DE69534728T2

DE69534728T2 - Amplifizierung von langen Nukleinsäuresequenzen mit PCR

Info

Publication number: DE69534728T2
Application number: DE69534728T
Authority: DE
Inventors: Suzanne El Cerrito Cheng
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1994-02-25
Filing date: 1995-02-16
Publication date: 2006-11-09
Anticipated expiration: 2015-02-17
Also published as: EP0669401B1; ES2256118T3; DK0669401T3; EP0669401A2; DE69524653T2; EP0669401A3; ATE315081T1; JPH0838198A; CA2143229A1; EP1130118B1; JP2002315590A; PT669401E; DE69534728D1; EP1130118A2; ATE211179T1; DE69524653D1; EP1130118A3; US5512462A; ES2169736T3

Description

Die vorliegende Erfindung fällt allgemein in das Gebiet der Molekularbiologie und Nucleinsäurechemie. Genauer betrifft es Verfahren zur Amplifikation langer Nucleinsäureketten durch die Polymerasekettenreaktion.
Die Polymerasekettenreaktion (PCR), ein wirkungsvolles Werkzeug zur Amplifikation von Nucleinsäuresequenzen, ist in den U.S. Patenten Nr. 4,683,202; 4,683,195; 4,800,195 und 4,965,188 offenbart. In ihrer einfachsten Form ist die PCR ein in vitro-Verfahren für die enzymatische Synthese spezifischer DNA-Sequenzen, indem man zwei Oligonucleotid-Primer benutzt, die an komplementäre Stränge hybridisieren und die Regionen von Interesse in der Ziel-DNA flankieren. Eine wiederholte Reihe von Reaktionsschritten, wie Denaturierung der Matrize, Anlagerung der Primer sowie Verlängerung der angelagerten Primer durch eine DNA-Polymerase, führt schließlich zu einer geometrischen Akkumulation eines spezifischen Fragmentes, dessen Enden durch die 5'-Enden der Primer definiert sind. Mit Hilfe der PCR lässt sich die selektive Anreicherung einer spezifischen DNA-Sequenz um den Faktor 10⁹ erreichen. Das PCR-Verfahren ist auch in Saiki et al., 1985, Science 230:1350–1354, beschrieben.
Die PCR findet breite Anwendung in der Molekularbiologie, molekularen Evolutionsforschung, medizinischen Genetik, Bevölkerungsgenetik, forensischen Biologie, der Kartierung des Genoms und bei Sequenzierungsprojekten. Das heutige PCR-Verfahren findet jedoch seine Grenzen in der Größe der DNA-Region, die zuverlässig amplifiziert werden kann.
Versuche, die Längenbegrenzung der PCR aufzuheben, sind beschrieben bei Glukhov et al., 1991, Molek. Biol. 25:1602–1610; Kainz et al., 1992, Anal. Biochem. 202:46–49; Ohler und Rose, 1992, PCR Meth. Applic. 2:51–59; Ponce und Micol, 1992, Nucl. Acids Res. 20:623 und Rychlik et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18:6409–6412. Obwohl Amplifikationen von 5–15 kb-Sequenzen erreicht wurden, ist die Ausbeute längerer Produkte doch sehr gering.
PCR-Verfahren zur Amplifikation langer Nucleinsäuresquenzen würden die Genom-Kartierung und Sequenzierung ebenso erleichtern wie das molekulare Clonen durch die Amplifikation von längerem eingefügten Material mit niedriger Kopienzahl. Ebenso würde dadurch eine Zusammenlagerung von größeren rekombinanten Konstrukten in der PCR-basierenden Mutagenese möglich. Es bleibt ein Bedarf für Verfahren, die eine PCR-Amplifikation von Zielen von mindestens 25 kb mit hoher Ausbeute ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung liefert verbesserte Verfahren und Reagenzien für die PCR-Amplifikation langer DNA-Zielsequenzen.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft die Kombinationen thermostabiler DNA-Polymerasen, die bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind. Die Kombinationen bestehen primär aus der DNA-Polymerase von Thermus thermophilus, einer hochaktiven, thermostabilen DNA-Polymerase, die keine 3'-zu 5'-Exonuclease-Aktivität zeigt, und zum anderen aus einer DNA-Polymerse von Thermococcus litoralis, Pyrococcus-Art GB-D oder Thermotoga maritima, alles thermostabile DNA-Polymerasen, die eine 3'-zu 5'-Exonuclease-Aktivität zeigen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen Puffer, der für die Amplifikation langer Ziele nützlich ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die PCR-Amplifikationen unter Verwendung spezifischer Kombinationen der vorstehend beschriebenen thermostabilen Enzyme. Die Reaktionsbedingungen sind so festgelegt, dass eine Amplifikation von Nucleinsäurezielsequenzen bis zu einer Länge von 42 kb ermöglicht wird.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Kits, umfassend Reagenzien, die zur Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind. Diese Kits umfassen eine Kombination thermostabiler DNA-Polymerasen wie vorstehend beschrieben, und gegebenefalls weitere Reagenzien zur Amplifikation, die für die Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind.
Zum besseren Verständnis der Erfindung sind im folgenden einige Ausdrücke definiert.
Der hier benutzte Ausdruck „Reaktionsgemisch für die Amplifikation" bezieht sich auf eine wässrige Lösung, die die verschiedenen Amplifikations-Reagenzien enthält, die zur Amplifikation einer Ziel-Nucleinsäure verwendet werden. Die Reagenzien beinhalten Primer, Enzyme, wässrige Puffer, Salze, Ziel-Nucleinsäure und Desoxynucleosidtriphosphate (konventionelle und unkonventionelle). Je nach Kontext kann das Gemisch ein vollständiges oder ein unvollständiges Reaktionsgemisch sein.
Die hier benutzten Ausdrücke „Nucleinsäure" und „Oligonucleotid" beziehen sich auf Primer, Sonden und Oligomerfragmente, die nachgewiesen werden sollen. Sie gehören zur Gattung der Polydesoxyribonucleotide (2-Desoxy-D-ribose enthaltend) und der Polyribonucleotide (D-Ribose enthaltend). Sie beziehen sich aber auch auf jede andere Art von Polynucleotiden, die ein N-Glycosid einer Purin- oder Pyrimidinbase oder eine modifizierte Purin- oder Pyrimidinbase ist. Mit den Ausdrücken „Nucleinsäure" und „Oligonucleotid" ist keine Längenunterscheidung verbunden, die Ausdrücke werden synonym verwandt, und beziehen sich nur auf die Primärstruktur des Moleküls. Daher umfassen diese Ausdrücke sowohl doppelsträngige als auch einzelsträngige DNA, und ebenso doppelsträngige und einzelsträngige RNA.
Weil Mononucleotide sich derartig zu Polynucleotiden verbinden, dass die 5'-Phosphatgruppe des Pentoseringes des einen Mononucleotids über eine Phophodiester-Bindung in eine Richtung an den 3'-Sauerstoff eines benachbarten Ringes bindet, bezeichnet man das Ende eines Oligonucleotides als „5'-Ende", wenn die 5'-Phosphatgruppe nicht mit dem 3'-Sauerstoff des Pentoseringes eines Mononucleotids verbunden ist, und als 3'-Ende, wenn der 3'-Sauerstoff nicht mit einem 5'-Phosphat des Pentoseringes eines folgenden Mononucleotids verbunden ist.
Die exakte Größe eines Oligonucleotids hängt von vielen Faktoren ab, nicht zuletzt auch von der Funktion oder der jeweiligen Verwendung des Oligonucleotids. Oligonucleotide können nach verschiedenen geeigneten Verfahren hergestellt werden, z.B. durch Clonierung und Restriktion geeigneter Sequenzen und durch direkte chemische Synthese, z.B. durch das Phosphotriester-Verfahren von Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90–99, das Phosphodiester-Verfahren von Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:109–151, das Diethylphospho ramidit-Verfahren von Beaucage et al., 1981, Tetahedron Lett. 22:1859–1862; und das Festphasenverfahren des U.S. Patents Nr. 4,458,066. Eine Übersicht der Syntheseverfahren findet sich bei Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1 (3):165–187.
Der hier benutzte Ausdruck „Hybridisierung" bezieht sich auf die Bildung eines Doppelstranges aus zwei einzelsträngigen Nucleinsäuren durch Paarung jeweiliger komplementärer Basen. Hybridisierung kann sowohl zwischen zueinander komplementären Nucleinsäuresträngen stattfinden als auch zwischen solchen, die kleinere, nicht zueinander passende Regionen enthalten. Die Stabilität eines Nucleinsäuredoppelstranges wird durch die Schmelztemperatur oder „T_M" angegeben. T_M ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert), bei der 50% der Basenpaare dissoziiert sind. Fachleute auf dem Gebiet der Nucleinsäuretechnologie können die Doppelstrang-Stabilität empirisch ermitteln, indem sie eine Reihe von Variablen berücksichtigen, wie etwa die Länge der Oligonucleotide, die Basenzusammensetzung und Sequenz der Oligonucleotide, die Ionenstärke und die Häufigkeit nicht passender Basenpaare.
Bedingungen, unter denen nur vollständig komplementäre Nucleinsäurestränge hybridisieren, werden als „strenge (stringente) Hybridisierungsbedingungen" bezeichnet. Strenge Hybridisierungsbedingungen sind der Fachwelt gut bekannt (vgl. z.B. Sambrook et al., 1985, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Allgemein werden strenge Bedingungen so ausgewählt, dass sie bei einer Temperatur von etwa 5°C unter der T_m für die jeweilige Sequenz bei definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert liegen. Typische strenge Bedingungen sind gegeben, wenn die Salzkonzentration mindestens etwa 0,2 molar ist, der pH-Wert 7, und die Temperatur mindestens etwa 60°C beträgt. Eine Lockerung der strengen Hybridisierungsbedingungen erlaubt die Tolerierung von Fehlpaarungen innerhalb der Sequenz; der Grad der nicht verpaarten Sequenzen kann durch eine entsprechende Einstellung der Hybridisierungsbedingungen kontrolliert werden.
Zwei einzelsträngige Nucleinsäuren, die bis auf kleinere Regionen, in denen keine Übereinstimmung vorliegt, komplementär zueinander sind, werden als „im wesentlichen komplementär" bezeichnet. Stabile Doppelstränge von im wesentlichen komplementären Sequenzen erhält man schon unter weniger strengen Hybridisierungsbedingungen. Fachleute auf dem Gebiet der Nucleinsäuretechnologie können die Doppelstrang-Stabilität empirisch ermitteln, in dem sie eine Reihe von Variablen berücksichtigen, wie etwa die Länge und Basenpaarkonzentration der Oligonucleotide, die Ionenstärke und die Häufigkeit nicht gepaarter Basenpaare.
Der hier verwandte Ausdruck „Primer" bezieht sich auf ein natürliches oder synthetisch hergestelltes Oligonucleotid, das als Initiationspunkt für eine DNA-Synthese fungieren kann, unter Bedingungen, unter denen die Synthese eines Primer-Verlängerungsproduktes komplementär zu einem Nucleinsäurestrang induziert wird, d.h. in Anwesenheit der vier verschiedenen Nucleosidtriphosphate und einem Reagenz für die Polymerisation (DNA-Polymerase oder reverse Transcriptase) in einem entsprechenden Puffer und bei einer geeigneten Temperatur. Ein Primer ist vorzugsweise ein einsträngiges Oligodesoxyribonucleotid. Die geeignete Länge eines Primers hängt von der Aufgabenstellung ab, typischerweise liegt sie im Bereich von 15 bis 35 Nucleotiden. Kurze Primer-Moleküle brauchen generell kühlere Temperaturen, um ausreichend stabile Hybrid-Komplexe mit der Matrize zu erzeugen.
Ein Primer braucht nicht die genaue Sequenz der Matrize zu haben, muss jedoch in genügendem Maße komplementär sein, um mit der Matrize hybridisieren zu können. Primer können zusätzliche Merkmale tragen, die ein Wiederauffinden oder eine Immobilisation der Primer ermöglichen, die aber zu keiner Beeinträchtigung der Hauptaufgabe der Primer, nämlich der Initiationspunkt einer DNA-Synthese zu sein, führen dürfen. Zum Beispiel können nichtkomplementäre Sequenzen am Ende eines Primers lokalisiert sein, um Schnittstellen für Restriktionsenzyme bereitzustellen, die bei der Clonierung einer amplifizierten Sequenz nützlich sind.
Die hier benutzten Ausdrücke „stromaufwärts" und „stromabwärts" beziehen sich auf die Lage der Primer-Bindungsstellen entlang der Zielsequenz. Der stromaufwärts liegende Primer hybridisiert mit dem nicht-codierenden Strang der Zielsequenz und bildet daher das 5'-Ende der amplifizierten Sequenz, die eine Subsequenz des codierenden Stranges der Zielsequenz ist. Entsprechend hybridisiert der stromabwärts liegende Primer mit dem codierenden Strang der Zielsequenz und bildet daher das 5'-Ende der amplifizierten Sequenz, die eine Subsequenz des nicht-codierenden Stranges der Zielsequenz ist.
Die hier benutzten Ausdrücke „Zielsequenz" und „Ziel-Nucleinsäuresequenz" beziehen sich auf einen Bereich des Oligonucleotides, der amplifiziert oder nachgewiesen werden soll, oder beides. Die Zielsequenz liegt zwischen den beiden Primersequenzen, die für die Amplifikation benutzt werden.
Der hier benutzte Ausdruck „thermostabile Nucleinsäure-Polymerase" bezieht sich auf ein Enzym, das, z.B. verglichen mit Nucleotid-Polymerasen von E. coli, relativ hitzestabil ist. Es katalysiert die Polymerisation von Nucleosidtriphosphaten. Im allgemeinen startet das Enzym die Synthese am 3'-Ende des an die Zielsequenz angehefteten Primers und setzt sie in Richtung 5'-Ende entlang der Matrize fort, bis die Synthese beendet ist.
Für die Verfahren der vorliegenden Erfindung werden spezielle Kombinationen einer DNA-Polymerase von Thermus thermophilus (Tth) und einer DNA-Polymerase von Thermotoga maritima (Tma), Pyrococcus-Art GB-D oder Thermococcus litoralis (Tli) verwendet.
Die hier benutzten Ausdrücke „ 3'-zu 5'-Nuclease-Aktivität" und „Korrekturlese-Aktivität" beziehen sich auf die Aktivität einer matrizenspezifischen Nucleinsäure-Polymerase, die nacheinander Nucleotide vom 3'-Ende eines Oligonucleotids entfernt.
Das Maß für diejenige Menge eines Enzyms, die benötigt wird, um Nucleinsäure mit einer bestimmten Rate zu synthetisieren, ist eine Einheit (Unit, U). Die hier benannten Aktivitäts-Einheiten entsprechen den Definitionen der jeweiligen Lieferanten der Polymerasen wie nachstehend aufgeführt. Da die Aktivitäten unter unterschiedlichen spezifischen Bedingungen untersucht werden können, kann man die Aktivität eines Enzymes nicht direkt mit der eines anderen Enzymes vergleichen.
