JP2004535814A - ニック形成エンドヌクレアーゼを使用する指数関数的核酸増幅 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ニック形成剤を使用する、核酸分子の指数関数的増幅のための方法および組成物を提供する。本発明は、多くの領域(例えば、疾患診断、遺伝的バリエーション検出、およびpre−mRNA選択的スプライシング分析)において有用である。核酸の増幅のための以前に公知である技術とは対照的に、本発明は、複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットの使用を必要とはせず、転写には基づかない、核酸増幅のための方法を提供する。さらに、本発明は、等温条件下で実行され得、従って、異なる温度のサイクルを提供するための装置に関連する出費を回避し得る。
Description
【技術分野】
【0001】
(発明の分野)
本発明は、分子生物学的の分野に関し、より特には、核酸に関する方法および組成物に関し、なおより特には、ニック形成剤を使用して核酸を増幅することに関連する方法および組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
(関連技術の説明)
多数の方法が、核酸の迅速な増幅のために開発されている。これらとしては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、自己維持配列複製(3SR)、核酸配列ベースの増幅(NASBA)、転写ベースの増幅系(TAS)、鎖置換増幅(SDA)、およびQβレプリカーゼを用いる増幅が挙げられる。核酸増幅のために広範に使用される方法のうちのほとんど(例えば、PCR)は、変性および再アニーリングのサイクルを達成するために異なる温度のサイクルを必要とする。他の方法は、等温で実施され得るが、複数のプライマーセット(例えば、好熱性SDAのバンパープライマー)を必要とするか、または転写および/もしくは逆転写に基づく(これは、RNA変性に感受性である(例えば、TAS、NASBA、および3SR))。従って、核酸増幅のためのより簡単でかつより効率の良い方法について、当該分野で長い間感じられた必要性が存在する。
【0003】
本発明は、下記のように、この必要性および関連する必要性を満たす。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0004】
(発明の簡単な要旨)
核酸の増幅のための以前に公知である技術とは対照的に、本発明は、複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットの使用を必要とはせず、転写には基づかない、核酸増幅のための方法を提供する。さらに、本発明は、等温条件下で実行され得、従って、異なる温度のサイクルを提供するための装置に関連する出費を回避し得る。本発明は、種々の適用(例えば、遺伝子変化検出、疾患診断、および遺伝子変化検出)において有用性を見出し得る。
【0005】
この目的のために、本発明は、下記に要約するようなシステムおよびアレイを含む、方法、化合物、および組成物を提供する。
【0006】
核酸分子(A2)を増幅するための方法。この方法は、(A)少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子(N1)を提供する工程であって、この少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子は、(i)第1のニック形成剤認識配列(NARS)のセンス鎖の配列、および(ii)その第1のNARSのアンチセンス鎖の配列のうちの少なくとも1つを含む、工程;(B)その第1のNARSを認識するニック形成剤(NA)と、DNAポリメラーゼと、1種以上のデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、第1の一本鎖核酸分子(A1)を増幅する工程であって、この増幅工程は、このDNAポリメラーゼのためのテンプレートとしてN1の一部を使用する、工程;(C)第2の一本鎖核酸分子(T2)を提供する工程であって、この第2の一本鎖核酸分子は、5’から3’の方向に、(i)第2のNARSのセンス鎖の配列と、(ii)A1と少なくとも実質的に相補的である配列とを含む、工程;ならびに(D)T2と、A1と、第1のNAと、第2のNARSを認識する第2のNAと、DNAポリメラーゼと、デオキシヌクレオシド三リン酸との存在下で、第3の一本鎖核酸分子(A2)を増幅する工程であって、A2は、A1と少なくとも実質的に相補的であり、A1、A2、または両方が、最大25ヌクレオチド長である、工程;を包含する。
【0007】
核酸分子(A2)を増幅するための方法。この方法は、(A)混合物を形成する工程であって、この混合物は、(i)第1のニック形成剤認識配列(NARS)のアンチセンス鎖の配列を含む少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子(N1);(ii)3’から5’の方向に、(a)N1中の第1のNARSのアンチセンス鎖の配列の5’側に位置するN1の一部と少なくとも実質的に同一である配列と、(b)第2のNERSのセンス鎖の配列とを含む、一本鎖核酸分子(T2);および(iii)第1のNARSを認識する第1のニック形成剤(NA)、第2のNARSを認識する第2のNA、DNAポリメラーゼ、および1種以上のデオキシヌクレオシド三リン酸を含む、工程;ならびに(B)一本鎖核酸分子(A2)を指数関数的に増幅する条件にて、上記混合物を維持する工程であって、A2が最大25ヌクレオチド長である、工程;を包含する。
【0008】
核酸分子(A2)を増幅するための方法。この方法は、(A)(i)第1のニック形成剤認識配列(NARS)のセンス鎖の配列を含む少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子(N1)と;(ii)一本鎖核酸分子(T2)と、(iii)第1のNARSを認識する第1のニック形成剤(NA)、第2のNARSを認識する第2のNA、DNAポリメラーゼ、および1種以上のデオキシヌクレオシド三リン酸との混合物を形成する工程であって、この一本鎖核酸分子(T2)は、3’から5’の方向に、(a)N1中の第1のNARSのセンス鎖の3’側に位置するN1の一部と少なくとも実質的に相補的である配列と、(b)第2のNARSのセンス鎖の配列とを含む、工程;ならびに(B)一本鎖核酸分子(A2)を増幅する条件にて、上記混合物を維持する工程であって、A2が最大25ヌクレオチド長である、工程;を包含する。
【0009】
タンデム核酸増幅システム。このシステムは、第1の核酸(A1)を増幅するための第1のプライマー伸長手段と、第2の核酸(A2)を増幅するための第2のプライマー伸長手段とを備え、ここで、(i)A1は、A2を増幅するための第2のプライマー伸長手段のための開始プライマー;(ii)この第1のプライマー伸長手段および第2のプライマー伸長手段の両方が、単一の反応容器内に含まれており、かつニック形成剤(NA)の存在を必要とし;(iii)A1、A2、または両方が、最大25ヌクレオチド長であり;そして(iv)A2は、A1と少なくとも実質的に相補的である。
【0010】
核酸分子A2の指数関数的増幅のための方法。この方法は、(a)第1のテンプレート核酸(T1)を、第1のNARSを認識する第1のニック形成エンドヌクレアーゼ(NA)と、第1のDNAポリメラーゼの存在下でのプライマー伸長反応により、テンプレートとして使用して核酸分子(A1)を増幅する工程であって、この第1のテンプレート核酸(T1)は、第1のニック形成剤認識配列(NARS)の1本の鎖の配列を含む、工程;ならびに(b)第2のテンプレート核酸(T2)をテンプレートとして使用し、A1を開始プライマーとして使用して、第2のNAと第2のDNAポリメラーゼとの存在下でのプライマー伸長反応によってA2を増幅する工程であって、この第2のテンプレート核酸(T2)は、第2のNARSのセンス鎖の配列を含む、工程;を包含する。好ましくは、A1、A2、または両方が、最大25ヌクレオチド長である。
【0011】
ゲノム核酸またはcDNA分子における遺伝子変化を同定するための方法。この遺伝子変化は、そのゲノム核酸またはcDNA分子中の第1のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)のアンチセンス鎖の配列の5’側に位置する。この方法は、(A)混合物を形成する工程であって、この混合物は、(i)ゲノム核酸またはcDNA分子、(ii)一本鎖核酸分子(T2)、および(iii)第1のNERSを認識する第1のニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)、第2のNERSを認識する第2のNE、DNAポリメラーゼ、および1種以上のデオキシヌクレオシド三リン酸を含み、この一本鎖核酸分子(T2)は、3’から5’の方向に、(a)第1のNERSのアンチセンス鎖の配列の5’側に位置するゲノム核酸部分またはcDNA分子部分と少なくとも実質的に同一である配列と、(b)第2のNERSのセンス鎖の配列とを含む、工程;(B)この混合物を、一本鎖核酸分子(A2)を指数関数的に増幅する条件にて維持する工程;ならびに(C)そのゲノム核酸またはcDNA分子中の遺伝子変化を同定するためにA2を特徴付ける工程;を包含する。
【0012】
標的核酸中の規定された位置における遺伝子変化を同定するための方法。この方法は、(a)第1のオリゴヌクレオチド(ODNP)と、第2のODNPと、標的核酸との混合物を形成する工程であって、(i)その標的核酸が、第1の鎖と第2の鎖とを有する二本鎖核酸である場合に、その第1のODNPは、第1のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)のセンス鎖のヌクレオチド配列と、その遺伝子変化の相補体の3’側に位置する標的核酸の第1の鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列とを含み、第2のODNPは、その遺伝子変化の3’側に位置する標的核酸の第2の鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつその第2のODNPは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列(RERS)の1本の鎖の配列を必要に応じて含むか、または(ii)標的核酸が一本鎖核酸である場合に、その第1のODNPは、第1のNERSのセンス鎖のヌクレオチド配列と、その遺伝子変化の5’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列とを含み、その第2のODNPは、その遺伝子変化の3’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そしてその第2のODNPは、必要に応じてRERSを含む、工程;ならびに(b)その第1のODNPと第2のODNPとを伸長して、その第1のODNPのヌクレオチド配列と第2のODNPのヌクレオチド配列とを含む伸張産物を生成させる工程;(c)工程(b)の伸長産物を、RERSを認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて必要に応じて消化して、消化産物を生成する工程;(d)工程(b)の伸長産物の1本の鎖または工程(c)の消化産物の一本の鎖を、第1のNERSを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)の存在下でテンプレートとして使用して、第1の一本鎖核酸フラグメント(A1)を増幅する工程;(e)A1にアニールするための第2の一本鎖核酸分子(T2)を提供する工程であって、T2は、5’から3’の方向に、(i)第2のNERSのセンス鎖の配列と、(ii)A1と少なくとも実質的に相補的な配列とを含む、工程;(f)A1をテンプレートとして使用して、第3の一本鎖核酸フラグメント(A2)を増幅する工程;ならびに(g)A2を特徴付けて、標的核酸中の遺伝子変化を同定する工程;を包含する。好ましくは、A1、A2、または両方が、最大25ヌクレオチドを有する。
【0013】
標的核酸における規定された位置での遺伝子変化を同定するための方法。この方法は、(a)第1のODNPと、第2のODNPと、標的核酸との混合物を形成する工程であって、(i)標的核酸が、第1鎖と第2鎖とを有する二本鎖である場合、その第1のODNPは、第1の制限エンドヌクレアーゼ認識配列(RERS)の1本の鎖のヌクレオチド配列と、その遺伝子変化の相補体の3’側に位置する標的核酸の第1鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列とを含み、第2のODNPは、第2のRERSの一本の鎖のヌクレオチド配列と、その遺伝子変化の3’側に位置する標的核酸の第2鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列とを含むか、または(ii)標的核酸が一本鎖核酸である場合、その第1ODNPは、第1RERSの1本の鎖のヌクレオチド配列と、その遺伝子変化の相補体の5’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列とを含み、その第2ODNPは、第2RERSの1本の鎖の配列と、その遺伝子変化の3’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列とを含む、工程;(b)デオキシリボヌクレオシド三リン酸と、少なくとも1種の改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸との存在下で、その第1ODNPと第2ODNPとを伸長させて、第1RERSおよび第2RERSの両方を含む伸長産物を生成する工程;(c)第1RERSを認識する制限エンドヌクレアーゼ(RE)と第2RERSを認識する制限エンドヌクレアーゼとの存在下で、工程(b)の伸長産物をテンプレートとして使用して、一本鎖核酸フラグメントを指数関数的に増幅する工程であって、この一本鎖核酸フラグメントは、25ヌクレオチド長以下である、工程;ならびに(d)工程(c)の一本鎖フラグメントのうちの少なくとも1つを特徴付けて、その遺伝子変化を同定する工程;を包含する。
【0014】
標的核酸における規定された位置での遺伝子変化を同定するための方法。この方法は、(a)第1ODNPと、第2ODNPと、標的核酸との混合物を形成する工程であって、(i)その標的核酸が、第1鎖と第2鎖とを有する二本鎖核酸である場合、その第1ODNPは、第1制限エンドヌクレアーゼ認識配列(RERS)の1本の鎖のヌクレオチド配列と、その遺伝子変化の相補体の3’側に位置する標的核酸の第1鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列とを含み、その第2ODNPは、第2RERSの1本の鎖のヌクレオチド配列と、その遺伝子変化の3’側に位置する標的核酸の第2鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列とを含むか;または(ii)その標的核酸が一本鎖核酸である場合、その第1ODNPは、第1RERSの一本の鎖のヌクレオチド配列と、その遺伝子変化の相補体の5’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列とを含み、第2ODNPは、第2RERSの1本の鎖の配列と、その遺伝子変化の3’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列とを含む、工程;(b)デオキシリボヌクレオシド三リン酸と、少なくとも1種の改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸との存在下で、第1ODNPと第2ODNPとを伸長させて、第1RERSおよび第2RERSの両方を含む伸長産物を生成する工程;(c)第1RERSと第2RERSとを認識する制限エンドヌクレアーゼ(RE)の存在下で、工程(b)の伸長産物の一本の鎖をテンプレートとして使用して、第1の一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程;(d)A1にアニールする第2の一本鎖核酸分子(T2)を提供する工程であって、T2は、5’から3’の方向に、(i)第3のRERSのセンス鎖の配列と、(ii)A1と少なくとも実質的に相補的な配列とを含む、工程;(e)A1をテンプレートとして使用して、第3の一本鎖核酸フラグメント(A2)を増幅する工程;ならびに(f)工程(c)の一本鎖フラグメントの少なくとも1つを特徴付けして、その遺伝子変化を同定する工程;を包含する。
【0015】
標的核酸中の規定された位置での遺伝子変化を同定するための方法であって、この方法は、(a)第1オリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)と、第2ODNPと、標的核酸との混合物を形成する工程であって、(i)その標的核酸が、第1鎖と第2鎖とを有する二本鎖核酸である場合、その第1ODNPは、その遺伝子変化の相補体の3'側に位置する標的核酸の第1鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、第2ODNPは、その遺伝子変化の3’側に位置する標的核酸の第2鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むか、または(ii)その標的核酸が一本鎖核酸である場合、その第1ODNPは、その遺伝子変化の5’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、第2ODNPは、その遺伝子変化の3’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、この第1ODNPと第2ODNPとは、各々さらに、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)のセンス鎖のヌクレオチド配列を含む、工程;(b)この第1ODNPおよび第2ODNPを伸長させて、2つのNERSを含む伸長産物を生成させる工程;(c)上記NERSを認識する1種以上のニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)の存在下で、工程(b)の伸長産物をテンプレートとして使用して、一本鎖核酸フラグメントを指数関数的に増幅する工程であって、この一本鎖核酸フラグメントは、25個以下のヌクレオチドを有する、工程;ならびに(d)工程(c)の一本鎖フラグメントの少なくとも1つを特徴付け、それによりその遺伝子変化を同定する工程;を包含する。
【0016】
標的核酸における規定された位置での遺伝子変化を同定するための方法。この方法は、(a)第1オリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)と、第2ODNPと、標的核酸との混合物を形成する工程であって、(i)その標的核酸が、第1鎖と第2鎖とを有する二本鎖核酸分子である場合、その第1ODNPは、その遺伝子変化の相補体の3’側に位置する標的核酸の第1鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、その第2ODNPは、その遺伝子変化の3’側に位置する標的核酸の第2鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むか、または(ii)その標的核酸が一本鎖核酸である場合、その第1ODNPは、その遺伝子変化の5’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、その第2ODNPは、その遺伝子変化の3’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、その第1ODNPおよび第2ODNPは、各々さらに、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)のセンス鎖のヌクレオチド配列を含む、工程;(b)その第1ODNPおよび第2ODNPを伸長させて、2つのNERSを含む伸長産物を生成させる工程;(c)NERSを認識する1種以上のニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)の存在下で、工程(b)の伸長産物の1本の鎖をテンプレートとして使用して、第1の一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程;(d)A1にアニールする第2の一本鎖核酸分子(T2)を提供する工程であって、T2は、5’から3’の方向に、(i)NERSのセンス鎖の配列と、(ii)A1と少なくとも実質的に相補的な配列とを含む、工程;(e)A1をテンプレートとして使用して、第3の一本鎖核酸フラグメント(A2)を増幅する工程;ならびに(f)工程(c)の一本鎖フラグメントを特徴付けることにより、その遺伝子変化を同定する工程;を包含する。好ましくは、A1、A2、または両方が、最大25ヌクレオチドを有する。
【0017】
サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する:(A)以下の(i)、(ii)、(iii)および(iv)を含む混合物を形成する工程:(i)このサンプルの核酸分子;(ii)3’から5’の向きで、以下の(a)、(b)および(c)を含む、第1の1本鎖核酸分子(T1):(a)標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的である第1配列、(b)第1のニック形成剤認識配列(NARS)のアンチセンス鎖の配列、および(c)多くとも25ヌクレオチドを有する第2配列;(iii)3’から5’の向きで、以下の(a)および(b)を含む、第2の1本鎖核酸分子(T2):(a)T1の第2配列に対して少なくとも実質的に同一である配列、および(b)第2NARSのセンス鎖の配列;ならびに(iv)この第1NARSを認識する第1ニック形成エンドヌクレアーゼ(NA)、この第2NARSを認識する第2NA、DNAポリメラーゼ、および1以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;(B)この標的核酸がこのサンプル中に存在するならば1本鎖核酸分子(A2)が指数関数的に増幅される条件にて、この混合物を維持する工程;ならびに(C)A2の存在または非存在を検出して、このサンプル中でのこの標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【0018】
サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する:(A)以下の(i)、(ii)、(iii)および(iv)を含む混合物を形成する工程:(i)このサンプルの核酸分子;(ii)3’から5’の向きで、以下の(a)および(b)を含む、第1の1本鎖核酸分子(T1):(a)標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的である配列、および(b)第1ニック形成剤認識配列(NARS)のセンス鎖の配列、(iii)3’から5’の向きで、以下の(a)および(b)を含む、第2の1本鎖核酸分子(T2):(a)第1NARSのセンス鎖の配列の3’側に位置する、T1の配列に対して少なくとも実質的に相補的である配列、および(b)第2NARSのセンス鎖の配列;ならびに(iv)この第1NARSを認識する第1ニック形成エンドヌクレアーゼ(NA)、この第2NARSを認識する第2NA、DNAポリメラーゼ、および1以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;(B)この標的核酸がこのサンプル中に存在するならば1本鎖核酸分子(A2)が増幅される条件にて、この混合物を維持する工程であって、ここで、A2は、(i)この標的核酸に対して少なくとも実質的に同一であり、そして(ii)好ましくは多くとも25ヌクレオチドを有する、工程;ならびに(C)A2の存在または非存在を検出して、このサンプル中のこの標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【0019】
サンプル中の、第1ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)を含む標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する:(A)以下の(i)、(ii)および(iii)を含む混合物を形成する工程:(i)このサンプルの核酸分子、(ii)3’から5’の向きで、以下の(a)および(b)を含む、1本鎖核酸分子(T2):(a)この第1NERSのアンチセンス鎖の配列の5’側に位置する、標的核酸分子の一部分に対して少なくとも実質的に同一である配列、および(b)第2NERSのセンス鎖の配列、ならびに(iii)この第1NERSを認識する第1ニック形成エンドヌクレアーゼ(NE);この第2NERSを認識する第2NE、DNAポリメラーゼ、および1以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;(B)この標的核酸がこのサンプル中に存在するならば1本鎖核酸分子(A2)が指数関数的に増幅される条件にて、この混合物を維持する工程;ならびに(C)A2の存在または非存在を検出して、このサンプル中でのこの標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【0020】
サンプル中の、第1ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)を含む標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する:(A)以下の(i)、(ii)、(iii)および(iv)を含む混合物を形成する工程:(i)この標的核酸分子、(ii)この標的核酸の一方の鎖に対して実質的に同一であり、かつこの第1NERSのアンチセンス鎖の配列を含む、第1の1本鎖核酸分子(T1)、(iii)3’から5’の向きで、以下の(a)および(b)を含む、第2の1本鎖核酸分子(T2):(a)この第1NERSのアンチセンス鎖の配列の5’側に位置する、T1の一部分に対して少なくとも実質的に同一である配列、および(b)第2NERSのセンス鎖の配列、ならびに(iv)この第1NERSを認識する第1ニック形成エンドヌクレアーゼ(NE);この第2NERSを認識する第2NE、DNAポリメラーゼ、および1以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;(B)この標的核酸がこのサンプル中に存在するならば1本鎖核酸分子(A2)が指数関数的に増幅される条件にて、この混合物を維持する工程;ならびに(C)A2の存在または非存在を検出して、このサンプル中でのこの標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【0021】
サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は以下を包含する:(A)第1オリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第2ODNP、およびこのサンプルの核酸分子の混合物を形成する工程であって、ここで(i)この標的核酸が、第1鎖および第2鎖を有する2本鎖核酸である場合、この第1ODNPは、第1制限エンドヌクレアーゼ認識配列(RERS)のセンス鎖のヌクレオチド配列、およびこの標的核酸の第1鎖の第1の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第2ODNPは、この標的核酸の第2鎖の第2の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第2RERSのセンス鎖の配列を含み、この第2の部分は、この標的核酸の第2鎖において第1の部分の相補体の3’側に位置するか、または(ii)この標的核酸が1本鎖核酸である場合、この第1ODNPは、第1RERSのセンス鎖のヌクレオチド配列、およびこの標的核酸の第1の部分に対して少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第2ODNPは、この標的核酸の第2の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第2RERSのセンス鎖の配列を含み、この第2の部分は、この標的核酸において第1の部分の5’側に位置する、工程;(B)この標的核酸がこのサンプル中に存在するならば、この第1RERSおよびこの第2RERSを認識する制限エンドヌクレアーゼ(RE)、デオキシリボヌクレオシド三リン酸および少なくとも1つの改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ならびにDNAポリメラーゼの存在下で1本鎖核酸分子(A2)が指数関数的に増幅される条件にて、この混合物を維持する工程であって、ここでA2は、25ヌクレオチド長以下である、工程;ならびに(C)A2の存在または非存在を検出して、このサンプル中でのこの標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【0022】
サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する:(A)第1オリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第2ODNP、およびこのサンプルの核酸分子の混合物を形成する工程であって、ここで(i)この標的核酸が、第1鎖および第2鎖を有する2本鎖核酸である場合、この第1ODNPは、第1ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)のセンス鎖のヌクレオチド配列、およびこの標的核酸の第1鎖の第1の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第2ODNPは、この標的核酸の第2鎖の第2の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第2NERSのセンス鎖の配列を含み、この第2の部分は、この標的核酸の第2鎖において第1の部分の相補体の3’側に位置するか、または(ii)この標的核酸が1本鎖核酸である場合、この第1ODNPは、第1NERSのセンス鎖の配列、およびこの標的核酸の第1の部分に対して少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第2ODNPは、この標的核酸の第2の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第2NERSのセンス鎖の配列を含み、この第2の部分は、この標的核酸において第1の部分の5’側に位置する、工程;(B)この標的核酸がこのサンプル中に存在するならば、この第1NERSおよびこの第2NERSを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)、デオキシリボヌクレオシド三リン酸およびDNAポリメラーゼの存在下で1本鎖核酸フラグメント(A2)が指数関数的に増幅される条件にて、この混合物を維持する工程であって、ここでA2は、好ましくは、25ヌクレオチド長以下である、工程;ならびに(C)A2の存在または非存在を検出して、このサンプル中でのこの標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【0023】
サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は以下を包含する:(A)第1オリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第2ODNP、およびこのサンプルの核酸分子の混合物を形成する工程であって、ここで(i)この標的核酸が、第1鎖および第2鎖を有する2本鎖核酸である場合、この第1ODNPは、第1ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)のセンス鎖のヌクレオチド配列、およびこの標的核酸の第1鎖の第1の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第2ODNPは、この標的核酸の第2鎖の第2の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第2NERSのセンス鎖の配列を含み、この第2の部分は、この標的核酸の第2鎖において第1の部分の相補体の3’側に位置するか、または(ii)この標的核酸が1本鎖核酸である場合、この第1ODNPは、第1NERSのセンス鎖のヌクレオチド配列、およびこの標的核酸の第1の部分に対して少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第2ODNPは、この標的核酸の第2の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第2NERSのセンス鎖の配列を含み、この第2の部分は、この標的核酸において第1の部分の5’側に位置する、工程;(B)この標的核酸がこのサンプル中に存在するならば、(i)この第1ODNPおよびこの第2ODNPを伸長して、この第1NERSおよびこの第2NERSの両方を含む伸長産物が生成される条件;(ii)この第1NERSおよびこの第2NERSを認識するさらにもう1つのニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)の存在下で、工程(b)のこの伸長産物の一方の鎖をテンプレートとして用いて、第1の1本鎖核酸フラグメント(A1)が増幅される条件;(iii)A1にアニーリングし得る第2の1本鎖核酸分子(T2)の存在下で、A1をテンプレートとして用いて、第3の1本鎖核酸フラグメント(A2)が増幅される条件にこの混合物を供する工程であって、A1、A2または両方は、多くとも25ヌクレオチドを有し、そしてここでT2は、5’から3’の向きで、以下の(a)および(b)を含む、工程:(a)第3のNERSのセンス鎖の配列、および(b)A1に対して少なくとも実質的に相補的な配列;ならびに(C)A2の存在または非存在を検出して、このサンプル中でのこの標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【0024】
サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する:(A)以下の(i)および(ii)を含む混合物を形成する工程:(i)このサンプルの核酸分子、および(ii)3’から5’の向きで、この標的核酸の5’部分に対して少なくとも実質的に相補的である配列、および第1のニック形成剤認識配列(NARS)のアンチセンス鎖の配列を含む、1本鎖核酸プローブ(T1)、(B)存在する場合、この標的核酸にハイブリダイズしたプローブ分子を、この標的核酸にハイブリダイズしていないプローブ分子から分離する工程;(C)存在するならば、この標的核酸にハイブリダイズしたプローブ分子、およびこの第1NARSを認識する第1ニック形成剤(NA)の存在下で増幅反応を行う工程;(D)5’から3’の向きで、以下の(i)および(ii)を含む、1本鎖核酸分子(T2)を提供する工程:(i)第2NARSのセンス鎖の配列、および(ii)この第1NARSのアンチセンス鎖の配列の5’側に位置する、この第1の1本鎖核酸プローブの一部分に対して少なくとも実質的に同一である配列、(E)この第2NARSを認識する第2NAの存在下で増幅反応を行う工程;(F)工程(E)の増幅産物の存在または非存在を検出して、このサンプル中での標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【0025】
サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する:(A)以下の(i)および(ii)を含む混合物を形成する工程:(i)このサンプルの核酸分子、および(ii)以下の(a)および(b)を含む、部分的に2本鎖の核酸プローブ:(a)第1NARSのセンス鎖の配列、この第1NARSのアンチセンスの配列、または両方;および(b)この鎖自体またはその伸長産物が、この第1NARSを認識する第1ニック形成剤(NA)によってニック形成可能なニック形成部位(NS)を含む鎖中の5’突出部、またはこの鎖もその伸長産物もこのNSを含まない鎖中の3’突出部であって、ここで、突出部は、この標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含む、工程;(B)存在する場合、この標的核酸にハイブリダイズしたプローブ分子を、この標的核酸にハイブリダイズしていないプローブ分子から分離する工程;(C)存在するならば、この標的核酸にハイブリダイズしたプローブ分子、およびこの第1NARSを認識する第1ニック形成剤(NA)の存在下で増幅反応を行う工程;(D)5’から3’の向きで、以下の(i)および(ii)を含む、1本鎖核酸分子(T2)を提供する工程:(i)第2NARSのセンス鎖の配列、および(ii)この第1NARSのアンチセンス鎖の配列の5’側に位置する、この核酸プローブの一部分に対して少なくとも実質的に同一である配列、(E)この第2NARSを認識する第2NAの存在下で増幅反応を行う工程;(F)工程(E)の増幅産物の存在または非存在を検出して、このサンプル中での標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【0026】
cDNA分子中の2つの特定のエキソン間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する:(A)以下の(i)および(ii)を含む少なくとも部分的に2本鎖の核酸分子(N1)を提供する工程:(i)第1ニック形成剤認識配列(NARS)のセンス鎖の配列、およびこの第1NARSのアンチセンス鎖の配列のうちの少なくとも一方、ならびに(ii)このcDNA分子の一部分の少なくとも一方の鎖であって、この部分は、この2つのエキソンの間に連結部を含む疑いがある、工程;(B)この第1NARSを認識するニック形成剤(NA)、DNAポリメラーゼ、および1以上のデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で第1の1本鎖核酸分子(A1)を増幅する工程であって、ここで、この増幅する工程は、このcDNAの一部分を、このポリメラーゼについてのテンプレートとして用いる、工程;(C)5’から3’の向きで、以下の(i)および(ii)を含む、第2の1本鎖核酸分子(T2)を提供する工程:(i)第2NARSのセンス鎖の配列、および(ii)A1に対して少なくとも実質的に相補的である配列;(D)T2、A1、この第1NA、この第2NARSを認識する第2NA、このDNAポリメラーゼ、およびこのデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、第3の1本鎖核酸分子(A2)を増幅する工程であって、ここで、A2は、A1に対して少なくとも実質的に相補的である、工程;ならびに(E)A2を検出および/または特徴付けして、このcDNA分子の連結部の存在または非存在を決定する工程。
【0027】
cDNA分子中の2つのエキソン間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、ここで、この連結部は、存在する場合、このcDNA分子中の第1ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)のアンチセンス鎖の配列の5’側に位置し、この方法は、以下を包含する:(A)以下の(i)、(ii)および(iii)を含む混合物を形成する工程:(i)このcDNA分子、(ii)3’から5’の向きで、以下の(a)および(b)を含む、1本鎖核酸分子(T2):(a)この第1NERSのアンチセンス鎖の配列の5’側に位置する、このcDNA分子の一部分に対して少なくとも実質的に同一である配列、および(b)第2NERSのセンス鎖の配列、ならびに(iii)この第1NERSを認識する第1ニック形成エンドヌクレアーゼ(NE);この第2NERSを認識する第2NE、DNAポリメラーゼ、および1以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;(B)1本鎖核酸分子(A2)を指数関数的に増幅する条件にて、この混合物を維持する工程;ならびに(C)A2を特徴付けして、このcDNA分子中での連結部の存在または非存在を決定する工程。
【0028】
cDNA分子中の遺伝子の上流エキソン(エキソンA)と下流エキソン(エキソンB)との間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する:(A)第1オリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第2ODNP、およびこのcDNA分子の混合物を形成する工程であって、ここで、(i)この第1ODNPは、エキソンAのアンチセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列をこのアンチセンス鎖中のエキソンAの5’末端付近に含み、(ii)この第2ODNPは、エキソンBのセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列をこのセンス鎖中のエキソンBの5’末端付近に含み、そして(iii)この第1ODNPおよびこの第2ODNPのうちの少なくとも一方は、第1ニック形成剤認識配列(NARS)のセンス鎖の配列をさらに含む、工程;ならびに(B)エキソンAおよびエキソンBの両方がこのcDNA中に存在するならば第1の1本鎖核酸(A1)が増幅される条件下にて、この第1NARSを認識するニック形成剤(NA)の存在下で、第1増幅反応を行う工程;(C)5’から3’の向きで、以下の(i)および(ii)を含む、第2の1本鎖核酸分子(T2)を提供する工程:(i)第2NARSのセンス鎖の配列、および(ii)A1に対して少なくとも実質的に相補的な配列;(D)エキソンAおよびエキソンBの両方が、このcDNA分子中に存在するならば、A1をテンプレートとして用いて、第3の1本鎖核酸フラグメント(A2)が増幅される条件下にて、この第2NARSを認識する第2NAの存在下で、第2増幅反応を行う工程;ならびに(G)A2を検出および/または特徴付けして、このcDNA分子中でのエキソンAとエキソンBとの間の連結部の存在または非存在を決定する工程。
【0029】
cDNA分子中の遺伝子の上流エキソン(エキソンA)と下流エキソン(エキソンB)との間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する:(A)第1オリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第2ODNP、およびこのcDNA分子の混合物を形成する工程であって、ここで、(i)この第1ODNPは、以下の(a)および(b)を含む:(a)エキソンAのアンチセンス鎖中のエキソンAの5’末端付近に、このアンチセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列、および(b)第1ニック形成剤認識配列(NARS)のセンス鎖の配列;そして(ii)この第2ODNPは、以下の(a)および(b)を含む:(a)エキソンBのセンス鎖中のエキソンBの5’末端付近に、このセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列、および(b)第2NARSのセンス鎖の配列;(B)エキソンAおよびエキソンBの両方がこのcDNA中に存在するならば第1の1本鎖核酸(A1)が増幅される条件下にて、この第1NARSを認識する第1ニック形成剤(NA)およびこの第2NARSを認識する第2NAの存在下で、第1増幅反応を行う工程;(C)5’から3’の向きで、以下の(i)および(ii)を含む、第2の1本鎖核酸分子(T2)を提供する工程:(i)第3のNARSのセンス鎖の配列、および(ii)A1に対して少なくとも実質的に相補的な配列;(D)エキソンAおよびエキソンBの両方が、このcDNA分子中に存在するならば、A1をテンプレートとして用いて、第3の1本鎖核酸フラグメント(A2)が増幅される条件下にて、この第2NARSを認識する第3NAの存在下で、第2増幅反応を行う工程;ならびに(E)A2を検出および/または特徴付けして、このcDNA分子中でのエキソンAとエキソンBとの間の連結部の存在または非存在を決定する工程。
【0030】
cDNA分子中の遺伝子の上流エキソン(エキソンA)と下流エキソン(エキソンB)との間の接合部の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下の工程を包含する:(A)第1オリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第2ODNP、およびcDNA分子の混合物を形成する工程であって、ここで、(i)第1ODNPは、(a)アンチセンス鎖中のエキソンAの5’末端付近のエキソンAのアンチセンス鎖の一部に少なくとも実質的に相補的な配列、および(b)第1ニック形成剤認識配列(NARS)のセンス鎖の配列、を含み;そして(ii)第2ODNPは、:(a)センス鎖中のエキソンBの5’末端付近のエキソンBのセンス鎖の一部に少なくとも実質的に相補的な配列、および(b)第2NARSのセンス鎖の配列を含む、工程;(B)エキソンAおよびエキソンBの両方がcDNA分子中に存在する場合に、一本鎖核酸フラグメント(A2)を指数関数的に増幅する条件下にこの混合物を維持する工程;ならびに(C)A2を検出および/または特徴付けして、cDNA分子中のエキソンAとエキソンBとの間の接合部の存在または非存在を決定する工程。
【0031】
