DE69205181T2

DE69205181T2 - Strangverdrängungsamplifikation.

Info

Publication number: DE69205181T2
Application number: DE69205181T
Authority: DE
Inventors: George T. Chapel Hill North Carolina 27514 Walker
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1991-01-31
Filing date: 1992-01-28
Publication date: 1996-03-21
Anticipated expiration: 2012-01-29
Also published as: ES2077887T3; EP0497272B1; US5712124A; JPH07114718B2; ATE128737T1; KR920014937A; US5455166A; AU1069992A; DE69205181D1; CA2060372A1; EP0497272A1; AU659429B2; CA2060372C; KR950003619B1; JPH05192195A; DK0497272T3; GR3018271T3

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Amplifizieren einer Zielnucleinsäuresequenz und bezieht sich insbesondere auf ein Verfahren zur Amplifikation durch endonucleasevermittelte Strangverdrängung und Nachweis der amplifizierten Reaktionsprodukte. Diese Erfindung bezieht sich weiterhin auf eine gemeinsam übertragene Anmeldung für eine Amplifikation durch exonucleasevermittelte Strangverdrängung, die am selben Tag wie die vorliegende eingereicht wurde.

Hintergrund der Erfindung

Nucleinsäuren können entweder in Form von Desoxyribonucleinsäuren (DNA) oder in Form von Ribonucleinsäuren (RNA) vorliegen. DNA und RNA sind hochmolekulare Polymere, die aus vielen Nucleotidbausteinen bestehen. Jedes Nucleotid ist aus einer Base (einem Purin oder einem Pyrimidin), einem Zucker (entweder Ribose oder Desoxyribose) und einem Phosphorsäuremolekül zusammengesetzt. DNA ist aus dem Zucker Desoxyribose und den Basen Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T) zusammengesetzt.
Die Nucleotide sind in einer linearen Kette unter Bildung der genetischen Information zusammengesetzt. Jede Sequenz aus drei Nucleotiden kann durch den Vorgang der Translation als Code für eine Aminosäure "abgelesen" werden. (DNA muß zuerst durch den Vorgang der Transcription in RNA umgewandelt werden.) Durch Variieren der Basenkombination in jeder Dreibasensequenz werden verschiedene Aminosäuren codiert. Durch Verknüpfen verschiedener Dreibasensequenzen kann eine Aminosäuresequenz hergestellt werden, die Proteine bildet. Die gesamte Codierungseinheit für ein Protein wird als Gen bezeichnet. In einem Organismus können eine oder mehrere Kopien eines Gens vorliegen. Einige Gene sind in Hunderten oder Tausenden von Kopien vorhanden. Andere sind nur als eine einzige Kopie vorhanden.
Unabhängig von der Anzahl der Kopien sind Gene in einem Organismus unter Bildung höherer Struktureinheiten miteinander verknüpft, die bei höheren Organismen als Chromosomen bezeichnet werden. Bei einigen niederen Organismen können Gene in Einheiten außerhalb von Chromosomen vorkommen, die man als Plasmide bezeichnet. Gene brauchen nicht direkt Ende an Ende miteinander verknüpft zu sein. Bestimmte nichtcodierende Bereiche (d.h. Basensequenzen, die sich nicht in Aminosäuren übersetzen lassen) können zwischen Genen oder innerhalb eines Gens vorkommen. Die Anordnung von Nucleotiden in einem Organismus bestimmt also seine genetische Ausstattung, die als sein Genom bezeichnet werden kann. (Daher wird aus einem Organismus isolierte DNA als genomische DNA bezeichnet.)
DNA ist in den meisten Organismen in Form eines Duplex angeordnet, wobei zwei DNA-Stränge in der bekannten Doppelhelix miteinander gepaart sind. In diesem Modell bilden sich Wasserstoffbrücken zwischen A und T bzw. zwischen C und G auf den gepaarten Strängen. Die Sequenz ATCG (5'T3') auf einem Strang hat also auf dem komplementären Strang die Sequenz TAGC (3'T5'). Beide Stränge enthalten jedoch dieselbe genetische Information, nur in einer komplementären basengepaarten Weise. Man könnte daher jeden der beiden DNA-Stränge ablesen, um die codierte genetische Sequenz zu bestimmen.
Wegen einer weiteren Beschreibung der Organisation, Struktur und Funktion von Nucleinsäuren siehe Watson, Molecular Biology of the Gene, W.J. Benjamin, Inc. (3. Auflage 1977), insbesondere Kapitel 6-14.
Die Kenntnis und die Bestimmung der genetischen Sequenz von Nucleinsäuren, die in einer Probe vorhanden sind, sind aus vielen Gründen wichtig. Erstens sind viele Krankheiten genetisch bedingt in dem Sinne, daß die Nucleotidsequenz für ein "normales" Gen in irgendeiner Weise verändert ist. Eine solche Veränderung könnte durch Ersatz einer Base durch eine andere erfolgen. Da ja drei Basen für eine einzige Aminosäure codieren, könnte eine Veränderung in einer Base (als Punktmutation bezeichnet) zu einer Änderung der Aminosäure führen, was wiederum dazu führen könnte, daß in einer Zelle ein fehlerhaftes Protein hergestellt wird. Die Sichelzellanämie ist ein klassisches Beispiel für einen solchen genetischen Defekt, der durch eine Veränderung einer einzigen Base in einem einzigen Gen verursacht wird. Weitere Beispiele für Krankheiten, die durch Defekte an einzelnen Genen verursacht werden, sind Faktor-IX- und Faktor-VIII-Defizienz, Adenosin- Desaminase-Defizienz, Purinnucleotid-Phosphorylase-Defizienz, Ornithin-Transcarbamoylase-Defizienz, Argininsuccinat-Synthetase- Defizienz, beta-Thalassämie, α&sub1;-Antitrypsin-Defizienz, Glucocerebrosidase-Defizienz, Phenylalanin-Hydroxylase-Defizienz und Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-Defizienz. Man glaubt, daß noch weitere Krankheiten, wie Krebse, durch die Aktivierung, Erhöhung der Kopienzahl und/oder Aufhebung der Suppression von Genen verursacht werden, von denen man weiß, daß sie im Genom vorhanden sind, und die als Oncogene bezeichnet werden. Beispiele für Oncogene, von denen man glaubt, daß sie bei bestimmten Krebsen von Bedeutung sind, sind N-myc für Neuroblastome, Retinoblastome und kleinzellige Lungenkrebse und c-abl für chronische myelogene Leukämie. Wegen einer weiteren Beschreibung der Bedeutung von Oncogenen für die Diagnose von Krebsen und einer Auflistung spezifischer Oncogene siehe Weinberg, Sci. Amer., Nov. 1983, Slamon et al., Science, 224:256 (1984), US-Patent Nr. 4,699,877 und 4,918,162.
Zweitens gibt es neben Anderungen der Sequenz von Nucleinsäuren auch genetische Veränderungen, die auf einem strukturellen Niveau auftreten. Zu diesen Veränderungen gehören Insertionen, Deletionen und Translokationen entlang eines Chromosoms und auch erhöhte oder verminderte Chromosomenzahlen. Im ersteren Fall können sich solche Veränderungen aus Ereignissen ergeben, die als Crossingover bezeichnet werden, wobei DNA-Stränge von einem Chromosom DNA verschiedener Länge mit einem anderen Chromosom austauschen. So kann sich zum Beispiel bei einem "normalen" Individuum das Gen für Protein "X" auf Chromosom 1 befinden; nach einem Crossingover könnte dieses Gen jetzt auf Chromosom 4 verlagert worden sein (mit oder ohne einen gleichen DNA-Austausch von Chromosom 4 nach Chromosom 1), und die Zelle erzeugt vielleicht kein X.
Im Falle einer erhöhten oder verminderten Chromosomenzahl (als Aneuploidie bezeichnet) tritt anstatt eines "normalen" Individuums mit der richtigen Zahl von Kopien jedes Chromosoms (z.B. jeweils zwei beim Menschen [außer den X- und Y-Chromosomen]) eine andere Zahl auf. Beim Menschen ist zum Beispiel das Down-Syndrom das Ergebnis davon, daß drei Kopien des Chromosoms 21 anstatt der normalen zwei Kopien vorhanden sind. Weitere aneuploide Zustände ergeben sich aus Trisomien, die die Chromosomen 13 und 18 betreffen.