Rekombinante DNA-Polymerasen von Thermus thermophilus (rTth) und Thermatoga maritima (UlTma) können über Perkin Elmer, Norwalk, CT bezogen werden. Eine Einheit (Unit) von rTth- oder UlTma^TM-DNA-Polymerase ist nach Definition des Lieferanten Perkin Elmer diejenige Menge des Enzymes, die in 30 Minuten bei 74°C 10 nMol dNTP in säureunlösliches Material einbaut, gemessen in einer 10-minütigen Inkubation in 50 μl Reaktionsgemisch bestehend aus den folgenden Reagenzien:
200 μM je von dATP, dGTP, dTTP
100 μM [α-32p]-dCTP (0.05 bis 0.1 Ci/mMol)
Aktivierte DNA von Lachsspermien
100 mM KCl
2,2 mM MgCl₂
25 mM TAPS [Natriumsalz der Tris-(hydroxymethyl)-methyl-amino-propansulfonsäure], pH 9,3 bei 25°C
1 mM beta-Mercaptoethanol
Rekombinante DNA-Polymerasen von Thermococcus litoralis (Vent_R ^® und Pyrococcus-Art GB-D (Deep Vent_R ^® können bezogen werden über New England Biolabs, Beverly, MA. Eine Einheit von Vent_R ^® oder Deep Vent_R ^® ist nach Definition des Lieferanten New England Biolabs diejenige Menge des Enzyms, die in 30 Minuten bei 75°C 10nMol dNTP in säureunlösliches Material einbaut. Das Reaktionsgemisch besteht dabei aus folgenden Reagenzien:
200 μM je von dNTP (dATP, dCTP, dGTP und ³H-dTTP)
0,2 mg/ml aktivierte DNA
10 mM KCl
10 mM (NH₄)₂SO₄
20 mM Tris-HCl, pH 8,8 bei 25°C
2 mM MgSO₄
0,1 % Triton X-100
Konventionelle Techniken aus der Molekularbiologie und der Mikrobiologie sowie rekombinante DNA-Techniken, die zu den Arbeitsverfahren des Fachgebietes gehören, sind vollständig in der Literatur dargestellt. Vgl. z.B. Sambrook, Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, Herausgeber, 1984); Nucleic Acid Hybridisation (B.D. Hames & S.J. Higgins, Herausgeber, 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal, 1984) und die Reihe Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.).
Die vorliegende Erfindung liefert verbesserte Verfahren und Reagenzien für die PCR-Amplifikation langer DNA-Zielsequenzen. Die PCR-Amplifikation für kurze Nucleinsäure-Sequenzen ist der Fachwelt gut bekannt und in den U.S. Patenten Nr. 4,683,195; 4,683,202 und 4,965,118 offenbart. Kommerzielle Lieferanten wie Perkin Elmer, Norwalk, CT, verkau fen PCR-Reagenzien und veröffentlichen PCR-Protokolle. Zum besseren Verständnis der Vorteile, die die vorliegende Erfindung bietet, wird im folgenden eine Zusammenfassung der PCR gegeben.
In jedem Zyklus einer PCR-Amplifikation wird eine doppelsträngige Zielsequenz denaturiert, Primer werden an jeden der beiden Stränge der denaturierten Zielsequenz angelagert, um dann durch die Tätigkeit einer DNA-Polymerase verlängert zu werden. Typischerweise wird dieser Vorgang 25 bis 40 Mal wiederholt. Die beiden Primer lagern sich an die gegenüberliegenden Enden der Ziel-Nucleinsäuresequenz, und sind so ausgerichtet, dass das Verlängerungsprodukt eines jeden Primers eine komplementäre Kopie der Zielsequenz ist und nach Abspaltung von seinem Komplement mit dem anderen Primer hybridisieren kann. Jeder Zyklus würde, wäre seine Effektivität 100%, eine Verdoppelung der Zahl der Zielsequenzen bewirken.
Um eine effiziente PCR-Amplifikation von langen Zielsequenzen zu erhalten, müssen mehrere Forderungen erfüllt werden. Erstens müssen die Zielsequenzen vollständig denaturiert werden. Mit zunehmender Länge enthalten die Sequenzen oft GC-reiche Abschnitte, die aufgrund ihrer relativ hohen Schmelztemperaturen zu einer unvollständigen Denaturierung neigen. Eine unvollständige Trennung der Stränge erlaubt eine schnelle Renaturierung der Ziel-DNA, möglicherweise werden die Primer an einer Anlagerung und Verlängerung gehindert. Zweitens müssen die Zeiten für eine Verlängerung ausreichend bemessen sein, um eine vollständige Strang-Synthese in jedem PCR-Zyklus zu gewährleisten. Drittens müssen die langen Ziele vor einem Abbau während der Amplifikation geschützt werden. Lange Ziele sind unter. PCR-Bedingungen empfindlicher gegenüber Abbau und Bruch der Stränge. Die Unversehrtheit der Ausgangsmatrize und das Überleben der gebildeten Stränge während der PCR sind daher wichtige Gesichtspunkte. Mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung sollen diese Forderungen für lange PCR erfüllt werden, ohne weder die Aktivität der Polymerse noch die für Einzelkopie-Gen-Amplifikationen von genomischer DNA notwendige Spezifität zu beeinträchtigen.
Verbesserung der Zielstrang-Trennung, Ausdehnung der Verlängerungszeiten und Schutz der Matrizen-DNA vor einem Abbau während der Temperatur-Zyklen vergrößert die maximale Amplifikationslänge der Zielsequenzen ganz erheblich, sind aber nicht ausreichend, um eine, effiziente Amplifikation der Zielsequenzen zu erzielen. Der limitierende Faktor bei der Amplifikation langer Zielsequenzen im Bereich von 23–42 kb ist die Genauigkeit der Nucleinsäuresynthese.
Der falsche Einbau von Nucleotiden während der Synthese der Primer-Verlängerungsprodukte begrenzt die Länge des Zieles, das erfolgreich amplifiziert werden kann. Die Auswirkungen auf die Primer-Verlängerung durch den Einbau einer 3'-Endbase, die nicht mit der Matrize übereinstimmt, wird in Huang et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20:4567–4573 beschrieben. Die Anwesenheit von falsch eingebauten Nucleotiden kann zu einer vorzeitig abgebrochenen Strang-Synthese führen, was wiederum die Anzahl der Matrizenstränge für weitere Runden der Amplifikation verringert, und damit die Gesamtausbeute der Amplifikation langer Ziele. Selbst ein geringer Prozentsatz falsch eingebauter Nucleotide kann für Sequenzen, die länger als 10 kb sind, kritisch werden.
Die Genauigkeit bei der DNA-Synthese wird verbessert, wenn man eine geringe Menge einer thermostabilen 3'-zu 5'-Exonuclease- oder „Korrekturlese"-Aktivität zusätzlich zur DNA-Polymerase zum Reaktionsgemisch dazu gibt. Die Korrekturlese-Aktivität verbessert offensichtlich die Ausbeute an langen Produkten dadurch, dass falsch eingebaute Nucleotide entfernt werden und der komplette Strang von der vorherrschenden Polymeraseaktivität synthetisiert werden kann. Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf spezifische Gemische thermostabiler DNA-Polymerasen, die die maximale amplifizierbare Länge der Sequenz wesentlich erhöhen, indem sie sowohl 3'-zu 5'-Exonuclease- als auch Polymerase-Aktivität bereitstellen.
Aktivität einer korrekturlesenden Exonuclease konnte in der Tth-DNA-Polymerase nicht nachgewiesen werden (Myers and Gelfand, 1991, Biochemistry 30:7661–7666), ist aber sehr wohl enthalten in den DNA-Polymerasen von Thermococcus litoralis (NEB Transcript (1991) Band 3, Nr. 1, XP000391405), Pyrococcus-Art GB-D und Thermatoga maritima. Trotzdem ist eine Amplifikation langer Ziele mit Vent_R ^®-DNA-Polymerasen allein nicht so effizient wie mit einer Tth-DNA-Polymerase, die keine 3'-zu 5'-Exonuclease-Aktivität aufweist. Die geringere Amplifikations-Effizienz beruht vermutlich, zumindest zu einem Teil, auf einem Abbau der Primer und einer Abnahme der Gesamtprozessierbarkeit, die von einer Konkurrenz zwischen der 3'-zu 5'-Exonuclease- und der Polymerase-Aktivität herrührt.
Die relativen Anteile der Aktivitäten von 3'-zu 5'-Exonuclease und Polymerase können durch das Mischen von DNA-Polymerasen kontrolliert werden. Mit der Zugabe einer kleinen Menge einer sekundären Polymerase, die eine Korrekturlese-Aktivität besitzt, wie etwa Tli-DNA-Polymerase, zu einer aktiven primären Polymerase, wie etwa Tth-DNA-Polymerase, kann der Vorteil einer Korrekturlese-Aktivität mit der großen Aktivität der DNA-Polymerase, die der primären Polymerase eigen ist, verbunden werden.
Nahezu alle Aspekte der PCR-Protokolle beeinflussen die Effizienz der Amplifikation längerer Zielsequenz-Moleküle. Verlängerungszeiten, Co-Lösungsmittel und die Polymerasen (mit oder ohne 3'-zu 5'- Exonuclease-Aktivität) sind die kritischsten Parameter, jedoch sind auch der pH-Wert, die Zusammensetzung der Reaktionspuffer, die Salze (K⁺ und Mg²⁺) und die richtige Wahl der Primer wichtige Variablen für eine erfolgreiche Amplifikation langer Zielsequenzen. Die Auswirkungen der einzelnen Komponenten einer PCR-Amplifikation auf die Effizienz der Amplifikation langer Zielsequenzen wird im folgenden beschrieben.
Temperaturzyklus
Die hier dargelegten Amplifikationsschritte verwenden einen zweistufigen Temperatur-Zyklus, in dem die Reaktionstemperatur zwischen einer hohen Temperatur, bei der die Ziel-Nucleinsäure denaturiert wird, und einer niedrigeren Temperatur, bei der sich die Primer an die denaturierten Ziel-Sequenzen anlagern, wechselt, und die Primer-Verlängerung stattfindet. Zeitraum und Temperatur jedes einzelnen Schrittes in jedem einzelnen Zyklus beeinflusst die Effizienz der Amplifikation.
Mit steigender Denaturierungstemperatur steigt auch der Grad der Denaturierung der Zielsequenz. Die Erhöhung der Denaturierungstemperatur kann jedoch auch höhere Schadensraten nach sich ziehen, etwa eine Depurinierung, die den Amplifikationserfolg schmälert, oder einen erhöhten Verlust der Polymerase-Aktivität. Obwohl einerseits eine vollständige Denaturierung der Ziel-Nucleinsäure-Sequenz erreicht werden soll, müssen andererseits gleichzeitig die Schäden an der Zielsequenz möglichst gering gehalten werden. Folglich werden moderate Denaturierungstemperaturen bevorzugt (z.B. etwa 94°C, abhängig vom GC-Gehalt), wobei die Vollständigkeit der Denaturierung durch die Zugabe bestimmter Co-Lösungsmittel verbesssert wird, wie im folgenden beschrieben.
Eine relativ hohe Anlagerungstemperatur (z.B. etwa 68°C) reduziert die Hybridisierung der Primer mit teilweise homologen Ziel-Sequenz-Abschnitten. Gleichzeitig wird dadurch die Synthese von Produkten sekundärer Anlagerungsstellen minimiert. Bei Amplifikationen mit Lambda-DNA-Zielsequenzen, wie in den Beispielen beschrieben, ist mindestens eine Temperatur von 68°C über den Zeitraum von 5–6 Minuten notwendig. Das Einfügen eines stringenten Anlagerungsschrittes bei 70–75°C verbessert die Ausbeuten nicht wesentlich. In ähnlicher Weise haben auch komplexere Temperaturprofile mit Höchsttemperaturen zur Anpassung möglicherweise problematischer GC- oder AT-reicher Strangbereiche keine signifikanten Verbesserungen gebracht.
Auch der Verlängerungszeitraum, der die vollständige Strang-Synthese erlaubt, ist eine kritische Größe, wenn man lange Zielsequenzen erfolgreich amplifizieren will. Für die Amplifikation von Zielsequenzen, die länger als 20 kb sind, hat sich eine Anlagerungs- und Verlängerungszeit von mindestens 12 Minuten, aber nicht mehr als 22 Minuten in jedem Zyklus als vorteilhaft erwiesen. Die Mindestverlängerungsdauer hängt von anderen Faktoren ab, etwa der Konzentration der Co-Lösungsmittel, wie im folgenden noch ausgeführt. Bei Amplifikationsreaktionen, in denen man für den ersten Verlängerungszeitraum eine Reaktionsdauer von etwa 12 Minuten wählt und diese Zeit in den folgenden Zyklen um jeweils 15–20 Sekunden pro Zyklus verlängert, erhält man weniger unspezifische Produkte, als wenn man während der gesamten Amplifikation jeweils eine Dauer von mehr als 15 Minuten ansetzt. Die von Perkin Elmer, Norwalk, CT, vertriebene automatische Anlage zur Amplifikation ermöglicht auf einfache Weise, die jeweiligen Verlängerungszeiten während einer Amplifikation zu erhöhen.
Reduzierung der Amplifikation von nicht-spezifischen Zielsequenzen
Klassischerweise werden die PCR-Reagentien vor dem ersten Denaturierungsschritt bei Zimmertemperatur zusammengegeben. Bei der niedrigen, weniger stringenten Temperatur können die Primer sowohl untereinander als auch mit teilweise homologen Abschnitten der Zielsequenz Bindungen eingehen. Diese unspezifischen Primerbindungen können zu Verlängerungsprodukten führen, die kurze Produkte ergeben, die sehr erfolgreich mit der eigentlichen Zielsequenz konkurrieren und dadurch den Erfolg der gewünschten Amplifikation langer Sequenzen erheblich mindern. Ein „Heiß-Start"- Verfahren minimiert die Synthese von Primerverlängerungsprodukten unspezifischer Primer-Hybridisierungen, durch Hemmung von Ver längerungsreaktionen, bis die Reaktionstemperatur hoch genug ist, um solche unspezifischen Bindungen nicht zustande kommen zu lassen. Da man davon ausgehen kann, dass genomische Matrizen Sequenzen beinhalten, die teilweise homolog mit Zielprimersequenzen sind, ist ein heißer Start wichtig für den Erfolg bei der Amplifikation langer Zielsequenzen.
Eine Methode für einen erfolgreichen Heiß-Start beinhaltet das Zurückhalten einer wesentlichen PCR-Reaktionskomponente, bis die Temperatur des Amplifikationsgemisches 75–80°C erreicht hat. Man kann zum Beispiel die DNA-Polymerase zurückhalten oder Mg²⁺, das ein wesentlicher Katalysator der DNA-Polymerase-Aktivität ist. In einem Heiß-Start-Ansatz werden die wesentlichen Komponenten per Hand zugegeben, nachdem die Denaturierungstemperatur erreicht worden ist. Man kann die wesentlichen Reaktionskomponenten auch zurückhalten, indem man die Komponenten in einem Reaktionsgefäß zunächst durch eine hitzelabile Barriere voneinander getrennt hält, etwa durch Wachs, das bei Erreichen der Reaktionstemperatur schmilzt. Auf diese Weise lässt sich die Anzahl des wiederholten Öffnens des Reaktionsgefäßes minimieren, wodurch die Möglichkeit einer Verunreinigung gering gehalten wird.
