JP2005516610A - ニック形成剤を用いる遺伝子発現分析 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ニック形成剤を用いる遺伝子発現分析のための方法および組成物を提供する。本発明は、cDNA集団中の標的cDNA分子、または生物学的サンプル中の標的mRNA分子の存在もしくは非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する:(A)(i)cDNA集団のcDNA分子または生物学的サンプルのRNA分子、(ii)テンプレート核酸分子、(iii)認識配列を認識するニック形成剤、(iv)DNAポリメラーゼ、および(v)1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸、を含む、混合物を形成する工程;(B)一本鎖核酸分子が増幅される条件に、混合物を維持する工程;ならびに(C)一本鎖核酸分子の存在もしくは非存在を検出して、cDNA集団中の標的cDNA分子の存在もしくは非存在を決定するか、または生物学的サンプル中の標的mRNAの存在もしくは非存在を決定する工程。
Description
(発明の背景)
(発明の分野)
本発明は、分子生物学の分野に関し、より具体的には、核酸を含む方法および組成物に関し、そしてなおより具体的には、ニック形成剤を用いる遺伝子発現分析に関連する方法および組成物に関する。
(発明の分野)
本発明は、分子生物学の分野に関し、より具体的には、核酸を含む方法および組成物に関し、そしてなおより具体的には、ニック形成剤を用いる遺伝子発現分析に関連する方法および組成物に関する。
(関連技術の説明)
遺伝子発現分析は、疾患ならびに生物の成長および発達に関与する遺伝子を同定するために重要である。このような分析の感度を増加させるために、cDNA分子が、検出または定量される前に増幅され得る。多数の核酸増幅方法が、cDNAを増幅するために使用され得、この方法は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、および鎖置換増幅(SDA)である。核酸増幅のために広く使用される方法のほとんど(例えば、PCR)が、変性および再アニーリングのサイクルを達成するために、異なる温度のサイクルを必要とする。他の方法は、等温で実施され得るが、複数セットのプライマー(例えば、好熱性SDAのバンパープライマー)を必要とする。従って、遺伝子発現分析の感度を増加させるための、より単純かつより効率的なcDNA増幅方法について、当該分野において長期にわたり、必要性が感じられている。
遺伝子発現分析は、疾患ならびに生物の成長および発達に関与する遺伝子を同定するために重要である。このような分析の感度を増加させるために、cDNA分子が、検出または定量される前に増幅され得る。多数の核酸増幅方法が、cDNAを増幅するために使用され得、この方法は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、および鎖置換増幅(SDA)である。核酸増幅のために広く使用される方法のほとんど(例えば、PCR)が、変性および再アニーリングのサイクルを達成するために、異なる温度のサイクルを必要とする。他の方法は、等温で実施され得るが、複数セットのプライマー(例えば、好熱性SDAのバンパープライマー)を必要とする。従って、遺伝子発現分析の感度を増加させるための、より単純かつより効率的なcDNA増幅方法について、当該分野において長期にわたり、必要性が感じられている。
本発明は、この必要性および以下に記載されるような関連する必要性を満たす。
(発明の簡単な要旨)
cDNA分子のような核酸を増幅するための、現在利用可能な方法とは対照的に、本発明は、複数セットのオリゴヌクレオチドプライマーの使用を必要としない、核酸増幅のための方法を提供する。さらに、本発明は、等温条件下で実施され得、従って、異なる温度のサイクルを提供するための設備に関連する費用を回避し得る。
cDNA分子のような核酸を増幅するための、現在利用可能な方法とは対照的に、本発明は、複数セットのオリゴヌクレオチドプライマーの使用を必要としない、核酸増幅のための方法を提供する。さらに、本発明は、等温条件下で実施され得、従って、異なる温度のサイクルを提供するための設備に関連する費用を回避し得る。
1つの局面において、本発明は、cDNA集団中の標的cDNA分子の存在もしくは非存在を決定するため、または生物学的サンプル中の標的mRNA分子の存在もしくは非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する:
(A) 以下:
(i) cDNA集団のcDNA分子または生物学的サンプルのRNA分子、
(ii) 以下:
(a) ニック形成剤認識配列の一方の鎖を含み、そして
(b) 標的cDNAが一本鎖である場合、標的cDNAに少なくとも実質的に相補的であるか、
標的cDNAが二本鎖である場合、標的cDNAの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的であるか、または
標的mRNAに少なくとも実質的に相補的である、テンプレート核酸分子、
(iii) 認識配列を認識するニック形成剤、
(iv) DNAポリメラーゼ、および
(v) 1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸、
を含む、混合物を形成する工程;
(B) 標的cDNAがcDNA集団中に存在するならば、または標的mRNAが生物学的サンプル中に存在するならば、標的cDNAの一部、標的mRNAの一部、またはテンプレート核酸分子の一部をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子が増幅される条件に、混合物を維持する工程;ならびに
(C) 一本鎖核酸分子の存在もしくは非存在を検出して、cDNA集団中の標的cDNA分子の存在もしくは非存在を決定するか、または生物学的サンプル中の標的mRNAの存在もしくは非存在を決定する工程。
(A) 以下:
(i) cDNA集団のcDNA分子または生物学的サンプルのRNA分子、
(ii) 以下:
(a) ニック形成剤認識配列の一方の鎖を含み、そして
(b) 標的cDNAが一本鎖である場合、標的cDNAに少なくとも実質的に相補的であるか、
標的cDNAが二本鎖である場合、標的cDNAの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的であるか、または
標的mRNAに少なくとも実質的に相補的である、テンプレート核酸分子、
(iii) 認識配列を認識するニック形成剤、
(iv) DNAポリメラーゼ、および
(v) 1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸、
を含む、混合物を形成する工程;
(B) 標的cDNAがcDNA集団中に存在するならば、または標的mRNAが生物学的サンプル中に存在するならば、標的cDNAの一部、標的mRNAの一部、またはテンプレート核酸分子の一部をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子が増幅される条件に、混合物を維持する工程;ならびに
(C) 一本鎖核酸分子の存在もしくは非存在を検出して、cDNA集団中の標的cDNA分子の存在もしくは非存在を決定するか、または生物学的サンプル中の標的mRNAの存在もしくは非存在を決定する工程。
特定の実施形態において、テンプレート核酸は、ニック形成剤認識配列の一方の鎖の配列に対して3’側に配置される配列を含み、この配列は、標的cDNAが一本鎖である場合、標的cDNAの3’部分に少なくとも実質的に相補的であるか、標的cDNAが二本鎖である場合、標的cDNAの一方の鎖の3’部分に少なくとも実質的に相補的であるか、または標的mRNAに少なくとも実質的に相補的である。
いくつかの実施形態において、標的cDNAは、二本鎖であり、そしてニック形成剤認識配列を含み、そしてここで、テンプレート核酸は、標的cDNAの、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む部分を含む。
他の実施形態において、標的cDNAは、一本鎖であり、そしてニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そしてここで、テンプレート核酸は、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む。
いくつかの実施形態において、標的cDNAが二本鎖であり、そしてニック形成剤認識配列を含み、そしてここで、テンプレート核酸は、3’から5’へと、以下を含む:
(i) ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む標的cDNAの鎖に対して、少なくとも実質的に相補的である配列、
(ii) ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(iii) ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む標的cDNAの鎖に実質的に相補的ではない配列。
(i) ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む標的cDNAの鎖に対して、少なくとも実質的に相補的である配列、
(ii) ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(iii) ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む標的cDNAの鎖に実質的に相補的ではない配列。
特定の実施形態において、標的cDNAが一本鎖であり、そしてニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そしてここで、テンプレート核酸は、3’から5’へと、以下を含む:
(i) 標的cDNAに少なくとも実質的に相補的である配列、
(ii) ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(iii) 標的cDNAに実質的に相補的ではない配列。
(i) 標的cDNAに少なくとも実質的に相補的である配列、
(ii) ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(iii) 標的cDNAに実質的に相補的ではない配列。
いくつかの実施形態において、テンプレート核酸分子が、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む。このような実施形態において、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列中の1つ以上のヌクレオチドが、標的cDNAまたは標的mRNAのヌクレオチドと従来の塩基対を形成しても形成しなくてもよい。
他の実施形態において、テンプレート核酸分子が、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む。
別の局面において、本発明は、サンプル中のmRNAの存在もしくは非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する:
(a) テンプレートとして、サンプル中のmRNA分子を用いて一本鎖cDNA分子を合成する工程;
(b) 以下:
(i) 工程(a)からの一本鎖cDNA分子;
(ii) 一本鎖核酸プローブであって、一本鎖核酸プローブは、3’から5’へと、標的核酸の3’部分に少なくとも実質的に相補的である配列、およびニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む、一本鎖核酸プローブ、
を含む、混合物を形成する工程;
(c) 工程(b)の混合物からハイブリダイズしていないプローブを取り除く工程;
(d) ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で増幅反応を行う工程;および
(e) 工程(d)の増幅産物の存在もしくは非存在を検出および/または特徴付けして、サンプル中の標的核酸の存在もしくは非存在を決定する工程。
(a) テンプレートとして、サンプル中のmRNA分子を用いて一本鎖cDNA分子を合成する工程;
(b) 以下:
(i) 工程(a)からの一本鎖cDNA分子;
(ii) 一本鎖核酸プローブであって、一本鎖核酸プローブは、3’から5’へと、標的核酸の3’部分に少なくとも実質的に相補的である配列、およびニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む、一本鎖核酸プローブ、
を含む、混合物を形成する工程;
(c) 工程(b)の混合物からハイブリダイズしていないプローブを取り除く工程;
(d) ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で増幅反応を行う工程;および
(e) 工程(d)の増幅産物の存在もしくは非存在を検出および/または特徴付けして、サンプル中の標的核酸の存在もしくは非存在を決定する工程。
いくつかの実施形態において、一本鎖cDNA分子の5’末端は、例えば、固定されたオリゴヌクレオチドプライマーの使用によって固定される。
別の局面において、本発明は、cDNA集団中のニック形成剤認識配列を含む二本鎖標的cDNA分子の存在もしくは非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する:
(A) cDNA集団、ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤、DNAポリメラーゼ、および1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸を含む混合物を形成する工程;
(B) 標的cDNA分子が、cDNA集団中に存在するならば、標的cDNA分子の一方の鎖をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子が増幅される条件に、混合物を維持する工程;および
(C) 工程(B)において増幅した一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、標的cDNAの存在もしくは非存在を決定する工程。
(A) cDNA集団、ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤、DNAポリメラーゼ、および1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸を含む混合物を形成する工程;
(B) 標的cDNA分子が、cDNA集団中に存在するならば、標的cDNA分子の一方の鎖をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子が増幅される条件に、混合物を維持する工程;および
(C) 工程(B)において増幅した一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、標的cDNAの存在もしくは非存在を決定する工程。
別の局面において、本発明は、cDNA集団をプロファイリングするための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する:
(A) cDNA集団、ニック形成剤、DNAポリメラーゼ、および1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸を含む混合物を形成する工程;
(B) ニック形成剤の認識配列を含むcDNA分子をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子が増幅される条件に、混合物を維持する工程;および
(C) 一本鎖核酸フラグメントを特徴付けして、cDNA集団をプロファイルする工程。
(A) cDNA集団、ニック形成剤、DNAポリメラーゼ、および1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸を含む混合物を形成する工程;
(B) ニック形成剤の認識配列を含むcDNA分子をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子が増幅される条件に、混合物を維持する工程;および
(C) 一本鎖核酸フラグメントを特徴付けして、cDNA集団をプロファイルする工程。
別の局面において、本発明は、cDNA集団中の標的cDNA分子の存在もしくは非存在を決定するため、または生物学的サンプル中の標的mRNAの存在もしくは非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する:
(A) 以下:
(i) cDNA集団中のcDNA分子、または生物学的サンプル中のRNA分子;
(ii) 以下:
(a) ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、またはその両方;および
(b) 鎖自体またはその伸長産物のいずれかが、ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤によりニック形成可能な、ニック形成部位を含む鎖中の5’突出部、または
鎖もその伸長産物も、ニック形成部位を含まない鎖中の3’突出部、
を含む、部分的に二本鎖の核酸プローブ、
を含む、混合物を形成する工程であって、
ここで、各突出部は、標的cDNAが一本鎖である場合、標的cDNAに少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含むか、
標的cDNAが二本鎖である場合、標的cDNAの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含むか、または
標的mRNAに少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含む、工程;
(B) cDNA分子またはmRNA分子にハイブリダイズしているプローブ分子を、cDNA分子またはmRNA分子にハイブリダイズしていないプローブ分子から分離する工程;
(C) ハイブリダイズしたプローブ分子およびニック形成剤認識部位を認識するニック形成剤の存在下で増幅反応を行って、標的cDNAがcDNA集団中に存在する場合、または標的mRNAが生物学的サンプル中に存在する場合、テンプレートとして部分的に二本鎖の核酸プローブの一方の鎖を用いて、一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程;ならびに
(D) 工程(C)の一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、cDNA集団中の標的cDNAの存在もしくは非存在を決定するか、または生物学的サンプル中の標的mRNAの存在もしくは非存在を決定する工程。
(A) 以下:
(i) cDNA集団中のcDNA分子、または生物学的サンプル中のRNA分子;
(ii) 以下:
(a) ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、またはその両方;および
(b) 鎖自体またはその伸長産物のいずれかが、ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤によりニック形成可能な、ニック形成部位を含む鎖中の5’突出部、または
鎖もその伸長産物も、ニック形成部位を含まない鎖中の3’突出部、
を含む、部分的に二本鎖の核酸プローブ、
を含む、混合物を形成する工程であって、
ここで、各突出部は、標的cDNAが一本鎖である場合、標的cDNAに少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含むか、
標的cDNAが二本鎖である場合、標的cDNAの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含むか、または
標的mRNAに少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含む、工程;
(B) cDNA分子またはmRNA分子にハイブリダイズしているプローブ分子を、cDNA分子またはmRNA分子にハイブリダイズしていないプローブ分子から分離する工程;
(C) ハイブリダイズしたプローブ分子およびニック形成剤認識部位を認識するニック形成剤の存在下で増幅反応を行って、標的cDNAがcDNA集団中に存在する場合、または標的mRNAが生物学的サンプル中に存在する場合、テンプレートとして部分的に二本鎖の核酸プローブの一方の鎖を用いて、一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程;ならびに
(D) 工程(C)の一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、cDNA集団中の標的cDNAの存在もしくは非存在を決定するか、または生物学的サンプル中の標的mRNAの存在もしくは非存在を決定する工程。
別の局面において、本発明は、cDNA集団中の標的cDNA分子の存在もしくは非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する:
(A) 第1のオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第2のODNP、およびcDNA集団中のcDNA分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
(i) 標的cDNAが第1の鎖および第2の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
第1のODNPは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖のヌクレオチド配列、および標的核酸の第1の鎖の第1の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして
第2のODNPは、標的核酸の第2の鎖の第2の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含み、第2の部分は、標的核酸の第2の鎖中の第1の部分の相補鎖に対して3’側に配置されるか、あるいは、
(ii) 標的核酸が一本鎖核酸である場合、
第1のODNPは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖のヌクレオチド配列、および標的核酸の第1の部分に少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
第2のODNPは、標的核酸の第2の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含み、第2の部分は、標的核酸の第1の部分に対して5’側に配置される、工程;
(B) 標的cDNAがcDNA集団中に存在する場合、混合物を以下の条件:
(i) 第1のODNPおよび第2のODNPを伸長させて、第1のODNPおよび第2のODNPを含む伸長産物を生成する条件;
(ii) 必要に応じて、工程(i)の伸長産物を、制限エンドヌクレアーゼ認識配列を認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて消化して、消化産物を提供する条件;
(iii)ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を認識するニック形成エンドヌクレアーゼの存在下で、テンプレートとして、工程(B)(i)の伸長産物の一方の鎖または工程(B)(ii)の消化産物を用いて一本鎖核酸フラグメントを増幅する条件、
に供する工程;
(C) 工程(B)(ii)の一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、cDNA集団中の標的cDNAの存在もしくは非存在を決定する工程。
(A) 第1のオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第2のODNP、およびcDNA集団中のcDNA分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
(i) 標的cDNAが第1の鎖および第2の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
第1のODNPは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖のヌクレオチド配列、および標的核酸の第1の鎖の第1の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして
第2のODNPは、標的核酸の第2の鎖の第2の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含み、第2の部分は、標的核酸の第2の鎖中の第1の部分の相補鎖に対して3’側に配置されるか、あるいは、
(ii) 標的核酸が一本鎖核酸である場合、
第1のODNPは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖のヌクレオチド配列、および標的核酸の第1の部分に少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
第2のODNPは、標的核酸の第2の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含み、第2の部分は、標的核酸の第1の部分に対して5’側に配置される、工程;
(B) 標的cDNAがcDNA集団中に存在する場合、混合物を以下の条件:
(i) 第1のODNPおよび第2のODNPを伸長させて、第1のODNPおよび第2のODNPを含む伸長産物を生成する条件;
(ii) 必要に応じて、工程(i)の伸長産物を、制限エンドヌクレアーゼ認識配列を認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて消化して、消化産物を提供する条件;
(iii)ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を認識するニック形成エンドヌクレアーゼの存在下で、テンプレートとして、工程(B)(i)の伸長産物の一方の鎖または工程(B)(ii)の消化産物を用いて一本鎖核酸フラグメントを増幅する条件、
に供する工程;
(C) 工程(B)(ii)の一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、cDNA集団中の標的cDNAの存在もしくは非存在を決定する工程。
別の局面において、本発明は、cDNA集団中の標的cDNA分子の存在もしくは非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する:
(A) 第1のオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第2のODNP、およびcDNA集団中のcDNA分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
(i) 標的cDNAが第1の鎖および第2の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
第1のODNPは、第1のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)のセンス鎖のヌクレオチド配列、および標的cDNAの第1の鎖の第1の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして
第2のODNPは、標的核酸の第2の鎖の第2の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして第2のNERSのセンス鎖の配列を含み、第2の部分は、標的cDNAの第2の鎖中の第1の部分の相補鎖に対して3’側に配置されるか、あるいは、
(ii) 標的cDNAが一本鎖核酸である場合、
第1のODNPは、第1のNERSのセンス鎖のヌクレオチド配列、および標的cDNAの第1の部分に少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
第2のODNPは、標的核酸の第2の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第2のNERSのセンス鎖の配列を含み、第2の部分は、標的cDNAの第1の部分に対して5’側に配置される、工程;
(B) 標的cDNAがcDNA集団中に存在する場合、混合物を以下の条件:
(i) 第1のODNPおよび第2のODNPを伸長させて、第1のNERSおよび第2のNERSの両方を含む伸長産物を生成する条件;
(ii)第1のNERSおよび第2のNERSを認識する1つ以上のニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)の存在下で、テンプレートとして、工程(B)(i)の伸長産物の一方の鎖を用いて、一本鎖核酸フラグメントを増幅する条件、
に供する工程;ならびに
(C) 工程(B)(ii)の一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、サンプル中の標的核酸の存在もしくは非存在を決定する工程。
(A) 第1のオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第2のODNP、およびcDNA集団中のcDNA分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
(i) 標的cDNAが第1の鎖および第2の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
第1のODNPは、第1のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)のセンス鎖のヌクレオチド配列、および標的cDNAの第1の鎖の第1の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして
第2のODNPは、標的核酸の第2の鎖の第2の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして第2のNERSのセンス鎖の配列を含み、第2の部分は、標的cDNAの第2の鎖中の第1の部分の相補鎖に対して3’側に配置されるか、あるいは、
(ii) 標的cDNAが一本鎖核酸である場合、
第1のODNPは、第1のNERSのセンス鎖のヌクレオチド配列、および標的cDNAの第1の部分に少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
第2のODNPは、標的核酸の第2の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第2のNERSのセンス鎖の配列を含み、第2の部分は、標的cDNAの第1の部分に対して5’側に配置される、工程;
(B) 標的cDNAがcDNA集団中に存在する場合、混合物を以下の条件:
(i) 第1のODNPおよび第2のODNPを伸長させて、第1のNERSおよび第2のNERSの両方を含む伸長産物を生成する条件;
(ii)第1のNERSおよび第2のNERSを認識する1つ以上のニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)の存在下で、テンプレートとして、工程(B)(i)の伸長産物の一方の鎖を用いて、一本鎖核酸フラグメントを増幅する条件、
に供する工程;ならびに
(C) 工程(B)(ii)の一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、サンプル中の標的核酸の存在もしくは非存在を決定する工程。
別の局面において、本発明は、cDNA集団中の標的cDNAの存在または非存在を決定する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する:
(A) 第1のオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第2のODNP、およびcDNA集団中のcDNA分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
(i) 標的cDNAが第1の鎖および第2の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
第1のODNPは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列(RERS)のセンス鎖のヌクレオチド配列、および標的cDNAの第1の鎖の第1の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして
第2のODNPは、標的核酸の第2の鎖の第2の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして第2のRERSのセンス鎖の配列を含み、第2の部分は、標的cDNAの第2の鎖中の第1の部分の相補鎖に対して3’側に配置されるか、あるいは、
(ii) 標的cDNAが一本鎖核酸である場合、
第1のODNPは、第1のRERSのセンス鎖のヌクレオチド配列、および標的cDNAの第1の部分に少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
第2のODNPは、標的核酸の第2の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第2のRERSのセンス鎖の配列を含み、第2の部分は、標的cDNAの第1の部分に対して5’側に配置される、工程;
(B) 標的cDNAがcDNA集団中に存在する場合、混合物を以下の条件:
(i) 第1のODNPおよび第2のODNPを伸長させて、第1のRERSおよび第2のRERSの両方を含む伸長産物を生成する条件;
(ii)第1のRERSおよび第2のRERSを認識する1つ以上の制限エンドヌクレアーゼ(RE)の存在下で、テンプレートとして、工程(B)(i)の伸長産物の一方の鎖を用いて、一本鎖核酸フラグメントを増幅する条件、
に供する工程;ならびに
(C) 工程(B)(ii)の一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、cDNA集団中の標的cDNAの存在もしくは非存在を決定する工程。
(A) 第1のオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第2のODNP、およびcDNA集団中のcDNA分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
(i) 標的cDNAが第1の鎖および第2の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
第1のODNPは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列(RERS)のセンス鎖のヌクレオチド配列、および標的cDNAの第1の鎖の第1の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして
第2のODNPは、標的核酸の第2の鎖の第2の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして第2のRERSのセンス鎖の配列を含み、第2の部分は、標的cDNAの第2の鎖中の第1の部分の相補鎖に対して3’側に配置されるか、あるいは、
(ii) 標的cDNAが一本鎖核酸である場合、
第1のODNPは、第1のRERSのセンス鎖のヌクレオチド配列、および標的cDNAの第1の部分に少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
第2のODNPは、標的核酸の第2の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第2のRERSのセンス鎖の配列を含み、第2の部分は、標的cDNAの第1の部分に対して5’側に配置される、工程;
(B) 標的cDNAがcDNA集団中に存在する場合、混合物を以下の条件:
(i) 第1のODNPおよび第2のODNPを伸長させて、第1のRERSおよび第2のRERSの両方を含む伸長産物を生成する条件;
(ii)第1のRERSおよび第2のRERSを認識する1つ以上の制限エンドヌクレアーゼ(RE)の存在下で、テンプレートとして、工程(B)(i)の伸長産物の一方の鎖を用いて、一本鎖核酸フラグメントを増幅する条件、
に供する工程;ならびに