以下の基準を単独または任意の組合せで使用して、上記および本明細書中の他の部分に概略を示すように本発明の方法をさらに記載し、ここでこれらの基準は、例示のみであり、そして本明細書の他の箇所に記述され得る他の基準をまた使用して、本発明の方法をさらに記載し得る:第1NARSは、第2NARSと同一である;第1ニック形成剤は、第2ニック形成剤と同じである;方法における任意の1つ以上のNARSがNERSである;第1NAおよび第2NAの両方が、ニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)である;NEが、N.BstNB Iである;NEが、N.Alw Iである;第1NEおよび第2NEの両方が、N.BstNB Iである;第1ニック形成剤または第2ニック形成剤の少なくとも一方がニック形成エンドヌクレアーゼである;第1NAおよび第2NAの両方が、制限エンドヌクレアーゼ(RE)である;第1NARS、第2NARSおよび第3NARS(3つのNARSが、本発明の実施形態において特定される場合)が、互いに同一である;第1NARS、第2NARSおよび第3NARSの各々が、ニック形成エンドヌクレアーゼにより認識される;第1NARS、第2NARSおよび第3NARSの少なくとも1つが、ニック形成エンドヌクレアーゼにより認識される;この方法の、任意の1つ、または任意の2つ、または任意の3つ、または任意の4つ、または任意の5つ、または任意の6つ、または任意の7つ、または任意の8つ、または任意の9つ、または任意の10などの工程(例えば、工程(A)、工程(B)、工程(C)および工程(D)、または例えば、工程(a)〜工程(j))が、単一の容器で行われる;一本鎖核酸フラグメントの増幅が、等温条件下で行われる;各増幅反応が、50℃〜70℃の範囲内の1つ以上の温度で行われる;各増幅反応が、60℃または約60℃で行われる;各増幅反応が、最高温度と最低温度との間の温度で行われ、ここで、最高温度が最低温度から20℃以内であり;各増幅反応が、最高温度と最低温度との間の温度で行われ、ここで、最高温度が最低温度の15℃以内であり;各増幅反応が、最高温度と最低温度との間の温度で行われ、ここで、最高温度が最低温度の10℃以内であり;各増幅反応が、最高温度と最低温度との間の温度で行われ、ここで、最高温度が最低温度の5℃以内であり;N1が、第1NERSのセンス鎖のヌクレオチド配列を含み;N1が、第1NERSのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含み;第1NAおよび第2NAの両方が、制限エンドヌクレアーゼ(RE)であり;N1が、トリガーオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)および一本鎖核酸(T1)をアニーリングすることにより与えられ、ここでT1は、第1NERSのセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかのヌクレオチド配列を含み;N1が、5’側から3’側に以下:(A)第1NARSのアンチセンス鎖の配列;および(B)トリガーODNPの少なくとも一部に対して少なくとも実質的に相補的である配列、を含む一本鎖標的核酸(T1)に対してトリガーオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)をアニーリングさせることにより与えられる場合、T1の配列(B)が、トリガーODNPの少なくとも一部に正確に相補的である;T1がT2に対して実質的に同一である;T2の3’末端が、リン酸基に結合される;T1の3’末端が、リン酸基に結合される;T1が、T2と正確に同一である;T1が、T2に対して実質的にも正確にも同一でない;N1中のNARSのアンチセンス鎖に対して5’側に位置するN1の部分に少なくとも実質的に同一であるT2のヌクレオチド配列が、実際に、第1NARSのアンチセンス鎖に対して5’側に位置するN1の部分に正確に同一である;T3が、テンプレート配列T2の少なくとも一部に少なくとも実質的に同一である配列を含む場合、一実施形態においてT3が、テンプレート配列T2の少なくとも一部に正確に同一である配列を含む;A2が、A1中のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含む;A2が、A1中のヌクレオチド配列に正確に同一であるヌクレオチド配列を含む;A1が、A2中のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含む;A1が、A2中のヌクレオチド配列に正確に同一であるヌクレオチド配列を含む;A2およびA1が、同一である;Alが、A2と実質的に同一である;A2が、A1と実質的に同一である;A1が、A2と正確に同一である;A1が、A2と実質的に同一でも正確に同一でもない;A1が、トリガーODNPと実質的に同一である;A1が、トリガーODNP正確に同一である;A2が、トリガーODNPと実質的に同一である;A2が、トリガーODNPと正確に同一である;A1が、少なくとも5、もしくは少なくとも6、もしくは少なくとも7、もしくは少なくとも8、もしくは少なくとも9、もしくは少なくとも10、もしくは少なくとも11、もしくは少なくとも12、もしくは少なくとも13、もしくは少なくとも14、もしくは少なくとも15、もしくは少なくとも16、もしくは少なくとも17、もしくは少なくとも18、もしくは少なくとも19、もしくは少なくとも20、もしくは少なくとも21、もしくは少なくとも22、もしくは少なくとも23、もしくは少なくとも24、もしくは少なくとも25ヌクレオチド長であり、一方、さらにまたはあるいは、A1は、40以下、もしくは39以下、もしくは38以下、もしくは37以下、もしくは36以下、もしくは35以下、もしくは34以下、もしくは33以下、もしくは32以下、もしくは31以下、もしくは30以下、もしくは29以下、もしくは28以下、もしくは27以下、もしくは26以下、もしくは25以下、もしくは24以下、もしくは23以下、もしくは22以下、もしくは21以下、もしくは20以下、もしくは19以下、もしくは18以下、もしくは17以下、もしくは16以下、もしくは15以下、もしくは14以下、もしくは13以下、もしくは12以下、もしくは11以下、もしくは10以下のヌクレオチド長であり、ここで、A1のヌクレオチド長に対する示された任意の上限は、A1のヌクレオチド長に対する任意の示された下限と組み合わされ得、その結果、例えば、A1は、8〜24ヌクレオチド長であり得るか、12〜17のヌクレオチド長である;A2は、少なくとも5、もしくは少なくとも6、もしくは少なくとも7、もしくは少なくとも8、もしくは少なくとも9、もしくは少なくとも10、もしくは少なくとも11、もしくは少なくとも12、もしくは少なくとも13、もしくは少なくとも14、もしくは少なくとも15、もしくは少なくとも16、もしくは少なくとも17、もしくは少なくとも18、もしくは少なくとも19、もしくは少なくとも20、もしくは少なくとも21、もしくは少なくとも22、もしくは少なくとも23、もしくは少なくとも24、もしくは少なくとも25ヌクレオチド長であり、一方、さらにまたはあるいは、A2は、40以下、もしくは39以下、もしくは38以下、もしくは37以下、もしくは36以下、もしくは35以下、もしくは34以下、もしくは33以下、もしくは32以下、もしくは31以下、もしくは30以下、もしくは29以下、もしくは28以下、もしくは27以下、もしくは26以下、もしくは25以下、もしくは24以下、もしくは23以下、もしくは22以下、もしくは21以下、もしくは20以下、もしくは19以下、もしくは18以下、もしくは17以下、もしくは16以下、もしくは15以下、もしくは14以下、もしくは13以下、もしくは12以下、もしくは11以下、もしくは10ヌクレオチド長であり、ここでA2のヌクレオチド長に対して述べた任意の上限は、A2のヌクレオチド長に対して述べた任意の下限と組み合わされ得、その結果、A2は、例えば、8〜24ヌクレオチド長、または12〜17ヌクレオチド長であり得る;T2分子の最初の数が、T1分子の最初の数より多い;N1は、ゲノムDNA由来である;N1が、ゲノムDNAの一部である;標的核酸が、変性二本鎖核酸の一方の鎖である;標的核酸が、二本鎖ゲノム核酸またはcDNAの一方の鎖である;標的核酸が、RNA分子である;標的核酸が、細菌から得られた核酸由来である;標的核酸が、ウイルスから得られた核酸由来である;標的核酸が、真菌から得られた核酸由来である;標的核酸が、寄生生物由来の核酸由来である;トリガーODNPが、二本鎖ゲノム核酸またはcDNAの一方の鎖である;トリガーODNPが、RNA分子である;トリガーODNPが、細菌から得られた核酸由来である;トリガーODNPが、ウイルスから得られた核酸由来である;トリガーODNPが、真菌から得られた核酸由来である;トリガーODNPが、寄生生物由来の核酸由来である;デオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも1つが、標識される;デオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも1つが、放射性標識に連結される;デオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも1つが、酵素標識に連結される;デオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも1つが、標識として機能する蛍光色素に連結される;デオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも1つが、標識として機能するジゴキシゲニン(digoxidenin)に連結される; デオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも1つが、ビオチンに連結される;方法の全ての工程において同じ型のDNAポリメラーゼが使用される;DNAポリメラーゼが、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損である;DNAポリメラーゼが、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損であり、そしてexo−Vent、exo−Deep Vent、exo−Bst、exo−Pfu、exo−Bca、DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメント、T5 DNAポリメラーゼ、Phi29 DNAポリメラーゼ、ファージM2 DNAポリメラーゼ、ファージPhiPRD1 DNAポリメラーゼ、Sequenase、PRD1 DNAポリメラーゼ、9°NmTMDNAポリメラーゼおよびT4 DNAポリメラーゼホモエンザイム(homoenzyme)から選択され、ここでこれらの列挙されたDNAポリメラーゼの任意の2つ以上が組み合わされて本発明の方法において使用されるDNAポリメラーゼが選択される群を形成し得、例えば、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼは、exo−Bstポリメラーゼ、exo−Bcaポリメラーゼ、exo−Ventポリメラーゼ、9°NmTM DNAポリメラーゼまたはexo−Deep Ventポリメラーゼである;DNAポリメラーゼが、鎖置換活性を有する;各増幅反応が、鎖置換促進因子(facilitator)の存在下で行われる;鎖置換促進因子が、増幅の間に使用され、ここでこの鎖置換促進因子は、BMRF1ポリメラーゼ補助(accessory)サブユニット、アデノウイルスDNA結合タンパク質、単純疱疹ウイルスタンパク質ICP8、一本鎖DNAタンパク質、ファージT4遺伝子32タンパク質、子ウシ胸腺ヘリカーゼ、およびトレハロースの群から選択され、ここで本発明は、列挙した促進因子の任意の2つ以上を組み合わせて、本発明の実施形態を実施するために促進因子が選択される群を形成し得ることを提供する;鎖置換促進因子はトレハロースである。
【0032】
本発明の方法のいずれも、増幅された核酸を検出する工程(例えば、定量的または定性的のいずれかでA2の形成を検出する工程)を包含し得るか、好ましくは包含する。一実施形態において、この検出は、発光分光法または分光測定法、蛍光分光法または分光測定法、質量分析、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光、および電気泳動から選択される技術により少なくとも部分的に実行され、ここで列挙された技術の任意の2つ、3つ、4つまたはそれ以上のメンバーを、本発明の実施形態において利用される技術が選択され得る技術の群を形成するように一緒にグループ化し得る(例えば、検出は、質量分析または液体クロマトグラフィーにより実行され得る)。一実施形態において、検出は、二本鎖核酸に特異的に結合する蛍光インターカレート剤の使用を伴う。
【0033】
さらなる局面において、本発明は、以下を提供する:
組成物であって、以下:(A)一方の鎖が5’側から3’側に以下を含む、第1の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子(例えば、本明細書中に記載されるN1またはH1):(i)多くとも25ヌクレオチド長の配列、および(ii)第1ニック形成剤認識配列(NARS)のアンチセンス鎖の配列;ならびに(B)一方の鎖が、5’側から3’側に以下を含む、第2の少なくとも二本鎖の核酸分子(例えは、本明細書中に記載されるN2またはH2):(i)第2NARSのセンス鎖の配列、および(ii)第1核酸分子中の第1NARSのアンチセンス鎖の配列に対して5’側に位置する配列に少なくとも実質的に同一な配列、を含む組成物。
【0034】
組成物であって、以下:(a)一方の鎖が、第1ニック形成剤認識配列(NARS)のセンス鎖の配列を含む、第1の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子(例えば、本明細書中に記載されるN1またはH1);ならびに(b)一方の鎖が、5’側から3’側に以下を含む第2の少なくとも二本鎖の核酸分子(例えば、本明細書中に記載されるN2またはH2):(i)第2NARSのセンス鎖の配列、および(ii)第1核酸分子中の第1NARSのセンス鎖の配列に対して3’側に位置する配列に少なくとも実質的に相補的である配列、を含み、ここで第1NARSを認識するニック形成剤、DNAポリメラーゼ、および1つ以上のヌクレオシド三リン酸の存在下において、第1核酸分子をテンプレートとして使用して増幅された一本鎖核酸フラグメントは、多くとも25個のヌクレオチドを有する。
【0035】
これらの組成物において、以下のさらなる基準および/または成分を使用して、組成物を記載し得、そして本発明の方法に関しては上記の基準も同様である:この組成物は、第1NARSを認識する第1NAおよび第2NARSを認識する第2NAをさらに含む;この組成物は、第1NARSおよび第2NARSの両方を認識するニック形成剤をさらに含む;この組成物は、第1NERSおよび第2NERSの両方を認識するニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)をさらに含む;この組成物は、第1NARSおよび第2NARSの両方を認識するニック形成剤(NA)をさらに含む;この組成物は、N.BstNB Iをさらに含む;この組成物は、DNAポリメラーゼをさらに含む;この組成物は、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損であるDNAポリメラーゼをさらに含む;この組成物は、exo−Vent、exo−Deep Vent、exo−Bst、exo−Pfu、exo−Bca、DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメント、T5 DNAポリメラーゼ、Phi29 DNAポリメラーゼ、ファージM2 DNAポリメラーゼ、ファージPhiPRD1 DNAポリメラーゼ、Sequenase、PRD1 DNAポリメラーゼ,9°NmTM DNAポリメラーゼおよびT4 DNAポリメラーゼホモエンザイム(homoenzyme)からなる群から選択されるDNAポリメラーゼをさらに含む;この組成物は、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼをさらに含む;この組成物は、鎖置換促進因子をさらに含む;この組成物は、BMRF1ポリメラーゼ補助サブユニット、アデノウイルスDNA結合タンパク質、単純疱疹ウイルスタンパク質ICP8、一本鎖DNA結合タンパク質、ファージT4遺伝子32タンパク質、子ウシ胸腺ヘリカーゼ、およびトレハロースの群から選択される鎖置換促進因子をさらに含み、ここでこの群の1つ以上のメンバーは、組み合わされて、本発明の実施形態において促進因子が選択される群を形成し得る;この組成物は、トレハロースを含む;この組成物は、標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸を含む。この組成物は、T2中の第2NARSのアンチセンス鎖の配列に対して5’側に位置する配列に少なくとも実質的に相補的である標識されたオリゴヌクレオチドを含む。この組成物は、蛍光インターカレート剤を含む。
【0036】
NARSを含む本発明の方法または化合物または組成物のいずれかにおいて、このNARSは、1つ以上のミスマッチヌクレオチドを含み得る。換言すると、NARSを形成するヌクレオチド塩基対の1つ以上は、従来のワトソン−クリック塩基対合則に従ってハイブリダイズしないかもしれない。しかし、ミスマッチヌクレオチドがこのNARSに存在する場合、少なくともNARSのセンス鎖を形成するのに必要な全てのヌクレオチドが存在する。一実施形態において、NARSにミスマッチ塩基対が存在せず、さらにこのNARSに存在する全てのヌクレオチドが相補鎖中のヌクレオチドと、従来のワトソン−クリック塩基対合則に従って対になる。一実施形態において、NARSは、ミスマッチ塩基対を含む。一実施形態において、NARSに1つのミスマッチ塩基対が存在するが、別の実施形態では、NARSに2つのミスマッチ塩基対が存在し、別の実施形態では、NARSを形成する全ての塩基対が、ミスマッチであり、別の実施形態では、NARSを形成する塩基対のn−1個はミスマッチであり、ここでn個の塩基対がNARSを形成する。本発明が第1NARSおよび第2NARSの両方を利用する一実施形態において、第1NARSに存在するミスマッチはまた、第2NARSにも存在する。本発明が第1NARSおよび第2NARSの両方を利用する一実施形態において、第1NARSに存在するミスマッチは、第2NARSには存在しない。本発明が第1NARSおよび第2NARSの両方を利用する一実施形態において、第1NARSは、ミスマッチ塩基対を含まないが、第2NARSは、1つ以上のミスマッチ塩基対を含む。一実施形態において、NARS中にマッチしないヌクレオチドが存在する。別の実施形態において、NARSのセンス鎖を形成するヌクレオチドがマッチしない。別の実施形態において、NARSは、マッチしないヌクレオチドを含む。
【0037】
また、本発明の方法、化合物および組成物において、1つ以上の核酸分子は、固体支持体に固定化され得る。代表的に、この固定化は、ハイブリダイズした物質とハイブリダイズしていない物質の予備的分離を可能にする。種々の実施形態において:第1ODNPが固定化される;第2ODNPが固定化される;第1ODNPおよび第2ODNPの両方が固定化される;標的核酸が固定化される;T2、または各T2が固定化される;固定化が、共有結合を介して固体支持体に対するものである。適切な固体支持体は、シリカ、プラスチックおよび金属のような材料から作製される。
【0038】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すると明らかとなる。
【0039】
(発明の詳細な説明)
本発明は、ニック形成剤を使用する、核酸の指数関数的な増幅のための単純かつ効率的な方法およびキットを提供する。この増幅は、等温的に行なわれ得、転写ベースではない。これらの方法およびキットは、遺伝的バリエーションの検出、病原体または疾患の診断、および差次的スプライシング分析のような多くの領域において有用である。
【0040】
(取り決め/定義)
本発明のより詳細な説明を提供する前に、以下のように、本明細書中で使用される場合の取り決めを規定し、そして定義を提供することは、本発明の理解により有用であり得る。さらなる定義もまた、本発明の記載の全体にわたって提供される。
【0041】
用語「3’」および「5’」は、核酸の一本鎖内の特定の部位の位置を記載するために、本明細書中で使用される。核酸内の位置が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列「に対して3’(側)」または「の3’(側)」である場合、これは、その位置が参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の3’末端と核酸の鎖の3’ヒドロキシルとの間に位置することを意味する。同様に、核酸内の位置が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列「に対して5’(側)」または「の5’(側)」である場合、これは、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の5’末端と核酸のその鎖の5’リン酸との間に位置することを意味する。さらに、ヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列「に対してすぐ3’(側)」または「のすぐ3’(側)」である場合、これは、このヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の3’末端にすぐ隣接することを意味する。同様に、ヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列「に対してすぐ5’(側)」または「のすぐ5’(側)」である場合、これは、このヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の5’末端にすぐ隣接することを意味する。
【0042】
「天然に存在する核酸」とは、天然に存在する核酸分子(例えば、全長ゲノムDNA分子またはmRNA分子)をいう。
【0043】
「単離された核酸分子」とは、任意の天然に存在する核酸に対して、または3つより多くの別々の遺伝子にわたる天然に存在するゲノム核酸の任意のフラグメントの核酸分子に対して同一でない、核酸分子をいう。
【0044】
本明細書中で使用される場合、「ニック形成」は、完全に二本鎖の核酸分子または部分的に二本鎖の核酸分子の二本鎖の部分の、ニック形成を行う酵素によって認識されるヌクレオチド配列に対する特定の位置での一方の鎖のみの切断をいう。核酸がニック形成される特定の位置は、「ニック形成部位」(NS)といわれる。
【0045】
「ニック形成剤」(NA)は、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子の特定のヌクレオチド配列を認識し、そしてこの認識配列に対して特定の位置で核酸分子の一方の鎖のみを切断する酵素である。ニック形成剤としては、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子が、半改変された認識/切断配列を含む場合、ニック形成エンドヌクレアーゼ(例えば、N.BstNB I)および制限エンドヌクレアーゼ(例えば、HincII)が挙げられるがこれらに限定されず、この半改変された認識/切断配列において、一本の鎖は、制限エンドヌクレアーゼによるその鎖(すなわち、誘導体化されたヌクレオチドを含む鎖)の切断を阻止する少なくとも1つの誘導体化されたヌクレオチドを含む。
【0046】
本明細書中で使用される場合、「ニック形成エンドヌクレアーゼ」(NE)は、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子のヌクレオチド配列を認識し、そして認識配列に対して特定の位置で核酸分子の一方の鎖のみを切断するエンドヌクレアーゼをいう。少なくとも1つの誘導体化されたヌクレオチドを含むことによって改変され、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子の誘導体化されたヌクレオチド含有鎖の切断を阻止する、その認識配列を必要とする、制限エンドヌクレアーゼ(RE)と違って、NEは、代表的に、ネイティブなヌクレオチドのみを含むヌクレオチド配列を認識し、そしてこのヌクレオチド配列を含む完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子の一方の鎖のみを切断する。
【0047】
本明細書中で使用される場合、「ネイティブなヌクレオチド」は、アデニル酸、グアニル酸、シチジル酸、チミジル酸またはウリジル酸をいう。「誘導体化されたヌクレオチド」は、ネイティブなヌクレオチドではないヌクレオチドをいう。
【0048】
NAが認識する完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子のヌクレオチド配列は、「ニック形成剤認識配列」(NARS)といわれる。同様に、NEが認識する完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子のヌクレオチド配列は、「ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列」(NERS)といわれる。REが認識する特定の配列は、「制限エンドヌクレアーゼ認識配列」(RERS)といわれる。本明細書中で使用される場合、「半改変されたRERS」は、認識配列の一方の鎖が、少なくとも1つの誘導体化されたヌクレオチド(例えば、α−チオデオキシヌクレオチド)を含み、これは、RERSを認識するREによるその鎖(すなわち、認識配列内に誘導体化されたヌクレオチドを含む鎖)の切断を阻止する二本鎖RERSをいう。
【0049】
特定の実施形態において、NARSは、配列の一方の鎖の各ヌクレオチドが、もう一方の鎖の対応する位置のヌクレオチドに対して相補的である二本鎖ヌクレオチド配列である。このような実施形態において、NARSを認識するNAによってニック形成可能なNSを含む鎖におけるNARSの配列は、「NARSのセンス鎖の配列」または「二本鎖NARSのセンス鎖の配列」といわれ、一方、NSを含まない鎖におけるNARS配列は、「NARSのアンチセンス鎖の配列」または「二本鎖NARSのアンチセンス鎖の配列」といわれる。
【0050】
同様に、NERSが、一方の鎖がもう一方の鎖に厳密に相補的である二本鎖ヌクレオチド配列である実施形態において、NERSを認識するNEによってニック形成可能なNSを含む鎖に位置するNERSの配列は、「NERSのセンス鎖の配列」または「二本鎖NERSのセンス鎖の配列」といわれ、一方、NSを含まない鎖に位置するNERSの配列は、「NERSのアンチセンス鎖の配列」または「二本鎖NERSのアンチセンス鎖の配列」といわれる。例えば、例示的なニック形成エンドヌクレアーゼ(N.BstNB I)の認識配列およびニック形成部位は、以下に示され、切断部位を示すために「黒逆三角形」を用い、そして任意のヌクレオチドを示すためにNを用いる:
【0051】
【化1】
【0052】
N.BstNB I認識配列のセンス鎖の配列は、5’−GAGTC−3’であるのに対して、アンチセンス鎖の配列は、5’−GACTC−3’である。
【0053】
同様に、半改変されたRERSを認識するREによってニック形成可能なNSを含む鎖(すなわち、いずれの誘導体化されたヌクレオチドも含まない鎖)に位置する半改変されたRERSの配列は、「半改変されたRERSのセンス鎖の配列」といわれ、半改変されたRERSを含む核酸の「半改変されたRERSのセンス鎖」に位置し、一方、NSを含まない鎖(すなわち、誘導体化されたヌクレオチドを含む鎖)における半改変されたRERSの配列は、「半改変されたRERSのアンチセンス鎖の配列」といわれ、半改変されたRERSを含む核酸の「半改変されたRERSのアンチセンス鎖」に位置する。
【0054】
特定の他の実施形態において、NARSは、1つ以上のヌクレオチドミスマッチを有する最大限に部分的に二本鎖のヌクレオチド配列であるが、上記されるような二本鎖のNARSのインタクトなセンス配列を含む。本明細書中で使用される慣例に従って、NARSを記載する文脈において、2つの核酸分子が、互いにアニールし、ハイブリダイズされた産物を形成し、このハイブリダイズされた産物がNARSを含み、そしてハイブリダイズされた産物のNARS内に少なくとも1つのミスマッチ塩基対が存在する場合、このNARSは、単に部分的に二本鎖であると考えられる。このようなNARSは、特定のニック形成剤(例えば、N.BstNB I)によって認識され得、このニック形成剤は、これらのニック形成活性に対して二本鎖認識配列の一方の鎖のみを必要とする。例えば、N.BstNB IのNARSは、特定の実施形態において、以下のようなインタクトなセンス鎖を含み得:
5’−GAGTC−3’
3’−NNNNN−5’
ここで、Nは、任意のヌクレオチドを示し、1つの位置のNは、他の位置のNと同一であってもそうでなくてもよいが、この認識配列の中に少なくとも1つのミスマッチ塩基対が存在する。この状況において、NARSは、少なくとも1つのミスマッチヌクレオチドを有するとして特徴付けられる。
【0055】
特定の他の実施形態において、NARSは、1つ以上の一致していないヌクレオチドを有する部分的または完全に一本鎖のヌクレオチド配列であるが、上記されるように、二本鎖NARSのインタクトなセンス鎖を含む。本明細書中で使用される慣例に従って、NARSを記載する文脈において、2つの核酸分子(すなわち、第1および第2の鎖)が、互いにアニールし、ハイブリダイズされた産物を形成し、このハイブリダイズされた産物が、NAによって認識される第1の鎖内のヌクレオチド配列を含み(すなわち、ハイブリダイズされた産物は、NARSを含む)、そしてNAによって認識される配列中の少なくとも1つのヌクレオチドが、ハイブリダイズされた産物が形成される場合に、第2の鎖中のヌクレオチドに対応しない(すなわち、それと向かい合わない)場合、このハイブリダイズされた産物のNARS内に少なくとも1つの一致しないヌクレオチドが存在し、そしてこのNARSが部分的または完全に一本鎖であると考えられる。このようなNARSは、特定のニック形成剤(例えば、N.BstNB I)によって認識され得、このニック形成剤は、これらのニック形成活性のために、二本鎖認識配列の一方の鎖のみを必要とする。例えば、N.BstNB IのNARSは、特定の実施形態において、以下のようなインタクトなセンス鎖を含み得:
5’−GAGTC−3’
3’−N0−4−5’
(ここで、「N」は、任意のヌクレオチドを示し、0−4は、ヌクレオチド「N」の数を示し、1つの位置での「N」は、別の位置での「N」と同じであってもそうでなくてもよい)、この鎖は、N.BstNB Iの二本鎖認識配列のセンス鎖の配列を含む。この例において、相補鎖中の対応するヌクレオチドが存在しないという点において、G、A、G、TまたはCの少なくとも1つは、一致しない。この状況は、例えば、ハイブリダイズされた産物中に「ループ」が存在し、特に、センス配列がループ内に完全にまたは部分的に存在する場合、生じる。
【0056】
本明細書中に使用される場合、句「核酸分子を増幅すること」または「核酸分子の増幅」は、特定の核酸分子の2つ以上のコピーを作製することをいう。「核酸分子を指数関数的に増幅すること」または「核酸分子の指数関数的増幅」は、2つ以上の核酸増幅反応を含むタンデムな増幅系による、特定の核酸分子の増幅をいう。このような系において、第1の増幅反応からの増幅産物は、第2の核酸増幅反応のための、開始増幅プライマーとして機能する。本明細書中で使用される場合、用語「核酸増幅反応」は、核酸分子(T)を使用して、核酸分子(A)の1つより多くのコピーを作製するためのプロセスをいい、この核酸分子(T)は、テンプレートとして核酸分子Aの配列に相補的な配列を含む。本発明に従って、第1および第2の核酸増幅反応の両方は、ニック形成反応およびプライマー伸長反応を使用する。
【0057】
本明細書中で使用される場合、「開始プライマー」は、テンプレート核酸にアニールするプライマーであり、核酸増幅反応を開始する。開始プライマーは、開始プライマー伸長のためのプライマーとして機能しなければならないが、任意の続いてのプライマー伸長のためのプライマーである必要はない。例えば、プライマーA1がテンプレート核酸T1の一部にアニールし、このテンプレート核酸T1が、NARSのセンス鎖に対して3’側の位置で、NARSのセンス鎖の配列を含むと仮定のこと。DNAポリメラーゼの存在下において、A1の3’末端は、二本鎖NARSを含む、二本鎖の核酸分子または部分的に二本鎖の核酸分子(H1)を産生するためのテンプレートとしてT1を使用して伸長される。NARSを認識するNAの存在下において、H1は、開始プライマーA1に相補的な鎖においてニック形成される。ニック形成部位に3’末端を含み、開始プライマーA1を含まない鎖は、NAおよびDNAポリメラーゼの存在下において、続いてのプライマー伸長のためのプライマーとして機能し得る。A1は、開始プライマーとみなされるが、第1のプライマー伸長に対してのみプライマーとして機能するが、続いてのプライマー伸長に対しては、プライマーとして機能しない。
【0058】
「トリガーオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)」は、タンデム核酸増幅系の第1の核酸増幅反応におけるプライマーとして機能するODNPである。これは、この系の他の必要とされる成分(例えば、DNAポリメラーゼ、NA、デオキシヌクレオシド三リン酸、第1の増幅反応のためのテンプレート(T1)、および第2の増幅反応のためのテンプレート(T2))の存在下で、核酸分子の指数関数的増幅を誘発する。特定の実施形態において、第1の増幅反応のためのテンプレート(T1)がNARSの一方の鎖の配列を含む場合、トリガーODNPは、NARSの他方の鎖の配列を含み得る。トリガーODNPは、標的核酸由来であり得るか、または化学的に合成され得る。
【0059】
第1の核酸が、第2の核酸の消化産物または第2の核酸分子もしくはテンプレートとしてその相補物の一部を使用した増幅産物のいずれかである場合、第1の核酸分子(「第1の核酸」)が、別の核酸分子(「第2の核酸」)「に由来する」かまたは別の核酸分子(「第2の核酸」)「から生じる」。第1の核酸分子は、第2核酸の少なくとも一部と厳密に同一である配列または厳密に相補的である配列を含まなければならない。
【0060】
第1の配列の相補物が、所定の反応混合物(例えば、核酸増幅混合物)中の第2の配列にアニールし得る場合、第1の核酸配列は、第2の核酸配列に「少なくとも実質的に同一」である。特定の好ましい実施形態において、第1の配列は、第2の配列に「厳密に同一」であり、つまり、各位置での第1の配列のヌクレオチドは、同じ位置での第2の配列のヌクレオチドと同一であり、第1の配列は、第2の配列と同じ長さである。
【0061】
第1の配列が、所定の反応混合物(例えば、核酸増幅混合物)中の第2の配列にアニールし得る場合、第1の核酸配列は、第2の核酸配列と「少なくとも実質的に相補的」である。特定の好ましい実施形態において、第1の配列は、第2の配列に「厳密にまたは完全に相補的」であり、つまり、第1の配列の各ヌクレオチドは、その対応する位置で第2の配列のヌクレオチドと相補的であり、第1の配列は、第2の配列と同じ長さである。
【0062】
本明細書中で用いられる場合、2本鎖核酸の他方の鎖(「第2鎖」のことをいう)中の別の位置(例えば、規定された位置)「に対応する」位置に位置する2本鎖核酸の一方の鎖(「第1鎖」のことをいう)中のヌクレオチドは、第2鎖中の対応する位置のヌクレオチドに相補的な第1鎖中のヌクレオチドのことをいう。同様に、2本鎖核酸の他方の鎖(「第2鎖」のことをいう)内のニック形成部位に対応する2本鎖核酸の一方の鎖(「第1鎖」のことをいう)中の位置は、第2鎖中の2つのヌクレオチドに相補的な(この間にニック形成が生じる)第1鎖中の2つのヌクレオチド間の位置のことをいう。
【0063】
核酸配列(または領域)は、この核酸配列が、他の核酸配列に対して5’側に配置される場合、その別の核酸配列(または領域)に対して「上流」にある。核酸配列(または領域)は、この核酸配列が、他の核酸配列に対して3’側に配置される場合、その別の核酸配列(または領域)に対して「下流」にある。
【0064】
(A.核酸の指数関数的増幅のための方法および組成物)
本発明は、ニック形成エンドヌクレアーゼを使用する、核酸の指数関数的増幅のための方法および組成物を提供する。最初に、以下の節は、この方法の一般的説明を提供し、続いて、2つの型の核酸増幅、および核酸増幅のための組成物またはキットの説明を提供する。
【0065】
(1.一般的説明)
1つの局面において、本発明は、核酸の指数関数的増幅のための単純かつ迅速な方法を提供する。これは、ニック形成剤(NA)およびDNAポリメラーゼの組合せによって触媒される、2つ以上の連結された増幅反応(すなわち、タンデム増幅系)を使用する。各増幅反応は、NAが、NAの認識配列を含む二本鎖の核酸分子または部分的に二本鎖の核酸分子にニック形成する能力、およびDNAポリメラーゼが、NAのニック形成部位(NS)において3’末端から伸長する能力に基づく。
【0066】
第1の増幅反応(図1)において、トリガーODNPは、NARSの一方の鎖の配列(「第1のNARS」と呼ばれる)を含む第1のテンプレート核酸(T1)にハイブリダイズして、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子(「第1の増幅反応の開始核酸分子(N1)」)を形成する。トリガーODNPは、第1のNARSの他方の鎖を含まず、T1中の第1のNARSの鎖の3’側に配置されるT1の一部にハイブリダイズするか、または第1のNARSの他方の鎖を含み、その結果、T1へのそのハイブリダイゼーションが、二本鎖の第1のNARSを含む核酸分子を形成するかのいずれかである。5’末端においてT1の一部が、N1における5’突出部を形成する場合、DNAポリメラーゼ(「第1のDNAポリメラーゼ」と呼ばれる)の存在下で、トリガーODNPは、テンプレートとしてT1を使用して、伸長されて、二本鎖の第1のNARSを含むハイブリッド(H1)を形成する(図1の工程(a))。得られるH1は、第1のNARSを認識するNAによってニック形成され得、ニック形成部位において3’末端および5’末端を作製する(工程(b))。ニック形成部位において5’末端を含むフラグメント(「A1」と呼ばれる)が十分に短い(例えば、18ヌクレオチド長未満)場合、そのフラグメントは、解離的反応条件下(例えば、60℃)でH1の他の部分から解離する。しかし、このフラグメント(すなわち、A1)が容易に解離しない場合、これは、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損であり、そして鎖置換活性を有する第1のDNAポリメラーゼの存在下で、NSにおいて残りのフラグメントのその3’末端からの伸長により、置換され得る(工程(d))。鎖置換はまた、鎖置換促進剤が存在する場合、第1のDNAポリメラーゼにおける鎖置換活性の非存在下で生じ得る。このような伸長は、第1のNAにおけるように、再びニック形成(「再ニック形成」)され得る第1のNAについての新たなNSを再び作製する。新たなNSにおいて5’末端を含むフラグメント(すなわち、新たなA1)が、再び、H1の他の部分から容易に解離し得るか、またはNSにおいて3’末端からの伸長によって置換され得る(工程(f))。ニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返され得(工程(g))、核酸フラグメントA1の直線的な蓄積/増幅を生じる。
【0067】
核酸分子の指数関数的増幅は、この第1増幅反応から増幅されたフラグメントA1を介して、上記の第1増幅反応と第2増幅反応とを合わせるかまたは結び付けることによって行われ得る。第2増幅反応(図2)では、A1は、第2NARSのセンス鎖の配列を含む、別の1本鎖核酸分子(T2)の一部分へとハイブリダイズする。得られる部分的に2本鎖の核酸分子は、「第2増幅反応の開始核酸分子(N2)」といわれる。T2のうちの、A1がハイブリダイズする部分は、第2NARSのセンス鎖の配列の3’側に位置し、その結果、A1は、T2をテンプレートとして用いたプライマー伸長反応についての開始プライマーとして機能する。A1からの伸長は、2本鎖の第2NARSを含むハイブリッド(H2)を生成する(図2の工程(a))。第2NARSを認識する第2NAの存在下では、H2がニック形成され、このニック形成部位にて3’末端および5’末端を生成する(工程(b))。このニック形成部位にて5’末端を含むフラグメントが充分に短い(例えば、18ヌクレオチド長未満)である場合、これは、特定の反応条件(例えば、60℃にて)下で、H2の他方の部分から解離し得る。しかし、このフラグメントがH2の他方の部分から容易に解離されない場合、これは、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損であって、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ(「第2DNAポリメラーゼ」という)の存在下で、このNSにて3’末端を有するフラグメントの伸長によって置換され得る(工程(c))。鎖置換はまた、この第2DNAポリメラーゼの鎖置換活性がなくとも、鎖置換促進因子の存在下で生じ得る。このような伸長は、第2NAによって再度ニック形成され得る(「再ニック形成され得る」)、第2NAについての新たなNSを再度作製する(工程(d))。この新たなNSにて5’末端を含むフラグメント(「A2という」)は、H2の他方の部分から再度容易に解離し得るか、またはこのNSにおける3’末端から伸長によって置換され得る(工程(e))。このニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返され得(工程(f))、この核酸フラグメントA2の指数関数的な蓄積/増幅を生じる。この増幅された1本鎖核酸フラグメントA2は、A1と少なくとも実質的に相補的である。A2は、A1と同じ長さである場合、A1と完全に相補的であり得る。
【0068】
1つの局面において、本発明は、核酸分子(A2)を増幅する方法を提供する。この方法は、(a)一本鎖核酸分子(A1)を提供する工程;(b)5’から3’にむかって、(i)NARSのセンス鎖の配列、および(ii)A1に少なくとも実質的に相補的な配列を含む、第2の一本鎖核酸分子(T2)を提供する工程;ならびに(c)T2、A1、NARSを認識するニック形成剤、DNAポリメラーゼ、および1種以上のデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、A2を増幅する工程(ここで、A2は、A1に少なくとも実質的に相補的であり、A1、A2またはその両方は、25ヌクレオチド長以下である)を包含する。A1が提供され得る例示の手段は、本明細書中に記載される。
【0069】
本発明の指数関数的核酸増幅法は、T2がNARSのセンス鎖の配列を含むことを必要とするが、T1は、NARSのセンス鎖またはアンチセンス鎖の配列を含み得る。これらの2つの型の核酸増幅反応は、第1NARSおよび第2NARSの両方についての例としてN.BstNB Iの認識配列を使用して、図3および4に例示される。しかし、当業者は、T1およびT2が、他のニック形成剤の認識配列を含みうることを理解する。
【0070】
本発明に従う核酸増幅の第1型は、T1が第1NARSのアンチセンス鎖の配列を含む場合である。図3に示されるように、第1増幅反応について、開始核酸分子N1は、トリガーODNPと、3つの領域(領域X1、Y1、およびZ1)を有するT1とをアニーリングすることによって形成される、部分的に二本鎖の核酸分子である。領域X1、Y1、およびZ1は、それぞれ、N.BstNB I認識配列のアンチセンス鎖の配列のすぐ3’側の領域、N.BstNB Iの認識配列のアンチセンス鎖の配列の3’末端からトリガーODNPの伸長産物中のN.BstNB Iのニック形成部位の3’末端ヌクレオチドに対応するヌクレオチドまでの領域(すなわち、3’−CACAGNNNN−5’(ここで、Nは、A、T、G、またはCであり得る))、および領域Y1のすぐ5’側の領域として規定される。トリガーODNPは、領域X1に少なくとも実質的に相補的であり、DNAポリメラーゼの存在下で核酸伸長のためのプライマーとして機能する。その伸長産物(H1)は、トリガーODNPの5’末端配列が、領域X1の3’末端配列にアニールするか否かに依存して、完全に二本鎖または部分的に二本鎖であり得る。H1は、二本鎖N.BstNB I認識配列を含むので、N.BstNB Iによりニック形成され得る。特定の実施形態において、T1の3’末端は、例えば、リン酸基によりブロックされ、その結果、この末端からの伸長が防止される。トリガーODNPの配列を含むニック形成産物は、DNAポリメラーゼによって、ニック形成部位で、その3’末端から再度伸長され得、ニック形成部位で、N.BstNB Iによって生成される5’末端を含む鎖を置換する。ニック形成−伸長サイクルは、複数回反復され、置換された鎖(A1)が蓄積される。
【0071】
次いで、第1増幅反応の産物A1は、第2増幅反応のための開始プライマーとして使用される。T2の領域X2(これはまた、さらなる2つの領域(領域Y2およびZ2)を含む)にアニーリングされ、第2増幅反応のための開始核酸分子N2が形成される。領域Y2は、N.BstNB Iの認識配列のセンス鎖の配列およびその配列のすぐ3’側の4つのヌクレオチド(すなわち、3’−NNNNCTGAG−5’(ここで、Nの各々は、A、T、GまたはCであり得る)からなる)のに対し、領域X2およびZ2は、それぞれ、領域Y2の3’末端および5’末端にすぐ隣接する領域をいう。T2をテンプレートとして用いるA1の伸長により、A1の5’末端配列が、領域X2の3’末端配列にアニーリングするか否か依存して、完全な二本鎖または部分的に二本鎖であり得るの伸長産物(H2)が提供される。H2は、二本鎖N.BstNB I認識配列を含むので、N.BstNB Iの存在下でニック形成され得る。ニック形成部位の得られる3’末端は、DNAポリメラーゼによって、再度伸長され得、領域X2を置換する。ニック形成−伸長サイクルは、複数回反復され、ニック形成部位にて5’末端を含む、置換された鎖A2が蓄積/増幅される。A2は、A1の5’末端配列が、領域X2の3’末端配列にアニールする場合に領域X2と正確に同一である。さもなければ、A2および領域X2は、それらが異なる長さを有する場合、互いに実質的に相補的である。A2の増幅は、親数関数的である。なぜならば、それは、2つの関連した線形増幅反応の最終増幅産物であるからである。
【0072】
本発明に従う第2型の核酸増幅は、T1が第1NARSのセンス鎖配列を含む場合である。好ましくは、この第1NARSは、第2NARSに同一である。センス鎖配列の配列がT1およびT2の両方中に存在する例示的NAとして、N.BstNB Iを使用して、この型の核酸増幅を、図4に例示する。
【0073】
図4に示されるように、第1増幅反応について、開始核酸分子N1は、トリガーODNPを、3つの領域(領域X1、領域Y1および領域Z1)を有するT1とアニーリングすることによって形成される、部分的に2本鎖の核酸分子である。領域X1、領域Y1および領域Z1は、それぞれ、N.BstNB IによるN1の伸長産物(すなわちH1)のニック形成部位の直ぐ3’側の領域、ニック形成部位からN.BstNB Iの認識配列のセンス鎖配列の5’末端までの領域(すなわち、5’−GAGTCNNNN−3’(ここで、NはA、T、GまたはCであり得る))、および領域Y2の直ぐ5’側の領域として規定される。このトリガーODNPは、領域X1またはその一部に少なくとも実質的に相補的であり、そしてDNAポリメラーゼの存在下で核酸伸長のためのプライマーとして機能する。この伸長産物(H1)は、トリガーODNPの5’末端配列が、領域X1の3’末端配列にアニーリングするか否かに依存して、完全に二本鎖のまたは部分的に2本鎖であり得る。H1は、2本鎖のN.BstNB I認識配列を含むので、これは、N.BstNB Iによってニック形成され得る。特定の実施形態において、T1の3’末端は、この末端からの伸長を妨げるように、例えば、リン酸基でブロックされる。N.BstNB Iの認識配列のセンス鎖の配列を含むニック形成産物は、DNAポリメラーゼによって、ニック形成部位でのその3’末端から再度伸長されて、ニック形成部位で、N.BstNB Iによって生成される5’末端を含む鎖を置換し得る。このニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返されて、ニック形成部位の5’末端を含む、置換された鎖A1の蓄積を生じる。
【0074】
次いで、第1増幅反応の産物A1は、第2増幅反応のための開始プライマーとして使用される。これは、T2の領域X2(これは、2つのさらなる領域、すなわち領域Y2および領域Z2を含む)にアニーリングされて、第2増幅反応のための開始核酸分子N2を形成する。領域Y2は、領域Y1に類似しており、N.BstNB Iの認識配列のセンス鎖配列、およびN.BstNB Iの認識配列のセンス鎖配列の直ぐ3’側に位置する4つのヌクレオチド(すなわち、5’−GAGTCNNNN−3’(ここで、NはA、T、GまたはCであり得る))を有する。領域X2および領域Z2は、それぞれ、領域Y2の3’末端および5’末端の直ぐ隣の領域をいう。テンプレートとしてT2を使用するA1の伸長は、A1の5’末端配列が領域X2の3’末端配列にアニーリングするかどうかに依存して、完全に2本鎖または部分的に2本鎖であり得る伸長産物(H2)を提供する。H2は、2本鎖N.BstNB I認識配列を含むので、これはN.BstNB Iによってニック形成され得る。ニック形成部位での得られた3’末端は、DNAポリメラーゼによって再度伸長されて、領域X2を置換し得る。このニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返されて、ニック形成部位の5’末端を含む、置換された鎖A2の蓄積/増幅を生じる。A2のこの増幅は、指数関数的である。なぜなら、これは2つの関連した線形増幅反応の最終増幅産物であるからである。
【0075】
本発明の方法は、2つの核酸増幅反応を一緒に関連づけることに制限されない。特定の実施形態では、第2増幅反応は、第3増幅反応とさらに結び付けられ得る。言い換えれば、この第2増幅反応の間に増幅された核酸分子A2は、NARS(「第3NARS」という)の1つの鎖の配列を含む別の核酸分子「T3」の一部分へとアニーリングして、第3増幅反応における核酸分子「A3」の増幅を誘発し得る。さらなる増幅反応が、この鎖に付加され得る。例えば、A3は次いで、NARS(「第4NARS」という)の1つの鎖をまた含む別の核酸分子「T4」の一部分へとアニーリングして、第4増幅反応において、核酸分子「A4」の増幅を開始し得る。その後の各増幅反応は、その以前の増幅反応からの増幅フラグメントの線形増幅をもたらすので、この系の他の成分(例えば、テンプレート核酸分子、NA、およびDNAポリメラーゼ)が増幅速度もレベルも制限しなければ、増幅系における増幅反応の数が多いほど、増幅レベルが高い。
【0076】
(a.ニック形成剤)
上記のとおり、本発明の指数関数的核酸増幅方法は、2以上の核酸増幅反応を一緒に結び付け、そして各増幅反応は、NAの存在下で行われる。1つの増幅反応についてのNAは、別の増幅反応についてのNAと異なり得る。1つの実施形態では、異なる増幅反応についてのNAは、互いに同一であり、その結果、たった1つのNAが核酸分子の指数関数的増幅に必要とされる。別の実施形態では、2つの異なるNA(例えば、異なるNARSを認識する2つのNA)が用いられる。
【0077】
特定のヌクレオチド配列を認識し、そしてこの配列を含む完全または部分的に2本鎖の核酸の1つの鎖のみを切断する任意の酵素が、本発明においてニック形成剤として使用され得る。このような酵素は、ネイティブなヌクレオチドから構成される特定の配列を認識するNE、または半改変認識配列を認識するREであり得る。
【0078】
ニック形成エンドヌクレアーゼは、その認識配列と重なるニック形成部位を有しても有さなくてもよい。その認識配列の外側にニックを形成する例示的なNEは、N.BstNB Iであり、これは、5’−GAGTC−3’から構成される独特の核酸配列を認識するが、この認識配列の3’末端を4ヌクレオチド超えたところにニック形成する。N.BstNB Iの認識配列およびニック形成部位を、以下:
【0079】
【化2】
【0080】
によって示し、ここで、「下向き黒三角」は、は、切断部位を示し、文字Nは、任意のヌクレオチドを示す。N.BstNB Iは、米国特許第6,191,267号に記載されるようにして、調製および単離され得る。このニック形成エンドヌクレアーゼを使用するための緩衝液および条件はまた、この’267特許に記載される。その認識配列の外側にニック形成するさらなる例示的なNEは、N.AlwIであり、これは、以下の2本鎖認識配列を認識する:
【0081】
【化3】
【0082】
N.AlwIのニック形成部位もまた、記号「下向き黒三角」により示される。両方のNEは、New England Biolabs(NEB)から入手可能である。N.AlwIはまた、Xuら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:12990−5,2001)に記載されるように、IIs型RE AlwIを変異させることによって、調製され得る。
【0083】
そのNERS内にニック形成する例示的なNEとしては、N.BbvCI−aおよびN.BbvCI−bが挙げられる。これら2つのNEおよびNSの認識配列(記号「下向き黒三角」で示す)を、以下に示す:
【0084】
【化4】
【0085】
両方のNEは、NEBから入手可能である。
【0086】
さらなる例示的なニック形成エンドヌクレアーゼとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:N.BstSE I(Abdurashitovら、Mol.Biol.(Mosk)30:1261−7,1996)、操作されたEcoR V(Stahlら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:6175−80,1996)、操作されたFok I(Kimら、Gene 203:43−49,1997)、Thermotoga maritima由来のエンドヌクレアーゼV(Huangら、Biochem.40:8738−48,2001)、Cvi Nickase(例えば、CviNY2A、CviNYSI、Megabase Research Products,Lincoln,Nebraska)(Zhangら、Virology 240:366−75,1998;Nelsonら、Biol.Chem.379:423−8,1998;Xiaら、Nucleic Acids Res.16:9477−87,1988)、および操作されたMly I(すなわち、N.Mly I)(BesnierおよびKong,EMBO Reports 2:782−6,2001)。さらなるNEは、他の制限エンドヌクレアーゼ、特に、IIs型制限エンドヌクレアーゼを、EcoR V、AlwI、Fok Iおよび/またはMly Iを操作するための方法と類似の方法を使用して操作することによって、得られ得る。
【0087】
ニック形成剤として有用なREは、その半改変された認識配列において2本鎖核酸にニック形成する任意のREであり得る。この半改変された2本鎖認識配列にニック形成する例示的なREとしては、Ava I、Bsl I、BsmA I、BsoB I、Bsr I、BstN I、BstO I、Fnu4H I、Hinc II、Hind IIおよびNci Iが挙げられるがこれらに限定されない。半改変された認識配列にニック形成するさらなるREは、米国特許第5,631,147号に記載される鎖保護アッセイによってスクリーニングされ得る。
【0088】
特定のニック形成剤は、少なくとも部分的に二本鎖の基質核酸中に、2本鎖認識配列のセンス鎖の存在のみを、ニック形成活性のために必要とする。例えば、N.BstNB Iは、一方の鎖に、1つ以上のヌクレオチドが、基質核酸の他方の鎖と従来の塩基対(例えば、G:C、A:T、またはA:U)を形成しない、その認識配列「5’−GAGTC−3’」のセンス鎖の配列を含む基質核酸のニック形成において活性である。N.BstNB Iのニック形成活性は、その認識配列のセンス鎖における、この基質核酸の他方の鎖中のいずれのヌクレオチドとも従来の塩基対を形成しないヌクレオチド数の増加に伴って低減する。
【0089】
特定の実施形態において、ニック形成剤は、DNA−RNA二重鎖におけるヌクレオチド配列を認識し得、この二重鎖の一方の鎖にニック形成する。特定の他の実施形態において、ニック形成剤は、2本鎖RNAにおけるヌクレオチド配列を認識し得、このRNAの一方の鎖にニック形成する。
【0090】
(b.DNAポリメラーゼ)
上記のように、本発明の指数関数的核酸増幅方法は、2以上の核酸増幅反応を一緒に結び付け、そして各増幅反応は、DNAポリメラーゼの存在下で行われる。1つの増幅反応についてのDNAポリメラーゼは、別の増幅反応についてのDNAポリメラーゼと異なり得る。1つの実施形態では、異なる増幅反応についてのDNAポリメラーゼは、互いに同一であり、その結果、ほんの1つのDNAポリメラーゼが、核酸分子の指数関数的増幅に必要とされる。