Drittens können Infektionskrankheiten von Parasiten, Mikroorganismen und Viren verursacht werden, die alle ihre eigenen Nucleinsäuren haben. Die Gegenwart dieser Organismen in einer Probe aus biologischem Material wird häufig nach einem von mehreren traditionellen Verfahren (z .B. die Kultur) festgestellt. Da jedoch jeder Organismus sein eigenes Genom hat, liefert dieses Genom, wenn es Gene oder Nucleinsäuresequenzen gibt, die für eine einzige Art (für mehrere verwandte Arten, für eine Gattung oder einen höheren Verwandtschaftsgrad) spezifisch sind, einen "Fingerabdruck" für diesen Organismus (oder die Art usw.) Beispiele für Viren, auf die sich diese Erfindung anwenden läßt, sind HIV, HPV, EBV, HSV, Hepatitis B sowie C und CMV. Beispiele für Mikroorganismen, auf die sich diese Erfindung anwenden läßt, sind Bakterien und insbesondere H. influenzae, Mycoplasmen, Legionellen, Mycobakterien, Chlamydien, Candida, Gonokokken, Shigella und Salmonellen.
In jedem der oben angeführten Beispiele kann man durch Identifizieren einer oder mehrerer Sequenzen, die für eine Krankheit oder einen Organismus spezifisch sind, Nucleinsäuren aus einer Probe isolieren und bestimmen, ob diese Sequenz vorhanden ist. Mehrere Verfahren wurden bei dem Versuch entwickelt, dies zu erreichen.
Während es entscheidend ist, daß eine oder mehrere Sequenzen, die für eine Krankheit oder einen Organismus spezifisch sind, identifiziert werden, ist es für die praktische Durchführung dieser Erfindung nicht wichtig, welches die Zielsequenzen sind oder wie sie identifiziert werden. Das einfachste Mittel, um die Gegenwart einer Zielsequenz in einer Probe von Nucleinsäuren nachzuweisen, besteht darin, eine Sondensequenz zu synthetisieren, die zu der Zielnucleinsäure komplementär ist. (Ausrüstungen wie Applied BioSystems 380B werden zur Zeit verwendet, um Nucleinsäuresequenzen zu diesem Zweck zu synthetisieren.) Die synthetisierte Sondensequenz kann dann zu einer Probe gegeben werden, die Nucleinsäuren enthält, und wenn die Zielsequenz zugegen ist, wird die Sonde unter Bildung eines Reaktionsprodukts an diese binden. Wenn keine Zielsequenz vorhanden ist und lediglich nichtspezifische Bindung auftritt, wird kein Reaktionsprodukt gebildet. Wenn die synthetisierte Sonde mit einer nachweisbaren Markierung versehen wurde, kann das Reaktionsprodukt nachgewiesen werden, indem man die Menge der vorhandenen Markierung mißt. Das Southern-Blot-Verfahren ist ein Beispiel dafür, wo dieses Verfahren verwendet wird.
Eine Schwierigkeit bei diesem Ansatz ist jedoch, daß er in Fällen, bei denen die Zahl der in einer Probe vorhandenen Kopien der Zielsequenz gering ist (d.h. weniger als 10&sup7;), nicht ohne weiteres anwendbar ist. In solchen Fällen ist es schwierig, zwischen Signal und Rauschen zu unterscheiden (d.h. zwischen echter Bindung zwischen Sonde und Zielsequenzen und nichtspezifischer Bindung zwischen Sonde und Nichtzielsequenzen). Eine Möglichkeit, dieses Problem zu umgehen, besteht darin, das Signal zu erhöhen. Entsprechend wurden mehrere Verfahren beschrieben, um die in einer Probe vorhandenen Zielsequenzen zu amplifizieren.
Eines der am besten bekannten Amplifikationsverfahren ist die Polymerase-Kettenreaktion (als PCR bezeichnet), die im Einzelnen in den US-Patenten Nr. 4,683,195, 4,683,202 und 4,800,159 beschrieben ist. In Kürze: Bei der PCR werden zwei Primersequenzen hergestellt, die zu Bereichen auf einander gegenüberliegenden komplementären Strängen der Zielsequenz komplementär sind. Ein Überschuß an Desoxynucleosidtriphosphaten wird zusammen mit einer DNA-Polymerase (z.B. Taq-Polymerase) zu einem Reaktionsgemisch gegeben. Wenn die Zielsequenz in einer Probe vorhanden ist, binden die Primer an das Zielmolekül, und die Polymerase bewirkt, daß die Primer entlang der Zielsequenz verlängert werden, indem sie Nucleotide anfügt. Durch Erhöhen und Senken der Temperatur des Reaktionsgemischs dissoziieren die verlängerten Primer unter Bildung von Reaktionsprodukten von dem Zielmolekül ab, überschüssige Primer binden an das Zielmolekül und an die Reaktionsprodukte, und der Vorgang wird wiederholt.
Ein anderes Verfahren zur Amplifikation ist in der EPA Nr. 320,308 beschrieben, die am 14. Juni 1989 veröffentlicht wurde, und zwar die Ligase-Kettenreaktion (als LCR bezeichnet). Bei der LCR werden zwei komplementäre Sondenpaare hergestellt, und in Gegenwart der Zielsequenz bindet jedes Paar an einander gegenüberliegende komplementäre Stränge des Zielmoleküls, so daß sie sich berühren. In Gegenwart einer Ligase verknüpfen sich die beiden Sondenpaare unter Bildung einer einzelnen Einheit. Durch einen Temperaturkreislauf wie bei der PCR dissoziieren gebundene ligasierte Einheiten von dem Zielmolekül ab und dienen dann als "Zielsequenzen" für die Ligasierung überschüssiger Sondenpaare. Das US-Pat. Nr. 4,883,750 beschreibt ein Verfahren, das der LCR ähnlich ist, zur Bindung von Sondenpaaren an eine Zielsequenz, beschreibt jedoch keinen Amplifikationsschritt.
Noch ein weiteres Amplifikationsverfahren ist in der PCT-Anmeldung Nr. PCT/US87/00880 beschrieben, die am 22. Oktober 1987 veröffentlicht wurde, und wird als Qβ-Replicase-Verfahren bezeichnet. Bei diesem Verfahren wird eine replikative RNA-Sequenz, die einen zur Zielsequenz komplementären Bereich aufweist, in Gegenwart einer RNA-Polymerase zu einer Probe gegeben. Die Polymerase kopiert die replikative Sequenz, die dann nachgewiesen werden kann.
Noch weitere Amplifikationsverfahren sind in der GB-Anmeldung Nr. 2 202 328, die am 21. September 1988 veröffentlicht wurde, und in der PCT-Anmeldung Nr. PCT/US89/01025, die am 5. Oktober 1989 veröffentlicht wurde, beschrieben. Bei der ersteren Anmeldung werden "modifizierte" Primer in einer PCR-artigen, matrizen- und enzymabhängigen Synthese verwendet. Die Primer können durch Markieren mit einer Abfangeinheit (z.B. Biotin) und/oder einer Nachweiseinheit (z.B. Enzym) modifiziert sein. Bei der letzteren Anmeldung wird ein Überschuß markierter Sonden zu einer Probe gegeben. In Gegenwart der Zielsequenz bindet die Sonde und wird katalytisch gespalten. Nach der Spaltung wird die Zielsequenz intakt freigesetzt und dann von überschüssiger Sonde gebunden zu werden. Die Spaltung der markierten Sonde signalisiert die Gegenwart der Zielsequenz.
Die EP-A-0 395 398 (Life Technologies, Inc.) beschreibt ein Verfahren zum statistischen Amplifizieren von Matrixnucleinsäuresequenzen ohne vorherige Kenntnis spezifischer Sequenzen. Oligonucleotidprimer mit statistischer Sequenz werden mit der Matrix hybridisiert und verlängert. Die neu synthetisierten Stränge werden ohne thermischen Kreislauf von der Matrix verdrängt. Die WO 90/01065 beschreibt Verfahren zur nichtspezifischen Amplifikation von RNA- und DNA-Fragmenten durch Anfügen eines Homopolymerschwanzes an das 3'-Ende des Gegensinnstranges und einer gewöhnlichen 3' -Endsequenz an den Sinnstrang. Die Fragmente werden unter Verwendung eines Homopolymerprimers und eines Primers mit definierter Sequenz amplifiziert. S. N. Ho et al. (1989. Gene 77:51-59) beschreiben Verfahren, bei denen komplementäre Oligoprimer in getrennten PCR-Reaktionen in DNA-Fragmente eingebaut werden. Die überlappenden Verlängerungsprodukte können dann verschmolzen werden, indem man sie in einer zusätzlichen Primerverlängerungsreaktion miteinander kombiniert.
