. Wenn sie zusammen verwendet werden, weisen diese vier Sonden alle Kombinationen von Basenpaaren nach, die an Positionen 29, 32 und 33 vorhanden sind.
Weiterhin ermöglicht die Zugabe von P1 (SEQ ID NO: 10) und P2 (SEQ ID NO: 11) zu dem vorstehend beschriebenen Satz von sechs Sonden die Genotypisierung aller sieben Allele.
P1 (SEQ ID NO: 10) 5'-AGCTCCATATGATCGCAC
P2 (SEQ ID NO: 11) 5'-AGCTCCATGTGGCCGCAC
Ein Sondensatz, der zur Identifizierung des an jeder der fünf polymorphen Stellen vorhandenen Basenpaares zusammengestellt wurde, kann 27 der 28 möglichen diploiden Genotypen nachweisen. Die O₃,A- und O₂,B₁-Genotypen sind nicht durch den unabhängigen Nachweis des an jeder polymorphen Stelle vorhandenen Basenpaares zu unterscheiden. Die Zweideutigkeit tritt auf, da das kombinierte Sondenhybridisierungsmuster nicht anzeigt, welches Allel ein bestimmtes Basenpaar zu dem beobachteten Sondenmuster beiträgt. Sowohl die O₃- und O₂-Allele als auch die A- und B₁-Allele sind nur durch das an Position 113 vorhandene Basenpaar zu unterscheiden. Beispiele der O₃,A- und O₂,B₁-Genotypen enthalten sowohl eine Nucleinsäure mit einem G:C-Basenpaar an Position 113 und eine Nucleinsäure mit einem A:T-Basenpaar an Position 113. Das Unterscheiden dieser Genotypen erfordert die Bestimmung, welches Allel zum Beispiel zu dem A:T-Basenpaar beiträgt, das nicht bestimmt wird, wenn die polymorphen Stellen unabhängig analysiert werden.
Die Zweideutigkeit bei der Genotypisierung kann durch die Verwendung einer sequenzspezifischen Amplifikation gelöst werden, um nur einen Untersatz von Allelen zu amplifizieren, der in einer zweideutigen Probe vorhanden sein könnte. Zum Beispiel ermöglicht die sequenzspezifische Amplifikation einer Nucleinsäure nur von A- oder B-Allelen unter Verwendung eines Primers, der für das zusätzliche G:C-Basenpaar spezifisch ist, das die A- und B-Allele von den O-Allelen unterscheidet, gefolgt von dem Nachweis des Basenpaars an Position 113, die Unterscheidung von A- und B-Allelen. Das Amplifizieren nur von A- oder B-Allelen von Proben, die entweder als O₃,A- oder als O₂,B₁-Genotyp bekannt sind, und das Identifizieren der amplifizierten Allele ermöglicht die Unterscheidung der O₃,A- und O₂,B₁-Genotypen. Die Verwendung einer sequenzspezifischen Amplifikation zur Eliminierung der Zweideutigkeit bei der Genotypisierung wurde in den HLA DRB-Genotypisierungsverfahren verwendet, die in WO 92/10589 beschrieben sind.
Die Zweideutigkeit bei der Genotypisierung kann auch durch den weiteren Nachweis einer anderen polymorphen Stelle außerhalb der Region von SEQ ID NO: 1 gelöst werden. Zum Beispiel beschreiben Lee und Chang, 1992, vorstehend, eine polymorphe Stelle an Position 700 der codierenden Sequenz, die zu einer Alu I-Stelle in B-Allelen führt, die in A-Allelen nicht vorhanden ist. Die Fähigkeit zur Unterscheidung von A- und B-Allelen ermöglicht die Unterscheidung der O₃,A- und O₂,B₁-Genotypen.
Dot-Blot-Assay
PCR-Produkte aus den Amplifikationsreaktionen, die im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt wurden, wurden durch Behandlung mit Alkali denaturiert. Genauer gesagt wurden 10 μl an PCR-Produkten zu 90 μl einer Denaturierungslösung bestehend aus 4,5 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0), 7,2 μl 5 N NaOH und 78,3 μl H₂O gegeben. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur 10 Minuten lang bis zur kompletten Denaturierung inkubiert.
BioDyne B-Nylon-Filter (Pall Corp., Glen Cove, NY) wurden durch Einweichen in H₂O für 5 bis 10 Minuten und anschließendes Spülen mit 200 μl H₂O nachdem das Dot-Blot-Manifold (Dot Blot von BioRad, Richmond, CA) aufgebaut worden war, zubereitet. Die 100 μl des denaturierten Probegemisches wurden unter Vakuum auf die Nylonmembran unter Verwendung des Dot-Blot-Apparats aufgebracht. Jede Vertiefung wurde anschließend mit 200 μl 0,4 N NaOH gespült, dann kurz mit 2 × SSC gespült und luftgetrocknet, bis keine Pools mit Flüssigkeit mehr übrig waren. Die immobilisierte DNA wurde mit dem Nylonfilter durch ultraviolette Bestrahlung mit einem Fluss von 500 mJ/cm² with einer Stratalinker-UV-Lichtbox (Stratagene, La Jolla, CA) vernetzt (Einstellung: „Autovernetzung").