【0091】
本発明において有用なDNAポリメラーゼは、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損であるが鎖置換活性を有する任意のDNAポリメラーゼであり得る。このようなDNAポリメラーゼとしては、exo−Deep Vent、exo−Bst、exo−Pfu、およびexo−Bcaが挙げられるがこれらに限定されない。本発明において有用なさらなるDNAポリメラーゼは、スクリーニングされ得るか、または米国特許第5,631,147号(その全体が本明細書中に参考として援用される)に記載される方法によって作製され得る。鎖置換活性は、以下に記載されるような鎖置換促進因子の存在によってさらに増強され得る。
【0092】
あるいは、特定の実施形態において、鎖置換活性を有さないDNAポリメラーゼが、使用され得る。このようなDNAポリメラーゼとしては、exo−Vent、Taq、DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメント、T5 DNAポリメラーゼおよびPhi29 DNAポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、これらのDNAポリメラーゼの使用は、鎖置換促進因子の存在を必要とする。「鎖置換促進因子」は、DNAポリメラーゼに触媒される、ニック形成部位での3’末端からの核酸伸長の間の鎖置換を促進する任意の化合物または組成物である。本発明において有用な、例示的な鎖置換促進因子の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:BMRF1ポリメラーゼアクセサリーサブユニット(Tsurumiら、J.Virology 67:7648−53,1993)、アデノウイルスDNA結合タンパク質(Zijderveldおよびvan der Vliet、J.Virology 68:1158−64,1994)、単純ヘルペスウイルスタンパク質ICP8(BoehmerおよびLehman、J.Virology 67:711−5,1993;SkaliterおよびLehman、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10665−9,1994)、一本鎖DNA結合タンパク質(RiglerおよびRomano、J.Biol.Chem.270:8910−9,1995)、ファージT4遺伝子32タンパク質(VillemainおよびGiedroc、Biochemistry 35:14395−4404,1996)、ウシ胸腺ヘリカーゼ(Siegelら、J.Biol.Chem.267:13629−35,1992)およびトレハロース。1つの実施形態では、トレハロースが、増幅反応混合物中に存在する。
【0093】
本発明において有用な、さらなる例示的なDNAポリメラーゼとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ファージM2 DNAポリメラーゼ(Matsumotoら、Gene 84:247,1989)、ファージPhiPRD1 DNAポリメラーゼ(Jungら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:8287,1987)、T5 DNAポリメラーゼ(Chatterjeeら、Gene 97:13−19,1991)、Sequenase(U.S.Biochemicals)、PRD1 DNAポリメラーゼ(ZhuおよびIto、Biochim.Biophys.Acta.1219:267−76,1994)、9°Nm TMDNAポリメラーゼ(New England Biolabs)(Southworthら、Proc.Natl.Acad.Sci.93:5281−5,1996;Rodriquezら、J.Mol.Biol.302:447−62,2000)およびT4 DNAポリメラーゼホロ酵素(KaboordおよびBenkovic、Curr.Biol.5:149−57,1995)。
【0094】
あるいは、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼが使用され得る。例えば、このようなDNAポリメラーゼは、ニック形成の後にテンプレート核酸から自動的に解離する短い核酸フラグメントを増幅するために有用であり得る。
【0095】
ニック形成剤がRNA−DNA二重鎖のDNA鎖にニック形成する特定の実施形態において、RNA依存性DNAポリメラーゼが使用され得る。ニック形成剤がRNA−DNA二重鎖のRNA鎖にニック形成する他の実施形態において、DNAプライマーから伸長させるDNA依存性DNAポリメラーゼ(例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素(Promega))が使用され得る。両方の場合において、標的mRNAは、cDNAに逆転写される必要はなく、そして標的mRNAに対して少なくとも実質的に相補的であるテンプレート核酸分子と直接に混合され得る。
【0096】
(c.反応条件)
本発明の指数関数的核酸増幅法は、増幅を達成する際に各々がニック形成反応およびプライマー伸長反応を使用する2つ以上の核酸増幅反応と連結する。本発明の方法に従って、各増幅反応において、DNAポリメラーゼは、NAがテンプレート核酸と混合される前、混合された後、または混合されると同時に、核酸分子(例えば、テンプレート核酸分子)と混合され得る。好ましくは、ニック形成−伸長反応緩衝液は、NAおよびDNAポリメラーゼの両方に適切であるように最適化される。例えば、N.BstNB IがNAであり、exo−VentがDNAポリメラーゼである場合、ニック形成−伸長緩衝液は、0.5×N.BstNB I緩衝液および1×DNAポリメラーゼ緩衝液であり得る。例示的な1×N.BstNB I緩衝液は、10mM Tris−HCl、10mM MgCl2、150mM KCl、および1mM ジチオスレイトール(25℃にてpH7.5)であり得る。例示的な1×DNAポリメラーゼ緩衝液は、10mM KCl、20mM Tris−HCl(25℃にてpH8.8)、10mM (NH4)2SO4、2mM MgSO4、および0.1% Triton X−100であり得る。当業者は、NAおよびDNAポリメラーゼのための反応緩衝液を容易に見いだし得る。
【0097】
さらに、DNAポリメラーゼが解離性である(すなわち、このDNAポリメラーゼは、Vent DNAポリメラーゼのようなテンプレート核酸から比較的解離しやすい)特定の実施形態において、反応混合物中のNA 対 DNAポリメラーゼの比はまた、全長核酸分子の最大増幅のために最適化され得る。本明細書中で使用される場合、「全長」核酸分子とは、そのテンプレートの5’末端配列に相補的な配列を含む、増幅された核酸分子をいう。言い換えると、全長核酸分子は、完全な遺伝子伸長反応の増幅産物である。NAの量が、DNAポリメラーゼの量に対して過剰である反応混合物において、部分的な増幅産物が、生成され得る。部分的増幅産物の生成は、NAによる、部分的に増幅した核酸分子の過剰なニック形成およびその後のこれらの分子のテンプレートからの解離に起因し得る。このような解離は、その部分的に増幅した核酸分子がさらに伸長しないようにする。
【0098】
異なるNAまたは異なるDNAポリメラーゼは、異なるニック形成活性またはプライマー伸長活性を有し得るので、全長核酸分子の最大の増幅に最適な、特定のNA 対 特異的な解離性DNAポリメラーゼの比は、特定のNAおよびDNAポリメラーゼの同一性に依存して変化する。しかし、特定のNAと特異的なDNAポリメラーゼとの所定の組み合わせについて、その比は、異なるNA 対 DNAポリメラーゼ比を有する反応混合物中で指数関数的な核酸増幅反応を行い、当該分野で公知の技術を使用して(例えば、液体クロマトグラフィーまたは質量分析法により)その増幅産物を特徴付けることにより最適化され得る。全長核酸分子の最大の産生を可能にする比は、将来的な増幅反応において使用され得る。
【0099】
核酸分子の部分的な増幅は、第1の増幅反応および第2の増幅反応の両方の間で起こり得るが、第1の増幅反応の間の部分的な増幅は、通常、全核酸増幅レベルまたは速度に有意には影響しないことは、注目すべきである。第1の増幅反応の間に増幅された核酸分子は、第2の増幅反応のための開始増幅プライマーとして使用されるので、これらの核酸分子は、これらのテンプレートに特異的にアニーリングさせるのに十分長い場合、これらの意図される使用のために十分である。全長核酸増幅のための、NA 対 解離性DNAポリメラーゼとの最適比を使用することを除いて、代替的に、増幅反応が、ある期間の間進行し、各々の遺伝子伸長反応をその完了まで進行させた後、部分的増幅産物量は、NAを不活性化することによって排除され得るかまたは低減され得るが、DNAポリメラーゼはそうなり得ない(例えば、熱不活性化)。
【0100】
特定の好ましい実施形態において、本発明のニック形成反応および伸長反応は、等温条件下で行われる。本明細書中で使用される場合、「等温的に」および「等温条件」とは、増幅過程の間、反応の温度が本質的に一定に保持された(すなわち、同じ温度であるか、または上限温度と下限温度との間の差異が20℃以下の同じ狭い温度範囲内である)反応条件のセットをいう。本発明の増幅方法の利点は、上限温度と下限温度との間で温度をサイクルさせる必要がないことである。ニック形成反応および伸長反応の両方が、同じ温度にて、または同じ狭い温度範囲内で行われる。温度を維持するために使用される装置が、反応混合物の温度を少ない程度で変動させることが可能である場合、このような変動は、増幅反応に不利益ではない。等温増幅のための例示的な温度としては、50℃〜70℃の間の任意の温度、または50℃〜70℃、55℃〜70℃、60℃〜70℃、65℃〜70℃、50℃〜55℃、50℃〜60℃、もしくは50℃〜65℃の間の温度範囲が挙げられるが、これらに限定されない。多くのNAおよびDNAポリメラーゼは、上記の例示的温度にてまたは上記の例示的な温度範囲内で活性である。例えば、N.BstNB I(New England Biolabs)を用いるニック形成反応およびexo− Bstポリメラーゼ(BioRad)を用いる伸長反応の両方は、約55℃にて行われ得る。約50℃〜70℃の間で活性な他のポリメラーゼとしては、exo− Vent(New England Biolabs)、exo− Deep Vent(New England Biolabs)、exo−Pfu(Strategene)、exo−Bca(Panvera)およびSequencing Grade Taq(Promega)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0101】
制限エンドヌクレアーゼが、ニック形成剤として使用される場合、改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸は、半改変(hemimodified)制限エンドヌクレアーゼ認識配列を生成するために必要である。制限エンドヌクレアーゼ認識配列中に改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む二本鎖核酸の一方の鎖の切断の阻害に寄与する任意の改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸が使用され得る。例示的な改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸としては、2’−デオキシシチジン5’−O−(1−チオ三リン酸)[すなわち、dCTP(.α.S)]、2’−デオキシグアノシン5’−O−(1−チオ三リン酸)、チミジン−5’−O−(1−チオ三リン酸)、2’−デオキシシチジン5’−O(1−チオ三リン酸)、2’−デオキシウリジン5’−三リン酸、5−メチルデオキシシチジン5’−三リン酸、および7−デアザ−2’−デオキシグアノシン5’−三リン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【0102】
(d.開始核酸(N1))
上に議論されるように、第1核酸増幅のための開始核酸(すなわち、N1)は、トリガーODNPをテンプレート核酸分子T1とアニーリングさせることによって提供され得る。トリガーODNPは、T1をテンプレートとして使用するプライマー伸長のためのプライマーとして機能するので、このトリガーODNPは、T1の一部と実質的に相補性でなければならず、そしてそこからプライマー伸長が生じる3’末端もまた有する。
【0103】
特定の実施形態において、トリガーODNPは、核酸分子に由来する。トリガーの3’末端は、当該分野で公知の種々の方法によって産生され得る。例えば、トリガーODNPの3’末端は、制限ヌクレアーゼ認識配列(RERS)を認識する制限エンドヌクレアーゼ(例えば、IIs型制限エンドヌクレアーゼ)を使用して、RERSを有する核酸フラグメントを消化することによって提供され得る。核酸フラグメント中のRERSは、天然に存在しても、RERSの1つの鎖を含むプライマーを使用することによって、フラグメント中に組込まれてもよい。あるいは、トリガーODNPの3’末端は、NARSを認識するNAで、NARSを有する核酸フラグメントにニック形成することによって産生され得る。NARSはまた、天然に存在しても、NARSの1つの鎖を含むプライマーを使用することによって、フラグメント中に組込まれてもよい。さらに、トリガーODNPの3’末端は、Szybalski(米国特許第4,935,357号)に従うオリゴヌクレオチド指向性切断によってかまたはMaxam−Gilbert(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:560−4,1977)に従う塩基特異性化学切断によって、作製され得る。特定の実施形態において、トリガーODNPの3’末端は、DNase Iまたは他の非特異的ヌクレアーゼで、核酸分子を切断することによってか、あるいは核酸分子を剪断することによって、作製され得る。切断生成物が、二本鎖核酸である状況において、トリガーODNPは、二本鎖核酸を変性することによって得られ得る。
【0104】
トリガーODNPが誘導される核酸分子は、天然に存在しても、合成であってもよい。この核酸分子は、RNAであってもDNAであってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。このような核酸分子としては、ゲノムDNA、cDNAまたはその誘導体(例えば、ランダムにプライムされた増幅産物または特異的にプライムされた増幅産物)が挙げられる。トリガーODNP自体は、一本鎖DNA分子または一本鎖RNA分子であり得る。トリガーODNPまたはトリガーODNPが誘導される核酸分子は、固体支持体に固定化されていても、固定されていなくてもよい。
【0105】
同様に、T1はまた、酵素的切断、化学的切断、または機械的切断による、別の核酸分子に由来し得る。酵素的切断は、例えば、核酸分子内の特異的配列を認識する制限エンドヌクレアーゼで、核酸分子を消化することによって達成され得る。あるいは、酵素的切断は、核酸分子内の特異的配列を認識するニック形成剤で、核酸分子にニック形成することによって、達成され得る。酵素的切断はまた、Szybalski(米国特許第4,935,357号)に従うオリゴヌクレオチド指向性切断でもあり得る。化学的切断および機械的切断は、核酸分子を切断するために適切な当該分野で公知の任意の方法(例えば、剪断)によって、達成され得る。切断生成物が二本鎖核酸分子である状況において、T1分子は、二本鎖核酸分子を変性することによって得られ得る。
【0106】
上記されるように、T1は、NARSの1つの鎖の配列を含む。NARSは、T1が誘導される核酸分子に存在し得る。あるいは、このNARSは、例えば、NARSの1つの鎖の配列を含むODNPを使用することによって、T1に組込まれ得る。
【0107】
トリガーONDPに類似して、T1分子は、種々の核酸分子から誘導され得る。これらの核酸分子は、天然に存在する核酸および合成核酸を含み、これらのいずれかは、二本鎖核酸分子であっても一本鎖核酸分子であってもよく、そしてDNA(例えば、ゲノムDNAおよびcDNA)であってもRNAであってもよい。
【0108】
特定の実施形態において、T1分子は、3’から5’まで以下を含むかまたは以下から本質的になる:せいぜい100ヌクレオチド長である第1配列;二本鎖ニック形成剤認識配列の1つの鎖の配列;およびせいぜい100ヌクレオチド長である第2配列。いくつかの実施形態において、T1分子は、せいぜい200、150、100、80、60、50、40、30、25、20、18,16、14、12、または10ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、第1の配列、第2の配列、またはその両方は、せいぜい100、80、60、50、40、30、25、20、18,16、14、12、10、9、8、7、6、5、または4ヌクレオチド長であり得る。
【0109】
(1)T1がニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そして(2)トリガーODNPがニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列に隣接するT1分子の一部分に相補的である特定の実施形態において、T1中のニック形成剤認識配列のセンス鎖内の1つ以上のヌクレオチドとトリガーODNP中の対応するヌクレオチドとの間にミスマッチが存在し得る。言い換えると、T1中のニック形成剤認識配列のセンス鎖内の1つ以上のヌクレオチドは、トリガーODNP内の任意のヌクレオチドと従来の塩基対を形成し得ない。特定のニック形成剤(例えば、N.BstNBI)は、これらの二本鎖認識配列のセンス鎖のみを含む基質にニック形成し得るので、T1にトリガーODNPをアニーリングすることによって形成される開始核酸(N1)は、T1分子中の認識配列のセンス鎖を認識するニック形成剤の存在下で、一本鎖核酸(A1)を増幅するためのテンプレートとして使用され得る。二本鎖ニック形成剤認識配列の、センス鎖の配列のみを含み、インタクトなアンチセンス鎖の配列を含まないテンプレート核酸を使用して一本鎖核酸を増幅するためのニック形成剤の使用についての詳細な記載は、「Amplification of Nucleic Acid Fragments Using Nicking Agents」と表題される、米国特許出願において提供される。
【0110】
トリガーODNP、T1、またはその両方が核酸分子から誘導される実施形態の代わりに、本発明はまた、トリガーODNP、T1、またはその両方が合成核酸分子である実施形態を含む。オリゴヌクレオチド合成のための当該分野で公知の任意の方法は、トリガーODNPおよび/またはT1を合成するために使用され得る。例えば、トリガーODNPおよび/またはT1は、米国特許第6,166,198号、同第6,043,353号、同第6,040,439号、および同第5,945,524号(参考として本明細書中にその全体が援用される)に開示される固相オリゴヌクレオチド合成方法によって合成され得る。簡単に言えば、固相オリゴヌクレオチド合成は、5’側がブロックされたヌクレオチドを樹脂に結合された発生期のオリゴヌクレオチドに連続的に連結し、続いてリン酸ジエステル結合を形成するために酸化および脱ブロック化することによって実施され得る。さらに、トリガーODNPおよび/またはT1は、特別に注文されるオリゴヌクレオチドを合成する企業から購入され得る。
【0111】
T1は、特定の実施形態において、固相支持体に固定化され得る。好ましくは、T1は、その5’末端によって固定化される。他の実施形態において、T1は、固相支持体に固定されなくてもよい。
【0112】
特定の実施形態において、第1増幅反応の開始核酸分子(すなわち、N1)は、トリガーODNPをテンプレート核酸分子T1とアニーリングさせること以外によって、提供され得る。例えば、N1は、二本鎖NARSを含む、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子であり得、このNARSは、任意の開始プライマー伸長反応(例えば、図1の工程(a))なしに、NARSを認識するNAによって容易にニック形成され得る(図1の工程(c))。このような場合において、N1分子の各鎖は、NARSの1つの鎖の配列を含む。従って、いずれかの鎖が、T1分子とみなされ、その相補鎖がトリガーODNPとみなされ得る。二本鎖N1分子は、例えば、NARSを含む核酸の消化産物であり得る。N1中のNARS配列は、別のヌクレオチド配列から生じるかまたはそれに由来するか、あるいは、NARSの1つの鎖の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーによってN1に組込まれるかまたはT1の化学合成の間にN1に組込まれ得る。
【0113】
N1は、二本鎖NARSまたはNARSの1つの鎖のみのいずれかを含む部分的に二本鎖の核酸分子であり得る。例えば、N1は、2つのNARSを含む核酸分子のニック形成産物であっても、NARSおよびRERSの両方を含む核酸分子のニック形成消化産物であってもよい。
【0114】
特定の実施形態において、N1は、固体支持体に固定化され得る。他の実施形態において、N1は、固体支持体に固定化され得ない。
【0115】
(e.T2分子)
T1と類似して、T2はまた、上記されるように他の核酸分子内において、酵素的切断、化学的切断または機械的切断によってか、またはテンプレートとして他の核酸分子を使用した核酸増幅によって、別の核酸分子から由来され得る。T2が由来する他の核酸分子は、天然に存在する核酸あるいは合成二本鎖核酸または合成一本鎖核酸、DNA(例えば、ゲノムDNAおよびcDNA)またはDNAであり得る。1つの実施形態において、T2は、化学的に合成される。
【0116】
上記されるように、T2は、NARSのセンス鎖の配列を含む。NARSは、T2が由来する核酸分子中に存在し得る。あるいは、NARSは、例えば、NARSの1つの鎖の配列を含むODNPを使用することによって、T2に組込まれ得る。
【0117】
増幅反応混合物中のT2分子の数は、代表的に、T1分子の数より多い。T1分子より多い数のT2分子に対する優先性は、T2分子がT1分子をテンプレートとして使用して増幅された一本鎖核酸分子(すなわち、A1)に対するアニーリングパートナーとして使用されるという事実に起因する。言い換えると、第1増幅反応の間、各T1分子は、テンプレートとして使用され、複数コピーのA1を産生する。従って、各々のT1分子について、好ましくは、複数のT2分子が、単一のT1分子をテンプレートとして使用して増幅された複数のA1分子に対するアニーリングパートナーを提供するために存在する。
【0118】
特定の実施形態において、T2分子は、3’から5’まで、以下を含むかまたは以下から本質的になる:せいぜい100ヌクレオチド長である第1配列;二本鎖ニック形成認識配列のセンス鎖の配列;およびせいぜい100ヌクレオチド長である第2配列。いくつかの実施形態において、T2分子は、ぜいぜい200、150、100、80、60、50、40、30、25、20、18、16、14、12、または10ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、第1の配列、第2の配列、またはその両方は、せいぜい100、80、60、50、40、30、25、20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、または4ヌクレオチド長であり得る。
【0119】
T2分子は、固相支持体に、好ましくは、その5’末端で固定化され得る。T2分子が結合される固相とプライマーの5’末端または3’末端との間にはリンカーが存在し得る。さらに、複数のT2分子は、単一の固相に固定化され、T2分子のアレイを生成し得る。複数のT2分子は、アレイの別個の位置で同一な配列を有し得る。あるいは、これらは、アレイの別個の位置で種々のA1分子に対して少なくとも実質的に相補的である異なる配列を有し得る。このようなアレイは、異なる配列を有する複数の一本鎖核酸分子を増幅するために使用され得る。特定の実施形態において、アレイの異なる位置で実施される増幅反応は、物理的に分離され(例えば、プレートのマイクロウェル中)、その結果、異なる位置での増幅産物は、互いに混合されず、ここに特徴付けされ得る。
【0120】
(2.核酸増幅のための核酸、組成物またはキット)
1つの局面において、本発明は、核酸の指数関数的な増幅のための組成物およびキットを提供する。このような組成物は、一般的に、上記される第1の型または第2の型の核酸増幅において機能するように設計された、第1の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子(N1またはH1)と第2の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子(N2またはH2)との組み合わせを含む。例えば、第1の型の核酸増幅について、組成物は、(1)一方の鎖が第1のNARSのアンチセンス鎖の配列を含む第1の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子(N1またはH1)、ならびに(2)5’から3’まで以下の(i)および(ii)を含む第2の核酸(N2またはH2)を含み得る:(i)第2のNARSのセンス鎖の配列、および(ii)第1の核酸分子における第1のNARSのアンチセンス鎖の配列に対して5’側に位置する配列に少なくとも実質的に同一である配列。第2の型の核酸増幅について、組成物は、(1)一方の鎖が第1のNARSのセンス鎖の配列を含む第1の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子(N1またはH1)、ならびに(2)一方の鎖が、5’から3’まで以下の(i)および(ii)を含む第2の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子(N2またはH2)を含み得る:(i)第2のNARSのセンス鎖の配列、および(ii)第1の核酸分子における第1のNARSのセンス鎖の配列に対して3’側に位置する配列に少なくとも実質的に相補的である配列。特定の実施形態において、両方の型の核酸増幅について、第1のNARSは、第2のNARSに対して同一である。
【0121】
本発明のキットは、上記の組成物のうちの1つを含み得る。あるいは、このキットは、上記の第1の型の核酸増幅または第2の型の核酸増幅のいずれかにおいて機能するように設計された一本鎖核酸分子T1およびT2の組合せを含み得る。例えば、第1の型の核酸増幅について、この組成物は、第1のNARSのアンチセンス鎖の配列を含むT1、ならびに5’から3’へと以下:(i)第2のNARSのセンス鎖の配列、および(ii)T1中の第1のNARSのアンチセンス鎖の配列の5’側に位置する配列に少なくとも実質的に同一である配列、を含むT2を含み得る。第2の型の核酸増幅について、この組成物は、第1のNARSのセンス鎖の配列を含むT1、ならびに5’から3’へと以下:(i)第2のNARSのセンス鎖の配列、および(ii)第1の核酸分子中の第1のNARSのセンス鎖の配列の3’側に位置する配列に少なくとも実質的に相補的である配列、を含むT2を含み得る。特定の実施形態では、両方の型の核酸増幅について、第1のNARSは、第2のNARSと同一である。
【0122】
上記の核酸分子に加えて、本発明のキット(または組成物)は、以下の構成要素のうちの少なくとも1つ、2つ、数個、または各々をさらに含み得る:(1)T1中のNARSの一方の鎖の配列の3’側のT1の配列に特異的にアニーリングし得るトリガーODNP;(2)NARS(その一方の鎖の配列が、T1、T2または両方に存在する)を認識するニック形成剤(例えば、NEまたはRE);(3)ニック形成剤(2)用の緩衝液;(4)プライマー伸長に有用なDNAポリメラーゼ;(5)DNAポリメラーゼ(4)用の緩衝液;(6)デオキシヌクレオシド三リン酸;(7)改変されたデオキシヌクレオシド三リン酸;(8)コントロールT1、T2および/またはトリガーODNP;ならびに(9)鎖置換促進因子(例えば、トレハロース)。多くの上記の構成要素の詳細な説明は、上記に提供される。
【0123】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、NAに特異的な緩衝液もDNAポリメラーゼに特異的な緩衝液も含まない。代りに、本発明の組成物は、ニック形成剤およびDNAポリメラーゼの両方に適切な緩衝液を含む。例えば、N.BstNB Iがニック形成剤であり、exo−VentがDNAポリメラーゼである場合、ニック形成−伸長緩衝液は、0.5×N.BstNB I緩衝液および1×exo−Vent緩衝液であり得る。
【0124】
本発明の組成物は、それらの構成要素を単純に混合することによってか、またはこの組成物の形成を生じる反応を実施することによって生成され得る。本発明のキットは、それらの構成要素のうちのいくつかを混合することによって調製され得るか、またはそれらの各々を個々の容器に保存する。
【0125】
(B.核酸増幅方法および組成物の診断用途)
本明細書中上記にて詳細に記載されるように、本発明は、核酸の指数関数的増幅のための方法および組成物を提供する。これらの方法および組成物は、広範な種々の適用における有用性を見出し得、ここで、核酸分子を迅速に増幅することが好適である。このような迅速な増幅は、診断適用において特に好適であり得る、例えば、生物学的サンプル中の病原体(例えば、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫)の存在を迅速に検出する場合に好適である。以下の節は、診断用途に具体的に適用可能な種々の例示的実施形態を記載する。
【0126】
(1.概要)
本発明は、生物学的サンプル中の標的核酸分子を検出するために有用である。この標的核酸としては、病原性生物に由来するか、それを起源とする核酸分子が挙げられる。サンプル中の標的核酸の存在または非存在に依存して、増幅産物は、標的核酸またはその部分をテンプレートとして使用するように設計された増幅系において、検出されても検出されなくても良い。標的核酸またはその部分は、第1の増幅反応におけるテンプレートとして使用されるために、まず、開始核酸分子(N1)中に組み込まれる。この開始核酸分子はまた、第1のNARSの少なくとも一方の鎖を含み、従って、DNAポリメラーゼおよび第1のNARSを認識するNAの存在下で、第1の増幅反応を誘発する。次いで、第1の増幅反応からの生成物(A1)は、別のテンプレート核酸分子(T2)にアニーリングする。T2は、第2のNARSのセンス鎖の配列を含み、従って、DNAポリメラーゼおよび第2のNARSを認識するNAの存在下で、第2の増幅反応を開始する。第1の増幅反応の生成物(A1)および/または第2の増幅反応の生成物(A2)の存在または非存在の決定は、生物学的サンプル中の標的核酸の存在または非存在を示す。
【0127】
(2.開始核酸分子(N1))
診断適用に有用な開始核酸分子は、種々のアプローチによって提供され得る。例えば、N1は、トリガーODNPをT1分子にアニーリングすることによって獲得され得、ここでトリガーODNPは、病原性生物を起源とする核酸分子に由来する(例えば、図5〜7および図13)。あるいは、N1は、病原性生物を起源とする二本鎖核酸分子に直接に由来し得る(例えば、図8)。N1はまた、適切なオリゴヌクレオチドプライマー対の使用によって調製され得る(例えば、図9〜11)。特定の実施形態において、N1は、標的核酸とハイブリダイズし得る突出部を有する部分的に二本鎖の核酸分子であり得る(例えば、図12)。診断適用に関連する、N1を提供するためのこれらおよび他の様式は、以下に記載される。
【0128】
(a.N1分子を提供するための第1の型の例示的方法)
トリガーODNPをT1分子にアニーリングすることによってN1が提供される本発明の特定の実施形態において、トリガーODNPは、病原性生物のDNA分子(例えば、ゲノムDNA分子)またはRNA分子(例えば、mRNA分子)のいずれかに由来し得る。病原性生物由来の核酸分子が、一本鎖である場合、それは、トリガーODNPとして直接使用され得る。あるいは、一本鎖核酸分子は、より短いフラグメントを生成するように切断され得、ここで、これらのフラグメントのうちの1つ以上が、トリガーODNPとして使用され得る。病原性生物由来の核酸分子が、二本鎖である場合、それは、変性され、そしてトリガーODNPとして直接使用され得るか、または変性された生成物は、複数のより短いフラグメントを提供するために切断され得、ここでこれらのフラグメントのうちの1つ以上が、トリガーODNPとして機能し得る。あるいは、それは、複数のより短い二本鎖フラグメントを得るためにまず切断され得、次いでこれらのより短いフラグメントは、1つ以上のトリガーODNPを提供するために変性される。
【0129】
上記のように、T1分子は、トリガーODNPに少なくとも実質的に相補的でなければならない。さらに、増幅反応混合物中のT1分子の数は、トリガーODNPへのアニーリングに対して、二本鎖核酸分子由来のトリガーODNPの相補鎖と効果的に競合するために、好ましくは、トリガーODNPの数より多い。
【0130】
N1分子を調製するための第1の型の方法の例は、図5に示される。この図に示されるように、二本鎖ゲノムDNAは、制限エンドヌクレアーゼによって、まず切断され得る。消化産物は、変性され得、そして消化産物のうちの1つの一方の鎖は、核酸増幅反応を開始するためのトリガーODNPとして使用され得る。
【0131】
(b.N1分子を提供するための第2の型の例示的方法)
トリガーODNPをT1分子にアニーリングすることによってN1が提供される本発明の特定の実施形態において、このトリガーODNPは、NARSのセンス鎖の配列を含む。トリガーODNPは、病原生生物を起源とする標的核酸(例えば、ゲノム核酸)に由来し得る。N1が、その認識配列の外側にニックを形成するニック形成エンドヌクレアーゼ(例えば、N.BstNB I)によって認識可能なNERSを含む特定の実施形態が、図6に例示される。この図によって例示されるように、NERSを含むゲノムDNAまたはそのフラグメントは、変性され、そしてゲノムDNAの一方の鎖またはその鎖のフラグメントは、T1分子にアニーリングする。このT1分子は、NERSのアンチセンス鎖の配列を含む、ゲノムDNAの他方の鎖の一部である。T1分子へのトリガーODNPのアニーリングは、増幅反応のための開始核酸分子N1を提供する。増幅反応混合物中のT1分子の数は、好ましくは、NERSのセンス鎖の配列を含むゲノムDNAまたはそのフラグメントの鎖の数よりも多い。
【0132】
上記のゲノムDNAは、特定の実施形態において、固体支持体に固定され得る。他の実施形態において、T1分子が固体支持体に固定され得る。
【0133】
トリガーODNPが、標的核酸に由来し、そしてNARSのセンス鎖の配列を含む、関連する実施形態において、T1分子は、その3’部分(すなわち、領域Xおよび領域Y)において(その5’部分(すなわち、領域Z)においてではなく)、トリガーODNPに少なくとも実質的に相補的であり得る(図7)。T1の3’部分は、NARSのアンチセンス鎖の配列を含み、その結果、T1のトリガーODNPへのアニーリングによって形成される開始核酸は、二本鎖NARSを含む。NARSを認識するNAの存在下において、N1分子は、ニック形成される。次いで、ニック形成部位の3’末端は、T1分子中のNARSのアンチセンス鎖の配列の5’の領域をテンプレートとして使用して伸長される。得られた増幅産物は、トリガーODNPの一部ではなく、NARSのアンチセンス鎖の配列の5’側に位置するT1の領域(すなわち、領域Z1)に相補的である一本鎖核酸分子である。
【0134】
(c.N1分子を提供するための第3の型の例示的方法)
本発明の特定の実施形態では、N1は、NARSおよびRERSの両方を含むゲノム核酸に直接由来する二本鎖核酸である。例示的なNARSとして、その認識配列の外側にニックを形成するニック形成エンドヌクレアーゼ(例えば、N.BstNB I)によって認識可能なNERSを用いる実施形態が、図8に例示される。この図に示されるように、NERSおよびRERSを含むゲノムDNAは、RERSを認識する制限エンドヌクレアーゼによって消化され得る。NERSを含む消化産物は、開始核酸分子(N1)として機能し得る。
【0135】
(d.N1分子を提供するための第4の型の例示的方法)
本発明の特定の実施形態では、開始核酸分子N1は、種々のODNP対を用いて生成される完全にか、または部分的に二本鎖の核酸分子である。ODNP対を使用してN1分子を調製する方法は、図9〜11と関連して以下に記載される。
【0136】
1つの実施形態において、N1の前駆体は、二本鎖NARSおよび二本鎖RERSを含む。このNARSおよびRERSは、ODNP対を用いて、この前駆体に組み込まれる。例示的なNARSとして、その認識配列の外側にニックを形成するNE(例えば、N.BstNB I)によって認識可能なNERS、および例示的なRERSとしてIIs型制限エンドヌクレアーゼ認識配列(TRERS)を用いる実施形態が、図9に例示される。この図に示されるように、第1のODNPは、NERSの一方の鎖の配列を含み、一方、第2のODNPは、TRERSの一方の鎖の配列を含む。これらの2つのODNPが、標的核酸の一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、生じる増幅産物(すなわち、N1の前駆体)は、二本鎖NERSおよび二本鎖TRERSの両方を含む。TRERSを認識するIIs型制限エンドヌクレアーゼの存在下で、この増幅産物は、二本鎖NERSを含む核酸分子N1を生成するために消化される。
【0137】
別の実施形態において、N1の前駆体は、2つの二本鎖NARSを含む。これらの2つのNARSは、2つのODNPを用いて、N1の前駆体に組み込まれる。例示的なNARSとして、その認識配列の外側にニックを形成するニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能なNERSを用いる実施形態が、図10aに例示される。この図に示されるように、両方のODNPが、NERSのセンス鎖の配列を含む。これらの2つのODNPが、標的核酸の一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、生じる増幅産物は、2つのNERSを含む。これらの2つのNERSは、互いに同一であっても同一でなくても良いが、好ましくは、それらは同一である。NERSを認識するNE(単数または複数)の存在下で、この増幅産物は、二本鎖NERSを各々含む2つの核酸分子(N1aおよびN1b)を生成するために、2回(各鎖において1回)ニック形成される。
【0138】
なお別の実施形態において、N1の前駆体は、2つの半改変RERSを含む。これらの2つの半改変RERSは、2つのODNPを使用することによって、この前駆体に組み込まれる。この実施形態は、図11に例示される。この図に示されるように、第1のODNPおよび第2のODNPの両方が、RERSの一方の鎖の配列を含む。これらの2つのODNPが、改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で、標的核酸の一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、生じる増幅産物は、2つの半改変RERSを含む。これらの2つのRERSは、互いに同一であっても同一でなくても良い。半改変RERSを認識するRE(単数または複数)の存在下で、上記の増幅産物は、半改変RERSの少なくとも一方の鎖の配列を各々含む2つの部分的に二本鎖の核酸分子(N1aおよびN1b)を生成するためにニック形成される。
【0139】
上記の第1のODNP、第2のODNPまたは両方は、特定の実施形態において固体支持体に固定され得る。他の実施形態において、標的核酸を含むサンプルの核酸分子が固定される。
【0140】
(e.N1分子を提供するための第5の型の例示的方法)
本発明の他の実施形態において、開始核酸分子N1は、NARSおよび標的核酸に少なくとも実質的に相補的な突出部を有する部分的に二本鎖の核酸分子である。N1が、例示的なNARSとして、その認識配列の外側にニックを形成するニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能なNERSを有する例示的な実施形態が、図12に例示される。この図に示されるように、N1分子は、NSを含むか、または伸長の際にNSを形成するかのいずれかである鎖中の5’突出部を含み得る。あるいは、N1分子は、NSを含まず、伸長の際にNSを形成もしない鎖中の3’突出部を含み得る。N1分子の突出部は、標的核酸分子に少なくとも実質的に相補的でなければならず、その結果、N1分子の突出部は、標的核酸分子にアニーリングし得る。標的核酸へのN1のアニーリングは、目的の生物学的サンプル中に標的核酸が存在する場合、標的核酸とN1分子との間で形成される複合体(「標的−N1複合体」)の単離を可能にする。
【0141】
例えば、生物学的サンプル中の核酸分子が、図12に示されるように、固体支持体に固定され得る。このような固定は、当該分野で公知の任意の方法によって実施され得、この方法としては、固定剤の使用または組織プリンティングが挙げられるが、これらに限定されない。次いで、特定の標的核酸分子に実質的に相補的である突出部を有するN1分子が、サンプルに適用される。このサンプル中に標的核酸が存在する場合、N1は、その突出部を介して、この標的核酸にハイブリダイズする。続いて、このサンプルは、任意のハイブリダイズしていないN1分子を除去するために洗浄される。DNAポリメラーゼおよびN1中のNERSを認識するニック形成エンドヌクレアーゼの存在下で、一本鎖核酸分子A1が増幅される。適切なT2分子のさらなる存在下で、別の一本鎖核酸分子A2が増幅される。しかし、標的核酸が、サンプル中に存在しない場合、N1は、サンプル中のいずれの核酸分子ともハイブリダイズできず、従って、サンプルから洗い出される。従って、この洗浄された生物学的サンプルが、核酸増幅反応混合物(すなわち、N1の一部をテンプレートとして使用する一本鎖核酸増幅に必要な全ての成分(例えば、N1分子中のNERSを認識するNEおよびDNAポリメラーゼ)を含む混合物)とともにインキュベートされる場合、N1の上記部分に相補的であるいずれの一本鎖核酸分子も増幅されない。
【0142】
標的核酸分子を固定することに加えて、標的−N1複合体は、まずN1分子を生物学的サンプル中の標的核酸分子とハイブリダイズし、次いで、標的核酸に結合した官能基によって複合体を単離することによって、精製され得る。例えば、標的核酸が、ビオチン分子で標識され得、続いて、標的と結合したビオチン分子を介して(固定化ストレプトアビジンを用いて、この複合体を沈殿させるように)、標的−N1複合体が精製され得る。
【0143】
特定の関連の実施形態において、N1は、生物学的サンプル由来の固定された標的核酸を、一本鎖T1分子とハイブリダイズさせることによって形成される。これらの実施形態の一例が、標的核酸を固定しないが、上記のT1分子を、その5’末端を介して固体支持体に固定するというものである。標的核酸がサンプル中に存在する場合、サンプルの核酸とT1とのハイブリダイゼーションは、その固体支持体が洗浄された場合に、その標的がその固体支持体に結合されたまま残ることを可能にする。ニック形成剤認識配列(このアンチセンス配列が、T1に存在する)を認識するニック形成剤とDNAポリメラーゼとの存在下において、一本鎖核酸分子は、T1の認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して5’側に位置づけられる配列をテンプレートとして使用して増幅される。標的がサンプル中に存在しない場合、サンプルの核酸は、T1が結合された固体支持体から洗い流される。従って、一本鎖核酸分子は、T1の一部分をテンプレートに使用して増幅されない。
【0144】
NARSの外側にニックを形成するニック形成剤によって認識可能なNARSを使用する上記の実施形態の別の例を、図13に例示する。この図に示されるように、生物学的サンプルの核酸は、その5’末端を介して固定される。次いで、生じる固定された核酸を、T1分子(これは、3’→5’に、生物学的サンプル中に存在することが疑われる標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的な配列、およびNARSのアンチセンス鎖の配列を含む)に対してハイブリダイズさせる。標的核酸がその生物学的サンプル中に存在する場合、T1分子は、標的核酸にハイブリダイズして、N1分子を形成する。このN1分子は、標的核酸が結合された固相を洗浄することによって、ハイブリダイズしていないT1分子から分離される。DNAポリメラーゼと、NARSを認識するニック形成剤との存在下において、N1は、テンプレートとして使用されて、一本鎖核酸分子A1を増幅する。しかし、標的核酸がサンプル中に存在しない場合、T1は、サンプル中のいかなる標的核酸ともハイブリダイズできず、従って、固体支持体から洗い流される。結果として、固体支持体に結合されるN1は形成され得ず、そしてN1の一部分に対して相補的な一本鎖核酸分子は増幅され得ない。
【0145】
NARSの外側にニックを形成するニック形成剤によって認識可能なNARSを使用する上記の実施形態の別の例を、図25に例示する。この図に示されるように、T1分子は、その5’末端を介して、固体支持体に固定される。T1分子は、5’→3’に、NARSのセンス鎖の配列、および標的核酸の3’部分に対して実質的に相補的な配列を含む。T1分子は、生物学的サンプル由来の核酸と混合される。標的核酸がサンプル中に存在する場合、T1分子は、標的とハイブリダイズされて、テンプレート分子を形成する。T1分子が結合された固体支持体を洗浄する場合、標的は、T1分子とのそのハイブリダイゼーションにより、固体支持体に結合されたまま残る。DNAポリメラーゼの存在下において、標的は、テンプレートとしてT1分子を使用して、その3’末端から伸長される。標的の伸長産物と、T1分子の伸長産物との間で形成される二重鎖は、二本鎖NARSを含む。NARSを認識するニック形成剤とDNAポリメラーゼとの存在下において、一本鎖核酸分子は、テンプレートとして標的核酸の一部分を使用することにより増幅される。しかし、標的核酸がサンプル中に存在しない場合、T1分子は、標的とハイブリダイズできない。従って、一本鎖核酸分子は、テンプレートとして標的を使用することにより増幅されない。
【0146】
上記の実施形態の別の例を、図26に例示する。この例では、固定されたT1分子は、標的核酸に対して実質的に相補性であるが、標的の3’部分に対しては必ずしも相補的ではない。T1はまた、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む。標的が生物学的サンプル中に存在する場合、T1分子がサンプル中の核酸と混合されると、そのT1分子は標的とハイブリダイズし得る。T1が結合された固体支持体が洗浄される場合、標的は、T1分子とのそのハイブリダイゼーションにより、固体支持体に結合されたまま残る。DNAポリメラーゼと、NARSを認識するニック形成剤との存在下では、NARSのセンス鎖の配列における1つ以上のヌクレオチドが、標的中のヌクレオチドと従来の塩基対を形成しない場合であっても、特定の状況下において、一本鎖核酸が、標的の一部分をテンプレートとして使用することにより増幅され得る。テンプレート核酸が二本鎖NARSを含まない場合に一本鎖核酸が増幅される状況についての詳細な説明は、「Amplification of Nucleic Acid Fragments Using Nicking Agents」との発明の名称が付けられた米国出願において提供される。しかし、標的核酸がサンプル中に存在しない場合、プローブは、標的とハイブリダイズできない。従って、一本鎖核酸分子は、標的をテンプレートとして使用することによって増幅されない。
【0147】
(3.特異性)
本発明の方法は、サンプル中における特定の病原性生物の存在または非存在を検出するため、ならびに、いくつかの密接に関連した病原性生物の存在を検出するために使用され得る。例えば、上記の例示的な方法の第1の型および第2の型に関して、T1分子がアニールするトリガーODNPの部分は、検出されるべき特定の病原性生物に対して特異的な標的核酸またはその一部分に由来し得る。あるいは、このようなトリガーODNPの一部分は、いくつかの密接に関連した病原性生物の間で実質的にまたは完全に保存されているが、他のより遠縁または無縁の病原性生物には存在しない標的核酸またはその一部分に由来し得る。
【0148】
特定の病原性生物に「特異的」な標的核酸またはその部分とは、特定の生物に存在するが、他のすべての生物(その特定の生物に密接に関連した生物を含む)には存在しない配列を有する標的核酸またはその部分をいう。さらに、いくつかの密接に関連した病原性生物の間で「実質的に保存されている」標的核酸中の領域とは、適切な条件下において、いくつかの密接に関連した生物の各々における対応領域にハイブリダイズし得るが、同一条件下において、より遠縁または無縁の生物由来の標的核酸中の類似領域にはハイブリダイズし得ない核酸分子が存在する、標的核酸中の領域をいう。また、いくつかの密接に関連した生物の間で「完全に保存されている」標的核酸中の領域とは、いくつかの密接に関連した病原性生物の各々に由来する標的核酸において同一の配列を有する領域をいう。
【0149】
同様に、上記の第4の型の例示的な方法に関して、プライマー対を使用して増幅される標的核酸の部分は、特定の病原性生物に対して特異的である領域、またはいくつかの密接に関連した病原性生物の間では実質的にまたは完全に保存されているが、他の遠縁または無縁の病原性生物には存在しない領域であり得る。さらに、標的核酸の増幅部分は、いくつかの密接に関連した病原性生物の間における、標的核酸の可変領域であり得る。本明細書中で使用される場合、標的核酸の「可変」領域とは、密接に関連した生物由来の標的核酸の間では50%未満の配列同一性を有するが、同じ密接に関連した生物由来の標的核酸の間で80%より高い配列同一性を有する領域によって各端を囲まれている領域をいう。本明細書中で使用される場合、2つの核酸の配列同一性のパーセントは、Altschulら(J.Mol.Biol.215:403−10,1990)のBLASTプログラムを、それらのデフォルトパラメータとともに使用して決定される。これらのプログラムは、KarlinおよびAltschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−7,1993)におけるように改変された、KarlinおよびAltschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264−8,1990)のアルゴリズムを実行する。BLASTプログラムは、例えば、ウェブサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)にて利用可能である。
【0150】