(C) 工程(B)(ii)の一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、cDNA集団中の標的cDNAの存在もしくは非存在を決定する工程。
別の局面において、本発明は、cDNA集団中の標的cDNA分子の存在もしくは非存在を決定するため、または生物学的サンプル中の標的mRNA分子の存在もしくは非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下:
(A)以下:
(i)上記cDNA集団の上記cDNA分子または上記生物学的サンプルの上記RNA分子、
(ii)以下:
(a)第1のニック形成剤認識配列の一方の鎖を含み、そして
(b)上記標的cDNAが一本鎖である場合、上記標的cDNAに少なくとも実質的に相補的であるか、
上記標的cDNAが二本鎖である場合、上記標的cDNAの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的であるか、または
上記標的mRNAに少なくとも実質的に相補的である、第1の一本鎖テンプレート核酸分子(T1)、
(iii)上記第1のニック形成剤認識配列を認識する第1のニック形成剤、
(iv)DNAポリメラーゼ、および
(v)1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸、
を含む、混合物を形成する工程;
(B)上記標的cDNAが上記cDNA集団中に存在するならば、または上記標的mRNAが上記生物学的サンプル中に存在するならば、上記標的cDNAの一部、上記標的mRNAの一部、または上記テンプレート核酸分子の一部をテンプレートとして用いて第1の一本鎖核酸分子(A1)が増幅される条件に、上記混合物を維持する工程;
(C)A1に対して少なくとも実質的に相補的であり、そして第2のニック形成剤認識配列の一方の鎖を含む、第2の一本鎖テンプレート核酸分子(T2)を提供する工程;
(D)テンプレートとしてA1またはT2のいずれかを用いて、上記第2のニック形成剤認識配列を認識する第2のニック形成剤の存在下で増幅反応を行って、第2の一本鎖核酸分子(A2)を増幅する工程;ならびに
(E)A2の存在または非存在を検出して、上記cDNA集団中の上記標的cDNA分子の存在または非存在、あるいは上記生物学的サンプル中の上記標的mRNAの存在または非存在を決定する工程、
を包含する。
(A)以下:
(i)上記cDNA集団の上記cDNA分子または上記生物学的サンプルの上記RNA分子、
(ii)以下:
(a)第1のニック形成剤認識配列の一方の鎖を含み、そして
(b)上記標的cDNAが一本鎖である場合、上記標的cDNAに少なくとも実質的に相補的であるか、
上記標的cDNAが二本鎖である場合、上記標的cDNAの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的であるか、または
上記標的mRNAに少なくとも実質的に相補的である、第1の一本鎖テンプレート核酸分子(T1)、
(iii)上記第1のニック形成剤認識配列を認識する第1のニック形成剤、
(iv)DNAポリメラーゼ、および
(v)1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸、
を含む、混合物を形成する工程;
(B)上記標的cDNAが上記cDNA集団中に存在するならば、または上記標的mRNAが上記生物学的サンプル中に存在するならば、上記標的cDNAの一部、上記標的mRNAの一部、または上記テンプレート核酸分子の一部をテンプレートとして用いて第1の一本鎖核酸分子(A1)が増幅される条件に、上記混合物を維持する工程;
(C)A1に対して少なくとも実質的に相補的であり、そして第2のニック形成剤認識配列の一方の鎖を含む、第2の一本鎖テンプレート核酸分子(T2)を提供する工程;
(D)テンプレートとしてA1またはT2のいずれかを用いて、上記第2のニック形成剤認識配列を認識する第2のニック形成剤の存在下で増幅反応を行って、第2の一本鎖核酸分子(A2)を増幅する工程;ならびに
(E)A2の存在または非存在を検出して、上記cDNA集団中の上記標的cDNA分子の存在または非存在、あるいは上記生物学的サンプル中の上記標的mRNAの存在または非存在を決定する工程、
を包含する。
いくつかの実施形態では、上記第1のテンプレート核酸は、一本鎖であり、そして上記第1のニック形成剤認識配列の一方の鎖の配列に対して3’側に位置付けられ、上記標的cDNAが一本鎖である場合に、上記標的cDNAの3’部分に対して少なくとも実質的に相補的であるか、上記標的cDNAが二本鎖である場合に、上記標的cDNAの一方の鎖に対して少なくとも実質的に相補的であるか、または上記標的mRNAに対して少なくとも実質的に相補的である配列を含む。
いくつかの実施形態では、上記標的cDNAは、二本鎖であり、そして上記第1のニック形成剤認識配列を含み、そしてここで、上記第1のテンプレート核酸は、上記第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む上記標的cDNAの部分を含む。
いくつかの実施形態では、上記標的cDNAは、一本鎖であり、そして上記第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そしてここで、上記第1のテンプレート核酸分子は、上記第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む。
特定の実施形態において、上記標的cDNAは、二本鎖であり、そして上記第1のニック形成剤認識配列を含み、そしてここで、上記第1のテンプレート核酸は、3’から5’へと、以下:
(i)上記第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む、上記標的cDNAの鎖に少なくとも実質的に相補的である配列、
(ii)上記第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(iii)上記第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む、上記標的cDNAの鎖に実質的に相補的ではない配列、
を含む。
(i)上記第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む、上記標的cDNAの鎖に少なくとも実質的に相補的である配列、
(ii)上記第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(iii)上記第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む、上記標的cDNAの鎖に実質的に相補的ではない配列、
を含む。
特定の実施形態では、上記標的cDNAは、一本鎖であり、そして上記第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そしてここで、上記第1のテンプレート核酸は、3’から5’へと、以下:
(i)上記標的cDNAに少なくとも実質的に相補的である配列、
(ii)上記第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(iii)上記標的cDNAに実質的に相補的ではない配列、
を含む。
(i)上記標的cDNAに少なくとも実質的に相補的である配列、
(ii)上記第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(iii)上記標的cDNAに実質的に相補的ではない配列、
を含む。
別の局面では、本発明は、cDNA集団中の標的cDNA分子の存在もしくは非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下:
(A)以下:
(i)上記cDNA集団の上記cDNA分子、
(ii)以下:
(a)第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み、そして
(b)上記標的cDNAが一本鎖の場合、上記標的cDNAに少なくとも実質的に相補的であるか、または
上記標的cDNAが二本鎖の場合、上記標的cDNAの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的である、
第1の一本鎖テンプレート核酸分子(T1)、
(iii)3’から5’へと、以下:
(a)上記第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して5’側に配置される上記T1の配列と少なくとも実質的に同一である配列、および
(b)第2のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、
を含む、第2の一本鎖テンプレート核酸分子(T2)、
(iv)上記第1のニック形成剤認識配列を認識する第1のニック形成剤、
(v)上記第2のニック形成剤認識配列を認識する第2のニック形成剤、
(vi)DNAポリメラーゼ、および
(vii)1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;
を含む、混合物を形成する工程;
(B)上記標的cDNAが、上記cDNA集団中に存在するならば、上記T2をテンプレートとして用いて第1の一本化核酸分子(A2)が増幅される条件に、上記混合物を維持する工程;ならびに
(C)A2の存在または非存在を検出して、上記cDNA集団中の上記標的cDNA分子の存在または非存在を決定する工程、
を包含する。
(A)以下:
(i)上記cDNA集団の上記cDNA分子、
(ii)以下:
(a)第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み、そして
(b)上記標的cDNAが一本鎖の場合、上記標的cDNAに少なくとも実質的に相補的であるか、または
上記標的cDNAが二本鎖の場合、上記標的cDNAの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的である、
第1の一本鎖テンプレート核酸分子(T1)、
(iii)3’から5’へと、以下:
(a)上記第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して5’側に配置される上記T1の配列と少なくとも実質的に同一である配列、および
(b)第2のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、
を含む、第2の一本鎖テンプレート核酸分子(T2)、
(iv)上記第1のニック形成剤認識配列を認識する第1のニック形成剤、
(v)上記第2のニック形成剤認識配列を認識する第2のニック形成剤、
(vi)DNAポリメラーゼ、および
(vii)1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;
を含む、混合物を形成する工程;
(B)上記標的cDNAが、上記cDNA集団中に存在するならば、上記T2をテンプレートとして用いて第1の一本化核酸分子(A2)が増幅される条件に、上記混合物を維持する工程;ならびに
(C)A2の存在または非存在を検出して、上記cDNA集団中の上記標的cDNA分子の存在または非存在を決定する工程、
を包含する。
別の局面では、本発明は、cDNA集団中の標的cDNA分子の存在または非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下:
(A)以下:
(i)上記cDNA集団の上記cDNA分子、
(ii)以下:
(a)第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そして
(b)上記標的cDNAが一本鎖の場合、上記標的cDNAに少なくとも実質的に相補的であるか、または
上記標的cDNAが二本鎖の場合、上記標的cDNAの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的である、
第1の一本鎖テンプレート核酸分子(T1)、
(iii)3’から5’へと、以下:
(a)上記第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列に対して3’側に配置されるT1の配列と少なくとも実質的に相補的である配列、
(b)第2のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、
を含む、第2の一本鎖テンプレート核酸分子(T2)、
(iv)上記第1のニック形成剤認識配列を認識する第1のニック形成剤、
(v)上記第2のニック形成剤認識配列を認識する第2のニック形成剤、
(vi)DNAポリメラーゼ、および
(vii)1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;
を含む、混合物を形成する工程;
(B)上記標的cDNAが、上記cDNA集団中に存在するならば、T2をテンプレートとして用いて第1の一本鎖核酸分子(A2)が増幅される条件に、上記混合物を維持する工程;ならびに
(C)A2の存在または非存在を検出して、上記cDNA集団中の上記標的cDNA分子の存在または非存在を決定する工程、
を包含する。
(A)以下:
(i)上記cDNA集団の上記cDNA分子、
(ii)以下:
(a)第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そして
(b)上記標的cDNAが一本鎖の場合、上記標的cDNAに少なくとも実質的に相補的であるか、または
上記標的cDNAが二本鎖の場合、上記標的cDNAの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的である、
第1の一本鎖テンプレート核酸分子(T1)、
(iii)3’から5’へと、以下:
(a)上記第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列に対して3’側に配置されるT1の配列と少なくとも実質的に相補的である配列、
(b)第2のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、
を含む、第2の一本鎖テンプレート核酸分子(T2)、
(iv)上記第1のニック形成剤認識配列を認識する第1のニック形成剤、
(v)上記第2のニック形成剤認識配列を認識する第2のニック形成剤、
(vi)DNAポリメラーゼ、および
(vii)1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;
を含む、混合物を形成する工程;
(B)上記標的cDNAが、上記cDNA集団中に存在するならば、T2をテンプレートとして用いて第1の一本鎖核酸分子(A2)が増幅される条件に、上記混合物を維持する工程;ならびに
(C)A2の存在または非存在を検出して、上記cDNA集団中の上記標的cDNA分子の存在または非存在を決定する工程、
を包含する。
別の局面では、本発明は、cDNA集団中の標的cDNA分子の存在または非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下:
(A)以下:
(i)上記cDNA集団の上記cDNA分子、
(ii)以下:
(a)第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み、そして
(b)上記標的cDNAが一本鎖の場合、上記標的cDNAに少なくとも実質的に相補的であるか、または
上記標的cDNAが二本鎖の場合、上記標的cDNAの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的である、
第1の一本鎖テンプレート核酸分子(T1)、
(iii)3’から5’へと、以下:
(a)上記第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して5’側に配置されるT1の配列と少なくとも実質的に同一である配列、および
(b)第2のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列、
を含む、第2の一本鎖テンプレート核酸分子(T2)、
(iv)上記第1のニック形成剤認識配列を認識する第1のニック形成剤、
(v)上記第2のニック形成剤認識配列を認識する第2のニック形成剤、
(vi)DNAポリメラーゼ、および
(vii)1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;
を含む、混合物を形成する工程;
(B)上記標的cDNAが上記cDNA集団中に存在するならば、上記第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖に対して5’側に配置されるT1の配列に対して少なくとも実質的に同一である、第1の一本鎖核酸分子(A2)を増幅する条件に、上記混合物を維持する工程;ならびに
(C)A2の存在または非存在を検出して、上記cDNA集団中の上記標的cDNA分子の存在または非存在を決定する工程、
を包含する。
(A)以下:
(i)上記cDNA集団の上記cDNA分子、
(ii)以下:
(a)第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み、そして
(b)上記標的cDNAが一本鎖の場合、上記標的cDNAに少なくとも実質的に相補的であるか、または
上記標的cDNAが二本鎖の場合、上記標的cDNAの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的である、
第1の一本鎖テンプレート核酸分子(T1)、
(iii)3’から5’へと、以下:
(a)上記第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して5’側に配置されるT1の配列と少なくとも実質的に同一である配列、および
(b)第2のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列、
を含む、第2の一本鎖テンプレート核酸分子(T2)、
(iv)上記第1のニック形成剤認識配列を認識する第1のニック形成剤、
(v)上記第2のニック形成剤認識配列を認識する第2のニック形成剤、
(vi)DNAポリメラーゼ、および
(vii)1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;
を含む、混合物を形成する工程;
(B)上記標的cDNAが上記cDNA集団中に存在するならば、上記第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖に対して5’側に配置されるT1の配列に対して少なくとも実質的に同一である、第1の一本鎖核酸分子(A2)を増幅する条件に、上記混合物を維持する工程;ならびに
(C)A2の存在または非存在を検出して、上記cDNA集団中の上記標的cDNA分子の存在または非存在を決定する工程、
を包含する。
別の局面では、本発明は、cDNA集団中の標的cDNA分子の存在または非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下:
(A)以下:
(i)上記cDNA集団の上記cDNA分子、
(ii)以下:
(a)第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そして
(b)上記標的cDNAが一本鎖の場合、上記標的cDNAに少なくとも実質的に相補的であるか、または
上記標的cDNAが二本鎖の場合、上記標的cDNAの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的である、
第1の一本鎖テンプレート核酸分子(T1)、
(iii)3’から5’へと、以下:
(a)上記第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列に対して3’側に配置されるT1の配列と少なくとも実質的に相補的である配列、および
(b)第2のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列、
を含む、第2の一本鎖テンプレート核酸分子(T2)、
(iv)上記第1のニック形成剤認識配列を認識する第1のニック形成剤、
(v)上記第2のニック形成剤認識配列を認識する第2のニック形成剤、
(vi)DNAポリメラーゼ、ならびに
(vii)1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;
を含む、混合物を形成する工程;
(B)上記標的cDNAが上記cDNA集団中に存在するならば、上記第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖に対して3’側に配置されるT1の配列に対して少なくとも実質的に同一である、第1の一本鎖核酸分子(A2)を増幅する条件に、上記混合物を維持する工程;ならびに
(C)A2の存在または非存在を検出して、上記cDNA集団中の上記標的cDNA分子の存在または非存在を決定する工程、
を包含する。
(A)以下:
(i)上記cDNA集団の上記cDNA分子、
(ii)以下:
(a)第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そして
(b)上記標的cDNAが一本鎖の場合、上記標的cDNAに少なくとも実質的に相補的であるか、または
上記標的cDNAが二本鎖の場合、上記標的cDNAの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的である、
第1の一本鎖テンプレート核酸分子(T1)、
(iii)3’から5’へと、以下:
(a)上記第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列に対して3’側に配置されるT1の配列と少なくとも実質的に相補的である配列、および
(b)第2のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列、
を含む、第2の一本鎖テンプレート核酸分子(T2)、
(iv)上記第1のニック形成剤認識配列を認識する第1のニック形成剤、
(v)上記第2のニック形成剤認識配列を認識する第2のニック形成剤、
(vi)DNAポリメラーゼ、ならびに
(vii)1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;
を含む、混合物を形成する工程;
(B)上記標的cDNAが上記cDNA集団中に存在するならば、上記第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖に対して3’側に配置されるT1の配列に対して少なくとも実質的に同一である、第1の一本鎖核酸分子(A2)を増幅する条件に、上記混合物を維持する工程;ならびに
(C)A2の存在または非存在を検出して、上記cDNA集団中の上記標的cDNA分子の存在または非存在を決定する工程、
を包含する。
別の局面では、本発明は、cDNA集団中の標的cDNA分子の存在または非存在を決定するためか、あるいは生物学的サンプル中の標的mRNA分子の存在または非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下:
(A)以下:
(i)上記cDNA集団の上記cDNA分子、または上記生物学的サンプル中の上記RNA分子、
(ii)3’から5’へと、以下:
(a)上記標的cDNAが一本鎖の場合、上記標的cDNAの3’部分に少なくとも実質的に相補的である第1の配列、または
上記標的cDNAが二本鎖の場合、上記標的cDNAの一方の鎖の3’部分に少なくとも実質的に相補的である第1の配列、または
上記標的mRNAの3’部分に少なくとも実質的に相補的である、第1の配列、
(b)第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(c)第2の配列、
を含む、第1のテンプレート核酸分子(T1)、
(iii)3’から5’へと、以下:
(a)T1の上記第2の配列と少なくとも実質的に同一である第1の配列、
(b)第2のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(c)第2の配列、
を含む、第2のテンプレート核酸分子(T2)、
(iv)上記第1のニック形成剤認識配列を認識する第1のニック形成剤、
(v)上記第2のニック形成剤認識配列を認識する第2のニック形成剤、
(vi)DNAポリメラーゼ、ならびに
(vii)1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;
を含む、混合物を形成する工程;
(B)上記標的cDNAが上記cDNA集団中に存在するならば、T2の上記第2の配列をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子(A2)が増幅される条件下で、上記混合物を維持する工程;ならびに
(C)A2の存在または非存在を検出して、上記cDNA集団中の上記標的cDNA分子の存在または非存在、あるいは上記生物学的サンプル中の上記標的mRNAの存在または非存在を決定する工程、
を包含する。
(A)以下:
(i)上記cDNA集団の上記cDNA分子、または上記生物学的サンプル中の上記RNA分子、
(ii)3’から5’へと、以下:
(a)上記標的cDNAが一本鎖の場合、上記標的cDNAの3’部分に少なくとも実質的に相補的である第1の配列、または
上記標的cDNAが二本鎖の場合、上記標的cDNAの一方の鎖の3’部分に少なくとも実質的に相補的である第1の配列、または
上記標的mRNAの3’部分に少なくとも実質的に相補的である、第1の配列、
(b)第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(c)第2の配列、
を含む、第1のテンプレート核酸分子(T1)、
(iii)3’から5’へと、以下:
(a)T1の上記第2の配列と少なくとも実質的に同一である第1の配列、
(b)第2のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(c)第2の配列、
を含む、第2のテンプレート核酸分子(T2)、
(iv)上記第1のニック形成剤認識配列を認識する第1のニック形成剤、
(v)上記第2のニック形成剤認識配列を認識する第2のニック形成剤、
(vi)DNAポリメラーゼ、ならびに
(vii)1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;
を含む、混合物を形成する工程;
(B)上記標的cDNAが上記cDNA集団中に存在するならば、T2の上記第2の配列をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子(A2)が増幅される条件下で、上記混合物を維持する工程;ならびに
(C)A2の存在または非存在を検出して、上記cDNA集団中の上記標的cDNA分子の存在または非存在、あるいは上記生物学的サンプル中の上記標的mRNAの存在または非存在を決定する工程、
を包含する。
別の局面では、本発明は、cDNA集団において、第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む標的cDNA分子の存在または不在を決定する方法を提供し、この方法は:
(A)以下を含む混合物を形成する工程:
(i)上記cDNA集団のcDNA分子、
(ii)3’から5’へと、以下を含む第1のテンプレート核酸分子(T1):
(a)上記第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列のすぐ5’に位置する標的cDNAの部分に少なくとも実質的に相補的である第1の配列、
(b)第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(c)第2の配列、
(iii)3’から5’へと、以下を含む第2のテンプレート核酸分子(T2):
(a)上記T1の第2の配列に少なくとも実質的に同一である第1の配列、
(b)第2のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(c)第2の配列、
(iv)上記第1のニック形成剤認識配列を認識する第1のニック形成剤、
(v)上記第2のニック形成剤認識配列を認識する第2のニック形成剤、
(vi)DNAポリメラーゼ、および
(vii)1以上のデオキシヌクレオシド三リン酸(単数または複数);
(B)標的cDNAが上記cDNA中に存在するならば、上記T2の第2の配列をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子(A2)が増幅される条件に、上記混合物を維持する工程;および
(C)A2の存在または不在を検出し、上記cDNA集団中の標的cDNA分子の存在または不在を検出する工程、を包含する。
(A)以下を含む混合物を形成する工程:
(i)上記cDNA集団のcDNA分子、
(ii)3’から5’へと、以下を含む第1のテンプレート核酸分子(T1):
(a)上記第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列のすぐ5’に位置する標的cDNAの部分に少なくとも実質的に相補的である第1の配列、
(b)第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(c)第2の配列、
(iii)3’から5’へと、以下を含む第2のテンプレート核酸分子(T2):
(a)上記T1の第2の配列に少なくとも実質的に同一である第1の配列、
(b)第2のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(c)第2の配列、
(iv)上記第1のニック形成剤認識配列を認識する第1のニック形成剤、
(v)上記第2のニック形成剤認識配列を認識する第2のニック形成剤、
(vi)DNAポリメラーゼ、および
(vii)1以上のデオキシヌクレオシド三リン酸(単数または複数);
(B)標的cDNAが上記cDNA中に存在するならば、上記T2の第2の配列をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子(A2)が増幅される条件に、上記混合物を維持する工程;および
(C)A2の存在または不在を検出し、上記cDNA集団中の標的cDNA分子の存在または不在を検出する工程、を包含する。
別の局面では、本発明は、天然に存在するゲノムDNAまたは天然に存在するmRNAのcDNAの一部分に少なくとも実質的に同一である配列を含む核酸を提供し、ここで、
(A)上記天然に存在するゲノムDNAまたは天然に存在するmRNAのcDNAの一部分は、3’から5’へと、以下からなり:
(i)長さが3〜50ヌクレオチドである第1の配列、
(ii)ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(iii)長さが8〜50ヌクレオチドである第2の配列、
(B)上記核酸は、多くても長さが120ヌクレオチドであり;そして
(C)上記核酸は、配列A(ii)を含む。
(A)上記天然に存在するゲノムDNAまたは天然に存在するmRNAのcDNAの一部分は、3’から5’へと、以下からなり:
(i)長さが3〜50ヌクレオチドである第1の配列、
(ii)ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(iii)長さが8〜50ヌクレオチドである第2の配列、
(B)上記核酸は、多くても長さが120ヌクレオチドであり;そして
(C)上記核酸は、配列A(ii)を含む。
別の局面において、本発明は、一本鎖核酸を提供し、この核酸は、
(a)多くとも長さが100ヌクレオチドであり、
(b)ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み、
(c)cDNA分子に実質的に相補的であり、そして
(d)上記ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で一本鎖核酸フラグメントを増幅するためのテンプレートとして機能し得る。
(a)多くとも長さが100ヌクレオチドであり、
(b)ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み、
(c)cDNA分子に実質的に相補的であり、そして
(d)上記ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で一本鎖核酸フラグメントを増幅するためのテンプレートとして機能し得る。
関連する局面において、本発明は、一本鎖核酸を提供し、この一本鎖核酸は、
(a)多くとも長さが100ヌクレオチドであり、
(b)ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、
(c)cDNA分子に実質的に相補的であり、そして
(d)上記cDNA分子にアニールするとき、ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下でcDNA分子の一部分の増幅を可能にする。
(a)多くとも長さが100ヌクレオチドであり、
(b)ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、
(c)cDNA分子に実質的に相補的であり、そして
(d)上記cDNA分子にアニールするとき、ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下でcDNA分子の一部分の増幅を可能にする。
別の局面では、本発明は、cDNA集団において標的cDNA分子の存在または不在を決定する方法を提供し、この方法は:
(A)以下:
(i)上記cDNA集団のcDNA分子;
(ii)以下のオリゴヌクレオチドプライマー、
(a)上記認識配列の外側でニックを形成するニック形成剤により認識可能な二本鎖ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そして
(b)上記一本鎖標的核酸または二本鎖標的核酸の第1の領域に少なくとも実質的に相補的である、オリゴヌクレオチドプライマー;および
(iii)以下の部分的に二本鎖である核酸、
(a)II制限エンドヌクレアーゼ認識配列、および
(b)一本鎖標的cDNA、またはこの一本鎖標的cDNAの第1の領域の5’に位置する二本鎖標的cDNAの1つの鎖、またはこの二本鎖標的cDNAの1つの鎖の第2の領域に少なくとも実質的に相補的である3’突出部を含む、核酸;を含む混合物を、上記オリゴヌクレオチドプライマーと、上記一本鎖cDNAの第1の領域または上記二本鎖核酸の1つの鎖との間、および上記部分的に二本鎖である核酸の3’突出部と、上記一本鎖標的cDNAまたは上記二本鎖核酸の1つの鎖の第2の領域との間のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で形成する工程;
(B)上記一本鎖標的cDNA、または上記第2の領域において、上記オリゴヌクレオチドプライマーおよび上記部分的に二本鎖である核酸にハイブリダイズした二本鎖標的cDNAの1つの鎖を消化する工程;
(C)ニック形成剤の存在下、テンプレートとして、上記工程(B)で消化された一本鎖標的cDNAまたは二本鎖標的cDNAの1つの鎖の一部分を用いて一本鎖核酸分子を増幅する増幅反応を実施する工程;および
(D)上記工程(C)の一本鎖核酸分子の存在または不在を検出し、上記cDNA集団中の標的cDNA分子の存在または不在を決定する工程、を包含する。
(A)以下:
(i)上記cDNA集団のcDNA分子;
(ii)以下のオリゴヌクレオチドプライマー、
(a)上記認識配列の外側でニックを形成するニック形成剤により認識可能な二本鎖ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そして
(b)上記一本鎖標的核酸または二本鎖標的核酸の第1の領域に少なくとも実質的に相補的である、オリゴヌクレオチドプライマー;および
(iii)以下の部分的に二本鎖である核酸、
(a)II制限エンドヌクレアーゼ認識配列、および
(b)一本鎖標的cDNA、またはこの一本鎖標的cDNAの第1の領域の5’に位置する二本鎖標的cDNAの1つの鎖、またはこの二本鎖標的cDNAの1つの鎖の第2の領域に少なくとも実質的に相補的である3’突出部を含む、核酸;を含む混合物を、上記オリゴヌクレオチドプライマーと、上記一本鎖cDNAの第1の領域または上記二本鎖核酸の1つの鎖との間、および上記部分的に二本鎖である核酸の3’突出部と、上記一本鎖標的cDNAまたは上記二本鎖核酸の1つの鎖の第2の領域との間のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で形成する工程;
(B)上記一本鎖標的cDNA、または上記第2の領域において、上記オリゴヌクレオチドプライマーおよび上記部分的に二本鎖である核酸にハイブリダイズした二本鎖標的cDNAの1つの鎖を消化する工程;