Die Hybridisierung wurde in einem Hybridisierungspuffer (5 × SSPE, 0,5% SDS) enthaltend 2 μM biotinylierte Sonde durchgeführt. Die Filter konnten 25 bis 30 Minuten lang bei 55°C hybridisieren. Nach der Hybridisierung wurden die Filter in einem Waschpuffer (2,5 × SSPE, 0,1% SDS) bei Zimmertemperatur gespült, um den Großteil der überschüssigen Sonde zu entfernen.
Die Biotinsondenmarker wurden an Meerrettichperoxidase-Streptavidin (HRP-SA) durch Inkubieren der Filter in einer Enzymkonjugatlösung konjugiert, die Hybridisierungspuffer und HRP-SA enthielt. Die Enzymkonjugatlösung wurde durch Zugabe von 8 μl Enzymkonjugat: HRP-SA von Perkin Elmer (Norwalk, CT) zu jedem ml der Hybridisierungslösung zubereitet. Jeder Filter wurde in der Enzymkonjugatlösung 5 Minuten lang bei 55°C inkubiert. Nach dem Konjugieren wurden die Filter in Waschpuffer bei Raumtemperatur gespült.
Ein stringenter Waschschritt wurde in einem Waschpuffer 12 Minuten lang bei 55°C in einem Schüttelwasserbad durchgeführt. Die sequenzspezifischen Hybridisierungsbedingungen des stringenten Waschschritts stellten sicher, dass nur Sonden, die exakt komplementär zu der Zielsequenz sind, gebunden sind.
Biotinylierte Sonden, die an das immobilisierte Amplifikationsprodukt gebunden blieben, wurden wie folgt sichtbar gemacht. Eine Farbentwicklungslösung wurde durch Mischen von 100 ml Citratpuffer (0,1 M Natriumcitrat, pH 5,0), 5 ml 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB)-Lösung (Perkin Elmer, Norwalk, CT) und 100 μl 3% Wasserstoffperoxid zubereitet. Die Filter wurden zuerst in 100 mM Natriumcitrat (pH 5,0) 5 Minuten lang gespült, dann in der Farbentwicklungslösung mit sanftem Rühren 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Das TMB, das anfangs farblos war, wurde durch das Sonden-gebundene HRP in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid in ein farbiges Präzipitat umgewandelt. Die entwickelten Filter wurden in Wasser mehrere Minuten lang gespült und sofort fotografiert.
Beispiel 3
Häufigkeiten der ABO-Allele
Zur Beurteilung der Häufigkeit von ABO-Allelen wurden Proben von 622 Individuen von 4 verschiedenen Populationen an dem ABO-Locus typisiert. Die Populationsproben bestanden aus 178 Afroamerikanern, 181 US-Kaukasieren, 174 Hispanoamerikanern bzw. 89 Japanern.
Die Amplifikation von ABO-Nucleinsäure wurde im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben mit den folgenden Ausnahmen durchgeführt. Zuerst wurden zusätzliche Amplifikationsprimer, die für Zielsequenzen von 8 anderen Genen spezifisch sind, zu dem Amplifikationsgemisch gegeben, so dass Zielsequenzen von jedem Gen gleichzeitig amplifiziert wurden. Anschließend lauteten die endgültigen Reagenskonzentrationen wie folgt:
2 ng menschliche genomische DNA
200 nM jedes Primers
jeweils 200 μM dNTP
50 mM KCl
20 mM Tris-HCl, pH 8,3
3 mM MgCl₂,
1,5 μl modifizierte DNA-Polymerase-Lösung (~7,5 Einheiten).