Bei allen oben beschriebenen Verfahren kann eine Vielzahl von Nachweisverfahren eingesetzt werden, die alle für das eingesetzte Amplifikationsverfahren nicht entscheidend sind. Ein Verfahren ist der Nachweis von Reaktionsprodukten mit einer spezifischen Größe über Elektrophorese. Ein anderes Verfahren besteht darin, die Primersequenz zum Beispiel mit ³²P radioaktiv zu markieren und dann die von den Reaktionsprodukten ausgesandte Radioaktivität nachzuweisen, was allein oder in Kombination mit Elektrophorese geschehen kann. Ein weiteres Verfahren besteht darin, den Primer chemisch zu modifizieren, indem man einen Rezeptor, der einen Liganden (z.B. Biotin-Avidin) und ein Enzym (z.B. Alkalische Phosphatase) aufweist, einen fluoreszierenden Farbstoff (z.B. Phycobiliprotein) oder eine Kombination davon hinzufügt. Ein weiteres Verfahren besteht darin, einen Nachweisprimer zu entwickeln, der an das Reaktionsprodukt bindet und in Gegenwart von Polymerase verlängert werden kann. Der Nachweisprimer kann radioaktiv markiert oder wie oben beschrieben chemisch modifiziert sein. Viele dieser Verfahren können an Festphasen- sowie an Lösungssysteme angepaßt werden. Mehrere dieser Verfahren sowie andere sind in den US-Patenten Nr. 4,358,535, 4,705,886, 4,743,535, 4,777,129, 4,767,699 und 4,767,700 beschrieben.
Jedes der oben angeführten Amplifikationsverfahren weist eine oder mehrere Einschränkungen auf. Bei den meisten der Amplifikationsverfahren besteht eine Haupteinschränkung in der Notwendigkeit eines Temperaturkreislaufs, um zu bewirken, daß die Reaktionsprodukte vom Zielmolekül abdissoziieren. Dadurch sind sowohl die zur Durchführung des Verfahrens verwendeten Vorrichtungen als auch die Wahl der Enzyme, die zur Bildung der Reaktionsprodukte notwendig sind, eingeschränkt. Zu den weiteren Einschränkungen bei diesen Verfahren gehören die Erzeugung von RNA-Zwischenstufen, die gegenüber Zersetzung durch endogene Nuclease empfindlich sind, und die Schwierigkeit bei der Erzeugung assoziierter Enzyme. Alternative Verfahren zu diesen vorhandenen Amplifikationsverfahren sind wünschenswert.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Diese Erfindung stellt ein Verfahren zum Amplifizieren einer Zielnucleinsäuresequenz (und ihres komplementären Stranges) in einer Probe durch endonucleasevermittelte Strangverdrängung bereit. Das Verfahren beinhaltet die Schritte: 1) Isolieren von Nucleinsäuren, von denen man annimmt, daß sie die Zielsequenz enthalten, aus einer Probe; 2) Erzeugen einzelsträngiger Fragmente von Zielsequenzen; 3) Hinzufügen eines Gemischs, umfassend (a) eine Nucleinsäure-Polymerase, (b) Desoxynucleosidtriphosphate einschließlich wenigstens eines substituierten Desoxynucleosidtriphosphats und (c) wenigstens einen Primer, der zu einem Bereich am 3'-Ende eines Zielfragments komplementär ist, wobei weiterhin jeder Primer eine Sequenz am 5'-Ende hat, die eine Erkennungssequenz für eine Restriktions-Endonuclease ist; und 4) Reagierenlassen des Gemisches während einer Zeit, die ausreicht, um Reaktionsprodukte zu erzeugen. Wenn die Fragmente doppelsträngige Nucleinsäuren umfassen, umfaßt das Verfahren weiterhin das Denaturieren der Nucleinsäurefragmente unter Bildung einzelsträngiger Zielsequenzen. Wenn die Nucleinsäuren RNA umfassen, ist es vorzuziehen, Reverse Transcriptase zu verwenden, um RNA in DNA umzuwandeln.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf Verfahren zur Trennung und/oder zum Nachweis von Reaktionsprodukten, die nach dem oben beschriebenen Verfahren erzeugt wurden. Zu den Verfahren zur Trennung gehören die magnetische Trennung, das Abfangen mit einer Membran und das Abfangen auffesten Trägern. Bei jedem Verfahren kann eine Abfangeinheit an eine Magnetkugel, eine Membran oder einen festen Träger gebunden sein. Die Kugeln, die Membran oder der feste Träger können dann auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von Reaktionsprodukten getestet werden. Ein Beispiel für eine Abfangeinheit ist eine Nucleinsäuresequenz, die zu den erzeugten Reaktionsprodukten komplementär ist, und ein Antikörper gegen einen Rezeptor, der in den Primer oder das Reaktionsprodukt eingebaut ist. Das Trennsystem kann an ein Nachweissystem gekoppelt sein oder auch nicht.
Nachweissysteme, die sich für die praktische Durchführung dieser Erfindung eignen, umfassen homogene Systeme, die keine Auftrennung erfordern, und heterogene Systeme. In jedem System werden ein oder mehrere nachweisbare Marker verwendet, und die Reaktion oder Emission von Nachweissystem wird, vorzugsweise automatisch, überwacht. Beispiele für homogene Systeme sind die Fluoreszenzpolarisation, enzymvermittelte Immunoassays, Fluoreszenzenergieübertragung, Hybridisierungsschutz (z.B. Acridinium-Lumineszenz) und Immunoassays mit klonierten Enzymdonoren. Beispiele für heterogene Systeme sind Enzymmarkierungen (wie mit Peroxidase, Alkalischer Phosphatase und β-Galactosidase), Fluoreszenzmarkierungen (wie enzymatische Markierungen und direkte Fluoreszenzmarkierungen [z.B. Fluorescein und Rhodamin]), Chemilumineszenz und Biolumineszenz. Außerdem können Liposomen oder andere sackartige Teilchen mit Farbstoffen und anderen nachweisbaren Markern gefüllt und in solchen Nachweissystemen verwendet werden. In diesen Systemen können die nachweisbaren Marker direkt oder indirekt mit einer Abfangeinheit konjugiert werden, oder die Reaktionsprodukte können in Gegenwart eines Rezeptors erzeugt werden, der von einem Liganden für den Rezeptor erkannt werden kann.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf Verfahren zur Erzeugung amplifizierter Produkte, die als Sonden oder Matrizen für eine Sequenzanalyse dienen können. In dieser Ausgestaltung werden die oben beschriebenen Verfahren und Schritte zur Erzeugung amplifizierter Produkte verwendet. Die amplifizierten Produkte können dann so behandelt werden, daß die Erkennungssequenz für das einschneidende Enzym entfernt wird, zum Beispiel, indem man ein Restriktionsenzym verwendet. Auf diese Weise wird die Erkennungssequenz entfernt, und das verbleibende amplifizierte Produkt umfaßt eine Sonde, die in anderen Systemen verwendet werden kann.
In Gegenwart eines einzelsträngigen Zielfragments bindet ein Primer an seinen komplementären Zielstrang. In Gegenwart von Polymerase werden Nucleotide und substituierte Nucleotide entlang der verbleibenden Länge der Zielsequenz an das 3'-Ende des Primers angefügt, und Nucleotide und substituierte Nucleotide werden entlang der Primersequenz an das 3'-Ende der Zielsequenz angefügt. Das resultierende doppelsträngige Produkt hat eine Sequenz, die substituierte Nucleotide enthält, die an das 3'-Ende des Zielstranges gekoppelt sind, während der Primerstrang eine unmodifizierte Sequenz hat, die an das 5'-Ende einer verlängerten Sequenz gekoppelt ist, die zu der Zielsequenz komplementär ist.
Die Endonuclease spaltet dann die Erkennungssequenz auf dem Primerstrang, spaltet jedoch nicht die komplementäre Sequenz auf dem Zielstrang, da seine Sequenz die substituierten Nucleotide enthält. Die Polymerase verlängert das 3'-Ende an dem Einschnitt und verdrängt gleichzeitig den stromabwärts gelegenen Strang auf der 5'-Seite des Einschnitts, wobei sie ein Reaktionsprodukt erzeugt, das zu dem Zielstrang komplementär ist.
Das Verfahren kann auch mit zwei Primern funktionieren, wobei ein Primer an einen Strang einer Zielsequenz bindet und der andere Primer an den komplementären Strang der Zielsequenz bindet. Wenn diese Ausführungsform verwendet wird, ist offensichtlich, daß jedes Reaktionsprodukt als "Zielmolekül" für den anderen Primer dienen kann. Auf diese Weise schreitet die Amplifikation exponentiell fort.
Der in dieser Druckschrift verwendete Ausdruck "einschneiden" (nicking) bezieht sich auf die bevorzugte Spaltung eines von zwei Strängen, die in einer doppelsträngigen Erkennungsstelle vorhanden sind.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 umfaßt ein Flußdiagramm der Schritte in einem Beispiel für das in dieser Erfindung beanspruchte Verfahren für ein einzelsträngiges DNA-Fragment und einen Amplifikationsprimer.
Fig. 2 umfaßt ein Flußdiagramm der Schritte in einem Beispiel für das in dieser Erfindung beanspruchte Verfahren für doppelsträngige genomische DNA und zwei Amplifikationsprimer.