同様に、上記の第5の型の例示的な方法に関して、N1の突出部は、病原性生物に特異的な標的核酸中の領域、またはいくつかの密接に関連した病原性生物の間で実質的にまたは完全に保存された標的核酸中の領域に対して、少なくとも実質的に相補的であり得る。この突出部が、特定の生物由来の標的核酸またはその一部分に対して完全に相補的であるが、1つ以上の密接に関連した生物由来の標的核酸またはその一部分に対しても実質的に相補的である場合、特定の生物の存在を検出するため、または密接に関連した生物のいずれか1つの存在を検出するためのいずれかのために、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは変動され得る。例えば、N1分子が、高度にストリンジェントな条件下で生物学的サンプル由来の核酸とハイブリダイズされる場合、テンプレートとしてN1分子の一部分を使用してハイブリダイズされていないN1分子を取り除いた後で、核酸増幅を行うことにより、その生物学的サンプル中における特定の生物の存在が示され得る。他方、N1分子が、中程度または低度のストリンジェント条件下で生物学的サンプル由来の核酸とハイブリダイズされる場合、核酸増幅(テンプレートとしてN1分子の一部分を使用してハイブリダイズされていないN1分子を取り除いた後)により、特定の生物および/または特定の生物に密接に関連した1つ以上の生物の存在が示され得る。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの調節は、当該分野で周知であり、そして例えば、SambrookおよびRussell、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,2001に見出され得る。
【0151】
初回核酸分子(N1)が、トリガーODNPをT1分子にアニーリングさせることによって提供される実施形態において、このトリガーODNPまたはその一部分、ならびにT1においてNARSの一方の鎖の配列に対して3’側に位置づけられるT1分子の一部分は、互いに対して、完全に相補的ではなく、実質的に相補的であり得る。例えば、トリガーODNPが、いくつかの密接に関連した病原性生物の間で実質的に保存されている標的核酸の領域に由来し、そしていくつかの生物のうちのいずれかの存在が検出されることを必要とする場合、トリガーODNPに対して実質的に相補的なT1分子が使用され得る。このような状況では、プライマーの伸長反応は、トリガーODNPがT1分子に対してアニーリングするのを妨げる程、または、トリガーODNPが、テンプレートとしてT1分子の一部分を使用して伸長されるのを妨げる程高いストリンジェントではない条件下で実施される必要がある。しかし、このような条件はまた、T1分子が、トリガーODNP以外の核酸分子に対して非特異的にアニーリングするのを防止するに十分なストリンジェントである必要もある。トリガーODNPまたはその一部分がT1分子の一部分に対して実質的に相補的である核酸増幅のために適切な条件は、反応温度および/または反応緩衝液の組成もしくは濃度を調節することによって解明され得る。一般的には、ハイブリダイゼーション反応と同様に、反応温度を上昇させることは、増幅反応のストリンジェンシーを増大させる。
【0152】
(4.A1分子)
上記のように、A1分子は、テンプレートとしてN1の一部分を使用して増幅される。特定の実施形態において、A1は、比較的短いものであり得、そして最大で25ヌクレオチド、最大で20ヌクレオチド、最大で17ヌクレオチド、最大で15ヌクレオチド、最大で10ヌクレオチド、または最大で8ヌクレオチドを有する。このような短い長さは、N1分子の作製において使用されるT1分子またはODNPを適切なように設計することによって達成され得る。例えば、N1分子を提供する第3の型について(図6)、T1は、NARSのアンチセンス鎖の配列に対して5’側の短い領域を有するように設計され得る。N1分子を提供する第4の型について(図9〜11)、ODNP対は、そのプライマーが標的核酸にアニールする場合に互いに対して近接となるように設計され得る。A1分子が短い長さであることは、有益であり得る。なぜなら、そうすることは、増幅の効率および速度を増加させるからである。さらに、このことは、鎖置換活性を有さないDNAポリメラーゼの使用を可能にする。これはまた、質量分析法による分析のような特定の技術を介して、A1分子および/または以後の増幅反応(ここでは、A1が、初回増幅プライマーとして使用される)の生成物(A2)の検出を容易にする。
【0153】
(5.T2分子)
本発明のT2分子は、NARSのセンス鎖の配列、ならびに、そのNARSのセンス鎖の配列に対して3’側に位置づけられ、テンプレートとして初回核酸分子N1の一部分を使用して増幅される一本鎖核酸分子(A1)に対して少なくとも実質的に相補的な配列、を含む。好ましくは、T2分子は、A1分子に対して完全に相補的な配列を含む。
【0154】
また上記で考察されたように、上記の第4の型の例示的な方法において、プライマー対を用いて増幅される標的核酸の部分は、特定の病原性生物に対して特異的である領域、またはいくつかの密接に関連した病原性生物の間では実質的にまたは完全に保存されているが、他の遠縁または無縁の病原性生物には存在しない領域であり得る。さらに、標的核酸の増幅部分は、いくつかの密接に関連した病原性生物の間における、標的核酸の可変領域であり得る。増幅領域が実質的に保存されている場合、NARSのアンチセンス鎖の配列に対して3’側に位置づけられ、特定の生物由来の増幅領域の一方の鎖に対して同一である配列を含むT2分子を使用して、高度にストリンジェントな条件下(例えば、特定の生物以外の生物に由来するA1分子が、T2分子とハイブリダイズするのを防止するために、比較的高い増幅温度)で増幅反応を実施することにより、特定の生物の存在が検出され得る。あるいは、中程度または低度のストリンジェント条件下(例えば、特定の生物に密接に関連する生物に由来するA1分子がT2分子とハイブリダイズすることを可能にし、そしてテンプレートとしてT2分子の一部分を使用して伸長されることを可能にするために、比較的低い増幅温度)で増幅反応を実施することにより、特定の生物の存在を検出するために、ならびに、特定の生物に密接に関連した1つ以上の生物の存在を検出するために、同じT2分子が使用され得る。
【0155】
さらに、増幅領域が、密接に関連した生物の間における可変領域である実施形態において、T2分子は、上記の密接に関連した生物の中で特定の生物に由来するN1分子を使用して増幅されるA1分子に対して少なくとも実質的に相補的である配列を含み得る。テンプレートとしてこのT2分子の一部分を使用する一本鎖核酸分子の増幅によって、生物学的サンプル中における特定の生物の存在が示される。
【0156】
特定の実施形態では、さらなるT2分子は、第2の増幅反応に必要とされない。これらの実施形態では、N1分子を生成する際に使用された第2のODNPは、その第2のODNPがA1にアニールするのを可能にする3’末端の配列を有する。この第2のODNPはまた、NARSのセンス鎖の配列を含む。従って、テンプレートとして第2のODNPを使用したA1の伸長により、二本鎖NARSが作製される。DNAポリメラーゼと、NARSを認識するNAとの存在下において、一本鎖核酸(A2)は、テンプレートとしてA1を使用して増幅される。上記の実施形態の一例を、図10bに例示する。この図10bにおいて、A1aおよびA1bは、NERSのセンス鎖の配列を各々含む2つのODNPを使用する第1の増幅反応において増幅される(図10a)。
【0157】
T2分子は、特定の実施形態では、固体支持体に、好ましくはその5’末端で、固定され得る。他の実施形態では、T2分子は、固定されなくてもよい。
【0158】
(6.増幅された一本鎖核酸の検出および/または特徴付け)
病原性生物に由来する標的核酸の存在は、増幅産物(例えば、A1、A2など)を検出および/または特徴付けることによって検出され得る。一本鎖核酸分子を検出または特徴付けるために適切な任意の方法が使用され得る。例えば、増幅反応は、標識化されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下において実施され得、その結果、その標識が、増幅された核酸分子に組み込まれる。核酸フラグメントに組み込まれるために適切な標識、およびそのフラグメントの以後の検出のための方法は、当該分野で公知であり、そして例示的な標識としては、放射性標識(例えば、32P、33P、125Iまたは35S)、着色反応産物を生成し得る酵素(例えば、アルカリホスファターゼ)、蛍光標識(例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC))、ビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン、抗原、ハプテン、または蛍光色素が挙げられるが、これらに限定されない。
【0159】
あるいは、増幅された核酸分子は、その増幅された核酸分子に対して実質的に(好ましくは、完全に)相補的である標識化されたディテクターオリゴヌクレオチドの使用によって検出され得る。標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と同様に、ディテクターオリゴヌクレオチドもまた、放射性タグ、化学発光タグまたは蛍光タグ(蛍光分極または蛍光共鳴エネルギー輸送を使用する検出のために適切なタグを含む)などで標識され得る。Spargoら,Mol.Cell.Probes 7:395−404,1993;Hellyerら,J.Infectious Diseases 173:934−41,1996;Walkerら,Nucl.Acids Res.24:348−53,1996;Walkerら,Clin.Chem.42:9−13,1996;Spearsら,Anal.Biochem.247:130−7,1997;Mehrpouyanら,Mol.Cell.Probes 11:337−47,1997;およびNadeauら,Anal.Biochem.276:177−87,1999を参照のこと。
【0160】
特定の実施形態において、増幅された核酸分子は、さらに特徴付けられ得る。この特徴付けにより、これらの核酸分子の正体が確認され得、それにより、生物学的サンプル中における病原性生物の標的核酸の存在が確認され得る。このような特徴付けは、一本鎖核酸フラグメントを特徴付けるために適切な任意の公知の方法を介して行われ得る。例示的な技術としては、クロマトグラフィー(例えば、液体クロマトグラフィー)、質量分析法および電気泳動が挙げられるが、これらに限定されない。種々の例示的な方法の詳細な説明、米国仮特許出願60/305,637および同60/345,445(それらの全体が参考として援用される)に見いだされ得る。
【0161】
増幅産物を検出および/または特徴付けして、生物学的サンプル中の標的核酸の存在を検出することに加えて、標的核酸の存在は、増幅反応において生成された完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子(例えば、H1、H2またはそれらのニック形成生成物)を検出することによって検出され得る。好ましい実施形態において、二本鎖核酸分子の検出は、二本鎖核酸分子に特異的に結合し、そして二本鎖核酸分子への結合に際して蛍光性となる色素(例えば、蛍光性インターカレート剤)を、増幅混合物に添加することによって行われ得る。蛍光性インターカレート剤の添加により、核酸増幅のリアルタイムモニタリングが可能になる。あるいは、二本鎖核酸分子(例えば、H1およびH2)の生成を最大にするために、ニック形成伸長反応混合物中において、DNAポリメラーゼではなくNEを、不活性化し得る(例えば、熱処理によって)。NEの不活性化により、反応混合物中のすべてのニック形成された核酸分子が、二本鎖核酸分子を生成するように伸長される。
【0162】
種々の蛍光挿入剤が、当該分野において公知であり、そして本発明において使用され得る。例示的な挿入剤としては、米国特許第4,119,521号;同5,599,932号、同5,658,735号;同5,734,058号;同5,763,162号;同5,808,077号;同6,015,902号;同6,255,048号および同6,280,933号に開示される挿入剤、GlazerおよびRye、Nature 359:859〜61、1992において論じられる挿入剤、PicoGreen色素ならびに、例えば、SYBR(登録商標)Gold、SYBR(登録商標)Green IおよびSYBR(登録商標)Green IIのようなSYBR(登録商標)色素(Molecular Probes、Eugene WA)が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光挿入剤によって生成される蛍光は、PMT、CCDカメラ、蛍光顕微鏡、蛍光スキャナー、および蛍光マイクロプレートリーダー、蛍光キャピラリーリーダーを含む種々の検出器によって検出され得る。
【0163】
(7.診断において有用な組成物およびキット)
病原体診断において有用な組成物およびキットは、核酸の指数関数的な増幅のための、上記のような組成物およびキットと同じであり得る。特定の実施形態において、これらの組成物およびキットは、増幅生成物の検出を容易にするために、付加的な成分をさらに含み得る。例えば、付加的な成分は、増幅生成物へ組み込まれる標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸であり得る。あるいは、増幅生成物とハイブリダイズ可能である標識された検出オリゴヌクレオチドであり得る。特定の実施形態において、付加的な成分は、蛍光挿入剤であり得る。
【0164】
(8.本発明の診断的使用)
本発明は、目的の任意の標的核酸の存在を迅速に検出することにおいて有用である。特定の実施形態において、標的核酸は、病原性生物(例えば、感染性疾患を引き起こす生物)由来であるか、または病原性生物を起源とする。このような病原性生物は、生体に脅威を突きつける病原性生物(例えば、炭疽および痘瘡)を含む。さらに、上記のように、本発明の方法は、特定の病原性生物の存在の検出のために、そして、幾つかの密接に関連する病原性生物の存在を検出するために使用され得る。本発明はまた、特定の抗生物質に対して耐性のある生物を検出するために使用され得る。例えば、本発明の方法、組成物またはキットは、抗生物質または抗生物質の特定の組み合わせで処置された被験体における特定の病原性生物の検出のために使用され得る。さらに、幾つかの実施形態における核酸増幅を検出するための蛍光挿入剤の使用は、生物学的サンプルにおける標的核酸のリアルタイム検出を提供する。
【0165】
(C.遺伝子バリエーション検出における核酸増幅方法および組成物の使用)
指数関数的な核酸増幅のための方法および組成物はまた、標的核酸における規定された位置で、遺伝子バリエーションを検出するために使用され得る。遺伝子バリエーションを含む標的核酸またはその一部は、第1の増幅反応において、テンプレートとして使用される初回核酸分子(N1)へ、最初に組み込まれる。初回核酸分子はまた、第1のニック形成剤認識配列の少なくとも一方の鎖を含み、従って、DNAポリメラーゼおよび第1のニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下において、第1の増幅反応を可能にする。第1の増幅反応からの生成物(A1)は、標的核酸における規定された位置のヌクレオチドまたは上記のヌクレオチドの相補的ヌクレオチドを含む。次いで、A1は、別のテンプレート核酸(T2)に対してアニールする。T2は、第2のNARSのセンス鎖の配列を含み、従って、DNAポリメラーゼおよび第2のNARSを認識するニック形成剤の存在下で、第2の増幅反応を可能にする。A1および/またはA2の特徴付けは、標的核酸における遺伝子バリエーションの同定を可能にする。
【0166】
(1.標的核酸)
遺伝子バリエーションを同定することに関連する本発明の標的核酸は、参照として野生型核酸配列を使用する遺伝子バリエーションを含み得る任意の核酸分子である。それは、固体支持体に対して固定化されてもよいし、または固定化されなくてもよい。それは、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。一本鎖標的核酸は、変性した二本鎖DNAの一方の鎖であり得る。あるいは、いかなる二本鎖DNAにも由来しない一本鎖核酸であり得る。1つの局面において、標的核酸は、ゲノムDNA、リボソームDNAおよびcDNAを含むDNAである。別の局面において、標的は、mRNA、rRNAおよびtRNAを含むRNAである。
【0167】
1つの局面において、標的核酸は、天然に存在する核酸か、または天然に存在する核酸由来のいずれかである。天然に存在する標的核酸は、生物学的サンプルから得られる。好ましい生物学的サンプルは、1以上の哺乳動物組織、好ましくはヒト組織(例えば、血液、血漿/血清、髪、皮膚、リンパ節、膵臓、肝臓など)および/あるいは細胞または細胞株を含む。生物学的サンプルは、1以上のヒト組織および/またはヒト細胞を含み得る。哺乳動物および/またはヒトの組織および/または細胞は、1以上の腫瘍組織および/または腫瘍細胞をさらに含み得る。
【0168】
生物学的サンプルから核酸の集団を単離するための方法論は、本発明の属する分野の当業者に周知であり、そして容易に利用可能である。例示的な技術は、例えば、以下の実験室研究マニュアルにおいて記載される:Sambrookら、「Molecular Cloning」(Cold Spring Harbor Press、第3版、2001)およびAusubelら、「Short Protocols in Molecular Biology」(1999)(本明細書でその全体が参考として援用される)。核酸単離キットはまた、多数の企業から商業的に入手可能であり、そして単離プロセスを簡素化および促進するために使用され得る。
【0169】
標的核酸は、1以上の正体不明のヌクレオチド(すなわち、遺伝子バリエーション)を含む。本発明は、未知のヌクレオチドの正体が分かり、それによって遺伝子バリエーションが同定される、組成物および方法を提供する。正体不明の塩基は、ヌクレオチド座(または「規定された位置(position)」あるいは「規定された位置(location)」)に存在し、それは、標的核酸上に正確な位置を有する1、2、3、4、5、6、7、またはそれ以上のヌクレオチドを含む特定のヌクレオチドまたは領域をいう。
【0170】
用語「多型性」は、集団における小さい領域(すなわち、1〜数個(例えば、2、3、4、5、6、7、または8)のヌクレオチド長)中の、2以上の遺伝子決定された代替配列または対立遺伝子の存在をいう。2以上の遺伝子決定された代替配列または対立遺伝子は各々、「遺伝子バリエーション」として言及され得る。遺伝子バリエーションは、選択された集団において最も頻繁に生じる対立遺伝子形態であり得、それはまた、「野生型形態」または他の対立遺伝子形態の1つとして言及され得る。二倍体生物は、対立遺伝子形態に対して同型接合または異型接合であり得る。
【0171】
遺伝子バリエーションは、発現レベルおよび発現生成物(すなわち、コードされたペプチド)を含む遺伝子発現に対する作用を有してもよいし、または有さなくてもよい。遺伝子発現に作用する遺伝子バリエーションはまた、点変異、フレームシフト変異、調節性変異、ナンセンス変異、およびミスセンス変異を含む「変異」として言及される。「点変異」は、野生型塩基(すなわち、A、C、G、またはT)が、核酸サンプル内の規定されたヌクレオチド座で、他の標準的な塩基の1つと置換される変異をいう。点変異は、塩基置換または塩基欠失によって引き起こされ得る。「フレームシフト変異」は、小さい欠失または挿入によって引き起こされ、これは次に、遺伝子の読み取り枠のシフトを引き起こし、従って、新規なペプチドが形成される。「調節性変異」は、非コード領域(例えば、イントロン)(正確な遺伝子発現(例えば、生成量、タンパク質の局在性、発現の時期)に作用するコード領域に対して5’側または3’側に位置する領域)における変異をいう。「ナンセンス変異」は、単一のヌクレオチド変化であって、ペプチド伸長の未成熟な終結(すなわち、短縮されたペプチド)を引き起こす「停止」コドンとして読まれる三重鎖コドン(ここで変異が生じる)が結果として生じる。「ミスセンス」変異は、異なるアミノ酸に交換される1個のアミノ酸が生じる変異である。このような変異は、ペプチドのフォールディング(3次元構造)および/または多量体タンパク質における他のペプチドとのその適切な会合において変化を引き起こし得る。
【0172】
本発明の1つの局面において、遺伝子バリエーションは、「単一ヌクレオチド多型」(SNP)であり、これは、任意の単一のヌクレオチド配列改変、好ましくは、生物の集団において一般的であり、そしてメンデル様式で遺伝される単一ヌクレオチド配列改変をいう。代表的には、SNPは、2個の可能性のある塩基のいずれかであり、そして、SNP部位で第3のヌクレオチド実体または第4のヌクレオチド実体を見出す可能性はない。
【0173】
遺伝子バリエーションは、疾患または障害と関連しうるか、またはそれらを引き起こし得る。本明細書で使用される用語「関連する」は、遺伝子バリエーションの発生と宿主における疾患または障害の存在との間の正の相関の存在をいう。このような疾患または障害は、ヒト遺伝性疾患または障害であり得、これらとしては、以下に限定されないが、嚢胞性線維症、膀胱癌、結腸直腸の腫瘍、鎌状血球貧血、サラセミア、al−抗トリプシン(al−antitrypsin)欠損、レッシュ−ナイハン症候群、嚢胞性線維症/ムコビシドーシス、デュシェーヌ/ベッカー筋ジストロフィー、アルツハイマー病、X染色体依存性精神遅滞、およびハンティングトン舞踏病、フェニルケトン尿症、ガラクトース血症、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、重症複合免疫不全、α−1−抗トリプシン欠損、白皮症、アルカプトン尿症、リソソーム蓄積症、エーレルス−ダンロー症候群、血友病、グルコース−6−ホスフェートデヒドロゲナーゼ障害、無ガンマグロブリン血症、尿崩症、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、ファブリー病、脆弱X症候群、家族性高コレステロール血症、多発性嚢胞腎臓症、遺伝性球状赤血球病、マルファン症候群、ヴォン・ヴィレブランド病、神経線維腫症、結節硬化症、遺伝性出血性毛細管拡張症、家族性結腸ポリポーシス、エーレルス−ダンロー症候群、筋緊張性ジストロフィー、骨形成不全症、急性間欠性ポルフィリン症、およびフォン・ヒッペル−リンダウ病が挙げられる。
【0174】
標的核酸は、以下に記載されるように、初回核酸に組み込まれる前に増幅され得る。核酸を増幅させるための任意の公知の方法が、使用され得る。例示的な方法としては、以下に限定されないが、Qβレプリカーゼ、鎖置換増幅(Walkerら、Nucleic Acid Research 20:1691〜6、1995)、転写媒介増幅(Kwohら、PCT国際特許出願公開番号WO88/10315)、RACE(Frohman、Methods Enzymol.218:340〜56、1993)、片側PCR(Oharaら、Proc.Natl.Acad.Sc.86:5673〜7、1989)、およびギャップ−LCR(Abravayaら、Nucleic Acids Res.23:675〜82、1995)の使用が挙げられる。引用された文献およびPCT国際特許出願は、本明細書でその全体が参考として援用される。
【0175】
(2.初回核酸分子(N1))
遺伝子バリエーションの検出のために有用な初回核酸分子は、種々のアプローチによって提供され得る。例えば、N1は、T1分子に対する、トリガーオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングによって得られ得、ここでトリガープライマーは、標的核酸分子由来であり、そして標的核酸における遺伝子バリエーションを囲む(例えば、図14)。あるいは、N1は、(例えば、図15に示されるように制限エンドヌクレアーゼによる標的核酸の消化によって)二本鎖標的核酸より直接誘導され得る。N1はまた、適切なオリゴヌクレオチドプライマー対の使用によって調製され得る(例えば、図16〜18)。初回核酸分子を提供するための幾つかの例示的な手段は、以下に記載される。
【0176】
(a.N1分子を提供するための第1の型の例示的な方法)
上記のように、N1は、T1分子に対するトリガーオリゴヌクレオチドのアニーリングによって提供され得る。トリガープライマーは、標的核酸の遺伝子バリエーションを囲む必要がある。N1分子を提供するためのこの型の例示的な方法が、図14において示される。この図に示されるように、二本鎖標的核酸(例えば、ゲノムDNA)は、認識配列が、遺伝子バリエーションが存在する規定された位置に近い制限エンドヌクレアーゼによって、まず切断される。消化生成物は、変性され得、次いで、潜在的な遺伝子バリエーションを含む消化生成物の鎖は、テンプレート核酸(T1)に対してアニールするためにトリガーオリゴヌクレオチドプライマーとして使用され得る。T1は、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、その結果、DNAポリメラーゼおよび認識配列を認識するニック形成剤の存在下において、標的核酸の遺伝子バリエーションの相補的なヌクレオチドを含む一本鎖核酸フラグメント(A1)が、増幅される。
【0177】
(b.N1分子を提供するための第2の型の例示的な方法)
本発明の特定の実施形態において、N1は、潜在的な遺伝子バリエーション、ニック形成剤認識配列、および制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む標的核酸から直接誘導される。例示的なニック形成剤認識配列として、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列の外側にニック形成するニック形成エンドヌクレアーゼ(例えば、N.BstNB I)によって認識可能な認識配列を用いる実施形態が、図15に示される。この図において示されるように、標的核酸は、標的核酸における配列を認識する制限エンドヌクレアーゼによって消化され得る。ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を含む消化生成物は、一本鎖核酸(A1)フラグメントを増幅するための初回核酸分子(N1)として機能し得る。遺伝子バリエーション(「X」)は、ニック形成剤によって生成されるニック形成部位に対応する位置と制限エンドヌクレアーゼの制限切断部位との間に存在する必要がある。このような位置によって、増幅されたフラグメント(A1)が、遺伝子バリエーションの相補体(「X])を含むことが可能となる。
【0178】
(c.N1分子を提供するための第3の型の例示的な方法)
本発明の特定の実施形態において、初回核酸分子N1は、種々のODNP対を使用して生成される完全に二本鎖の核酸分子か、または部分的に二本鎖の核酸分子である。N1分子を調製するためにODNP対を使用する方法は、図16〜18と合わせて、以下に簡単に記載される。より詳細な説明は、米国仮出願番号60/305,637および同60/345,445に見出され得る。
【0179】
特定の実施形態において、N1に対する前駆体は、二本鎖ニック形成剤認識配列および制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。ニック形成剤認識配列および制限エンドヌクレアーゼ認識配列は、プライマー対を使用して前駆体へ組み込まれる。例示的なニック形成剤認識配列として、ニック形成剤認識配列の外側にニック形成するニック形成剤(例えば、N.BstNB I)によって認識可能な認識配列、および例示的な制限エンドヌクレアーゼ認識配列として、IIs型制限エンドヌクレアーゼ認識配列(TRERS)を用いる実施形態が、図16に示される。この図に示されるように、第1のプライマーは、ニック形成剤認識配列の一方の鎖の配列を含み、一方、第2のODNPは、IIs型制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含む。これらの2つのODNPが、標的核酸の一部を増幅するためにプライマーとして使用される場合に、生じる増幅生成物(すなわち、N1に対する前駆体)は、二本鎖NERSおよび二本鎖TRERSの両方を含む。さらに、第1のプライマーは、遺伝子バリエーションの相補体に対して3’側に位置する標的核酸の一方の鎖の一部にアニールするように設計されるのに対し、第2のプライマーは、遺伝子バリエーションに対して3’側に位置する標的核酸の一方の鎖の一部にアニールするように設計される。このような設計によって、N1に対する前駆体が、遺伝子バリエーションおよびその相補体を囲むことが可能になる。TRERSを認識するIIs型制限エンドヌクレアーゼの存在下では、増幅生成物は、二本鎖NERSを含む部分的に二本鎖の核酸分子N1を生成するように消化される。
【0180】
他の実施形態において、N1に対する前駆体は、2つの二本鎖ニック形成剤認識配列を含む。2つのニック形成剤認識配列は、2つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、N1に対する前駆体へ組み込まれる。例示的なニック形成剤認識配列として、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列の外側にニック形成するニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能な認識配列を用いた実施形態が、図17に示される。この図に示されるように、両方のプライマーは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含む。さらに、第1のプライマーが、遺伝子バリエーションの相補体に対して3’側に位置する標的核酸の一方の鎖の一部にアニールするように設計されるのに対し、第2のプライマーは、遺伝子バリエーションに対して3’側に位置する標的核酸の一方の鎖の一部にアニールするように設計される。これらの2つのプライマーが、標的核酸の一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合に、生じる増幅生成物(すなわち、以下に記載されるN1aおよびN1bに対する前駆体)は、遺伝子バリエーションおよびその相補体、ならびに2つのニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。これらの2つの認識配列は、互いに同一であっても、または同一でなくてもよいが、好ましくは、それらは同一である。ニック形成エンドヌクレアーゼまたは認識配列を認識するニック形成エンドヌクレアーゼの存在下で、増幅生成物は、二本鎖ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列の1つを各々含む2つの部分的に二本鎖の核酸分子(N1aおよびN1b)を生成するために、2回(各鎖に対して1回)ニック形成される。
【0181】
例示的なニック形成剤認識配列として半改変された(hemimodified)制限エンドヌクレアーゼ認識配列を用いる別の実施形態が、図18に示される。この図に示されるように、第1のプライマーおよび第2のプライマーの両方は、制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含む。さらに、第1のプライマーは、遺伝子バリエーションの相補体に対して3’側に位置する標的核酸の一方の鎖の一部にアニールするように設計されるのに対し、第2のプライマーは、遺伝子バリエーションに対して3’側に位置する標的核酸の一方の鎖の一部にアニールするように設計される。これらの2つのプライマーが、改変されたデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、標的核酸の一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合に、生じる増幅生成物(すなわち、以下に記載されるN1aおよびN1bに対する前駆体)は、遺伝子バリエーションおよびその相補体、ならびに2つの半改変された制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。これらの2つの半改変された認識配列は、互いに同一であってよいし、または同一でなくてもよい。制限エンドヌクレアーゼおよび半改変された認識配列を認識する制限エンドヌクレアーゼの存在下で、上記増幅生成物は、1つの半改変された制限エンドヌクレアーゼ認識配列の少なくとも一方の鎖の配列を各々含む、2つの部分的に二本鎖の核酸分子(N1aおよびN1b)を生成するようにニック形成される。
【0182】
上記第1のODNP、第2のODNP、またはその両方は、特定の実施形態において固体支持体に固定化され得る。他の実施形態において、標的核酸を含むサンプルの核酸分子が、固定化される。
【0183】
(3.A1分子)
以上に記載されたように、A1分子は、N1の一部をテンプレートとして使用して増幅される。このN1の一部は、標的核酸の遺伝子バリエーションまたはその相補体を含み、その結果、A1は、遺伝子バリエーションの相補体または遺伝子バリエーション自体を含む。A1は、比較的短いものであり得、そして多くとも25個、20個、17個、15個、10個、8個のヌクレオチドを有する。このような短い長さは、N1分子を作製する際に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを適切に設計することによって達成され得る。例えば、N1分子を提供する第3の型について(図16〜18)、ODNP対は、それらが標的核酸にアニールする場合に、互いに近接となるように設計され得る。上記の本発明の診断適用と類似して、A1分子の長さを短くすることは、増幅効率および増幅速度を増加させ、鎖置換活性を有さないDNAポリメラーゼの使用を可能にし、A1分子および/またはA1が、例えば、質量分析のような特定の技術を介して初回増幅プライマーとして使用されるその後の増幅反応の生成物(A2)の検出を容易にする。
【0184】
(4.T2分子)
本発明のT2分子は、NARSのセンス鎖の配列、およびテンプレートとして開始核酸分子N1の一部を使用して増幅される一本鎖核酸分子(A1)に少なくとも実質的に相補的である(このNARSのセンス鎖の配列に対して3’側に位置する)配列を含む。T2は、ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤およびDNAポリメラーゼの存在下で、その認識配列のセンス鎖の配列を含むので、A1は、開始核酸伸長のためのプライマーとして使用され、続いて、別の一本鎖核酸フラグメント(A2)を増幅するためのテンプレートとして使用される。上記のように、A1は、標的核酸の遺伝子バリエーションまたはその相補体を含む。従って、A2は、遺伝子バリエーションの相補体または遺伝子バリエーションそれ自体を含む。従って、A2の特徴付けは、その標的核酸の遺伝子バリエーションの検出および/または同定を可能にする。
【0185】
本発明の診断適用と同様に、本発明に従う遺伝子バリエーション検出の特定の実施形態において、さらなるT2分子は、第二の増幅反応のために必要でない。これらの実施形態において、N1分子を生成する際に使用される第二のODNPは、3’末端配列を有し、この3’末端配列は、第二のODNPがA1にアニーリングするのを可能にする。この第二のODNPはまた、NARSのセンス鎖の配列を含む。従って、この第二のODNPをテンプレートとして使用するA1の伸長により、二本鎖NARSが作製される。DNAポリメラーゼおよびNARSを認識するNAの存在下で、一本鎖核酸(A2)は、A1をテンプレートとして使用して増幅される。
【0186】
特定の実施形態において、このT2分子は、好ましくは、その5’末端を介して、固体支持体に固定化され得る。他の実施形態において、このT2分子は、固定化されていなくてもよい。
【0187】
(5.増幅された一本鎖核酸の特徴付け)
標的核酸における潜在的な遺伝子バリエーションは、増幅産物(すなわち、A1およびA2)を特徴付けることによって、検出または同定され得る。一本鎖核酸分子を特徴付けするのに適切な任意の方法が、使用され得る。例示的な技術としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:クロマトグラフィー(例えば、液体クロマトグラフィー)、質量分析法および電気泳動。種々の例示的な方法の詳細な説明は、米国仮特許出願番号60/305,637および60/345,445において見出され得る。
【0188】
増幅された一本鎖核酸フラグメントを特徴付けするための多くの方法論をまた使用して、増幅反応混合物中の特定の増幅された一本鎖核酸フラグメントの量を測定し得る。例えば、増幅された一本鎖核酸分子が、液体クロマトグラフィーによってその増幅反応混合物中の他の分子から最初に分離され、次いで質量分光分析に供される実施形態において、この増幅された一本鎖核酸分子の量は、核酸分子を含む画分の液体クロマトグラフィーによってか、または核酸分子に対応する質量分光ピークのイオン電流測定値のいずれかによって、定量され得る。
【0189】
このような方法論を使用して、標的核酸の対立遺伝子改変体もまた存在し得る核酸集団内の標的核酸の対立遺伝子頻度を決定し得る。「対立遺伝子改変体」とは、標的核酸の規定された位置以外でその標的核酸と同一の配列を有する、核酸分子をいう。「核酸集団内の標的核酸の対立遺伝子頻度」とは、標的核酸である核酸集団内での標的核酸およびその対立遺伝子改変体の総量の割合をいう。N1に対する前駆体を調製する際に使用されるプライマー対は、標的の規定された位置における潜在的な遺伝子バリエーションの各部位においてその標的核酸の一部にアニーリングするように設計されているので、このプライマー対をプライマーとして使用し、この標的核酸を含む核酸集団をテンプレートとして使用する増幅は、この標的核酸の規定された位置において遺伝子バリエーションを含む核酸フラグメントを生じ、そして対立遺伝子改変体がこの核酸集団内に存在する場合、その標的核酸の対立遺伝子改変体の同じ位置において遺伝子バリエーションを含む核酸フラグメントを生じる。標的核酸およびその対立遺伝子改変体の配列は、その規定された位置においてのみ異なるので、標的核酸および対立遺伝子改変体をそれぞれテンプレートとして使用して、N1に対する前駆体は、同一または類似の効率で増幅される。同様に、標的核酸の遺伝子バリエーションまたはその相補体を含む一本鎖核酸分子(A1)は、対立遺伝子改変体の遺伝子バリエーションまたはその相補体を含む一本鎖核酸分子の増幅と同一または類似の効率で増幅される。さらに、標的およびその対立遺伝子改変体をそれぞれテンプレートとして使用して、同じ効率で増幅されたA1分子にアニーリングするT2分子が使用される場合、開始テンプレートとして標的を用いて増幅されたA2分子 対 開始テンプレートとして改変体を使用して増幅されたA2分子の比は、その核酸集団内の標的 対 その改変体の比を反映する。従って、反応混合物中のA1(またはA2)分子の相対量の測定値は、この核酸集団内の標的核酸の相対量を示す。
【0190】
(6.遺伝子バリエーションの検出に有用な組成物およびキット)
遺伝子バリエーションの検出に有用な組成物およびキットは、指数関数的核酸増幅について上記される組成物およびキットと同じであり得る。特定の実施形態において、これらのキットは、増幅産物を特徴付けする際に有用な1つ以上のさらなる構成要素をさらに備え得る。例えば、このさらなる構成要素は、以下の(1)〜(5)であり得る:(1)クロマトグラフィーカラム;(2)核酸のクロマトグラフィーによる特徴付けまたは分離を実施するための緩衝液;(3)マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルプレート;(4)液体クロマトグラフィーおよび/または質量分析法のための、オリゴヌクレオチド標準(例えば、6マー、7マー、8マー、10マー、12マー、14マー、および16マー);ならびに、(5)このキットを使用するための指示書冊子。
【0191】
(7.本発明の遺伝子バリエーション検出方法の適用)
上で詳細に記載されるように、本発明は、標的核酸における遺伝子バリエーションを検出および/または同定するための方法を提供する。本発明に従う方法は、遺伝子バリエーションを同定または測定することが望ましいかまたは必要である、広範な種々の適用における有用性を見出し得る。このような適用としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:遺伝性の転移性疾患についての遺伝子分析、腫瘍診断、疾患の素因、法医学、親子鑑定、植物栽培もしくは動物の繁殖の促進、細胞機能および/もしくは疾患マーカー遺伝子の発現プロファイリング、ならびに植物もしくは動物において感染性疾患を引き起こし、そして/もしくは食物安全性に関連する感染性生物の同定および/または特徴付けが挙げられる。
【0192】
例えば、本発明は、法医学的目的のための遺伝子分析において有用であり得る。DNA配列バリエーションのレベルにおける個体の同定は、従来基準(例えば、指紋、血液型または身体的特徴)よりも有利である。大部分の表現型マーカーとは対照的に、DNA分析は、親子鑑定において必要とされるような個体間の関連性の推定を容易に可能にする。遺伝子分析は、密接に関連したドナー細胞とレシピエント細胞との間を識別する必要がある骨髄移植において、高度に有用であることが証明されている。本発明は、サンプルDNAの多型を特徴付けする際に、従って法医学的DNA分析において、有用である。例えば、サンプル中の22の別個の遺伝子配列の分析(各々1つずつが、集団において2つの異なる形態で存在する)が、1010の異なる結果を生み出し、このことは、ヒトの個体の唯一の識別を可能にする。
【0193】
ウイルス性または細胞性の癌遺伝子の検出は、核酸診断の適用の別の重要な分野である。ウイルス性癌遺伝子(v癌遺伝子)は、レトロウイルスにより伝播され、一方で、これらの細胞性の対応物(c癌遺伝子)は、正常な細胞内にすでに存在する。しかし、細胞性癌遺伝子は、特定の改変(例えば、(膀胱癌および結腸直腸癌におけるc−K−ras癌遺伝子におけるような)点変異)、小さな欠失および小さな挿入により活性化され得る。この活性化プロセスの各々は、さらなる縮重プロセスと組み合わせて、増加した制御されていない細胞増殖を導く。さらに、点変異、小さい欠失または挿入はまた、いわゆる「劣性癌遺伝子」を不活性化し得、そしてそれにより(網膜芽細胞腫(Rb)遺伝子および骨肉腫におけるような)腫瘍の形成を導く。本発明は、癌遺伝子を活性化するかまたは劣性癌遺伝子を不活性化する(これらは、次いで、癌を引き起こす)点変異、小さい欠失、および小さい変異の検出または識別において有用である。
【0194】
本発明はまた、移植分析において有用であり得る。移植された組織の拒絶反応が、特定のクラスの組織適合抗原(HLA)によって決定的に制御される。これらは、抗原提示血液細胞(例えば、マクロファージ)の表面上で発現される。HLAと外来抗原との間の複合体は、細胞表面上の対応するT細胞レセプターを介してTヘルパー細胞により認識される。HLA、抗原、およびT細胞レセプターの間の相互作用は、複雑な防御反応を引き起こし、これは、身体に対するカスケード様免疫応答を導く。
【0195】
異種外来抗原の認識は、抗体反応に類似して、T細胞レセプターの抗原特異的可変領域により媒介される。従って、移植片の拒絶において、外来抗原に適合する特異的なT細胞レセプターを発現するT細胞は、T細胞プールから排除され得る。そのような分析は、抗原特異的な可変DNA配列の同定により可能であり、ここでこの配列は、PCRにより増幅され、従って選択的に増加される。特異的な増幅反応は、特異的なT細胞レセプターの、単一の細胞に特異的な同定を可能にする。
【0196】
同様の分析が、若年性糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、または脳脊髄炎のような自己免疫疾患の同定のために本明細書において実施される。
【0197】
本発明は、種々の外来抗原の認識に関連する抗原特異的な可変領域をコードするT細胞レセプター遺伝子における遺伝子バリエーションを決定するために有用である。従って、本発明は、移植された組織の拒絶反応の可能性を予測する際に有用であり得る。
【0198】
本発明はまた、ゲノム診断において有用であり得る。全ての新生児の4%が、遺伝的欠損を有して生まれる;たった1つの遺伝子の改変により引き起こされる、記載された3,500の遺伝性疾患のうち、原発性の分子の欠損は、それらのうち約400についてのみ知られている。
【0199】
遺伝性疾患は、長い間、表現型分析(病歴(例えば、血液の欠乏:サラセミア))、染色体分析(核型(例えば、モンゴリズム:21トリソミー))または遺伝産物分析(改変タンパク質(例えば、フェニルケトン尿症:フェニルピルビン酸の増強されたレベルを生じる、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素の欠損))により診断されてきた。核酸検出方法のさらなる使用は、ゲノム診断の範囲を非常に増大させる。
【0200】
特定の遺伝子疾患の場合、2つの対立遺伝子のうちたった1つの改変が、疾患のために十分である(優性に伝播された単一遺伝子欠損);多くの場合、両方の対立遺伝子は、改変されなくてはならない(劣性に伝播された単一遺伝子欠損)。第3の型の遺伝子欠損において、この疾患の発症は、遺伝子の改変によってだけでなく、食習慣(糖尿病または動脈硬化の場合)またはライフスタイル(癌の場合)のような要因によっても決定される。非常にしばしば、これらの疾患は、高齢者において生じる。精神分裂病、躁うつ病または癲癇のような疾患は、また、この文脈において、言及されるべきである;これらの場合において、この疾患の発症が、環境要因および異なる染色体位置におけるいくつかの遺伝子の改変に依存するか否かは、調査中である。
【0201】
直接的および間接的なDNA分析を用いて、以下の一連の遺伝子疾患の診断が可能になっている:膀胱癌、結腸直腸癌、鎌状赤血球貧血、サラセミア、a1−抗トリプシン欠損、レッシュ−ナイハン症候群、嚢胞性線維症/ムコビシドーシス、デュシェーヌジストロフィー/ベッカー型筋ジストロフィー、アルツハイマー病、X染色体依存性精神遅滞、およびハンティングトン舞踏病、フェニルケトン尿症、ガラクトース血症、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、重症複合型免疫不全、α1−抗トリプシン欠損、白皮症、アルカプトン尿症、リソソーム蓄積症(lysosomal storage disease)、エーレルス−ダンロー症候群、血友病、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ障害、無ガンマグロブリン血症、潜伏性糖尿病、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、ファブリー病、ぜい弱X症候群、家族性高コレステロール血症、多発性嚢胞腎疾患、遺伝性球状赤血球症、マルファン症候群、ヴォン・ヴィレブランド病、神経線維腫症、結節硬化症、遺伝性出血性毛細管拡張症、家族性結腸ポリープ症、エーレルス−ダンロー症候群、筋緊張性ジストロフィー、骨形成不全症、急性間欠性ポルフィリン症、およびフォン・ヒッペル−リンダウ症候群。本発明は、規定された位置での点変異、小さい欠損または小さい挿入により引き起こされる任意の遺伝子疾患の診断に有用である。
【0202】
関連した局面において、本発明は、疾患感受性についての試験において使用され得る。特定の遺伝子バリエーションは、直接的に疾患を引き起こさないが、これらは、疾患に関連する。言い換えれば、被験体によるこれらの遺伝子のバリエーションの保持は、被験体を、これらの疾患に対して感受性にする。本発明の方法を用いるそのような遺伝子バリエーションの検出は、特定の疾患の疑いのある被験体の識別および引き続く予防方法の実施を可能にする。
【0203】
本発明はまた、薬理ゲノム学にも適用可能である。例えば、それは、薬物耐性に関連する遺伝子(例えば、チトクロムP450遺伝子の種々の対立遺伝子)を検出または同定するために用いられ得る。
【0204】
さらに、本発明は、残留する疾患の検出または特徴付けのために有用な方法を提供する。言い換えれば、本発明の方法は、特定の処置(例えば、化学療法手術)の後の癌のような残留する変異体遺伝子型を検出または同定するために用いられ得る。それは、新性の変異体(例えば、病原性生物に薬物耐性を与える特定の遺伝子における遺伝子バリエーション)の同定においても有用であり得る。
【0205】
(D.プレmRNAの選択的スプライシング分析における核酸増幅方法および組成物の使用)
指数関数的核酸増幅のための方法および組成物はまた、プレmRNA選択的スプライシング分析のために使用され得る。特定のエキソン−エキソン連結部を含むと疑われている標的cDNAまたはその部分は、第一の増幅反応においてテンプレートとして使用される開始核酸分子(N1)に、最初に取り込まれる。この開始核酸分子はまた、第一のニック形成剤認識配列の少なくとも一方の鎖を含み、従って、DNAポリメラーゼおよびこの第一のニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で、第一の増幅反応を可能にする。この第一の増幅反応からの生成物(A1)は、特定のエキソン−エキソン連結部またはその相補的な部分を含むことが疑われる標的核酸の部分を含む。次いで、A1は、別のテンプレート核酸(T2)にアニーリングする。T2は、第二のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、従って、DNAポリメラーゼおよびこの第二のニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で、第二の増幅反応を可能にする。A1および/またはA2のこの特徴は、標的が特定のエキソン−エキソン連結部を含むか否かを示す。
【0206】
(1.定義)
本明細書で用いられる「エキソン」は、成熟RNA産物中で提示される、中断された遺伝子の任意のセグメントである。「イントロン」は、転写されるが、そのいずれかの側で配列(エキソン)をともにスプライスすることにより転写物内から除かれるセグメントをいう。
【0207】
本明細書で用いられるcDNA分子の「センス鎖」は、mRNA中のヌクレオチド「U」がcDNA分子ではヌクレオチド「T」により置換されることを除けば、このcDNA分子が派生するmRNA分子と同一の配列を有する鎖をいう。一方、cDNA分子の「アンチセンス鎖」は、cDNA分子が派生するmRNA分子に相補的である鎖をいう。
【0208】
エキソン(エキソンA)は、エキソンAのセンス鎖の配列がエキソンBのセンス鎖の配列に対して5’側にあるとき、同一遺伝子内で別のエキソン(エキソンB)に対し「上流」にある。エキソンAおよびエキソンBは、さらに、それぞれ、上流エキソンおよび下流エキソンと称され得る。
【0209】
標的cDNA分子は、目的の遺伝子に由来するcDNA分子をいう。言い換えると、それは、目的の遺伝子の転写から得られるmRNA分子の逆転写の産物である。標的cDNA分子は、部分配列を有し得る(すなわち、部分的なmRNA分子から逆転写される)が、好ましくは、全長配列である。
【0210】
第一のODNPと第二のODNPを取り囲む核酸フラグメントは、1つの鎖が第一のODNPの配列、第二のODNPの相補配列、および第一のODNPと第二のODNPの相補配列との間の配列からなり;その一方、他方の鎖が、第一のODNPの相補配列、第二のODNPの配列、および第一のODNPの相補配列と第二のODNPの配列との間の配列からなる、二本鎖核酸フラグメントと称される。
【0211】
「差次的(differetial)スプライシング」または「選択的スプライシング」は、1つの遺伝子の同じ転写物からの、少なくとも2つの異なるmRNA分子の生成である。例えば、転写物の特定のセグメントは、mRNA分子の1つに存在し得るが、他のmRNA分子からスプライシング除去され得る。
【0212】
「2つの特定のエキソンの連結部であると疑われる位置」または「2つの特定のエキソンの疑わしい連結部の位置」とは、比較的上流のエキソンのセンス鎖の3’末端および/またはそのエキソンのアンチセンス鎖の5’末端をいう。
【0213】
標的cDNAにおける「エキソンAおよびエキソンBの連結部」とは、標的cDNAのセンス鎖中の位置(ここで、エキソンAの3’末端は、エキソンBの5’末端と接合している)および/または標的cDNAのアンチセンス鎖中の位置(ここで、エキソンAの5’末端は、エキソンBの3’末端と接合している)をいう。