Ein anderer Heiß-Start-Ansatz, der bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung von Nutzen sein kann, verwendet Uracil-N-glycosylase, die alle unspezifischen Produkte abbaut, die vor Erreichen der eigentlichen Amplifikationsgemischtemperatur gebildet werden (vgl. PCT-Patent-Veröffentlichung Nr. WO 92/01814).
PCR-Reagenzien
In einer PCR findet die Primer-Verlängerungsreaktion statt, wenn das Primer-Matrizen-Gemisch unter geeigneten Polymerisationsbedingungen mit einer DNA-Polymerase inkubiert wird. Diese Bedingungen sind gegeben, wenn das Reaktionsgemisch ein bivalentes Kation, ein monovalentes Kation, alle vier Desoxyribonucleotid-Triphosphate (dNTPs) und einen Puffer enthält. Co-Lösungsmittel, die die Denaturierungsreaktion beeinflussen, können zum Reaktionsgemisch hinzugegeben werden. Jeder dieser Komponenten beeinflusst die Effizienz der Verlängerungsreaktion und wird im folgenden gesondert besprochen.
DNA-Polymerase
Die Auswahl der Kombination von thermostabilen DNA-Polyrnerasen und deren Konzentration ist von entscheidender Bedeutung, wenn die Länge oder Komplexität der Zielsequenz zunimmt. Mit der Kombination von Tth-DNA-Polymerase und Tli-DNA-Polymerase erhält man die beste Ausbeute bei der Amplifikation langer PCR-Produkte, dabei sind Amplifikationen von Sequenzen von über 40 kb möglich.
Die optimale Menge von DNA-Polymerase in einer PCR-Amplifikation hängt von einer Reihe von Faktoren ab, einschließlich der Anzahl der Kopien der Zielsequenzen in der Probe. Liegt eine große Anzahl von Kopien vor (10⁷ Kopien der Zielsequenz), erhält man eine höhere Ausbeute bei einer Dosierung von 2–2,5 Einheiten (Units, U) Tth-DNA-Polymerase pro 50 μl Reaktionsgemisch. Eine weitere Erhöhung der Polymerase-Konzentration führt zu einem Anstieg der Amplifikation unspezifischer Zielmoleküle, die sich in höheren Hintergrundniveaus bemerkbar machen, wenn die amplifizierten Produkte mittels Agarose-Gelelektrophorese nachgewiesen werden. Bei einer geringen Anzahl von Kopien (10⁴ Kopien der Zielsequenz) erhält man eine maximale Spezifizierung bei etwa 0,8–1 U Tth-DNA-Polymerase pro 50 μl Reaktionsgemisch. Bei einer mittleren Kopienzahl von Zielsequenzen werden maximale Ausbeuten bei mittleren Polymerasekonzentrationen erreicht. Die optimale Polymerase-Konzentration hängt auch von der Konzentration des bivalenten Kations ab. Bei höheren Mg²⁺-Konzentrationen wurden die Polymerase-Konzentrationen reduziert, um die Akkumulation unspezifischer Produkte zu minimieren.
Wurde bei der PCR Tth-DNA-Polymerase allein verwendet, ergab sich bei Proben mit einer großen Anzahl von Kopien von Lambda-Phagen-DNA eine maximale Länge der Zielsequenz, die noch amplifiziert wurde, von etwa 23 kb. In ähnlicher Weise war die maximale amplifizierbare Länge von Zielsequenzen bei einer geringen Anzahl von Kopien von Lambda-Phagen-DNA-Proben auf etwa 10–12 kb beschränkt. Dramatische Verbesserungen in der Länge der amplifizierbaren Zielsequenzen ergaben sich durch die Zugabe einer geringen Menge von thermostabiler 3'-zu 5'-Exonuclease.
Wie vorstehend beschrieben, findet man in der Tth-DNA-Polymerase keine 3'-zu 5'-Exonuclease-Aktivität. Die Aktivität des Korrekturlesens ergibt sich erst bei der Kombination von Tth-DNA-Polymerase mit einer geringen Menge thermostabiler DNA-Polymerase, die die Korrekturlese-Aktivität besitzt, etwa DNA-Polymerasen von Thermococcus litoralis, Pyro coccus-Art GB-D und Thermotoga maritima. Niedrige Konzentrationen einer dieser DNA-Polymerasen bewirken, dass längere Zielsequenzen mit der PCR amplifiziert werden können als nur mit der Tth-DNA-Polymerase allein. Eine Kombination von Tth- und Tli-DNA-Polymerasen hat sich als das verlässlichste und wirkungsvollste Verfahren erwiesen.
Das optimale Konzentrationsverhältnis liegt bei 0,015–0,15 U Tli-DNA-Polymerase pro 2–2,5 U Tth-DNA-Polymerase für Amplifikationen von Proben mit hoher Anzahl von Kopien (10⁷ Kopien der Zielsequenz in 50 μl Reaktionsgemisch). Für Amplifikationen von Proben mit einer geringen Anzahl an Kopien (10⁴ Kopien der Zielsequenz in 50 μl Reaktionsgemisch) beträgt die optimale Konzentration etwa 0,015–0,15 U Tli-DNA-Polymerase pro 0,8–1 U Tth-DNA-Polymerase. Höhere Konzentrationen von Tli-DNA-Polymerase reduzieren den Erfolg, vermutlich durch Primerabbau.
Co-Lösungsmittel
Ein Co-Lösungsmittel, wie etwa Glycerin, ist eine kritische Reaktionskomponente für die effiziente Amplifikation langer Zielsequenzen. Von einer Reihe von Co-Lösungsmitteln wird berichtet, dass sie die PCR erleichtern, darunter Glycerin, Dimethylsulfoxid (DMSO) Polyethylenglycol und Formamid. Ein Weg, wodurch ein Co-Lösungsmittel die Effizienz einer Amplifikation langer Zielsequenzen verbessern kann, besteht in der Verbesserung der thermischen Stabilität der DNA-Polymerase. Eine höhere thermische Stabilität verlangsamt den Verlust von DNA-Polymerase-Aktivität während der wiederholten Denaturierungsschritte bei hohen Temperaturen.
Ein anderer Effekt ist, dass ein Co-Lösungsmittel wesentlich die Schmelz- und Strangtrennungstemperatur herabsetzen kann, wodurch die Denaturierung der Matrize erleichtert wird und sich die Spezifität der Primer-Anlagerung erhöht. Die Schmelztemperatur kann zum Beispiel um 2,5–3°C verringert werden, wenn man 10% Glycerin zugibt. Auf diese Weise kann mit der Zugabe eines Co-Lösungsmittels die Vollständigkeit der Denaturierung der Zielsequenz erhöht werden, ohne dass die Denaturierungstemperatur angehoben werden muss, was, wie vorstehend dargelegt, gleichzeitig den Abbau der Zielsequenz-Moleküle fördern würde.
Ein Standard-Tth-PCR-Puffer enthält typischerweise 5% (v/v) Glycerin. Eine größere Menge Glycerin im Amplifikations-Reaktionsgemisch kann die Amplifikation langer Zielsequenzen signifikant verbessern. Signifikante Verbesserungen in der Ausbeute einer 9,4 kb-Zielsequenz sind auf die Ergänzung eines Standard-Tth-PCR-Puffers mit 5% (w/v) Glycerin zurückzuführen. Die angegebenen Prozentzahlen berücksichtigen nicht etwaige Glycerin-Zugaben durch die verschiedenen benutzten Enzym-Stammlösungen.
DMSO, vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 5–6% (v/v), kann auch allein verwendet werden. Kombinationen aus Glycerin und DMSO sind bei langen Zielsequenzen allerdings wirkungsvoller. Bevorzugte Konzentrationskombinationen beinhalten 5–14% (w/v) Glycerin mit 0,5–5% (v/v) DMSO. Zum Beispiel werden Amplifikationen von Lambda-Phagen-Zielsequenzen mit 25–34 kb Länge verbessert, wenn man 1–3% (v/v) DMSO mit 10% Glycerin zugibt oder 5% von beiden Co-Lösungsmitteln verwendet. Amplifikationen von Lambda-Phagen-Zielsequenzen mit 35–42 kb Länge können mit der Zugabe von 8–9% Glycerin und 5% DMSO am erfolgreichsten durchgeführt werden. Zusätzlich werden Zielsequenzen von bis zu 34 kb mit einer Kombination aus 3% DMSO und 10% Glycerin in einer Verlängerungszeit von 10 Minuten leicht amplifiziert. Bei einer Kombination von 1% DMSO und 10% Glycerin war die Amplifikation auf 26 kb Länge der Zielsequenz begrenzt. Eine bevorzugte Kombination besteht aus 10% Glycerin und 2,25% DMSO.
Im Unterschied zu Glycerin setzt DMSO die Thermostabilität der Polymerase herab. Trotzdem ist die effektive Erniedrigung der Schmelz- und Strangtrennungstemperatur um 5,5–6°C pro 10% DMSO wahrscheinlich der dominierende Faktor für die lange PCR. Die Zugabe von DMSO erhöht vermutlich auch die DNA-Stabilität durch eine Herabsetzung der Depurinierungsrate und/oder der Rate der Kettenbrüche und beschleunigt vermutlich die Strang-Renaturierung. Die Reduktion von Schmelz- und Strangtrennungstemperaturen durch die Kombination von Glycerin und DMSO stimmt generell mit der Gesamtreduktion überein, die sich aus einer Summierung der Effekte der einzelnen Komponenten allein ergeben würde. Die Verbesserung der Ausbeuten durch die wirksame Senkung der Schmelz- und Strangtrennungstemperaturen mit Hilfe der Zugabe eines Co-Lösungsmittels wird, wie vorstehend besprochen, durch eine Erhöhung der Denaturierungs- oder Anlagerungstemperatur während der PCR nicht leicht verdoppelt.
Puffer
Der pH-Wert eines Amplifikationsgemisches beeinflusst die Stabilität der Matrizen-DNA. Eine Erhöhung des pH-Wertes im Reaktionsgemisch kann den Abbau der Matrizen-DNA während der Temperaturzyklen vermindern. Obwohl PCR-Amplifikationsgemische pH- gepuffert sind, variiert der pH-Wert einer typischen PCR-Reaktion durch die Temperaturabhängigkeit der Reaktionspuffer erheblich während der Temperaturzyklen. Der normalerweise in einer PCR benutzte Puffer ist Tris, das einen pKa-Wert von –0,031 pro °C aufweist. Die Schwankungen des pH-Wertes während der Temperaturzyklen können durch die Verwendung eines Puffers mit einem kleinerem pKa-Wert vermindert werden.
Zwei geeignete Puffer sind Tris(hydroxymethyl)methylglycin (Tricin), das einen pKa-Wert von –0,021 pro °C hat, und N,N-Bis(hydroxyethyl)glycin (Bicin) mit einem pKa-Wert von –0,018 pro °C; beide Werte gemessen bei 20°C und einer Ionenstärke von 0,1M (vgl. Good and Izawa, 1972, Meth. Enzymol. 24, Teil B: 53–68). Bei Verwendung eines Tricin- oder Bicin-Puffers bleibt der pH-Wert bei den Reaktionsbedingungen mit hoher Temperatur höher als mit dem üblichen Tris-Puffer, und die Schwankungen im pH-Wert aufgrund der Temperaturzyklen sind geringer.
Optimale Puffer und pH-Werte sind unter anderem abhängig von der verwendeten DNA-Polymerase. Benutzt manTth-DNA-Polymerase, werden mit einem Puffer von 10–35 mM, vorzugsweise 20–25 mM, Tricin bei einem pH-Wert von 8,5–8,7 (25°C) die verlässlichsten Ergebnisse erzielt. Optimale Puffer-Bedingungen müssen am besten empirisch für die Amplifikation der spezifischen Zielsequenzen festgelegt werden.
Bivalentes Kation
Das bevorzugte bivalente Kation für eine DNA-Amplifikation ist Mg²⁺ Ohne eine hinzugefügte 3'-zu 5'-Exonucleaseaktivität wird die lange PCR am besten durch eine Gesamt- Mg²⁺-Konzentration von 1,72 mM vorangetrieben. In Anwesenheit einer Korrekturlese-Aktivität hingegen werden die höchsten Ausbeuten bei 0,9–1,3 mM Gesamtkonzentration Mg²⁺ erzielt. Bei einigen Zielsequenzen kann man eine noch höhere Ausbeute erhalten, wenn man die Mg²⁺-Konzentration bis auf 1,5 mM erhöht und gleichzeitig die Gesamt- Enzymkonzentration verringert, insbesondere die der primären Polymerasen (auf 1,25–2 U Tth-DNA-Polymerase). Bei einigen Zielsequenzen jedoch bewirkt eine Reduzierung der Gesamt-Enzymkonzentration, durch die man ja bei gleichzeitiger hoher Konzentration von Mg²⁺ die Produktion unspezifischer Produkte vermindern wollte, eine insgesamt geringere Ausbeute. Wie bei den nachstehend beschriebenen K⁺-Konzentarationen muss das Mg²⁺-Optimum möglicherweise für jedes System empirisch eingestellt werden.
Monovalentes Kation
Das bevorzugte monovalente Kation ist K⁺, in Form von KOAc (K-acetat) oder KCl. Für die Amplifikation längerer Zielsequenzen sind niedrigere K⁺-Konzentrationen von Vorteil. Eine Reduzierung des unspezifischen Hintergrundes kann erreicht werden, wenn K⁺ als KOAc statt als KCl bereitgestellt wird. Allgemein gilt, K⁺-Konzentrationen, die um 10–40% reduziert sind, sind vorteilhafter für eine lange PCR als die Standardkonzentrationen (100 mM KCl für Tth-DNA-Polymerase). Bevorzugte Konzentrationen bei Verwendung der Tth-DNA-Polymerase sind 60–100 mM KOAc, besonders 80–85 mM KOAc. Eine optimale Konzentration ist auch hier systemabhängig.
Für die Effizienz der PCR-Amplifikationen mit Tricin- oder Bicin-Puffer ist unerheblich, ob KCl oder KOAc als monovalentes Kation eingesetzt wird. Der Gebrauch von einem Tricin/KOAc-Puffer erhöht allerdings die Unempfindlichkeit der ablaufenden Reaktionen. Ein Tricin/KOAc-Puffer hat eine etwas geringere Ionenstärke als ein Tricin/KCl-Puffer, was dazu beitragen könnte, Sekundärstrukturen in einer Matrize mit hohem G+C-Gehalt zu destabilisieren, was wiederum die Vollständigkeit der Denaturierung der Zielsequenz-Stränge verbessert.
Obgleich KCl und KOAc die bevorzugten monovalenten Salze sind, können auch andere monovalente Salze für die Verfahren der hier vorliegende Erfindung nützlich sein, darunter NaCl, (NH₄)₂SO₄, K-Glutamat und NH₄-Acetat.
Primer
Primer-Konzentrationen müssen möglicherweise für jedes System und die ungefähre Anzahl von vorhandenen Matrizen-Kopien optimiert werden. Zum Beispiel war bei den in den nachstehend angeführten Beispielen beschriebenen Lambda-Phagen-Amplifikationen für die Amplikation von Proben mit einer hohen Kopienzahl von Zielsequenzen eine höhere Primer-Konzentration optimal als für die Amplifikation von Proben, die eine geringere Anzahl von Zielsequenz-Kopien enthielten. Für die Reaktionen mit einer hohen Anzahl von Kopien (10⁷ Kopien der Zielsequenz) lag die optimale Konzentration bei 0,4–0,5 μM für jeden Primer. Für die Amplifikation weniger Kopien (10⁴ Kopien der Zielsequenz) waren 0,15–0,2 μM für jeden Primer am effektivsten, wenn keine Korrekturlese-Aktivität vorhanden war, und 0,2 μM für jeden Primer war am besten, wenn eine 3'-zu 5'-exonucleolytische Aktivität vorhanden war. Bei Reaktionen mit mittlerer Anzahl an Kopien erwies sich eine Erhöhung der Primer-Konzentrationen auf über 0,2 μM für eine Erhöhung der Ausbeute als mindestens ebenso effektiv wie eine Erhöhung der DNA-Polymerase-Konzentrationen, wie bereits vorstehend diskutiert. Die verbesserten PCR-Protokolle, die die Amplifikation von Nucleinsäure-Sequenzen bis zu 42 kb Länge ermöglichen, sind in der untenstehenden Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1
Optimale Bedingungen für lange PCR
Temperaturprofil