(C)ニック形成剤の存在下、テンプレートとして、上記工程(B)で消化された一本鎖標的cDNAまたは二本鎖標的cDNAの1つの鎖の一部分を用いて一本鎖核酸分子を増幅する増幅反応を実施する工程;および
(D)上記工程(C)の一本鎖核酸分子の存在または不在を検出し、上記cDNA集団中の標的cDNA分子の存在または不在を決定する工程、を包含する。
本発明のこれらおよびその他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照する際明らかとなる。
(発明の詳細な説明)
本発明は、遺伝子発現分析のための方法、組成物およびキットを提供し、この分析は、例えば、生物学的サンプル中のcDNA集団中の標的cDNAまたは標的mRNAの存在または非存在を決定する。本発明に従って、標的cDNAの存在は、一本鎖核酸分子を直線的にまたは指数関数的に増幅する反応をトリガーする。一本鎖核酸分子の検出は、cDNA集団中の標的cDNAの存在または生物学的サンプル中の標的mRNAの存在を示す。本方法は、核酸増幅反応を使用するので、低いレベルの遺伝子発現の検出において敏感である。
本発明は、遺伝子発現分析のための方法、組成物およびキットを提供し、この分析は、例えば、生物学的サンプル中のcDNA集団中の標的cDNAまたは標的mRNAの存在または非存在を決定する。本発明に従って、標的cDNAの存在は、一本鎖核酸分子を直線的にまたは指数関数的に増幅する反応をトリガーする。一本鎖核酸分子の検出は、cDNA集団中の標的cDNAの存在または生物学的サンプル中の標的mRNAの存在を示す。本方法は、核酸増幅反応を使用するので、低いレベルの遺伝子発現の検出において敏感である。
(A.定義)
本発明のより詳細な説明を提供する前に、以下のように、本明細書中で使用される場合の慣例を規定し、そして定義を提供することは、本発明の理解により有用であり得る。さらなる定義もまた、本発明の記載の全体にわたって提供される。
本発明のより詳細な説明を提供する前に、以下のように、本明細書中で使用される場合の慣例を規定し、そして定義を提供することは、本発明の理解により有用であり得る。さらなる定義もまた、本発明の記載の全体にわたって提供される。
用語「3’」および「5’」は、核酸の一本鎖内の特定の部位の位置を記載するために、本明細書中で使用される。核酸内の位置が、参照ヌクレオチド「に対して3’」または参照ヌクレオチド配列「の3’」である場合、これは、その位置が参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の3’末端と核酸の参照ヌクレオチド鎖の3’ヒドロキシルとの間に位置することを意味する。同様に、核酸内の位置が、参照ヌクレオチド「に対して5’」または参照ヌクレオチド配列「の5’」である場合、これは、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の5’末端と核酸の参照ヌクレオチド鎖の5’リン酸との間に位置することを意味する。さらに、ヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド「に対してすぐ3’」または参照ヌクレオチド配列「のすぐ3’」である場合、これは、このヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の3’末端にすぐ隣接することを意味する。同様に、ヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド「に対してすぐ5’」または参照ヌクレオチド配列「のすぐ5’」である場合、これは、このヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の5’末端にすぐ隣接することを意味する。
「一本鎖核酸の3’部分」は、核酸の3’末端を含む核酸の部分をいう。同様に、「一本鎖核酸の5’部分」は、核酸の5’末端を含む核酸の部分をいう。
「二本鎖核酸の1つの鎖の3’部分」は、核酸のこの鎖の3’末端を含む核酸のこの鎖の部分をいう。同様に、「二本鎖核酸の1つの鎖の5’部分」は、核酸のこの鎖の5’末端を含む核酸のこの鎖の部分をいう。
「天然に存在するゲノムDNA」および「天然に存在するcDNA」は、それぞれ、精製された形態または精製されない形態のいずれにおいてでも、天然に存在するゲノムDNA分子およびcDNA分子をいう。
本明細書中で使用される場合、「ニック形成」は、完全に二本鎖の核酸分子または部分的に二本鎖の核酸分子の二本鎖の部分の、ニック形成を行う酵素によって認識されるヌクレオチド配列に対する特定の位置での一方の鎖のみの切断をいう。核酸がニック形成される特定の位置は、「ニック形成部位」(NS)といわれる。
「ニック形成剤」(NA)は、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子の特定のヌクレオチド配列を認識し、そしてこの認識配列に対して特定の位置で核酸分子のただ1つの鎖を切断する酵素である。ニック形成剤としては、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子が、半改変された認識/切断配列を含む場合、ニック形成エンドヌクレアーゼ(例えば、N.BstNBI)および制限エンドヌクレアーゼ(例えば、HincII)が挙げられるがこれらに限定されず、この半改変された認識/切断配列において、一本の鎖は、制限エンドヌクレアーゼによるその鎖(すなわち、誘導体化されたヌクレオチドを含む鎖)の切断を阻止する少なくとも1つの誘導体化されたヌクレオチドを含む。
本明細書中で使用される場合、「ニック形成エンドヌクレアーゼ」(NE)は、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子のヌクレオチド配列を認識し、そして認識配列に対して特定の位置で核酸分子のただ1つの鎖を切断するエンドヌクレアーゼをいう。少なくとも1つの誘導体化されたヌクレオチドを含むことによって改変され、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子の誘導体化されたヌクレオチド含有鎖の切断を阻止する、その認識配列を必要とする、制限エンドヌクレアーゼ(RE)と違って、NEは、代表的に、ネイティブなヌクレオチドのみを含むヌクレオチド配列を認識し、そしてこのヌクレオチド配列を含む完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子の1つの鎖のみを切断する。
本明細書中で使用される場合、「ネイティブなヌクレオチド」は、アデニル酸、グアニル酸、シチジル酸、チミジル酸またはウリジル酸をいう。「誘導体化されたヌクレオチド」は、ネイティブなヌクレオチドではないヌクレオチドをいう。
NAが認識する完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子のヌクレオチド配列は、「ニック形成剤認識配列」(NARS)といわれる。同様に、NEが認識する完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子のヌクレオチド配列は、「ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列」(NERS)といわれる。REが認識する特定の配列は、「制限エンドヌクレアーゼ認識配列」(RERS)といわれる。本明細書中で使用される場合、「半改変されたRERS」は、1つの鎖の認識配列が、少なくとも1つの誘導体化されたヌクレオチド(例えば、α−チオデオキシヌクレオチド)を含み、これは、RERSを認識するREによる鎖(すなわち、認識配列内に誘導体化されたヌクレオチドを含む鎖)の切断を阻止する二本鎖RERSをいう。
特定の実施形態において、NARSは、1つの鎖の配列の各ヌクレオチドが、もう1つの鎖の対応する位置のヌクレオチドに対して相補的である二本鎖ヌクレオチド配列である。このような実施形態において、NARSを認識するNAによってニック形成可能なNSを含む鎖におけるNARSの配列は、「NARSのセンス鎖の配列」または「二本鎖NARSのセンス鎖の配列」といわれ、一方、NSを含まない鎖におけるNARS配列は、「NARSのアンチセンス鎖の配列」または「二本鎖NARSのアンチセンス鎖の配列」といわれる。
同様に、NERSが、1つの鎖がもう1つの鎖に厳密に相補的である二本鎖ヌクレオチド配列である実施形態において、NERSを認識するNEによってニック形成可能なNSを含む鎖に位置するNERSの配列は、「NERSのセンス鎖の配列」または「二本鎖NERSのセンス鎖の配列」といわれ、一方、NSを含まない鎖に位置するNERSの配列は、「NERSのアンチセンス鎖の配列」または「二本鎖NERSのアンチセンス鎖の配列」といわれる。例えば、例示的なニック形成エンドヌクレアーゼ(N.BstNBI)の認識配列およびニック形成部位は、以下に示され、切断部位を示すために「黒逆三角形」を用い、そして任意のヌクレオチドを示すためにNを用いる:
同様に、半改変されたRERSを認識するREによってニック形成可能なNSを含む鎖(すなわち、いずれの誘導体化されたヌクレオチドも含まない鎖)に位置する半改変されたRERSの配列は、「半改変されたRERSのセンス鎖の配列」といわれ、半改変されたRERSを含む核酸の「半改変されたRERSのセンス鎖」に位置し、一方、NSを含まない鎖(すなわち、誘導体化されたヌクレオチドを含む鎖)における半改変されたRERSの配列は、「半改変されたRERSのアンチセンス鎖の配列」といわれ、半改変されたRERSを含む核酸の「半改変されたRERSのアンチセンス鎖」に位置する。
特定の他の実施形態において、NARSは、1つ以上のヌクレオチドミスマッチを有する最大限に部分的に二本鎖のヌクレオチド配列であるが、上記されるような二本鎖のNARSのインタクトなセンス配列を含む。本明細書中で使用される慣例に従って、NARSを記載する文脈において、2つの核酸分子が、互いにアニールし、ハイブリダイズされた産物を形成し、このハイブリダイズされた産物がNARSを含み、そしてハイブリダイズされた産物のNARS内に少なくとも1つのミスマッチ塩基対が存在する場合、このNARSは、単に部分的に二本鎖であると考えられる。このようなNARSは、特定のニック形成剤(例えば、N.BstNBI)によって認識され得、このニック形成剤は、これらのニック形成活性に対して二重鎖認識配列のただ1つの鎖を必要とする。例えば、N.BstNBIのNARSは、特定の実施形態において、以下のようなインタクトなセンス鎖を含み得:
5’−GAGTC−3’
3’−NNNNN−5’
ここで、Nは、任意のヌクレオチドを示し、1つの位置のNは、他の位置のNと同一であってもそうでなくてもよいが、この認識配列の中に少なくとも1つのミスマッチ塩基対が存在する。この状況において、NARSは、少なくとも1つのミスマッチヌクレオチドを有するとして特徴付けられる。
5’−GAGTC−3’
3’−NNNNN−5’
ここで、Nは、任意のヌクレオチドを示し、1つの位置のNは、他の位置のNと同一であってもそうでなくてもよいが、この認識配列の中に少なくとも1つのミスマッチ塩基対が存在する。この状況において、NARSは、少なくとも1つのミスマッチヌクレオチドを有するとして特徴付けられる。
特定の他の実施形態において、NARSは、1つ以上の一致していないヌクレオチドを有する部分的なまたは完全な一本鎖ヌクレオチド配列であるが、上記されるように、二本鎖NARSのインタクトなセンス鎖を含む。本明細書中で使用される慣例に従って、NARSを記載する文脈において、2つの核酸分子(すなわち、第1および第2の鎖)が、互いにアニールし、ハイブリダイズされた産物を形成し、このハイブリダイズされた産物が、NAによって認識される第1の鎖内のヌクレオチド配列を含み(すなわち、ハイブリダイズされた産物は、NARSを含む)、そしてNAによって認識される配列中の少なくとも1つのヌクレオチドが、ハイブリダイズされた産物が形成される場合に、第2の鎖中のヌクレオチドに対応しない(すなわち、それと向かい合わない)場合、このハイブリダイズされた産物のNARS内に少なくとも1つの一致しないヌクレオチドが存在し、そしてこのNARSが部分的または完全に一本鎖であると考えられる。このようなNARSは、特定のニック形成剤(例えば、N.BstNBI)によって認識され得、このニック形成剤は、これらのニック形成活性のために、二本鎖認識配列のただ1つの鎖を必要とする。例えば、N.BstNBIのNARSは、特定の実施形態において、以下のようなインタクトなセンス鎖を含み得:
5’−GAGTC−3’
3’−N0−4−5’
(ここで、「N」は、任意のヌクレオチドを示し、0−4は、ヌクレオチド「N」の数を示し、1つの位置での「N」は、別の位置での「N」と同じであってもそうでなくてもよい)、この鎖は、N.BstNBIの二本鎖認識配列のセンス鎖を含む。この例において、相補鎖中の対応するヌクレオチドが存在しないという点において、G、A、G、TまたはCの少なくとも1つは、一致しない。この状況は、例えば、ハイブリダイズされた産物中に「ループ」が存在し、特に、センス配列がループ内に完全にまたは部分的に存在する場合、生じる。
5’−GAGTC−3’
3’−N0−4−5’
(ここで、「N」は、任意のヌクレオチドを示し、0−4は、ヌクレオチド「N」の数を示し、1つの位置での「N」は、別の位置での「N」と同じであってもそうでなくてもよい)、この鎖は、N.BstNBIの二本鎖認識配列のセンス鎖を含む。この例において、相補鎖中の対応するヌクレオチドが存在しないという点において、G、A、G、TまたはCの少なくとも1つは、一致しない。この状況は、例えば、ハイブリダイズされた産物中に「ループ」が存在し、特に、センス配列がループ内に完全にまたは部分的に存在する場合、生じる。
本明細書中に使用される場合、句「核酸分子を増幅すること」または「核酸分子の増幅」は、特定の核酸分子の2つ以上のコピーを作製することをいう。「核酸分子を指数関数的に増幅すること」または「核酸分子の指数関数的増幅」は、2つ以上の核酸増幅反応を含むタンデムな増幅系による、特定の核酸分子の増幅をいう。このような系において、第1の増幅反応からの増幅産物は、第2の核酸増幅反応について、少なくとも初期増幅プライマーとして機能する。言い換えると、第1の増幅反応からの増幅産物は、初期プライマー伸長の間、少なくともプライマーとして機能するが、続いてのプライマー伸長の間、プライマーとして機能してもしなくてもよい。本明細書中で使用される場合、用語「核酸増幅反応」は、核酸分子(T)を使用して、核酸分子(A)の1つより多くのコピーを作製するためのプロセスをいい、この核酸分子(T)は、テンプレートとして核酸分子Aの配列に相補的な配列を含む。本発明に従って、第1および第2の核酸増幅反応の両方は、ニック形成反応およびプライマー伸長反応を使用する。
本明細書中で使用される場合、「初期増幅プライマー」は。テンプレート核酸にアニールするプライマーであり、核酸増幅反応を開始する。開始プライマーは、初期プライマー伸長のためのプライマーとして機能しなければならないが、任意の続いてのプライマー伸長のためのプライマーである必要はない。例えば、プライマーA1がテンプレート核酸T2の一部にアニールし、このテンプレート核酸T2が、NARSのセンス鎖に対して3’の位置で、NARSのセンス鎖の配列を含むと仮定のこと。DNAポリメラーゼの存在下において、A1の3’末端は、二本鎖NARSを含む、二本鎖の核酸分子または部分的に二本鎖の核酸分子(H2)を産生するためのテンプレートとしてT2を使用して伸長される。NARSを認識するNAの存在下において、H2は、開始プライマーA1に相補的な鎖においてニック形成される。ニック形成部位に3’末端を含み、開始プライマーA1を含まない鎖は、NAおよびDNAポリメラーゼの存在下において、続いてのプライマー伸長のためのプライマーとして機能し得る。A1は、開始プライマーとみなされるが、第1のプライマー伸長に対してのみプライマーとして機能するが、続いてのプライマー伸長に対しては、プライマーとして機能しない。
第1の核酸が、第2の核酸の消化産物または第2の核酸分子もしくはテンプレートとしてその相補物の一部を使用した増幅産物のいずれかである場合、第1の核酸分子(「第1の核酸」)が、別の核酸分子(「第2の核酸」)「に由来する」かまたは別の核酸分子(「第2の核酸」)「から生じる」。第1の核酸分子は、第2核酸の少なくとも一部と厳密に同一である配列または厳密に相補的である配列を含まなければならない。
第1の配列の相補物が、所定の反応混合物(例えば、核酸増幅混合物)中の第2の配列にアニールし得る場合、第1の核酸配列は、第2の核酸配列に「少なくとも実質的に同一」である。特定の好ましい実施形態において、第1の配列は、第2の配列に「厳密に同一」であり、つまり、各位置での第1の配列のヌクレオチドは、同じ位置での第2の配列のヌクレオチドと同一であり、第1の配列は、第2の配列と同じ長さである。
第1の配列が、所定の反応混合物(例えば、核酸増幅混合物)中の第2の配列にアニールし得る場合、第1の核酸配列は、第2の核酸配列と「少なくとも実質的に相補的」である。特定の好ましい実施形態において、第1の配列は、第2の配列に「厳密にまたは完全に相補的」であり、つまり、第1の配列の各ヌクレオチドは、その対応する位置で第2の配列のヌクレオチドと相補的であり、第1の配列は、第2の配列と同じ長さである。
本明細書中で用いられる場合、2本鎖核酸の他方の鎖(「第2鎖」のことをいう)中の別の位置(例えば、規定された位置)「に対応する」位置に位置する2本鎖核酸の一方の鎖(「第1鎖」のことをいう)中のヌクレオチドは、第2鎖中の対応する位置のヌクレオチドに相補的な第1鎖中のヌクレオチドのことをいう。同様に、2本鎖核酸の他方の鎖(「第2鎖」のことをいう)内のニック形成部位に対応する2本鎖核酸の一方の鎖(「第1鎖」のことをいう)中の位置は、第2鎖中の2つのヌクレオチドに相補的な(この間にニックが生じる)第1鎖中の2つのヌクレオチド間の位置のことをいう。
「cDNA集団のプロファイリング」は、テンプレートとしてのcDNA集団における1種類以上のcDNA分子を用いて増幅される、1種類以上の1本鎖核酸分子の特徴付けのことをいう。そのような特徴付けは、cDNA集団における特定のcDNAの存在または非存在を示し得る。そのことはまた、1つのcDNA集団と別のcDNA集団との比較において有用であり得る。
「cDNA集団」は、1種類位以上のcDNA分子を含む組成物のことをいう。このcDNA分子は、実質的に精製され得、その結果、この組成物中に存在するcDNA分子以外の分子は最小量である。言い換えると、このcDNA集団は、主としてcDNA分子を含む。あるいは、cDNA集団におけるこれらのcDNA分子は、部分的に精製され得、その結果、cDNA分子以外の少なくとも数種類の分子がcDNA集団から除去される。特定の実施形態において、cDNA集団におけるこれらのcDNA分子は、精製されていなくてもよい。言い換えると、このcDNA集団は、基本的に、cDNA集団を得る生物学的サンプルと同一である。
(B.線形的核酸増幅法を用いた遺伝子発現分析)
1つの局面において、本発明は、ニック形成剤の存在下での線形的核酸増幅反応を用いた遺伝子発現分析のための方法を提供する。本発明の方法を用いて、cDNA集団をプロファイルし得るのと同様に、cDNA集団における標的cDNAの存在もしくは非存在、または生物学的サンプルにおける標的mRNAの存在もしくは非存在を決定し得る。
1つの局面において、本発明は、ニック形成剤の存在下での線形的核酸増幅反応を用いた遺伝子発現分析のための方法を提供する。本発明の方法を用いて、cDNA集団をプロファイルし得るのと同様に、cDNA集団における標的cDNAの存在もしくは非存在、または生物学的サンプルにおける標的mRNAの存在もしくは非存在を決定し得る。
(1.概要)
本発明に従って、cDNA集団における標的cDNAの存在は、ニック形成剤認識配列および少なくとも標的cDNA分子の一部を含む、完全な2本鎖核酸分子または部分的な2本鎖核酸分子(「開始核酸分子(N1)」)の生成を可能にする。N1分子中の認識配列を認識するニック形成剤およびDNAポリメラーゼの存在下で、テンプレートとしてN1分子の一部を用いて、1本鎖核酸分子(A1)を増幅し得る。A1分子の検出は、cDNA集団における標的cDNAの存在を示す。特定の実施形態において、標的cDNA自体が、ニック形成剤認識配列を含み、従って、開始核酸(N1)分子として機能し得る。しかし、cDNA集団に標的cDNAが存在しない場合、少なくとも標的cDNAの一部を含む開始核酸(N1)分子は、生成されない。従って、テンプレートとして開始核酸分子の一部を用いても、1本鎖核酸分子は、増幅されない。従って、そのような1本鎖核酸分子の検出の失敗は、cDNA集団における標的cDNAの非存在を示し得る。
本発明に従って、cDNA集団における標的cDNAの存在は、ニック形成剤認識配列および少なくとも標的cDNA分子の一部を含む、完全な2本鎖核酸分子または部分的な2本鎖核酸分子(「開始核酸分子(N1)」)の生成を可能にする。N1分子中の認識配列を認識するニック形成剤およびDNAポリメラーゼの存在下で、テンプレートとしてN1分子の一部を用いて、1本鎖核酸分子(A1)を増幅し得る。A1分子の検出は、cDNA集団における標的cDNAの存在を示す。特定の実施形態において、標的cDNA自体が、ニック形成剤認識配列を含み、従って、開始核酸(N1)分子として機能し得る。しかし、cDNA集団に標的cDNAが存在しない場合、少なくとも標的cDNAの一部を含む開始核酸(N1)分子は、生成されない。従って、テンプレートとして開始核酸分子の一部を用いても、1本鎖核酸分子は、増幅されない。従って、そのような1本鎖核酸分子の検出の失敗は、cDNA集団における標的cDNAの非存在を示し得る。
代表的な実施形態の主な工程を、図1に示す。この実施形態において、テンプレート核酸(T1)をcDNA集団に加え、cDNA集団が、標的cDNAを含むか否かを検出する。このT1分子は、少なくとも実質的に標的cDNAと相補的であり、そしてニック形成剤認識配列の一方の鎖の配列を含む。標的cDNAが、cDNA集団に存在する場合、T1分子とアニールし、部分的な2本鎖核酸(N1)を形成する。DNAポリメラーゼ存在下で、一方または両方のN1分子の3’末端が伸長され、ニック形成剤認識配列の両方の鎖を含む、完全な2本鎖核酸分子(H1)を形成する(工程(a))。H1分子内のニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤存在下で、H1は、ニックにより切断され、ニック形成部位に3’末端および5’末端が生じる(工程(b))。ニック形成部位に5’末端を含むフラグメントが、十分に短い(例えば、17ヌクレオチド未満のヌクレオチド長)場合、このフラグメントは、特定の反応条件(例えば、60℃で)下で、H1の他の部分から分離する。しかし、このフラグメントが容易に分離しない場合、このフラグメントは、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損でありかつ鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼの存在下で、ニック形成部位に3’末端を含むフラグメントの伸長によって置換され得る(工程(d))。鎖置換はまた、鎖置換促進因子が存在する場合、DNAポリメラーゼの鎖置換活性の非存在下でも生じ得る。そのような伸長は、再度ニックにより切断され得、ニック形成剤についての、新しいニック形成部位を再生する(工程(e))。新しいニック形成部位に5’末端を含むフラグメント(A1)は、再度、容易にH1の他の部分から分離し得るか、または新しいニック形成部位での3’末端からの伸長によって置換され得る(工程(f))。このニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返され得(工程(g))、核酸フラグメントA1の線形的な蓄積が生じる。
上記のように、T1分子は、ニック形成剤認識配列の一方の鎖の配列を含む。特定の実施形態において、T1分子は、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み得る。このような実施形態の例は、図2に示され、代表的なニック形成剤認識配列としてN.BstNB Iの認識配列を用いている。この図において、開始核酸分子N1は、1本鎖標的cDNA(または、2本鎖標的cDNAの一方の鎖)またはその一部を以下の3つの領域(領域X1、領域Y1および領域Z1)を有するT1とアニーリングすることよって形成される部分的な2本鎖核酸分子である。領域X1、領域Y1および領域Z1は、それぞれ、N.BstNB I認識配列のアンチセンス鎖の配列に対してすぐ3’側に続く領域、N.BstNB Iの認識配列のアンチセンス鎖の配列の3’末端からトリガーODNP(すなわち、3’−CACAGNNNN−5’(ここでNは、A、T、GまたはCであり得る))の伸長生成物内のN.BstNB Iのニック形成部位の3’末端ヌクレオチドに対応するヌクレオチドまでの領域、および領域Y1に対してすぐ5’側に続く領域であると規定される。標的cDNAは、少なくとも、領域X1に対して実質的に相補的であり、DNAポリメラーゼ存在下での核酸伸長のためのプライマーとして機能する。生じた伸長生成物(H1)は、2本鎖N.BstNB I認識配列を含み、N.BstNB Iによってニックにより切断され得る。このニックにより切断される生成物(トリガーODNPの配列を含む)は、DNAポリメラーゼによって、そのニック形成部位の3’末端から再度伸長され得、ニック形成部位でN.BstNB Iによって生成される5’末端を含む鎖と置換される。このニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返され、領域Z1に対して正確に相補的である、置換された鎖(A1)が蓄積する。
特定の実施形態において、T1分子は、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み得る。このような実施形態の例は、図3に示され、代表的なニック形成剤認識配列としてN.BstNB Iの認識配列を用いている。この図において、開始核酸分子N1は、1本鎖標的cDNA(または、2本鎖標的cDNAの一方の鎖)またはその一部を、以下の3つの領域(領域X1、領域Y1および領域Z1)を有するT1とアニーリングすることよって形成される部分的な2本鎖核酸分子である。領域X1、領域Y1および領域Z1は、それぞれ、N.BstNB IによるN1の伸長生成物(すなわち、H1)のニック形成部位に対してすぐ3’側に続く領域、ニック形成部位からN.BstNB Iの認識配列のセンス鎖の配列(すなわち、5’−GAGTCNNNN−3’(ここでNは、A、T、GまたはCであり得る))の5’末端までの領域、および領域Y2に対してすぐ5’側に続く領域であると規定される。標的cDNAは、少なくとも、領域X1に対して実質的に相補的であり、DNAポリメラーゼ存在下での核酸伸長のためのプライマーとして機能する。生じた伸長生成物(H1)は、2本鎖N.BstNB I認識配列を含み、N.BstNB Iによってニックにより切断され得る。このニックにより切断される生成物(N.BstNB Iの認識配列のセンス鎖の配列を含む)は、DNAポリメラーゼによって、そのニック形成部位の3’末端から再度伸長され得、ニック形成部位でN.BstNB Iによって生成される5’末端を含む鎖と置換される。このニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返され、ニック形成部位の5’末端を含む、置換された鎖A1の蓄積が生じる。
標的cDNAのテンプレート核酸分子へのアニーリングに加え、開始核酸分子N1を提供するために、多様な他の方法が用いられ得る。例えば、特定の実施形態において、標的cDNA自体が、ニック形成剤認識配列を含み、従って、N1分子として機能し得る。あるいは、種々のプライマー対を用いて、N1分子を調製し得る。開始核酸を調製するための多様な方法についての詳細な説明は、別の章において、以下に提供される。
(2.mRNA集団またはcDNA集団、および標的mRNA分子または標的cDNA分子)
本発明のmRNAは、目的のmRNA分子を含み得、そしてcDNAを調製するためにさらに使用され得る、任意の生物学的サンプルから単離され得る。特に、この生物学的サンプルは、任意の細胞、器官、組織、生検材料などであり得る。目的のサンプルは、哺乳動物(特にヒト)、植物、細菌および下等真核生物細胞(例えば、酵母、真菌細胞)に由来する。例示的な生物学的サンプルとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:癌生検、神経変性斑、神経変性の兆候を示す脳領域の生検、皮膚サンプル、血球サンプル、結腸直腸生検など。例示的な細胞としては、筋肉細胞、肝細胞、繊維芽細胞、神経細胞、上皮細胞および真皮細胞、血球(例えば、Bリンパ球、Tリンパ球)、肥満細胞、単球、顆粒球およびマクロファージが挙げられる。さらに、高感受性に起因して、遺伝子発現分析のための本発明の方法は、単一細胞から単離されたmRNAを分析するために使用され得る。
本発明のmRNAは、目的のmRNA分子を含み得、そしてcDNAを調製するためにさらに使用され得る、任意の生物学的サンプルから単離され得る。特に、この生物学的サンプルは、任意の細胞、器官、組織、生検材料などであり得る。目的のサンプルは、哺乳動物(特にヒト)、植物、細菌および下等真核生物細胞(例えば、酵母、真菌細胞)に由来する。例示的な生物学的サンプルとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:癌生検、神経変性斑、神経変性の兆候を示す脳領域の生検、皮膚サンプル、血球サンプル、結腸直腸生検など。例示的な細胞としては、筋肉細胞、肝細胞、繊維芽細胞、神経細胞、上皮細胞および真皮細胞、血球(例えば、Bリンパ球、Tリンパ球)、肥満細胞、単球、顆粒球およびマクロファージが挙げられる。さらに、高感受性に起因して、遺伝子発現分析のための本発明の方法は、単一細胞から単離されたmRNAを分析するために使用され得る。
特定の実施形態において、2つの別個の生物学的サンプル由来のcDNA集団が、差示的に発現される遺伝子を同定するために比較される。このような比較について、一方のサンプルは、遺伝的疾患もしくは病原体感染を有する疑いがあるか、またはこれらを有する危険性がある被験体由来であり得、他方のサンプルは、健常なコントロール被験体由来であり得る。あるいは、これら2つのサンプルは、同じ生物学的供給源であるが、異なる発生段階由来であり得る。特定の実施形態において、一方のサンプルは、所望の形質(例えば、疾患耐性)を有する被験体由来であり得るが、他方のサンプルは、同じ形質を有さない被験体由来であり得る。他の実施形態において、一方のサンプルは、化学物質(例えば、薬物または毒性物質)で処置された被験体由来であり、他方のサンプルは、未処置のコントロール被験体由来である。
mRNAを単離する方法およびcDNA合成の方法は、当該分野で周知である(例えば、Sambrookら、前出;Chomczynskiら、Anal.Biochem.162:156、1987を参照のこと)。このような方法は、一般に、細胞、組織またはサンプルの溶解、および抽出手順によるRNAの回収を含む。これらの手順は、カオトロピック剤(例えば、グアニジニウムチオシアネート)での処置、その後の溶媒(フェノールおよびクロロホルム)を用いるRNA抽出によって、特に実施され得る。これらは、総RNA単離についてのUS73750キット(Amersham)のような市販のキットを使用して、容易に実施され得る。mRNA分子は、mRNA分子のポリ(A)テイルに結合するオリゴ(dT)プライマーを使用して、総細胞RNAから精製され得る(Jacobson、Metho.Enzymol.152:254、1987(本明細書中で参考として援用される)を参照のこと)。これに関して、mRNAの調製は、市販のキット(例えば、US72700キット(Amersham)を使用して、実施され得る。あるいは、ランダムプライマー(すなわち、ランダム配列を有するプライマー)が、総細胞RNAからmRNAを精製するために使用され得る(Singhら、Cell 52:415、1988;Vinsonら、Genes Dev.2:801、1988を参照のこと)。オリゴ(dT)プライマーまたはランダムプライマーのいずれかが、mRNAの精製を促進するために、固定化され得る。特定の他の実施形態において、mRNAは、最初に総RNAを単離せずに、生物学的サンプルから直接単離され得る。
次いで、単離/精製されたmRNAは、従来の分子生物学的技術に従う逆転写によって、第一鎖cDNAを合成するためのテンプレートとして使用され得る(例えば、Sambrookら、前出を参照のこと)。逆転写は、逆転写酵素およびプライマーを使用して、一般に実施される。
多くの逆転写酵素が、文献中に記載されており、そして市販されている(例えば、1483188キット、Boehringer)。例示的な逆転写酵素としては、トリウイルスであるAMV(トリ骨髄芽球症ウイルス)、マウス白血病ウイルスであるMMLV(モロニーマウス白血病ウイルス)、Yhermus flavusおよびThermus thermophilus HB−8(Promega、カタログ番号M1941およびM2101)由来の逆転写酵素が挙げられるが、これらに限定されない。これらの酵素に適用される作業条件は、当業者に周知である。
逆転写に使用されるプライマーは、種々の型のものであり得る。これは、4〜10ヌクレオチド(好ましくはヘキサヌクレオチド)を含むランダムオリゴヌクレオチドであり得る。この型のランダムプライマーの使用は、文献中に記載されており、そしてRNA分子内の異なる部位での逆転写のランダムな開始を可能にする。あるいは、4マー〜20マー(好ましくは15マー)を含むポリ(dT)プライマーが使用され得る。特定の実施形態において、mRNAの単離において使用されるプライマーはまた、cDNA合成でも使用される。
第二鎖cDNAは、RNase HおよびDNAポリメラーゼを使用して合成され得る。あるいは、これは、アダプター配列を第一鎖cDNA分子に最初に連結し、そして第一鎖cDNAをテンプレートとして使用して、このアダプター配列に対して相補的なプライマーを伸長させることによって、合成され得る。
合成されたcDNAは、溶液中に存在し得るか、または例えば、mRNAを単離するため、およびcDNAを合成するための固定されたプライマー(例えば、その5’末端を介して固定されたポリ(dT)n)を介して、固体支持体に連結され得る。
その発現が目的のものである任意の遺伝子が、本発明によって分析され得る。特定の実施形態において、この遺伝子は、疾患または障害(特にヒトの疾患または障害)に関連する。他の実施形態において、この遺伝子は、その遺伝子の起源である生物の所望の形質に関連する。なお他の好ましい実施形態において、この遺伝子は、その遺伝子が単離される被験体の発生に関与する。いくつかの実施形態において、この遺伝子は、この遺伝子が単離される生物の外部刺激(例えば、光、薬物およびストレスによる処置)に対する応答に関与する。
(3.開始核酸(N1)を調製するための種々の実施形態)
遺伝子発現分析のために有用な開始核酸分子は、種々のアプローチによって提供され得る。例えば、N1は、標的cDNAまたはその一部を、T1分子にアニールすることによって、獲得され得る。あるいは、N1は、直接標的cDNA自体であり得るか、または標的cDNAに直接由来し得、ここで、この標的cDNAは、二重鎖であり、かつニック形成剤認識配列を含む。N1はまた、種々のオリゴヌクレオチドプライマー対を使用しても調製され得る。N1分子を提供するためのこれらおよび他の手段が、以下に記載される。
遺伝子発現分析のために有用な開始核酸分子は、種々のアプローチによって提供され得る。例えば、N1は、標的cDNAまたはその一部を、T1分子にアニールすることによって、獲得され得る。あるいは、N1は、直接標的cDNA自体であり得るか、または標的cDNAに直接由来し得、ここで、この標的cDNAは、二重鎖であり、かつニック形成剤認識配列を含む。N1はまた、種々のオリゴヌクレオチドプライマー対を使用しても調製され得る。N1分子を提供するためのこれらおよび他の手段が、以下に記載される。
(a.アニーリングによる)
本発明の特定の実施形態において、N1は、標的cDNA分子をT1分子でアニーリングすることによって、提供される。標的cDNAが一本鎖である場合、この標的cDNAは、この標的cDNAの3’部分に少なくとも実質的に相補的なT1分子をアニーリングするために直接使用され得る。あるいは、一本鎖標的cDNAは、切断されて、より短いフラグメントを産生し得、ここで、これらのフラグメントのうちの1つ以上は、T1分子をアニーリングするために使用され得る。標的cDNAが二本鎖である場合、この標的cDNAは、変性され得、そしてT1分子をアニーリングするために直接使用され得る。あるいは、この二本鎖標的cDNAは、まず切断されて、より短い二本鎖フラグメントを与え得、次いで、これらのより短いフラグメントが変性され、このうちの一方が、T1分子をアニーリングし得る。