Ausführliche Beschreibung

In dieser Erfindung kann die Probe von jedem Material isoliert worden sein, von dem man annimmt, daß es die Zielnucleinsäuresequenz enthält. Bei Tieren, vorzugsweise Säugern und besonders bevorzugt Menschen, können die Quellen solcher Materialien Blut, Knochenmark, Lymphe, harte Gewebe (z.B. Leber, Milz, Niere, Lunge, Eierstock usw.), Sputum, Faeces und Urin umfassen. Andere Materialquellen können von Pflanzen, von Boden und weiteren Materialien, von denen man annimmt, daß sie biologische Organismen enthalten, abgeleitet sein.
Die Isolierung von Nucleinsäuren aus diesen Materialien kann nach irgendeinem von mehreren Verfahren erfolgen. Zu diesen Verfahren gehören die Verwendung von Detergenslysaten, die Ultrabeschallung, das Verwirbeln mit Glaskugeln und eine Französische Presse. In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, die isolierten Nucleinsäuren zu reinigen (z.B. wenn endogene Nucleasen vorhanden sind). In diesen Fällen kann die Reinigung der Nucleinsäuren durch Phenolextraktion, Chromatographie, Ionenaustausch, Gelelektrophorese oder dichteabhängige Zentrifugation erreicht werden.
Sobald die Nucleinsäuren isoliert sind, wird nur zu Veranschaulichungszwecken angenommen, daß es sich bei der genomischen Nucleinsäure um doppelsträngige DNA handelt. In solchen Fällen werden die Nucleinsäuren in der Probe bevorzugt in Fragmente mit einer Größe zwischen ungefähr 50-500 bp gespalten. Dies kann mit einem Restriktionsenzym, wie HhaI, FokI oder DpnI erfolgen. Die Wahl des Enzyms und der Länge der Sequenz sollte so erfolgen, daß die gesuchte Zielsequenz in ihrer Gesamtheit innerhalb des erzeugten Fragments enthalten ist oder daß wenigstens ein ausreichender Teil der Zielsequenz in dem Fragment vorhanden ist, um eine ausreichende Bindung der Primersequenz zu erhalten. Weitere Verfahren zur Erzeugung von Fragmenten sind PCR und Ultrabeschallung.
Die in diesem Verfahren verwendeten Primer haben im allgemeinen eine Länge von 25-100 Nucleotiden. Primer mit ungefähr 35 Nucleotiden werden bevorzugt. Diese Sequenz sollte zu einer Sequenz auf dem Zielmolekül im wesentlichen homolog sein, so daß unter sehr stringenten Bedingungen eine Bindung erfolgt. Der Primer sollte außerdem eine Sequenz (zum 5'-Ende hin) enthalten, die von der in späteren Schritten zu verwendenden einschneidenden Endonuclease erkannt wird. Die Erkennungssequenzen sind im allgemeinen, wenn auch nicht notwendigerweise, nichtpalindromisch. Die Sequenz kann auch so gewählt werden, daß das im vorherigen Schritt zur Spaltung der Fragmente verwendete Restriktionsenzym dasselbe ist wie die in späteren Schritten zu verwendende einschneidende Endonuclease.
Sobald Zielnucleinsäurefragmente erzeugt worden sind, werden sie denaturiert, so daß sie einzelsträngig werden, um eine Bindung der Primer an die Zielstränge zu ermöglichen. Die Erhöhung der Reaktionstemperatur auf ungefähr 95ºC ist ein bevorzugtes Verfahren zum Denaturieren der Nucleinsäuren. Weitere Verfahren umfassen eine Erhöhung des pH-Werts; dies erfordert jedoch, daß der pH-Wert wieder gesenkt wird, damit die Primer an das Zielmolekül binden können.
Entweder bevor oder nachdem die Nucleinsäuren denaturiert werden, werden ein Gemisch, das einen Überschuß aller vier Desoxynucleosidtriphosphate umfaßt, wobei wenigstens eines davon substituiert ist, eine Polymerase und eine Endonuclease hinzugefügt. (Wenn eine hohe Temperatur verwendet wird, um die Nucleinsäuren zu denaturieren, ist es vorzuziehen, sofern keine thermophilen Enzyme verwendet werden, die Enzyme nach der Denaturierung hinzuzufügen.) Das substituierte Desoxynucleosidtriphosphat sollte so modifiziert sein, daß es die Spaltung in dem Strang, der die substituierten Desoxynucleosidtriphosphate enthält, hemmt, jedoch nicht die Spaltung an dem anderen Strang hemmt. Beispiele für solche substituierten Desoxynucleosidtriphosphate sind 2'-Desoxyadenosin-5'-O-(1-thiotriphosphat), 5-Methyldesoxy- cytidin-5'-triphosphat, 2'-Desoxyuridin-5'-triphosphat und 7-Desaza-2'-desoxyguanosin-5'-triphosphat.
Das Gemisch, das die Reaktionskomponenten für die Erzeugung des Zielmoleküls und die Strangverdrängungsamplifikation umfaßt, kann gegebenenfalls auch NMP (1-Methyl-2-pyrrolidinon), Glycerin, Polyethylenglycol, Dimethylsulfoxid und/oder Formamid enthalten. Man glaubt, daß die Aufnahme solcher organischer Lösungsmittel die Reduktion von Hintergrundhybridisierungsreaktionen unterstützt.
Man sollte wissen, daß die Substitution der Desoxynucleotide auch nach dem Einbau in einen Strang erreicht werden kann. Zum Beispiel könnte eine Methylase, wie M.TaqI, verwendet werden, um Methylgruppen an den synthetisierten Strang anzuzufügen. Die an die Nucleotide angefügten Methylgruppen werden so substituiert und haben eine ähnliche Funktion wie die thiosubstituierten Nucleotide.
Man sollte weiterhin wissen, daß es, wenn alle Nucleotide substituiert sind, nicht notwendig ist, daß die Polymerase über keine 5'T3'-Exonuclease-Aktivität verfügt. Die Gegenwart der Substituenten überall im synthetisierten Strang wird diese Aktivität verhindern, ohne das System zu inaktivieren.
Wie für die Auswahl der in dem Primer eingebauten Erkennungssequenz beschrieben, sollte die Auswahl der in diesem Verfahren verwendeten Endonuclease so erfolgen, daß sie einen Strang auf der 3'-Seite (oder 5'-Seite) der Erkennungssequenz spaltet. Die Endonuclease sollte weiterhin so ausgewählt werden, daß sie die komplementäre Erkennungssequenz nicht spaltet, die durch die Anwesenheit der Polymerase im Zielstrang erzeugt wird, und sollte weiterhin so ausgewählt werden, daß sie mit annehmbarer Geschwindigkeit von der eingeschnittenen Erkennungssequenz abdissoziiert. Sie braucht nicht thermophil zu sein. Endonucleasen wie HincII, HindII, AvaI, Fnu4HI, Tth111I und NciI werden bevorzugt.
Man kann neben den in dieser Anmeldung im einzelnen aufgeführten mehrere alternative Einschneideenzymsysteme ins Auge fassen. Zum Beispiel wird allgemein angenommen, daß Restriktions-Endonucleasen der Klasse 115 (z.B. FokI) zwei DNA-Spaltungszentren innerhalb einer einzigen Polypeptideinheit enthalten. Wenn eines der Spaltungszentren inaktiviert würde, etwa durch ortsspezifische Mutagenese, könnte das resultierende einschneidende Enzym in einem Amplifikationssystem verwendet werden, das keine modifizierten Desoxynucleosidtriphosphate erfordert. Als weiteres Beispiel wurde von dem Restriktionsenzym EcoRI gezeigt, daß es vorzugsweise einen Strang in nichtkanonischen Erkennungsbereichen spaltet, oder wenn sein kanonischer Erkennungsbereich von einem Oligopurintrakt flankiert ist (Thielking et al. (1990) Biochemistry 29, 4682; Lesser et al. (1990) Science 250, 776; Venditti & Wells (1991) J. Biol. Chem. 266, 16786) . Als weiteres Beispiel spaltet das Restriktionsenzym DpnI (erhältlich von New England Biolabs, Beverly MA) eine Erkennungsstelle, die an beiden Strängen me&sup6;dA enthält. DpnI oder ein analoges Restriktionsenzym kann in der Lage sein, den methylhaltigen Strang eines hemimethylierten Erkennungsbereichs einzuschneiden. Ein solches System würde SDA-Primer (P&sub1; und P&sub2;) mit methylierten Erkennungssequenzen zusammen mit unmodifizierten Desoxynucleosidtriphosphaten verwenden. Alternativ dazu ist bekannt, daß bestimmte Restriktionsenzyme den nichtmethylierten Strang eines hemimethylierten Erkennungsbereichs spalten (z.B. MspI und me&sup5;dC). Ein solches System würde ein methyliertes Desoxynucleosidtriphosphat verwenden. Schließlich könnte man Replikationsstartpunktproteine verwenden, um einen Strang einer Erkennungssequenz einzuschneiden.
Das folgende Diagramm führt Enzyme, ihre Erkennungssequenzen und das modifizierte dNTP für die Verwendung mit dem Verfahren auf: Enzym Erkennungsbereich modifiziertes