25 bis 40 Amplifikationszyklen (abhängig von der Anzahl der Matrizen-Kopien) Zwei-Temperaturen-Zyklus: (a) Kurzer Denaturierungsschritt (z.B. 94°C für 10–15 Sekunden) (b) Langer Anlagerungs-/Verlängerungsschritt (z.B. 68°C für anfänglich 10–14 Minuten, dann um 15–20 Sekunden pro Zyklus verlängert, für mindestens 5–8 Zyklen) Abschließendes Halten auf 72°C für mindestens 10 Minuten

Heiß-Start
Zurückhalten von einem Reagenz (Mg²⁺, Enzym oder dNTPs), bis alle Proben eine Temperatur von 75–80°C erreicht haben, am besten durch eine Wachs-Trennschicht.
Primäre Polymerase

2,5 Einheiten Tth-DNA-Polymerase pro 50 μl für Matrizen mit hoher Anzahl von Ausgangskopien (10⁷ Kopien)
0,8-1 Einheiten) Tth-DNA-Polymerase pro 50 μl für Matrizen mit geringer Anzahl von Ausgangskopien (10⁴ Kopien)
3'- zu 5'-Exonuclease (für Matrizen mit hoher oder geringer Anzahl von Kopien) 0,015–0,15 Einheiten Tli-DNA-Polymerase pro 50 μl

Co-Lösungsmittel

5–14% Glycerin mit 0,5–5% DMSO

Puffer

20–25 mM Tricin oder Bicin, pH 8,5–8,7

Bivalentes Kation

0,9–1,5 mM Mg²⁺ gesamt, 0,2 mM Unterschiede können kritisch wirken

Monovalentes Kation

80–85 mM KOAc

Primer-Herstellung

Entweder 20–23 Bp mit 50–60% GC-Anteil oder längere Sequenzen, um eine relativ hohe Anlagerungstemperatur zu ermöglichen.