本発明の特定の実施形態において、N1は、標的cDNA分子をT1分子でアニーリングすることによって、提供される。標的cDNAが一本鎖である場合、この標的cDNAは、この標的cDNAの3’部分に少なくとも実質的に相補的なT1分子をアニーリングするために直接使用され得る。あるいは、一本鎖標的cDNAは、切断されて、より短いフラグメントを産生し得、ここで、これらのフラグメントのうちの1つ以上は、T1分子をアニーリングするために使用され得る。標的cDNAが二本鎖である場合、この標的cDNAは、変性され得、そしてT1分子をアニーリングするために直接使用され得る。あるいは、この二本鎖標的cDNAは、まず切断されて、より短い二本鎖フラグメントを与え得、次いで、これらのより短いフラグメントが変性され、このうちの一方が、T1分子をアニーリングし得る。
上で議論されるように、T1分子は、一本鎖標的cDNAまたは二本鎖標的cDNAの1つの鎖に対して、少なくとも実質的に相補的でなければならない。さらに、増幅反応混合物中のT1分子の数は、好ましくは、遺伝子発現分析において限定要因にならないように、標的cDNAの数より大きい。
N1分子を提供するためのこの型の方法の1つの例は、図4に示される。この図において、二本鎖標的cDNAを含み得るcDNA集団は、標的cDNAにおける配列を認識する制限エンドヌクレアーゼで消化される。消化産物が変性され得、そして標的cDNAがcDNA集団中に存在する場合には、標的cDNAの消化産物の1つの鎖は、消化産物の鎖の3’部分に少なくとも実質的に相補的なT1分子にアニーリングされ得る。
N1分子を提供するためのこの型の方法の別の例は、図5に示される。標的cDNA(またはそのフラグメント)自体が、ニック形成剤(nicking agent)認識配列を含む。標的cDNAが変性され、そして標的cDNAのうちの1つの鎖が、T1分子にアニーリングする。T1分子は、標的cDNAの、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む部分である。T1分子への、標的cDNAの1つの鎖のアニーリングは、増幅反応のための最初の核酸分子N1を提供する。
標的cDNAがニック形成剤認識配列を含む、関連する実施形態において、T1分子は、T1分子の3’部分においてニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列(すなわち、領域Xおよび領域Y)を含むが、T1分子の5’部分(すなわち、領域Z)においては含まない、標的cDNAの鎖(すなわち、標的cDNAの第一鎖)に少なくとも実質的に相補的であるように設計され得る(図6)。T1の3’部分は、NARSのアンチセンス鎖の配列を含み、その結果、標的cDNAの上記鎖にT1をアニーリングすることによって形成される最初の核酸は、二本鎖NARSを含む。NARSを認識するNAの存在下で、N1分子がニックを形成される。次いで、ニック形成部位における3’末端は、T1分子におけるNARSのアンチセンス鎖の配列に対して5’の領域を、テンプレートとして使用して、伸長される。得られる増幅産物は、標的cDNAの一部ではなく、NARSのアンチセンス鎖(すなわち、領域Z1)の配列に対して5’に位置するT1の領域に相補的な、一本鎖核酸分子である。
N1分子を提供するためのこの型の方法の別の例は、図21に示される。この例において、そのNARSの外側でニック形成するニック形成試薬によって認識されるNARSが、例示的なニック形成剤として使用される。オリゴヌクレオチドプライマー(すなわち、T1分子)が、一本鎖標的核酸(mRNA、第一鎖cDNA、または二本鎖cDNAの1つの鎖)をテンプレートとして使用して一本鎖核酸分子を増幅するために、使用される。プライマーは、5’から3’へと、以下の3つの領域を含む:領域A、領域B、および領域C。領域Bは、二本鎖ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列からなり、ここで、領域Aおよび領域Cは、それぞれ領域Bに対してすぐ5’およびすぐ3’に位置する領域である。オリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸と少なくとも実質的に相補的であり、その結果、一本鎖核酸の増幅を可能にする条件下で、このオリゴヌクレオチドプライマーは、標的をアニーリングし得、そしてDNAポリメラーゼの存在下で、その3’末端から伸長する。得られる伸長産物は、オリゴヌクレオチドプライマーの領域Bに、標的核酸におけるヌクレオチドと従来の塩基対を形成しない1つ以上のヌクレオチドが存在し得る場合でさえも、二本鎖ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で、ニックを形成され得る。「従来の塩基対」とは、完全にかまたは部分的に二本鎖の核酸の1つの鎖のヌクレオチドと、その核酸の他方の鎖における別のヌクレオチドとの間で、標準的なワトソン−クリックモデルに従って形成される塩基対(例えば、G:C、A:T、およびA:U)である。5’末端を含むニック形成産物は、比較的短い場合には(例えば、18ヌクレオチド長以下)標的核酸から容易に解離し得るか、またはニック形成部位において3’末端を含むニック形成生成物の伸長によって置換され得る。ニック形成剤がその認識配列の外側でニックを形成する場合、伸長産物は、ポリヌクレオチドプライマーの領域B(すなわち、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列)を維持し、従って、ニック形成剤によって再ニック形成され得る。上記ニック形成伸長サイクルは、複数回反復され得、ニック形成部位に5’末端を含む一本鎖核酸分子の増幅を生じる。
1つ以上のミスマッチが、領域Bと標的核酸におけるその対応領域との間に存在する実施形態において、領域Bを認識するニック形成剤のニック形成活性は、領域Bと標的におけるその対応領域との間のミスマッチの数の増加と共に低下する。例えば、N.BstNB Iは、二本鎖認識配列を含む二重鎖をニック形成する際、その二本鎖認識配列のセンス鎖の配列を含むが、その認識配列のセンス鎖と、二重鎖の対向する鎖におけるその対応領域との間に、1つのミスマッチを有する二重鎖のニック形成において、約半分である。N.BstNB Iのニック形成活性は、その二本鎖認識配列のセンス鎖の配列を含むが、その認識配列のセンス鎖におけるヌクレオチドのいずれかと従来の塩基対を形成するヌクレオチドを他方の鎖に有さない二重鎖でニックを形成する場合、その最大レベルの約10%〜20%に低下する。
特定の実施形態において、その認識配列中でニックを形成するニック形成剤はまた、標的におけるヌクレオチドと従来の塩基対を形成しない、領域Bにおけるヌクレオチドが、領域Bにおけるニック形成部位に対して5’の位置である場合に、使用され得る。オリゴヌクレオチドプライマーと標的との間で形成された二重鎖が、領域Bにおけるニック形成剤によってニックを形成された後に、このニック形成部位における3’末端は、伸長して領域Bを再生(regerate)し得る。このような再生は、ニック形成−伸長サイクルの反復を可能にする。さらに、領域Bと標的におけるその対応領域との間のミスマッチは、ニック形成部位の3’末端からの伸長に影響を与えてはならない。一般に、従来の塩基対を形成しないニック形成部位と領域Bにおけるヌクレオチドとの間の距離が長いほど、そのミスマッチは、伸長に対する不利な影響が低い。
領域Aは、オリゴヌクレオチドプライマーの標的核酸へのアニーリングを容易にするか、または可能にする。さらに、この領域は、ニック形成部位の3’末端を含むニック形成産物が、標的へのアニーリングを維持すること、およびDNAポリメラーゼの存在下で3’末端から伸長することを可能にする。特定の実施形態において、領域Aは、最大で100、75、50、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、または2ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、領域Aにおいて、標的核酸中のヌクレオチドと従来の塩基対を形成しない、1つ以上のヌクレオチドが存在し得る。
オリゴヌクレオチドプライマーは、領域Cを有しても有さなくても良い。領域Cが存在する場合、特定の実施形態において、この領域Cは、最大で100、75、50、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1ヌクレオチド長であり得る。領域Cと、標的核酸におけるその対応領域との間に、ミスマッチが存在し得る。しかし、ミスマッチの存在は、オリゴヌクレオチドプライマーと標的との間に形成される二重鎖のニック形成、または二重鎖の伸長産物のニック形成を、依然として可能にする必要がある。さらに、ミスマッチの存在は、ニック形成部位において3’末端を含むニック形成産物の伸長が、DNAポリメラーゼの存在下でその末端から伸長することを、依然として可能にする必要がある。領域Cが、領域Bを認識するニック形成剤によってニック形成可能なニック形成部位を含む場合、一般に、領域Cの5’末端とニック形成部位との間のヌクレオチドは、標的におけるヌクレオチドと従来の塩基対を形成する。
本発明は、サンプル中の標的核酸(すなわち、標的mRNAまたはcDNA)の存在を検出するために有用である。標的核酸がサンプル中に存在する場合、これは、標的に対して少なくとも実質的に相補的でオリゴヌクレオチドプライマー(すなわち、T1分子)とアニーリングし、そして標的の一部をテンプレートとして使用して、一本鎖核酸(すなわち、A1分子)の増幅を開始する。しかし、この標的核酸が非存在である場合、オリゴヌクレオチドプライマーは、標的とアニーリングし得ず、そしてこの標的の一部をテンプレートとして使用して、一本鎖核酸分子は増幅されない。従って、一本鎖増幅産物の存在または非存在を決定することによって、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定し得る。
標的mRNAまたはcDNAは、任意の目的のmRNAまたはcDNAであり得る。オリゴヌクレオチドプライマーにおける二本鎖ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列の存在は、プライマーと標的との間で形成される二重鎖が、二本鎖ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤によってニックを形成されるために十分であるので、この標的は、認識配列のセンス鎖内のヌクレオチドと従来の塩基対を形成する、二本鎖認識配列のインタクトなアンチセンス鎖またはヌクレオチドのいずれかさえも有する必要はない。しかし、ニック形成剤のニック形成活性は、対向する鎖のヌクレオチドと従来の塩基対を形成しない認識配列のセンス鎖のヌクレオチドの数の増加と共に低下するので、標的核酸の一部にアニーリングする場合に、プライマーにおける認識配列のセンス鎖中のヌクレオチドが標的のヌクレオチドと1つ以上の従来の塩基対を形成するように、オリゴヌクレオチドプライムを設計することが好ましい。
特定の実施形態において、以下に記載されるように、比較的短い一本鎖核酸を合成することが望ましくあり得る。このような実施形態において、標的核酸は、最初に、酵素的切断、化学的切断、または機械的切断に供され得る。比較的短い一本鎖核酸としては、多くとも200、150、100、75、50、40、30、25、20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、または4のヌクレオチドを含む核酸が挙げられる。酵素的切断は、例えば、標的核酸における特定の配列を認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて核酸分子を消化することによって達成され得る。あるいは、酵素的切断は、核酸分子における特定の配列を認識するニック形成剤で、標的核酸をニック形成することによって、達成され得る。酵素的切断はまた、Szybalski(米国特許第4,935,357号)によるオリゴヌクレオチド特異的切断であり得る。化学的切断および機械的切断は、せん断のような、核酸分子を切断するために適切な、当該分野において公知の任意の方法によって達成され得る。切断生成物は、二本鎖である場合、まず変性され得、そして引き続いて、上記オリゴヌクレオチドプライマーにアニーリングされ得る。
標的核酸の酵素的切断および引き続くこの標的の一部に相補的な一本鎖核酸の増幅の1つの例示的な実施形態が、図22に示されている。二本鎖ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーが、一本鎖標的核酸(すなわち、mRNA、cDNAの第一鎖、またはcDNAの第二鎖)の第一領域にアニーリングされ、一方で部分的に二本鎖の核酸は、第一領域に対して5’に位置する標的核酸の第二領域にアニーリングされる。この二本鎖核酸分子は、標的核酸の第二領域の一部に少なくとも実質的に、好ましくは正確に相補的な、二本鎖部分および3’突出部におけるII型制限酵素認識配列(TRERS)の二本鎖認識配列を含む。II型制限エンドヌクレアーゼは、その二本鎖認識配列の外側の核酸を切断するので、部分的に二本鎖の核酸分子は、部分的に二本鎖の核酸分子の3’突出部と標的核酸の第二領域との間に形成される二重鎖内で切断するよう設計され得る。このような切断の結果、標的核酸のより短いフラグメントがテンプレートとして使用され、一本鎖核酸フラグメントを増幅する。
特定の実施形態において、センス鎖がオリゴヌクレオチドプライマーの領域Bに存在する二本鎖ニック形成剤認識配列は、二本鎖TRERSと同一であり得る。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーの領域Bは、ニック形成エンドヌクレアーゼN.BstNB Iによって認識される配列「5’−GAGTC−3’」からなり得、一方で部分的に二本鎖の核酸分子におけるTRERSは、II型制限エンドヌクレアーゼPlelおよびMlylによって認識される
5’−GAGTC−3’
3’−CTCAG−5’
であり得る。このような実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーの領域Bと、標的核酸における対応領域との間に、ミスマッチが存在することが必要である。換言すれば、領域Bにおける1つ以上のヌクレオチドは、標的におけるヌクレオチドと従来の塩基対を形成しない。ミスマッチの存在は、TRERSを認識するII型制限エンドヌクレアーゼによる、オリゴヌクレオチドプライマーと標的の第一領域との間に形成される二重鎖の切断を防止する。
5’−GAGTC−3’
3’−CTCAG−5’
であり得る。このような実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーの領域Bと、標的核酸における対応領域との間に、ミスマッチが存在することが必要である。換言すれば、領域Bにおける1つ以上のヌクレオチドは、標的におけるヌクレオチドと従来の塩基対を形成しない。ミスマッチの存在は、TRERSを認識するII型制限エンドヌクレアーゼによる、オリゴヌクレオチドプライマーと標的の第一領域との間に形成される二重鎖の切断を防止する。
N1分子を提供するためのこの型の方法の別の例が、図7に示される。この例において、認識配列の外側でニックを形成するニック形成剤によって認識可能なニック形成剤認識配列が、例示的な認識配列として使用される。この図に示されるように、cNDA集団のcNDA分子は、その5’末端を介して固定される。これらの固定された核酸は、T1分子(これは、3’から5’へと、cDNA集団に存在し得る標的cDNAに少なくとも実質的に相補的な配列、およびニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む)と混合される。標的cDNAがcDNA集団に存在する場合、T1分子は、標的核酸とハイブリダイズして、N1分子を形成し、そして標的cNDAが付着した固相を洗浄することによって、ハイブリダイズしていないT1分子から分離され得る。DNAポリメラーゼおよびニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で、N1は、一本鎖核酸分子A1を増幅するためのテンプレートとして使用される。しかし、標的cDNAがcDNA集団に存在しない場合には、T1は、集団中のいずれのcDNA分子ともハイブリダイズし得ず、従って、固体支持体から洗浄除去される。その結果、固体支持体に付着したN1は形成され得ず、そしてN1の一部に相補的な一本鎖核酸分子は増幅され得ない。
(b.ニック形成剤認識配列を含む標的cDNA)
特定の実施形態において、標定cDNA自体が、二本鎖ニック形成剤認識配列を含み、cDNA集団において存在する場合、N1分子として直接機能し得る。標的cDNAがまた、制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む場合、制限エンドヌクレアーゼ認識配列を認識する制限エンドヌクレアーゼによって最初に消化され得る。ニック形成剤認識配列を含むこの消化生成物は、開始核酸分子(N1)として機能し得る。例示的ニック形成剤認識配列(例えば、N.BstNB I)としてのニック形成剤認識配列の外側にニック形成する、ニック形成エンドヌクレアーゼにより認識可能なニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を有する実施形態が、図8に例示される。
特定の実施形態において、標定cDNA自体が、二本鎖ニック形成剤認識配列を含み、cDNA集団において存在する場合、N1分子として直接機能し得る。標的cDNAがまた、制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む場合、制限エンドヌクレアーゼ認識配列を認識する制限エンドヌクレアーゼによって最初に消化され得る。ニック形成剤認識配列を含むこの消化生成物は、開始核酸分子(N1)として機能し得る。例示的ニック形成剤認識配列(例えば、N.BstNB I)としてのニック形成剤認識配列の外側にニック形成する、ニック形成エンドヌクレアーゼにより認識可能なニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を有する実施形態が、図8に例示される。
他の実施形態において、開始核酸分子N1は、ニック形成剤認識配列および標的cDNAもしくは標的mRNAに少なくとも実質的に相補的な突出部を有する、部分的に二本鎖の核酸分子である。例示的なニック形成剤認識配列としてのニック形成剤認識配列の外側にニック形成する、ニック形成エンドヌクレアーゼにより認識可能なニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列をN1が有する例示的な実施形態が、図9に例示される。この図に示されるように、このN1分子は、伸長の際に、ニック形成部位を含むかまたはニック形成部位を形成するかのいずれかである鎖に、5’突出部を含み得る。あるいは、このN1分子は、伸長の際に、ニック形成部位を含みもせず、ニック形成部位を形成もしない鎖に、3’突出部を含み得る。N1分子の突出部は、標的核酸分子にアニールし得るように、標的cDNA分子(または標的mRNA)に少なくとも実質的に相補的でなければならない。N1の標的cDNA(または標的mRNA)へのアニーリングは、標的cDNAが、目的のcDNA集団中に存在するかまたは、標的mRNAが目的の生物学的サンプル中に存在する場合に、標的cDNAとN1分子との間に形成される複合体(「標的−N1複合体」)の単離を可能にする。
例えば、cDNA集団中のcDNA分子または生物学的サンプル中のmRNA分子は、図9に示されるように、固体支持体に固定化され得る。このような固定化は、当該分野で公知の任意の方法(固定または組織プリンティングの使用が挙げられるが、これらに限定されない)により行われ得る。次いで、特定の標的cDNAまたは標的mRNAに実質的に相補的な突出部を有するN1分子は、cDNA集団または生物学的サンプルに適用される。標的cDNAがcDNA集団中に存在するか、または標的mRNAが生物学的サンプル中に存在する場合、N1は、その突出部を介して、標的核酸にハイブリダイズする。cDNA集団または生物学的サンプルは引き続いて洗浄されて、全てのハイブリダイズしなかったN1分子が除去される。DNAポリメラーゼおよびN1におけるNERSを認識するニック形成エンドヌクレアーゼの存在下で、一本鎖核酸分子A1は、増幅される。しかし、標的cDNAまたはmRNAが、cDNA集団(または生物学的サンプル)中に存在しない場合、N1は、サンプル中のいずれの核酸分子にもハイブリダイズすることができず、よってサンプルから洗い流される。従って、洗浄されたcDNA集団(または生物学的サンプル)が、核酸増幅反応混合物(すなわち、テンプレートとしてN1の部分を使用する一本鎖核酸増幅に必要な成分(例えば、N1分子におけるNERSを認識するNEおよびDNAポリメラーゼ)の全てを含む混合物)とともにインキュベートされ、N1の上記の部分に相補的な一本鎖核酸分子は増幅されない。
標的核酸分子を固定化するほかに、標的−N1複合体は、N1分子を、cDNA集団(または生物学的サンプル)中の標的cDNA(またはmRNA)分子と最初にハイブリダイズさせ、次いで、標的核酸と会合する官能基によりその複合体を単離することによって精製され得る。例えば、cDNA集団中のcDNA分子は、ビオチン分子で標識され得、その標的−N1標的複合体は、続いて、標的と結合したビオチン分子を介して精製され得る(例えば、固定化ストレプトアビジンで複合体を沈澱させる)。
(c.オリゴヌクレオチドプライマーの使用)
本発明の特定の実施形態では、開始核酸分子N1は、種々のオリゴヌクレオチドプライマー対を使用して生成される、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子である。N1分子を調製するためにODNP対を使用する方法は、図10〜12と合わせて、以下に記載される。
本発明の特定の実施形態では、開始核酸分子N1は、種々のオリゴヌクレオチドプライマー対を使用して生成される、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子である。N1分子を調製するためにODNP対を使用する方法は、図10〜12と合わせて、以下に記載される。
1つの実施形態では、N1に対する前駆体は、二本鎖のNARSおよびRERSを含む。このNARSおよびRERSは、ODNP対を使用することにより、この前駆体に組み込まれる。例示的なNARSとして、その認識配列の外側でニックを形成するNEによって認識可能なNERS(例えば、N.BstNB I)および例示的なRERSとして、IIs型の制限エンドヌクレアーゼ認識配列(TRERS)を用いた実施形態を、図10に示す。この図に示されるように、第1のODNPは、NERSの1つの鎖の配列を含むが、第2のODNPは、TRERSの1つの鎖の配列を含む。これらの2つのODNPが、標的cDNAの一部分を増幅するためのプライマーとして使用される場合、生じる増幅産物(すなわち、N1に対する前駆体)は、二本鎖のNERSおよび二本鎖のTRERSの両方を含む。TRERSを認識するIIs型制限エンドヌクレアーゼの存在下において、この増幅産物は、二本鎖NERSを含む核酸分子N1を生成するように消化される。
別の実施形態では、N1に対する前駆体は、2つの二本鎖NARSを含む。この2つのNARSは、2つのODNPを使用することにより、N1に対する前駆体に組み込まれる。例示的なNARSとしてその認識配列の外側にニックを形成するニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能なNERSを用いた実施形態を、図11に示す。この図に示されるように、両方のODNPは、NERSのセンス鎖の配列を含む。これらの2つのODNPを、標的cDNAの一部分を増幅するためのプライマーとして使用する場合、生じる増幅産物は、2つのNERSを含む。これらの2つのNERSは、互いに対して同一であっても同一でなくてもよいが、好ましくは、これらの2つのNERSは同一である。NERSを認識するNE(1つまたは複数)の存在下において、この増幅産物は、2回(各鎖において1回)ニック形成されて、二本鎖のNERSを各々含む2つの核酸分子(N1aおよびN1b)を生成する。
さらに別の実施形態において、N1に対する前駆体は、2つの半改変RERSを含む。この2つの半改変RERSは、2つのODNPを使用することによって、この前駆体に組み込まれる。この実施形態を図11に示す。この図に示されるように、第1のODNPおよび第2のODNPは両方とも、RERSの1つの鎖の配列を含む。これらの2つのODNPを、改変デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下において標的cDNAの一部分を増幅するためのプライマーとして使用する場合、生じる増幅産物は、2つの半改変RERSを含む。これらの2つの半改変RERSは、互いに対して同一であっても同一でなくてもよい。半改変RERSを認識するRE(1つまたは複数)の存在下において、上記の増幅産物はニック形成されて、半改変RERSの少なくとも1つの鎖の配列を各々含む、部分的に二本鎖の2つの核酸分子(N1aおよびN1b)を生成する。
(4.ニック形成剤)
特定のヌクレオチド配列を認識し、そしてこの配列を含む核酸の1つの鎖のみを切断する任意の酵素が、本発明のニック形成剤として使用され得る。このような酵素は、NE(ネイティブのヌクレオチドから構成される特定の配列を認識する)、またはRE(半改変認識配列を認識する)であり得る。
特定のヌクレオチド配列を認識し、そしてこの配列を含む核酸の1つの鎖のみを切断する任意の酵素が、本発明のニック形成剤として使用され得る。このような酵素は、NE(ネイティブのヌクレオチドから構成される特定の配列を認識する)、またはRE(半改変認識配列を認識する)であり得る。
ニック形成エンドヌクレアーゼは、その認識配列と重なるニック形成部位を有しても有さなくてもよい。その認識配列の外側にニック形成する例示的なNEは、N.BstNB Iであり、これは、5’−GAGTC−3’から構成される固有の核酸配列を認識するが、この認識配列の3’末端を超えて4ヌクレオチドにニック形成する。N.BstNB Iの認識配列およびニック形成部位を、以下で、
そのNERS内にニック形成する例示的なNEとしては、N.BbvCl−aおよびN.BbvCl−bが挙げられる。これら2つのNEの認識配列およびNS(記号:
さらなる例示的なニック形成エンドヌクレアーゼとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:N.BstSE I(Abdurashitovら、Mol.Biol.(Mosk)30:1261−7,1996)、操作されたEcoR V(Stahlら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:6175−80,1996)、操作されたFok I(Kimら、Gene 203:43−49,1997)、Thermotoga maritima由来のエンドヌクレアーゼV(Huangら、Biochem.40:8738−48,2001)、Cvi Nickase(例えば、CviNY2A、CviNYSI、Megabase Research Products,Lincoln,Nebraska)(Zhangら、Virology 240:366−75,1998;Nelsonら、Biol.Chem.379:423−8,1998;Xiaら、Nucleic Acids Res.16:9477−87,1988)、および操作されたMly I(すなわち、N.Mly I)(BesnierおよびKong,EMBO Reports 2:782−6,2001)。さらなるNEは、他の制限エンドヌクレアーゼ、特に、IIs型制限エンドヌクレアーゼを、EcoR V、AlwI、Fok Iおよび/またはMly Iを操作するための方法と類似の方法を使用して操作することによって、得られ得る。
ニック形成剤として有用なREは、その半改変された認識配列で二本鎖核酸にニック形成する任意のREであり得る。この半改変された二本鎖認識配列にニック形成する例示的なREとしては、AvaI、BslI、BsmAI、BsoBI、BsrI、BstNI、BstOI、Fnu4HI、HincII、HindIIおよびNciIが挙げられるがこれらに限定されない。半改変された認識配列にニック形成するさらなるREは、米国特許第5,631,147号に記載される鎖保護アッセイによってスクリーニングされ得る。
特定の実施形態において、ニック形成剤は、DNA−RNA二重鎖においてヌクレオチド配列を認識し得、二重鎖の一方の鎖にニック形成する。特定の他の実施形態において、ニック形成剤は、二本鎖RNAにおいてヌクレオチド配列を認識し得、RNAの一方の鎖にニック形成する。
特定のニック形成剤は、少なくとも部分的に二本鎖の基質核酸中に、二本鎖の認識配列のセンス鎖の存在のみを、ニック形成活性のために必要とする。例えば、N.BstNBIは、基質核酸のニック形成において活性であり、この核酸は、1つの鎖に、1つ以上のヌクレオチドが基質核酸のもう1つの鎖上のヌクレオチドと従来の塩基対(例えば、G:C、A:T、またはA:U)を形成しない認識配列「5’−GAGTC−3’」のセンス鎖の配列を含む。
(5.DNAポリメラーゼ)
本発明において有用なDNAポリメラーゼは、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損であるが鎖置換活性を有する任意のDNAポリメラーゼであり得る。このようなDNAポリメラーゼとしては、exo− Deep Vent、exo− Bst、exo− Pfu、およびexo− Bcaが挙げられるがこれらに限定されない。本発明において有用なさらなるDNAポリメラーゼは、スクリーニングされ得るか、または米国特許第5,631,147号(その全体を本明細書中に参考として援用される)に記載される方法によって作製され得る。鎖置換活性は、以下に記載される鎖置換促進因子の存在によってさらに増強される。
本発明において有用なDNAポリメラーゼは、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損であるが鎖置換活性を有する任意のDNAポリメラーゼであり得る。このようなDNAポリメラーゼとしては、exo− Deep Vent、exo− Bst、exo− Pfu、およびexo− Bcaが挙げられるがこれらに限定されない。本発明において有用なさらなるDNAポリメラーゼは、スクリーニングされ得るか、または米国特許第5,631,147号(その全体を本明細書中に参考として援用される)に記載される方法によって作製され得る。鎖置換活性は、以下に記載される鎖置換促進因子の存在によってさらに増強される。
あるいは、特定の実施形態において、鎖置換活性を有さないDNAポリメラーゼが、使用され得る。このようなDNAポリメラーゼとしては、exo−Vent、Taq、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、T5 DNAポリメラーゼおよびPhi29 DNAポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、これらのDNAポリメラーゼの使用は、鎖置換促進因子(facilitator)の存在を必要とする。「鎖置換促進因子」は、DNAポリメラーゼに触媒される、ニック形成部位の3’末端からの核酸伸長の間の鎖置換を促進する任意の化合物または組成物である。本発明において有用な、例示的な鎖置換促進因子の例としては、BMRF1ポリメラーゼアクセサリーサブユニット(Tsurumiら、J.Virology 67:7648−53,1993)、アデノウイルスDNA結合タンパク質(Zijderveldおよびvan der Vliet、J.Virology 68:1158−64,1994)、単純ヘルペスウイルスタンパク質ICP8(BoehmerおよびLehman、J.Virology 67:711−5,1993;SkaliterおよびLehman、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10665−9,1994)、一本鎖DNA結合タンパク質(RiglerおよびRomano、J.Biol.Chem.270:8910−9,1995)、ファージT4遺伝子32タンパク質(VillemainおよびGiedroc、Biochemistry 35:14395−4404,1996)、ウシ胸腺ヘリカーゼ(Siegelら、J.Biol.Chem.267:13629−35,1992)およびトレハロースが挙げられるが、これらに限定されない。1つの実施形態では、トレハロースが、増幅反応混合物中に存在する。
本発明において有用な、さらなる例示的なDNAポリメラーゼとしては、ファージM2 DNAポリメラーゼ(Matsumotoら、Gene 84:247,1989)、ファージPhiPRD1 DNAポリメラーゼ(Jungら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:8287,1987)、T5 DNAポリメラーゼ(Chatterjeeら、Gene 97:13−19,1991)、Sequenase(U.S.Biochemicals)、PRD1 DNAポリメラーゼ(ZhuおよびIto、Biochim.Biophys.Acta.1219:267−76,1994)、9°Nm TMDNAポリメラーゼ(New England Biolabs)(Southworthら、Proc.Natl.Acad.Sci.93:5281−5,1996;Rodriquezら、J.Mol.Biol.302:447−62,2000)およびT4 DNAポリメラーゼホロ酵素(KaboordおよびBenkovic、Curr.Biol.5:149−57,1995)が挙げられるが、これらに限定されない。
あるいは、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼが使用され得る。例えば、このようなDNAポリメラーゼは、ニック形成の後、テンプレート核酸から自動的に解離する短い核酸フラグメントを増幅するために有用であり得る。
ニック形成剤が、RNA−DNA二重鎖のDNA鎖にニックを入れる特定の実施形態において、RNA依存性DNAポリメラーゼが使用され得る。ニック形成剤が、RNA−DNA二重鎖のRNA鎖にニックを入れる他の実施形態において、DNAプライマーから伸長させるDNA依存性DNAポリメラーゼ(例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素(Promega))が使用され得る。両方の事例において、標的RNAは、cDNAに逆転写される必要はなく、そして標的mRNAに対して少なくとも実質的に相補的であるテンプレート核酸分子と直接に混合され得る。
(6.A1分子)
上記のように、A1分子は、テンプレートとしてN1の一部を使用して増幅される。特定の実施形態において、A1は比較的短くあり得、25個以下のヌクレオチド、20個以下のヌクレオチド、17個以下のヌクレオチド、15個以下のヌクレオチド、10個以下のヌクレオチド、または8個以下のヌクレオチドを有する。このような短さは、N1分子を作製する際に使用されるT1分子またはODNPを適切に設計することによって達成され得る。例えば、図4〜7に示される実施形態について、T1は、NARSのアンチセンス鎖の配列に対して5’側に短い領域を有するように設計され得る。図9に示される実施形態については、部分的に二重鎖のN1分子が、N1における認識配列を認識するニック形成薬剤によってニック形成可能なニック形成部位に対応する位置に対して5’側に位置した短い領域を有するように設計され得る。図10〜12に示される実施形態については、ODNP対が、プライマーが標的核酸にアニーリングする場合に、互いに近くにあるように設計され得る。A1分子の短さは、有利であり得る。なぜなら、この短さは、増幅効率および増幅速度を増大させるからである。さらに、この短さは、鎖置換活性を有さないDNAポリメラーゼを使用することを可能にする。この短さはまた、A1が質量分析のような特定の技術を介した初期増幅プライマーとして使用されるA1分子の検出を容易にする。
上記のように、A1分子は、テンプレートとしてN1の一部を使用して増幅される。特定の実施形態において、A1は比較的短くあり得、25個以下のヌクレオチド、20個以下のヌクレオチド、17個以下のヌクレオチド、15個以下のヌクレオチド、10個以下のヌクレオチド、または8個以下のヌクレオチドを有する。このような短さは、N1分子を作製する際に使用されるT1分子またはODNPを適切に設計することによって達成され得る。例えば、図4〜7に示される実施形態について、T1は、NARSのアンチセンス鎖の配列に対して5’側に短い領域を有するように設計され得る。図9に示される実施形態については、部分的に二重鎖のN1分子が、N1における認識配列を認識するニック形成薬剤によってニック形成可能なニック形成部位に対応する位置に対して5’側に位置した短い領域を有するように設計され得る。図10〜12に示される実施形態については、ODNP対が、プライマーが標的核酸にアニーリングする場合に、互いに近くにあるように設計され得る。A1分子の短さは、有利であり得る。なぜなら、この短さは、増幅効率および増幅速度を増大させるからである。さらに、この短さは、鎖置換活性を有さないDNAポリメラーゼを使用することを可能にする。この短さはまた、A1が質量分析のような特定の技術を介した初期増幅プライマーとして使用されるA1分子の検出を容易にする。