Polymerasen, die sich für dieses Verfahren eignen, umfassen solche, die an der Stelle des Einschnitts eine 5'-3'-Polymerisation starten. Die Polymerase sollte auch den polymerisierten Strang stromabwärts von dem Einschnitt verdrängen und, was wichtig ist, sollte außerdem über keine 5'T3'-Exonuclease-Aktivität verfügen. Polymerasen, wie das Klenow-Fragment der DNA- Polymerase I und das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, dem die Exonucleaseaktivität fehlt, und ein ähnliches Fragment der Bst-Polymerase (Bio-Rad, Richmond, CA) sind geeignet. Mit der SEQUENASE 1.0 und der SEQUENASE 2.0 (US Biochemical), der T5-DNA- Polymerase und den Phi29-DNA-Polymerasen geht es auch. Man sollte wissen, daß eine Polymerase, die normalerweise über eine solche Exonucleaseaktivität verfügt, als eine angesehen werden kann, der eine solche Aktivität "fehlt", wenn diese Aktivität durch die Zugabe eines Blockierungsmittels blockiert ist.
Ein weiteres Merkmal dieses Verfahrens ist, daß es keinen Temperaturkreislauf erfordert. Viele Amplifikationsverfahren erfordern einen Temperaturkreislauf, um das Zielmolekül von dem synthetisierten Strang abzudissoziieren. In diesem Verfahren kann eine einzige Temperatur verwendet werden, nachdem die Denaturierung stattgefunden hat. Die Temperatur der Reaktion sollte hoch genug sein, um ein Niveau der Stringenz einzustellen, das die nichtspezifische Bindung minimiert, aber tief genug, um eine spezifische Hybridisierung mit dem Zielstrang zu ermöglichen. Außerdem sollte die richtige Temperatur eine wirksame Enzymaktivität unterstützen. Es wurde gefunden, daß von etwa 37ºC bis etwa 42ºC ein bevorzugter Temperaturbereich ist. Eine Denaturierung der Enzyme und der Nucleinsäure ist zu vermeiden.
Unter Bezugnahme auf Fig. 1 wird ein Beispiel für diese Erfindung dargelegt. In diesem Beispiel stellt der mit P markierte Strang den Primer dar und enthält am 5'-Ende die Sequenz CCGGG, die von der Endonuclease NciI erkannt wird. Der mit T markierte Strang ist die Zielsequenz, die bereits fragmentiert und einzelsträngig gemacht wurde. In diesem Verfahren bindet der Primer an das Zielmolekül, und in Gegenwart von Polymerase, Desoxynucleosidtriphosphaten und α-thiosubstituiertem Desoxycytosintriphosphat wird der Primer um die Länge des Zielmoleküls verlängert, während das Zielmolekül über die Erkennungssequenz hinaus verlängert wird. In Gegenwart der Endonuclease NciI wird der Primerstrang zwischen den C-G-Resten eingeschnitten. Im Gegenwart der Polymerase, der die 5'T3'-Exonucleaseaktivität fehlt, wird das 3'-Ende an dem Einschnitt verlängert, und stromabwärts wird der Primer- Strang, am Einschnitt beginnend, von dem Zielstrang weggedrängt, so daß ein Reaktionsprodukt entsteht, und ein neuer Strang wird synthetisiert. Danach (nicht gezeigt) wird, kurz gesagt, der neu synthetisierte Strang ebenfalls von der Endonuclease eingeschnitten, und die Polymerase verdrängt dann diesen Strang, wobei sie einen anderen erzeugt, bis die Reaktion entweder abgebrochen wird oder eines der Reagentien knapp wird.
Figur 2 stellt eine Strangverdrängungsamplifikation (SDA; strand displacement amplification) unter Verwendung von zwei Primern dar. Der erste Schritt besteht darin, ein Ziel-DNA-Fragment mit definiertem 5'- und 3'-Ende zu erzeugen (z.B. durch Spaltung mit einem Restriktionsenzym) . Nach der Denaturierung in der Hitze binden die beiden einzelsträngigen Zielfragmente (T&sub1; und T&sub2;) an die beiden SDA-Primer (P&sub1; bzw. P&sub2;), die im Überschuß vorhanden sind. Die 5'-Überhänge von P&sub1; und P&sub2; enthalten eine Erkennungssequenz für das einschneidende Enzym. Die DNA-Polymerase verlängert die 3'-Enden der Duplexe unter Verwendung von 3 Desoxynucleosidtriphosphaten und einem modifizierten Desoxynucleosidtriphosphat, was hemimodifizierte Erkennungsbereiche auf P&sub1;T&sub1; und P&sub2;T&sub2; erzeugt. Das einschneidende Enzym schneidet die ungeschützten Primerstränge der hemimodifizierten Erkennungsbereiche ein und läßt die modifizierten komplementären Stränge intakt. Die DNA-Polymerase verlängert das 3'-Ende am Einschnitt auf P&sub1;T&sub1; und verdrängt den stromabwärts gelegenen Strang, der zu T&sub2; funktionell äquivalent ist. Ähnlich führt eine Verlängerung am Einschnitt von P&sub2;T&sub2; zur Verdrängung eines stromabwärts gelegenen Stranges, der zu T&sub1; funktionell äquivalent ist. Die Schritte des Einschneidens und des Polymerisierens/Verdrängens wiederholen sich an P&sub1;T&sub1; und P&sub2;T&sub2; kontinuierlich, da die Verlängerung an einem Einschnitt einen einschneidbaren Erkennungsbereich regeneriert. Die Amplifikation des Zielmoleküls erfolgt exponentiell, da von P&sub1;T&sub1; verdrängte Stränge als Zielmolekül für P&sub2; dienen, während von P&sub2;T&sub2; verdrängte Stränge als Zielmolekül für P&sub1; dienen. Diese Schritte wiederholen sich kontinuierlich während des gesamten Verlaufs der Amplifikation. Zum Beispiel geht eine 10&sup6;-fache Amplifikation theoretisch aus ca. 20 Wiederholungen oder Durchläufen der Schritte in Figur 2 hervor (2²&sup0; = 10&sup6;).
Sinn- und Gegensinn-DNA-Stränge sind durch dünne und dicke Linien voneinander unterschieden.
SDA kann verwendet werden, um einzelsträngige DNA-Sonden oder einzelsträngige Matrizen zum Sequenzieren zu erzeugen. Zu diesem Zweck arbeitet die SDA entweder mit einem einzelnen Primer (Figur 1) oder unter Verwendung von zwei Primern (Figur 2), wobei ein Primer gegenüber dem anderen im Überschuß vorliegt. Das Ergebnis ist die Erzeugung eines Überschusses von einem verdrängten Einzelstrang gegenüber dem anderen.
Die Gegenwart des amplifizierten Zielmoleküls kann dann nach irgendeinem von mehreren Verfahren erfolgen. Ein Verfahren besteht darin, Reaktionsprodukte einer spezifischen Größe mit Hilfe der Gelelektrophorese nachzuweisen. Dieses Verfahren ist besonders geeignet, wenn die verwendeten Nucleotide mit einem Radionuklid, wie ³²P, markiert sind. Weitere Verfahren umfassen das Markieren der Nucleotide mit einer physischen Markierung, wie Biotin. Biotinhaltige Reaktionsprodukte können dann mit Hilfe von Avidin, das an ein signalerzeugendes Enzym, wie Peroxidase, gebunden ist, identifiziert werden.
Nachweissysteme, die für die praktische Durchführung dieser Erfindung geeignet sind, umfassen homogene Systeme, die keine Auftrennung erfordern, und heterogene Systeme. In jedem System werden ein oder mehrere nachweisbare Marker verwendet, und die Reaktion oder Emission von Nachweissystem wird, vorzugsweise automatisch, überwacht. Beispiele für homogene Systeme sind die Fluoreszenzpolarisation, enzymvermittelte Immunoassays, Fluoreszenzenergieübertragung, Hybridisierungsschutz (z.B. Acridinium- Lumineszenz) und Immunoassays mit klonierten Enzymdonoren. Beispiele für heterogene Systeme sind Enzymmarkierungen (wie mit Peroxidase, Alkalischer Phosphatase und β-Galactosidase), Fluoreszenzmarkierungen (wie enzymatische Markierungen und direkte Fluoreszenzmarkierungen [z.B. Fluorescein und Rhodamin]), Chemilumineszenz und Biolumineszenz. Außerdem können Liposomen oder andere sackartige Teilchen mit Farbstoffen und anderen nachweisbaren Markern gefüllt und in solchen Nachweissystemen verwendet werden. In diesen Systemen können die nachweisbaren Marker direkt oder indirekt mit einer Abfangeinheit konjugiert werden, oder die amplifizierten Produkte können in Gegenwart eines Rezeptors erzeugt werden, der von einem Liganden für den Rezeptor erkannt werden kann.
Die folgenden Beispiele erläutern die spezifischen Ausführungsformen der hier beschriebenen Erfindung. Wie der Fachmann erkennen würde, sind vielfältige Änderungen und Modifikationen möglich und werden im Umfang der beschriebenen Erfindung in Betracht gezogen.