Primer-Konzentration

0,4–0,5 μM für Matrizen mit hoher Anzahl von Ausgangskopien (10⁷ Kopien)
0,15–0,2 μM für Matrizen mit geringer Anzahl von Ausgangskopien (10⁴ Kopien)

dNTP- Konzentration

0,2 mM jeweils für dATP, dCTP, dGTP, dTTP

Im allgemeinen wird die Nucleinsäure in der Probe DNA sein, in den meisten Fällen genomische DNA. Die vorliegende Erfindung kann jedoch auch bei anderen Nucleinsäuren, etwa RNA oder clonierter DNA angewendet werden, und die Nucleinsäure kann als Einzelstrang oder als Doppelstrang in der Probe vorliegen und dennoch für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignet sein. Fachleute nehmen zur Kenntnis, dass, wie auch immer die Nucleinsäure beschaffen ist, sie mit geeigneten Modifikationen der vorgestellten Verfahren amplifziert werden kann.
Aufgrund der enormen Amplifikationsmöglichkeiten mit der PCR können schon geringe DNA-Verunreinigungen, etwa mit DNA aus einer hochkonzentrierten DNA-Probe, von Positiv-Kontroll-Matrizen oder von vorausgegangenen Amplifikationen, PCR-Produkte erzeugen, selbst wenn keine absichtlich hinzugefügte Matrizen-DNA in der Probe vorhanden ist. Wenn möglich sollten daher alle Reaktionsgemische räumlich getrennt von der PCR-Analyse und der Probenvorbereitung angesetzt werden. Die Benutzung von gekennzeichneten oder Einmal-Gefäßen, Lösungen und Pipetten (vorzugsweise Verdrängungspipetten) für RNA/DNA-Präparation, Reaktionsgemische und Probenanalyse minimieren eine gegenseitige Verunreinigung. Vgl. auch Higuchi und Kwok, 1989, Nature 339:237–238; und Kwok, und Orrego in Innis et al., Herausgeber, 1990 PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., San Diego, CA.
Enzymatische Verfahren zur Verringerung des Problems einer PCR-Verunreinigung durch die amplifizierte Nucleinsäure aus vorhergehenden Reaktionen sind in der PCT-Patent-Veröffentlichung Nr. WO 92/01814 und dem U.S. Patent Nr. 5,035,996 beschrieben. Die Verfahren erlauben den enzymatischen Abbau jeder amplifizierter DNA aus vorausgegangenen Reaktionen. PCR-Amplifikationen werden in Gegenwart von dUTP anstatt dTTP durchgeführt. Das daraus resultierende doppelsträngige Amplifikationsprodukt, das Uracil enthält, wird von der Uracil-N-glycosylase (UNG) angegriffen, während eine normale Thyminenthaltende DNA nicht von UNG angegriffen wird. Amplifikationsreaktionsgemische werden vor der Amplifikation mit UNG behandelt, um alle Uracil-haltige DNA auszuschalten, die als Ziel fungieren könnte. Weil die einzige Quelle einer Uracil-haltigen DNA das amplifizierte Produkt aus einer vorhergehenden Reaktion sein kann, verhindert dieses Verfahren effektiv das Problem der Verunreinigung durch vorhergehende Reaktionen (Carry-over). UNG wird durch Hitze zeitweise inaktiviert, so dass die Denaturierungsschritte des Amplifikationsprozesses gleichzeitig auch dazu dienen, die UNG zu inaktivieren. Neue Amplifikationsprodukte werden demzufolge, obwohl sie Uracil einbauen, in einer UNG-inaktivierten Umgebung gebildet und daher nicht abgebaut.
Die Analyse der amplifizierten Produkte kann auf verschiedene Art und Weise durchgeführt werden, abhängig von der jeweils gewünschten Information. Die Nucleotidsequenz der amplifizierten Produkte kann durch Standard-Techniken ermittelt. werden, wie sie bei Innis et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9436–9440 beschrieben werden. Die PCR-Amplifikationsprodukte können direkt sequenziert werden (vgl. Saiki et al., 1988, Science 239:487–491) oder indirekt, indem man sie zunächst cloniert, und sie sich dann in einer geeigneten Wirtszelle replizieren lässt.
Mit den Verfahren für Nachweis und Reinigung amplifizierter Nucleinsäure-Sequenzen ist die Fachwelt wohlvertraut (vgl. Sambrook et al., 1989, siehe oben). Zur Reinigung der amplifizierten Nucleinsäuren können Verfahren angewendet werden, die die Moleküle nach ihrer Größe trennen, zum Beispiel die Gelelektrophorese. Besonders die Agarose- und/oder Acrylamid-Gelelektrophorese eignen sich zur Analyse amplifizierter Produkte (vgl. Scharf et al., 1986, Science 233:1076–1078). Für eine bessere Größenauflösung können entweder die Feldinversion-Gelelektrophorese oder die niedrigprozentige (0,3%) Agarose-Gelelektrophorese angewendet werden, wie in den Beispielen beschrieben.
Amplifizierte Produkte können durch direkte Anschauung ausgewertet werden, indem man die elektrophoretisch nach Größe aufgetrennten Produkte anfärbt, zum Beispiel mit Ethidiumbromid. Alternativ kann man Oligonucleotid-Hybridisierungssonden einsetzen, die kom plementär zur Zielsequenz sind, um amplifizierte Produkte nachzuweisen. Unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen lagern sich die Sonden nur an die Ziel-Nucleinsäuresequenzen an. Die Anwesenheit hybridisierter Doppelstränge, die dann durch zahlreiche Verfahren nachgewiesen werden können, belegt die Anwesenheit amplifizierter Produkte. Um den Nachweis hybridisierter Doppelstränge aus Sonde und gesuchter Nucleinsäure-Sequenz zu erleichtern, können entweder die Primer oder die Sonden mit zusätzlichen Molekülen versehen werden, etwa einem nachweisbaren Marker oder einem Molekül, das Primer oder Sonde immobilisiert. In die Sonden eingebaute Marker zum Nachweis oder zur Immobilisierung sollten die Hybridisierungseigenschaften der Sonden allerdings nicht beeinträchtigen.
Zur Kennzeichnung der Sonden eignen sich Marker, die sich mit spektroskopischen, photochemischen, biochemischen, immunochemischen oder chemischen Verfahren nachweisen lassen. Geeignete Marker sind zum Beispiel ³²P, fluoreszierende Farbstoffe, elektronendichte Reagenzien, Enzyme (wie üblicherweise in ELISAs verwendet), Biotin oder Haptene oder Proteine, für die Antiseren oder monoclonale Antikörper verfügbar sind. Die Sonden können auch an zusätzliche Verbindungen gebunden werden, die die Sonde an einer festen Phase fixieren.
Markierte Sonden können durch die oben beschriebenen Techniken zur Herstellung von Oligonucleotiden synthetisiert und markiert werden. Zum Beispiel kann eine Sonde am 5'-Ende mit ³²P markiert werden, indem man sie mit ³²P-ATP und einer Kinase inkubiert. Ein geeigneter nicht-radioaktiver Marker für SSO-Sonden ist Meerrettich-Peroxidase (HRP). Verfahren zur Herstellung und zum Nachweis von Sonden mit diesem Marker werden in den U.S. Patenten Nr. 4,914,210 und 4,962,029 beschrieben. Die Verwendung von solchermaßen markierten Sonden wird ebenfalls im U.S. Patent Nr. 4,789,630 beschrieben; Saiki et al., 1988, N. Eng. J. Med. 319:537–541; und Bugawan et al.,1988, Bio/Technology 6:943–947. Geeignete Farbstoffe für den Nachweis von HRP-markierten Sonden sind zum Beispiel Red leuco dye und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB).
Eine zusätzliche Verbindung, die in die Sonden eingebaut werden kann, um eine Immobilisierung der Sonde zu erreichen, ist zum Beispiel ein langer Poly-dT „Schwanz", der durch Bestrahlung auf einem Nylon-Untergrund fixiert werden kann; eine Technik, die im einzelnen in der PCT-Patent-Veröffentlichung Nr. WO 89/11548 beschrieben ist.
Geeignete Verfahren, Hybride zwischen Sonde und gesuchter Nucleinsäure-Sequenz in einer Probe nachzuweisen, sind in der Fachwelt bekannt (Sambrook et al., 1985, siehe oben). Sie umfassen zum Beispiel den Dot-Blot- und den Revers-Dot-Blot-Test.
In einem Dot-Blot-Format wird die unmarkierte amplifizierte Ziel-DNA auf einem festen Untergrund, etwa einer Nylonmembran, fixiert. Der Membran-Zielsequenz-Komplex wird mit einer markierten Sonde unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen inkubiert, nicht hybridisiertes Sondenmaterial wird durch Waschen unter geeignet stringenten Bedingungen entfernt, worauf die Membran auf die Anwesenheit von gebundenem Sondenmaterial untersucht werden kann.
Eine andere Untersuchung ist ein „umgekehrtes" Dot-Blot-Format, in dem die amplifizierte Ziel-DNA markiert wird und die Sonden auf einem festen Untergrund, etwa einer Nylon-Membran, fixiert sind. Die Ziel-DNA wird üblicherweise während der Amplifikation durch den Einbau von markierten Primern markiert. Der Membran-Sonden-Komplex und die markierte Probe werden unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen inkubiert, nichthybridisiertes Probenmaterial wird durch Waschen unter geeignet stringenten Bedingungen enfernt, worauf der Filter auf die Anwesenheit von gebundener Ziel-DNA untersucht wird.
Alternativ kann der Revers-Dot-Blot-Test auch durchgeführt werden, indem man einen festen Träger mit einer Vielzahl von Hybridisierungsstellen oder Vertiefungen benutzt. Zum Beispiel ist eine Mikrotiter-Platte besonders sinnvoll für die in großem Umfang durchgeführten klinischen Anwendungen der vorliegenden Verfahren. Ein Revers-Dot-Blot-Test mit Verwendung einer Mikrotiter-Platte wird bei Loeffelholz et al., 1992, in J. Clin. Microbiol. 30 (11):2847-2851 beschrieben. Sonden können durch passive Bindung direkt an der Mikrotiter-Platte fixiert werden, oder sie werden zunächst an Rinderserumalbumin (BSA) gebunden, das sich an den Mikrotiter-Platten anlagert.
Ein weiteres geeignetes Untersuchungssystem ist im U.S. Patent Nr. 5,210,015 beschrieben, bei dem eine markierte Sonde während des PCR-Amplifikationsprozesses zugegeben wird. Die Sonden sind so modifiziert, dass sie nicht als Primer für eine DNA-Synthese wirken können. Jede Sonde, die während jedes Synthese-Schrittes mit der Ziel-DNA hybridisiert, wird durch die 5'-zu 3'-Exonuclease-Aktivität der DNA-Polymerase abgebaut. Die Abbauprodukte der Sonde werden dann nachgewiesen. Die Anwesenheit von Abbauprodukten der Sonde belegt, daß Hybridisierung zwischen Sonde und Ziel-DNA stattgefunden hat.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Kits, Einheiten mit mehreren Behältern, die hilfreiche Komponenten zur Anwendung der beschriebenen Verfahren darstellen. Ein Kit enthält eine Kombination der bevorzugten Polymerase-Enzyme in den Konzentrationsverhältnissen, wie sie hier beschrieben sind. Zusätzliche Komponenten, die in einem sinnvollen Kit zusammengestellt sein können, umfassen Primer für die PCR-Amplifikation und Reagenzien für die Durchführung der PCR-Verfahrenn wie sie in der vorliegenden Erfindung beschrieben werden.
Die Fähigkeit, Sequenzen von 10 bis 40 kb zu amplifizieren, findet zahlreiche Anwendungen in Gebieten wie etwa Genomkartierung, Sequenzierung oder in der Genetik. Kleine Lücken in den Genkartierungen, die sich bisher als resistent gegenüber dem molekularen Clonen erwiesen haben, können vielleicht über die Amplifikation einer Sequenz, die von bekannten Sequenzen flankiert wird, zugänglich gemacht werden. Die Amplifikation längerer Zielsequenzen erlaubt außerdem eine größere Flexibilität in der Wahl der Primer, um problematische Sequenzen zu vermeiden, so wie in dem Betaglobin-Gensystem, das nachstehend beschrieben ist. Von der Verwendung längerer Matrizen verspricht man sich durch die Abdeckung eines größeren Bereiches bei jedem Sequenzierungsschritt auch eine Beschleunigung der Genomsequenzierung. Ausgehend von bekannten Sequenzen können Amplifikationen nun längere Introns umspannen, und vollständigere Gensequenzen können in einem Schritt amplifiziert werden. Die lange PCR vervollständigt daher die Technologie für eine schnelle, größere Abschnitte umfassende Sequenzierung. Auch eine auf der PCR basierende Charakterisierung und Diagnose von homozygoten und heterozygoten Trägern von einer Reihe von medizinisch bedeutsamen Insertionen und Deletionen mit einer Länge von mehr als 4 kb wird möglich.
Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen besonders die vielfältigen Möglichkeiten bei der Anwendung dieser Verfahren für die Charakterisierung clonierter Sequenzen. Die nachstehend beschriebenen J- und cro- Gen-Primer, CF1018 (SEQ ID NO:23) und CF1019 (SEQ ID NO:24) sollten für nahezu alle Insertionen, die mit Lambda-basierenden Vektoren cloniert sind, nützlich sein, für Amplifikationen sowohl von Plaques als auch von isolierter DNA. Die PCR-Produkte werden vollständig durch Restriktionsabbau analysiert und sollten für die Se quenzierung geeignet sein. Cosmid-Insertionen können gleichfalls von Kolonien amplifizierbar sein. Die lange PCR wird das molekulare Clonieren erleichtern, weil bereits wenige Kopien amplifiziert werden können, und auch die Zusammenlagerung längerer rekombinanter Konstrukte in der PCR-basierenden Mutagenese wird erleichtert.
Die im folgenden angeführten Beispiele in der vorliegenden Erfindung dienen lediglich der Erläuterung und sollen nicht den Umfang der Erfindung begrenzen.
Beispiel 1
Material und Verfahren
Im folgenden werden bevorzugte Verfahrensweisen und Reagenzien für die PCR-Amplifikation von langen Lambda-Phagen- und menschlichen Betaglobin-Genkomplex-Sequenzen beschrieben. Die Ergebnisse der Amplifikationen mit den folgenden Verfahren sind in den darauffolgenden Beispielen beschrieben.
Ziel-Nucleinsäure-Sequenzen
Zwei Matrizen-Nucleinsäure-Sequenzen wurden zur Herstellung der nachstehend beschriebenen Amplifikations-Primer benutzt: die Sequenz des Lambda-Phagen-Genoms (GenBank Zulassungsnummer M17233) und die Sequenz des menschlichen Betaglobin-Genkomplexes (GenBank Zulassungsnummer J00179). Lambda-Phagen- und menschliche DNA wurden für die nachstehend beschriebenen Amplifikationen verwendet.
Lambda-DNA (1 ng/μl) wurde von Perkin Elmer, Norwalk, CT bezogen. Aliquots (~100 ng) von Lambda-DNA wurden einmal aufgetaut und dann bei 4°C gelagert. Vollständige genomische DNA aus der menschlichen Plazenta wurde von Sigma Chemicals, St. Louis, MO bezogen. Alle Verdünnungen von Matrizen-DNA wurden mit 10 mM Tris·Cl (pH 8 bei 25°C), 0,1 mM EDTA angesetzt.
Eine Bibliothek von menschlichen genomischen Clonen in Lambda-FIX II wurde von Stratagene, La Jolla, CA bezogen, und wie vom Hersteller empfohlen, auf Luria Broth-Agarplatten mit Top-Agarose weitergezüchtet. Per Zufall ausgewählte Plaques wurden mit Hilfe von sili konisierten Pasteurpipetten entnommen, in 30 μl 25 mM Tris·Cl (pH 8,3), 10 mM MgCl₂ gegeben und bei 4°C gelagert. Mengen von 1 μl wurden jeweils für die PCR verwendet.
Vollständige genomische DNA einer lymphoblastoiden Zelllinie (KAS011B) wurde isoliert mit Hilfe von 0,1 mg/ml Proteinase K und 0,5% SDS in 10 mM Tris·Cl (pH 8), 150 mM NaCl und 10 mM EDTA, über Nacht bei 50°C. Es folgte eine Extraktion mit Tris-gesättigtem Phenol (pH 8), eine Ethanol-Fällung mit NaOAc; die Probe wurde mit RNase A versetzt, dann mit Phenol-Chloroform extrahiert und gegen 10 mM Tris·Cl (pH 8), 1 mM EDTA dialysiert.
Primer
Es wurde ein Satz von Primern hergestellt, um die PCR-Amplifikation von Lambda-Genom-Zielsequenzen in der Größenordnung von 1,5 bis 42,2 kb durchführen zu können. Es wurden stromaufwärts liegende Primer hergestellt, um sie mit jedem der stromabwärts liegenden Primer einsetzen zu können. Im Ergebnis wurden eine Reihe von Zielsequenzen erhalten, die in der Länge um 1 bis 3 Kilobasen zunahmen.
Jeder Primer des Satzes wurde so hergestellt, dass er in etwa die gleiche optimale Anlagerungstemperatur (~68°C) besaß. Es wurden Primer-Sequenzen zwischen 20 und 23 Basenpaaren Länge ausgewählt, so dass der Hybrid-Doppelstrang zwischen Primer und Zielsequenz eine Zusammenstellung von insgesamt 12 G-C-Paarungen und 8–11 A-T-Paarungen aufwies. Optimale Anlagerungstemperaturen wurden mit Hilfe des „Tp"-Algorithmus von Wu et al., 1991, DNA Cell Biol. 10:233–238, ermittelt.
Ein weiteres Primer-Paar, die J- und cro-Gen-Primer, wurden hergestellt, um eine Amplifikation nahezu aller Insertionen, die mit Lambda-basierenden Vektoren cloniert sind, zu ermöglichen. Dies gilt sowohl für Plaques als auch für isolierte DNA, wie in Tabelle 2 dargestellt, siehe nachstehend.
In ähnlicher Weise wurden Primer für die Amplifikation von bestimmten Regionen des menschlichen Betaglobin-Gen-Komplexes hergestellt. Die Primer wurden so ausgelegt, dass ein fixierter stromabwärts liegender Primer mit einer Reihe von stromaufwärts liegenden Primern benutzt werden konnte, um Zielsequenzen von 7,5–22 kb zu amplifizieren. Die Primer amplifizieren eine Zielsequenz, die sich stromaufwärts über das Deltaglobin-Gen hinaus in das zweite Intron des A-Gammaglobin-Gens hinein erstreckt.
Die Nucleotidsequenzen der Primer, die in den folgenden Beispielen benutzt werden, werden (5'-zu 3') in der Tabelle 2, siehe nachstehend, dargestellt. Die Schmelztemperaturen (Tm) wurden im wesentlichen berechnet wie bei Wetmur, 1991, Crit.Rev.Biochem.Mol. Biol. 26: 227–259 angegeben. Die Schmelztemperaturen wurden unter folgenden Annahmen berechnet: zwei freie Enden, 3,5 μg/ml (~0,5 μM) Primer, 80 mM Na⁺ und 1,5 mM Mg²⁺. Die berechneten Schmelztemperaturen lagen zwischen 63–70°C. Die Zugabe von 10% Glycerin senkt die Temperatur T_m um 2,5°C. Die Nucleotidsequenzen der Primer wurden wegen möglicher sekundärer Bindungsstellen innerhalb der Matrizen-DNA-Sequenzen und auf Inter- und Intra-Primer-Sequenz-Komplementierung ausgewertet. Verwendet wurde dabei die Oligo 4,0 Software (National Biosciences, Plymouth, MN).
Tabelle 2 Primer für die Amplifikation