(7.反応条件)
本発明は、ニック形成薬剤およびDNAポリメラーゼの存在下で一本鎖核酸分子を増幅した。このような増幅反応において、DNAポリメラーゼは、NAがテンプレート核酸と混合される前、混合された後、または混合されると同時に、核酸分子(例えば、テンプレート核酸分子)と混合され得る。好ましくは、ニック形成−伸長反応緩衝液は、NAおよびDNAポリメラーゼの両方に適切であるように最適化される。例えば、N.BstNB IがNAであり、exo−VentがDNAポリメラーゼである場合、ニック形成−伸長緩衝液は、0.5×N.BstNB I緩衝液および1×DNAポリメラーゼ緩衝液であり得る。例示的な1×N.BstNB I緩衝液は、10mM Tris−HCl、10mM MgCl2、150mM KCl、および1mM ジチオスレイトール(25℃にてpH7.5)であり得る。例示的な1×DNAポリメラーゼ緩衝液は、10mM KCl、20mM Tris−HCl(25℃にてpH8.8)、10mM (NH4)2SO4、2mM MgSO4、および0.1% Triton X−100であり得る。当業者は、NAおよびDNAポリメラーゼのための反応緩衝液を容易に見いだし得る。
本発明は、ニック形成薬剤およびDNAポリメラーゼの存在下で一本鎖核酸分子を増幅した。このような増幅反応において、DNAポリメラーゼは、NAがテンプレート核酸と混合される前、混合された後、または混合されると同時に、核酸分子(例えば、テンプレート核酸分子)と混合され得る。好ましくは、ニック形成−伸長反応緩衝液は、NAおよびDNAポリメラーゼの両方に適切であるように最適化される。例えば、N.BstNB IがNAであり、exo−VentがDNAポリメラーゼである場合、ニック形成−伸長緩衝液は、0.5×N.BstNB I緩衝液および1×DNAポリメラーゼ緩衝液であり得る。例示的な1×N.BstNB I緩衝液は、10mM Tris−HCl、10mM MgCl2、150mM KCl、および1mM ジチオスレイトール(25℃にてpH7.5)であり得る。例示的な1×DNAポリメラーゼ緩衝液は、10mM KCl、20mM Tris−HCl(25℃にてpH8.8)、10mM (NH4)2SO4、2mM MgSO4、および0.1% Triton X−100であり得る。当業者は、NAおよびDNAポリメラーゼのための反応緩衝液を容易に見いだし得る。
さらに、DNAポリメラーゼが解離性である(すなわち、このDNAポリメラーゼは、Vent DNAポリメラーゼのようなテンプレート核酸から比較的乖離しやすい)特定の実施形態において、反応混合物中のNA 対 DNAポリメラーゼの比はまた、全長核酸分子の最大増幅のために最適化され得る。本明細書中で使用される場合、「全長」核酸分子とは、そのテンプレートの5’末端配列に相補的な配列を含む、増幅された核酸分子をいう。言い換えると、全長核酸分子は、完全な遺伝子伸長反応の増幅産物である。NAの量が、DNAポリメラーゼの量に対して過剰である反応混合物において、部分的な増幅産物が、生成され得る。部分的増幅産物の生成は、NAによる、部分的に増幅した核酸分子の過剰なニック形成およびその後のこれらの分子のテンプレートからの解離に起因し得る。このような解離は、その部分的に増幅した核酸分子がさらに伸長しないようにする。
異なるNAまたは異なるDNAポリメラーゼは、異なるニック形成活性またはプライマー伸長活性を有し得るので、全長核酸分子の最大の増幅に適切な、特定のNA 対 特定の解離性DNAポリメラーゼの比は、特定のNAおよびDNAポリメラーゼに特に依存して変化する。しかし、特定のNAと特定のDNAポリメラーゼとの所定の組み合わせについては、その比は、異なるNA 対 DNAポリメラーゼ比を有する反応混合物中で指数関数的な核酸増幅反応を行い、当該分野で公知の技術を使用して(例えば、液体クロマトグラフィーまたは質量分析法により)その増幅産物を特徴付けることにより最適化され得る。全長核酸分子の最大の生成を可能にする比は、将来的な増幅反応において使用され得る。
特定の好ましい実施形態において、本発明のニック形成反応および伸長反応は、等温条件下で行われる。本明細書中で使用される場合、「等温的に」および「等温条件」とは、増幅過程の間、反応の温度が本質的に一定に保持された(すなわち、同じ温度であるか、または上限温度と下限温度との差異が20℃以下である同じ狭い温度範囲内である)反応条件のセットをいう。本発明の増幅方法の利点は、上限温度と下限温度との間で温度をサイクルさせる必要がないことである。ニック形成反応および伸長反応の両方が、同じ温度にて、または同じ狭い温度範囲内で行われる。温度を維持するために使用される装置が、反応混合物の温度を少ない程度で変動させることが可能である場合、このような変動は、増幅反応に不利益ではない。等温増幅のための例示的な温度としては、50℃〜70℃の間の任意の温度、または50℃〜70℃、55℃〜70℃、60℃〜70℃、65℃〜70℃、50℃〜55℃、50℃〜60℃、もしくは50℃〜65℃の間の温度範囲が挙げられるが、これらに限定されない。多くのNAおよびDNAポリメラーゼは、上記の例示的温度にてまたは上記の例示的な温度範囲内で活性である。例えば、N.BstNB I(New England Biolabs)を用いるニック形成反応およびexo− Bstポリメラーゼ(BioRad)を用いる伸長反応の両方は、約55℃にて行われ得る。約50℃〜70℃の間で活性な他のポリメラーゼとしては、exo− Vent(New England Biolabs)、exo− Deep Vent(New England Biolabs)、exo−Pfu(Strategene)、exo−Bca(Panvera)およびSequencing Grade Taq(Promega)が挙げられるが、これらに限定されない。
制限エンドヌクレアーゼが、ニック形成薬剤として使用される場合、改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸は、半改変(hemimodified)制限エンドヌクレアーゼ認識配列を生成するために必要である。制限エンドヌクレアーゼ認識配列中に改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む二本鎖核酸の一方の鎖の切断の阻害に寄与する任意の改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸が使用され得る。例示的な改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸としては、2’−デオキシシチジン5’−O−(1−チオ三リン酸)[すなわち、dCTP(.α.S)]、2’−デオキシグアノシン5’−O−(1−チオ三リン酸)、チミジン−5’−O−(1−チオ三リン酸)、2’−デオキシシチジン5’−O(1−チオ三リン酸)、2’−デオキシウリジン5’−三リン酸、5−メチルデオキシシチジン5’−三リン酸、および7−デアザ−2’−デオキシグアノシン5’−三リン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
(8.増幅された一本鎖核酸の検出および/または特徴付け)
cDNA集団中の標的cDNAまたは生物学的サンプル中の標的mRNAの存在は、増幅産物(A1)を検出および/または特徴付けすることによって検出され得る。一本鎖核酸分子を検出または特徴付けするために適切な任意の方法が、使用され得る。例えば、増幅反応は、標識が、増幅核酸分子に組み込まれるように、標識デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で行われ得る。核酸フラグメントへの組み込みに適した標識、およびその後のフラグメントの検出のための方法は、当該分野で公知であり、例示的な標識としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:放射標識(例えば、32P、33P、125Iまたは35S)、呈色反応生成物を生じ得る酵素(例えば、アルカリホスファターゼ)、蛍光標識(例えば、フルオレセインイソチオシアネート)(FITC)、ビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン、抗原、ハプテン、または蛍光色素。
cDNA集団中の標的cDNAまたは生物学的サンプル中の標的mRNAの存在は、増幅産物(A1)を検出および/または特徴付けすることによって検出され得る。一本鎖核酸分子を検出または特徴付けするために適切な任意の方法が、使用され得る。例えば、増幅反応は、標識が、増幅核酸分子に組み込まれるように、標識デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で行われ得る。核酸フラグメントへの組み込みに適した標識、およびその後のフラグメントの検出のための方法は、当該分野で公知であり、例示的な標識としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:放射標識(例えば、32P、33P、125Iまたは35S)、呈色反応生成物を生じ得る酵素(例えば、アルカリホスファターゼ)、蛍光標識(例えば、フルオレセインイソチオシアネート)(FITC)、ビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン、抗原、ハプテン、または蛍光色素。
あるいは、増幅核酸分子は、実質的に、好ましくは完全に、増幅核酸分子に相補的な標識された検出因子(detector)オリゴヌクレオチドの使用によって検出され得る。標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸と同様に、検出因子オリゴヌクレオチドはまた、放射活性タグ、化学発光タグ、または蛍光タグ(蛍光分極(fluorescence polarization)または蛍光共鳴エネルギー移動を使用する検出に適したものが挙げられる)などで標識され得る。Spargoら,Mol.Cell.Probes 7:395−404,1993;Hellyerら,J.Infectious Diseases 173:934−41,1996;Walkerら,Nucl.Acids Res.24:348−53,1996;Walkerら,Clin.Chem.42:9−13,1996;Spearsら,Anal.Biochem.247:130−7,1997;Mehrpouyanら,Mol.Cell.Probes 11:337−47,1997;およびNadeauら,Anal.Biochem.276:177−87,1999を参照のこと。
特定の実施形態において、増幅核酸分子は、さらに特徴付けられ得る。その特徴付けにより、これらの核酸分子の正体が確認され得、従って、cDNA集団中の標的cDNAまたは生物学的サンプル中の標的mRNAの存在が確認され得る。このような特徴付けは、一本鎖核酸フラグメントを特徴付けるために適した任意の公知の方法を介して行われ得る。例示的な技術としては、クロマトグラフィー(例えば、液体クロマトグラフィー)、質量分析および電気泳動が挙げられるが、これらに限定されない。種々の例示的な方法の詳細な記載は、米国特許仮出願第60/305,637号および同第60/345,445号(それらの全体が本明細書中に参考として援用される)に見いだされ得る。
増幅産物を検出および/または特徴付けして、DNA集団中の標的cDNAまたは生物学的サンプル中の標的mRNAの存在を検出することに加えて、標的核酸の存在は、増幅反応において生じた完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子(例えば、それらのH1生成物、H2生成物またはニック形成生成物)を検出することによって検出され得る。特定の実施形態において、二本鎖核酸分子の検出は、二本鎖核酸分子に特異的に結合する蛍光化合物(すなわち、蛍光插入剤)を増幅混合物に付加することによって行われ得る。蛍光插入剤の付加により、核酸増幅のリアルタイムモニタリングが可能になる。あるいは、二本鎖核酸分子(例えば、H1およびH2)の生成を最大にするために、ニック形成伸長反応混合物中のNE(DNAポリメラーゼではない)を、不活性化し得る(例えば、熱処理によって)。NEの不活性化により、反応混合物中の全てのニック形成された核酸分子が、二本鎖核酸分子を生成するために伸長することが可能になる。種々の蛍光插入剤は、当該分野で公知であり、本発明において使用され得る。例示的な薬剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:米国特許第4,119,521号;同第5,599,932号、同第5,658,735号;同第5,734,058号;同第5,763,162号;同第5,808,077号;同第6,015,902号;同第6,255,048号および同第6,280,933号において開示されているもの、GlazerおよびRye,Nature 359:859−61,1992ならびにSYBR(登録商標)(Molecular Probes,Eugene WAにおいて議論されているもの。
(9.遺伝子発現プロファイリング)
遺伝子が生物学的サンプル中で発現されるか否かを決定するための方法に加えて、本発明はまた、サンプル中の複数遺伝子の発現をプロファイリングするための方法を提供する。例えば、生物学的サンプルに由来するmRNA用いて生成された二本鎖cDNA分子は、制限エンドヌクレアーゼで最初に消化されて、比較的短いcDNAフラグメントを提供し得る。これらのcDNAフラグメントは、核酸増幅に適した反応緩衝液中で、ニック形成薬剤およびDNAポリメラーゼと混合され得る。ニック形成薬剤の認識配列を含むそのcDNAフラグメントは、従って、一本鎖核酸を増幅するためのテンプレートとして機能し得る。増幅された一本鎖核酸は、分離および/または特徴付けされ得る。これらの増幅核酸の特徴付けは、1以上の目的のcDNA分子の存在または非存在を示し得る。さらにこのような特徴付けはまた、生物学的サンプルに由来するcDNA集団のプロフィールとして機能し得る。これは、別の生物学的サンプルに由来するcDNA集団のプロフィールと比較され得る。
遺伝子が生物学的サンプル中で発現されるか否かを決定するための方法に加えて、本発明はまた、サンプル中の複数遺伝子の発現をプロファイリングするための方法を提供する。例えば、生物学的サンプルに由来するmRNA用いて生成された二本鎖cDNA分子は、制限エンドヌクレアーゼで最初に消化されて、比較的短いcDNAフラグメントを提供し得る。これらのcDNAフラグメントは、核酸増幅に適した反応緩衝液中で、ニック形成薬剤およびDNAポリメラーゼと混合され得る。ニック形成薬剤の認識配列を含むそのcDNAフラグメントは、従って、一本鎖核酸を増幅するためのテンプレートとして機能し得る。増幅された一本鎖核酸は、分離および/または特徴付けされ得る。これらの増幅核酸の特徴付けは、1以上の目的のcDNA分子の存在または非存在を示し得る。さらにこのような特徴付けはまた、生物学的サンプルに由来するcDNA集団のプロフィールとして機能し得る。これは、別の生物学的サンプルに由来するcDNA集団のプロフィールと比較され得る。
特定の実施形態において、増幅核酸の全てが、特徴付けられるわけではない。言い換えると、これらの実施形態において、所定の基準を満たす特定の増幅核酸のみが、特徴付けられる必要がある。例えば、増幅核酸分子は、始めに、液体クロマトグラフィーによって分離され得、短い核酸フラグメントを含む画分のみが、例えば、質量分析によりさらに特徴付けられる。cDNA分子の消化は、その後の質量分析に適した比較的短いフラグメントの増幅を増大させる。しかし、cDNA分子が、ニック形成薬剤およびDNAポリメラーゼと混合される前に、消化される必要はない。
(10.固定化核酸および核酸のアレイ)
特定の実施形態において、本発明に従って指数関数的に核酸増幅に関与する核酸またはオリゴヌクレオチドは、固体支持体(「基材」ともいわれる)に固定され得る。固定され得るこの核酸またはオリゴヌクレオチドとしては、標的mRNAまたはcDNA、開始核酸(以下に記載される)、トリガーODNP、およびT1分子を調製するために有用であるオリゴヌクレオチドプライマーが挙げられる。特定の実施形態において、このような核酸またはオリゴヌクレオチドは、それらが一本鎖である場合にそれらの5’末端もしくは3’末端を介して固定され得るか、またはそれらが二本鎖である場合に一方の鎖の5’末端もしくは3’末端’を介して固定され得る。
特定の実施形態において、本発明に従って指数関数的に核酸増幅に関与する核酸またはオリゴヌクレオチドは、固体支持体(「基材」ともいわれる)に固定され得る。固定され得るこの核酸またはオリゴヌクレオチドとしては、標的mRNAまたはcDNA、開始核酸(以下に記載される)、トリガーODNP、およびT1分子を調製するために有用であるオリゴヌクレオチドプライマーが挙げられる。特定の実施形態において、このような核酸またはオリゴヌクレオチドは、それらが一本鎖である場合にそれらの5’末端もしくは3’末端を介して固定され得るか、またはそれらが二本鎖である場合に一方の鎖の5’末端もしくは3’末端’を介して固定され得る。
核酸またはオリゴヌクレオチドを固定するための方法は、当該分野で公知である。特定の実施形態において、本発明の核酸またはオリゴヌクレオチド(例えば、N1分子を調製するために必要なT1分子またはODNP)は、アレイを形成するために基材に固定され得る。本明細書中で使用される場合、「アレイ」とは、異なる領域において固体支持体上に配置され得る核酸またはオリゴヌクレオチドの集団をいう。各領域は、核酸またはオリゴヌクレオチドが結合または沈着されない距離だけいくらか分離される。いくつかの実施形態において、領域サイズは、20〜500ミクロンであり、近隣領域の中心間距離は、50〜1500ミクロンの範囲である。本発明のアレイは、2〜9、10〜100、101〜400、401〜1,000、または1,000個を超える異なる領域を含み得る。
一般に、核酸またはオリゴヌクレオチドは、以下の2つの方法において基材に固定され得る:(1)核酸またはオリゴヌクレオチドを基材上に直接合成すること(しばしば、「インサイチュ合成」といわれる)、または(2)核酸またはオリゴヌクレオチドを別々に合成またはさもなければ調製して、次いでこれらを、基材に位置づけまたは結合させること(ときおり、「合成後結合」といわれる)。インサイチュ合成について、主な技術は、フォトリソグラフィーである。簡潔には、この技術は、固体支持体の表面を、例えば、連結エレメントを通じて基材に結合される酸素原子を保護する感光性基で改変することを包含する。保護化ヒドロキシル基のこのアレイは、フォトリソグラフィーマスクを通じて照射され、照射された領域において反応性ヒドロキシル基を生成する。同じ感光性基で5’−ヒドロキシルにて保護された3’−O−ホスホルアミダイト活性化デオキシヌクレオシドは、次いで、表面に提示され、カップリングが、照射された領域のヒドロキシル基を通じて発生する。さらなる化学的反応の後に、基材はすすがれ、その表面は、第2のマスクを通じて照射されて、さらなるヒドロキシル基がカップリングのために曝される。第2の5’保護し、3’−O−ホスホルアミダイト活性化したデオキシヌクレオシドは、表面に提示される。選択的光脱保護およびカップリングサイクルは、所望のセットの生成物が得られるまで反復される。アレイ製作におけるフォトリソグラフィーの使用についての詳細な記載は、以下の特許または公開特許出願において見いだされ得る:米国特許第5,143,854号;同第5,424,186号;同第5,856,101号;同第5,593,839号;同第5,908,926号;同第5,737,257号;および公開PCT特許出願番号WO99/40105;WO99/60156;WO00/35931。
合成後付着アプローチは、予め存在するオリゴヌクレオチドを基材に付着するための方法を必要とする。1つの方法は、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を用いる。簡単に述べれば、ビオチンとストレプトアビジンとが、共有結合ではないが、強度において共有結合に等価であると考えられ得る非常に強い相互作用を形成することが周知である。あるいは、予め合成された核酸もしくはオリゴヌクレオチド、または予め調製された核酸もしくはオリゴヌクレオチドを、基材に共有結合し得る。例えば、カルボジイミドは、3つの異なるアプローチで一般に用いられ、DNAを固体支持体に結合する。1つのアプローチでは、支持体は、次に、カルボジイミドおよびカルボキシ改変オリゴヌクレオチドで処理されるヒドラジド基でコートされる。あるいは、複数のカルボン酸基をもつ基材は、アミノ改変オリゴヌクレオチドおよびカルボジイミドで処理され得る。エポキシドを基礎にした化学もまた、アミン改変オリゴヌクレオチドと用いられる。予め存在するオリゴヌクレオチドを基材に付着するための方法の詳細な記載は、以下の参考文献中に見出され得る:米国特許第6,030,782号;同第5,760,130号;同第5,919,626号;公開されたPCT特許出願番号WO00/40593;Stimpsonら、Proc.Natl.Acad.Sci.92:6379〜6383(1995);Beattieら、Clin.Chem.41:700〜706(1995);Lamtureら、Nucleic Acids Res.22:2121〜2125(1994);Chriseyら、Nucleic Acids Res.24:3031〜3039(1996);およびHolmstromら、Anal.Biochem.209:278〜283(1993)。
主要な合成後付着技法は、インクジェットおよび機械的スポットを含む。インクジェットは、インクジェットプリンティング工業に由来するディスペンサを用いて核酸またはオリゴヌクレオチドを散布することを含む。この核酸オリゴヌクレオチドは、供給源プレートからプリントヘッド中に上に引き抜かれ、そして次に基材の上の位置に移動される。次いで、核酸またはオリゴヌクレオチドは、小オリフィスを通じて押され、プリントヘッドから基材の表面上に小滴の射出を引き起こす。アレイ製作においてインクジェットを用いる詳細な記載は、以下の特許中に見出され得る:米国特許第5,700,637号;第6,054,270号;第5,658,802号;同5,958,342号;同6,136,962号および同第6,001,309号。
機械的スポットは、剛直性のピンの使用を含む。ピンは、核酸またはオリゴヌクレオチド溶液中に浸漬され、それによって小容量の溶液をピンの先端上に移す。ピン先端を基材に触れさせてスポットを残し、その直径は、ピン、核酸またはオリゴヌクレオチド溶液、および基材の表面エネルギーによって決定される。機械的スポットは、一回の核酸またはオリゴヌクレオチドローディグで複数のアレイをスポットするために用いられ得る。アレイ製作において機械的スポットを用いる詳細な記載は、以下の特許および公開された特許出願中に見出され得る:米国特許第6,054,270号;同第6,040,193号;同第5,429,807号;同第5,807,522号;同第6,110,426号;同第6,063,339号;および同第6,101,946号;ならびに公開されたPCT特許出願番号WO99/36760;同99/05308;同00/01859;および00/01798。
当業者は、上記に記載した技法の他に、他の方法もまた、基材に核酸またはオリゴヌクレオチドを固定することにおいて用いられ得ることを認識する。このような方法の記載は、制限されないで、以下の特許または公開された特許出願中に見出され得る:米国特許第5,677,195号;同第6,030,782号;同第5,760,130号;および同第5,919,626号;ならびに公開されたPCT特許出願番号WO98/01221;WO99/41007;WO99/42813;WO99/43688;WO99/63385;WO00/40593;WO99/19341;およびWO00/07022。
アレイを形成するために本発明の核酸またはオリゴヌクレオチドが固定される基材は、適切な材料から調製される。好ましくは、この基材は剛直性であり、そして実質的に平坦である表面を有している。いくつかの実施形態では、この表面は、領域を輪郭で分ける一段高い部分を有し得る。このような輪郭は、増幅反応混合物を互いに別個の領域で分離し、そして別個の領域における増幅産物が個々に分析され、または特徴付けられるべきことを可能にする。適切な材料は、制限されないで、シリコン、ガラス、紙、セラミック、金属、非金属、およびプラスチックを含む。代表的な基材は、シリコンウェーハおよびホウケイ酸塩スライド(例えば、顕微鏡ガラススライド)である。特に有用な固体支持体の例は、半導体の構築に電子工業で通常用いられているシリコンウェーハである。これらのウェーハは1つの側面が高度に研磨され、かつ反射性であり、そしてシラン化学を用いてポリ(エチレンイミン)のような種々のリンカーで容易に被覆され得る。ウェーハは、WaferNet、San Jose、CAのような企業から商業的に入手可能である。
意図される適用に依存して、当業者は、本発明のアレイの固定された分子の組成を変動し得る。例えば、本発明のT1またはODNP分子は、アレイの別個の領域毎に固定されてもよいし、されなくてもよい。好ましくは、アレイの別個の領域中の核酸またはオリゴヌクレオチドは均一である。より好ましくは、核酸またはオリゴヌクレオチドが固定されるアレイの別個の領域毎にある核酸またはオリゴヌクレオチドは均一である。本明細書で用いられる用語「均一」は、別個の領域中の核酸またはオリゴヌクレオチド分子の各々が、同じ領域中の別の核酸またはオリゴヌクレオチド分子と同じ配列をもつことを示す。あるいは、アレイの別個の領域の少なくとも1つにある核酸またはオリゴヌクレオチドは異質である。本明細書で用いられる用語「異質」は、別個の領域にある少なくとも1つの核酸またはオリゴヌクレオチドが、その領域中の別の核酸またはオリゴヌクレオチドとは異なる配列を有することを示す。いくつかの実施形態では、上記に記載の核酸またはオリゴヌクレオチド以外の分子はまた、アレイの別個の領域のいくつかまたはすべてに存在し得る。例えば、アレイの質の内部コントロールとして有用な分子が、アレイの別個の領域のいくつかまたはすべてに付着され得る。このような分子の別の例は、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーの指標として有用な核酸であり得る。他の実施形態では、アレイの別個の領域毎における核酸またはオリゴヌクレオチドの組成は同一である。このようなアレイは、選択された集団の生物中の特定遺伝子中の遺伝子変動を決定することで、または特定遺伝子中の変異と関連する疾患または障害の平行する診断で有用であり得る。
想定される適用に依存して、本発明の固定された核酸またはオリゴヌクレオチド(例えば、T1またはT2分子)は、種々の標的核酸に少なくとも実質的に相補的または同一であるオリゴヌクレオチド配列を含み得る。このような標的核酸は、制限されないで、動物における遺伝性疾患、発癌遺伝子、疾患素因に関連する遺伝子、法医学および/または父性決定のために有用なゲノムDNA、植物または動物において所望の特徴に関連するか、またはそれを与える遺伝子、および感染性生物のゲノムまたはエピソーム性DNAを含む。本発明のアレイは、別個の領域中の特定の型の標的核酸に少なくとも実質的に相補的であるかまたは同一である核酸またはオリゴヌクレオチドを含み得る。例えば、アレイは、第1の別個の領域中に疾患素因に関連する第1の遺伝子に少なくとも実質的に相補的であるかまたは同一である核酸またはオリゴヌクレオチド、第2の別個の領域中にこれもまた疾患素因に関連する第2の遺伝子に少なくとも実質的に相補的であるかまたは同一である別の核酸またはオリゴヌクレオチド、第3の別個の領域中にこれもまた疾患素因に関連する第3の遺伝子に少なくとも実質的に相補的であるかまたは同一であるなお別の核酸またはオリゴヌクレオチドを有し得る。このようなアレイは、(ヒトを含む)個々の動物または植物の疾患素因を決定するために有用である。あるいは、アレイは標的の機能によりカテゴリー分けされる複数の型の標的核酸に少なくとも実質的に相補的または同一である核酸またはオリゴヌクレオチドを有し得る。
さらに、アレイは、種々の可能な遺伝子変動を含む標的核酸の一部分に少なくとも実質的に相補的であるかまたは同一である核酸またはオリゴヌクレオチドを含み得る。例えば、アレイの第1の領域は、標的の1つの対立遺伝子の遺伝子変動を含む標的遺伝子の一部分に少なくとも実質的に相補的であるかまたは同一である核酸またはオリゴヌクレオチドを含み得る。アレイの第2の領域は、標的の別の対立遺伝子の遺伝子変動を含む標的遺伝子の一部分に少なくとも実質的に相補的であるかまたは同一である固定核酸またはオリゴヌクレオチドを含み得る。このアレイは、標的のさらなる対立遺伝子の遺伝子変動を含む標的遺伝子の一部分に少なくとも実質的に相補的であるかまたは同一である固定核酸またはオリゴヌクレオチドを含むさらなる領域を有し得る。
一般に、アレイ環境における首尾良い性能のために、固定された核酸またオリゴヌクレオチドは、安定であり、そしてハイブリダイゼーション、洗浄または増幅反応が実施される温度でのインキュベーションのような、種々の処理の間に解離してはならない。固定された核酸またオリゴヌクレオチドの密度は、次の分析に十分でなければならない。本発明の方法に適切なアレイには、代表的には1000〜1012、好ましくは1000〜106、106〜109、または109〜1012のODNP分子が少なくとも1つの別個の領域中に固定される。しかし、基材への他の核酸の非特異的結合は最小でなければならない。固定プロセスは、指数的核酸増幅に必要な固定核酸またはオリゴヌクレオチドの能力を妨害するべきではない。
特定の実施形態では、リンカーを介して基材に間接的に結合した本発明の核酸またはオリゴヌクレオチドを有することが所望され得る。このリンカー(「連結エレメント」とも称される)は、核酸またはオリゴヌクレオチドを基材から距離を置くために供される化学的鎖を備える。特定の実施形態では、このリンカーは、切断可能であり得る。連結エレメントを配置する多くの方法がある。1つの一般的アプローチでは、基材は、多くの反応末端/部位をもつ連結エレメントを提供するポリマー層で被覆される。一般的な例は、ポリリシンで被覆されたガラススライドであり、これは商業的に入手可能である。別の例は、公開されたPCT出願番号WO99/04896および米国特許第6,150,103号に記載のような、ポリ(エチレンイミン)で被覆された基材である。
アレイを形成しない本発明の核酸分子について、これらは、アレイを調製することで有用である上記に記載の方法を経由して固定され得る。さらに、当該分野で公知の任意の方法が用いられ得る。例えば、本発明の標的mRNAは、固定プリンティングまたは組織プリンティングの使用により固定され得る。標的cDNAは、最初に合成され得、そして次に、ニトロセルロースメンブレンまたはナイロンメンブレンのような、核酸またはオリゴヌクレオチドに結合する基材に固定され得る。あるいは、標的cDNAは、基材上に固定されたオリゴヌクレオチドプライマーによるなどのように、基材上に直接合成され得る。
(C.指数的核酸増幅方法を用いる遺伝子発現分析)
1つの局面では、本発明は、標的cDNAまたは標的mRNAの存在下で一本鎖核酸分子を指数的に増幅する。この指数的核酸増幅は、増幅された一本鎖核酸分子の検出の感度を増大し、そしてそれ故、標的cDNAまたは標的mRNAの存在を検出する感度を増大する。
1つの局面では、本発明は、標的cDNAまたは標的mRNAの存在下で一本鎖核酸分子を指数的に増幅する。この指数的核酸増幅は、増幅された一本鎖核酸分子の検出の感度を増大し、そしてそれ故、標的cDNAまたは標的mRNAの存在を検出する感度を増大する。
この指数的核酸増幅は、上記に記載の直線状核酸増幅反応を少なくとも別の核酸増幅反応と連結することにより実施される。第2の増幅反応の主要なステップを図13に示す。この反応では、第1の核酸増幅反応(図1)で増幅された一本鎖核酸分子(A1)は、第2のテンプレート核酸(T2)分子の存在下で初期増幅プライマーとして用いられ得る。T2は、3’〜5’に:A1に実質的に相補的である配列、ニック形成剤認識配列の1つの鎖の配列を含む。A1がT2にアニールするとき、得られる部分的に二本鎖の核酸分子は、「第2の増幅反応の初期核酸分子(N2)」と称される。DNAポリメラーゼの存在下、A1からの伸長は、二本鎖ニック形成剤認識配列を含むハイブッド(H2)を生成する(工程(a))。認識配列を認識するニック形成剤の存在下、H2はニックを形成され、ニック形成部位で3’末端および5’末端を生成する(工程(b))。ニック形成部位で5’末端を含むフラグメントが十分に短い場合(例えば、長さが18ヌクレオチドより少ない)、それは、特定の条件下(例えば、60℃で)H2のその他の部分から解離し得る。しかし、このフラグメントが、H2のその他の部分から容易に解離しない場合、それは、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損であり、かつ鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼの存在下で、ニック形成部位に3’末端を有するフラグメントの伸長により置換され得る(工程(c))。鎖置換はまた、鎖置換促進剤の存在下で生じ得る。このような伸長は、ニック形成剤により再ニック形成され得る新たなニック形成部位を再度創製する(工程(d))。新たなNSで5’末端を含むフラグメント(「A2」と称される)は、再び、H2のその他の部分から容易に解離され得るか、またはニック形成部位で3’末端からの伸長により置換され得る(工程(e))。このニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返され得(工程(f))、核酸フラグメントA2の指数的蓄積/増幅を生じる。
上記のように、T2分子は、ニック形成剤認識配列の1つの鎖の配列を含む。特定の実施形態では、T2分子は、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み得る。このような実施形態の例は、N.BstNB Iの認識配列を例示のニック形成剤認識配列として用い、図12に示される。図14では、A1の増幅は、図2中のそれと同じであり、ここで、T1は、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む。次いで、A1は、第2のテンプレート(T2)の領域X2にアニールされ、これはまた、2つのさらなる領域:領域Y2およびZ2を有し、第2の増幅反応のために初期核酸分子N2を形成する。領域Y2は、領域Y1と類似の配列(すなわち、3’−CTCAGNNNN−5’ここで領域Y2中の複数のNは、領域Y1中の同じ位置におけるそれらと同一であり得るか、または異なり得る)を有し、その一方、領域X2およびZ2は、領域Y2の3’末端および5’末端のすぐ次の領域をそれぞれいう。T2をテンプレートとして用いる伸長は、A1の5’末端配列が領域X2の3’末端配列にアニールするか否かに依存して、二本鎖核酸フラグメント(H2)または部分的に二本鎖の核酸フラグメント(H2)を生成する。得られるH2は、二本鎖N.BstNB I認識配列を含み、これは、N.BstNB Iによりニックを形成され得る。ニック形成部位の3’末端は、ニック形成部位で5’末端を含む鎖A2を置換して、DNAポリメラーゼにより再び伸長され得る。このニック形成−伸長サイクルは複数回繰り返され、置換された鎖A2の蓄積/増幅を生じる。A2の増幅は指数的である。なぜなら、それは、2つの連結された直線状増幅反応の最終増幅産物であるからである。
A2は、領域Z2をテンプレートとして増幅されるので、A2は、領域Z2がA1に少なくとも実質的に相補的である配列、またはA1に実質的に相補的でない配列を有するよう設計することによりA1と少なくとも実質的に同一である配列、またはA1とは異なる配列を有するように設計され得る。1つの実施形態では、領域Z2は、A1に少なくとも実質的に相補的であり、その結果、領域X2およびZ2の両方がA1にアニールし得る。A1のZ2へのアニーリングは、しかし、A1の3’末端またはニック形成部位でのH2のニックを形成された産物の3’末端からの伸長により置換され得、そしてそれ故、A2増幅の速度に有意に影響しない。なぜなら、この実施形態では、A2はA1に少なくとも実質的に同一であり、A2もまた、領域X2にアニールし、そしてそれ自身の増幅を開始するからである。このような増幅は、A2増幅の速度およびレベルを劇的に増加し得る。
T2がニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む別の例の実施形態を図15に示す。この実施例では、N.BstNB Iの認識配列が、ニック形成剤認識配列の例として用いられる。第1の増幅反応におけるA1の増幅は、図3におけるそれと同じであり、ここで、第1のテンプレートT1は、N.BstNB Iの認識配列のセンス鎖の配列を含む。第2の増幅反応におけるA2の増幅は、図14におけるそれと同じである。