Beispiel 1

Dieses Beispiel erläutert SDA unter Verwendung eines FokI- Restriktionsschrittes zur Erzeugung von Zielfragmenten vor der Amplifikation. Zwei Primer, die am 3'-Ende eine primäre Aminogruppe beinhalten, wurden mit einem Applied-Biosystems-380B- Instrument synthetisiert, wobei Phosphoramiditchemie und 3'-Amin- ON-CPG-Säulen (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) verwendet wurden. Die Schutzgruppe der Nucleotide wurde mit Ammonium entfernt, und die Nucleotide wurden durch denaturierende Gelelektrophorese gereinigt. Die Primersequenzen waren:
SEQ ID NO: 1 und
SEQ ID NO: 2.
Plasmid pBR322 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) wurde bei 25ºC mit 0,05 mg/ml E.-coli-DNA, 50 mM K-Acetat, 10 mM Mg-Acetat, 1 mM DTT, 12,5 mM TRIS (pH 7,9) in einer Verdünnungsreihe verdünnt. 20-ul-Proben, die 1 ug E.-coli-DNA und verschiedene Mengen pBR322 enthielten, wurden bei 37ºC 3 Stunden mit 10 Einheiten FokI (New England Biolabs, Beverly, MA) verdaut. Die FokI-Verdauprodukte von pBR322/E.-coli-DNA wurden in Gegenwart von 12,5 rnM K-Acetat, 10 mM Mg-Acetat, 1 mM DTT, 12,5 mM TRIS (pH 7,9) bei 25ºC, 100 ug/ml BSA, jeweils 0,3 mM dATP, dGTP, TTP, dCTP(αS) (Pharmacia, Piscataway, NJ) und 0,1 uM jedes Primers auf 100 u1 verdünnt. Eine Gruppe von Proben wurde nach der Zugabe von 4 Einheiten Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, dem die 5'T3'- Exonucleaseaktivität fehlt (US Biochemical, Cleveland OH), und 48 Einheiten NciI (New England Biolabs) 4 Stunden bei 45ºC einer Strangverdrängungsamplifikation unterzogen. Eine zweite Gruppe von Proben wurde ohne die Polymerase und ohne NciI als nicht amplifizierte Standards durchlaufen gelassen.
Um die Reaktionsprodukte nachzuweisen, wurde eine pBR322-spezifische Nachweissonde (SEQ ID NO: 3) hergestellt und unter Verwendung von Polynucleotid-Kinase mit ³²P markiert. 10-ul-Aliquote der amplifizierten und nicht amplifizierten FokI/pBR322/E.-coli- DNA-Proben wurden mit 2 ul 1,8 uM, mit ³²P markierter Nachweissonde und 0,5 Einheiten/ul Taq-DNA-Polymerase (United States Biochemical) gemischt. Die Proben wurden 2 Minuten auf 95ºC und 5 Minuten auf 50ºC erhitzt, mit 50% Harnstoff abgelöscht, und ein Teil wurde auf ein 10%iges denaturierendes Polyacrylamidgel aufgebracht. Die Gegenwart amplifizierter Reaktionsprodukte wurde anhand der Verlängerung der ³²P-markierten Nachweissonde auf eine Länge von 43 oder 60 Nucleotide nachgewiesen. Nicht amplifiziertes FokI/pBR322 wurde durch eine Verlängerung auf 40 Nucleotide angezeigt. Die ³²P-markierten Elektrophoresebanden wurden durch Flüssigszintillationszählen quantifiziert, wobei geeignete Hintergrundbanden abgezogen wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle I gezeigt. Tabelle I Zahl der pBR322-Moleküle amplifiziert nicht amplifiziert
NB = nicht bestimmt
Wie man aus Tabelle I ersieht, nimmt die Zahl der Zählungen pro Minute (cpm) mit abnehmender Menge von pBR322-DNA in dem Aliquot ebenfalls ab.