【0214】
(2.開始核酸分子(N1))
差次的スプライシング分析のために有用な開始核酸分子は、種々のアプローチによって提供され得る。例えば、N1は、トリガーオリゴヌクレオチドプライマーのT1分子へのアニーリングによって得られ得る。ここで、このトリガープライマーは、標的cDNAから誘導され、かつ2つのエキソンの連結部であると疑われる位置を包含する(例えば、図19)。あるいは、N1は、(例えば、図20に示されるように、制限エンドヌクレアーゼを用いた標的cDNAの消化によって)二本鎖標的cDNAから直接誘導され得る。N1はまた、適切なオリゴヌクレオチドプライマー対の使用によって調製され得る(例えば、図21〜24)。開始核酸分子N1を提供するためのいくつかの例示的な手段が、以下に記載される。
【0215】
(a.N1分子を提供するための例示的な方法の第一型)
上記のように、N1は、トリガーオリゴヌクレオチドプライマーをT1分子にアニーリングすることによって提供され得る。このトリガープライマーは、特定のエキソン−エキソン連結部であると疑われる位置を包含する必要がある。N1分子を提供するための方法のこの型の例は、図19に例示される。この図に示されるように、二本鎖標的cDNAは、制限エンドヌクレアーゼによって最初に切断され、その認識配列は、特定のエキソン−エキソン連結部であると疑われる位置に近接している。この消化産物は変性され得、次いで、特定のエキソン−エキソン連結部であると疑われる位置を含む消化産物の鎖は、テンプレート核酸(T1)にアニーリングするためのトリガーオリゴヌクレオチドプライマーとして使用され得る。T1は、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、その結果、DNAポリメラーゼおよびその認識配列を認識するニック形成剤の存在下で、特定のエキソン−エキソン連結部であると疑われる位置を含む一本鎖核酸フラグメント(A1)が増幅される。
【0216】
特定の実施形態において、標的cDNA分子は、固体支持体に固定化され得る。他の実施形態において、T1分子は、好ましくは、その5’末端を介して固定化され得る。
【0217】
(b.N1分子を提供するための第2の型の例示的方法)
本発明の特定の実施形態において、N1は、特定のエキソン−エキソン連結部であると疑われる位置を含み、ニック形成剤認識配列および制限エンドヌクレアーゼ認識配列をさらに含む標的cDNAから直接誘導され得る。例示的ニック形成剤認識配列としてその認識配列の外側にニック形成するニック形成エンドヌクレアーゼ(例えば、N.BstNB I)により認識されうる認識配列を有する実施形態は、図20に例示される。この図に示されるように、標的cDNAは、標的核酸における配列を認識する制限エンドヌクレアーゼにより消化され得る。ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を含む消化産物は、開始核酸分子(N1)として機能して、一本鎖核酸フラグメント(A1)を増幅し得る。特定のエキソン−エキソン連結部であると疑われる位置は、その位置が、増幅されたA1フラグメントへ移入されるかまたは組み込まれるように、ニック形成剤により生成されるニック形成部位と、制限エンドヌクレアーゼの切断部位との間にあることが必要である。
【0218】
(c.N1分子を提供するための第3の型の例示的方法)
特定の実施形態において、開始核酸分子(N1)は、種々のプライマー対を使用して生成される、完全に二本鎖のまたは部分的に二本鎖の核酸分子である。以下の節は、まず、上記の開始核酸分子を提供するための一般的方法を記載し(図21)、次いで、一般的方法のある特定の実施形態を提供する(図22〜24)。
【0219】
上流エキソン(エキソンA)と下流エキソン(エキソンB)との連結部の存在または非存在を決定するために、以下の2つのプライマーから構成されるプライマー対が、使用されうる:(1)エキソンAのアンチセンス鎖においてエキソンAの5’末端付近にエキソンAのアンチセンス鎖の一部に相補的な配列を含む第1プライマー、および(2)エキソンBのセンス鎖においてエキソンBの5’末端付近にエキソンBのセンス鎖の一部に相補的な配列を含む第2プライマー(図21)。第1のODNPとエキソンAのアンチセンス鎖の一部との間の相補性は、正確である必要はないが、このODNPが、エキソンAのその一部に特異的にアニールすることが可能であるに十分でなければならない。同様に、第2のODNPと、エキソンBのセンス鎖の一部との間の相補性は、正確である必要はないが、このODNPがエキソンBのその一部に特異的にアニールすることが可能であるに十分でなければならない。エキソンの鎖の一部は、その一部が、その鎖中のその末端から100ヌクレオチド、90ヌクレオチド、80ヌクレオチド、70ヌクレオチド、60ヌクレオチド、50ヌクレオチド、40ヌクレオチド、35ヌクレオチド、30ヌクレオチド、25ヌクレオチド、20ヌクレオチド、15ヌクレオチド、または10ヌクレオチド以内にある場合、そのエキソンの一方の末端付近にある。ODNP対の2つのODNPの間のこのような間隔を空けた配置は、エキソンAとエキソンBとの連結部が標的cDNA中に存在する場合に、標的cDNAをテンプレートとして使用して、第1のプライマーおよび第2のプライマーを包含する比較的短いフラグメントの増幅を可能にする。
【0220】
各プライマーとその対応するエキソンの一方の鎖との間の配列相補性に加えて、第1のプライマーまたは第2のプライマーのいずれかが、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列をさらに含まなければならない。認識シーケンサーは、ニック形成エンドヌクレアーゼまたは制限エンドヌクレアーゼによって認識可能であり得る。特定の好ましい実施形態において、第1のプライマーおよび第2のプライマーの両方が、ニック形成剤認識配列を含む。認識配列の存在は、第1のプライマーおよび第2のプライマーを含む増幅核酸フラグメントが、DNAポリメラーゼと認識配列を認識するニック形成剤との存在下で一本鎖核酸フラグメント(A1)を増幅するためのテンプレート核酸として機能することを可能にする。
【0221】
プライマーおよび標的cDNAが増幅反応において組み合わされる場合、増幅産物の存在(または非存在)および組成は、エキソンAおよびエキソンBの接合部の存在または非存在を反映する。エキソンAのみまたはエキソンBのみが標的cDNAに存在する場合、プライマーとしての上記プライマーおよびテンプレートとしての標的cDNAを使用して、いかなる増幅産物も作製されない。エキソンAおよびエキソンBの両方が標的cDNAに存在する場合、第1のプライマーおよび第2のプライマーを含む増幅産物(すなわち、N1分子またはN1に対する前駆体)が作製される。エキソンAおよびエキソンBの接合部が標的cDNAに存在する場合、増幅産物は、この接合物を含む(図21A)。エキソンAとエキソンBとの接合部が存在しない(すなわち、エキソンAとエキソンBとの間に配列が存在する)場合、増幅産物は、接合部を含まないが、2つのエキソンの間の配列を含む(図21B)。従って、テンプレートとしてN1を使用して増幅される一本鎖核酸分子(A1)および/またはテンプレートとしてA1を使用する別の一本鎖核酸分子(A2)を特徴付けることは、標的cDNAがエキソンAとエキソンBとの接合部を含むか否かを示す。
【0222】
上記一般的方法の特定の実施形態が、図22に示される。この図に示されるように、第1のプライマーは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含み、そしてエキソンAのアンチセンス鎖の一部にアニールし、第2のプライマーは、IIs型制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含み、そしてエキソンBのセンス鎖の一部にアニールする。これらの2つのプライマーが標的cDNAの一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、増幅産物(すなわち、N1に対する前駆体)は、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列の両方の鎖およびIIs型制限エンドヌクレアーゼ認識配列の両方の鎖を含む。さらに、増幅産物はまた、接合部が標的cDNAに存在する場合、エキソンAとエキソンBとの接合部を含む。IIs型制限エンドヌクレアーゼ認識配列を認識するIIs型エンドヌクレアーゼの存在下で、増幅産物が消化されて、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列の両方の鎖を含み、かつまた接合部が標的cDNAに存在する場合には、エキソンAとエキソンBとの接合部も含む、部分的に二本鎖の核酸分子N1を生成する。
【0223】
上記一般的な方法の別の特定の実施形態が、図23に示される。この図に示されるように、両方のプライマーは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。さらに、第1のプライマーは、エキソンAのアンチセンス鎖の一部にアニールするように設計され、第2のプライマーは、エキソンBのセンス鎖の一部にアニールするように設計される。これらの2つのプライマーが標的cDNAの一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、増幅産物(すなわち、N1に対する前駆体)は、接合部が標的cDNAに存在する場合には、エキソンAとエキソンBとの接合部、ならびに2つの二本鎖ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。これらの2つの認識配列は、互いに同一であっても良く同一でなくても良いが、好ましくは、これらは、同一である。上記認識配列を認識するニック形成エンドヌクレアーゼの存在下において、増幅産物は、それぞれがニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のうちの1つを含む2つの部分的に二本鎖の核酸分子(N1aおよびN1b)を生成するために、2回(各鎖で1回)ニック形成される。さらに、これら2つの分子のそれぞれの突出部(overhang)はまた、接合部が標的cDNAに存在する場合には、エキソンAとエキソンBとの接合部を含む。
【0224】
上記一般的な方法のさらなる特定の実施形態を、図24に示す。この図に示されるように、両方のプライマーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。さらに、第1のプライマーは、エキソンAのアンチセンス鎖の一部にアニールするように設計され、第2のプライマーは、エキソンBのセンス鎖の一部にアニールするように設計される。これら2つのプライマーが、改変デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で標的cDNAの一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、増幅産物(すなわち、N1に対する前駆体)は、接合部が標的cDNAに存在する場合には、エキソンAとエキソンBとの接合部、ならびに2つの半改変制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。これらの2つの半改変認識配列は、互いに同一であっても良いし、同一でなくても良いが、好ましくは、これらは、同一である。上記認識配列を認識する制限エンドヌクレアーゼの存在下で、増幅産物は、それぞれが半改変認識配列の1つの一方の鎖の配列を含む、2つの部分的に二本鎖の核酸分子(N1aおよびN1b)を生成するために、2回(各鎖で1回)ニック形成される。さらに、これら2つの分子のそれぞれの突出部はまた、接合部が標的cDNAに存在する場合には、エキソンAとエキソンBとの接合部を含む。
【0225】
上記第1のODNP、第2のODNPまたは両方が、特定の実施形態において固体支持体に固定され得る。他の実施形態において、標的cDNA分子が固定化される。
【0226】
(3.A1分子)
上記のように、A1分子は、テンプレートとしてN1の一部を使用して増幅される。N1のこの部分は、特定のエキソン−エキソン接合部であると推定される位置を含み、その結果、この位置が、A1に移されるかまたは組み込まれる。特定の実施形態において、A1の長さは、特定のエキソンーエキソン接合部が標的cDNAに存在する場合に比較的短いように調整され得る。例えば、N1分子を提供する第3の型(図21〜24)について、ODNP対は、それらが標的cDNAにアニールする場合、互いに近接するように設計され得る。より詳細には、第1のプライマーは、エキソンAの5’末端に近い標的cDNAのアンチセンス鎖の一部にアニールするように設計され得るが、第2のプライマーは、エキソンBの5’末端に近い標的cDNAのセンス鎖の一部にアニールするように設計され得る。上記の本発明の診断的使用および遺伝的バリエーションの検出と同様に、A1分子の短い長さは、増幅効率および速さを増大し、鎖置換活性を有しないDNAポリメラーゼの使用を可能にし、そして質量分析のような特定の技術を介してA1分子および/または引き続く増幅反応(ここで、開始増幅プライマーとしてA1が使用される)の生成物(A2)の検出を促進する。
【0227】
(4.T2分子)
本発明のT2分子は、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列、ならびにその認識配列のセンス鎖の配列の3’側に位置する配列(すなわち、テンプレートとして、開始核酸分子N1の一部を使用して増幅される一本鎖核酸分子(A1)に対して少なくも実質的に相補性である配列)を含む。T2がニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含むので、その認識配列を認識するニック形成剤とDNAポリメラーゼとの存在下で、A1は、開始増幅プライマーとして使用され、続いて、別の一本鎖核酸フラグメント(A2)を増幅するためのテンプレートとして使用される。上記のように、A1は、特定のエキソン−エキソン接合部であると推定される位置を含む。この位置は、続いて、A2に移されるかまたは組み込まれる。従って、A2の特徴付けは、その位置の各側における配列を決定し得、従って、特定のエキソン−エキソン接合部が標的cDNA内に存在するか否かを決定し得る。
【0228】
本発明の診断適用と同様に、本発明に従うプレmRNA選択的スプライシング分析の特定の実施形態において、第2増幅反応のために、さらなるT2分子は必要ではない。これらの実施形態において、N1モジュールを作製する際に使用される第2のプライマーが、第2プライマーをA1にアニールさせる3’末端配列を有する。第2のプライマーはまた、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む。従って、テンプレートとして第2のプライマーを使用するA1の伸長は、二本鎖ニック形成剤認識配列を作製する。DNAポリメラーゼとこの認識配列を認識するニック形成剤との存在下において、一本鎖核酸(A2)は、テンプレートとしてA1を使用して増幅される。
【0229】
T2分子は、特定の実施形態において、固体支持体に、好ましくはその5’末端を介して固定され得る。他の実施形態において、T2は、固定されていなくてもよい。
【0230】
(5.増幅された一本鎖核酸の特徴付け)
標的cDNA分子における特定のエキソン−エキソン接合部の存在が、増幅生成物(すなわち、A1またはA2)を特徴付けることにより決定され得る。一本鎖核酸分子を特徴付けするために適切な任意の方法が、使用され得る。例示的な技術としては、クロマトグラフィー(例えば、液体クロマトグラフィー)、質量分析法、および電気泳動が挙げられるが、これらに限定されない。種々の例示的な方法の詳細な記載が、米国特許仮出願第60/305,637号および同第60/345,445号に見出され得る。
【0231】
増幅された一本鎖核酸フラグメントの特徴(例えば、質量分析により得られる質量 対 電荷比)は、続いて、テンプレート核酸フラグメントを調製する際に使用されるプライマーの位置および組成を考慮して推定される一本鎖核酸フラグメントの特徴と、および2つのエキソン(これらに対してプライマーが相補的である)の間の接合部が存在するという仮定と比較される。増幅され推定された核酸フラグメントの特徴が同一である場合、標的cDNA分子中に存在すると仮定された特定のエキソン−エキソン接合部は、実際に標的cDNA分子中に存在する。増幅される一本鎖核酸フラグメントの配列および特徴(例えば、質量 対 電荷比)の推定は、エキソン−イントロン接合部付近のコンセンサス配列についての知見に基づく。この知見は、当業者が、そのエキソン−イントロン接合部を正確に特定し、従って、2つのエキソンの間のイントロンがスプライシングによって除去された場合にエキソン−エキソン接合部の正確な位置を推定することを、可能にする。
【0232】
(6.プレmRNA差示的スプライシング分析において有用な組成物およびキット)
プレmRNA差示的スプライシング分析において有用な組成物およびキットは、指数関数的核酸増幅についての上記の組成物およびキットと同じであり得る。特定の実施形態において、これらのキットは、増幅産物を特徴付ける際に有用な1以上のさらなる成分をさらに含み得る。例えば、そのさらなる成分は、(1)クロマトグラフィーカラム;(2)核酸のクロマトグラフィーによる特徴付けまたは分離を行うための緩衝液;(3)マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルプレート;(4)液体クロマトグラフィーおよび/または質量分析法のためのオリゴヌクレオチド標準(例えば、6マー、7マー、8マー、10マー、12マー、14マー、および16マー);(5)逆転写酵素;(6)逆転写酵素のための緩衝液;および(7)このキットを使用するための説明書冊子。
【0233】
(7.本発明のプレmRNA差示的スプライシング分析の適用)
本発明は、目的の任意のmRNA差示的スプライシングを検出する際に有用である。選択的プレmRNAスプライシングは、高等真核生物における遺伝子発現を調節するために重要な機構である。最近の評価によると、ヒト遺伝子の約30%の一次転写産物が、選択的スプライシングに供され、しばしば、通常の発生の間に特定の空間的パターン/時間的パターンにて調節される。複雑な遺伝子においては、選択的スプライシングは、1つの転写産物から、数十個から数百個もの異なるmRNAアイソフォームを生成し得る(BreitbartおよびNadal−Ginard,Annu.Rev.Biochem.56:467−95,1987;MisslerおよびSudhof,Trends Genet 14:20−6,1988;Gascardら、Blood 92:4404−14,1998)。多くの場合、選択的スプライシングされたエキソンは、触媒活性または結合相互作用にとって機能的に重要なタンパク質ドメインをコードし、生じたタンパク質は、異なる活性または拮抗的活性すら示し得る。
【0234】
本明細書中上記で詳細に議論されるように、本発明は、プレmRNA選択的スプライシングを検出(cDNA分子またはcDNA集団中の遺伝子の特定のエキソンの末端における選択的スプライシングの検出およびcDNA分子またはcDNA集団中の遺伝子の全てのエキソンの全ての末端における選択的スプライシングの検出を包含する)するための方法、組成物、およびキットを提供する。プレmRNAスプライシングの重要性に起因して、これらの方法、組成物およびキットは、疾患の診断、素因、および処置、作物栽培、ならびに動物の繁殖、植物および動物の発生調節、薬物開発、ならびに外部刺激(例えば、極端な温度、毒物、および光)に対する生物の応答の操作のような、広範な種々の適用における有用性が見出される。
【0235】
例えば、本発明の方法は、病理的条件に特有のプレmRNAスプライシングパターンを同定および/または特徴付けするために使用され得る。多くの遺伝子における異常なプレmRNAスプライシングは、種々の疾患または障害(特に癌)に関与している。小細胞性肺癌腫において、タンパク質p130の遺伝子(これは、網膜芽細胞腫タンパク質ファミリーに属する)は、コンセンサススプライシング部位にて変異される。この変異の結果として、エキソン2が除去され、未成熟終止コドンの存在に起因してタンパク質の合成がない。同様に、特定の非小細胞性肺癌において、タンパク質p161NK4A(サイクリン依存性キナーゼcdk4およびcdk6のインヒビターである)の遺伝子は、ドナースプライシング部位にて変異される。この変異は、短縮化された短い半減期のタンパク質の生成を生じる。さらに、WT1(ウィルムス腫瘍サプレッサー遺伝子)は、選択的スプライシングによって生成されるいくつかのメッセンジャーRNAへと転写される。乳癌において、異なる改変体の相対的割合は、健常な組織と比較して改変され、従って、診断ツール、または腫瘍進行におけるWT1の種々の機能的ドメインの重要性を理解するに当たっての知見が得られる。細胞形質転換の間の異なるmRNA形態およびタンパク質アイソフォームの間の比に影響を及ぼす類似の変化プロセスはまた、ニューロフィブリンNF1において見出される。さらに、頭部および頸部の癌において、p53が不活性化される機構の1つが、コンセンサススプライシング部位における変異を含んでいた。さらに、IRF−1腫瘍サプレッサー遺伝子転写物の改変されたスプライシングパターンは、この腫瘍サプレッサーの不活性化を生じ、そしてIRF−1 mRNAにおけるエキソンスキッピングの加速は、脊髄形成異常症候群からの顕在白血病、急性骨髄性白血病、および脊髄形成異常症候群を含む多くの造血障害の指標である(米国特許第5,643,729号)。
【0236】
本発明の方法は、疾患(または障害)状態と関連することが知られているかまたは疑われる遺伝子の転写物のスプライシングパターンを比較するため、およびその存在または不在が疾患(または障害)状態に特有であるエキソンを同定するため、または疾患(または障害)状態に特有の異なるスプライシング改変体間の比率における変化を同定するために、用いられ得る。疾患(または障害)状態に存在していないエキソンの同定は、これらエキソンによりコードされるドメインが、健常細胞の正常機能に重要であること、そして、このようなドメインを含むシグナル伝達経路が、治療目的のために回復され得ることを、示し得る。その一方、疾患(または障害)状態に特有に存在するエキソンの同定は、診断ツールとして用いられ得、そしてそのコードされるドメインは、これらドメインにより媒介されるシグナル伝達と拮抗することが意図される低分子量化合物についてのスクリーニング標的として考慮され得る。さらに、これらドメインに対する特異的親和性を有する抗体はまた、この疾患(または障害)状態の診断ツールとして用いられ得る。
【0237】
本発明はまた、生物発生において重要なプレmRNA差次的スプライシングを同定および/または特徴付けるために用いられ得る。選択的スプライシングは、Drosophilaにおける性決定、ヒトにおける抗体応答、および他の組織特異的プロセスまたは発生段階特異的プロセスにおいて主要な役割を演じている(Chabot、Trends Genet.12:472〜8;Smithら、Annu.Rev.Genet.23:527〜77、1989;Breitbartら、Cell 49:793〜803、1987)。従って、本発明の方法は、異なる発生段階で発生調節に関与することが知られているかまたはそれが疑われる遺伝子のプレmRNAスプライシングパターンを比較するために用いられ得る。この遺伝子における差次的スプライシングの存在の同定および/または特徴付けは、所望の形質(例えば、より大きな果実、より高いタンパク質含有量の種子またはより高い油含量の種子、より高いミルク生産)を得るために対応する発生プロセスを調節することにおける指針を提供し得る。
【0238】
本発明の方法はまた、種々の外部刺激に対する生物の応答において重要なプレmRNA差次的スプライシングを同定および/または特徴付けるために用いられ得る。非処置生物の特定の刺激(例えば、病原体の攻撃)に対する応答において役割を演じていることが知られているかまたはそれが疑われる遺伝子のプレmRNAスプライシングパターンは、この刺激を受けた生物のプレmRNAスプライシングパターンと比較され得る。その刺激を受けた生物に特有のスプライシングパターンの同定および/または特徴付けは、この応答を増大するため(この応答が所望される場合)、または低減/排除するため(この応答が所望されない場合)に、対応する応答プロセスを操作することにおける指針を提供し得る。
【0239】
本明細書中で参照され、そして/または出願データシートに列挙される、上記の全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国の特許、外国の特許出願、ならびに非特許刊行物は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【0240】
前述より、本発明の特定の実施形態が例示の目的で本明細書中に記載されたが、種々の改変が、本発明の本質および範囲から逸脱することなくなされ得ることが、理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲を除いて限定されない。
【図面の簡単な説明】
【0241】
【図1】図1は、本発明のタンデム型増幅系の第1の増幅反応の主要な工程の概略図である。
【図2】図2は、本発明のタンデム型増幅系の第2の増幅反応の主要な工程の概略図である。
【図3】図3は、本発明に従う核酸増幅のための例示的な方法の主要な工程の概略図であり、ここで、N.BstNB Iの認識配列は、例示的NARSとして使用され、第1のテンプレート(T1)はNARSのアンチセンス鎖の配列(すなわち、5’−GACTC−3’)を含み、そして第2のテンプレート(T2)はNARSのセンス鎖の配列(すなわち、5’−GAGTC−3’)を含む。
【図4】図4は、本発明に従う核酸増幅のための例示的な方法の主要な工程の概略図であり、ここで、N.BstNB Iの認識配列は、例示的NARSとして使用され、第1のテンプレート(T1)および第2のテンプレート(T2)は、両方、NARSのセンス鎖の配列(すなわち、5’−GAGTC−3’)を含む。
【図5】図5は、ゲノムDNA由来のトリガーODNPを第1のテンプレートT1にアニーリングすることによって開始核酸分子N1を調製し、その後一本鎖核酸分子A1を増幅するための主要な工程の概略図を示す。このトリガーODNPは、ゲノムDNAを消化し、次いで消化されたゲノムDNAを変性させることによって調製される。
【図6】図6は、ゲノムDNAから開始核酸分子N1を調製し、その後一本鎖核酸分子A1を増幅するための主要な工程の概略図を示す。このゲノムDNAは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。このN1分子は、ゲノムDNAフラグメントの一方の鎖をそのゲノムDNAフラグメントの他方の鎖の一部(すなわち、T1)でアニーリングすることによって生成される。
【図7】図7は、ゲノムDNAから開始核酸分子N1を調製し、その後一本鎖核酸分子A1を増幅するための主要な工程の概略図を示す。このゲノムDNAは、ニック形成剤認識配列を含む。N1分子は、ゲノムDNAフラグメントの一方の鎖を第1のテンプレート(T1)(これは、ゲノムDNAの3’側部分ではそのゲノムDNAの鎖に相補的であるが、5’側部分では相補的ではない)にアニーリングすることによって生成される。
【図8】図8は、ゲノムDNAから開始核酸分子N1を調製し、その後核酸分子A1を増幅するための主要な工程の概略図を示す。このゲノムDNAは、ニック形成剤認識配列および制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。その認識配列の外側にニックを形成するニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能な、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列は、例示的なニック形成剤認識配列として使用される。
【図9】図9は、2つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、標的核酸から開始核酸分子N1を調製し、その後核酸分子A1を増幅するための主要な工程の概略図を示す。一方のプライマーは、NERSのセンス鎖の配列を含むが、他方は、IIs型制限エンドヌクレアーゼ認識配列(TRERS)の一方の鎖を含む。
【図10a】図10aは、2つのODNPを使用して、開始核酸分子N1aおよびN1bを調製し、その後核酸分子A1aおよびA1bを増幅するための主要な工程の概略図を示す。この例示的な実施形態において、両方のODNPは、NERSのセンス鎖の配列を含む。
【図10b】図10bは、図10aのA1aおよびA1bをそれぞれのテンプレートとして使用して、核酸分子A2aおよびA2bを増幅するための主要な工程の概略図を示す。この例示的な実施形態において、図10aの第1のプライマーおよび第2のプライマーをA1bおよびA1aにそれぞれアニールし、N2b分子およびN2a分子を形成する。
【図11】図11は、2つのODNPを使用して、例示的な実施形態において開始核酸分子N1を調製し、その後核酸分子A1を増幅するための主要な工程の概略図を示す。両方のODNPとも、RERSの一方の鎖の配列を含む。この増幅は、例示的な改変デオキシヌクレオシド三リン酸として使用される、α−チオデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で実施される。
【図12】図12は、NERSを含む、部分的に2本鎖の開始核酸分子N1を使用して、固定化された標的核酸を検出するための方法の概略図を示す。
【図13】図13は、NERSのアンチセンス鎖の配列を含む、一本鎖核酸分子T1を使用して、固定化された標的核酸を検出するための方法の概略図を示す。
【図14】図14は、標的核酸から開始核酸分子N1を調製し、その後一本鎖核酸分子A1を増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的核酸は、制限エンドヌクレアーゼ認識配列および潜在性遺伝的バリエーションを含む。
【図15】図15は、標的核酸から開始核酸分子N1を調製し、その後一本鎖核酸分子A1を増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的核酸は、ニック形成剤認識配列、制限エンドヌクレアーゼ認識配列、およびこれら2つの認識配列間の遺伝的バリエーションを含む。
【図16】図16は、2つのプライマーを使用して、標的核酸から開始核酸分子N1を調製し、その後核酸分子A1を増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的核酸は、遺伝的バリエーション(「X」)を含む。この第1のプライマーは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含むが、第2のプライマーは、IIs型制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含む。
【図17】図17は、2つのプライマーを使用して、標的核酸から開始核酸分子(N1aおよびN1b)を調製し、その後核酸分子A1aおよびA1bを増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的核酸は、遺伝的バリエーション(「X」)を含む。両方のプライマーとも、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含む。
【図18】図18は、2つのプライマーを使用して、標的核酸から開始核酸分子(N1aおよびN1b)を調製し、その後核酸分子A1aおよびA1bを増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的核酸は、遺伝的バリエーション(「X」)を含む。両方のプライマーとも、制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含む
【図19】図19は、標的cDNAから開始核酸分子(N1)を調製し、その後核酸分子(A1)を増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的cDNAは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列および特定のエキソン−エキソン接合部であると疑われる位置を含む。
【図20】図20は、標的cDNAから開始核酸分子(N1)を調製し、その後核酸分子(A1)を増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的cDNAは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列、制限エンドヌクレアーゼ認識配列、およびこれらの2つの認識配列間の特定のエキソン−エキソン接合部であると疑われる位置を含む。
【図21】図21Aおよび21Bは、標的cDNAから開始核酸分子(N1)を調製し、その後核酸分子(A1)を増幅するためのプロセスの概略図を示す。この標的cDNAは、エキソンAおよびエキソンAに対して直接的に下流にあるエキソンBを含むか(図21A)、またはエキソンA、エキソンB、およびエキソンAとエキソンBとの間の配列を含む(図21B)。
【図22】図22は、2つのプライマーを使用して、標的cDNAから開始核酸分子(N1)を調製し、その後核酸分子(A1)を増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的cDNAは、エキソンAおよびエキソンBを含む。第1のプライマーは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含み、エキソンAのアンチセンス鎖の一部にアニールする。第2のプライマーは、IIs型制限エンドヌクレアーゼ認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み、エキソンBのセンス鎖の一部にアニールする。
【図23】図23は、2つのプライマーを使用して、標的cDNAから開始核酸分子(N1aおよびN1b)を調製し、その後核酸分子(A1aおよびA1b)を増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的cDNAは、エキソンAおよびエキソンBを含む。両方のプライマーとも、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含む。第一のプライマーは、エキソンAのアンチセンス鎖の一部にアニールするが、第2のプライマーは、エキソンBのセンス鎖の一部にアニールする。
【図24】図24は、2つのプライマーを使用して、標的cDNAから開始核酸分子(N1aおよびN1b)を調製し、その後核酸分子(A1aおよびA1b)を増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的cDNAは、エキソンAおよびエキソンBを含む。両方のプライマーとも、制限エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含む。第一のプライマーは、エキソンAのアンチセンス鎖の一部にアニールするが、第2のプライマーは、エキソンBのセンス鎖の一部にアニールする。
【図25】図25は、NARSのセンス鎖の配列および標的核酸の3’側部分に少なくとも実質的に相補的である配列を含む固定化されたT1分子を使用して、標的核酸の存在を検出するための方法の概略図を示す。
【図26】図26は、NARSのセンス鎖の配列を含み、標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的である、固定化されたT1分子を使用して、標的核酸の存在を検出するための方法の概略図を示す。
【0001】
(発明の分野)
本発明は、分子生物学的の分野に関し、より特には、核酸に関する方法および組成物に関し、なおより特には、ニック形成剤を使用して核酸を増幅することに関連する方法および組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
(関連技術の説明)
多数の方法が、核酸の迅速な増幅のために開発されている。これらとしては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、自己維持配列複製(3SR)、核酸配列ベースの増幅(NASBA)、転写ベースの増幅系(TAS)、鎖置換増幅(SDA)、およびQβレプリカーゼを用いる増幅が挙げられる。核酸増幅のために広範に使用される方法のうちのほとんど(例えば、PCR)は、変性および再アニーリングのサイクルを達成するために異なる温度のサイクルを必要とする。他の方法は、等温で実施され得るが、複数のプライマーセット(例えば、好熱性SDAのバンパープライマー)を必要とするか、または転写および/もしくは逆転写に基づく(これは、RNA変性に感受性である(例えば、TAS、NASBA、および3SR))。従って、核酸増幅のためのより簡単でかつより効率の良い方法について、当該分野で長い間感じられた必要性が存在する。
【0003】
本発明は、下記のように、この必要性および関連する必要性を満たす。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0004】
(発明の簡単な要旨)
核酸の増幅のための以前に公知である技術とは対照的に、本発明は、複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットの使用を必要とはせず、転写には基づかない、核酸増幅のための方法を提供する。さらに、本発明は、等温条件下で実行され得、従って、異なる温度のサイクルを提供するための装置に関連する出費を回避し得る。本発明は、種々の適用(例えば、遺伝子変化検出、疾患診断、および遺伝子変化検出)において有用性を見出し得る。
【0005】
この目的のために、本発明は、下記に要約するようなシステムおよびアレイを含む、方法、化合物、および組成物を提供する。
【0006】
核酸分子(A2)を増幅するための方法。この方法は、(A)少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子(N1)を提供する工程であって、この少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子は、(i)第1のニック形成剤認識配列(NARS)のセンス鎖の配列、および(ii)その第1のNARSのアンチセンス鎖の配列のうちの少なくとも1つを含む、工程;(B)その第1のNARSを認識するニック形成剤(NA)と、DNAポリメラーゼと、1種以上のデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、第1の一本鎖核酸分子(A1)を増幅する工程であって、この増幅工程は、このDNAポリメラーゼのためのテンプレートとしてN1の一部を使用する、工程;(C)第2の一本鎖核酸分子(T2)を提供する工程であって、この第2の一本鎖核酸分子は、5’から3’の方向に、(i)第2のNARSのセンス鎖の配列と、(ii)A1と少なくとも実質的に相補的である配列とを含む、工程;ならびに(D)T2と、A1と、第1のNAと、第2のNARSを認識する第2のNAと、DNAポリメラーゼと、デオキシヌクレオシド三リン酸との存在下で、第3の一本鎖核酸分子(A2)を増幅する工程であって、A2は、A1と少なくとも実質的に相補的であり、A1、A2、または両方が、最大25ヌクレオチド長である、工程;を包含する。
【0007】
核酸分子(A2)を増幅するための方法。この方法は、(A)混合物を形成する工程であって、この混合物は、(i)第1のニック形成剤認識配列(NARS)のアンチセンス鎖の配列を含む少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子(N1);(ii)3’から5’の方向に、(a)N1中の第1のNARSのアンチセンス鎖の配列の5’側に位置するN1の一部と少なくとも実質的に同一である配列と、(b)第2のNERSのセンス鎖の配列とを含む、一本鎖核酸分子(T2);および(iii)第1のNARSを認識する第1のニック形成剤(NA)、第2のNARSを認識する第2のNA、DNAポリメラーゼ、および1種以上のデオキシヌクレオシド三リン酸を含む、工程;ならびに(B)一本鎖核酸分子(A2)を指数関数的に増幅する条件にて、上記混合物を維持する工程であって、A2が最大25ヌクレオチド長である、工程;を包含する。
【0008】
核酸分子(A2)を増幅するための方法。この方法は、(A)(i)第1のニック形成剤認識配列(NARS)のセンス鎖の配列を含む少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子(N1)と;(ii)一本鎖核酸分子(T2)と、(iii)第1のNARSを認識する第1のニック形成剤(NA)、第2のNARSを認識する第2のNA、DNAポリメラーゼ、および1種以上のデオキシヌクレオシド三リン酸との混合物を形成する工程であって、この一本鎖核酸分子(T2)は、3’から5’の方向に、(a)N1中の第1のNARSのセンス鎖の3’側に位置するN1の一部と少なくとも実質的に相補的である配列と、(b)第2のNARSのセンス鎖の配列とを含む、工程;ならびに(B)一本鎖核酸分子(A2)を増幅する条件にて、上記混合物を維持する工程であって、A2が最大25ヌクレオチド長である、工程;を包含する。
【0009】
タンデム核酸増幅システム。このシステムは、第1の核酸(A1)を増幅するための第1のプライマー伸長手段と、第2の核酸(A2)を増幅するための第2のプライマー伸長手段とを備え、ここで、(i)A1は、A2を増幅するための第2のプライマー伸長手段のための開始プライマー;(ii)この第1のプライマー伸長手段および第2のプライマー伸長手段の両方が、単一の反応容器内に含まれており、かつニック形成剤(NA)の存在を必要とし;(iii)A1、A2、または両方が、最大25ヌクレオチド長であり;そして(iv)A2は、A1と少なくとも実質的に相補的である。
【0010】
核酸分子A2の指数関数的増幅のための方法。この方法は、(a)第1のテンプレート核酸(T1)を、第1のNARSを認識する第1のニック形成エンドヌクレアーゼ(NA)と、第1のDNAポリメラーゼの存在下でのプライマー伸長反応により、テンプレートとして使用して核酸分子(A1)を増幅する工程であって、この第1のテンプレート核酸(T1)は、第1のニック形成剤認識配列(NARS)の1本の鎖の配列を含む、工程;ならびに(b)第2のテンプレート核酸(T2)をテンプレートとして使用し、A1を開始プライマーとして使用して、第2のNAと第2のDNAポリメラーゼとの存在下でのプライマー伸長反応によってA2を増幅する工程であって、この第2のテンプレート核酸(T2)は、第2のNARSのセンス鎖の配列を含む、工程;を包含する。好ましくは、A1、A2、または両方が、最大25ヌクレオチド長である。
【0011】
ゲノム核酸またはcDNA分子における遺伝子変化を同定するための方法。この遺伝子変化は、そのゲノム核酸またはcDNA分子中の第1のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)のアンチセンス鎖の配列の5’側に位置する。この方法は、(A)混合物を形成する工程であって、この混合物は、(i)ゲノム核酸またはcDNA分子、(ii)一本鎖核酸分子(T2)、および(iii)第1のNERSを認識する第1のニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)、第2のNERSを認識する第2のNE、DNAポリメラーゼ、および1種以上のデオキシヌクレオシド三リン酸を含み、この一本鎖核酸分子(T2)は、3’から5’の方向に、(a)第1のNERSのアンチセンス鎖の配列の5’側に位置するゲノム核酸部分またはcDNA分子部分と少なくとも実質的に同一である配列と、(b)第2のNERSのセンス鎖の配列とを含む、工程;(B)この混合物を、一本鎖核酸分子(A2)を指数関数的に増幅する条件にて維持する工程;ならびに(C)そのゲノム核酸またはcDNA分子中の遺伝子変化を同定するためにA2を特徴付ける工程;を包含する。
【0012】
標的核酸中の規定された位置における遺伝子変化を同定するための方法。この方法は、(a)第1のオリゴヌクレオチド(ODNP)と、第2のODNPと、標的核酸との混合物を形成する工程であって、(i)その標的核酸が、第1の鎖と第2の鎖とを有する二本鎖核酸である場合に、その第1のODNPは、第1のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)のセンス鎖のヌクレオチド配列と、その遺伝子変化の相補体の3’側に位置する標的核酸の第1の鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列とを含み、第2のODNPは、その遺伝子変化の3’側に位置する標的核酸の第2の鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつその第2のODNPは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列(RERS)の1本の鎖の配列を必要に応じて含むか、または(ii)標的核酸が一本鎖核酸である場合に、その第1のODNPは、第1のNERSのセンス鎖のヌクレオチド配列と、その遺伝子変化の5’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列とを含み、その第2のODNPは、その遺伝子変化の3’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そしてその第2のODNPは、必要に応じてRERSを含む、工程;ならびに(b)その第1のODNPと第2のODNPとを伸長して、その第1のODNPのヌクレオチド配列と第2のODNPのヌクレオチド配列とを含む伸張産物を生成させる工程;(c)工程(b)の伸長産物を、RERSを認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて必要に応じて消化して、消化産物を生成する工程;(d)工程(b)の伸長産物の1本の鎖または工程(c)の消化産物の一本の鎖を、第1のNERSを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)の存在下でテンプレートとして使用して、第1の一本鎖核酸フラグメント(A1)を増幅する工程;(e)A1にアニールするための第2の一本鎖核酸分子(T2)を提供する工程であって、T2は、5’から3’の方向に、(i)第2のNERSのセンス鎖の配列と、(ii)A1と少なくとも実質的に相補的な配列とを含む、工程;(f)A1をテンプレートとして使用して、第3の一本鎖核酸フラグメント(A2)を増幅する工程;ならびに(g)A2を特徴付けて、標的核酸中の遺伝子変化を同定する工程;を包含する。好ましくは、A1、A2、または両方が、最大25ヌクレオチドを有する。
【0013】
標的核酸における規定された位置での遺伝子変化を同定するための方法。この方法は、(a)第1のODNPと、第2のODNPと、標的核酸との混合物を形成する工程であって、(i)標的核酸が、第1鎖と第2鎖とを有する二本鎖である場合、その第1のODNPは、第1の制限エンドヌクレアーゼ認識配列(RERS)の1本の鎖のヌクレオチド配列と、その遺伝子変化の相補体の3’側に位置する標的核酸の第1鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列とを含み、第2のODNPは、第2のRERSの一本の鎖のヌクレオチド配列と、その遺伝子変化の3’側に位置する標的核酸の第2鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列とを含むか、または(ii)標的核酸が一本鎖核酸である場合、その第1ODNPは、第1RERSの1本の鎖のヌクレオチド配列と、その遺伝子変化の相補体の5’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列とを含み、その第2ODNPは、第2RERSの1本の鎖の配列と、その遺伝子変化の3’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列とを含む、工程;(b)デオキシリボヌクレオシド三リン酸と、少なくとも1種の改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸との存在下で、その第1ODNPと第2ODNPとを伸長させて、第1RERSおよび第2RERSの両方を含む伸長産物を生成する工程;(c)第1RERSを認識する制限エンドヌクレアーゼ(RE)と第2RERSを認識する制限エンドヌクレアーゼとの存在下で、工程(b)の伸長産物をテンプレートとして使用して、一本鎖核酸フラグメントを指数関数的に増幅する工程であって、この一本鎖核酸フラグメントは、25ヌクレオチド長以下である、工程;ならびに(d)工程(c)の一本鎖フラグメントのうちの少なくとも1つを特徴付けて、その遺伝子変化を同定する工程;を包含する。
【0014】
標的核酸における規定された位置での遺伝子変化を同定するための方法。この方法は、(a)第1ODNPと、第2ODNPと、標的核酸との混合物を形成する工程であって、(i)その標的核酸が、第1鎖と第2鎖とを有する二本鎖核酸である場合、その第1ODNPは、第1制限エンドヌクレアーゼ認識配列(RERS)の1本の鎖のヌクレオチド配列と、その遺伝子変化の相補体の3’側に位置する標的核酸の第1鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列とを含み、その第2ODNPは、第2RERSの1本の鎖のヌクレオチド配列と、その遺伝子変化の3’側に位置する標的核酸の第2鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列とを含むか;または(ii)その標的核酸が一本鎖核酸である場合、その第1ODNPは、第1RERSの一本の鎖のヌクレオチド配列と、その遺伝子変化の相補体の5’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列とを含み、第2ODNPは、第2RERSの1本の鎖の配列と、その遺伝子変化の3’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列とを含む、工程;(b)デオキシリボヌクレオシド三リン酸と、少なくとも1種の改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸との存在下で、第1ODNPと第2ODNPとを伸長させて、第1RERSおよび第2RERSの両方を含む伸長産物を生成する工程;(c)第1RERSと第2RERSとを認識する制限エンドヌクレアーゼ(RE)の存在下で、工程(b)の伸長産物の一本の鎖をテンプレートとして使用して、第1の一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程;(d)A1にアニールする第2の一本鎖核酸分子(T2)を提供する工程であって、T2は、5’から3’の方向に、(i)第3のRERSのセンス鎖の配列と、(ii)A1と少なくとも実質的に相補的な配列とを含む、工程;(e)A1をテンプレートとして使用して、第3の一本鎖核酸フラグメント(A2)を増幅する工程;ならびに(f)工程(c)の一本鎖フラグメントの少なくとも1つを特徴付けして、その遺伝子変化を同定する工程;を包含する。