特定の他の実施形態において、T2分子は、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み得る。このような実施形態の例が、例示的なニック形成剤認識配列としてN.BstNBIの認識配列を使用して、図16に示される。図16において、A1の増幅は、図2における増幅と同じであり、ここで、T1は、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む。次いで、A1は、第2の増幅反応のための開始プライマーとして使用される。A1は、T2のRegion X2(これはまた、2つのさらなる領域(Region Y2およびZ2)を有する)にアニーリングされて、その第2の増幅反応のための開始核酸分子N2を形成する。Region Y2は、N.BstNBIの認識配列のセンス鎖の配列、およびその配列に対して直接3’側の4つのヌクレオチド(すなわち、3’−NNNNCTGAG−5’(ここで、Nの各々は、A、T、GまたはCであり得る))からなり、一方、Region X2およびZ2は、Region Y2の、それぞれ3’末端および5’末端のすぐ次の領域をいう。テンプレートとしてT2を使用したA1の伸長は、完全にかまたは部分的に二本鎖であり得る伸長産物(H2)を提供し、これは、A1の5’末端配列がRegion X2の3’末端配列にアニーリングされるか否かに依存する。H2は、二本鎖N.BstNBI認識配列を含むので、このH2は、N.BstNBIの存在下でニック形成され得る。このニック形成部位において得られた3’末端は、DNAポリメラーゼによって再度伸長され、Region X2を置き換える。このニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返され、結果として、そのニック形成部位にて5’末端を含む置換された鎖A2の蓄積/増幅を生じる。A1の5’末端配列がRegion X2の3’末端配列にアニーリングする場合、A2は、Region X2と正確に同一である。そうでなければ、A2およびRegion X2は、それらが異なる長さを有する場合、互いに実質的に相補的である。A2の増幅は、指数関数的である。なぜなら、これは、2つの連結した線形増幅反応の最終増幅産物であるからである。
T2がニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む実施形態の別の例が、図17に示される。この例において、N.BstNBIの認識配列は、例示的なニック形成剤認識配列として使用される。第1の増幅反応におけるA1の増幅は、図3における増幅と同じであり、ここで、この第1のテンプレートであるT1は、N.BstNBIの認識配列のセンス鎖の配列を含む。第2の増幅反応におけるA2の増幅は、図16における増幅と同じである。
上記の例示的な実施形態に加えて、指数関数的な核酸増幅は、第2の線形増幅反応を用いて線形増幅を行う遺伝子発現分析に関連する節において記載される種々の線形増幅方法を連結させることによって、行われ得る。これらの節において記載される線形増幅反応によって増幅された一本鎖核酸分子は、ニック形成剤認識配列の一方の鎖の配列を含む第2のテンプレート核酸T2にアニーリングされ得る。得られる開始核酸N2は伸長され得、そして第2の一本鎖核酸分子A2を増幅するためのテンプレートとして使用され得る。
いくつかの他の実施形態において、指数関数的な核酸増幅は、1つのテンプレート核酸(すなわち、T1分子)のみの存在下で行われ得る。例えば、N.BstNBIの認識配列を例示的な認識配列として使用する、図23に示される実施形態において、T1分子のRegion X1およびRegion Z1の両方が、トリガーODNPの配列(「S1」とも呼ばれる)に実質的に相補的であるかまたは正確に相補的である、同一な配列(「S1’」とも呼ばれる)を含む。第1の増幅の間、A1は、Region Z1をテンプレートとして使用して増幅されるので、A1は、S1と同じ配列を有する。次いで、A1は、T1の別の分子をテンプレートとして使用する第2の増幅反応のためのオリゴヌクレオチドプライマーとして機能し得る。第1の増幅反応のためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびテンプレートは、それぞれ、第2の増幅反応ためのプライマーおよびテンプレートの配列と同一の配列を有するので、この第2の増幅反応から得られる増幅核酸フラグメント(A2)は、第1の増幅反応からの増幅核酸フラグメント(A1)の配列と同じ配列を有する。次いで、A2は、T1の別の分子をテンプレートとして使用して、A2に同一である核酸フラグメント(A3)を増幅させる第3の増幅反応のためのオリゴヌクレオチドプライマーとして機能し得る。上記のプロセスは、全てのT1分子がトリガーODNP分子もしくは増幅フラグメント(すなわち、A1、A2,A3など)にアニーリングされるか、またはこれらの核酸増幅反応の他の必要な成分の1つ(例えば、デオキシヌクレオシド三リン酸)が消耗されるまで、複数回繰り返され得る。
上記の核酸増幅プロセスの間、トリガーODNP(標的mRNAまたはcDNA由来)の存在は、以前の増幅反応からの増幅核酸フラグメント(これは、引き続く増幅反応のための増幅プライマーとして機能する)によって連結された、複数増幅反応を開始する。各反応は、T1分子をテンプレートとして使用し、トリガーODNPと同一の配列を有する核酸フラグメントを増幅させる。最終結果は、テンプレートT1分子の存在下における、トリガーODNPの非常に高速な増幅である。
トリガーODNPの1テンプレート増幅のいくつかの実施形態において、Region X1は、トリガーODNPの配列(S1)に少なくとも実質的に相補的である配列(S1x’)以外のさらなる配列を含み得る。このさらなる配列は、T1中のS1x’とNARSのアンチセンス鎖の配列との間にあり得、かつ5ヌクレオチド以下、10ヌクレオチド以下、15ヌクレオチド以下、20ヌクレオチド以下、25ヌクレオチド以下、50ヌクレオチド以下、または100ヌクレオチド以下を含み得る。同様に、Region Z1もまた、S1x’に少なくとも実質的に同一である配列(S1z’)以外のさらなる配列を含み得る。しかし、このようなさらなる配列がRegion Z1に存在する場合、S1z’は、この配列がRegion Y1またはその3’部分に相補的でない場合に、T1の5’末端に位置付けられる必要があり、その結果、さらなる配列は、別のT1分子をテンプレートとして使用してA1が伸長されるのを防止するように、A1の3’末端において存在しない。いくつかの実施形態において、このさらなる配列は、T1中のNARSのアンチセンス鎖の配列とS1z’との間に存在し、かつ5ヌクレオチド以下、10ヌクレオチド以下、15ヌクレオチド以下、20ヌクレオチド以下、25ヌクレオチド以下、50ヌクレオチド以下、または100ヌクレオチド以下を含む。
トリガーODNPの上記の指数関数的な増幅の特定の実施形態において、T1は、多くとも、50ヌクレオチド長、75ヌクレオチド長、100ヌクレオチド長、150ヌクレオチド長、または200ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、S1x’および/またはS1z’は、少なくとも6ヌクレオチド長、8ヌクレオチド長、10ヌクレオチド長、12ヌクレオチド長、14ヌクレオチド長、16ヌクレオチド長、18ヌクレオチド長、または20ヌクレオチド長である。いくつかの好ましい実施形態において、S1x’および/またはS1z’は、8〜24ヌクレオチド長であり、より好ましくは、12〜17ヌクレオチド長である。
上記のように、本発明の指数関数的な核酸増幅方法は、2以上の核酸増幅反応を一緒に連結させ、各増幅反応は、ニック形成剤の存在下で行われる。一方の増幅反応のためのニック形成剤は、他方の増幅反応のためのニック形成剤と異なっていてもよい。あるいは、異なる増幅反応のためのニック形成剤は、互いに同一であってもよく、その結果、一方のニック形成剤のみが、核酸分子の指数関数的な増幅のために必要とされる。
同様に、一方の増幅反応のDNAポリメラーゼは、他方の増幅反応のDNAポリメラーゼと異なっていてもよい。あるいは、異なる増幅反応のためのニック形成剤は、互いに同一であってもよく、その結果、一方のDNAポリメラーゼのみが、核酸分子の指数関数的な増幅のために必要とされる。
特定の実施形態において、第2の増幅反応は、等温条件下で行われる。いくつかの実施形態において、第1の増幅反応と第2の増幅反応の両方が、等温条件下で行われる。
いくつかの実施形態において、第1の増幅反応と第2の増幅反応の両方が、1個の容器内で行われ、従って、同一条件下で行われる。このような実施形態において、増幅反応混合物中のT2分子の数は、好ましくは、T1分子の数よりも多いが、必ずしもT1分子の数より多い必要があるわけではない。T1分子の数よりもT2分子の数が多いほうが好ましいことは、T2分子が、T1分子をテンプレートとして使用して増幅される一本鎖核酸分子A1のためのアニーリングパートナーとして使用されるという事実に起因する。言い換えると、第1の増幅反応の間、各T1分子はテンプレートとして使用され、複数コピーのA1を作製する。従って、T1分子の各々について、複数のT2分子は、好ましくは、単一のT1分子をテンプレートとして使用して増幅される複数のA1分子のためのアニーリングパートナーを提供するために存在する。
本発明のT2分子は、固体支持体に固定されていても固定されていなくてもよい。固定されている場合、その固体支持体の別個の領域上の複数のT2分子は、アレイを形成し得、その結果、二回目の核酸増幅は、このアレイ上で行われる。このようなアレイは、上記のような本発明の他の核酸分子のアレイ(例えば、T1アレイ)の1つと類似の型のアレイであり得る。
特定の実施形態において、第2の増幅反応の増幅産物は、相対的に短くあり得、かつ多くとも、25ヌクレオチド、20ヌクレオチド、17ヌクレオチド、15ヌクレオチド、10ヌクレオチド、または8ヌクレオチドを有する。このような短い長さのものは、適切に設計したT2分子によって達成され得る。短い長さのA2分子が、有利であり得る。なぜなら、この短い長さのA2分子が、増幅効率および増幅速度を増加させるからである。さらに、これにより、鎖置換活性を有さないDNAポリメラーゼの使用が可能になる。これはまた、質量分光測定分析のような特定の技術によるA2分子の検出を容易にする。
本発明の核酸増幅方法は、2つの核酸増幅反応を一緒に連結させることに限定されない。特定の実施形態において、第2の増幅反応は、第3の増幅反応にさらに連結され得る。言い換えると、第2の増幅反応の間に増幅された核酸分子A2は、別の核酸分子「T3」の一部にアニーリングされ得、この核酸分子T3は、第3の増幅反応において核酸分子「A3」の増幅を誘発するために、NARSの一方の鎖の配列を含む。さらなる増幅反応が、その鎖に加えられ得る。例えば、A3は、順に、NARSの一方の鎖もまた含んでいる別の核酸分子「T4」の一部にアニーリングし得、そして第4の増幅反応において核酸分子「A4」の増幅を誘発し得る。引き続く各増幅反応は、その以前の増幅反応からの増幅フラグメントの線形増幅を生じるので、増幅系において増幅反応の数が多くなれば、増幅レベルはより高くなる(但し、この系の他の成分(例えば、テンプレート核酸分子、NA、およびDNAポリメラーゼ)は、その増幅速度も増幅レベルも限定しない)。
(D.遺伝子発現分析用の組成物およびキット)
1つの局面において、本発明は、核酸分子を提供し、この核酸分子は、二本鎖ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を有する、天然に存在するゲノムDNAまたは天然に存在するmRNAのcDNAの一部に少なくとも実質的に同一である配列を含む。この核酸配列は、多くとも、200ヌクレオチド長、150ヌクレオチド長、120ヌクレオチド長、100ヌクレオチド長、75ヌクレオチド長、50ヌクレオチド長、40ヌクレオチド長、30ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長、または20ヌクレオチド長である。この核酸配列は、3’側から5’側へと、3つの領域(Region A、BおよびC)を含む。Region Aは、多くとも、100ヌクレオチド長、75ヌクレオチド長、50ヌクレオチド長、40ヌクレオチド長、30ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、10ヌクレオチド長、8ヌクレオチド長、7ヌクレオチド長、6ヌクレオチド長、5ヌクレオチド長、4ヌクレオチド長、または3ヌクレオチド長のヌクレオチド配列である。Region Bは、天然に存在するゲノムDNAまたは天然に存在するmRNAのcDNAの一部に存在するニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列である。Region Cは、多くとも、100ヌクレオチド長、75ヌクレオチド長、50ヌクレオチド長、40ヌクレオチド長、30ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、10ヌクレオチド長、8ヌクレオチド長、7ヌクレオチド長、6ヌクレオチド長、5ヌクレオチド長、4ヌクレオチド長、または3ヌクレオチド長のヌクレオチド配列である。この核酸は、上記のような(例えば、図5)二本鎖ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含むmRNA分子またはcDNA分子を検出するための、テンプレートとして機能し得る。
1つの局面において、本発明は、核酸分子を提供し、この核酸分子は、二本鎖ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を有する、天然に存在するゲノムDNAまたは天然に存在するmRNAのcDNAの一部に少なくとも実質的に同一である配列を含む。この核酸配列は、多くとも、200ヌクレオチド長、150ヌクレオチド長、120ヌクレオチド長、100ヌクレオチド長、75ヌクレオチド長、50ヌクレオチド長、40ヌクレオチド長、30ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長、または20ヌクレオチド長である。この核酸配列は、3’側から5’側へと、3つの領域(Region A、BおよびC)を含む。Region Aは、多くとも、100ヌクレオチド長、75ヌクレオチド長、50ヌクレオチド長、40ヌクレオチド長、30ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、10ヌクレオチド長、8ヌクレオチド長、7ヌクレオチド長、6ヌクレオチド長、5ヌクレオチド長、4ヌクレオチド長、または3ヌクレオチド長のヌクレオチド配列である。Region Bは、天然に存在するゲノムDNAまたは天然に存在するmRNAのcDNAの一部に存在するニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列である。Region Cは、多くとも、100ヌクレオチド長、75ヌクレオチド長、50ヌクレオチド長、40ヌクレオチド長、30ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、10ヌクレオチド長、8ヌクレオチド長、7ヌクレオチド長、6ヌクレオチド長、5ヌクレオチド長、4ヌクレオチド長、または3ヌクレオチド長のヌクレオチド配列である。この核酸は、上記のような(例えば、図5)二本鎖ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含むmRNA分子またはcDNA分子を検出するための、テンプレートとして機能し得る。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を有する、天然に存在するゲノムDNAまたは天然に存在するmRNAのcDNAの一部に正確に同一である配列を含む。他の実施形態において、この核酸分子は、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を有する、天然に存在するゲノムDNAまたは天然に存在するmRNAのcDNAの一部に実質的に同一である配列を含む。天然に存在するゲノムDNAまたは天然に存在するmRNAのcDNAの一部に実質的に同一である核酸分子の配列は、この天然に存在するゲノムDNAまたは天然に存在するmRNAのcDNAの一部に、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であり得る。この文脈において、2つの核酸のパーセント配列同一性は、Altschulら(J.Mol.Biol.215:403−10,1990)のBLASTプログラムを、それらのデフォルトパラメータとともに使用して決定される。これらのプログラムは、KarlinおよびAltschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−7,1993)におけるように改変された、KarlinおよびAltschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264−8,1990)のアルゴリズムを実行する。BLASTプログラムは、例えば、ウェブサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)にて利用可能である。
本発明はまた、標的cDNAまたは標的mRNAおよびニック形成剤の存在下において、一本鎖核酸フラグメントを増幅する際にテンプレートとして機能し得る一本鎖核酸分子を提供する。この一本鎖核酸分子は、多くとも、200ヌクレオチド長、150ヌクレオチド長、120ヌクレオチド長、100ヌクレオチド長、75ヌクレオチド長、50ヌクレオチド長、40ヌクレオチド長、30ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長、または20ヌクレオチド長であり、ニック形成剤によって認識可能な二本鎖ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み、かつ標的cDNA分子または標的mRNA分子に実質的に相補的である。
関連した局面において、本発明は、標的cDNAまたは標的mRNAにアニーリングした際に、ニック形成剤の存在下でこの標的cDNAまたは標的mRNAの一部の増幅を可能にする一本鎖核酸分子をさらに提供する。この一本鎖核酸分子は、多くとも、200ヌクレオチド長、150ヌクレオチド長、120ヌクレオチド長、100ヌクレオチド長、75ヌクレオチド長、50ヌクレオチド長、40ヌクレオチド長、30ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長、または20ヌクレオチド長であり、ニック形成剤によって認識可能な二本鎖ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、かつ標的cDNA分子または標的mRNA分子に実質的に相補的である。
本発明はまた、遺伝子発現分析用のキットを提供する。このようなキットは、以下の構成要素の、1種、2種、数種、または全てを備え得る:(1)二本鎖ニック形成剤認識配列の1つの鎖を含むテンプレートT1分子;(2)ニック形成剤(例えば、NEまたはRE);(3)ニック形成剤(2)のために適切な緩衝液;(4)DNAポリメラーゼ;(5)DNAポリメラーゼ(4)のために適切な緩衝液;(6)dNTP;(7)改変dNTP;(8)コントロールテンプレートおよび/またはテンプレート核酸を増幅するためのコントロールオリゴヌクレオチドプライマー;(9)クロマトグラフィーカラム;(10)クロマトグラフィーによる核酸の特徴付けまたは分離を行うための緩衝液;(11)鎖置換促進剤(facilitator)(例えば、1Mのトレハロース);(12)マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルプレート;(13)液体クロマトグラフィーおよび/または質量分析法のためのオリゴヌクレオチド標準(例えば、6マー、7マー、8マー、12マーおよび16マー);ならびに(14)このキットを使用するための指示書冊子。上記の多数の構成要素の詳細な説明は、上記に与えられている。
特定の実施形態において、本発明の組成物は、NAに特異的な緩衝液もDNAポリメラーゼに特異的な緩衝液も含有しない。代わりに、この組成物は、ニック形成剤とDNAポリメラーゼとの両方に適切な緩衝液を含有する。例えば、N.BstNBIがニック形成剤であり、そしてexo−VentがDNAポリメラーゼである場合、このニック形成−伸長緩衝液は、0.5×N.BstNBI緩衝液および1×exo−Vent緩衝液であり得る。
指数関数的な核酸増幅を行う遺伝子発現分析のために、このキットは、第2の増幅反応において使用される1種以上のさらなる構成要素をさらに備え得る。これらの構成要素としては、以下が挙げられる:(1)第2のニック形成剤;(2)第2のDNAポリメラーゼ;および(3)第2のテンプレート核酸分子T2。
関連した局面において、本発明は、指数関数的な核酸増幅を行う遺伝子発現分析用の組成物を提供する。このような組成物は、一般に、上記のような(図14〜17)第1の核酸増幅反応および第2の核酸増幅反応においてそれぞれ機能するように設計された、少なくとも部分的に二本鎖の第1の核酸分子(N1またはH1)および少なくとも部分的に二本鎖の第2の核酸分子(N2またはH2)の組み合わせを含有する。
本発明の組成物は、単純にその成分を混合することによってか、または組成物の形成を生じる反応を実施することによって、作製され得る。本発明のキットは、その成分のいくつかを混合することによって調製され得るか、または個々の容器中にその成分の各々を維持する。
(E.発明の適用)
本明細書中の上記に詳細に考察されるように、本発明は、ニック形成剤(nicking agent)を使用する、遺伝子発現分析のための方法および組成物を提供する。本発明は、広範な種々の適用において有用性を見出し、ここで、生物学的サンプル中の目的の遺伝子が発現される場所を決定することが必要であり、そしてここで、2つの核酸集団を比較することが所望され得る。このような適用としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:植物もしくは動物において感染性疾患を引き起こすかまたは食物安全性に関与する、感染性生物の同定および/または特徴付け、ならびに植物、動物もしくはヒトにおける疾患関連遺伝子、または植物もしくは動物における所望の形質(例えば、高収穫量、増加した疾患耐性および高栄養価)に関連する遺伝子の同定および/または特徴付け。
本明細書中の上記に詳細に考察されるように、本発明は、ニック形成剤(nicking agent)を使用する、遺伝子発現分析のための方法および組成物を提供する。本発明は、広範な種々の適用において有用性を見出し、ここで、生物学的サンプル中の目的の遺伝子が発現される場所を決定することが必要であり、そしてここで、2つの核酸集団を比較することが所望され得る。このような適用としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:植物もしくは動物において感染性疾患を引き起こすかまたは食物安全性に関与する、感染性生物の同定および/または特徴付け、ならびに植物、動物もしくはヒトにおける疾患関連遺伝子、または植物もしくは動物における所望の形質(例えば、高収穫量、増加した疾患耐性および高栄養価)に関連する遺伝子の同定および/または特徴付け。
例えば、本発明は、病原体特異的遺伝子発現を検出することによって、目的の生物学的サンプル中の病原体を検出するために有用である。あるいは、特定の形質(例えば、疾患耐性または疾患感受性)に関連することが既知の遺伝子の発現を検出するために使用され得、従って、サンプルが得られた特定の被験体が特定の形質を有する可能性を予測するために有用である。
さらに、本発明はまた、cDNA集団をプロファイリングするための方法を提供する。2つのcDNA集団間のプロファイルの比較は、両方のcDNA集団に共通するcDNA分子および一方の集団には存在するがもう片方には存在しないcDNA分子を同定し得る。このような同定は、一方のcDNA集団が単離された一方の生物のみによって保有され、そして他方のcDNA集団が調製された他方の生物には保有されない表現型に関連する核酸分子の同定および/または特徴付けを助ける。
以下の実施例は、例示として提供されるのであって、限定としてではない。
(実施例1)
(核酸配列の指数関数的増幅)
この実施例は、ニック形成制限エンドヌクレアーゼおよびDNAポリメラーゼを使用する、特定の核酸配列の指数関数的増幅を記載する。
(核酸配列の指数関数的増幅)
この実施例は、ニック形成制限エンドヌクレアーゼおよびDNAポリメラーゼを使用する、特定の核酸配列の指数関数的増幅を記載する。
この実施例において使用したオリゴヌクレオチドは、MWG Biotech(North Carolina)から獲得し、そしてその配列を、N.BstNB I認識配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖の配列に下線を付して、以下に示す:
75μl 水
10μl 10×Thermopol緩衝液(NEB(Beverly、MA)より)
5μl 10×N.BstNBI(NEBより)
5μl T1(0.2ナノモル/μl)
5μl TOP1(0.2ナノモル/μl)。
この混合物を、95℃に加熱し、次いで50℃に冷却し、そして50℃で10分間維持した。50℃でのインキュベーション後、以下の二重鎖(N1)を形成した:
25μl 10×Thermopol緩衝液(NEBより)
12.5μl 10×N.BstNBI(NEBより)
0.5μl 上記の二重鎖混合物
10μl 25mM dNTP(NEBより)
100μl 1M トレハロース(Sigma(St.Louis、MO)より)
25単位 N.BstNBIニック形成酵素(NEBより)
5単位 exo−Vent DNAポリメラーゼ(NEBより)
5μl T2
102μl 水。
この反応物を、60℃で15分間インキュベートした。15分後、10μlの反応物をサンプリングし、そして質量分析に供した。
60℃でのインキュベーション後、以下の二重鎖(H1)を、DNAポリメラーゼの作用によってフィルイン(fill in)した。「黒逆三角形」は、N.BstNBIのニック形成部位を示す:
増幅されたフラグメントA2は、以下のような、予測された質量/電荷プロフィールを有する:
コントロール実験における質量分析を、図19に示す。上のパネルは、質量分析器からの総イオン電流を示す。中央のパネルは、1448.6の質量/電荷比を有するフラグメントについての、イオン電流を示す。総イオン電流は、43単位であり、これは、バックグラウンドのみを示す。下のパネルは、ダイオードアレイからのトレースを示す。
上記の結果は、フラグメントA2の指数関数的な増幅(109倍の増幅が観察された)が存在したこと、そしてTOP1が省かれたコントロール実験においては産物が生成されなかったことを示す。
(実施例2)
(1つのテンプレートを使用する、オリゴヌクレオチドの指数関数的増幅)
この実施例は、1つだけのテンプレート核酸を使用する、オリゴヌクレオチドの指数関数的増幅を記載する。
(1つのテンプレートを使用する、オリゴヌクレオチドの指数関数的増幅)
この実施例は、1つだけのテンプレート核酸を使用する、オリゴヌクレオチドの指数関数的増幅を記載する。
この実施例において使用するオリゴヌクレオチド配列は以下の通りであり、N.BstNB Iの認識配列のアンチセンス鎖の配列には、下線を付している:
以下の反応混合物を、4℃でアセンブルした:
100μl 10×Thermopol緩衝液
50μl 10×N.BstNBI緩衝液
16μl 25mM dNTP
0.5μl T1(100pmol/μl)
80μl 2000単位/ml N.BstNBI(NEB)
24μl 9°NmTM DNAポリメラーゼ(NEB)
10μl 400×SYBR(Molecular Probes、Eugene WA)
740μl 水。
100μl 10×Thermopol緩衝液
50μl 10×N.BstNBI緩衝液
16μl 25mM dNTP
0.5μl T1(100pmol/μl)
80μl 2000単位/ml N.BstNBI(NEB)
24μl 9°NmTM DNAポリメラーゼ(NEB)
10μl 400×SYBR(Molecular Probes、Eugene WA)
740μl 水。
この反応混合物を、4℃で完全に混合した。150μlの反応混合物を第一のチューブに配置し、そして100μlを9つのさらなるチューブに配置した。トリガーを、水で100倍に希釈し、次いで1μlを第一のチューブに配置した。次いで、93倍希釈物を作製した。
30μlの各反応物を、光サイクラーキャピラリーに添加した。このキャピラリーを、示された時間にわたって、60℃でインキュベートした。それぞれの結果を、図20に示す。この図は、時間の関数として、光サイクラーキャピラリーの1つにおける蛍光の蓄積を示す。これらのデータを、以下の表に要約する:
(実施例3)
(オリゴヌクレオチドの線形増幅)
この実施例は、テンプレート二重鎖からのオリゴヌクレオチドの線形増幅を記載する。このテンプレート二重鎖を、2つのオリゴヌクレオチドを以下に示すように互いにアニールすることによって形成する。N.BstNBIの認識配列を、以下に示す:
(オリゴヌクレオチドの線形増幅)
この実施例は、テンプレート二重鎖からのオリゴヌクレオチドの線形増幅を記載する。このテンプレート二重鎖を、2つのオリゴヌクレオチドを以下に示すように互いにアニールすることによって形成する。N.BstNBIの認識配列を、以下に示す:
以下の反応物を、4℃にてアセンブルした。
740μl ヌクレアーゼを含まない脱イオン水
110μl 10×N.BstNBI緩衝液(NEB)
55μl 10×N.BstNBI緩衝液(NEB)
1μl 1ピコモル/μlのNBbt16オリゴヌクレオチド
1μl 1ピコモル/μlのITATOPオリゴヌクレオチド
80μl 2000単位/mlのN.BstNBI(NEB)
24μl 5000単位/mlの9°NmTM DNAポリメラーゼ(NEB)
16μl 25mM dNTP(NEB)。
110μl 10×N.BstNBI緩衝液(NEB)
55μl 10×N.BstNBI緩衝液(NEB)
1μl 1ピコモル/μlのNBbt16オリゴヌクレオチド
1μl 1ピコモル/μlのITATOPオリゴヌクレオチド
80μl 2000単位/mlのN.BstNBI(NEB)
24μl 5000単位/mlの9°NmTM DNAポリメラーゼ(NEB)
16μl 25mM dNTP(NEB)。
この反応混合物を、PCRチューブ中で、20個の50μlアリコートに分割した。これらのチューブを、MJ サーモサイクラー上に60℃で配置し、そして示された時間にわたってインキュベートした。次いで、これらのサンプルを、以下の液体クロマトグラフィー質量分析に供した。
カラム緩衝液は、以下の通りである:緩衝液Aは、0.05Mのジメチルブチルアミンアセテート(pH7.6)を含むが、一方で緩衝液Bは、0.05Mのジメチルブチルアミンアセテート(pH7.6)、50%アセトニトリルを含む。
アセトニトリルの浅い勾配を使用して、オリゴヌクレオチドを溶出し、そしてサンプルを清浄化する。この勾配の分析部分は、5%アセトニトリルで開始し、そして約90秒にわたって15%まで増大し、次いで、たった数秒にわたってカラムへと45%アセトニトリルの「プラグ」を迅速に押す洗浄を行い、その後、5%アセトニトリルの出発条件に戻る。
使用するカラムは、GuardカラムXterra2.×20mm、3.5ミクロン、MSC18である。このカラムの前方は、フリットホルダ(Upchurch A356フリットホルダ、Upchurch A701 Peek Prefilter Frit 0.5ミクロンを有する)中のフリットである。
液体クロマトグラフィーからの画分を、質量分析器(エレクトロスプレー入り口を有するMicromass LCT Time−of−Flight、Micromass Inc.、Manchester UK)に注入した。注入容量は、10マイクロリットルであった。これらのサンプルを、走査範囲800〜2000amuで、エレクトロスプレーネガティブモードで流した。1247.1ダルトンでの相対的質量単位のタイムコース結果を、以下の表中に示す:
(検出のために蛍光インターカレーティング剤を使用する、遺伝子発現分析)
以下のシステムは、任意の型の生物学的サンプル中のIL−1 mRNAまたはcDNAの測定を可能にする。標的cDNAを、最初に、生物学的サンプルから作製し、そして引き続いて、一本鎖オリゴヌクレオチドの指数関数的増幅を誘発する。
(IL−1 771システム)
N.BstNB I認識配列のセンス鎖の配列を含むcDNAフラグメントおよびこのcDNAフラグメントに実質的に相補的な第一のテンプレートを、以下に示す。N.BstNB Iの認識配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列に、下線を付す。751は、IL−1 cDNAの、最初に示されたヌクレオチドの数である。
N.BstNB I認識配列のセンス鎖の配列を含むcDNAフラグメントおよびこのcDNAフラグメントに実質的に相補的な第一のテンプレートを、以下に示す。N.BstNB Iの認識配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列に、下線を付す。751は、IL−1 cDNAの、最初に示されたヌクレオチドの数である。
cDNAフラグメント(部分的な配列のみを示す):
(IL−1L914系)
認識配列N.BstNB Iのセンス鎖の配列を含むcDNAフラグメントと、そのcDNAフラグメントと実質的に相補的な第1テンプレートとが、以下に示される。そのN.BstNB Iの認識配列のセンス鎖の配列およびアンチセンス鎖の配列に、下線を付してある。901は、IL−1 cDNAの最初に示されたヌクレオチドの数である。
認識配列N.BstNB Iのセンス鎖の配列を含むcDNAフラグメントと、そのcDNAフラグメントと実質的に相補的な第1テンプレートとが、以下に示される。そのN.BstNB Iの認識配列のセンス鎖の配列およびアンチセンス鎖の配列に、下線を付してある。901は、IL−1 cDNAの最初に示されたヌクレオチドの数である。
cDNAフラグメント(部分配列のみ示される):
(RNA調製およびcDNA合成)
総RNAを、フェノール−クロロホルム法により抽出した。そしてその総RNAを、MessageCleanキット(Gene Hunter,Nashville,TN)を使用して、DNアーゼIを用いて37℃にて1時間消化した。QIAGEN(Valencia,CA)Oligotex mRNA Mini Kitを使用して、オリゴ(dT)−セルロースクロマトグラフィーによりポリ(A)+RNAを抽出した。ポリ(A)+RNAからcDNAを合成するために、1μgのポリ(A)+RNAを、1μlの10×CDSプライマー混合物と混合し、5×反応緩衝液と、10×dNTPと、0.5μlの100mMジチオスレイトールと、50単位のモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素(CLONTECH,Palo Alto,CA)との混合物とともに、総体積10μlにおいて、予熱したサーマルサイクラーにおいて70℃にて2分間インキュベートし、50℃にて2分間インキュベートし、その後、50℃にて25分間インキュベートした。1μlの10×終結混合物を添加することによりその反応を停止させ、cDNAを、Chroma Spin−200カラム(CLONTECH)にて精製した。
総RNAを、フェノール−クロロホルム法により抽出した。そしてその総RNAを、MessageCleanキット(Gene Hunter,Nashville,TN)を使用して、DNアーゼIを用いて37℃にて1時間消化した。QIAGEN(Valencia,CA)Oligotex mRNA Mini Kitを使用して、オリゴ(dT)−セルロースクロマトグラフィーによりポリ(A)+RNAを抽出した。ポリ(A)+RNAからcDNAを合成するために、1μgのポリ(A)+RNAを、1μlの10×CDSプライマー混合物と混合し、5×反応緩衝液と、10×dNTPと、0.5μlの100mMジチオスレイトールと、50単位のモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素(CLONTECH,Palo Alto,CA)との混合物とともに、総体積10μlにおいて、予熱したサーマルサイクラーにおいて70℃にて2分間インキュベートし、50℃にて2分間インキュベートし、その後、50℃にて25分間インキュベートした。1μlの10×終結混合物を添加することによりその反応を停止させ、cDNAを、Chroma Spin−200カラム(CLONTECH)にて精製した。
以下の反応物を、4℃にてアセンブルした。