Beispiel 2

Dieses Beispiel erläutert SDA unter Verwendung einer synthetischen einzelsträngigen Ziel-DNA-Sequenz. Eine synthetische Zielnucleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO: 4 wurde aufgebaut. Primer für die Strangverdrängungsamplifikationsreaktion unter Verwendung des Restriktionsenzyms HincII (New England Biolabs) wurden synthetisiert, so daß man ein 3'-NH&sub2;-Ende erhielt, wobei 3'-Amin-on-CPG-Säulen verwendet wurden. Die verwendeten Primersequenzen waren:
SEQ ID NO: 5 und
SEQ ID NO: 6.
Eine Sonde zum Nachweis der Reaktionsprodukte hatte die Sequenz: SEQ ID NO: 7. Alle synthetischen Sequenzen wurden wie oben mit einem Applied-Biosystems-380B-Instrument synthetisiert und auf 10%igen oder 15%igen Polyacrylamidgelen, die 50% Harnstoff enthielten, gereinigt. Die herausgeschnittenen Banden wurden in 1/2X-TBE-Puffer elektroeluiert.
SEQ ID NO: 4 wurde in 0,3 uM der Primer (d.h. SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6) verdünnt, was eine endgültige Konzentration der Stammlösung von 600 000 Zielmolekülen/ul ergab. Dieses Gemisch wurde 3 Minuten gekocht und bei 37ºC stehengelassen. Eine Verdünnungsreihe mit 4fachen Verdünnungen dieser Stammlösung wurde dann in Gegenwart der Primer hergestellt. (In der Kontrollprobe waren nur Amplifikationsprimer vorhanden.)
Zwanzig ul der verdünnten Zielmolekülstammlösungen wurden zu einem Gemisch gegeben, so daß man ein Endvolumen von 60 ul und folgende Endkonzentrationen der Komponenten erhielt: 20 mM TRIS (pH 7,2) bei 25ºC, 0,1 uM der Primersequenzen, 20 mM Ammoniumsulfat, 50 mM KCl, 50 Einheiten HincII, 5 Einheiten Exo&supmin;-Klenow- Polymerase (US Biochemical), 1 mM DTT, 5 mM MgCl&sub2; und jeweils 300 uM 5'dCTP, 5'dGTP, 5'dTTP und 5'dATP(αS). Die Amplifikationsreaktion wurde 1 oder 2 Stunden bei 37ºC fortschreiten gelassen. In einer Reaktionsgruppe wurden nach 1 Stunde weitere 50 Einheiten HincII hinzugefügt, und man ließ die Reaktion eine weitere Stunde fortschreiten.
Am Ende der Reaktionszeiten wurde ein 10-ul-Aliquot jedes Gemischs auf Eis gegeben. Zu diesen 10 ul gab man 1 ul einer 1-uM-Stammlösung von Abfangsonde, die frisch mit ³²P markiert wurde. Dieses Gemisch wurde 3 Minuten gekocht und auf 37ºC abgekühlt, woraufhin 1 ul Sequenase 2.0 (1 Einheit/ul; U.S. Biochemical) hinzugefügt wurde. (Dieses Enzym polymerisiert die Abfangsonde entlang der vollen Länge jedes Reaktionsprodukts, wenn die Abfangsonde an ein Reaktionsprodukt gebunden ist.) Diese Verlängerungsreaktion wurde 15 Minuten bei 37ºC fortschreiten gelassen. Zu diesem Gemisch gab man ein gleiches Volumen Ladefarbstoffe in 50% Harnstoff. Die Proben wurden wiederum 3 Minuten lang gekocht, bevor man sie auf ein 10%iges Polyacrylamidgel gab, das 50% Harnstoff enthielt. Die auf das Gel gegebenen Proben stellten 2,5 ul der ursprünglichen 60 ul des Reaktionsgemischs dar. Man ließ die Elektrophorese mit 59 W 1 bis 1,5 Stunden fort schreiten, danach wurde das Gel entnommen und über Nacht bei -70ºC auf Film gelegt. Die Banden wurden nach der Belichtung sichtbar gemacht, herausgeschnitten und durch Flüssigszintillation quantifiziert. Tabelle II Zahl der Zielmoleküle Stunde Stunden Stunden mit weiterem
Aus Tabelle II ist zu erkennen, daß SDA zwischen 0 und 30 000 Anfangszielmolekülen klar unterscheidet.

Beispiel 3

Dies ist ein Beispiel, bei dem vor der SDA ein FokI-Restriktionsverdau vorgenommen wurde. Die folgenden Primersequenzen wurden verwendet:
SEQ ID NO: 8 und
SEQ ID NO: 9.
Diese Sequenzen wurden wie in den anderen Beispielen erzeugt und wurden verwendet, um eine Zielsequenz in dem Plasmid pBR322 nachzuweisen.
Ein ug pBR322 wurde bei 37ºC 2 Stunden mit 8 Einheiten FokI verdaut und dann mit 0,05 mg/ml Human-Placenta-DNA, die mit HphI verdaut worden war, 50 mM KCI, 5 mM MgCl&sub2;, 20 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 1 mM DTT und 20 mM TRIS (pH 7,2 bei 25ºC) in einer Verdünnungsreihe verdünnt. 10-ul-Proben, die 0,5 ug Human-Placenta-DNA und verschiedene Mengen pBR322 enthielten, wurden in Gegenwart von 50 mM KC1, 5 mM MgCl&sub2;, 20 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 1 mM DTT und 20 mM TRIS (pH 7,2 bei 25ºC), 100 ug/ml BSA, jeweils 0,1 mM dGTP, TTP, dCTP (Pharmacia), 0,5 mM dATP(αS) (Pharmacia) und 0,1 uM jeder Sonde auf 100 ul verdünnt. Eine Gruppe von Proben wurde nach der Zugabe von 5 Einheiten Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, dem die 5'T3'-Exonucleaseaktivität fehlt, und 50 Einheiten HincII 3,5 Stunden bei 39ºC einer Strangverdrängungsamplifikation unterzogen. Eine zweite Gruppe von Proben wurde ohne Polymerase und ohne HincII als nicht amplifizierte Standards durchlaufen gelassen.
Um die Reaktionsprodukte nachzuweisen, wurde der pBR322-Nachweisprimer mit der SEQ ID NO: 7 verwendet, nachdem er mit ³²P markiert wurde. 10-ul-Aliquote der amplifizierten und nicht amplifizierten FokI/pBR322/Human-Placenta-DNA-Proben wurden mit 2 ul 1 uM, mit ³²P markiertem Nachweisprimer gemischt und 2 Minuten auf 95ºC erhitzt. Zwei Einheiten Sequenase 2.0 wurden dann hinzugefügt, und die Proben wurden 5 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Proben wurden mit 50% Harnstoff abgelöscht und auf ein 10%iges denaturierendes Polyacrylamidgel aufgebracht. Die Gegenwart amplifizierter Reaktionsprodukte wurde anhand der Verlängerung des ³²P-markierten Nachweisprimers auf Längen von 54 und 75 Nucleotide nachgewiesen. Nicht amplifizierte Proben wurden durch eine Verlängerung auf 50 Nucleotide angezeigt. Die Elektrophorese der markierten Banden wurde durch Flüssigszintillationszählen quantifiziert, wobei geeignete Hintergrundbanden abgezogen wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle III gezeigt. Tabelle III Zahl der pBR322-Moleküle amplifiziert nicht amplifiziert
NB = nicht bestimmt
* Die amplifizierte Probe mit Null zugesetzten pBR322-Molekülen zeigte schwache amplifizierte zielmolekülspezifische Banden (54- und 75-mer) aufgrund einer unvorhergesehenen Verunreinigung mit pBR322.
Ein Vergleich der nicht amplifizierten Proben mit 10&sup9; und 10&sup8; pBR322-Molekülen mit entsprechenden Proben, die 10&sup4; bzw. 10³ pBR322-Moleküle enthielten, ergibt einen Amplifikationsfaktor von über 10&sup5;-fach. Weiterhin wurde gefunden, daß man durch Einstellen der Pufferzusammensetzung und der Desoxynucleosidtriphosphatkonzentrationen die Amplifikationsleistung verbessern kann. Es wurde gefunden, daß die Aufnahme von (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, ein relativ niedriger pH-Wert und ein dATP(αS) :dGTP-Verhältnis von 5:1 die Amplifikationswirkung erhöhen.
Obwohl die Erfindung in bezug auf spezifische Modifikationen beschrieben wurde, sind deren Einzelheiten nicht als Einschränkungen anzusehen, denn man wird erkennen, daß man auf verschiedene Äquivalente, Änderungen und Modifikationen zurückgreifen kann, ohne von ihrem Geiste und Umfang abzuweichen, und es gilt als vereinbart, daß solche äquivalenten Ausführungsformen hier mit eingeschlossen sein sollen.
Allen in dieser Beschreibung genannten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen läßt sich der Kenntnisstand des normalen Fachmanns erkennen, an den sich diese Erfindung richtet. Auf alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen wird hier in demselben Maße ausdrücklich Bezug genommen, als ob bei jeder einzelnen Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und individuell angegeben worden wäre, auf sie sei ausdrücklich Bezug genommen.
Der normale Fachmann wird erkennen, daß viele Anderungen und Modifikationen in der Erfindung vorgenommen werden können, ohne vom Geiste oder vom Umfang der beigefügten Ansprüche abzuweichen.