Die verwendete modifizierte DNA-Polymerase war Taq-DNA-Polymerase, die durch eine Reaktion mit einem 200-fachen molaren Überschuss von Citraconsäureanhydrid wie in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 96113222.2 beschrieben, die am 17. August 1996 eingereicht wurde, reversibel inaktiviert worden war. Kurz gesagt schließt das Verfahren die Verwendung von Taq-DNA-Polymerase (AmpliTaq^®, Perkin Elmer, Norwalk CT) mit einer anfänglichen Konzentration von 1,3 mg/ml in einem Trispuffer (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 65 mM KCl, pH 7,5) ein. Eine Lösung von Citraconsäureanhydrid wurde durch Verdünnen von 11,06 M Citraconsäureanhydrid (im Handel erhältlich von Aldrich, Milwaukee, WI) 100-fach in DMF (N,N-Dimethylformamid) zubereitet. Eine Lösung, die ein molares Verhältnis von Citraconsäureanhydrid zu Taq-DNA-Polymerase von etwa 200/1 enthielt, wurde über Nacht bei 4°C inkubiert, um die Taq-DNA-Polymerase zu inaktivieren. Nach der Inaktivierung wurden die Amplifikationen unter Verwendung einer Verdünnungsreihe des modifizierten Enzyms durchgeführt, um eine Menge der citraconylierten Taq-DNA-Polymeraselösung zu bestimmen, die in einer Amplifikation im Wesentlichen die gleichen Ergebnisse liefern würde, wie durch die Verwendung von 7,5 Einheiten nicht modifizierter Taq-DNA-Polymerase erreicht wird. Die Menge der in den Co-Amplifikationen (7,5 Einheiten) verwendeten DNA-Polymeraseaktivität wurde gegenüber der Menge, die in den einfachen Amplifikationen (2,5 Einheiten) verwendet wurde, erhöht, um die für die Co-Amplifikation notwendige erhöhte DNA-Synthese zu erleichtern. Basierend auf der empirischen Bestimmung wurden 1,5 μl der modifizierten DNA-Polymeraselösung zu jeder Reaktion zugegeben. Die modifizierte DNA-Polymerase wurde in den Co-Amplifikationen verwendet, um einen wie vorstehend beschriebenen „Hot Start" zu erreichen. Eine Inkubation des Reaktionsgemisches vor der Reaktion erfolgte 5 Minuten lang, 30 Sekunden bei 94°C, um die modifizierte DNA-Polymerase wieder zu aktivieren.
Die hierin verwendeten Allel-Bezeichnungen sind nachstehend in Tabelle 3 in Bezug auf die unter Verwendung des Satzes von sechs vorstehend beschriebenen Sonden nachgewiesenen Polymorphismen definiert. Die Positionen der polymorphen Stellen sind in Bezug auf SEQ ID NO: 1 nummeriert. Für jedes Allel wurden die an den polymorphen Stellen an Positionen 29 und 113 vorhandenen Basenpaare, und das Vorhandensein oder die Abwesenheit eines zusätzlichen G:C-Basenpaares zwischen Positionen 77 und 78 von SEQ ID NO: 1 bestimmt. Die an Positionen 32 und 33 vorhandenen Basenpaare wurden nicht getrennt bestimmt.
Tabelle 3 ABO-Glycosyltransferase-Allele
Die Allelidentifikation wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Die Allel- und Genotyphäufigkeiten, die für jede Population beobachtet wurden, sind in den nachstehenden Tabellen gezeigt. Die erwarteten Genotyphäufigkeiten wurden von den beobachteten Allelfrequenzen unter Annahme des Hardy-Weinberg-Gleichgewichts errechnet.
Wie vorstehend beschrieben, wurde die vorliegende Genotypisierung vor der Entdeckung der B₂-, O₃- und O₄-Allele durchgeführt. Unerwartete Ergebnisse wurden bei 13 Afroamerikanern, 4 US-Kaukasiern, 5 Hispanoamerikanern und 8 Japanern beobachtet. Das am häufigsten beobachtete unerwartete Ergebnis war ein Versagen von GZ27 (SEQ ID NO: 2), die erwartungsgemäß an die B-Allele hybridisieren sollte, an eine Probe zu hybridisieren, die als O₁,B basierend auf der Hybridisierung der anderen fünf Sonden typisiert wurde. Die nachfolgende Sequenzanalyse bestimmte, dass diese Proben in der Tat O₁,B₂ waren. Von den 30 Proben, die zu unerwarteten Hybridisierungsergebnissen führten, lieferten die Proben von 3 Afroamerikanern und einem Hispanoamerikaner nicht zu interpretierende Ergebnisse und wurden von den nachstehend dargestellten Ergebnissen ausgenommen. Allel- und Genotyphäufigkeiten wurden unter Verwendung der 618 Proben berechnet, die interpretierbare Hybridisierungsergebnisse lieferten. Im Nachhinein war angesichts der nachfolgenden Entdeckung der O₃-Allele eine Verzerrung der Schätzung der Häufigkeiten der A- und B-Allele vorhanden, da sowohl der O₃,A- als auch der O₂,B₁-Genotyp, die unter Verwendung des vorliegenden Sondensatzes nicht zu unterscheiden sind, als O₂,B-Genotypen klassifiziert worden wären. Somit war die geschätzte Häufigkeit der O₂,B-Genotypen eine Überschätzung. Da jedoch das O₃-Allel ungewöhnlich ist, ist es wahrscheinlich, dass das Vorkommen der O₃,A-Genotypen die erhaltenen Schätzungen der Häufigkeit nicht deutlich betrafen.