100μlの10×Thermopol緩衝液
50μlの10×N.BstNBI緩衝液
16μlの25mM dNTP
0.5μlのT1オリゴヌクレオチド(100pmol/μl)
1.0μlのT2オリゴヌクレオチド(100pmol/μl)
80μlの2000単位/mlのN.BstNBIニック形成酵素(NEB)
24μlの9°NmTMDNAポリメラーゼ(NEB)
10μlの400×SYBR(Molecular Probes,Eugene WA)
740μlの水。
50μlの10×N.BstNBI緩衝液
16μlの25mM dNTP
0.5μlのT1オリゴヌクレオチド(100pmol/μl)
1.0μlのT2オリゴヌクレオチド(100pmol/μl)
80μlの2000単位/mlのN.BstNBIニック形成酵素(NEB)
24μlの9°NmTMDNAポリメラーゼ(NEB)
10μlの400×SYBR(Molecular Probes,Eugene WA)
740μlの水。
この反応物を、4℃にて徹底的に混合し、その後、150μlを第1チューブ中に配置し、100μlをさらなる9個のチューブ中に配置した。そのRNAを、0.01m Tris−HCl、5mM EDTA中で1〜100倍希釈し、その後、1μlを第1チューブ中に配置した。その後、5個の10倍希釈物を作製した。
25μlの各反応物を、光サイクラーキャピラリーに添加した。このキャピラリーを、60℃にて20分間インキュベートした。そのデータを、以下の表にまとめる:
(検出のために液体クロマトグラフィーおよび質量分光計を使用する、遺伝子発現分析)
IL−1 771系およびIL−1 914系のためのテンプレートは、実施例4と同じである。以下の反応物を氷上でアセンブルし、予熱したサーマルサイクラーに60℃にて10分間配置した:
1×Thermopol緩衝液
0.5×N.BstNBI緩衝液
400μM dNTP
0.1μMのT2オリゴヌクレオチド
0.2μlのT1オリゴヌクレオチド
150単位/mlのN.BstNBI
50単位の9°NmTMポリメラーゼ(NEB)
1×10−6ピコモル〜1×10−1ピコモルのcDNA(IL−1 mRNAから変換した)。
その後、そのサンプルを、実施例3に記載されるような液体クロマトグラフィー/質量分光分析に供した。IL−1 771系およびIL−1 914系における増幅されるフラグメントの推定質量を、以下の表に示す:
(ニック形成剤認識配列中にミスマッチを含むテンプレート核酸を使用する、核酸増幅)
以下のオリゴヌクレオチドが合成された。そのオリゴヌクレオチドをMWG(MWG Biotech Inc.,High Point,NC)から得た。このオリゴヌクレオチドを、100ピコモル/μlにて、0.01M Tris−HClおよび0.001M EDTA中に配置した。N.BstNBIの二本鎖認識配列のセンス鎖の配列に下線を付しており、一方、N.BstNBIの二本鎖認識配列のアンチセンス鎖の対応位置のヌクレオチドとは異なるヌクレオチドを、イタリック体にしている:
250μlの10×Thermopol緩衝液(NEB Biolabs,Beverly,MA)
125μlの10×N.BstNBI(NEB Biolabs,Beverly,MA)
100μlの25mM dNTP(NEB Biolabs,Beverly,MA)
1000μlの1Mトレハロース(Sigma,St.Louis,MO)
250単位のN.BstNBIニック形成酵素(NEB Biolabs,Beverly,MA)
50単位のVentエキソDNAポリメラーゼ(NEB Biolabs,Beverly,MA)
1020μlの超純水。
その後、個々の二重鎖各々25μlを、マイクロタイタープレートに添加した。2つのオリゴヌクレオチドプライマーをまず希釈し、それらを最終濃度1ピコモル/μlにて溶液(1×Thermopol緩衝液(New England Biolabs,Beverly,MA)および0.5×N.BstNBI緩衝液)中に配置することによって、この二重鎖を形成させた。この1×Thermopol緩衝液は、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris−HCl(pH8.8)、0.1% Triton X−100、2mM MgSO4からなり、一方、1×N.BstNBI緩衝液は、150mM KCl、10mM Tris−HCl、10mM MgCl2、1mM DTTからなる。その後、この混合物を100℃まで1分間加熱し、その後、50℃にて10分間保持して、二重鎖を形成させた。そのプレートを4℃にて再密封し、その後、60℃まで1時間加熱した。
125μlの10×N.BstNBI(NEB Biolabs,Beverly,MA)
100μlの25mM dNTP(NEB Biolabs,Beverly,MA)
1000μlの1Mトレハロース(Sigma,St.Louis,MO)
250単位のN.BstNBIニック形成酵素(NEB Biolabs,Beverly,MA)
50単位のVentエキソDNAポリメラーゼ(NEB Biolabs,Beverly,MA)
1020μlの超純水。
その後、個々の二重鎖各々25μlを、マイクロタイタープレートに添加した。2つのオリゴヌクレオチドプライマーをまず希釈し、それらを最終濃度1ピコモル/μlにて溶液(1×Thermopol緩衝液(New England Biolabs,Beverly,MA)および0.5×N.BstNBI緩衝液)中に配置することによって、この二重鎖を形成させた。この1×Thermopol緩衝液は、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris−HCl(pH8.8)、0.1% Triton X−100、2mM MgSO4からなり、一方、1×N.BstNBI緩衝液は、150mM KCl、10mM Tris−HCl、10mM MgCl2、1mM DTTからなる。その後、この混合物を100℃まで1分間加熱し、その後、50℃にて10分間保持して、二重鎖を形成させた。そのプレートを4℃にて再密封し、その後、60℃まで1時間加熱した。
以下の二重鎖を試験した:
このクロマトグラフィーシステムは、Agilent HPLC−1100であった。このAgilent HPLC−1100は、バイナリーポンプ、脱気器、カラムオーブン、ダイオードアレイ検出器、およびサーモスタット付きマイクロウェルプレートオートインジェクター(Palo Alto,CA)から構成された。このカラムは、Waters Xterraであり、3μM粒径を有するC18パッキングを組込んでおり、300オングストロームの孔径、2.1mm×50mmを有した(Waters inc.,Milford,MA)。このカラムに、5mMトリエチルアミン酢酸(TEAA)中のアセトニトリル勾配を用いて30℃にて通した。緩衝液は5mM TEAAであり、緩衝液Bは5mM TEAAおよび25%(V/V)アセトニトリルであった。この勾配は、10%Bでの1分間保持にて始まり、その後、4分間かけて50%Bまで上昇し、その後、30秒間で95%Bまで上昇し、最終的に、合計通過時間6分間で10%Bまで戻った。そのカラム温度は、30℃にて一定に保持した。流速は、0.416ml/分であった。注入体積は、10μlであった。質量分光計へのフローは、200μl/分であった。LCフローの半分を、T字管を使用して廃液へと転送した。その質量分光計は、電子スプレー入口を備えたMicromass LCT飛行時間型質量分光計(Micromass Inc.,Manchester,UK)であった。サンプルを、電子スプレーネガティブモードにて通した。スキャン範囲は、700amu〜2300amuであり、1秒スキャン時間を使用した。機器パラメーターは、以下であった:TDC開始電圧700、TDC停止電圧50、TDC閾値0、TDC利得制御0、TDCエッジ制御0、Lteff 1117.5、Veff 4600。供給源パラメーターは、以下であった:脱溶媒和気体862L/時間、キャピラリー3000V、サンプルコーン25V、RFレンズ200V、抽出コーン2V、脱溶媒和温度250℃、供給源温度150℃、RF DCオフセット1.4V、FR DCオフセット2.1V、開口部6V、加速200V、焦点10V、ステアリング0V、MCP検出器2700V、プッシャーサイクル時間(手動)60、イオンエネルギー40V、チューブレンズ0V、グリッド2.74V、TOF飛行管4620V、反射1790V。
抽出した以下のイオン流をモニターした:以下のフラグメント
その結果を以下の表に示す:
上記から、本発明の特定の実施形態が例示のために本明細書中に記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく種々の改変がなされ得ることが、認識される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲によって以外は、限定されない。
Claims (181)
- cDNA集団中の標的cDNA分子の存在もしくは非存在を決定するため、または生物学的サンプル中の標的mRNA分子の存在もしくは非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下:
(A) 以下:
(i) 該cDNA集団の該cDNA分子または該生物学的サンプルの該RNA分子、
(ii) 以下:
(a) ニック形成剤認識配列の一方の鎖を含み、そして
(b) 該標的cDNAが一本鎖である場合、該標的cDNAに少なくとも実質的に相補的であるか、
該標的cDNAが二本鎖である場合、該標的cDNAの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的であるか、または
該標的mRNAに少なくとも実質的に相補的である、テンプレート核酸分子、
(iii) 該認識配列を認識するニック形成剤、
(iv) DNAポリメラーゼ、および
(v) 1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸、
を含む、混合物を形成する工程;
(B) 該標的cDNAが該cDNA集団中に存在するならば、または該標的mRNAが該生物学的サンプル中に存在するならば、該標的cDNAの一部、該標的mRNAの一部、または該テンプレート核酸分子の一部をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子が増幅される条件に、該混合物を維持する工程;ならびに
(C) 該一本鎖核酸分子の存在もしくは非存在を検出して、該cDNA集団中の該標的cDNA分子の存在もしくは非存在を決定するか、または該生物学的サンプル中の該標的mRNAの存在もしくは非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、ここで、前記テンプレート核酸は、前記ニック形成剤認識配列の一方の鎖の配列に対して3’側に配置される配列を含み、該配列は、前記標的cDNAが一本鎖である場合、該標的cDNAの3’部分に少なくとも実質的に相補的であるか、該標的cDNAが二本鎖である場合、該標的cDNAの一方の鎖の3’部分に少なくとも実質的に相補的であるか、または前記標的mRNAに少なくとも実質的に相補的である、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記標的cDNAは、二本鎖であり、そして前記ニック形成剤認識配列を含み、そしてここで、前記テンプレート核酸は、該標的cDNAの部分を含み、該標的cDNAは、該ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記標的cDNAは、一本鎖であり、そして前記ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そしてここで、前記テンプレート核酸は、該ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記標的cDNAが二本鎖であり、そして前記ニック形成剤認識配列を含み、そしてここで、前記テンプレート核酸は、3’から5’へと、以下:
(i) 該ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む該標的cDNAの鎖に対して、少なくとも実質的に相補的である配列、
(ii) ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(iii) 該ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む該標的cDNAの鎖に実質的に相補的ではない配列、
を含む、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記標的cDNAが一本鎖であり、そして前記ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そしてここで、前記テンプレート核酸は、3’から5’へと、以下:
(i) 該標的cDNAに少なくとも実質的に相補的である配列、
(ii) 該ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(iii) 該標的cDNAに実質的に相補的ではない配列、
を含む、方法。 - 前記標的cDNAが固定される、請求項1に記載の方法。
- 前記テンプレート核酸分子が、前記ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記テンプレート核酸分子が、前記ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列中の1つ以上のヌクレオチドが、前記標的cDNAまたは前記標的mRNAのヌクレオチドと従来の塩基対を形成しない、請求項8に記載の方法。
- 前記cDNA分子もしくは前記cDNA集団または前記生物学的サンプルの前記RNA分子が、固体支持体に固定される、請求項1に記載の方法。
- 前記テンプレート核酸分子が、固体支持体に固定される、請求項1に記載の方法。
- 請求項9に記載の方法であって、ここで、前記ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して5’側に配置される配列は、該ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して5’側に配置される配列と少なくとも実質的に同一である、方法。
- 請求項13に記載の方法であって、ここで、前記ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して5’側に配置される配列は、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して5’側に配置される配列と厳密に同一である、方法。
- 前記ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して5’側に配置される配列は、少なくとも10ヌクレオチドである、請求項13に記載の方法。
- 前記ニック形成剤が、ニック形成エンドヌクレアーゼである、請求項1に記載の方法。
- 前記ニック形成エンドヌクレアーゼが、N.BstNB Iである、請求項16に記載の方法。
- 前記ニック形成剤が、制限エンドヌクレアーゼである、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(B)が、等温条件下で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(B)が、50℃〜70℃で行われる、請求項19に記載の方法。
- 前記工程(B)が、60℃で行われる、請求項20に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼが、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損である、請求項1に記載の方法。
- 請求項22に記載の方法であって、前記5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼが、exo−Vent、exo−Deep Vent、exo−Bst、exo−Pfu、exo−Bca、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、T5 DNAポリメラーゼ、Phi29 DNAポリメラーゼ、ファージM2 DNAポリメラーゼ、ファージPhiPRD1 DNAポリメラーゼ、Sequenase、PRD1 DNAポリメラーゼ、9°NmTM DNAポリメラーゼ、およびT4 DNAポリメラーゼホモ酵素からなる群より選択される、方法。
- 前記5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼが、exo−Bstポリメラーゼ、exo−Bcaポリメラーゼ、exo−Ventポリメラーゼ、9°NmTM DNAポリメラーゼ、またはexo−Deep Ventポリメラーゼである、請求項23に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼが、鎖置換活性を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼが、鎖置換活性を有さない、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(B)が、鎖置換促進剤の存在下で行われる、請求項1に記載の方法。
- 請求項27に記載の方法であって、ここで、前記鎖置換促進剤は、BMRF1ポリメラーゼ補助サブユニット、アデノウイルスDNA結合タンパク質、単純ヘルペスウイルスタンパク質ICP8、一本鎖DNA結合タンパク質、ファージT4遺伝子32タンパク質、ウシ胸腺ヘリカーゼ、およびトレハロースからなる群より選択される、方法。
- 前記鎖置換促進剤が、トレハロースである、請求項28に記載の方法。
- 前記工程(B)の前記一本鎖核酸分子が、多くとも24ヌクレオチドを有する、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(B)の前記一本鎖核酸分子が、多くとも20ヌクレオチドを有する、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(B)の前記一本鎖核酸分子が、多くとも17ヌクレオチドを有する、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(B)の前記一本鎖核酸分子が、多くとも12ヌクレオチドを有する、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(B)の前記一本鎖核酸分子が、多くとも8ヌクレオチドを有する、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記工程(C)が、質量分析、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光、核酸ハイブリダイゼーション、および電気泳動からなる群より選択される技術の使用により少なくとも部分的に行われる、方法。
- 前記工程(C)が、液体クロマトグラフィーの使用により、少なくとも部分的に行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(C)が、質量分析の使用により、少なくとも部分的に行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(C)が、液体クロマトグラフィーおよび質量分析の使用により少なくとも部分的に行われる、請求項1に記載の方法。
- サンプル中のmRNAの存在もしくは非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下:
(a) テンプレートとして、該サンプル中の該mRNA分子を用いて一本鎖cDNA分子を合成する工程;
(b) 以下:
(i) 工程(a)からの一本鎖cDNA分子;
(ii) 一本鎖核酸プローブであって、該一本鎖核酸プローブは、3’から5’までに、標的核酸の3’部分に少なくとも実質的に相補的である配列、およびニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む、一本鎖核酸プローブ、
を含む、混合物を形成する工程;
(c) 工程(b)の混合物からハイブリダイズしていないプローブを取り除く工程;
(d) 該ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で増幅反応を行う工程;および
(e) 工程(d)の増幅産物の存在もしくは非存在を検出および/または特徴付けして、該サンプル中の該標的核酸の存在もしくは非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記一本鎖cDNA分子の5’末端が固定される、請求項39に記載の方法。
- 前記工程(a)が、固定されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われる、請求項40に記載の方法。
- cDNA集団中のニック形成剤認識配列を含む二本鎖標的cDNA分子の存在もしくは非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下:
(A) 該cDNA集団、該ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤、DNAポリメラーゼ、および1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸を含む混合物を形成する工程;
(B) 標的cDNA分子が該cDNA集団中に存在するならば、該標的cDNA分子の一方の鎖をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子が増幅される条件に、該混合物を維持する工程;および
(C) 工程(B)において増幅した該一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、該標的cDNAの存在もしくは非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記cDNA集団は、制限エンドヌクレアーゼで消化された後、前記工程(A)の前記ニック形成剤、前記DNAポリメラーゼ、および1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸と混合される、請求項42に記載の方法。
- cDNA集団をプロファイリングするための方法であって、該方法は、以下:
(A) 該cDNA集団、ニック形成剤、DNAポリメラーゼ、および前記1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸を含む混合物を形成する工程;
(B) 該ニック形成剤の認識配列を含むcDNA分子をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子が増幅される条件に、該混合物を維持する工程;および
(C) 該一本鎖核酸フラグメントを特徴付けして、該cDNA集団をプロファイルする工程、
を包含する、方法。 - 前記cDNA集団は、制限エンドヌクレアーゼで消化された後、前記工程(A)の前記ニック形成剤、前記DNAポリメラーゼ、および前記1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸と混合される、請求項44に記載の方法。
- 前記ニック形成剤が、ニック形成エンドヌクレアーゼである、請求項44に記載の方法。
- 前記ニック形成剤が、N.BstNB Iである、請求項46に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼが、exo−Bstポリメラーゼ、exo−Bcaポリメラーゼ、exo−Ventポリメラーゼ、9°NmTM DNAポリメラーゼ、およびexo−Deep Ventポリメラーゼから選択される、請求項44に記載の方法。
- 前記工程(B)が、等温条件で行われる、請求項44に記載の方法。
- 前記工程(C)の前記1つ以上の一本鎖核酸フラグメントが、多くとも25のヌクレオチドを有する、請求項44に記載の方法。
- 前記工程(C)の前記1つ以上の一本鎖核酸フラグメントが、多くとも17のヌクレオチドを有する、請求項44に記載の方法。
- 前記工程(C)の前記1つ以上の一本鎖核酸フラグメントが、多くとも12のヌクレオチドを有する、請求項44に記載の方法。
- 前記工程(C)の前記1つ以上の一本鎖核酸フラグメントが、多くとも8のヌクレオチドを有する、請求項44に記載の方法。
- 前記工程(C)が、液体クロマトグラフィーの使用により、少なくとも部分的に行われる、請求項44に記載の方法。
- 前記工程(C)が、質量分析の使用により、少なくとも部分的に行われる、請求項44に記載の方法。
- 前記工程(C)が、液体クロマトグラフィーおよび質量分析の使用により、少なくとも部分的に行われる、請求項44に記載の方法。
- cDNA集団中の標的cDNA分子の存在もしくは非存在を決定するため、または生物学的サンプル中の標的mRNAの存在もしくは非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下:
(A) 以下:
(i) 該cDNA集団中の該cDNA分子、または該生物学的サンプル中の該RNA分子;
(ii) 以下:
(a) ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列、該ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、またはその両方;および
(b) 該鎖自体またはその伸長産物のいずれかが、該ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤によりニック形成可能な、ニック形成部位を含む該鎖中の5’突出部、または
該鎖もその伸長産物も、該ニック形成部位を含まない該鎖中の3’突出部、
を含む、部分的に二本鎖の核酸プローブを含む、混合物を形成する工程であって、
ここで、各突出部は、該標的cDNAが一本鎖である場合、該標的cDNAに少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含むか、
該標的cDNAが二本鎖である場合、該標的cDNAの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含むか、または
該標的mRNAに少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含む、工程;
(B) 該cDNA分子またはmRNA分子にハイブリダイズしている該プローブ分子を、該cDNA分子またはmRNA分子にハイブリダイズしていないプローブ分子から分離する工程;
(C) 該ハイブリダイズしたプローブ分子および該ニック形成剤認識部位を認識するニック形成剤の存在下で増幅反応を行って、該標的cDNAが該cDNA集団中に存在する場合、または該標的mRNAが該生物学的サンプル中に存在する場合、テンプレートとして該部分的に二本鎖の核酸プローブの一方の鎖を用いて、一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程;ならびに
(D) 工程(C)の一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、該cDNA集団中の該標的cDNAの存在もしくは非存在を決定するか、または該生物学的サンプル中の該標的mRNAの存在もしくは非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記cDNA集団中の前記cDNA分子または前記生物学的サンプルの前記RNA分子が、固体支持体に固定される、請求項57に記載の方法。
- 前記ニック形成剤が、ニック形成エンドヌクレアーゼである、請求項57に記載の方法。
- cDNA集団中の標的cDNA分子の存在もしくは非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下:
(A) 第1のオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第2のODNP、および該cDNA集団中の該cDNA分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
(i) 該標的cDNAが第1の鎖および第2の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
該第1のODNPは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的核酸の該第1の鎖の第1の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして
該第2のODNPは、該標的核酸の第2の鎖の第2の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含み、該第2の部分は、該標的核酸の該第2の鎖中の該第1の部分の該相補鎖に対して3’側に配置されるか、あるいは、
(ii) 該標的核酸が一本鎖核酸である場合、
該第1のODNPは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的核酸の第1の部分に少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
該第2のODNPは、該標的核酸の第2の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含み、該第2の部分は、該標的核酸の該第1の部分に対して5’側に配置される、工程;
(B) 該標的cDNAが該cDNA集団中に存在する場合、該混合物を以下の条件:
(i) 該第1のODNPおよび該第2のODNPを伸長させて、該第1のODNPおよび該第2のODNPを含む伸長産物を生成する条件;
(ii) 必要に応じて、工程(i)の伸長産物を、該制限エンドヌクレアーゼ認識配列を認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて消化して、消化産物を提供する条件;
(iii)該ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を認識するニック形成エンドヌクレアーゼの存在下で、工程(B)(i)の伸長産物の一方の鎖または工程(B)(ii)の消化産物をテンプレートとして用いて一本鎖核酸フラグメントが増幅される条件、
に供する工程;および
(C) 工程(B)(ii)の一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、該cDNA集団中の該標的cDNAの存在もしくは非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記RERSがII型制限エンドヌクレアーゼにより認識可能である、請求項60に記載の方法。
- cDNA集団中の標的cDNA分子の存在もしくは非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下:
(A) 第1のオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第2のODNP、および該cDNA集団中の該cDNA分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
(i) 該標的cDNAが第1の鎖および第2の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
該第1のODNPは、第1のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)のセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的cDNAの該第1の鎖の第1の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして
該第2のODNPは、該標的核酸の第2の鎖の第2の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして第2のNERSのセンス鎖の配列を含み、該第2の部分は、該標的cDNAの該第2の鎖中の該第1の部分の該相補鎖に対して3’側に配置されるか、あるいは、
(ii) 該標的cDNAが一本鎖核酸である場合、
該第1のODNPは、第1のNERSのセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的cDNAの第1の部分に少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
該第2のODNPは、該標的核酸の第2の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第2のNERSのセンス鎖の配列を含み、該第2の部分は、該標的cDNAの該第1の部分に対して5’側に配置される、工程;
(B) 該標的cDNAが該cDNA集団中に存在する場合、該混合物を以下の条件:
(i) 該第1のODNPおよび該第2のODNPを伸長させて、該第1のNERSおよび該第2のNERSの両方を含む伸長産物を生成する条件;
(ii)該第1のNERSおよび該第2のNERSを認識する1つ以上のニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)の存在下で、工程(B)(i)の伸長産物の一方の鎖をテンプレートとして用いて一本鎖核酸フラグメントが増幅される条件、
に供する工程;
(C) 工程(B)(ii)の一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、サンプル中の該標的核酸の存在もしくは非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記第1のNERSおよび前記第2のNERSが、同一である、請求項62に記載の方法。
- 前記第1のODNP、前記第2のODNP、または両方のODNPが、固体支持体に固定される、請求項62に記載の方法。
- cDNA集団中の標的cDNAの存在または非存在を決定する方法であって、該方法は、以下:
(A) 第1のオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第2のODNP、および該cDNA集団中の該cDNA分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
(i) 該標的cDNAが第1の鎖および第2の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
該第1のODNPは、第1の制限エンドヌクレアーゼ認識配列(RERS)のセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的cDNAの該第1の鎖の第1の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして
該第2のODNPは、該標的核酸の第2の鎖の第2の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして第2のRERSのセンス鎖の配列を含み、該第2の部分は、該標的cDNAの該第2の鎖中の該第1の部分の該相補鎖に対して3’側に配置されるか、あるいは、
(ii) 該標的cDNAが一本鎖核酸である場合、
該第1のODNPは、第1のRERSのセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的cDNAの第1の部分に少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
該第2のODNPは、該標的核酸の第2の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第2のRERSのセンス鎖の配列を含み、該第2の部分は、該標的cDNAの該第1の部分に対して5’側に配置される、工程;
(B) 該標的cDNAが該cDNA集団中に存在する場合、該混合物を以下の条件:
(i) 該第1のODNPおよび該第2のODNPを伸長させて、該第1のRERSおよび該第2のRERSの両方を含む伸長産物を生成する条件;
(ii)該第1のRERSおよび該第2のRERSを認識する1つ以上の制限エンドヌクレアーゼ(RE)の存在下で、工程(B)(i)の伸長産物の一方の鎖をテンプレートとして用いて一本鎖核酸フラグメントが増幅される条件、
に供する工程;ならびに