【0015】
標的核酸中の規定された位置での遺伝子変化を同定するための方法であって、この方法は、(a)第1オリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)と、第2ODNPと、標的核酸との混合物を形成する工程であって、(i)その標的核酸が、第1鎖と第2鎖とを有する二本鎖核酸である場合、その第1ODNPは、その遺伝子変化の相補体の3'側に位置する標的核酸の第1鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、第2ODNPは、その遺伝子変化の3’側に位置する標的核酸の第2鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むか、または(ii)その標的核酸が一本鎖核酸である場合、その第1ODNPは、その遺伝子変化の5’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、第2ODNPは、その遺伝子変化の3’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、この第1ODNPと第2ODNPとは、各々さらに、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)のセンス鎖のヌクレオチド配列を含む、工程;(b)この第1ODNPおよび第2ODNPを伸長させて、2つのNERSを含む伸長産物を生成させる工程;(c)上記NERSを認識する1種以上のニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)の存在下で、工程(b)の伸長産物をテンプレートとして使用して、一本鎖核酸フラグメントを指数関数的に増幅する工程であって、この一本鎖核酸フラグメントは、25個以下のヌクレオチドを有する、工程;ならびに(d)工程(c)の一本鎖フラグメントの少なくとも1つを特徴付け、それによりその遺伝子変化を同定する工程;を包含する。
【0016】
標的核酸における規定された位置での遺伝子変化を同定するための方法。この方法は、(a)第1オリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)と、第2ODNPと、標的核酸との混合物を形成する工程であって、(i)その標的核酸が、第1鎖と第2鎖とを有する二本鎖核酸分子である場合、その第1ODNPは、その遺伝子変化の相補体の3’側に位置する標的核酸の第1鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、その第2ODNPは、その遺伝子変化の3’側に位置する標的核酸の第2鎖のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むか、または(ii)その標的核酸が一本鎖核酸である場合、その第1ODNPは、その遺伝子変化の5’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、その第2ODNPは、その遺伝子変化の3’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、その第1ODNPおよび第2ODNPは、各々さらに、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)のセンス鎖のヌクレオチド配列を含む、工程;(b)その第1ODNPおよび第2ODNPを伸長させて、2つのNERSを含む伸長産物を生成させる工程;(c)NERSを認識する1種以上のニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)の存在下で、工程(b)の伸長産物の1本の鎖をテンプレートとして使用して、第1の一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程;(d)A1にアニールする第2の一本鎖核酸分子(T2)を提供する工程であって、T2は、5’から3’の方向に、(i)NERSのセンス鎖の配列と、(ii)A1と少なくとも実質的に相補的な配列とを含む、工程;(e)A1をテンプレートとして使用して、第3の一本鎖核酸フラグメント(A2)を増幅する工程;ならびに(f)工程(c)の一本鎖フラグメントを特徴付けることにより、その遺伝子変化を同定する工程;を包含する。好ましくは、A1、A2、または両方が、最大25ヌクレオチドを有する。
【0017】
サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する:(A)以下の(i)、(ii)、(iii)および(iv)を含む混合物を形成する工程:(i)このサンプルの核酸分子;(ii)3’から5’の向きで、以下の(a)、(b)および(c)を含む、第1の1本鎖核酸分子(T1):(a)標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的である第1配列、(b)第1のニック形成剤認識配列(NARS)のアンチセンス鎖の配列、および(c)多くとも25ヌクレオチドを有する第2配列;(iii)3’から5’の向きで、以下の(a)および(b)を含む、第2の1本鎖核酸分子(T2):(a)T1の第2配列に対して少なくとも実質的に同一である配列、および(b)第2NARSのセンス鎖の配列;ならびに(iv)この第1NARSを認識する第1ニック形成エンドヌクレアーゼ(NA)、この第2NARSを認識する第2NA、DNAポリメラーゼ、および1以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;(B)この標的核酸がこのサンプル中に存在するならば1本鎖核酸分子(A2)が指数関数的に増幅される条件にて、この混合物を維持する工程;ならびに(C)A2の存在または非存在を検出して、このサンプル中でのこの標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【0018】
サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する:(A)以下の(i)、(ii)、(iii)および(iv)を含む混合物を形成する工程:(i)このサンプルの核酸分子;(ii)3’から5’の向きで、以下の(a)および(b)を含む、第1の1本鎖核酸分子(T1):(a)標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的である配列、および(b)第1ニック形成剤認識配列(NARS)のセンス鎖の配列、(iii)3’から5’の向きで、以下の(a)および(b)を含む、第2の1本鎖核酸分子(T2):(a)第1NARSのセンス鎖の配列の3’側に位置する、T1の配列に対して少なくとも実質的に相補的である配列、および(b)第2NARSのセンス鎖の配列;ならびに(iv)この第1NARSを認識する第1ニック形成エンドヌクレアーゼ(NA)、この第2NARSを認識する第2NA、DNAポリメラーゼ、および1以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;(B)この標的核酸がこのサンプル中に存在するならば1本鎖核酸分子(A2)が増幅される条件にて、この混合物を維持する工程であって、ここで、A2は、(i)この標的核酸に対して少なくとも実質的に同一であり、そして(ii)好ましくは多くとも25ヌクレオチドを有する、工程;ならびに(C)A2の存在または非存在を検出して、このサンプル中のこの標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【0019】
サンプル中の、第1ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)を含む標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する:(A)以下の(i)、(ii)および(iii)を含む混合物を形成する工程:(i)このサンプルの核酸分子、(ii)3’から5’の向きで、以下の(a)および(b)を含む、1本鎖核酸分子(T2):(a)この第1NERSのアンチセンス鎖の配列の5’側に位置する、標的核酸分子の一部分に対して少なくとも実質的に同一である配列、および(b)第2NERSのセンス鎖の配列、ならびに(iii)この第1NERSを認識する第1ニック形成エンドヌクレアーゼ(NE);この第2NERSを認識する第2NE、DNAポリメラーゼ、および1以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;(B)この標的核酸がこのサンプル中に存在するならば1本鎖核酸分子(A2)が指数関数的に増幅される条件にて、この混合物を維持する工程;ならびに(C)A2の存在または非存在を検出して、このサンプル中でのこの標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【0020】
サンプル中の、第1ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)を含む標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する:(A)以下の(i)、(ii)、(iii)および(iv)を含む混合物を形成する工程:(i)この標的核酸分子、(ii)この標的核酸の一方の鎖に対して実質的に同一であり、かつこの第1NERSのアンチセンス鎖の配列を含む、第1の1本鎖核酸分子(T1)、(iii)3’から5’の向きで、以下の(a)および(b)を含む、第2の1本鎖核酸分子(T2):(a)この第1NERSのアンチセンス鎖の配列の5’側に位置する、T1の一部分に対して少なくとも実質的に同一である配列、および(b)第2NERSのセンス鎖の配列、ならびに(iv)この第1NERSを認識する第1ニック形成エンドヌクレアーゼ(NE);この第2NERSを認識する第2NE、DNAポリメラーゼ、および1以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;(B)この標的核酸がこのサンプル中に存在するならば1本鎖核酸分子(A2)が指数関数的に増幅される条件にて、この混合物を維持する工程;ならびに(C)A2の存在または非存在を検出して、このサンプル中でのこの標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【0021】
サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は以下を包含する:(A)第1オリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第2ODNP、およびこのサンプルの核酸分子の混合物を形成する工程であって、ここで(i)この標的核酸が、第1鎖および第2鎖を有する2本鎖核酸である場合、この第1ODNPは、第1制限エンドヌクレアーゼ認識配列(RERS)のセンス鎖のヌクレオチド配列、およびこの標的核酸の第1鎖の第1の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第2ODNPは、この標的核酸の第2鎖の第2の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第2RERSのセンス鎖の配列を含み、この第2の部分は、この標的核酸の第2鎖において第1の部分の相補体の3’側に位置するか、または(ii)この標的核酸が1本鎖核酸である場合、この第1ODNPは、第1RERSのセンス鎖のヌクレオチド配列、およびこの標的核酸の第1の部分に対して少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第2ODNPは、この標的核酸の第2の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第2RERSのセンス鎖の配列を含み、この第2の部分は、この標的核酸において第1の部分の5’側に位置する、工程;(B)この標的核酸がこのサンプル中に存在するならば、この第1RERSおよびこの第2RERSを認識する制限エンドヌクレアーゼ(RE)、デオキシリボヌクレオシド三リン酸および少なくとも1つの改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ならびにDNAポリメラーゼの存在下で1本鎖核酸分子(A2)が指数関数的に増幅される条件にて、この混合物を維持する工程であって、ここでA2は、25ヌクレオチド長以下である、工程;ならびに(C)A2の存在または非存在を検出して、このサンプル中でのこの標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【0022】
サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する:(A)第1オリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第2ODNP、およびこのサンプルの核酸分子の混合物を形成する工程であって、ここで(i)この標的核酸が、第1鎖および第2鎖を有する2本鎖核酸である場合、この第1ODNPは、第1ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)のセンス鎖のヌクレオチド配列、およびこの標的核酸の第1鎖の第1の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第2ODNPは、この標的核酸の第2鎖の第2の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第2NERSのセンス鎖の配列を含み、この第2の部分は、この標的核酸の第2鎖において第1の部分の相補体の3’側に位置するか、または(ii)この標的核酸が1本鎖核酸である場合、この第1ODNPは、第1NERSのセンス鎖の配列、およびこの標的核酸の第1の部分に対して少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第2ODNPは、この標的核酸の第2の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第2NERSのセンス鎖の配列を含み、この第2の部分は、この標的核酸において第1の部分の5’側に位置する、工程;(B)この標的核酸がこのサンプル中に存在するならば、この第1NERSおよびこの第2NERSを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)、デオキシリボヌクレオシド三リン酸およびDNAポリメラーゼの存在下で1本鎖核酸フラグメント(A2)が指数関数的に増幅される条件にて、この混合物を維持する工程であって、ここでA2は、好ましくは、25ヌクレオチド長以下である、工程;ならびに(C)A2の存在または非存在を検出して、このサンプル中でのこの標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【0023】
サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は以下を包含する:(A)第1オリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第2ODNP、およびこのサンプルの核酸分子の混合物を形成する工程であって、ここで(i)この標的核酸が、第1鎖および第2鎖を有する2本鎖核酸である場合、この第1ODNPは、第1ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)のセンス鎖のヌクレオチド配列、およびこの標的核酸の第1鎖の第1の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第2ODNPは、この標的核酸の第2鎖の第2の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第2NERSのセンス鎖の配列を含み、この第2の部分は、この標的核酸の第2鎖において第1の部分の相補体の3’側に位置するか、または(ii)この標的核酸が1本鎖核酸である場合、この第1ODNPは、第1NERSのセンス鎖のヌクレオチド配列、およびこの標的核酸の第1の部分に対して少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含み、そしてこの第2ODNPは、この標的核酸の第2の部分に対して少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第2NERSのセンス鎖の配列を含み、この第2の部分は、この標的核酸において第1の部分の5’側に位置する、工程;(B)この標的核酸がこのサンプル中に存在するならば、(i)この第1ODNPおよびこの第2ODNPを伸長して、この第1NERSおよびこの第2NERSの両方を含む伸長産物が生成される条件;(ii)この第1NERSおよびこの第2NERSを認識するさらにもう1つのニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)の存在下で、工程(b)のこの伸長産物の一方の鎖をテンプレートとして用いて、第1の1本鎖核酸フラグメント(A1)が増幅される条件;(iii)A1にアニーリングし得る第2の1本鎖核酸分子(T2)の存在下で、A1をテンプレートとして用いて、第3の1本鎖核酸フラグメント(A2)が増幅される条件にこの混合物を供する工程であって、A1、A2または両方は、多くとも25ヌクレオチドを有し、そしてここでT2は、5’から3’の向きで、以下の(a)および(b)を含む、工程:(a)第3のNERSのセンス鎖の配列、および(b)A1に対して少なくとも実質的に相補的な配列;ならびに(C)A2の存在または非存在を検出して、このサンプル中でのこの標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【0024】
サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する:(A)以下の(i)および(ii)を含む混合物を形成する工程:(i)このサンプルの核酸分子、および(ii)3’から5’の向きで、この標的核酸の5’部分に対して少なくとも実質的に相補的である配列、および第1のニック形成剤認識配列(NARS)のアンチセンス鎖の配列を含む、1本鎖核酸プローブ(T1)、(B)存在する場合、この標的核酸にハイブリダイズしたプローブ分子を、この標的核酸にハイブリダイズしていないプローブ分子から分離する工程;(C)存在するならば、この標的核酸にハイブリダイズしたプローブ分子、およびこの第1NARSを認識する第1ニック形成剤(NA)の存在下で増幅反応を行う工程;(D)5’から3’の向きで、以下の(i)および(ii)を含む、1本鎖核酸分子(T2)を提供する工程:(i)第2NARSのセンス鎖の配列、および(ii)この第1NARSのアンチセンス鎖の配列の5’側に位置する、この第1の1本鎖核酸プローブの一部分に対して少なくとも実質的に同一である配列、(E)この第2NARSを認識する第2NAの存在下で増幅反応を行う工程;(F)工程(E)の増幅産物の存在または非存在を検出して、このサンプル中での標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【0025】
サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する:(A)以下の(i)および(ii)を含む混合物を形成する工程:(i)このサンプルの核酸分子、および(ii)以下の(a)および(b)を含む、部分的に2本鎖の核酸プローブ:(a)第1NARSのセンス鎖の配列、この第1NARSのアンチセンスの配列、または両方;および(b)この鎖自体またはその伸長産物が、この第1NARSを認識する第1ニック形成剤(NA)によってニック形成可能なニック形成部位(NS)を含む鎖中の5’突出部、またはこの鎖もその伸長産物もこのNSを含まない鎖中の3’突出部であって、ここで、突出部は、この標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含む、工程;(B)存在する場合、この標的核酸にハイブリダイズしたプローブ分子を、この標的核酸にハイブリダイズしていないプローブ分子から分離する工程;(C)存在するならば、この標的核酸にハイブリダイズしたプローブ分子、およびこの第1NARSを認識する第1ニック形成剤(NA)の存在下で増幅反応を行う工程;(D)5’から3’の向きで、以下の(i)および(ii)を含む、1本鎖核酸分子(T2)を提供する工程:(i)第2NARSのセンス鎖の配列、および(ii)この第1NARSのアンチセンス鎖の配列の5’側に位置する、この核酸プローブの一部分に対して少なくとも実質的に同一である配列、(E)この第2NARSを認識する第2NAの存在下で増幅反応を行う工程;(F)工程(E)の増幅産物の存在または非存在を検出して、このサンプル中での標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
【0026】
cDNA分子中の2つの特定のエキソン間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する:(A)以下の(i)および(ii)を含む少なくとも部分的に2本鎖の核酸分子(N1)を提供する工程:(i)第1ニック形成剤認識配列(NARS)のセンス鎖の配列、およびこの第1NARSのアンチセンス鎖の配列のうちの少なくとも一方、ならびに(ii)このcDNA分子の一部分の少なくとも一方の鎖であって、この部分は、この2つのエキソンの間に連結部を含む疑いがある、工程;(B)この第1NARSを認識するニック形成剤(NA)、DNAポリメラーゼ、および1以上のデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で第1の1本鎖核酸分子(A1)を増幅する工程であって、ここで、この増幅する工程は、このcDNAの一部分を、このポリメラーゼについてのテンプレートとして用いる、工程;(C)5’から3’の向きで、以下の(i)および(ii)を含む、第2の1本鎖核酸分子(T2)を提供する工程:(i)第2NARSのセンス鎖の配列、および(ii)A1に対して少なくとも実質的に相補的である配列;(D)T2、A1、この第1NA、この第2NARSを認識する第2NA、このDNAポリメラーゼ、およびこのデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、第3の1本鎖核酸分子(A2)を増幅する工程であって、ここで、A2は、A1に対して少なくとも実質的に相補的である、工程;ならびに(E)A2を検出および/または特徴付けして、このcDNA分子の連結部の存在または非存在を決定する工程。
【0027】
cDNA分子中の2つのエキソン間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、ここで、この連結部は、存在する場合、このcDNA分子中の第1ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)のアンチセンス鎖の配列の5’側に位置し、この方法は、以下を包含する:(A)以下の(i)、(ii)および(iii)を含む混合物を形成する工程:(i)このcDNA分子、(ii)3’から5’の向きで、以下の(a)および(b)を含む、1本鎖核酸分子(T2):(a)この第1NERSのアンチセンス鎖の配列の5’側に位置する、このcDNA分子の一部分に対して少なくとも実質的に同一である配列、および(b)第2NERSのセンス鎖の配列、ならびに(iii)この第1NERSを認識する第1ニック形成エンドヌクレアーゼ(NE);この第2NERSを認識する第2NE、DNAポリメラーゼ、および1以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;(B)1本鎖核酸分子(A2)を指数関数的に増幅する条件にて、この混合物を維持する工程;ならびに(C)A2を特徴付けして、このcDNA分子中での連結部の存在または非存在を決定する工程。
【0028】
cDNA分子中の遺伝子の上流エキソン(エキソンA)と下流エキソン(エキソンB)との間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する:(A)第1オリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第2ODNP、およびこのcDNA分子の混合物を形成する工程であって、ここで、(i)この第1ODNPは、エキソンAのアンチセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列をこのアンチセンス鎖中のエキソンAの5’末端付近に含み、(ii)この第2ODNPは、エキソンBのセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列をこのセンス鎖中のエキソンBの5’末端付近に含み、そして(iii)この第1ODNPおよびこの第2ODNPのうちの少なくとも一方は、第1ニック形成剤認識配列(NARS)のセンス鎖の配列をさらに含む、工程;ならびに(B)エキソンAおよびエキソンBの両方がこのcDNA中に存在するならば第1の1本鎖核酸(A1)が増幅される条件下にて、この第1NARSを認識するニック形成剤(NA)の存在下で、第1増幅反応を行う工程;(C)5’から3’の向きで、以下の(i)および(ii)を含む、第2の1本鎖核酸分子(T2)を提供する工程:(i)第2NARSのセンス鎖の配列、および(ii)A1に対して少なくとも実質的に相補的な配列;(D)エキソンAおよびエキソンBの両方が、このcDNA分子中に存在するならば、A1をテンプレートとして用いて、第3の1本鎖核酸フラグメント(A2)が増幅される条件下にて、この第2NARSを認識する第2NAの存在下で、第2増幅反応を行う工程;ならびに(G)A2を検出および/または特徴付けして、このcDNA分子中でのエキソンAとエキソンBとの間の連結部の存在または非存在を決定する工程。
【0029】
cDNA分子中の遺伝子の上流エキソン(エキソンA)と下流エキソン(エキソンB)との間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下を包含する:(A)第1オリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第2ODNP、およびこのcDNA分子の混合物を形成する工程であって、ここで、(i)この第1ODNPは、以下の(a)および(b)を含む:(a)エキソンAのアンチセンス鎖中のエキソンAの5’末端付近に、このアンチセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列、および(b)第1ニック形成剤認識配列(NARS)のセンス鎖の配列;そして(ii)この第2ODNPは、以下の(a)および(b)を含む:(a)エキソンBのセンス鎖中のエキソンBの5’末端付近に、このセンス鎖の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列、および(b)第2NARSのセンス鎖の配列;(B)エキソンAおよびエキソンBの両方がこのcDNA中に存在するならば第1の1本鎖核酸(A1)が増幅される条件下にて、この第1NARSを認識する第1ニック形成剤(NA)およびこの第2NARSを認識する第2NAの存在下で、第1増幅反応を行う工程;(C)5’から3’の向きで、以下の(i)および(ii)を含む、第2の1本鎖核酸分子(T2)を提供する工程:(i)第3のNARSのセンス鎖の配列、および(ii)A1に対して少なくとも実質的に相補的な配列;(D)エキソンAおよびエキソンBの両方が、このcDNA分子中に存在するならば、A1をテンプレートとして用いて、第3の1本鎖核酸フラグメント(A2)が増幅される条件下にて、この第2NARSを認識する第3NAの存在下で、第2増幅反応を行う工程;ならびに(E)A2を検出および/または特徴付けして、このcDNA分子中でのエキソンAとエキソンBとの間の連結部の存在または非存在を決定する工程。
【0030】
cDNA分子中の遺伝子の上流エキソン(エキソンA)と下流エキソン(エキソンB)との間の接合部の存在または非存在を決定するための方法であって、この方法は、以下の工程を包含する:(A)第1オリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第2ODNP、およびcDNA分子の混合物を形成する工程であって、ここで、(i)第1ODNPは、(a)アンチセンス鎖中のエキソンAの5’末端付近のエキソンAのアンチセンス鎖の一部に少なくとも実質的に相補的な配列、および(b)第1ニック形成剤認識配列(NARS)のセンス鎖の配列、を含み;そして(ii)第2ODNPは、:(a)センス鎖中のエキソンBの5’末端付近のエキソンBのセンス鎖の一部に少なくとも実質的に相補的な配列、および(b)第2NARSのセンス鎖の配列を含む、工程;(B)エキソンAおよびエキソンBの両方がcDNA分子中に存在する場合に、一本鎖核酸フラグメント(A2)を指数関数的に増幅する条件下にこの混合物を維持する工程;ならびに(C)A2を検出および/または特徴付けして、cDNA分子中のエキソンAとエキソンBとの間の接合部の存在または非存在を決定する工程。
【0031】
以下の基準を単独または任意の組合せで使用して、上記および本明細書中の他の部分に概略を示すように本発明の方法をさらに記載し、ここでこれらの基準は、例示のみであり、そして本明細書の他の箇所に記述され得る他の基準をまた使用して、本発明の方法をさらに記載し得る:第1NARSは、第2NARSと同一である;第1ニック形成剤は、第2ニック形成剤と同じである;方法における任意の1つ以上のNARSがNERSである;第1NAおよび第2NAの両方が、ニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)である;NEが、N.BstNB Iである;NEが、N.Alw Iである;第1NEおよび第2NEの両方が、N.BstNB Iである;第1ニック形成剤または第2ニック形成剤の少なくとも一方がニック形成エンドヌクレアーゼである;第1NAおよび第2NAの両方が、制限エンドヌクレアーゼ(RE)である;第1NARS、第2NARSおよび第3NARS(3つのNARSが、本発明の実施形態において特定される場合)が、互いに同一である;第1NARS、第2NARSおよび第3NARSの各々が、ニック形成エンドヌクレアーゼにより認識される;第1NARS、第2NARSおよび第3NARSの少なくとも1つが、ニック形成エンドヌクレアーゼにより認識される;この方法の、任意の1つ、または任意の2つ、または任意の3つ、または任意の4つ、または任意の5つ、または任意の6つ、または任意の7つ、または任意の8つ、または任意の9つ、または任意の10などの工程(例えば、工程(A)、工程(B)、工程(C)および工程(D)、または例えば、工程(a)〜工程(j))が、単一の容器で行われる;一本鎖核酸フラグメントの増幅が、等温条件下で行われる;各増幅反応が、50℃〜70℃の範囲内の1つ以上の温度で行われる;各増幅反応が、60℃または約60℃で行われる;各増幅反応が、最高温度と最低温度との間の温度で行われ、ここで、最高温度が最低温度から20℃以内であり;各増幅反応が、最高温度と最低温度との間の温度で行われ、ここで、最高温度が最低温度の15℃以内であり;各増幅反応が、最高温度と最低温度との間の温度で行われ、ここで、最高温度が最低温度の10℃以内であり;各増幅反応が、最高温度と最低温度との間の温度で行われ、ここで、最高温度が最低温度の5℃以内であり;N1が、第1NERSのセンス鎖のヌクレオチド配列を含み;N1が、第1NERSのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含み;第1NAおよび第2NAの両方が、制限エンドヌクレアーゼ(RE)であり;N1が、トリガーオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)および一本鎖核酸(T1)をアニーリングすることにより与えられ、ここでT1は、第1NERSのセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかのヌクレオチド配列を含み;N1が、5’側から3’側に以下:(A)第1NARSのアンチセンス鎖の配列;および(B)トリガーODNPの少なくとも一部に対して少なくとも実質的に相補的である配列、を含む一本鎖標的核酸(T1)に対してトリガーオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)をアニーリングさせることにより与えられる場合、T1の配列(B)が、トリガーODNPの少なくとも一部に正確に相補的である;T1がT2に対して実質的に同一である;T2の3’末端が、リン酸基に結合される;T1の3’末端が、リン酸基に結合される;T1が、T2と正確に同一である;T1が、T2に対して実質的にも正確にも同一でない;N1中のNARSのアンチセンス鎖に対して5’側に位置するN1の部分に少なくとも実質的に同一であるT2のヌクレオチド配列が、実際に、第1NARSのアンチセンス鎖に対して5’側に位置するN1の部分に正確に同一である;T3が、テンプレート配列T2の少なくとも一部に少なくとも実質的に同一である配列を含む場合、一実施形態においてT3が、テンプレート配列T2の少なくとも一部に正確に同一である配列を含む;A2が、A1中のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含む;A2が、A1中のヌクレオチド配列に正確に同一であるヌクレオチド配列を含む;A1が、A2中のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含む;A1が、A2中のヌクレオチド配列に正確に同一であるヌクレオチド配列を含む;A2およびA1が、同一である;Alが、A2と実質的に同一である;A2が、A1と実質的に同一である;A1が、A2と正確に同一である;A1が、A2と実質的に同一でも正確に同一でもない;A1が、トリガーODNPと実質的に同一である;A1が、トリガーODNP正確に同一である;A2が、トリガーODNPと実質的に同一である;A2が、トリガーODNPと正確に同一である;A1が、少なくとも5、もしくは少なくとも6、もしくは少なくとも7、もしくは少なくとも8、もしくは少なくとも9、もしくは少なくとも10、もしくは少なくとも11、もしくは少なくとも12、もしくは少なくとも13、もしくは少なくとも14、もしくは少なくとも15、もしくは少なくとも16、もしくは少なくとも17、もしくは少なくとも18、もしくは少なくとも19、もしくは少なくとも20、もしくは少なくとも21、もしくは少なくとも22、もしくは少なくとも23、もしくは少なくとも24、もしくは少なくとも25ヌクレオチド長であり、一方、さらにまたはあるいは、A1は、40以下、もしくは39以下、もしくは38以下、もしくは37以下、もしくは36以下、もしくは35以下、もしくは34以下、もしくは33以下、もしくは32以下、もしくは31以下、もしくは30以下、もしくは29以下、もしくは28以下、もしくは27以下、もしくは26以下、もしくは25以下、もしくは24以下、もしくは23以下、もしくは22以下、もしくは21以下、もしくは20以下、もしくは19以下、もしくは18以下、もしくは17以下、もしくは16以下、もしくは15以下、もしくは14以下、もしくは13以下、もしくは12以下、もしくは11以下、もしくは10以下のヌクレオチド長であり、ここで、A1のヌクレオチド長に対する示された任意の上限は、A1のヌクレオチド長に対する任意の示された下限と組み合わされ得、その結果、例えば、A1は、8〜24ヌクレオチド長であり得るか、12〜17のヌクレオチド長である;A2は、少なくとも5、もしくは少なくとも6、もしくは少なくとも7、もしくは少なくとも8、もしくは少なくとも9、もしくは少なくとも10、もしくは少なくとも11、もしくは少なくとも12、もしくは少なくとも13、もしくは少なくとも14、もしくは少なくとも15、もしくは少なくとも16、もしくは少なくとも17、もしくは少なくとも18、もしくは少なくとも19、もしくは少なくとも20、もしくは少なくとも21、もしくは少なくとも22、もしくは少なくとも23、もしくは少なくとも24、もしくは少なくとも25ヌクレオチド長であり、一方、さらにまたはあるいは、A2は、40以下、もしくは39以下、もしくは38以下、もしくは37以下、もしくは36以下、もしくは35以下、もしくは34以下、もしくは33以下、もしくは32以下、もしくは31以下、もしくは30以下、もしくは29以下、もしくは28以下、もしくは27以下、もしくは26以下、もしくは25以下、もしくは24以下、もしくは23以下、もしくは22以下、もしくは21以下、もしくは20以下、もしくは19以下、もしくは18以下、もしくは17以下、もしくは16以下、もしくは15以下、もしくは14以下、もしくは13以下、もしくは12以下、もしくは11以下、もしくは10ヌクレオチド長であり、ここでA2のヌクレオチド長に対して述べた任意の上限は、A2のヌクレオチド長に対して述べた任意の下限と組み合わされ得、その結果、A2は、例えば、8〜24ヌクレオチド長、または12〜17ヌクレオチド長であり得る;T2分子の最初の数が、T1分子の最初の数より多い;N1は、ゲノムDNA由来である;N1が、ゲノムDNAの一部である;標的核酸が、変性二本鎖核酸の一方の鎖である;標的核酸が、二本鎖ゲノム核酸またはcDNAの一方の鎖である;標的核酸が、RNA分子である;標的核酸が、細菌から得られた核酸由来である;標的核酸が、ウイルスから得られた核酸由来である;標的核酸が、真菌から得られた核酸由来である;標的核酸が、寄生生物由来の核酸由来である;トリガーODNPが、二本鎖ゲノム核酸またはcDNAの一方の鎖である;トリガーODNPが、RNA分子である;トリガーODNPが、細菌から得られた核酸由来である;トリガーODNPが、ウイルスから得られた核酸由来である;トリガーODNPが、真菌から得られた核酸由来である;トリガーODNPが、寄生生物由来の核酸由来である;デオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも1つが、標識される;デオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも1つが、放射性標識に連結される;デオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも1つが、酵素標識に連結される;デオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも1つが、標識として機能する蛍光色素に連結される;デオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも1つが、標識として機能するジゴキシゲニン(digoxidenin)に連結される; デオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも1つが、ビオチンに連結される;方法の全ての工程において同じ型のDNAポリメラーゼが使用される;DNAポリメラーゼが、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損である;DNAポリメラーゼが、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損であり、そしてexo−Vent、exo−Deep Vent、exo−Bst、exo−Pfu、exo−Bca、DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメント、T5 DNAポリメラーゼ、Phi29 DNAポリメラーゼ、ファージM2 DNAポリメラーゼ、ファージPhiPRD1 DNAポリメラーゼ、Sequenase、PRD1 DNAポリメラーゼ、9°NmTMDNAポリメラーゼおよびT4 DNAポリメラーゼホモエンザイム(homoenzyme)から選択され、ここでこれらの列挙されたDNAポリメラーゼの任意の2つ以上が組み合わされて本発明の方法において使用されるDNAポリメラーゼが選択される群を形成し得、例えば、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼは、exo−Bstポリメラーゼ、exo−Bcaポリメラーゼ、exo−Ventポリメラーゼ、9°NmTM DNAポリメラーゼまたはexo−Deep Ventポリメラーゼである;DNAポリメラーゼが、鎖置換活性を有する;各増幅反応が、鎖置換促進因子(facilitator)の存在下で行われる;鎖置換促進因子が、増幅の間に使用され、ここでこの鎖置換促進因子は、BMRF1ポリメラーゼ補助(accessory)サブユニット、アデノウイルスDNA結合タンパク質、単純疱疹ウイルスタンパク質ICP8、一本鎖DNAタンパク質、ファージT4遺伝子32タンパク質、子ウシ胸腺ヘリカーゼ、およびトレハロースの群から選択され、ここで本発明は、列挙した促進因子の任意の2つ以上を組み合わせて、本発明の実施形態を実施するために促進因子が選択される群を形成し得ることを提供する;鎖置換促進因子はトレハロースである。
【0032】
本発明の方法のいずれも、増幅された核酸を検出する工程(例えば、定量的または定性的のいずれかでA2の形成を検出する工程)を包含し得るか、好ましくは包含する。一実施形態において、この検出は、発光分光法または分光測定法、蛍光分光法または分光測定法、質量分析、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光、および電気泳動から選択される技術により少なくとも部分的に実行され、ここで列挙された技術の任意の2つ、3つ、4つまたはそれ以上のメンバーを、本発明の実施形態において利用される技術が選択され得る技術の群を形成するように一緒にグループ化し得る(例えば、検出は、質量分析または液体クロマトグラフィーにより実行され得る)。一実施形態において、検出は、二本鎖核酸に特異的に結合する蛍光インターカレート剤の使用を伴う。
【0033】
さらなる局面において、本発明は、以下を提供する:
組成物であって、以下:(A)一方の鎖が5’側から3’側に以下を含む、第1の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子(例えば、本明細書中に記載されるN1またはH1):(i)多くとも25ヌクレオチド長の配列、および(ii)第1ニック形成剤認識配列(NARS)のアンチセンス鎖の配列;ならびに(B)一方の鎖が、5’側から3’側に以下を含む、第2の少なくとも二本鎖の核酸分子(例えは、本明細書中に記載されるN2またはH2):(i)第2NARSのセンス鎖の配列、および(ii)第1核酸分子中の第1NARSのアンチセンス鎖の配列に対して5’側に位置する配列に少なくとも実質的に同一な配列、を含む組成物。
【0034】
組成物であって、以下:(a)一方の鎖が、第1ニック形成剤認識配列(NARS)のセンス鎖の配列を含む、第1の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子(例えば、本明細書中に記載されるN1またはH1);ならびに(b)一方の鎖が、5’側から3’側に以下を含む第2の少なくとも二本鎖の核酸分子(例えば、本明細書中に記載されるN2またはH2):(i)第2NARSのセンス鎖の配列、および(ii)第1核酸分子中の第1NARSのセンス鎖の配列に対して3’側に位置する配列に少なくとも実質的に相補的である配列、を含み、ここで第1NARSを認識するニック形成剤、DNAポリメラーゼ、および1つ以上のヌクレオシド三リン酸の存在下において、第1核酸分子をテンプレートとして使用して増幅された一本鎖核酸フラグメントは、多くとも25個のヌクレオチドを有する。
【0035】
これらの組成物において、以下のさらなる基準および/または成分を使用して、組成物を記載し得、そして本発明の方法に関しては上記の基準も同様である:この組成物は、第1NARSを認識する第1NAおよび第2NARSを認識する第2NAをさらに含む;この組成物は、第1NARSおよび第2NARSの両方を認識するニック形成剤をさらに含む;この組成物は、第1NERSおよび第2NERSの両方を認識するニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)をさらに含む;この組成物は、第1NARSおよび第2NARSの両方を認識するニック形成剤(NA)をさらに含む;この組成物は、N.BstNB Iをさらに含む;この組成物は、DNAポリメラーゼをさらに含む;この組成物は、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損であるDNAポリメラーゼをさらに含む;この組成物は、exo−Vent、exo−Deep Vent、exo−Bst、exo−Pfu、exo−Bca、DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメント、T5 DNAポリメラーゼ、Phi29 DNAポリメラーゼ、ファージM2 DNAポリメラーゼ、ファージPhiPRD1 DNAポリメラーゼ、Sequenase、PRD1 DNAポリメラーゼ,9°NmTM DNAポリメラーゼおよびT4 DNAポリメラーゼホモエンザイム(homoenzyme)からなる群から選択されるDNAポリメラーゼをさらに含む;この組成物は、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼをさらに含む;この組成物は、鎖置換促進因子をさらに含む;この組成物は、BMRF1ポリメラーゼ補助サブユニット、アデノウイルスDNA結合タンパク質、単純疱疹ウイルスタンパク質ICP8、一本鎖DNA結合タンパク質、ファージT4遺伝子32タンパク質、子ウシ胸腺ヘリカーゼ、およびトレハロースの群から選択される鎖置換促進因子をさらに含み、ここでこの群の1つ以上のメンバーは、組み合わされて、本発明の実施形態において促進因子が選択される群を形成し得る;この組成物は、トレハロースを含む;この組成物は、標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸を含む。この組成物は、T2中の第2NARSのアンチセンス鎖の配列に対して5’側に位置する配列に少なくとも実質的に相補的である標識されたオリゴヌクレオチドを含む。この組成物は、蛍光インターカレート剤を含む。
【0036】
NARSを含む本発明の方法または化合物または組成物のいずれかにおいて、このNARSは、1つ以上のミスマッチヌクレオチドを含み得る。換言すると、NARSを形成するヌクレオチド塩基対の1つ以上は、従来のワトソン−クリック塩基対合則に従ってハイブリダイズしないかもしれない。しかし、ミスマッチヌクレオチドがこのNARSに存在する場合、少なくともNARSのセンス鎖を形成するのに必要な全てのヌクレオチドが存在する。一実施形態において、NARSにミスマッチ塩基対が存在せず、さらにこのNARSに存在する全てのヌクレオチドが相補鎖中のヌクレオチドと、従来のワトソン−クリック塩基対合則に従って対になる。一実施形態において、NARSは、ミスマッチ塩基対を含む。一実施形態において、NARSに1つのミスマッチ塩基対が存在するが、別の実施形態では、NARSに2つのミスマッチ塩基対が存在し、別の実施形態では、NARSを形成する全ての塩基対が、ミスマッチであり、別の実施形態では、NARSを形成する塩基対のn−1個はミスマッチであり、ここでn個の塩基対がNARSを形成する。本発明が第1NARSおよび第2NARSの両方を利用する一実施形態において、第1NARSに存在するミスマッチはまた、第2NARSにも存在する。本発明が第1NARSおよび第2NARSの両方を利用する一実施形態において、第1NARSに存在するミスマッチは、第2NARSには存在しない。本発明が第1NARSおよび第2NARSの両方を利用する一実施形態において、第1NARSは、ミスマッチ塩基対を含まないが、第2NARSは、1つ以上のミスマッチ塩基対を含む。一実施形態において、NARS中にマッチしないヌクレオチドが存在する。別の実施形態において、NARSのセンス鎖を形成するヌクレオチドがマッチしない。別の実施形態において、NARSは、マッチしないヌクレオチドを含む。
【0037】
また、本発明の方法、化合物および組成物において、1つ以上の核酸分子は、固体支持体に固定化され得る。代表的に、この固定化は、ハイブリダイズした物質とハイブリダイズしていない物質の予備的分離を可能にする。種々の実施形態において:第1ODNPが固定化される;第2ODNPが固定化される;第1ODNPおよび第2ODNPの両方が固定化される;標的核酸が固定化される;T2、または各T2が固定化される;固定化が、共有結合を介して固体支持体に対するものである。適切な固体支持体は、シリカ、プラスチックおよび金属のような材料から作製される。
【0038】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すると明らかとなる。
【0039】
(発明の詳細な説明)
本発明は、ニック形成剤を使用する、核酸の指数関数的な増幅のための単純かつ効率的な方法およびキットを提供する。この増幅は、等温的に行なわれ得、転写ベースではない。これらの方法およびキットは、遺伝的バリエーションの検出、病原体または疾患の診断、および差次的スプライシング分析のような多くの領域において有用である。
【0040】
(取り決め/定義)
本発明のより詳細な説明を提供する前に、以下のように、本明細書中で使用される場合の取り決めを規定し、そして定義を提供することは、本発明の理解により有用であり得る。さらなる定義もまた、本発明の記載の全体にわたって提供される。
【0041】
用語「3’」および「5’」は、核酸の一本鎖内の特定の部位の位置を記載するために、本明細書中で使用される。核酸内の位置が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列「に対して3’(側)」または「の3’(側)」である場合、これは、その位置が参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の3’末端と核酸の鎖の3’ヒドロキシルとの間に位置することを意味する。同様に、核酸内の位置が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列「に対して5’(側)」または「の5’(側)」である場合、これは、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の5’末端と核酸のその鎖の5’リン酸との間に位置することを意味する。さらに、ヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列「に対してすぐ3’(側)」または「のすぐ3’(側)」である場合、これは、このヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の3’末端にすぐ隣接することを意味する。同様に、ヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列「に対してすぐ5’(側)」または「のすぐ5’(側)」である場合、これは、このヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の5’末端にすぐ隣接することを意味する。
【0042】
「天然に存在する核酸」とは、天然に存在する核酸分子(例えば、全長ゲノムDNA分子またはmRNA分子)をいう。