*Stromabwärts liegende Primer komplementär zu den aufgelisteten Positionsnummern

Primer wurden mit dem Cyanoethoxyphosphoramidit-Verfahren (1μM Maßstab) auf einem 394-DNA-Synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, CA) synthetisiert. Die Primer-Schutzgruppen wurden entfernt und in 29% NH₃/H₂O vom Harz abgespalten, dann mit Sephadex G25 (NAP-10-Säulen von Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) entsalzt. Die Ergebnisse jeder Synthese wurden mit einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese überprüft. Alle Primer-Stammlösungen wurden mit 10 mM Tris·Cl (pH 8 bei 25°C), 0,1 mM EDTA angesetzt.
Thermostabile DNA-Polymerasen
Rekombinante Tth-DNA-Polymerase (rTht) wurde von Perkin Elmer, Norwalk, CT bezogen. Die Tli-DNA-Polymerase wird im U.S. Patent No. 5,210,036 beschrieben. Die Tli-DNA-Polymerase (Vent_R ^® und DNA-Polymerase von Pyrococcus-Art GB-D (Deep Vent_R ^® wurden von New England Biolabs, Beverly, MA bezogen. Die Tma-DNA-Polymerase wird in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 92/03556 beschrieben und darin pTma12–3 genannt. Eine modifizierte DNA-Polymerase von Thermatoga maritima ist bei Perkin Elmer, Norwalk, CT käuflich zu erwerben (UITma^TM).
Verdünnungen (1/5 und 1/10) der Vent_R ^®- und Deep Vent_R ^®-DNA-Polymerasen werden vorzugsweise in Aufbewahrungspuffern nach den Angaben der Hersteller hergestellt. In den folgenden Beispielen enthielten die Vent_R ^®-Verdünnungspuffer jedoch 1 mM EDTA und 0,05% Tween 20 (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) anstatt 0,1% Triton X-100. Diese Modifizierung hatte keinen Einfluss auf die Amplifikationsreaktionen. Vent_R ^®-Polymerase-Lösungen wurden wöchentlich frisch angesetzt, Deep VentR -Polymerase wurde direkt vor dem Gebrauch verdünnt. Die Polymerase kann auch in dem Aufbewahrungspuffer der rTth-DNA-Polymerase gelagert werden, der vom Hersteller mitgeliefert wird (100 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5% Tween^® 20, 50% (v/v) Glycerin).
Zusätzliche Puffer-Komponenten
Standard-Tth-Polymerase-Puffer (5%(v/v) Glycerin, 10 mM Tris·Cl (pH 8,3) 100 mM KCl, 0,75 mM EGTA, 0,05% Tween^® 20) für die PCR wurde von Perkin Elmer, Norwalk, CT bezogen. Die Tricin-Puffer-Stammlösungen (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) mit 1,0 M wurden mit KOH auf ihren endgültigen pH-Wert (bei 25°C) eingestellt. Dimethylsulfoxid für molekularbiologische Zwecke (DMSO) und Glycerin wurden von Sigma Chemicals, St. Louis, MO beziehungsweise von J.T. Baker Chemicals, Phillipsburg, NJ, bezogen. Kaliumacetat (KOAc) stammte ebenfalls von J.T. Baker Chemicals. Der Beitrag von Glycerin aus dem Vorratspuffer für die Enzyme (im allgemeinen 1%) wurde in keiner der Glycerin-Konzentrationen, die hier für die PCR-Puffer angegeben wurden, berücksichtigt.
PCR-Methoden
Alle Lambda-genomischen DNA-Amplifikationen wurden in einem GeneAmp^® PCR System 9600 Thermocycler unter Verwendung von MicroAmp^TM-Gefäßen mit Einzeldeckeln durchgeführt, alles zu beziehen bei Perkin Elmer, Norwalk, CT. Reaktionsvolumina waren entweder 50 oder 100 μl. Die Konzentration von jeder dNTP betrug durchgehend 0,2 mM in allen Reaktionen, die anderen Reaktionskomponenten wurden jedoch variiert, wie im Text angegeben und in Tabelle 1 aufgelistet.
Zur Minimierung der Amplifikation unspezifischer Sequenzen und der Bildung von Primer-Dimeren wurden manuelle „Heiß-Starts" durchgeführt, bei denen das Mg²⁺ zurückgehalten wurde, bis die Proben im Thermocycler für etwa 90 Sekunden eine Temperatur von 75–80°C erreicht hatten. Das notwendige Mg²⁺ wurde dann aus einer 25 mM Stammlösung (bei Raumtemperatur) zugegeben. Nach der Zugabe von Mg²⁺ wurden die Proben weitere 30–60 Sekunden inkubiert, insgesamt etwa 4–7 Minuten bei 75–80°C vor dem ersten Denaturierungsschritt. Die Gesamtzeit schließt die Zeit mit ein, die für die Mg²⁺-Zugabe gebraucht wird, hängt also von der Anzahl der Reaktionsgefäße ab. Eine andere „Heiß-Start"-Vorgehensweise ist in Beispiel 6 beschrieben.
Der Thermocycler war für ein Zwei-Stufen-Temperaturprofil programmiert. Jeder Amplifikations-Zyklus bestand aus Denaturierung bei 94°C für 10 Sekunden und anschließender Anlagerungs-und Verlängerungsphase bei 68°C für 5–20 Minuten. Der Denaturierungsschritt kann auch 15 Sekunden dauern. Für Anlagerungs- und Verlängerungszeiten von mehr als 12–14 Minuten wurde das Autoextensions-Programm des Thermocyclers benutzt, um 15–20 Sekunden pro Zyklus hinzuzufügen, bis zuletzt etwa 16–22 Minuten. Die Reaktionen erfolgten insgesamt in 25–40 Zyklen, abhängig von der Anzahl der Zielsequenz-Kopien zu Beginn, der Länge der Zielsequenz und den Reaktionsbedingungen. Die meisten Versuchsansätze enthielten einen ersten Inkubationsschritt bei 94°C für 10 Sekunden und einen letzten Inkubationsschritt bei 72°C für 10 Minuten.
Die in den folgenden Beispielen beschriebenen Amplifikationen von menschlichen Gen-Insertionen, die in Lambda FIX II cloniert wurden, und von Regionen des menschlichen Betaglobin-Genkomplexes wurden im wesentlichen so durchgeführt, wie vorstehend beschrieben, jedoch mit den Modifikationen, die im folgenden genauer beschrieben werden. Die spezifischen Bedingungen für die Amplifikation von menschlichen genomischen Insertionen cloniert in Lambda-FIX II aus Plaque-Suspensionen in 100 μl Reaktionsvolumina sind folgende:
25 mM Tricin (pH 8,7)
85 mM KOAc
12% (w/v) Glycerin
0,2 mM von jedem dNTP
0,4 μM von jedem Primer
1,75 U Tth- Polymerase
0,02 U Tli-Polymerase
1,15 mM Mg(OAc)₂
Es wurde ein Heiß-Start bei 80°C mit einem Zwei-Stufen-Temperatur-Zyklus-Profil durchgeführt, wie vorstehend beschrieben. Der Anlagerungs- und Verlängerungsschritt betrug anfangs 12 Minuten bei 68°C und wurde um 15 Sekunden pro Zyklus verlängert, insgesamt über 32 Zyklen.
Die genauen Bedingungen für die Amplifikation einer Region des menschlichen Betaglobin-Genkomplexes von 37 ng der KAS011-DNA in 50 μl Reaktionsvolumen waren folgende:
20 mM Tricin (pH 8,7)
85 mM KOAc
10% (w/v) Glycerin
2% (v/v) DMSO
0,2 mM von jedem dNTP
0,2 μM von jedem Primer
0,9 U Tth-Polymerase
0,02 U Tli-Polymerase
1,1 mM Mg(OAc)₂
Es wurde ein Heiß-Start bei 78°C mit einem Zwei-Stufen-Temperatur-Zyklus-Profil gewählt, wie vorstehend beschrieben. Der Anlagerungs- und Verlängerungsschritt betrug anfangs 12 Minuten bei 68°C über 12 Zyklen und wurde dann um 15 Sekunden pro Zyklus über 24 Zyklen verlängert.
Eine erhöhte Ausbeute des amplifizierten Produktes kann durch die Zugabe von bis zu 500 μg/ml nichtacetyliertem BSA zur Amplifikationsreaktion erzielt werden.
Analyse der PCR-Produkte
Üblicherweise werden 5–8 μl von jeder PCR-Amplifikation mit Hilfe von standardisierten horizontalen Gels untersucht. Sie bestehen aus 0,6% (w/v) SeaKem GTG-Agarose (FMC BioProducts, Rockland, ME) in 1X TBE (89 mM Tris-Base, 89 mM Borsäure, 1 μM bis 2 mM EDTA) oder 1X TAE (40 mM Tris-Acetat, 2 mM EDTA, pH 8–8,5) mit 0,5 μg/ml Ethidiumbromid bei etwa 4–6 V/cm für 1,5–2 Stunden. Für eine bessere Größenauflösung wurden zwei Alternativen benutzt: Feld-Inversions-Gelelektrophorese und 0,3% Agarose-Gelelektrophorese.
Die Feld-Inversions-Gelelektrophorese (FIGE) wurde in einem Hoefer-System durchgeführt (SuperSub Gel-Apparat, Switchback Pulse Controller und Netzteil, alle von Hoefer, San Francisco, CA) mit einer Kühleinheit (2219 Multitemp II von Pharmacia LKB). Zwischen 3 und 7 μl von jeder PCR-Amplifikation wurden auf FIGE-Gelen aus 0,95% Agarose in 0,5x TBE (bei 1 μM EDTA) analysiert. Die FIGE-Gele hatten einen Vorlauf von 15 Minuten bei 110 V, der eigentliche Lauf ging über 22–25 Stunden bei 140–145 V und Pulszeiten von 0,65–1,95 oder 0,75–2 Sekunden (vorwärts: rückwärts = 2,8:1 oder 3:1). Die Lauftemperaturen wurden auf 12–15°C geschätzt.
Alternativ verwende man 2–5 μl auf 0,3% Chromosomal Grade-Agarose (Bio-Rad, Richmond, CA) oder SeaKem GTG oder Gold (FMC BioProducts, Rockland, ME) in 1X TAE. Das Gel wird vor Entfernung des Kamms auf 4°C gekühlt. Nach Beladen mit 5–8 μl Probe erfolgt der Lauf in 1XTAE mit 0,5% Ethidiumbromid bei 100 V für 2 Minuten, dann entweder bei 1,5 V/cm für 6 Stunden oder 0,7 V/cm für 16 Stunden.
Die Größe der amplifizierten Produkte wurde durch einen Vergleich mit Molekulargewichtsmarkern ermittelt, die in jedem Gel gleichzeitig mit der Probe mitliefen. Die verwendeten Molekulargewichtsmarker waren Lambda/HindIII, entweder von New England Biolabs oder Gibco BRL; Lambda/Mono Cut-Mix von New England Biolabs und 1 kb-Leitern von Gibco BRL.
Für Restriktionsanalysen wurden gleiche Mengen (10–16 μl) der PCR-Amplifikationsprodukte von Lambda DNA-Amplifikationen vor der Elektrophorese mit BclI, BssHII und MluI (New England Biolabs), oder mit BamHI, EcoRI und HindIII (Gibco BRL) unter Verwendung der Hersteller-Puffer geschnitten. Das Schneiden wurde innerhalb von 2,5–3 Stunden in 30–36 μl Reaktionsgemischen durchgeführt. Die Analyse der Proben erfolgte auf 0,6–8% Agarose-Gel. Gleiche Mengen von Plaque-PCR-Proben (10–30 μl Aliquots) wurden mit NotI (Stratagene) über Nacht in 40 μl Reaktionsgemischen geschnitten.
Beispiel 2
Amplifikation genomischer Sequenzen des Lambda-Phagen
Die Durchführung der Amplifikationen erfolgte unter Verwendung von Zielsequenzen mit einer hohen Anzahl von Ausgangskopien von Lambda-Phagen-DNA in den Proben (10⁷-10⁸ Kopien der Zielsequenz), wie im Beispiel 1 beschrieben, siehe oben. Zielsequenzen von 1,5 bis 42,2 kb Länge wurden innerhalb dieser ~50 kb-Sequenz (GenBank M17233) durch die zahlreichen Paarungen der in Tabelle 2, siehe oben, aufgelisteten Primer definiert.
Amplifizierte Produkte wurden mit der Feldinversions-Gelelektrophorese (FIGE) analysiert und mit einer Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht. Die totalen Erträge (pro 50 μl), ermittelt durch den Vergleich mit einem Lambda/HindIII-Molekulargewichtsmarker, lagen zwischen 0,7–1 μg eines 22,8 kb-Produktes und 0,2–0,3 μg eines 39 kb-Produktes. Eine 42,2 kb lange Zielsequenz, amplifiziert mit Hilfe der Primer SC1011 (SEQ ID NO: 2) und SC1024 (SEQ ID NO: 22), wurde mit geringerem Ertrag amplifiziert.
Beispiel 3
Lambda Clon-Amplifikation von Plaques
Eine wichtige Anwendung für die Verfahren der vorliegenden Erfindung ist die Amplifikation von Insertionen von Lambda-Klonen ohne vorherige arbeits- und zeitintensive DNA-Isolierung. Um die Nützlichkeit der hier vorliegenden Verfahren für die Amplifikation solcher Insertionen aufzeigen zu können, wurden die Primer CF1018 (SEQ ID NO:23) und CF1019 (SEQ ID NO:24) aus Sequenzen innerhalb der Lambda-Gene J und cro hergestellt (vgl. Tabelle 2).