Tabelle 4 Allelhäufigkeit
Tabelle 5 ABO-Genotypverteilung (Afroamerikaner)
Tabelle 6 ABO-Genotypverteilung (US-Kaukasier)
Tabelle 7 ABO-Genotypverteilung (Hispanoamerikaner)
Tabelle 8 ABO-Gentypverteilung (Japaner)
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Oligonucleotid, welches exakt komplementär ist zu SEQ ID NO: 1 oder der dazu komplementären Sequenz, umfassend die polymorphen Stellen an den Nucleotidpositionen 29, 32 und 33 von SEQ ID NO: 1 oder die polymorphen Stellen an den Nucleotiden 129, 130 und 133 der komplementären Sequenz von SEQ ID NO: 1, welches 15 bis 35 Nucleotide lang ist, und wobei die Sequenz von SEQ ID NO: 1 an Position 29 ein A, an Position 32 ein A und an Position 33 ein C ist; oder die Sequenz von SEQ ID NO: 1 an Position 29 ein A, an Position 32 ein A und an Position 33 ein T ist; oder die Sequenz von SEQ ID NO: 1 an Position 29 ein G, and Position 32 ein G und an Position 33 ein C ist; oder die Sequenz der komplementären Sequenz von SEQ ID NO: 1 an Position 129 ein G, an Position 130 ein T und an Position 133 ein T ist; oder die Sequenz der komplementären Sequenz von SEQ ID NO: 1 an Position 129 ein A, an Position 130 ein T und an Position 133 ein T ist; oder die Sequenz der komplementären Sequenz von SEQ ID NO: 1 an Position 129 ein G; an Position 130 ein C und an Position 133 ein C ist.
Oligonucleotid nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GZ26 (SEQ ID NO: 4), P1 (SEQ ID NO: 10), P2 (SEQ ID NO: 11) und den exakt komplementären Sequenzen davon.
Verfahren zur Identifizierung eines Allels, welches in einer Probe vorhanden ist, die Nucleinsäure des ABO-Glycosyltransferase-Gens enthält, wobei die Nucleinsäure Nucleotide 29 bis 33 von SEQ ID NO: 1 oder die komplementäre Sequenz dazu enthält, wobei das Verfahren die Bestimmung eines Nucleotid-Basenpaares, welches an einer polymorphen Stelle vorhanden ist, umfasst, ausgewählt aus den Positionen 29, 32 und 33 von SEQ ID NO: 1, und wobei das Nucleotid von SEQ ID NO: 1 an Position 29 ein A oder G ist, das Nucleotid von SEQ ID NO: 1 an Position 32 ein A oder G ist und das Nucleotid von SEQ ID NO: 1 an Position 33 ein C oder T ist.
Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit einer Sequenzvariante des ABO-Glycosyltransferase-Gens in einer Probe, welche menschliche Nucleinsäuren enthält, umfassend: (a) Mischen der Nucleinsäure mit einem Oligonucleotid, welches eine Nucleotidsequenz von mindestens 10 Nucleotiden Länge umfasst, wobei die Nucleotidsequenz in der Region, bestehend aus Positionen 22 bis 58 von SEQ ID NO: 1 oder der dazu komplementären Region, enthalten ist, wobei das Oligonucleotid exakt komplementär ist zu der Sequenzvariante an einer polymorphen Stelle, ausgewählt aus den polymorphen Stellen an Nucleotidpositionen 29, 32 und 33, unter Bedingungen, unter welchen das Oligonucleotid an die Nucleinsäure bindet, um nur dann einen stabilen Hybrid-Duplex zu bilden, wenn die Nucleinsäure die Sequenzvariante enthält; und (b) Nachweis der Anwesenheit aller gebildeten Hybride zwischen dem Oligonucleotid und der Nucleinsäure, welcher die Anwesenheit der Sequenzvariante anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Nucleinsäure vor Schritt (a) amplifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Nachweis in Schritt (b) die Durchführung einer Amplifizierungsreaktion umfasst, wobei die Oligonucleotide als Amplifizierungsprimer verwendet werden, unter Bedingungen, unter welchen die Amplifikation nur stattfindet, wenn das Oligonucleotid einen stabilen Hybrid-Duplex mit der Nucleinsäure bildet.
Kit zum Nachweis des Genotyps eines Individuums am ABO-Glycosyltransferase-Locus, umfassend ein Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 oder 2.
Kit nach Anspruch 7, weiterhin umfassend Primer, welche an konservierte Regionen der ABO-Gens hybridisieren.