【0043】
「単離された核酸分子」とは、任意の天然に存在する核酸に対して、または3つより多くの別々の遺伝子にわたる天然に存在するゲノム核酸の任意のフラグメントの核酸分子に対して同一でない、核酸分子をいう。
【0044】
本明細書中で使用される場合、「ニック形成」は、完全に二本鎖の核酸分子または部分的に二本鎖の核酸分子の二本鎖の部分の、ニック形成を行う酵素によって認識されるヌクレオチド配列に対する特定の位置での一方の鎖のみの切断をいう。核酸がニック形成される特定の位置は、「ニック形成部位」(NS)といわれる。
【0045】
「ニック形成剤」(NA)は、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子の特定のヌクレオチド配列を認識し、そしてこの認識配列に対して特定の位置で核酸分子の一方の鎖のみを切断する酵素である。ニック形成剤としては、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子が、半改変された認識/切断配列を含む場合、ニック形成エンドヌクレアーゼ(例えば、N.BstNB I)および制限エンドヌクレアーゼ(例えば、HincII)が挙げられるがこれらに限定されず、この半改変された認識/切断配列において、一本の鎖は、制限エンドヌクレアーゼによるその鎖(すなわち、誘導体化されたヌクレオチドを含む鎖)の切断を阻止する少なくとも1つの誘導体化されたヌクレオチドを含む。
【0046】
本明細書中で使用される場合、「ニック形成エンドヌクレアーゼ」(NE)は、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子のヌクレオチド配列を認識し、そして認識配列に対して特定の位置で核酸分子の一方の鎖のみを切断するエンドヌクレアーゼをいう。少なくとも1つの誘導体化されたヌクレオチドを含むことによって改変され、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子の誘導体化されたヌクレオチド含有鎖の切断を阻止する、その認識配列を必要とする、制限エンドヌクレアーゼ(RE)と違って、NEは、代表的に、ネイティブなヌクレオチドのみを含むヌクレオチド配列を認識し、そしてこのヌクレオチド配列を含む完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子の一方の鎖のみを切断する。
【0047】
本明細書中で使用される場合、「ネイティブなヌクレオチド」は、アデニル酸、グアニル酸、シチジル酸、チミジル酸またはウリジル酸をいう。「誘導体化されたヌクレオチド」は、ネイティブなヌクレオチドではないヌクレオチドをいう。
【0048】
NAが認識する完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子のヌクレオチド配列は、「ニック形成剤認識配列」(NARS)といわれる。同様に、NEが認識する完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子のヌクレオチド配列は、「ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列」(NERS)といわれる。REが認識する特定の配列は、「制限エンドヌクレアーゼ認識配列」(RERS)といわれる。本明細書中で使用される場合、「半改変されたRERS」は、認識配列の一方の鎖が、少なくとも1つの誘導体化されたヌクレオチド(例えば、α−チオデオキシヌクレオチド)を含み、これは、RERSを認識するREによるその鎖(すなわち、認識配列内に誘導体化されたヌクレオチドを含む鎖)の切断を阻止する二本鎖RERSをいう。
【0049】
特定の実施形態において、NARSは、配列の一方の鎖の各ヌクレオチドが、もう一方の鎖の対応する位置のヌクレオチドに対して相補的である二本鎖ヌクレオチド配列である。このような実施形態において、NARSを認識するNAによってニック形成可能なNSを含む鎖におけるNARSの配列は、「NARSのセンス鎖の配列」または「二本鎖NARSのセンス鎖の配列」といわれ、一方、NSを含まない鎖におけるNARS配列は、「NARSのアンチセンス鎖の配列」または「二本鎖NARSのアンチセンス鎖の配列」といわれる。
【0050】
同様に、NERSが、一方の鎖がもう一方の鎖に厳密に相補的である二本鎖ヌクレオチド配列である実施形態において、NERSを認識するNEによってニック形成可能なNSを含む鎖に位置するNERSの配列は、「NERSのセンス鎖の配列」または「二本鎖NERSのセンス鎖の配列」といわれ、一方、NSを含まない鎖に位置するNERSの配列は、「NERSのアンチセンス鎖の配列」または「二本鎖NERSのアンチセンス鎖の配列」といわれる。例えば、例示的なニック形成エンドヌクレアーゼ(N.BstNB I)の認識配列およびニック形成部位は、以下に示され、切断部位を示すために「黒逆三角形」を用い、そして任意のヌクレオチドを示すためにNを用いる:
【0051】
【化1】
【0052】
N.BstNB I認識配列のセンス鎖の配列は、5’−GAGTC−3’であるのに対して、アンチセンス鎖の配列は、5’−GACTC−3’である。
【0053】
同様に、半改変されたRERSを認識するREによってニック形成可能なNSを含む鎖(すなわち、いずれの誘導体化されたヌクレオチドも含まない鎖)に位置する半改変されたRERSの配列は、「半改変されたRERSのセンス鎖の配列」といわれ、半改変されたRERSを含む核酸の「半改変されたRERSのセンス鎖」に位置し、一方、NSを含まない鎖(すなわち、誘導体化されたヌクレオチドを含む鎖)における半改変されたRERSの配列は、「半改変されたRERSのアンチセンス鎖の配列」といわれ、半改変されたRERSを含む核酸の「半改変されたRERSのアンチセンス鎖」に位置する。
【0054】
特定の他の実施形態において、NARSは、1つ以上のヌクレオチドミスマッチを有する最大限に部分的に二本鎖のヌクレオチド配列であるが、上記されるような二本鎖のNARSのインタクトなセンス配列を含む。本明細書中で使用される慣例に従って、NARSを記載する文脈において、2つの核酸分子が、互いにアニールし、ハイブリダイズされた産物を形成し、このハイブリダイズされた産物がNARSを含み、そしてハイブリダイズされた産物のNARS内に少なくとも1つのミスマッチ塩基対が存在する場合、このNARSは、単に部分的に二本鎖であると考えられる。このようなNARSは、特定のニック形成剤(例えば、N.BstNB I)によって認識され得、このニック形成剤は、これらのニック形成活性に対して二本鎖認識配列の一方の鎖のみを必要とする。例えば、N.BstNB IのNARSは、特定の実施形態において、以下のようなインタクトなセンス鎖を含み得:
5’−GAGTC−3’
3’−NNNNN−5’
ここで、Nは、任意のヌクレオチドを示し、1つの位置のNは、他の位置のNと同一であってもそうでなくてもよいが、この認識配列の中に少なくとも1つのミスマッチ塩基対が存在する。この状況において、NARSは、少なくとも1つのミスマッチヌクレオチドを有するとして特徴付けられる。
【0055】
特定の他の実施形態において、NARSは、1つ以上の一致していないヌクレオチドを有する部分的または完全に一本鎖のヌクレオチド配列であるが、上記されるように、二本鎖NARSのインタクトなセンス鎖を含む。本明細書中で使用される慣例に従って、NARSを記載する文脈において、2つの核酸分子(すなわち、第1および第2の鎖)が、互いにアニールし、ハイブリダイズされた産物を形成し、このハイブリダイズされた産物が、NAによって認識される第1の鎖内のヌクレオチド配列を含み(すなわち、ハイブリダイズされた産物は、NARSを含む)、そしてNAによって認識される配列中の少なくとも1つのヌクレオチドが、ハイブリダイズされた産物が形成される場合に、第2の鎖中のヌクレオチドに対応しない(すなわち、それと向かい合わない)場合、このハイブリダイズされた産物のNARS内に少なくとも1つの一致しないヌクレオチドが存在し、そしてこのNARSが部分的または完全に一本鎖であると考えられる。このようなNARSは、特定のニック形成剤(例えば、N.BstNB I)によって認識され得、このニック形成剤は、これらのニック形成活性のために、二本鎖認識配列の一方の鎖のみを必要とする。例えば、N.BstNB IのNARSは、特定の実施形態において、以下のようなインタクトなセンス鎖を含み得:
5’−GAGTC−3’
3’−N0−4−5’
(ここで、「N」は、任意のヌクレオチドを示し、0−4は、ヌクレオチド「N」の数を示し、1つの位置での「N」は、別の位置での「N」と同じであってもそうでなくてもよい)、この鎖は、N.BstNB Iの二本鎖認識配列のセンス鎖の配列を含む。この例において、相補鎖中の対応するヌクレオチドが存在しないという点において、G、A、G、TまたはCの少なくとも1つは、一致しない。この状況は、例えば、ハイブリダイズされた産物中に「ループ」が存在し、特に、センス配列がループ内に完全にまたは部分的に存在する場合、生じる。
【0056】
本明細書中に使用される場合、句「核酸分子を増幅すること」または「核酸分子の増幅」は、特定の核酸分子の2つ以上のコピーを作製することをいう。「核酸分子を指数関数的に増幅すること」または「核酸分子の指数関数的増幅」は、2つ以上の核酸増幅反応を含むタンデムな増幅系による、特定の核酸分子の増幅をいう。このような系において、第1の増幅反応からの増幅産物は、第2の核酸増幅反応のための、開始増幅プライマーとして機能する。本明細書中で使用される場合、用語「核酸増幅反応」は、核酸分子(T)を使用して、核酸分子(A)の1つより多くのコピーを作製するためのプロセスをいい、この核酸分子(T)は、テンプレートとして核酸分子Aの配列に相補的な配列を含む。本発明に従って、第1および第2の核酸増幅反応の両方は、ニック形成反応およびプライマー伸長反応を使用する。
【0057】
本明細書中で使用される場合、「開始プライマー」は、テンプレート核酸にアニールするプライマーであり、核酸増幅反応を開始する。開始プライマーは、開始プライマー伸長のためのプライマーとして機能しなければならないが、任意の続いてのプライマー伸長のためのプライマーである必要はない。例えば、プライマーA1がテンプレート核酸T1の一部にアニールし、このテンプレート核酸T1が、NARSのセンス鎖に対して3’側の位置で、NARSのセンス鎖の配列を含むと仮定のこと。DNAポリメラーゼの存在下において、A1の3’末端は、二本鎖NARSを含む、二本鎖の核酸分子または部分的に二本鎖の核酸分子(H1)を産生するためのテンプレートとしてT1を使用して伸長される。NARSを認識するNAの存在下において、H1は、開始プライマーA1に相補的な鎖においてニック形成される。ニック形成部位に3’末端を含み、開始プライマーA1を含まない鎖は、NAおよびDNAポリメラーゼの存在下において、続いてのプライマー伸長のためのプライマーとして機能し得る。A1は、開始プライマーとみなされるが、第1のプライマー伸長に対してのみプライマーとして機能するが、続いてのプライマー伸長に対しては、プライマーとして機能しない。
【0058】
「トリガーオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)」は、タンデム核酸増幅系の第1の核酸増幅反応におけるプライマーとして機能するODNPである。これは、この系の他の必要とされる成分(例えば、DNAポリメラーゼ、NA、デオキシヌクレオシド三リン酸、第1の増幅反応のためのテンプレート(T1)、および第2の増幅反応のためのテンプレート(T2))の存在下で、核酸分子の指数関数的増幅を誘発する。特定の実施形態において、第1の増幅反応のためのテンプレート(T1)がNARSの一方の鎖の配列を含む場合、トリガーODNPは、NARSの他方の鎖の配列を含み得る。トリガーODNPは、標的核酸由来であり得るか、または化学的に合成され得る。
【0059】
第1の核酸が、第2の核酸の消化産物または第2の核酸分子もしくはテンプレートとしてその相補物の一部を使用した増幅産物のいずれかである場合、第1の核酸分子(「第1の核酸」)が、別の核酸分子(「第2の核酸」)「に由来する」かまたは別の核酸分子(「第2の核酸」)「から生じる」。第1の核酸分子は、第2核酸の少なくとも一部と厳密に同一である配列または厳密に相補的である配列を含まなければならない。
【0060】
第1の配列の相補物が、所定の反応混合物(例えば、核酸増幅混合物)中の第2の配列にアニールし得る場合、第1の核酸配列は、第2の核酸配列に「少なくとも実質的に同一」である。特定の好ましい実施形態において、第1の配列は、第2の配列に「厳密に同一」であり、つまり、各位置での第1の配列のヌクレオチドは、同じ位置での第2の配列のヌクレオチドと同一であり、第1の配列は、第2の配列と同じ長さである。
【0061】
第1の配列が、所定の反応混合物(例えば、核酸増幅混合物)中の第2の配列にアニールし得る場合、第1の核酸配列は、第2の核酸配列と「少なくとも実質的に相補的」である。特定の好ましい実施形態において、第1の配列は、第2の配列に「厳密にまたは完全に相補的」であり、つまり、第1の配列の各ヌクレオチドは、その対応する位置で第2の配列のヌクレオチドと相補的であり、第1の配列は、第2の配列と同じ長さである。
【0062】
本明細書中で用いられる場合、2本鎖核酸の他方の鎖(「第2鎖」のことをいう)中の別の位置(例えば、規定された位置)「に対応する」位置に位置する2本鎖核酸の一方の鎖(「第1鎖」のことをいう)中のヌクレオチドは、第2鎖中の対応する位置のヌクレオチドに相補的な第1鎖中のヌクレオチドのことをいう。同様に、2本鎖核酸の他方の鎖(「第2鎖」のことをいう)内のニック形成部位に対応する2本鎖核酸の一方の鎖(「第1鎖」のことをいう)中の位置は、第2鎖中の2つのヌクレオチドに相補的な(この間にニック形成が生じる)第1鎖中の2つのヌクレオチド間の位置のことをいう。
【0063】
核酸配列(または領域)は、この核酸配列が、他の核酸配列に対して5’側に配置される場合、その別の核酸配列(または領域)に対して「上流」にある。核酸配列(または領域)は、この核酸配列が、他の核酸配列に対して3’側に配置される場合、その別の核酸配列(または領域)に対して「下流」にある。
【0064】
(A.核酸の指数関数的増幅のための方法および組成物)
本発明は、ニック形成エンドヌクレアーゼを使用する、核酸の指数関数的増幅のための方法および組成物を提供する。最初に、以下の節は、この方法の一般的説明を提供し、続いて、2つの型の核酸増幅、および核酸増幅のための組成物またはキットの説明を提供する。
【0065】
(1.一般的説明)
1つの局面において、本発明は、核酸の指数関数的増幅のための単純かつ迅速な方法を提供する。これは、ニック形成剤(NA)およびDNAポリメラーゼの組合せによって触媒される、2つ以上の連結された増幅反応(すなわち、タンデム増幅系)を使用する。各増幅反応は、NAが、NAの認識配列を含む二本鎖の核酸分子または部分的に二本鎖の核酸分子にニック形成する能力、およびDNAポリメラーゼが、NAのニック形成部位(NS)において3’末端から伸長する能力に基づく。
【0066】
第1の増幅反応(図1)において、トリガーODNPは、NARSの一方の鎖の配列(「第1のNARS」と呼ばれる)を含む第1のテンプレート核酸(T1)にハイブリダイズして、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子(「第1の増幅反応の開始核酸分子(N1)」)を形成する。トリガーODNPは、第1のNARSの他方の鎖を含まず、T1中の第1のNARSの鎖の3’側に配置されるT1の一部にハイブリダイズするか、または第1のNARSの他方の鎖を含み、その結果、T1へのそのハイブリダイゼーションが、二本鎖の第1のNARSを含む核酸分子を形成するかのいずれかである。5’末端においてT1の一部が、N1における5’突出部を形成する場合、DNAポリメラーゼ(「第1のDNAポリメラーゼ」と呼ばれる)の存在下で、トリガーODNPは、テンプレートとしてT1を使用して、伸長されて、二本鎖の第1のNARSを含むハイブリッド(H1)を形成する(図1の工程(a))。得られるH1は、第1のNARSを認識するNAによってニック形成され得、ニック形成部位において3’末端および5’末端を作製する(工程(b))。ニック形成部位において5’末端を含むフラグメント(「A1」と呼ばれる)が十分に短い(例えば、18ヌクレオチド長未満)場合、そのフラグメントは、解離的反応条件下(例えば、60℃)でH1の他の部分から解離する。しかし、このフラグメント(すなわち、A1)が容易に解離しない場合、これは、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損であり、そして鎖置換活性を有する第1のDNAポリメラーゼの存在下で、NSにおいて残りのフラグメントのその3’末端からの伸長により、置換され得る(工程(d))。鎖置換はまた、鎖置換促進剤が存在する場合、第1のDNAポリメラーゼにおける鎖置換活性の非存在下で生じ得る。このような伸長は、第1のNAにおけるように、再びニック形成(「再ニック形成」)され得る第1のNAについての新たなNSを再び作製する。新たなNSにおいて5’末端を含むフラグメント(すなわち、新たなA1)が、再び、H1の他の部分から容易に解離し得るか、またはNSにおいて3’末端からの伸長によって置換され得る(工程(f))。ニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返され得(工程(g))、核酸フラグメントA1の直線的な蓄積/増幅を生じる。
【0067】
核酸分子の指数関数的増幅は、この第1増幅反応から増幅されたフラグメントA1を介して、上記の第1増幅反応と第2増幅反応とを合わせるかまたは結び付けることによって行われ得る。第2増幅反応(図2)では、A1は、第2NARSのセンス鎖の配列を含む、別の1本鎖核酸分子(T2)の一部分へとハイブリダイズする。得られる部分的に2本鎖の核酸分子は、「第2増幅反応の開始核酸分子(N2)」といわれる。T2のうちの、A1がハイブリダイズする部分は、第2NARSのセンス鎖の配列の3’側に位置し、その結果、A1は、T2をテンプレートとして用いたプライマー伸長反応についての開始プライマーとして機能する。A1からの伸長は、2本鎖の第2NARSを含むハイブリッド(H2)を生成する(図2の工程(a))。第2NARSを認識する第2NAの存在下では、H2がニック形成され、このニック形成部位にて3’末端および5’末端を生成する(工程(b))。このニック形成部位にて5’末端を含むフラグメントが充分に短い(例えば、18ヌクレオチド長未満)である場合、これは、特定の反応条件(例えば、60℃にて)下で、H2の他方の部分から解離し得る。しかし、このフラグメントがH2の他方の部分から容易に解離されない場合、これは、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損であって、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ(「第2DNAポリメラーゼ」という)の存在下で、このNSにて3’末端を有するフラグメントの伸長によって置換され得る(工程(c))。鎖置換はまた、この第2DNAポリメラーゼの鎖置換活性がなくとも、鎖置換促進因子の存在下で生じ得る。このような伸長は、第2NAによって再度ニック形成され得る(「再ニック形成され得る」)、第2NAについての新たなNSを再度作製する(工程(d))。この新たなNSにて5’末端を含むフラグメント(「A2という」)は、H2の他方の部分から再度容易に解離し得るか、またはこのNSにおける3’末端から伸長によって置換され得る(工程(e))。このニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返され得(工程(f))、この核酸フラグメントA2の指数関数的な蓄積/増幅を生じる。この増幅された1本鎖核酸フラグメントA2は、A1と少なくとも実質的に相補的である。A2は、A1と同じ長さである場合、A1と完全に相補的であり得る。
【0068】
1つの局面において、本発明は、核酸分子(A2)を増幅する方法を提供する。この方法は、(a)一本鎖核酸分子(A1)を提供する工程;(b)5’から3’にむかって、(i)NARSのセンス鎖の配列、および(ii)A1に少なくとも実質的に相補的な配列を含む、第2の一本鎖核酸分子(T2)を提供する工程;ならびに(c)T2、A1、NARSを認識するニック形成剤、DNAポリメラーゼ、および1種以上のデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、A2を増幅する工程(ここで、A2は、A1に少なくとも実質的に相補的であり、A1、A2またはその両方は、25ヌクレオチド長以下である)を包含する。A1が提供され得る例示の手段は、本明細書中に記載される。
【0069】
本発明の指数関数的核酸増幅法は、T2がNARSのセンス鎖の配列を含むことを必要とするが、T1は、NARSのセンス鎖またはアンチセンス鎖の配列を含み得る。これらの2つの型の核酸増幅反応は、第1NARSおよび第2NARSの両方についての例としてN.BstNB Iの認識配列を使用して、図3および4に例示される。しかし、当業者は、T1およびT2が、他のニック形成剤の認識配列を含みうることを理解する。
【0070】
本発明に従う核酸増幅の第1型は、T1が第1NARSのアンチセンス鎖の配列を含む場合である。図3に示されるように、第1増幅反応について、開始核酸分子N1は、トリガーODNPと、3つの領域(領域X1、Y1、およびZ1)を有するT1とをアニーリングすることによって形成される、部分的に二本鎖の核酸分子である。領域X1、Y1、およびZ1は、それぞれ、N.BstNB I認識配列のアンチセンス鎖の配列のすぐ3’側の領域、N.BstNB Iの認識配列のアンチセンス鎖の配列の3’末端からトリガーODNPの伸長産物中のN.BstNB Iのニック形成部位の3’末端ヌクレオチドに対応するヌクレオチドまでの領域(すなわち、3’−CACAGNNNN−5’(ここで、Nは、A、T、G、またはCであり得る))、および領域Y1のすぐ5’側の領域として規定される。トリガーODNPは、領域X1に少なくとも実質的に相補的であり、DNAポリメラーゼの存在下で核酸伸長のためのプライマーとして機能する。その伸長産物(H1)は、トリガーODNPの5’末端配列が、領域X1の3’末端配列にアニールするか否かに依存して、完全に二本鎖または部分的に二本鎖であり得る。H1は、二本鎖N.BstNB I認識配列を含むので、N.BstNB Iによりニック形成され得る。特定の実施形態において、T1の3’末端は、例えば、リン酸基によりブロックされ、その結果、この末端からの伸長が防止される。トリガーODNPの配列を含むニック形成産物は、DNAポリメラーゼによって、ニック形成部位で、その3’末端から再度伸長され得、ニック形成部位で、N.BstNB Iによって生成される5’末端を含む鎖を置換する。ニック形成−伸長サイクルは、複数回反復され、置換された鎖(A1)が蓄積される。
【0071】
次いで、第1増幅反応の産物A1は、第2増幅反応のための開始プライマーとして使用される。T2の領域X2(これはまた、さらなる2つの領域(領域Y2およびZ2)を含む)にアニーリングされ、第2増幅反応のための開始核酸分子N2が形成される。領域Y2は、N.BstNB Iの認識配列のセンス鎖の配列およびその配列のすぐ3’側の4つのヌクレオチド(すなわち、3’−NNNNCTGAG−5’(ここで、Nの各々は、A、T、GまたはCであり得る)からなる)のに対し、領域X2およびZ2は、それぞれ、領域Y2の3’末端および5’末端にすぐ隣接する領域をいう。T2をテンプレートとして用いるA1の伸長により、A1の5’末端配列が、領域X2の3’末端配列にアニーリングするか否か依存して、完全な二本鎖または部分的に二本鎖であり得るの伸長産物(H2)が提供される。H2は、二本鎖N.BstNB I認識配列を含むので、N.BstNB Iの存在下でニック形成され得る。ニック形成部位の得られる3’末端は、DNAポリメラーゼによって、再度伸長され得、領域X2を置換する。ニック形成−伸長サイクルは、複数回反復され、ニック形成部位にて5’末端を含む、置換された鎖A2が蓄積/増幅される。A2は、A1の5’末端配列が、領域X2の3’末端配列にアニールする場合に領域X2と正確に同一である。さもなければ、A2および領域X2は、それらが異なる長さを有する場合、互いに実質的に相補的である。A2の増幅は、親数関数的である。なぜならば、それは、2つの関連した線形増幅反応の最終増幅産物であるからである。
【0072】
本発明に従う第2型の核酸増幅は、T1が第1NARSのセンス鎖配列を含む場合である。好ましくは、この第1NARSは、第2NARSに同一である。センス鎖配列の配列がT1およびT2の両方中に存在する例示的NAとして、N.BstNB Iを使用して、この型の核酸増幅を、図4に例示する。
【0073】
図4に示されるように、第1増幅反応について、開始核酸分子N1は、トリガーODNPを、3つの領域(領域X1、領域Y1および領域Z1)を有するT1とアニーリングすることによって形成される、部分的に2本鎖の核酸分子である。領域X1、領域Y1および領域Z1は、それぞれ、N.BstNB IによるN1の伸長産物(すなわちH1)のニック形成部位の直ぐ3’側の領域、ニック形成部位からN.BstNB Iの認識配列のセンス鎖配列の5’末端までの領域(すなわち、5’−GAGTCNNNN−3’(ここで、NはA、T、GまたはCであり得る))、および領域Y2の直ぐ5’側の領域として規定される。このトリガーODNPは、領域X1またはその一部に少なくとも実質的に相補的であり、そしてDNAポリメラーゼの存在下で核酸伸長のためのプライマーとして機能する。この伸長産物(H1)は、トリガーODNPの5’末端配列が、領域X1の3’末端配列にアニーリングするか否かに依存して、完全に二本鎖のまたは部分的に2本鎖であり得る。H1は、2本鎖のN.BstNB I認識配列を含むので、これは、N.BstNB Iによってニック形成され得る。特定の実施形態において、T1の3’末端は、この末端からの伸長を妨げるように、例えば、リン酸基でブロックされる。N.BstNB Iの認識配列のセンス鎖の配列を含むニック形成産物は、DNAポリメラーゼによって、ニック形成部位でのその3’末端から再度伸長されて、ニック形成部位で、N.BstNB Iによって生成される5’末端を含む鎖を置換し得る。このニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返されて、ニック形成部位の5’末端を含む、置換された鎖A1の蓄積を生じる。
【0074】
次いで、第1増幅反応の産物A1は、第2増幅反応のための開始プライマーとして使用される。これは、T2の領域X2(これは、2つのさらなる領域、すなわち領域Y2および領域Z2を含む)にアニーリングされて、第2増幅反応のための開始核酸分子N2を形成する。領域Y2は、領域Y1に類似しており、N.BstNB Iの認識配列のセンス鎖配列、およびN.BstNB Iの認識配列のセンス鎖配列の直ぐ3’側に位置する4つのヌクレオチド(すなわち、5’−GAGTCNNNN−3’(ここで、NはA、T、GまたはCであり得る))を有する。領域X2および領域Z2は、それぞれ、領域Y2の3’末端および5’末端の直ぐ隣の領域をいう。テンプレートとしてT2を使用するA1の伸長は、A1の5’末端配列が領域X2の3’末端配列にアニーリングするかどうかに依存して、完全に2本鎖または部分的に2本鎖であり得る伸長産物(H2)を提供する。H2は、2本鎖N.BstNB I認識配列を含むので、これはN.BstNB Iによってニック形成され得る。ニック形成部位での得られた3’末端は、DNAポリメラーゼによって再度伸長されて、領域X2を置換し得る。このニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返されて、ニック形成部位の5’末端を含む、置換された鎖A2の蓄積/増幅を生じる。A2のこの増幅は、指数関数的である。なぜなら、これは2つの関連した線形増幅反応の最終増幅産物であるからである。
【0075】
本発明の方法は、2つの核酸増幅反応を一緒に関連づけることに制限されない。特定の実施形態では、第2増幅反応は、第3増幅反応とさらに結び付けられ得る。言い換えれば、この第2増幅反応の間に増幅された核酸分子A2は、NARS(「第3NARS」という)の1つの鎖の配列を含む別の核酸分子「T3」の一部分へとアニーリングして、第3増幅反応における核酸分子「A3」の増幅を誘発し得る。さらなる増幅反応が、この鎖に付加され得る。例えば、A3は次いで、NARS(「第4NARS」という)の1つの鎖をまた含む別の核酸分子「T4」の一部分へとアニーリングして、第4増幅反応において、核酸分子「A4」の増幅を開始し得る。その後の各増幅反応は、その以前の増幅反応からの増幅フラグメントの線形増幅をもたらすので、この系の他の成分(例えば、テンプレート核酸分子、NA、およびDNAポリメラーゼ)が増幅速度もレベルも制限しなければ、増幅系における増幅反応の数が多いほど、増幅レベルが高い。
【0076】
(a.ニック形成剤)
上記のとおり、本発明の指数関数的核酸増幅方法は、2以上の核酸増幅反応を一緒に結び付け、そして各増幅反応は、NAの存在下で行われる。1つの増幅反応についてのNAは、別の増幅反応についてのNAと異なり得る。1つの実施形態では、異なる増幅反応についてのNAは、互いに同一であり、その結果、たった1つのNAが核酸分子の指数関数的増幅に必要とされる。別の実施形態では、2つの異なるNA(例えば、異なるNARSを認識する2つのNA)が用いられる。
【0077】
特定のヌクレオチド配列を認識し、そしてこの配列を含む完全または部分的に2本鎖の核酸の1つの鎖のみを切断する任意の酵素が、本発明においてニック形成剤として使用され得る。このような酵素は、ネイティブなヌクレオチドから構成される特定の配列を認識するNE、または半改変認識配列を認識するREであり得る。
【0078】
ニック形成エンドヌクレアーゼは、その認識配列と重なるニック形成部位を有しても有さなくてもよい。その認識配列の外側にニックを形成する例示的なNEは、N.BstNB Iであり、これは、5’−GAGTC−3’から構成される独特の核酸配列を認識するが、この認識配列の3’末端を4ヌクレオチド超えたところにニック形成する。N.BstNB Iの認識配列およびニック形成部位を、以下:
【0079】
【化2】
【0080】
によって示し、ここで、「下向き黒三角」は、は、切断部位を示し、文字Nは、任意のヌクレオチドを示す。N.BstNB Iは、米国特許第6,191,267号に記載されるようにして、調製および単離され得る。このニック形成エンドヌクレアーゼを使用するための緩衝液および条件はまた、この’267特許に記載される。その認識配列の外側にニック形成するさらなる例示的なNEは、N.AlwIであり、これは、以下の2本鎖認識配列を認識する:
【0081】
【化3】
【0082】
N.AlwIのニック形成部位もまた、記号「下向き黒三角」により示される。両方のNEは、New England Biolabs(NEB)から入手可能である。N.AlwIはまた、Xuら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:12990−5,2001)に記載されるように、IIs型RE AlwIを変異させることによって、調製され得る。
【0083】
そのNERS内にニック形成する例示的なNEとしては、N.BbvCI−aおよびN.BbvCI−bが挙げられる。これら2つのNEおよびNSの認識配列(記号「下向き黒三角」で示す)を、以下に示す:
【0084】
【化4】
【0085】
両方のNEは、NEBから入手可能である。
【0086】
さらなる例示的なニック形成エンドヌクレアーゼとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:N.BstSE I(Abdurashitovら、Mol.Biol.(Mosk)30:1261−7,1996)、操作されたEcoR V(Stahlら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:6175−80,1996)、操作されたFok I(Kimら、Gene 203:43−49,1997)、Thermotoga maritima由来のエンドヌクレアーゼV(Huangら、Biochem.40:8738−48,2001)、Cvi Nickase(例えば、CviNY2A、CviNYSI、Megabase Research Products,Lincoln,Nebraska)(Zhangら、Virology 240:366−75,1998;Nelsonら、Biol.Chem.379:423−8,1998;Xiaら、Nucleic Acids Res.16:9477−87,1988)、および操作されたMly I(すなわち、N.Mly I)(BesnierおよびKong,EMBO Reports 2:782−6,2001)。さらなるNEは、他の制限エンドヌクレアーゼ、特に、IIs型制限エンドヌクレアーゼを、EcoR V、AlwI、Fok Iおよび/またはMly Iを操作するための方法と類似の方法を使用して操作することによって、得られ得る。
【0087】
ニック形成剤として有用なREは、その半改変された認識配列において2本鎖核酸にニック形成する任意のREであり得る。この半改変された2本鎖認識配列にニック形成する例示的なREとしては、Ava I、Bsl I、BsmA I、BsoB I、Bsr I、BstN I、BstO I、Fnu4H I、Hinc II、Hind IIおよびNci Iが挙げられるがこれらに限定されない。半改変された認識配列にニック形成するさらなるREは、米国特許第5,631,147号に記載される鎖保護アッセイによってスクリーニングされ得る。
【0088】
特定のニック形成剤は、少なくとも部分的に二本鎖の基質核酸中に、2本鎖認識配列のセンス鎖の存在のみを、ニック形成活性のために必要とする。例えば、N.BstNB Iは、一方の鎖に、1つ以上のヌクレオチドが、基質核酸の他方の鎖と従来の塩基対(例えば、G:C、A:T、またはA:U)を形成しない、その認識配列「5’−GAGTC−3’」のセンス鎖の配列を含む基質核酸のニック形成において活性である。N.BstNB Iのニック形成活性は、その認識配列のセンス鎖における、この基質核酸の他方の鎖中のいずれのヌクレオチドとも従来の塩基対を形成しないヌクレオチド数の増加に伴って低減する。
【0089】
特定の実施形態において、ニック形成剤は、DNA−RNA二重鎖におけるヌクレオチド配列を認識し得、この二重鎖の一方の鎖にニック形成する。特定の他の実施形態において、ニック形成剤は、2本鎖RNAにおけるヌクレオチド配列を認識し得、このRNAの一方の鎖にニック形成する。
【0090】
(b.DNAポリメラーゼ)
上記のように、本発明の指数関数的核酸増幅方法は、2以上の核酸増幅反応を一緒に結び付け、そして各増幅反応は、DNAポリメラーゼの存在下で行われる。1つの増幅反応についてのDNAポリメラーゼは、別の増幅反応についてのDNAポリメラーゼと異なり得る。1つの実施形態では、異なる増幅反応についてのDNAポリメラーゼは、互いに同一であり、その結果、ほんの1つのDNAポリメラーゼが、核酸分子の指数関数的増幅に必要とされる。
【0091】
本発明において有用なDNAポリメラーゼは、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損であるが鎖置換活性を有する任意のDNAポリメラーゼであり得る。このようなDNAポリメラーゼとしては、exo−Deep Vent、exo−Bst、exo−Pfu、およびexo−Bcaが挙げられるがこれらに限定されない。本発明において有用なさらなるDNAポリメラーゼは、スクリーニングされ得るか、または米国特許第5,631,147号(その全体が本明細書中に参考として援用される)に記載される方法によって作製され得る。鎖置換活性は、以下に記載されるような鎖置換促進因子の存在によってさらに増強され得る。
【0092】
あるいは、特定の実施形態において、鎖置換活性を有さないDNAポリメラーゼが、使用され得る。このようなDNAポリメラーゼとしては、exo−Vent、Taq、DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメント、T5 DNAポリメラーゼおよびPhi29 DNAポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、これらのDNAポリメラーゼの使用は、鎖置換促進因子の存在を必要とする。「鎖置換促進因子」は、DNAポリメラーゼに触媒される、ニック形成部位での3’末端からの核酸伸長の間の鎖置換を促進する任意の化合物または組成物である。本発明において有用な、例示的な鎖置換促進因子の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:BMRF1ポリメラーゼアクセサリーサブユニット(Tsurumiら、J.Virology 67:7648−53,1993)、アデノウイルスDNA結合タンパク質(Zijderveldおよびvan der Vliet、J.Virology 68:1158−64,1994)、単純ヘルペスウイルスタンパク質ICP8(BoehmerおよびLehman、J.Virology 67:711−5,1993;SkaliterおよびLehman、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10665−9,1994)、一本鎖DNA結合タンパク質(RiglerおよびRomano、J.Biol.Chem.270:8910−9,1995)、ファージT4遺伝子32タンパク質(VillemainおよびGiedroc、Biochemistry 35:14395−4404,1996)、ウシ胸腺ヘリカーゼ(Siegelら、J.Biol.Chem.267:13629−35,1992)およびトレハロース。1つの実施形態では、トレハロースが、増幅反応混合物中に存在する。
【0093】
本発明において有用な、さらなる例示的なDNAポリメラーゼとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ファージM2 DNAポリメラーゼ(Matsumotoら、Gene 84:247,1989)、ファージPhiPRD1 DNAポリメラーゼ(Jungら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:8287,1987)、T5 DNAポリメラーゼ(Chatterjeeら、Gene 97:13−19,1991)、Sequenase(U.S.Biochemicals)、PRD1 DNAポリメラーゼ(ZhuおよびIto、Biochim.Biophys.Acta.1219:267−76,1994)、9°Nm TMDNAポリメラーゼ(New England Biolabs)(Southworthら、Proc.Natl.Acad.Sci.93:5281−5,1996;Rodriquezら、J.Mol.Biol.302:447−62,2000)およびT4 DNAポリメラーゼホロ酵素(KaboordおよびBenkovic、Curr.Biol.5:149−57,1995)。
【0094】
あるいは、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼが使用され得る。例えば、このようなDNAポリメラーゼは、ニック形成の後にテンプレート核酸から自動的に解離する短い核酸フラグメントを増幅するために有用であり得る。
【0095】
ニック形成剤がRNA−DNA二重鎖のDNA鎖にニック形成する特定の実施形態において、RNA依存性DNAポリメラーゼが使用され得る。ニック形成剤がRNA−DNA二重鎖のRNA鎖にニック形成する他の実施形態において、DNAプライマーから伸長させるDNA依存性DNAポリメラーゼ(例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素(Promega))が使用され得る。両方の場合において、標的mRNAは、cDNAに逆転写される必要はなく、そして標的mRNAに対して少なくとも実質的に相補的であるテンプレート核酸分子と直接に混合され得る。
【0096】
(c.反応条件)
本発明の指数関数的核酸増幅法は、増幅を達成する際に各々がニック形成反応およびプライマー伸長反応を使用する2つ以上の核酸増幅反応と連結する。本発明の方法に従って、各増幅反応において、DNAポリメラーゼは、NAがテンプレート核酸と混合される前、混合された後、または混合されると同時に、核酸分子(例えば、テンプレート核酸分子)と混合され得る。好ましくは、ニック形成−伸長反応緩衝液は、NAおよびDNAポリメラーゼの両方に適切であるように最適化される。例えば、N.BstNB IがNAであり、exo−VentがDNAポリメラーゼである場合、ニック形成−伸長緩衝液は、0.5×N.BstNB I緩衝液および1×DNAポリメラーゼ緩衝液であり得る。例示的な1×N.BstNB I緩衝液は、10mM Tris−HCl、10mM MgCl2、150mM KCl、および1mM ジチオスレイトール(25℃にてpH7.5)であり得る。例示的な1×DNAポリメラーゼ緩衝液は、10mM KCl、20mM Tris−HCl(25℃にてpH8.8)、10mM (NH4)2SO4、2mM MgSO4、および0.1% Triton X−100であり得る。当業者は、NAおよびDNAポリメラーゼのための反応緩衝液を容易に見いだし得る。
【0097】
さらに、DNAポリメラーゼが解離性である(すなわち、このDNAポリメラーゼは、Vent DNAポリメラーゼのようなテンプレート核酸から比較的解離しやすい)特定の実施形態において、反応混合物中のNA 対 DNAポリメラーゼの比はまた、全長核酸分子の最大増幅のために最適化され得る。本明細書中で使用される場合、「全長」核酸分子とは、そのテンプレートの5’末端配列に相補的な配列を含む、増幅された核酸分子をいう。言い換えると、全長核酸分子は、完全な遺伝子伸長反応の増幅産物である。NAの量が、DNAポリメラーゼの量に対して過剰である反応混合物において、部分的な増幅産物が、生成され得る。部分的増幅産物の生成は、NAによる、部分的に増幅した核酸分子の過剰なニック形成およびその後のこれらの分子のテンプレートからの解離に起因し得る。このような解離は、その部分的に増幅した核酸分子がさらに伸長しないようにする。
【0098】
異なるNAまたは異なるDNAポリメラーゼは、異なるニック形成活性またはプライマー伸長活性を有し得るので、全長核酸分子の最大の増幅に最適な、特定のNA 対 特異的な解離性DNAポリメラーゼの比は、特定のNAおよびDNAポリメラーゼの同一性に依存して変化する。しかし、特定のNAと特異的なDNAポリメラーゼとの所定の組み合わせについて、その比は、異なるNA 対 DNAポリメラーゼ比を有する反応混合物中で指数関数的な核酸増幅反応を行い、当該分野で公知の技術を使用して(例えば、液体クロマトグラフィーまたは質量分析法により)その増幅産物を特徴付けることにより最適化され得る。全長核酸分子の最大の産生を可能にする比は、将来的な増幅反応において使用され得る。
【0099】
核酸分子の部分的な増幅は、第1の増幅反応および第2の増幅反応の両方の間で起こり得るが、第1の増幅反応の間の部分的な増幅は、通常、全核酸増幅レベルまたは速度に有意には影響しないことは、注目すべきである。第1の増幅反応の間に増幅された核酸分子は、第2の増幅反応のための開始増幅プライマーとして使用されるので、これらの核酸分子は、これらのテンプレートに特異的にアニーリングさせるのに十分長い場合、これらの意図される使用のために十分である。全長核酸増幅のための、NA 対 解離性DNAポリメラーゼとの最適比を使用することを除いて、代替的に、増幅反応が、ある期間の間進行し、各々の遺伝子伸長反応をその完了まで進行させた後、部分的増幅産物量は、NAを不活性化することによって排除され得るかまたは低減され得るが、DNAポリメラーゼはそうなり得ない(例えば、熱不活性化)。
【0100】
特定の好ましい実施形態において、本発明のニック形成反応および伸長反応は、等温条件下で行われる。本明細書中で使用される場合、「等温的に」および「等温条件」とは、増幅過程の間、反応の温度が本質的に一定に保持された(すなわち、同じ温度であるか、または上限温度と下限温度との間の差異が20℃以下の同じ狭い温度範囲内である)反応条件のセットをいう。本発明の増幅方法の利点は、上限温度と下限温度との間で温度をサイクルさせる必要がないことである。ニック形成反応および伸長反応の両方が、同じ温度にて、または同じ狭い温度範囲内で行われる。温度を維持するために使用される装置が、反応混合物の温度を少ない程度で変動させることが可能である場合、このような変動は、増幅反応に不利益ではない。等温増幅のための例示的な温度としては、50℃〜70℃の間の任意の温度、または50℃〜70℃、55℃〜70℃、60℃〜70℃、65℃〜70℃、50℃〜55℃、50℃〜60℃、もしくは50℃〜65℃の間の温度範囲が挙げられるが、これらに限定されない。多くのNAおよびDNAポリメラーゼは、上記の例示的温度にてまたは上記の例示的な温度範囲内で活性である。例えば、N.BstNB I(New England Biolabs)を用いるニック形成反応およびexo− Bstポリメラーゼ(BioRad)を用いる伸長反応の両方は、約55℃にて行われ得る。約50℃〜70℃の間で活性な他のポリメラーゼとしては、exo− Vent(New England Biolabs)、exo− Deep Vent(New England Biolabs)、exo−Pfu(Strategene)、exo−Bca(Panvera)およびSequencing Grade Taq(Promega)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0101】
制限エンドヌクレアーゼが、ニック形成剤として使用される場合、改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸は、半改変(hemimodified)制限エンドヌクレアーゼ認識配列を生成するために必要である。制限エンドヌクレアーゼ認識配列中に改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む二本鎖核酸の一方の鎖の切断の阻害に寄与する任意の改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸が使用され得る。例示的な改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸としては、2’−デオキシシチジン5’−O−(1−チオ三リン酸)[すなわち、dCTP(.α.S)]、2’−デオキシグアノシン5’−O−(1−チオ三リン酸)、チミジン−5’−O−(1−チオ三リン酸)、2’−デオキシシチジン5’−O(1−チオ三リン酸)、2’−デオキシウリジン5’−三リン酸、5−メチルデオキシシチジン5’−三リン酸、および7−デアザ−2’−デオキシグアノシン5’−三リン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【0102】
(d.開始核酸(N1))
上に議論されるように、第1核酸増幅のための開始核酸(すなわち、N1)は、トリガーODNPをテンプレート核酸分子T1とアニーリングさせることによって提供され得る。トリガーODNPは、T1をテンプレートとして使用するプライマー伸長のためのプライマーとして機能するので、このトリガーODNPは、T1の一部と実質的に相補性でなければならず、そしてそこからプライマー伸長が生じる3’末端もまた有する。
【0103】
特定の実施形態において、トリガーODNPは、核酸分子に由来する。トリガーの3’末端は、当該分野で公知の種々の方法によって産生され得る。例えば、トリガーODNPの3’末端は、制限ヌクレアーゼ認識配列(RERS)を認識する制限エンドヌクレアーゼ(例えば、IIs型制限エンドヌクレアーゼ)を使用して、RERSを有する核酸フラグメントを消化することによって提供され得る。核酸フラグメント中のRERSは、天然に存在しても、RERSの1つの鎖を含むプライマーを使用することによって、フラグメント中に組込まれてもよい。あるいは、トリガーODNPの3’末端は、NARSを認識するNAで、NARSを有する核酸フラグメントにニック形成することによって産生され得る。NARSはまた、天然に存在しても、NARSの1つの鎖を含むプライマーを使用することによって、フラグメント中に組込まれてもよい。さらに、トリガーODNPの3’末端は、Szybalski(米国特許第4,935,357号)に従うオリゴヌクレオチド指向性切断によってかまたはMaxam−Gilbert(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:560−4,1977)に従う塩基特異性化学切断によって、作製され得る。特定の実施形態において、トリガーODNPの3’末端は、DNase Iまたは他の非特異的ヌクレアーゼで、核酸分子を切断することによってか、あるいは核酸分子を剪断することによって、作製され得る。切断生成物が、二本鎖核酸である状況において、トリガーODNPは、二本鎖核酸を変性することによって得られ得る。
【0104】
トリガーODNPが誘導される核酸分子は、天然に存在しても、合成であってもよい。この核酸分子は、RNAであってもDNAであってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。このような核酸分子としては、ゲノムDNA、cDNAまたはその誘導体(例えば、ランダムにプライムされた増幅産物または特異的にプライムされた増幅産物)が挙げられる。トリガーODNP自体は、一本鎖DNA分子または一本鎖RNA分子であり得る。トリガーODNPまたはトリガーODNPが誘導される核酸分子は、固体支持体に固定化されていても、固定されていなくてもよい。
【0105】
同様に、T1はまた、酵素的切断、化学的切断、または機械的切断による、別の核酸分子に由来し得る。酵素的切断は、例えば、核酸分子内の特異的配列を認識する制限エンドヌクレアーゼで、核酸分子を消化することによって達成され得る。あるいは、酵素的切断は、核酸分子内の特異的配列を認識するニック形成剤で、核酸分子にニック形成することによって、達成され得る。酵素的切断はまた、Szybalski(米国特許第4,935,357号)に従うオリゴヌクレオチド指向性切断でもあり得る。化学的切断および機械的切断は、核酸分子を切断するために適切な当該分野で公知の任意の方法(例えば、剪断)によって、達成され得る。切断生成物が二本鎖核酸分子である状況において、T1分子は、二本鎖核酸分子を変性することによって得られ得る。
【0106】
上記されるように、T1は、NARSの1つの鎖の配列を含む。NARSは、T1が誘導される核酸分子に存在し得る。あるいは、このNARSは、例えば、NARSの1つの鎖の配列を含むODNPを使用することによって、T1に組込まれ得る。
【0107】
トリガーONDPに類似して、T1分子は、種々の核酸分子から誘導され得る。これらの核酸分子は、天然に存在する核酸および合成核酸を含み、これらのいずれかは、二本鎖核酸分子であっても一本鎖核酸分子であってもよく、そしてDNA(例えば、ゲノムDNAおよびcDNA)であってもRNAであってもよい。
【0108】