Claims

1. Verfahren zum Amplifizieren einer Zielnucleinsäuresequenz, das die Schritte umfaßt:

a) Hinzufügen eines Reaktionsgemischs, umfassend einen Überschuß an Desoxynucleosidtriphosphaten, von denen wenigstens eines substituiert ist, eine DNA-Polymerase, die über keine 5'T3'-Exonuclease-Aktivität verfügt, Primer, die zu den Einzelsträngen der Zielsequenz komplementär sind und weiterhin am 5'-Ende eine Erkennungssequenz für eine Endonuclease aufweisen, und eine Endonuclease, die die Erkennungssequenz in dem Primer zu spalten vermag, zu einer Zielnucleinsäure- Sequenz;

b) Hybridisieren der Primer mit der Zielnucleinsäure- Sequenz, wie es in Fig. 1/2 oder Fig. 2/2 gezeigt ist; und

c) Umsetzen des Reaktionsgemisches mit den einzelsträngigen Fragmenten während einer Zeit, die ausreicht, um Reaktionsprodukte zu erzeugen.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Zielsequenz doppelsträngig ist und vor Schritt a) einzelsträngig gemacht wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Polymerase aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, dem die Exonucleaseaktivität fehlt, und dem Klenow-Fragment der Bst-Polymerase besteht.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Endonuclease aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus NciI, AvaI, HincII und Fnu4HI besteht.

5. Verfahren zum Amplifizieren einer Zielnucleinsäuresequenz in einer Probe biologischen Materials, das von einem Menschen stammt, umfassend die Schritte:

a) Isolieren von Nucleinsäuren aus der Probe;

b) Herstellen doppelsträngiger Fragmente der Nucleinsäuren durch Hinzufügen eines Restriktionsenzyms zu der Probe;

c) Erzeugen einzelsträngiger Nucleinsäurefragmente durch Erwärmen der Probe;

d) Hinzufügen eines Reaktionsgemischs, umfassend einen Überschuß an Desoxynucleosidtriphosphaten, von denen wenigstens eines substituiert ist, Klenow-Fragmente der DNA-Polymerase I, Primer, die zu den Einzelsträngen der Ziel Sequenz komplementär sind und weiterhin am 5'-Ende die Erkennungssequenz 5'GTPyPuAC3' aufweisen, und HincII;

e) Hybridisieren der Primer mit der Zielnucleinsäure- sequenz, wie es in Fig. 1/2 oder Fig. 2/2 gezeigt ist;

f) Umsetzen des Reaktionsgemisches mit den einzelsträngigen Fragmenten während einer Zeit, die ausreicht, um Reaktionsprodukte zu erzeugen; und

g) Nachweisen der gebildeten Reaktionsprodukte.

6. Verfahren zum Erzeugen mehrfacher Kopien einer einzelnen Nucleinsäuresequenz, das die Schritte umfaßt:

a) Herstellen eines oder mehrerer einzelsträngiger Fragmente der zu kopierenden Nucleinsäuresequenz;

b) Hinzufügen eines Reaktionsgemischs, umfassend einen Überschuß an Desoxynucleosidtriphosphaten, von denen wenigstens eines substituiert ist, eine DNA-Polymerase, die über keine 5'T3'-Exonuclease-Aktivität verfügt, einen Primer, der zu den Einzelsträngen der Zielsequenz komplementär ist und weiterhin am 5'-Ende eine Erkennungssequenz für eine Endonuclease aufweist, und eine Endonuclease, die die Erkennungssequenz in der Sonde zu spalten vermag;

c) Hybridisieren der Primer mit der Zielnucleinsäure- sequenz, wie es in Fig. 1/2 oder Fig. 2/2 gezeigt ist; und

d) Umsetzen des Reaktionsgemisches mit den einzelsträngigen Fragmenten während einer Zeit, die ausreicht, um Reaktionsprodukte zu erzeugen.

7. Verfahren zum Amplifizieren einer Zielnucleinsäuresequenz, das die Schritte umfaßt

a) Hinzufügen eines Reaktionsgemischs, umfassend einen Überschuß an Desoxynucleosidtriphosphaten, eine DNA- Polymerase, die über keine 5'T3'-Exonuclease-Aktivität verfügt, Primer, die zu den Einzelsträngen der Zielsequenz komplementär sind und weiterhin am 5'-Ende eine Erkennungssequenz für eine Endonuclease aufweisen, und eine Endonuclease, die nur den einen Strang in der Erkennungssequenz in dem Primer zu Spalten vermag, zu einer Zielnucleinsäuresequenz;

8. Verfahren zum Amplifizieren einer Zielnucleinsäuresequenz in einer Probe biologischen Materials, umfassend die Schritte:

a) Isolieren von Nucleinsäuren aus der Probe;

b) Herstellen doppelsträngiger Fragmente der Nuclein- Säuren in der Probe;

c) Erzeugen einzelsträngiger Nucleinsäurefragmente;

d) Hinzufügen eines Reaktionsgemischs, umfassend einen Überschuß an Desoxynucleosidtriphosphaten, eine DNA- Polymerase, die über keine 5'T3'-Exonuclease-Aktivität verfügt, Primer, die zu den Einzelsträngen der Zielsequenz komplementär sind und weiterhin am 5'-Ende eine Erkennungssequenz für eine Endonuclease aufweisen, und eine Endonuclease, die nur den einen Strang in der Erkennungssequenz in dem Primer zu spalten vermag;

g) Nachweisen der gebildeten Reaktionsprodukte.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Polymerase aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, dem die Exonucleaseaktivität fehlt, und dem Klenow-Fragment der Bst-Polymerase besteht.

10. Verfahren zum Erzeugen mehrfacher Kopien einer einzelnen Nucleinsäuresequenz, das die Schritte umfaßt:

b) Hinzufügen eines Reaktionsgemischs, umfassend einen Überschuß an Desoxynucleosidtriphosphaten, eine DNA- Polymerase, die über keine 5'T3'-Exonuclease-Aktivität verfügt, einen Primer, der zu den Einzelsträngen der Zielsequenz komplementär ist und weiterhin am 5'-Ende eine Erkennungssequenz für eine Endonuclease aufweist, und eine Endonuclease, die nur den einen Strang in der Erkennungssequenz in dem Primer zu spalten vermag;