(C) 工程(B)(ii)の一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、cDNA集団中の該標的cDNAの存在もしくは非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記第1のRERSが、前記第2のRERSと同一である、請求項65に記載の方法。
- 前記第1のODNP、前記第2のODNP、または両方のODNPが固定される、請求項65に記載の方法。
- cDNA集団中の標的cDNA分子の存在または非存在を決定するか、あるいは生物学的サンプル中の標的mRNAの存在または非存在を決定する方法であって、該方法は、以下:
(A) 以下:
(i) 該cDNA集団の該cDNA分子、または該生物学的サンプル中の該RNA分子、
(ii) 以下:
(a) 第1のニック形成剤認識配列の一方の鎖を含み、そして
(b) 該標的cDNAが一本鎖の場合、該標的cDNAに少なくとも実質的に相補的であるか、
該標的cDNAが二本鎖の場合、該標的cDNAの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的であるか、または
該標的mRNAに少なくとも実質的に相補的である、
第1の一本鎖テンプレート核酸分子(T1)、
(iii) 該第1のニック形成剤認識配列を認識する第1のニック形成剤、
(iv) DNAポリメラーゼ、および
(v) 1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;
を含む混合物を形成する工程;
(B) 該標的cDNAが該cDNA集団中に存在するならば、または該標的mRNAが該生物学的サンプル中に存在するならば、該標的cDNAの部分、該標的mRNAの部分、または該テンプレート核酸分子の部分をテンプレートとして用いて第1の一本鎖核酸分子(A1)が増幅される条件に、該混合物を維持する工程;
(C) A1に対して少なくとも実質的に相補的であり、そして第2のニック形成剤認識配列の一方の鎖を含む、第2の一本鎖テンプレート核酸分子(T2)を提供する工程;
(D) テンプレートとしてA1またはT2のいずれかを用いて、第2のニック形成剤認識配列を認識する第2のニック形成剤の存在下で増幅反応を行って、第2の一本鎖核酸分子(A2)を増幅する工程;および
(E) A2の存在または非存在を検出して、該cDNA集団中の該標的cDNA分子の存在または非存在、あるいは生物学的サンプル中の該標的mRNAの存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 請求項68に記載の方法であって、ここで、前記第1のテンプレート核酸は一本鎖であり、そして前記第1のニック形成剤認識配列の一方の鎖の配列に対して3’側に位置付けられ、該標的cDNAが一本鎖である場合に、該標的cDNAの3’部分に対して少なくとも実質的に相補的であるか、該標的cDNAが二本鎖である場合に、該標的cDNAの一方の鎖に対して少なくとも実質的に相補的であるか、または該標的mRNAに対して少なくとも実質的に相補的である、配列を含む、方法。
- 請求項68に記載の方法であって、ここで、前記標的cDNAは二本鎖であり、そして前記第1のニック形成剤認識配列を含み、そしてここで、前記第1のテンプレート核酸が、該第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む、該標的cDNAの部分を含む、方法。
- 請求項68に記載の方法であって、ここで、前記標的cDNAが一本鎖であり、そして前記第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そしてここで、前記第1のテンプレート核酸分子が、該第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む、方法。
- 請求項68に記載の方法であって、ここで前記標的cDNAが二重鎖であり、そして前記第1のニック形成剤認識配列を含み、そしてここで、該第1のテンプレート核酸が、3’から5’へと、以下:
(i) 該第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖に配列を含む、該標的cDNAの鎖に少なくとも実質的に相補的である配列、
(ii) 該第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、
(iii) 該第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む該標的cDNAの鎖に実質的に相補的ではない配列、
を含む、方法。 - 請求項68に記載の方法であって、ここで前記標的cDNAが一本鎖であり、そして前記第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そしてここで、該第1のテンプレート核酸が、3’から5’へと、以下:
(i) 該標的cDNAに少なくとも実質的に相補的である配列、
(ii) 該第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(iii) 該標的cDNAに実質的に相補的ではない配列、
を含む、方法。 - 前記標的cDNAが固定される、請求項68に記載の方法。
- 前記T1が、前記第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む、請求項68に記載の方法。
- 前記T1が、前記第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む、請求項68に記載の方法。
- 前記T2が、前記第2のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む、請求項68に記載の方法。
- 前記T2が、前記第2のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む、請求項68に記載の方法。
- 前記ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列中の1つ以上のヌクレオチドが、前記標的cDNAまたは前記標的mRNAのヌクレオチドと従来の塩基対を形成しない、請求項75に記載の方法。
- 前記cDNA分子もしくはcDNA集団、または生物学的サンプル中のRNA分子が、固体支持体に固定される、請求項68に記載の方法。
- 前記テンプレート核酸分子が、固体支持体に固定される、請求項68に記載の方法。
- 前記ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して5’側に配置される配列が、該ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して5’側に配置される配列に少なくとも実質的に同一である、請求項76に記載の方法。
- 前記ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して5’側に配置される配列が、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して5’側に配置される配列に厳密に同一である、請求項82に記載の方法。
- 前記ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して5’側に配置される配列が、少なくとも10ヌクレオチドである、請求項82に記載の方法。
- 前記第1のニック形成剤および前記第2のニック形成剤の両方が、ニック形成エンドヌクレアーゼである、請求項68に記載の方法。
- 前記第1のニック形成剤および前記第2のニック形成剤が同一である、請求項85に記載の方法。
- 前記ニック形成エンドヌクレアーゼが、N.BstNB Iである、請求項86に記載の方法。
- 前記第1のニック形成剤および前記第2のニック形成剤が、制限エンドヌクレアーゼである、請求項1に記載の方法。
- 請求項68に記載の方法であって、前記工程(A)〜(D)が、単一の容器中で行われる、方法。
- 請求項68に記載の方法であって、前記工程(B)および(D)が、等温条件下で行われる、方法。
- 請求項90に記載の方法であって、前記工程(B)および(D)が、50℃〜70℃で行われる、方法。
- 請求項91に記載の方法であって、前記工程(B)および(D)が、60℃で行われる、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記工程(B)および(D)が、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼの存在下で行われる、方法。
- 請求項93に記載の方法であって、ここで、前記5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼが、exo−Vent、exo−Deep Vent、exo−Bst、exo−Pfu、exo−Bca、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、T5 DNAポリメラーゼ、Phi29 DNAポリメラーゼ、ファージM2 DNAポリメラーゼ、ファージPhiPRD1 DNAポリメラーゼ、Sequenase、PRD1 DNAポリメラーゼ、9°NmTMDNAポリメラーゼ、およびT4 DNAポリメラーゼホロ酵素からなる群より選択される、方法。
- 前記5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼが、exo−Bstポリメラーゼ、exo−Bcaポリメラーゼ、exo−Ventポリメラーゼ、9°NmTMDNAポリメラーゼ、またはexo−Deep Ventポリメラーゼである、請求項94に記載の方法。
- 請求項68に記載の方法であって、前記工程(B)および(D)が、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼの存在下で行われる、方法。
- 請求項68に記載の方法であって、前記工程(B)および(D)が、鎖置換活性を有さないDNAポリメラーゼの存在下で行われる、方法。
- 請求項68に記載の方法であって、前記工程(B)および(D)が、鎖置換促進因子促進因子の存在下で行われる、方法。
- 請求項98に記載の方法であって、ここで、前記鎖置換促進因子促進因子が、BMRF1ポリメラーゼ補助サブユニット、アデノウイルスDNA結合タンパク質、単純ヘルペスウイルスタンパク質ICP8、一本鎖DNA結合タンパク質、ファージT4遺伝子32タンパク質、ウシ胸腺ヘリカーゼ、およびトレハロースからなる群より選択される、方法。
- 前記鎖置換促進因子が、トレハロースである、請求項99に記載の方法。
- 前記A1が、多くとも24ヌクレオチドを有する、請求項68に記載の方法。
- 前記A1が、多くとも20ヌクレオチドを有する、請求項68に記載の方法。
- 前記A1が、多くとも17ヌクレオチドを有する、請求項68に記載の方法。
- 前記A1が、多くとも12ヌクレオチドを有する、請求項68に記載の方法。
- 前記A1が、多くとも8ヌクレオチドを有する、請求項68に記載の方法。
- 前記A2が、多くとも24ヌクレオチドを有する、請求項68に記載の方法。
- 前記A1が、多くとも20ヌクレオチドを有する、請求項68に記載の方法。
- 前記A1が、多くとも17のヌクレオチドを有する、請求項68に記載の方法。
- 前記A1が、多くとも12ヌクレオチドを有する、請求項68に記載の方法。
- 前記A1が、多くとも8ヌクレオチドを有する、請求項68に記載の方法。
- 請求項68に記載の方法であって、前記工程(E)が、質量分析、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光、核酸ハイブリダイゼーション、および電気泳動からなる群より選択される技術を使用することにより、少なくとも部分的に行われる、方法。
- 請求項68に記載の方法であって、前記工程(E)が、液体クロマトグラフィーの使用により少なくとも部分的に行われる、方法。
- 請求項68に記載の方法であって、前記工程(E)が、質量分析の使用により少なくとも部分的に行われる、方法。
- 請求項68に記載の方法であって、前記工程(E)が、液体クロマトグラフィーおよび質量分析の使用により少なくとも部分的に行われる、方法。
- cDNA集団における標的cDNA分子の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下:
(A)以下:
(i) 該cDNA集団の該cDNA分子、
(ii) 以下:
(a) 第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み、そして
(b) 該標的cDNAが一本鎖の場合、該標的cDNAに少なくとも実質的に相補的であるか、または
該標的cDNAが二本鎖の場合、該標的cDNAの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的である、
第1の一本鎖テンプレート核酸分子(T1)、
(iii) 3’から5’へと、以下:
(a) 該第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して5’側に配置されるT1の配列と少なくとも実質的に同一である配列、および
(b) 第2のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、
を含む、第2の一本鎖テンプレート核酸分子(T2)、
(iv) 該第1のニック形成剤認識配列を認識する第1のニック形成剤、
(v) 該第2のニック形成剤認識配列を認識する第2のニック形成剤、
(vi) DNAポリメラーゼ、および
(vii) 1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;
を含む混合物を形成する工程;
(B) 該標的cDNAが、該cDNA集団中に存在するならば、T2をテンプレートとして用いて第1の一本化核酸(A2)が増幅される条件に、該混合物を維持する工程;および
(C) A2の存在または非存在を検出して、該cDNA集団中の該標的cDNAの存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記第1のニック形成剤認識配列が、第2のニック形成剤認識配列と同一である、請求項115に記載の方法。
- 請求項115に記載の方法であって、ここで、前記T2が、前記第2のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖に対して5’に配置される配列に少なくとも実質的に同一である、該第2のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖に対して3’側に配置される配列を含む、方法。
- 請求項115に記載の方法であって、ここで、前記第2のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖に対して3’側に配置される配列が、該第2のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖に対して5’に配置される配列と厳密に同一である、方法。
- 前記cDNA集団の前記cDNA分子が固定される、請求項115に記載の方法。
- 前記T1が固定される、請求項115に記載の方法。
- 前記T2が固定される、請求項115に記載の方法。
- 請求項115に記載の方法であって、ここで、前記T2が、前記第2のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して3’に配置される配列に少なくとも実質的に同一である、該第2のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して5’側に配置される配列を含む、方法。
- 前記第2のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して5’側に配置される配列が、多くとも10ヌクレオチドの長さである、請求項122に記載の方法。
- cDNA集団における標的cDNA分子の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下:
(A)以下:
(i) 該cDNA集団の該cDNA分子、
(ii) 以下:
(a) 第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そして
(b) 該標的cDNAが一本鎖の場合、該標的cDNAに少なくとも実質的に相補的であるか、または
該標的cDNAが二本鎖の場合、該標的cDNAの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的である、
第1の一本鎖テンプレート核酸分子(T1)、
(iii) 3’から5’へと、以下:
(a) 該第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列に対して3’側に配置されるT1の配列と少なくとも実質的に相補的である配列、および
(b) 第2のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、
を含む、第2の一本鎖テンプレート核酸分子(T2)、
(iv) 該第1のニック形成剤認識配列を認識する第1のニック形成剤、
(v) 該第2のニック形成剤認識配列を認識する第2のニック形成剤、
(vi) DNAポリメラーゼ、および
(vii) 1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;
を含む混合物を形成する工程;
(B) 該標的cDNAが該cDNA集団中に存在するならば、T2をテンプレートとして用いて第1の一本化核酸(A2)が増幅される条件に、該混合物を維持する工程;ならびに
(C) A2の存在または非存在を検出して、該cDNA集団中の該標的cDNA分子の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記第1のニック形成剤認識配列が、前記第2のニック形成剤認識配列と同一である、請求項124に記載の方法。
- 前記cDNA集団の前記cDNA分子が固定される、請求項124に記載の方法。
- 前記T1が固定される、請求項124の方法。
- 前記T2が固定される、請求項124の方法。
- cDNA集団における標的cDNA分子の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下:
(A)以下:
(i) 該cDNA集団の該cDNA分子、
(ii) 以下:
(a) 第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み、そして
(b) 該標的cDNAが一本鎖の場合、該標的cDNAに少なくとも実質的に相補的であるか、または
該標的cDNAが二本鎖の場合、該標的cDNAの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的である、
第1の一本鎖テンプレート核酸分子(T1)、
(iii) 3’から5’へと、以下:
(a) 該第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して5’側に配置されるT1の配列と少なくとも実質的に同一である配列、および
(b) 第2のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列、
を含む、第2の一本鎖テンプレート核酸分子(T2)、
(iv) 該第1のニック形成剤認識配列を認識する第1のニック形成剤、
(v) 該第2のニック形成剤認識配列を認識する第2のニック形成剤、
(vi) DNAポリメラーゼ、および
(vii) 1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;
を含む混合物を形成する工程;
(B) 該標的cDNAが該cDNA集団中に存在するならば、該第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖に対して5’側に配置されるT1の配列と少なくとも実質的に同一である、第1の一本鎖核酸分子(A2)が増幅される条件下に、該混合物を維持する工程;ならびに
(C) A2の存在または非存在を検出して、該cDNA集団中の該標的cDNA分子の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記第1のニック形成剤認識配列が、前記第2のニック形成認識配列と同一である、請求項129に記載の方法。
- 前記cDNA集団の前記cDNA分子が固定される、請求項129の方法。
- T1が固定される、請求項129に記載の方法。
- T2が固定される、請求項129に記載の方法。
- cDNA集団における標的cDNA分子の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下:
(A)以下:
(i) 該cDNA集団の該cDNA分子、
(ii) 以下:
(a) 第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そして
(b) 該標的cDNAが一本鎖の場合、該標的cDNAに少なくとも実質的に相補的であるか、または
該標的cDNAが二本鎖の場合、該標的cDNAの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的である、
第1の一本鎖テンプレート核酸分子(T1)、
(iii) 3’から5’へと、以下:
(a) 該第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列に対して3’側に配置されるT1の配列と少なくとも実質的に相補的である配列、および
(b) 第2のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列、
を含む、第2の一本鎖テンプレート核酸分子(T2)、
(iv) 該第1のニック形成剤認識配列を認識する第1のニック形成剤、
(v) 該第2のニック形成剤認識配列を認識する第2のニック形成剤、
(vi) DNAポリメラーゼ、および
(vii) 1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;
を含む混合物を形成する工程;
(B) 該標的cDNAが該cDNA集団中に存在するならば、該第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖に対して3’側に配置されるT1の配列に対して少なくとも実質的に同一である、第1の一本鎖核酸分子(A2)が増幅される条件に、該混合物を維持する工程;ならびに
(C) A2の存在または非存在を検出して、該cDNA集団中の該標的cDNA分子の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記第1のニック形成剤認識配列が、前記第2のニック形成認識配列と同一である、請求項134に記載の方法。
- 前記cDNA集団の前記cDNA分子が固定される、請求項134に記載の方法。
- 前記T1が固定される、請求項134に記載の方法。
- 前記T2が固定される、請求項134に記載の方法。
- cDNA集団における標的cDNA分子の存在または非存在を決定するか、あるいは生物学的サンプル中の標的mRNA分子の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下:
(A)以下:
(i) 該cDNA集団の該cDNA分子、該生物学的サンプル中の標的RNA分子、
(ii) 3’から5’へと、以下:
(a) 該標的cDNAが一本鎖の場合、該標的cDNAの3’部分に少なくとも実質的に相補的である第1の配列、または
該標的cDNAが二本鎖の場合、該標的cDNAの一方の鎖の3’部分に少なくとも実質的に相補的である第1の配列、または
該標的mRNAの3’部分に少なくとも実質的に相補的である、第1の配列、
(b) 第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(c)第2の配列、
を含む、第1のテンプレート核酸分子(T1)、
(iii) 3’から5’へと、以下:
(a) T1の第2の配列と少なくとも実質的に同一である第1の配列、
(b) 第2のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(c) 第2の配列、
を含む、第2のテンプレート核酸分子(T2)、
(iv) 該第1のニック形成剤認識配列を認識する第1のニック形成剤、
(v) 該第2のニック形成剤認識配列を認識する第2のニック形成剤、
(vi) DNAポリメラーゼ、および
(vii) 1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;
を含む混合物を形成する工程;
(B) 該標的cDNAが該cDNA集団中に存在するならば、T2の第2の配列をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子(A2)が増幅される条件に、該混合物を維持する工程;および
(C) A2の存在または非存在を検出して、該cDNA集団中の該標的cDNA分子の存在または非存在、あるいは該生物学的サンプル中の該標的mRNAの存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記T2の第2の配列が、T2の第1の配列に少なくとも実質的に同一である、請求項139に記載の方法。
- 前記T2の第2の配列が、T2の第1の配列と厳密に同一である、請求項139に記載の方法。
- 前記第1のニック形成剤および前記第2のニック形成剤が同一である、請求項139に記載の方法。
- 前記第1のニック形成剤および前記第2のニック形成剤が、ニック形成エンドヌクレアーゼである、請求項142に記載の方法。
- 前記第1のニック形成剤および第2のニック形成剤が、N.BstNB Iである、請求項143に記載の方法。
- cDNA集団における第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む標的cDNA分子の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下:
(A)以下:
(i) 該cDNA集団の該cDNA分子、
(ii) 3’から5’へと、以下:
(a) 該第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列に対してすぐ5’側に配置される該標的cDNAの部分に少なくとも実質的に相補的である第1の配列、
(b) 第1のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(c)第2の配列、
を含む、第1のテンプレート核酸分子(T1)、
(iii) 3’から5’へと、以下:
(a) T1の第2の配列と少なくとも実質的に同一である第1の配列、
(b) 第2のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(c) 第2の配列、
を含む、第2のテンプレート核酸分子(T2)、
(iv) 該第1のニック形成剤認識配列を認識する第1のニック形成剤、
(v) 該第2のニック形成剤認識配列を認識する第2のニック形成剤、
(vi) DNAポリメラーゼ、および
(vii) 1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;
を含む混合物を形成する工程;
(B) 該標的cDNAが該cDNA集団中に存在するならば、T2の第2の配列をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子(A2)が増幅される条件下に、該混合物を維持する工程;ならびに
(C) A2の存在または非存在を検出して、該cDNA集団中の該標的cDNAの存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記T2の第2の配列が、前記T2の第1の配列と少なくとも実質的に同一である、請求項145に記載の方法。
- 前記T2の第2の配列が、前記T2の第1の配列と厳密に同一である、請求項145に記載の方法。
- 前記第1のニック形成剤および前記第2のニック形成剤が、同一である、請求項145に記載の方法。
- 前記第1のニック形成剤および前記第2のニック形成剤が、ニック形成エンドヌクレアーゼである、請求項148に記載の方法。
- 前記第1のニック形成剤および前記第2のニック形成剤が、N.BstNB Iである、請求項149に記載の方法。
- 前記T1の第1の配列が、前記第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列に対してすぐ5’側に配置された前記標的cDNAの部分に対して厳密に相補的である、請求項145に記載の方法。
- 前記T1の第2の配列が、前記第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列に対してすぐ3’側に配置された前記標的cDNAの部分と少なくとも実質的に相補的である、請求項145または151に記載の方法。
- 前記T1の第2の配列が、前記第1のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列に対してすぐ3’側に配置された前記標的cDNAの部分に対して厳密に相補的である、請求項152に記載の方法。
- 天然に存在するゲノムDNA、または天然に存在するmRNAのcDNAの部分に少なくとも実質的に同一である配列を含む核酸であって、ここで、
(A) 天然に存在するゲノムDNAまたは天然に存在するmRNAのcDNAの部分は、3’から5’へと、以下:
(i) 3〜50ヌクレオチドの長さである第1の配列、
(ii) ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
(iii) 8〜50ヌクレオチドの長さである第2の配列、
からなり;
(B) 該核酸は、多くとも120ヌクレオチドの長さであり;そして
(C)該核酸が、配列A(ii)を含む、核酸。 - 前記配列A(i)が、5〜10ヌクレオチドの長さである、請求項154に記載の核酸。
- 前記配列A(iii)が、12〜24ヌクレオチドの長さである、請求項154または155に記載の核酸。
- 前記ニック形成剤認識配列が、ニック形成エンドヌクレアーゼにより認識可能である、請求項154に記載の核酸。
- 前記ニック形成エンドヌクレアーゼが、N.BstNB Iである、請求項157に記載の核酸。
- 前記核酸が、天然に存在するゲノムDNAの部分を含む、請求項154に記載の核酸。
- 前記核酸が、天然に存在するmRNAのcDNAの部分を含む、請求項154に記載の核酸。
- 前記核酸が、多くとも30ヌクレオチドの長さである、請求項154に記載の核酸。
- 前記核酸が、多くとも25ヌクレオチドの長さである、請求項154に記載の核酸。
- 前記核酸が、多くとも20ヌクレオチドの長さである、請求項154に記載の核酸。
- 前記核酸が、その3’末端または5’末端を介して固定される、請求項154に記載の核酸。
- 請求項154に記載の核酸であって、ここで、前記天然に存在するゲノムDNAまたは前記天然に存在するmRNAのcDNAの前記部分と少なくとも実質的に同一である前記配列が、該天然に存在するゲノムDNAまたは該天然に存在するmRNAのcDNAの該部分と厳密に同一である、核酸。
- 請求項154に記載の核酸であって、ここで、前記天然に存在するゲノムDNAまたは前記天然に存在するmRNAのcDNAの前記部分と少なくとも実質的に同一である前記配列が、該天然に存在するゲノムDNAまたは該天然に存在するmRNAのcDNAの該部分と少なくとも95%同一である、核酸。
- 請求項154に記載の核酸であって、ここで、前記天然に存在するゲノムDNAまたは前記天然に存在するmRNAのcDNAの前記部分と少なくとも実質的に同一である前記配列が、該天然に存在するゲノムDNAまたは該天然に存在するmRNAのcDNAの該部分と少なくとも98%同一である、核酸。
- 一本鎖核酸であって、以下:
(a) 多くとも100ヌクレオチドの長さであり、
(b) ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み、
(c) cDNA分子に実質的に相補的であり、そして
(d) 該ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で、一本鎖核酸フラグメントを増幅するためのテンプレートとして機能し得る、一本鎖核酸。 - 一本鎖核酸であって、以下:
(a) 多くとも100ヌクレオチドの長さであり、
(b) ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、
(c) cDNA分子に実質的に相補的であり、そして
(d) 該cDNA分子にアニールする場合、該ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で、該cDNA分子の部分を増幅することが可能である、一本鎖核酸。 - 前記一本鎖核酸が、多くとも50ヌクレオチドの長さである、請求項168または169に記載の一本鎖核酸。
- 前記一本鎖核酸が、多くとも30ヌクレオチドの長さである、請求項168または169に記載の一本鎖核酸。
- 前記一本鎖核酸が、多くとも25ヌクレオチドの長さである、請求項168または169に記載の一本鎖核酸。
- 前記一本鎖核酸が、多くとも20ヌクレオチドの長さである、請求項168または169に記載の一本鎖核酸。
- 前記ニック形成剤が、ニック形成エンドヌクレアーゼである、請求項168または169に記載の一本鎖核酸。
- 前記ニック形エンドヌクレアーゼが、N.BstNB Iである、請求項174に記載の一本鎖核酸。
- 前記一本鎖核酸が、前記cDNA分子の部分と厳密に同一である、請求項168または169に記載の一本鎖核酸。
- 前記一本鎖核酸が、固体支持体に固定される、請求項168または169に記載の一本鎖核酸。
- cDNA集団における標的cDNA分子の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下:
(A) 以下:
(i) 該cDNA集団の該cDNA分子、
(ii) 以下:
(a) 認識配列の外側にニックを形成するニック形成剤により認識可能な、二本鎖ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そして
(b) 該一本鎖標的核酸の第1の領域、または二本鎖標的核酸の一方の鎖の第1の領域に少なくとも実質的に相補的である、
オリゴヌクレオチドプライマー;ならびに
(iii) 部分的に二本鎖の核酸であって、
(a) 二本鎖II型制限エンドヌクレアーゼ認識配列、および
(b) 該一本鎖標的cDNAの第2の領域、もしくは該一本鎖標的cDNAの第1の領域に対して5’側に配置される、該二本鎖標的cDNAの第2の領域、または該二本鎖標的cDNAの一方の鎖の第2の領域に、少なくとも実質的に相補的である、3’突出部、
を含む、部分的に二本鎖の核酸、
を含む混合物を、
該オリゴヌクレオチドプライマーと、該一本鎖標的cDNAの第1の領域または該二本鎖核酸の一方の鎖の第1の領域との間のハイブリダイゼーション、および該部分的に二本鎖の核酸の3’突出部と、該一本鎖標的cDNAの第2の領域または該二本鎖核酸の一方の鎖の第2の領域との間のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で形成する工程;
(B) 該オリゴヌクレオチドプライマーおよび部分的に二本鎖の核酸に、該第2の領域でハイブリダイズした、該一本鎖標的cDNAまたは該二本鎖標的cDNAの一方の鎖を消化する工程;ならびに
(C) 該ニック形成剤の存在下で、テンプレートとして、工程(B)において消化した該一本鎖標的cDNAの部分、または該二本鎖標的cDNAの一方の鎖の部分を用いて一本鎖核酸分子を増幅する、増幅反応を行う工程、ならびに
(D) 工程(C)の一本鎖核酸分子の存在または非存在を検出して、該cDNA集団中の該標的cDNA分子の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記二本鎖ニック形成剤認識配列が、N.BstNB Iにより認識可能である、請求項178に記載の方法。
- 請求項178に記載の方法であって、ここで、前記二本鎖ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列中のヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記標的核酸にアニールする場合、前記一本鎖標的cDNAまたは前記二本鎖cDNAの一方の鎖の別のヌクレオチドと、従来の塩基対合を形成しない、方法。
- 前記TRERSが、PlelまたはMlylにより認識可能である、請求項178に記載の方法。
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