Die Amplifikationen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, verwendet wurden zufällig ausgewählte Plaques aus der menschlichen Genbibliothek in Lambda FIX, in Beispiel 1 beschrieben. Die Amplifikationsprodukte wurden mit einer Gelelektrophorese analysiert, nachdem sie mit NotI geschnitten worden waren, um die Insertionen von den flankierenden Vektor-Sequenzen zu trennen. Die Anwesenheit beider Vektorfragmente belegt, dass die gesamte Insertion amplifiziert worden war.
Die Größen der amplifizierten Insertionen reichte von weniger als 10 kb bis größer als 20 kb. Schätzungen des Herstellers besagen, dass Insertionen in der Größe zwischen 9 und 23 kb von diesem Lambda-Vektor transportiert werden können. Die Größe der Insertionen wurde relativ zu Molekulargewichtsmarkern in FIGE-Gelen gemessen.
Beispiel 4
Amplifikationen von Zielsequenzen aus dem menschlichen Genom
Der menschliche Betaglobin-Genkomplex wurde als ein Beispiel für Zielsequenzen aus dem Genom ausgewählt, die wahrscheinlich repetitive Sequenzen und homologe Abschnitte an anderen Orten im Genom aufweisen. Die hergestellten Primer für den menschlichen Betaglobin-Genkomplex sind in Tabelle 2 aufgelistet, siehe vorstehend. Ein fixierter stromabwärts liegender Primer wurde mit einer Reihe von stromaufwärts liegenden Primern gepaart, die eine Region amplifizieren, die sich stromaufwärts über das Deltaglobin-Gen hinweg in das zweite Intron eines A-Gammaglobin-Gens hinein erstreckt. Es wurden Zielsequenzen von 13,5, 17,7, 19,6 und 22 kb aus 37 ng (10⁴ Ausgangskopien) der gesamten menschlichen Genom-DNA amplifiziert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Je 12,5 μl der amplifizierten Produkte wurden auf FIGE-Gele gegeben. Zum Vergleich wurde ein Lambda/HindIII-Molekulargewichtsmarker verwendet.
Zum Vergleich wurden Zielsequenzen von 16,5, 18,8, 20,8 und 22,8 kb von 0,05 pg (~10³ Ausgangskopien) oder 0,5 pg (~10⁴ Ausgangskopien) Lambda-Phagen-DNA vor dem Hintergrund von ~3,7 ng bzw. 37 ng menschlicher genomischer DNA aus der Plazenta unter gleichen Bedingungen amplifiziert. Amplifiziert man eine Zielsequenz von einer niedrigen Anzahl von Ausgangskopien zusätzlich zu einer vorherigen Amplifikation mit einer hohen Anzahl von Ausgangskopien, können die Effekte einer Abnahme von Ausgangskopien getrennt werden von den Effekten, die sich aus der Differenz der Zielsequenz ergeben.
Es wurden Zielsequenzen vom Betaglobin-Genkomplex bis zu einer Länge von 22 kb amplifiziert. Die Betaglobin-Zielsequenzen wurden weniger erfolgreich amplifiziert als Lambda-Sequenzen ähnlicher Länge, die auf einem Einzelkopie-Niveau auf dem Hintergrund einer menschlichen Plazenta-DNA vorlagen, entweder in der gleichen Gesamtkonzentration wie die Globin-Zielsequenz oder in einer 10-fach niedrigeren Konzentration. Diese Unterschiede in der Effizienz können die relative Komplexität der Sequenzen widerspiegeln, selbst wenn die Lambda-Zielsequenz auch in einem Hintergrund menschlichen Genoms eingebettet war. Die gestiegene Wahrscheinlichkeit, dass lange Zielsequenzen Abschnitte enthalten, die ausreichend homolog sind, um als sekundäre Primer-Anlagerungsorte zu wirken, und die Anwesenheit repetitiver Sequenzen im menschlichen Genom erklären möglicherweise, warum Lambda-Zielsequenzen erfolgreicher amplifiziert werden können als Betaglobin-Gen-Sequenzen vergleichbarer Länge.
Das Problem der sekundären Primer-Orte beeinflusste auch die Wahl von geeigneten Primern für die Amplifikation der Betaglobin-Gen-Zielsequenzen. Es wurde der stromabwärts liegende Primer RH1053 (SEQ ID NO: 32) ausgewählt, der 5' mit dem Betaglobin-Gen hybridisiert, denn RH1016 (SEQ ID NO: 31), der innerhalb Exon 2 des Betaglobin-Gens hybridisiert, hybridisiert bei Zielsequenzen, die länger als 14 kb sind, auch mit einem sekundären Anlagerungsort, was vielfältige Produkte erzeugt. Der stromaufwärts liegende Primer RH1020 (SEQ ID NO: 26) erzeugte vielfältige sekundäre Produkte, wie auch der Gebrauch zweier anderer Primer (nicht aufgelistet) innerhalb von 100 Basen von RH1020 (SEQ ID NO: 26). Alle drei liegen innerhalb einer Alu-Wiederholungssequenz.
Ergebnisse einer Amplifikation von Sequenzen bis zu 16 kb Länge vom menschlichen Neurofibromatose-1-Gen deuten ebenso darauf hin, dass Verfahren zur Sicherstellung der Primer-Spezifität von entscheidender Wichtigkeit sind, um eine effiziente PCR-Amplifikation langer Zielsequenzen durchführen zu können.
Beispiel 5
DNA-Polymerase-Kombinationen
Um die relative Effizienz verschiedener Kombinationen von DNA-Polymerasen herauszufinden, wurden Amplifikationsreaktionen im wesentlichen wie in Beispiel 1, siehe vorstehend, durchgeführt. Die verwendeten Primer amplifizieren Zielsequenzen von 22,8, 26,4, 29,9 und 33,9 kb Länge. Die miteinander verglichenen DNA-Polymerase-Kombinationen waren wie folgt:
2,5 U rTth-DNA-Polymerase + 0,02 U Vent_R ^®-DNA-Polymerase
2,5 U rTth-DNA-Polymerase + 0,06 U Deep Vent_R ^®-DNA-Polymerase
3,15 U rTth-DNA-Polymerase + 0,5 U Tma-DNA-Polymerase
Alle Reaktionen wurden in 50 μl mit 10⁷ Ausgangskopien von Lambda-DNA, 0,45 μM von jedem Primer und 1,0–1,1 mM Mg(OAc)₂ durchgeführt. Für die Amplifikationsreaktionen galten die folgenden spezifischen Reaktionsbedingungen.
Reaktionen, bei denen entweder rTth- und Vent_R ^®- oder rTth- und Deep Vent_R ^®-DNA-Polymerasen verwendet wurden, wurden in 20 mM Tricin (pH 8,7), 85 mM KOAc, 10% Glycerin und 3% DMSO durchgeführt. Reaktionen, bei denen rTth- und Tma-DNA-Polmerasen verwendet wurden, wurden in 20 mM Tricin (pH 8,7), 85 mM KOAc, 10% Glycerin und 2,5% DMSO durchgeführt.
Das Temperaturzyklus-Profil war im wesentlichen wie in Beispiel 1, siehe vorstehend, beschrieben. Für die ersten 9 Zyklen wurde eine 13-minütige Verlängerungszeit gewählt. Die Verlängerungszeit wurde dann auf 13,5 Minuten ausgedehnt und bei jedem der folgenden 18 Zyklen um 20 Sekunden verlängert. Aus jeder Reaktion wurden 7 μl zusammen mit 150 ng des Lambda/HindIII-Molekulargewichtsmarker auf ein Standard-Agarosegel gegeben.
Alle Matrizen (bis zu 33,9 kb) wurden unter Benutzung von Kombinationen von rTth-DNA-Polymerase mit Vent_R ^®-, Deep VentR – und Tma-DNA-Polymerase amplifiziert. Die Kombination von 2,5 U rTth-DNA-Polymerase und 0,02 U Vent_R ^®-DNA-Polymerase amplifizierte alle Zielsequenzen mit größter Effizienz.
Beispiel 6
PCR-Amplifikations-Kit
Die Reagenzien der Erfindung eignen sich für eine Verwendung in einem Kit für die Durchführung der PCR-Amplifikation langer Zielsequenzen. Ein Kit enthält mindestens ein DNA- Polymerase-Gemisch wie hier beschrieben. Zusätzlich können Komponenten enthalten sein, die weitere für die Reaktionen verwendete Reagenzien und Reaktionsbehälter, wie nachstehend beschrieben, beinhalten.
Eine bevorzugte DNA-Polymerase-Kombination, die sich für Zielsequenzen sowohl mit einer hohen Anzahl von Ausgangskopien als auch mit einer niedrigen Anzahl von Ausgangskopien eignet, besteht aus rTth- und VentR -DNA-Polymerasen im Verhältnis von 2 Einheiten (U) rTth-DNA-Polymerase zu 0,08 U Vent_R ^®-DNA-Polymerase. Wie nachstehend angeführt, ist jedoch die bevorzugte Polymerase-Konzentration für die Amplifikation einer hohen Anzahl von Ausgangskopien der Zielsequenz doppelt so hoch wie die bevorzugte Konzentration für die Amplifikation von Zielsequenzen mit einer niedrigen Anzahl von Ausgangskopien, das Verhältnis primärer und sekundärer Polymerasen zueinander bleibt aber gleich.
Ein Reaktionspuffer, der in einen Kit aufgenommen werden kann, besteht aus Tricin, KOAc, Glycerin und DMSO, etwa in den folgenden Konzentrationen:
25 mM Tricin (pH 8,7)
80 mM KOAc
10% (w/v) Glycerin
2,25% (v/v) DMSO
Der Ausdruck „etwa" bezieht sich auf die Einstellung der Standard-Konzentration plus/minus einer 10%igen Toleranz bei der Herstellung. Gewöhnlich kann der Reaktionspuffer mit einer höheren Konzentration gelagert werden, um dann vor dem Gebrauch verdünnt zu werden.
Die Amplifikationen werden im wesentlichen unter VerwSETR der vorstehend beschriebenen Kit-Komponenten durchgeführt, jedoch unter Verwendung der im folgenden beschriebenen bevorzugten Reaktionsbedingungen. Diese Reagenzien und Bedingungen sind sehr häufig benutzt worden und haben sich als geeignet erwiesen, verlässliche Amplifikationen langer Zielsequenzen zu ermöglichen.
Bevorzugte Bedingungen für eine Amplifikation von Zielsequenzen mit einer geringen Anzahl (2,0 × 10⁴ Ausgangskopien) von Zielsequenzen (z.B. aus dem menschlichen Genom) in 100 μl Reaktionsvolumen sind folgende:
25 mM Tricin (pH 8,7)
80 mM KOAc
10% (w/v) Glycerin
2,25% (v/v) DMSO
0,2 mM von jedem dNTP
0,2 μM von jedem Primer
2 U rTth-Polymerase
0,08 U Vent_R ^®-Polymerase
1,1 mM Mg(OAc)₂
Bevorzugte Zyklus-Parameter für die Amplifikation von Sequenzen mit geringer Anzahl von Ausgangskopien (> 10 kb) sind folgende:
Bevorzugte Bedingungen für die Amplifikation von Zielsequenzen mit hoher Anzahl von Ausgangskopien (2,0 × 10⁷ Ausgangskopien), z.B. clonierte DNA, in 100 μl Reaktionsvolumen sind folgende:
25 mM Tricin (pH 8,7)
80 mM KOAc
10% (w/v) Glycerin
2,25% (v/v) DMSO
0,2 mM von jedem dNTP
0,4 μM von jedem Primer
4 U rTth-Polymerase
0,16 U Vent_R ^®-Polymerase
1,1 mM Mg(OAc)₂
Bevorzugte Zyklus-Parameter für die Amplifikation von Zielsequenzen mit hoher Anzahl von Ausgangskopien (> 10 kb) sind folgende:
Es wird ein „Heiß-Start" durchgeführt, indem die Reagenzien in den Reaktionsgefäßen mit Wachsperlen voneinander getrennt werden (Ampliwax^TM PCR Gem 100, entwickelt und hergestellt von Hoffmannn-La Roche und vertrieben von Perkin Elmer, Norwalk, CT). Eine 40 μl Grundschicht aus den Reagenzien Puffer (Tricin, KOAc, Glycerin und DMSO), Mg(OAc)₂ und den dNTPs wird ins Reaktionsgefäß gegeben. Über diese Grundschicht wird eine Wachslage aus Ampliwax^TM PCR Gem 100 aufgebracht und das Ganze im Thermocycler zunächst 5 Minuten bei 80°C, dann 5 Minuten bei 25°C inkubiert. Danach wird die oberste Schicht von 60 μl zugegeben, enthaltend Puffer, die DNA-Polymerase-Kombination, die Primer und die Zielsequenz-DNA.
Analysiert werden die Proben, wie oben beschrieben, auf einem 0,6% Agarose-Gel in 1X TAE und 0,5 μg/ml EtBr für 1,5 Stunden bei 7 V/cm.

Claims

DNA-Polymerase-Zusammensetzung zur Polymerasekettenreaktion-Amplifikation von Nucleinsäuresequenzen mit einer Länge von mehr als 10 kb, bestehend aus einer Kombination einer ersten DNA-Polymerase und einer zweiten DNA-Polymerase, wobei die erste DNA-Polymerase eine DNA-Polymerase aus Thermus thermophilus ist und wobei die zweite DNA-Polymerase eine thermostabile DNA-Polymerase ist, welche die maximale amplifizierbare Zielsequenzlänge durch das Bereitstellen von beidem, 3'-nach-5'-Exonucleaseaktivität und Polymeraseaktivität, erhöht, und wobei die DNA-Polymerase-Zusammensetzung aus etwa 0,8 bis 2,5 Einheiten der ersten DNA-Polymerase je 0,015 bis 0,15 Einheiten der zweiten DNA-Polymerase besteht.
DNA-Polymerase-Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die zu amplifizierenden Nucleinsäuresequenzen im Bereich von 23 bis 42 kb liegen.
DNA-Polymerase-Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die DNA-Polymerase-Zusammensetzung aus etwa 2 Einheiten der ersten DNA-Polymerase je 0,08 Einheiten der zweiten DNA-Polymerase besteht.
Verfahren zum Amplifizieren einer Nucleinsäure unter Verwendung einer DNA-Polymerase-Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3.
Verwendung einer DNA-Polymerase-Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zum Amplifizieren einer Nucleinsäure.
Kit, umfassend eine DNA-Polymerase-Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3.
Kit gemäß Anspruch 6, ferner umfassend einen Reaktionspuffer für die Polymerase-Kettenreaktion-Amplifikation von langen Nucleinsäuresequenzen, wobei der Reaktionspuffer vorzugsweise etwa 25 mM Tricin, 80 mM KOAc, 10% (w/v) Glycerin und 2,25% (v/v) DMSO umfasst.