特定の実施形態において、T1分子は、3’から5’まで以下を含むかまたは以下から本質的になる:せいぜい100ヌクレオチド長である第1配列;二本鎖ニック形成剤認識配列の1つの鎖の配列;およびせいぜい100ヌクレオチド長である第2配列。いくつかの実施形態において、T1分子は、せいぜい200、150、100、80、60、50、40、30、25、20、18,16、14、12、または10ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、第1の配列、第2の配列、またはその両方は、せいぜい100、80、60、50、40、30、25、20、18,16、14、12、10、9、8、7、6、5、または4ヌクレオチド長であり得る。
【0109】
(1)T1がニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そして(2)トリガーODNPがニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列に隣接するT1分子の一部分に相補的である特定の実施形態において、T1中のニック形成剤認識配列のセンス鎖内の1つ以上のヌクレオチドとトリガーODNP中の対応するヌクレオチドとの間にミスマッチが存在し得る。言い換えると、T1中のニック形成剤認識配列のセンス鎖内の1つ以上のヌクレオチドは、トリガーODNP内の任意のヌクレオチドと従来の塩基対を形成し得ない。特定のニック形成剤(例えば、N.BstNBI)は、これらの二本鎖認識配列のセンス鎖のみを含む基質にニック形成し得るので、T1にトリガーODNPをアニーリングすることによって形成される開始核酸(N1)は、T1分子中の認識配列のセンス鎖を認識するニック形成剤の存在下で、一本鎖核酸(A1)を増幅するためのテンプレートとして使用され得る。二本鎖ニック形成剤認識配列の、センス鎖の配列のみを含み、インタクトなアンチセンス鎖の配列を含まないテンプレート核酸を使用して一本鎖核酸を増幅するためのニック形成剤の使用についての詳細な記載は、「Amplification of Nucleic Acid Fragments Using Nicking Agents」と表題される、米国特許出願において提供される。
【0110】
トリガーODNP、T1、またはその両方が核酸分子から誘導される実施形態の代わりに、本発明はまた、トリガーODNP、T1、またはその両方が合成核酸分子である実施形態を含む。オリゴヌクレオチド合成のための当該分野で公知の任意の方法は、トリガーODNPおよび/またはT1を合成するために使用され得る。例えば、トリガーODNPおよび/またはT1は、米国特許第6,166,198号、同第6,043,353号、同第6,040,439号、および同第5,945,524号(参考として本明細書中にその全体が援用される)に開示される固相オリゴヌクレオチド合成方法によって合成され得る。簡単に言えば、固相オリゴヌクレオチド合成は、5’側がブロックされたヌクレオチドを樹脂に結合された発生期のオリゴヌクレオチドに連続的に連結し、続いてリン酸ジエステル結合を形成するために酸化および脱ブロック化することによって実施され得る。さらに、トリガーODNPおよび/またはT1は、特別に注文されるオリゴヌクレオチドを合成する企業から購入され得る。
【0111】
T1は、特定の実施形態において、固相支持体に固定化され得る。好ましくは、T1は、その5’末端によって固定化される。他の実施形態において、T1は、固相支持体に固定されなくてもよい。
【0112】
特定の実施形態において、第1増幅反応の開始核酸分子(すなわち、N1)は、トリガーODNPをテンプレート核酸分子T1とアニーリングさせること以外によって、提供され得る。例えば、N1は、二本鎖NARSを含む、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子であり得、このNARSは、任意の開始プライマー伸長反応(例えば、図1の工程(a))なしに、NARSを認識するNAによって容易にニック形成され得る(図1の工程(c))。このような場合において、N1分子の各鎖は、NARSの1つの鎖の配列を含む。従って、いずれかの鎖が、T1分子とみなされ、その相補鎖がトリガーODNPとみなされ得る。二本鎖N1分子は、例えば、NARSを含む核酸の消化産物であり得る。N1中のNARS配列は、別のヌクレオチド配列から生じるかまたはそれに由来するか、あるいは、NARSの1つの鎖の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーによってN1に組込まれるかまたはT1の化学合成の間にN1に組込まれ得る。
【0113】
N1は、二本鎖NARSまたはNARSの1つの鎖のみのいずれかを含む部分的に二本鎖の核酸分子であり得る。例えば、N1は、2つのNARSを含む核酸分子のニック形成産物であっても、NARSおよびRERSの両方を含む核酸分子のニック形成消化産物であってもよい。
【0114】
特定の実施形態において、N1は、固体支持体に固定化され得る。他の実施形態において、N1は、固体支持体に固定化され得ない。
【0115】
(e.T2分子)
T1と類似して、T2はまた、上記されるように他の核酸分子内において、酵素的切断、化学的切断または機械的切断によってか、またはテンプレートとして他の核酸分子を使用した核酸増幅によって、別の核酸分子から由来され得る。T2が由来する他の核酸分子は、天然に存在する核酸あるいは合成二本鎖核酸または合成一本鎖核酸、DNA(例えば、ゲノムDNAおよびcDNA)またはDNAであり得る。1つの実施形態において、T2は、化学的に合成される。
【0116】
上記されるように、T2は、NARSのセンス鎖の配列を含む。NARSは、T2が由来する核酸分子中に存在し得る。あるいは、NARSは、例えば、NARSの1つの鎖の配列を含むODNPを使用することによって、T2に組込まれ得る。
【0117】
増幅反応混合物中のT2分子の数は、代表的に、T1分子の数より多い。T1分子より多い数のT2分子に対する優先性は、T2分子がT1分子をテンプレートとして使用して増幅された一本鎖核酸分子(すなわち、A1)に対するアニーリングパートナーとして使用されるという事実に起因する。言い換えると、第1増幅反応の間、各T1分子は、テンプレートとして使用され、複数コピーのA1を産生する。従って、各々のT1分子について、好ましくは、複数のT2分子が、単一のT1分子をテンプレートとして使用して増幅された複数のA1分子に対するアニーリングパートナーを提供するために存在する。
【0118】
特定の実施形態において、T2分子は、3’から5’まで、以下を含むかまたは以下から本質的になる:せいぜい100ヌクレオチド長である第1配列;二本鎖ニック形成認識配列のセンス鎖の配列;およびせいぜい100ヌクレオチド長である第2配列。いくつかの実施形態において、T2分子は、ぜいぜい200、150、100、80、60、50、40、30、25、20、18、16、14、12、または10ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、第1の配列、第2の配列、またはその両方は、せいぜい100、80、60、50、40、30、25、20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、または4ヌクレオチド長であり得る。
【0119】
T2分子は、固相支持体に、好ましくは、その5’末端で固定化され得る。T2分子が結合される固相とプライマーの5’末端または3’末端との間にはリンカーが存在し得る。さらに、複数のT2分子は、単一の固相に固定化され、T2分子のアレイを生成し得る。複数のT2分子は、アレイの別個の位置で同一な配列を有し得る。あるいは、これらは、アレイの別個の位置で種々のA1分子に対して少なくとも実質的に相補的である異なる配列を有し得る。このようなアレイは、異なる配列を有する複数の一本鎖核酸分子を増幅するために使用され得る。特定の実施形態において、アレイの異なる位置で実施される増幅反応は、物理的に分離され(例えば、プレートのマイクロウェル中)、その結果、異なる位置での増幅産物は、互いに混合されず、ここに特徴付けされ得る。
【0120】
(2.核酸増幅のための核酸、組成物またはキット)
1つの局面において、本発明は、核酸の指数関数的な増幅のための組成物およびキットを提供する。このような組成物は、一般的に、上記される第1の型または第2の型の核酸増幅において機能するように設計された、第1の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子(N1またはH1)と第2の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子(N2またはH2)との組み合わせを含む。例えば、第1の型の核酸増幅について、組成物は、(1)一方の鎖が第1のNARSのアンチセンス鎖の配列を含む第1の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子(N1またはH1)、ならびに(2)5’から3’まで以下の(i)および(ii)を含む第2の核酸(N2またはH2)を含み得る:(i)第2のNARSのセンス鎖の配列、および(ii)第1の核酸分子における第1のNARSのアンチセンス鎖の配列に対して5’側に位置する配列に少なくとも実質的に同一である配列。第2の型の核酸増幅について、組成物は、(1)一方の鎖が第1のNARSのセンス鎖の配列を含む第1の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子(N1またはH1)、ならびに(2)一方の鎖が、5’から3’まで以下の(i)および(ii)を含む第2の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子(N2またはH2)を含み得る:(i)第2のNARSのセンス鎖の配列、および(ii)第1の核酸分子における第1のNARSのセンス鎖の配列に対して3’側に位置する配列に少なくとも実質的に相補的である配列。特定の実施形態において、両方の型の核酸増幅について、第1のNARSは、第2のNARSに対して同一である。
【0121】
本発明のキットは、上記の組成物のうちの1つを含み得る。あるいは、このキットは、上記の第1の型の核酸増幅または第2の型の核酸増幅のいずれかにおいて機能するように設計された一本鎖核酸分子T1およびT2の組合せを含み得る。例えば、第1の型の核酸増幅について、この組成物は、第1のNARSのアンチセンス鎖の配列を含むT1、ならびに5’から3’へと以下:(i)第2のNARSのセンス鎖の配列、および(ii)T1中の第1のNARSのアンチセンス鎖の配列の5’側に位置する配列に少なくとも実質的に同一である配列、を含むT2を含み得る。第2の型の核酸増幅について、この組成物は、第1のNARSのセンス鎖の配列を含むT1、ならびに5’から3’へと以下:(i)第2のNARSのセンス鎖の配列、および(ii)第1の核酸分子中の第1のNARSのセンス鎖の配列の3’側に位置する配列に少なくとも実質的に相補的である配列、を含むT2を含み得る。特定の実施形態では、両方の型の核酸増幅について、第1のNARSは、第2のNARSと同一である。
【0122】
上記の核酸分子に加えて、本発明のキット(または組成物)は、以下の構成要素のうちの少なくとも1つ、2つ、数個、または各々をさらに含み得る:(1)T1中のNARSの一方の鎖の配列の3’側のT1の配列に特異的にアニーリングし得るトリガーODNP;(2)NARS(その一方の鎖の配列が、T1、T2または両方に存在する)を認識するニック形成剤(例えば、NEまたはRE);(3)ニック形成剤(2)用の緩衝液;(4)プライマー伸長に有用なDNAポリメラーゼ;(5)DNAポリメラーゼ(4)用の緩衝液;(6)デオキシヌクレオシド三リン酸;(7)改変されたデオキシヌクレオシド三リン酸;(8)コントロールT1、T2および/またはトリガーODNP;ならびに(9)鎖置換促進因子(例えば、トレハロース)。多くの上記の構成要素の詳細な説明は、上記に提供される。
【0123】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、NAに特異的な緩衝液もDNAポリメラーゼに特異的な緩衝液も含まない。代りに、本発明の組成物は、ニック形成剤およびDNAポリメラーゼの両方に適切な緩衝液を含む。例えば、N.BstNB Iがニック形成剤であり、exo−VentがDNAポリメラーゼである場合、ニック形成−伸長緩衝液は、0.5×N.BstNB I緩衝液および1×exo−Vent緩衝液であり得る。
【0124】
本発明の組成物は、それらの構成要素を単純に混合することによってか、またはこの組成物の形成を生じる反応を実施することによって生成され得る。本発明のキットは、それらの構成要素のうちのいくつかを混合することによって調製され得るか、またはそれらの各々を個々の容器に保存する。
【0125】
(B.核酸増幅方法および組成物の診断用途)
本明細書中上記にて詳細に記載されるように、本発明は、核酸の指数関数的増幅のための方法および組成物を提供する。これらの方法および組成物は、広範な種々の適用における有用性を見出し得、ここで、核酸分子を迅速に増幅することが好適である。このような迅速な増幅は、診断適用において特に好適であり得る、例えば、生物学的サンプル中の病原体(例えば、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫)の存在を迅速に検出する場合に好適である。以下の節は、診断用途に具体的に適用可能な種々の例示的実施形態を記載する。
【0126】
(1.概要)
本発明は、生物学的サンプル中の標的核酸分子を検出するために有用である。この標的核酸としては、病原性生物に由来するか、それを起源とする核酸分子が挙げられる。サンプル中の標的核酸の存在または非存在に依存して、増幅産物は、標的核酸またはその部分をテンプレートとして使用するように設計された増幅系において、検出されても検出されなくても良い。標的核酸またはその部分は、第1の増幅反応におけるテンプレートとして使用されるために、まず、開始核酸分子(N1)中に組み込まれる。この開始核酸分子はまた、第1のNARSの少なくとも一方の鎖を含み、従って、DNAポリメラーゼおよび第1のNARSを認識するNAの存在下で、第1の増幅反応を誘発する。次いで、第1の増幅反応からの生成物(A1)は、別のテンプレート核酸分子(T2)にアニーリングする。T2は、第2のNARSのセンス鎖の配列を含み、従って、DNAポリメラーゼおよび第2のNARSを認識するNAの存在下で、第2の増幅反応を開始する。第1の増幅反応の生成物(A1)および/または第2の増幅反応の生成物(A2)の存在または非存在の決定は、生物学的サンプル中の標的核酸の存在または非存在を示す。
【0127】
(2.開始核酸分子(N1))
診断適用に有用な開始核酸分子は、種々のアプローチによって提供され得る。例えば、N1は、トリガーODNPをT1分子にアニーリングすることによって獲得され得、ここでトリガーODNPは、病原性生物を起源とする核酸分子に由来する(例えば、図5〜7および図13)。あるいは、N1は、病原性生物を起源とする二本鎖核酸分子に直接に由来し得る(例えば、図8)。N1はまた、適切なオリゴヌクレオチドプライマー対の使用によって調製され得る(例えば、図9〜11)。特定の実施形態において、N1は、標的核酸とハイブリダイズし得る突出部を有する部分的に二本鎖の核酸分子であり得る(例えば、図12)。診断適用に関連する、N1を提供するためのこれらおよび他の様式は、以下に記載される。
【0128】
(a.N1分子を提供するための第1の型の例示的方法)
トリガーODNPをT1分子にアニーリングすることによってN1が提供される本発明の特定の実施形態において、トリガーODNPは、病原性生物のDNA分子(例えば、ゲノムDNA分子)またはRNA分子(例えば、mRNA分子)のいずれかに由来し得る。病原性生物由来の核酸分子が、一本鎖である場合、それは、トリガーODNPとして直接使用され得る。あるいは、一本鎖核酸分子は、より短いフラグメントを生成するように切断され得、ここで、これらのフラグメントのうちの1つ以上が、トリガーODNPとして使用され得る。病原性生物由来の核酸分子が、二本鎖である場合、それは、変性され、そしてトリガーODNPとして直接使用され得るか、または変性された生成物は、複数のより短いフラグメントを提供するために切断され得、ここでこれらのフラグメントのうちの1つ以上が、トリガーODNPとして機能し得る。あるいは、それは、複数のより短い二本鎖フラグメントを得るためにまず切断され得、次いでこれらのより短いフラグメントは、1つ以上のトリガーODNPを提供するために変性される。
【0129】
上記のように、T1分子は、トリガーODNPに少なくとも実質的に相補的でなければならない。さらに、増幅反応混合物中のT1分子の数は、トリガーODNPへのアニーリングに対して、二本鎖核酸分子由来のトリガーODNPの相補鎖と効果的に競合するために、好ましくは、トリガーODNPの数より多い。
【0130】
N1分子を調製するための第1の型の方法の例は、図5に示される。この図に示されるように、二本鎖ゲノムDNAは、制限エンドヌクレアーゼによって、まず切断され得る。消化産物は、変性され得、そして消化産物のうちの1つの一方の鎖は、核酸増幅反応を開始するためのトリガーODNPとして使用され得る。
【0131】
(b.N1分子を提供するための第2の型の例示的方法)
トリガーODNPをT1分子にアニーリングすることによってN1が提供される本発明の特定の実施形態において、このトリガーODNPは、NARSのセンス鎖の配列を含む。トリガーODNPは、病原生生物を起源とする標的核酸(例えば、ゲノム核酸)に由来し得る。N1が、その認識配列の外側にニックを形成するニック形成エンドヌクレアーゼ(例えば、N.BstNB I)によって認識可能なNERSを含む特定の実施形態が、図6に例示される。この図によって例示されるように、NERSを含むゲノムDNAまたはそのフラグメントは、変性され、そしてゲノムDNAの一方の鎖またはその鎖のフラグメントは、T1分子にアニーリングする。このT1分子は、NERSのアンチセンス鎖の配列を含む、ゲノムDNAの他方の鎖の一部である。T1分子へのトリガーODNPのアニーリングは、増幅反応のための開始核酸分子N1を提供する。増幅反応混合物中のT1分子の数は、好ましくは、NERSのセンス鎖の配列を含むゲノムDNAまたはそのフラグメントの鎖の数よりも多い。
【0132】
上記のゲノムDNAは、特定の実施形態において、固体支持体に固定され得る。他の実施形態において、T1分子が固体支持体に固定され得る。
【0133】
トリガーODNPが、標的核酸に由来し、そしてNARSのセンス鎖の配列を含む、関連する実施形態において、T1分子は、その3’部分(すなわち、領域Xおよび領域Y)において(その5’部分(すなわち、領域Z)においてではなく)、トリガーODNPに少なくとも実質的に相補的であり得る(図7)。T1の3’部分は、NARSのアンチセンス鎖の配列を含み、その結果、T1のトリガーODNPへのアニーリングによって形成される開始核酸は、二本鎖NARSを含む。NARSを認識するNAの存在下において、N1分子は、ニック形成される。次いで、ニック形成部位の3’末端は、T1分子中のNARSのアンチセンス鎖の配列の5’の領域をテンプレートとして使用して伸長される。得られた増幅産物は、トリガーODNPの一部ではなく、NARSのアンチセンス鎖の配列の5’側に位置するT1の領域(すなわち、領域Z1)に相補的である一本鎖核酸分子である。
【0134】
(c.N1分子を提供するための第3の型の例示的方法)
本発明の特定の実施形態では、N1は、NARSおよびRERSの両方を含むゲノム核酸に直接由来する二本鎖核酸である。例示的なNARSとして、その認識配列の外側にニックを形成するニック形成エンドヌクレアーゼ(例えば、N.BstNB I)によって認識可能なNERSを用いる実施形態が、図8に例示される。この図に示されるように、NERSおよびRERSを含むゲノムDNAは、RERSを認識する制限エンドヌクレアーゼによって消化され得る。NERSを含む消化産物は、開始核酸分子(N1)として機能し得る。
【0135】
(d.N1分子を提供するための第4の型の例示的方法)
本発明の特定の実施形態では、開始核酸分子N1は、種々のODNP対を用いて生成される完全にか、または部分的に二本鎖の核酸分子である。ODNP対を使用してN1分子を調製する方法は、図9〜11と関連して以下に記載される。
【0136】
1つの実施形態において、N1の前駆体は、二本鎖NARSおよび二本鎖RERSを含む。このNARSおよびRERSは、ODNP対を用いて、この前駆体に組み込まれる。例示的なNARSとして、その認識配列の外側にニックを形成するNE(例えば、N.BstNB I)によって認識可能なNERS、および例示的なRERSとしてIIs型制限エンドヌクレアーゼ認識配列(TRERS)を用いる実施形態が、図9に例示される。この図に示されるように、第1のODNPは、NERSの一方の鎖の配列を含み、一方、第2のODNPは、TRERSの一方の鎖の配列を含む。これらの2つのODNPが、標的核酸の一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、生じる増幅産物(すなわち、N1の前駆体)は、二本鎖NERSおよび二本鎖TRERSの両方を含む。TRERSを認識するIIs型制限エンドヌクレアーゼの存在下で、この増幅産物は、二本鎖NERSを含む核酸分子N1を生成するために消化される。
【0137】
別の実施形態において、N1の前駆体は、2つの二本鎖NARSを含む。これらの2つのNARSは、2つのODNPを用いて、N1の前駆体に組み込まれる。例示的なNARSとして、その認識配列の外側にニックを形成するニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能なNERSを用いる実施形態が、図10aに例示される。この図に示されるように、両方のODNPが、NERSのセンス鎖の配列を含む。これらの2つのODNPが、標的核酸の一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、生じる増幅産物は、2つのNERSを含む。これらの2つのNERSは、互いに同一であっても同一でなくても良いが、好ましくは、それらは同一である。NERSを認識するNE(単数または複数)の存在下で、この増幅産物は、二本鎖NERSを各々含む2つの核酸分子(N1aおよびN1b)を生成するために、2回(各鎖において1回)ニック形成される。
【0138】
なお別の実施形態において、N1の前駆体は、2つの半改変RERSを含む。これらの2つの半改変RERSは、2つのODNPを使用することによって、この前駆体に組み込まれる。この実施形態は、図11に例示される。この図に示されるように、第1のODNPおよび第2のODNPの両方が、RERSの一方の鎖の配列を含む。これらの2つのODNPが、改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で、標的核酸の一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、生じる増幅産物は、2つの半改変RERSを含む。これらの2つのRERSは、互いに同一であっても同一でなくても良い。半改変RERSを認識するRE(単数または複数)の存在下で、上記の増幅産物は、半改変RERSの少なくとも一方の鎖の配列を各々含む2つの部分的に二本鎖の核酸分子(N1aおよびN1b)を生成するためにニック形成される。
【0139】
上記の第1のODNP、第2のODNPまたは両方は、特定の実施形態において固体支持体に固定され得る。他の実施形態において、標的核酸を含むサンプルの核酸分子が固定される。
【0140】
(e.N1分子を提供するための第5の型の例示的方法)
本発明の他の実施形態において、開始核酸分子N1は、NARSおよび標的核酸に少なくとも実質的に相補的な突出部を有する部分的に二本鎖の核酸分子である。N1が、例示的なNARSとして、その認識配列の外側にニックを形成するニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能なNERSを有する例示的な実施形態が、図12に例示される。この図に示されるように、N1分子は、NSを含むか、または伸長の際にNSを形成するかのいずれかである鎖中の5’突出部を含み得る。あるいは、N1分子は、NSを含まず、伸長の際にNSを形成もしない鎖中の3’突出部を含み得る。N1分子の突出部は、標的核酸分子に少なくとも実質的に相補的でなければならず、その結果、N1分子の突出部は、標的核酸分子にアニーリングし得る。標的核酸へのN1のアニーリングは、目的の生物学的サンプル中に標的核酸が存在する場合、標的核酸とN1分子との間で形成される複合体(「標的−N1複合体」)の単離を可能にする。
【0141】
例えば、生物学的サンプル中の核酸分子が、図12に示されるように、固体支持体に固定され得る。このような固定は、当該分野で公知の任意の方法によって実施され得、この方法としては、固定剤の使用または組織プリンティングが挙げられるが、これらに限定されない。次いで、特定の標的核酸分子に実質的に相補的である突出部を有するN1分子が、サンプルに適用される。このサンプル中に標的核酸が存在する場合、N1は、その突出部を介して、この標的核酸にハイブリダイズする。続いて、このサンプルは、任意のハイブリダイズしていないN1分子を除去するために洗浄される。DNAポリメラーゼおよびN1中のNERSを認識するニック形成エンドヌクレアーゼの存在下で、一本鎖核酸分子A1が増幅される。適切なT2分子のさらなる存在下で、別の一本鎖核酸分子A2が増幅される。しかし、標的核酸が、サンプル中に存在しない場合、N1は、サンプル中のいずれの核酸分子ともハイブリダイズできず、従って、サンプルから洗い出される。従って、この洗浄された生物学的サンプルが、核酸増幅反応混合物(すなわち、N1の一部をテンプレートとして使用する一本鎖核酸増幅に必要な全ての成分(例えば、N1分子中のNERSを認識するNEおよびDNAポリメラーゼ)を含む混合物)とともにインキュベートされる場合、N1の上記部分に相補的であるいずれの一本鎖核酸分子も増幅されない。
【0142】
標的核酸分子を固定することに加えて、標的−N1複合体は、まずN1分子を生物学的サンプル中の標的核酸分子とハイブリダイズし、次いで、標的核酸に結合した官能基によって複合体を単離することによって、精製され得る。例えば、標的核酸が、ビオチン分子で標識され得、続いて、標的と結合したビオチン分子を介して(固定化ストレプトアビジンを用いて、この複合体を沈殿させるように)、標的−N1複合体が精製され得る。
【0143】
特定の関連の実施形態において、N1は、生物学的サンプル由来の固定された標的核酸を、一本鎖T1分子とハイブリダイズさせることによって形成される。これらの実施形態の一例が、標的核酸を固定しないが、上記のT1分子を、その5’末端を介して固体支持体に固定するというものである。標的核酸がサンプル中に存在する場合、サンプルの核酸とT1とのハイブリダイゼーションは、その固体支持体が洗浄された場合に、その標的がその固体支持体に結合されたまま残ることを可能にする。ニック形成剤認識配列(このアンチセンス配列が、T1に存在する)を認識するニック形成剤とDNAポリメラーゼとの存在下において、一本鎖核酸分子は、T1の認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して5’側に位置づけられる配列をテンプレートとして使用して増幅される。標的がサンプル中に存在しない場合、サンプルの核酸は、T1が結合された固体支持体から洗い流される。従って、一本鎖核酸分子は、T1の一部分をテンプレートに使用して増幅されない。
【0144】
NARSの外側にニックを形成するニック形成剤によって認識可能なNARSを使用する上記の実施形態の別の例を、図13に例示する。この図に示されるように、生物学的サンプルの核酸は、その5’末端を介して固定される。次いで、生じる固定された核酸を、T1分子(これは、3’→5’に、生物学的サンプル中に存在することが疑われる標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的な配列、およびNARSのアンチセンス鎖の配列を含む)に対してハイブリダイズさせる。標的核酸がその生物学的サンプル中に存在する場合、T1分子は、標的核酸にハイブリダイズして、N1分子を形成する。このN1分子は、標的核酸が結合された固相を洗浄することによって、ハイブリダイズしていないT1分子から分離される。DNAポリメラーゼと、NARSを認識するニック形成剤との存在下において、N1は、テンプレートとして使用されて、一本鎖核酸分子A1を増幅する。しかし、標的核酸がサンプル中に存在しない場合、T1は、サンプル中のいかなる標的核酸ともハイブリダイズできず、従って、固体支持体から洗い流される。結果として、固体支持体に結合されるN1は形成され得ず、そしてN1の一部分に対して相補的な一本鎖核酸分子は増幅され得ない。
【0145】
NARSの外側にニックを形成するニック形成剤によって認識可能なNARSを使用する上記の実施形態の別の例を、図25に例示する。この図に示されるように、T1分子は、その5’末端を介して、固体支持体に固定される。T1分子は、5’→3’に、NARSのセンス鎖の配列、および標的核酸の3’部分に対して実質的に相補的な配列を含む。T1分子は、生物学的サンプル由来の核酸と混合される。標的核酸がサンプル中に存在する場合、T1分子は、標的とハイブリダイズされて、テンプレート分子を形成する。T1分子が結合された固体支持体を洗浄する場合、標的は、T1分子とのそのハイブリダイゼーションにより、固体支持体に結合されたまま残る。DNAポリメラーゼの存在下において、標的は、テンプレートとしてT1分子を使用して、その3’末端から伸長される。標的の伸長産物と、T1分子の伸長産物との間で形成される二重鎖は、二本鎖NARSを含む。NARSを認識するニック形成剤とDNAポリメラーゼとの存在下において、一本鎖核酸分子は、テンプレートとして標的核酸の一部分を使用することにより増幅される。しかし、標的核酸がサンプル中に存在しない場合、T1分子は、標的とハイブリダイズできない。従って、一本鎖核酸分子は、テンプレートとして標的を使用することにより増幅されない。
【0146】
上記の実施形態の別の例を、図26に例示する。この例では、固定されたT1分子は、標的核酸に対して実質的に相補性であるが、標的の3’部分に対しては必ずしも相補的ではない。T1はまた、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む。標的が生物学的サンプル中に存在する場合、T1分子がサンプル中の核酸と混合されると、そのT1分子は標的とハイブリダイズし得る。T1が結合された固体支持体が洗浄される場合、標的は、T1分子とのそのハイブリダイゼーションにより、固体支持体に結合されたまま残る。DNAポリメラーゼと、NARSを認識するニック形成剤との存在下では、NARSのセンス鎖の配列における1つ以上のヌクレオチドが、標的中のヌクレオチドと従来の塩基対を形成しない場合であっても、特定の状況下において、一本鎖核酸が、標的の一部分をテンプレートとして使用することにより増幅され得る。テンプレート核酸が二本鎖NARSを含まない場合に一本鎖核酸が増幅される状況についての詳細な説明は、「Amplification of Nucleic Acid Fragments Using Nicking Agents」との発明の名称が付けられた米国出願において提供される。しかし、標的核酸がサンプル中に存在しない場合、プローブは、標的とハイブリダイズできない。従って、一本鎖核酸分子は、標的をテンプレートとして使用することによって増幅されない。
【0147】
(3.特異性)
本発明の方法は、サンプル中における特定の病原性生物の存在または非存在を検出するため、ならびに、いくつかの密接に関連した病原性生物の存在を検出するために使用され得る。例えば、上記の例示的な方法の第1の型および第2の型に関して、T1分子がアニールするトリガーODNPの部分は、検出されるべき特定の病原性生物に対して特異的な標的核酸またはその一部分に由来し得る。あるいは、このようなトリガーODNPの一部分は、いくつかの密接に関連した病原性生物の間で実質的にまたは完全に保存されているが、他のより遠縁または無縁の病原性生物には存在しない標的核酸またはその一部分に由来し得る。
【0148】
特定の病原性生物に「特異的」な標的核酸またはその部分とは、特定の生物に存在するが、他のすべての生物(その特定の生物に密接に関連した生物を含む)には存在しない配列を有する標的核酸またはその部分をいう。さらに、いくつかの密接に関連した病原性生物の間で「実質的に保存されている」標的核酸中の領域とは、適切な条件下において、いくつかの密接に関連した生物の各々における対応領域にハイブリダイズし得るが、同一条件下において、より遠縁または無縁の生物由来の標的核酸中の類似領域にはハイブリダイズし得ない核酸分子が存在する、標的核酸中の領域をいう。また、いくつかの密接に関連した生物の間で「完全に保存されている」標的核酸中の領域とは、いくつかの密接に関連した病原性生物の各々に由来する標的核酸において同一の配列を有する領域をいう。
【0149】
同様に、上記の第4の型の例示的な方法に関して、プライマー対を使用して増幅される標的核酸の部分は、特定の病原性生物に対して特異的である領域、またはいくつかの密接に関連した病原性生物の間では実質的にまたは完全に保存されているが、他の遠縁または無縁の病原性生物には存在しない領域であり得る。さらに、標的核酸の増幅部分は、いくつかの密接に関連した病原性生物の間における、標的核酸の可変領域であり得る。本明細書中で使用される場合、標的核酸の「可変」領域とは、密接に関連した生物由来の標的核酸の間では50%未満の配列同一性を有するが、同じ密接に関連した生物由来の標的核酸の間で80%より高い配列同一性を有する領域によって各端を囲まれている領域をいう。本明細書中で使用される場合、2つの核酸の配列同一性のパーセントは、Altschulら(J.Mol.Biol.215:403−10,1990)のBLASTプログラムを、それらのデフォルトパラメータとともに使用して決定される。これらのプログラムは、KarlinおよびAltschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−7,1993)におけるように改変された、KarlinおよびAltschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264−8,1990)のアルゴリズムを実行する。BLASTプログラムは、例えば、ウェブサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)にて利用可能である。
【0150】
同様に、上記の第5の型の例示的な方法に関して、N1の突出部は、病原性生物に特異的な標的核酸中の領域、またはいくつかの密接に関連した病原性生物の間で実質的にまたは完全に保存された標的核酸中の領域に対して、少なくとも実質的に相補的であり得る。この突出部が、特定の生物由来の標的核酸またはその一部分に対して完全に相補的であるが、1つ以上の密接に関連した生物由来の標的核酸またはその一部分に対しても実質的に相補的である場合、特定の生物の存在を検出するため、または密接に関連した生物のいずれか1つの存在を検出するためのいずれかのために、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは変動され得る。例えば、N1分子が、高度にストリンジェントな条件下で生物学的サンプル由来の核酸とハイブリダイズされる場合、テンプレートとしてN1分子の一部分を使用してハイブリダイズされていないN1分子を取り除いた後で、核酸増幅を行うことにより、その生物学的サンプル中における特定の生物の存在が示され得る。他方、N1分子が、中程度または低度のストリンジェント条件下で生物学的サンプル由来の核酸とハイブリダイズされる場合、核酸増幅(テンプレートとしてN1分子の一部分を使用してハイブリダイズされていないN1分子を取り除いた後)により、特定の生物および/または特定の生物に密接に関連した1つ以上の生物の存在が示され得る。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの調節は、当該分野で周知であり、そして例えば、SambrookおよびRussell、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,2001に見出され得る。
【0151】
初回核酸分子(N1)が、トリガーODNPをT1分子にアニーリングさせることによって提供される実施形態において、このトリガーODNPまたはその一部分、ならびにT1においてNARSの一方の鎖の配列に対して3’側に位置づけられるT1分子の一部分は、互いに対して、完全に相補的ではなく、実質的に相補的であり得る。例えば、トリガーODNPが、いくつかの密接に関連した病原性生物の間で実質的に保存されている標的核酸の領域に由来し、そしていくつかの生物のうちのいずれかの存在が検出されることを必要とする場合、トリガーODNPに対して実質的に相補的なT1分子が使用され得る。このような状況では、プライマーの伸長反応は、トリガーODNPがT1分子に対してアニーリングするのを妨げる程、または、トリガーODNPが、テンプレートとしてT1分子の一部分を使用して伸長されるのを妨げる程高いストリンジェントではない条件下で実施される必要がある。しかし、このような条件はまた、T1分子が、トリガーODNP以外の核酸分子に対して非特異的にアニーリングするのを防止するに十分なストリンジェントである必要もある。トリガーODNPまたはその一部分がT1分子の一部分に対して実質的に相補的である核酸増幅のために適切な条件は、反応温度および/または反応緩衝液の組成もしくは濃度を調節することによって解明され得る。一般的には、ハイブリダイゼーション反応と同様に、反応温度を上昇させることは、増幅反応のストリンジェンシーを増大させる。
【0152】
(4.A1分子)
上記のように、A1分子は、テンプレートとしてN1の一部分を使用して増幅される。特定の実施形態において、A1は、比較的短いものであり得、そして最大で25ヌクレオチド、最大で20ヌクレオチド、最大で17ヌクレオチド、最大で15ヌクレオチド、最大で10ヌクレオチド、または最大で8ヌクレオチドを有する。このような短い長さは、N1分子の作製において使用されるT1分子またはODNPを適切なように設計することによって達成され得る。例えば、N1分子を提供する第3の型について(図6)、T1は、NARSのアンチセンス鎖の配列に対して5’側の短い領域を有するように設計され得る。N1分子を提供する第4の型について(図9〜11)、ODNP対は、そのプライマーが標的核酸にアニールする場合に互いに対して近接となるように設計され得る。A1分子が短い長さであることは、有益であり得る。なぜなら、そうすることは、増幅の効率および速度を増加させるからである。さらに、このことは、鎖置換活性を有さないDNAポリメラーゼの使用を可能にする。これはまた、質量分析法による分析のような特定の技術を介して、A1分子および/または以後の増幅反応(ここでは、A1が、初回増幅プライマーとして使用される)の生成物(A2)の検出を容易にする。
【0153】
(5.T2分子)
本発明のT2分子は、NARSのセンス鎖の配列、ならびに、そのNARSのセンス鎖の配列に対して3’側に位置づけられ、テンプレートとして初回核酸分子N1の一部分を使用して増幅される一本鎖核酸分子(A1)に対して少なくとも実質的に相補的な配列、を含む。好ましくは、T2分子は、A1分子に対して完全に相補的な配列を含む。
【0154】
また上記で考察されたように、上記の第4の型の例示的な方法において、プライマー対を用いて増幅される標的核酸の部分は、特定の病原性生物に対して特異的である領域、またはいくつかの密接に関連した病原性生物の間では実質的にまたは完全に保存されているが、他の遠縁または無縁の病原性生物には存在しない領域であり得る。さらに、標的核酸の増幅部分は、いくつかの密接に関連した病原性生物の間における、標的核酸の可変領域であり得る。増幅領域が実質的に保存されている場合、NARSのアンチセンス鎖の配列に対して3’側に位置づけられ、特定の生物由来の増幅領域の一方の鎖に対して同一である配列を含むT2分子を使用して、高度にストリンジェントな条件下(例えば、特定の生物以外の生物に由来するA1分子が、T2分子とハイブリダイズするのを防止するために、比較的高い増幅温度)で増幅反応を実施することにより、特定の生物の存在が検出され得る。あるいは、中程度または低度のストリンジェント条件下(例えば、特定の生物に密接に関連する生物に由来するA1分子がT2分子とハイブリダイズすることを可能にし、そしてテンプレートとしてT2分子の一部分を使用して伸長されることを可能にするために、比較的低い増幅温度)で増幅反応を実施することにより、特定の生物の存在を検出するために、ならびに、特定の生物に密接に関連した1つ以上の生物の存在を検出するために、同じT2分子が使用され得る。
【0155】
さらに、増幅領域が、密接に関連した生物の間における可変領域である実施形態において、T2分子は、上記の密接に関連した生物の中で特定の生物に由来するN1分子を使用して増幅されるA1分子に対して少なくとも実質的に相補的である配列を含み得る。テンプレートとしてこのT2分子の一部分を使用する一本鎖核酸分子の増幅によって、生物学的サンプル中における特定の生物の存在が示される。
【0156】
特定の実施形態では、さらなるT2分子は、第2の増幅反応に必要とされない。これらの実施形態では、N1分子を生成する際に使用された第2のODNPは、その第2のODNPがA1にアニールするのを可能にする3’末端の配列を有する。この第2のODNPはまた、NARSのセンス鎖の配列を含む。従って、テンプレートとして第2のODNPを使用したA1の伸長により、二本鎖NARSが作製される。DNAポリメラーゼと、NARSを認識するNAとの存在下において、一本鎖核酸(A2)は、テンプレートとしてA1を使用して増幅される。上記の実施形態の一例を、図10bに例示する。この図10bにおいて、A1aおよびA1bは、NERSのセンス鎖の配列を各々含む2つのODNPを使用する第1の増幅反応において増幅される(図10a)。
【0157】
T2分子は、特定の実施形態では、固体支持体に、好ましくはその5’末端で、固定され得る。他の実施形態では、T2分子は、固定されなくてもよい。
【0158】
(6.増幅された一本鎖核酸の検出および/または特徴付け)
病原性生物に由来する標的核酸の存在は、増幅産物(例えば、A1、A2など)を検出および/または特徴付けることによって検出され得る。一本鎖核酸分子を検出または特徴付けるために適切な任意の方法が使用され得る。例えば、増幅反応は、標識化されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下において実施され得、その結果、その標識が、増幅された核酸分子に組み込まれる。核酸フラグメントに組み込まれるために適切な標識、およびそのフラグメントの以後の検出のための方法は、当該分野で公知であり、そして例示的な標識としては、放射性標識(例えば、32P、33P、125Iまたは35S)、着色反応産物を生成し得る酵素(例えば、アルカリホスファターゼ)、蛍光標識(例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC))、ビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン、抗原、ハプテン、または蛍光色素が挙げられるが、これらに限定されない。
【0159】
あるいは、増幅された核酸分子は、その増幅された核酸分子に対して実質的に(好ましくは、完全に)相補的である標識化されたディテクターオリゴヌクレオチドの使用によって検出され得る。標識化デオキシヌクレオシド三リン酸と同様に、ディテクターオリゴヌクレオチドもまた、放射性タグ、化学発光タグまたは蛍光タグ(蛍光分極または蛍光共鳴エネルギー輸送を使用する検出のために適切なタグを含む)などで標識され得る。Spargoら,Mol.Cell.Probes 7:395−404,1993;Hellyerら,J.Infectious Diseases 173:934−41,1996;Walkerら,Nucl.Acids Res.24:348−53,1996;Walkerら,Clin.Chem.42:9−13,1996;Spearsら,Anal.Biochem.247:130−7,1997;Mehrpouyanら,Mol.Cell.Probes 11:337−47,1997;およびNadeauら,Anal.Biochem.276:177−87,1999を参照のこと。
【0160】
特定の実施形態において、増幅された核酸分子は、さらに特徴付けられ得る。この特徴付けにより、これらの核酸分子の正体が確認され得、それにより、生物学的サンプル中における病原性生物の標的核酸の存在が確認され得る。このような特徴付けは、一本鎖核酸フラグメントを特徴付けるために適切な任意の公知の方法を介して行われ得る。例示的な技術としては、クロマトグラフィー(例えば、液体クロマトグラフィー)、質量分析法および電気泳動が挙げられるが、これらに限定されない。種々の例示的な方法の詳細な説明、米国仮特許出願60/305,637および同60/345,445(それらの全体が参考として援用される)に見いだされ得る。
【0161】
増幅産物を検出および/または特徴付けして、生物学的サンプル中の標的核酸の存在を検出することに加えて、標的核酸の存在は、増幅反応において生成された完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子(例えば、H1、H2またはそれらのニック形成生成物)を検出することによって検出され得る。好ましい実施形態において、二本鎖核酸分子の検出は、二本鎖核酸分子に特異的に結合し、そして二本鎖核酸分子への結合に際して蛍光性となる色素(例えば、蛍光性インターカレート剤)を、増幅混合物に添加することによって行われ得る。蛍光性インターカレート剤の添加により、核酸増幅のリアルタイムモニタリングが可能になる。あるいは、二本鎖核酸分子(例えば、H1およびH2)の生成を最大にするために、ニック形成伸長反応混合物中において、DNAポリメラーゼではなくNEを、不活性化し得る(例えば、熱処理によって)。NEの不活性化により、反応混合物中のすべてのニック形成された核酸分子が、二本鎖核酸分子を生成するように伸長される。
【0162】
種々の蛍光挿入剤が、当該分野において公知であり、そして本発明において使用され得る。例示的な挿入剤としては、米国特許第4,119,521号;同5,599,932号、同5,658,735号;同5,734,058号;同5,763,162号;同5,808,077号;同6,015,902号;同6,255,048号および同6,280,933号に開示される挿入剤、GlazerおよびRye、Nature 359:859〜61、1992において論じられる挿入剤、PicoGreen色素ならびに、例えば、SYBR(登録商標)Gold、SYBR(登録商標)Green IおよびSYBR(登録商標)Green IIのようなSYBR(登録商標)色素(Molecular Probes、Eugene WA)が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光挿入剤によって生成される蛍光は、PMT、CCDカメラ、蛍光顕微鏡、蛍光スキャナー、および蛍光マイクロプレートリーダー、蛍光キャピラリーリーダーを含む種々の検出器によって検出され得る。
【0163】
(7.診断において有用な組成物およびキット)
病原体診断において有用な組成物およびキットは、核酸の指数関数的な増幅のための、上記のような組成物およびキットと同じであり得る。特定の実施形態において、これらの組成物およびキットは、増幅生成物の検出を容易にするために、付加的な成分をさらに含み得る。例えば、付加的な成分は、増幅生成物へ組み込まれる標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸であり得る。あるいは、増幅生成物とハイブリダイズ可能である標識された検出オリゴヌクレオチドであり得る。特定の実施形態において、付加的な成分は、蛍光挿入剤であり得る。
【0164】
(8.本発明の診断的使用)
本発明は、目的の任意の標的核酸の存在を迅速に検出することにおいて有用である。特定の実施形態において、標的核酸は、病原性生物(例えば、感染性疾患を引き起こす生物)由来であるか、または病原性生物を起源とする。このような病原性生物は、生体に脅威を突きつける病原性生物(例えば、炭疽および痘瘡)を含む。さらに、上記のように、本発明の方法は、特定の病原性生物の存在の検出のために、そして、幾つかの密接に関連する病原性生物の存在を検出するために使用され得る。本発明はまた、特定の抗生物質に対して耐性のある生物を検出するために使用され得る。例えば、本発明の方法、組成物またはキットは、抗生物質または抗生物質の特定の組み合わせで処置された被験体における特定の病原性生物の検出のために使用され得る。さらに、幾つかの実施形態における核酸増幅を検出するための蛍光挿入剤の使用は、生物学的サンプルにおける標的核酸のリアルタイム検出を提供する。
【0165】
(C.遺伝子バリエーション検出における核酸増幅方法および組成物の使用)
指数関数的な核酸増幅のための方法および組成物はまた、標的核酸における規定された位置で、遺伝子バリエーションを検出するために使用され得る。遺伝子バリエーションを含む標的核酸またはその一部は、第1の増幅反応において、テンプレートとして使用される初回核酸分子(N1)へ、最初に組み込まれる。初回核酸分子はまた、第1のニック形成剤認識配列の少なくとも一方の鎖を含み、従って、DNAポリメラーゼおよび第1のニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下において、第1の増幅反応を可能にする。第1の増幅反応からの生成物(A1)は、標的核酸における規定された位置のヌクレオチドまたは上記のヌクレオチドの相補的ヌクレオチドを含む。次いで、A1は、別のテンプレート核酸(T2)に対してアニールする。T2は、第2のNARSのセンス鎖の配列を含み、従って、DNAポリメラーゼおよび第2のNARSを認識するニック形成剤の存在下で、第2の増幅反応を可能にする。A1および/またはA2の特徴付けは、標的核酸における遺伝子バリエーションの同定を可能にする。
【0166】
(1.標的核酸)
遺伝子バリエーションを同定することに関連する本発明の標的核酸は、参照として野生型核酸配列を使用する遺伝子バリエーションを含み得る任意の核酸分子である。それは、固体支持体に対して固定化されてもよいし、または固定化されなくてもよい。それは、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。一本鎖標的核酸は、変性した二本鎖DNAの一方の鎖であり得る。あるいは、いかなる二本鎖DNAにも由来しない一本鎖核酸であり得る。1つの局面において、標的核酸は、ゲノムDNA、リボソームDNAおよびcDNAを含むDNAである。別の局面において、標的は、mRNA、rRNAおよびtRNAを含むRNAである。
【0167】
1つの局面において、標的核酸は、天然に存在する核酸か、または天然に存在する核酸由来のいずれかである。天然に存在する標的核酸は、生物学的サンプルから得られる。好ましい生物学的サンプルは、1以上の哺乳動物組織、好ましくはヒト組織(例えば、血液、血漿/血清、髪、皮膚、リンパ節、膵臓、肝臓など)および/あるいは細胞または細胞株を含む。生物学的サンプルは、1以上のヒト組織および/またはヒト細胞を含み得る。哺乳動物および/またはヒトの組織および/または細胞は、1以上の腫瘍組織および/または腫瘍細胞をさらに含み得る。
【0168】
生物学的サンプルから核酸の集団を単離するための方法論は、本発明の属する分野の当業者に周知であり、そして容易に利用可能である。例示的な技術は、例えば、以下の実験室研究マニュアルにおいて記載される:Sambrookら、「Molecular Cloning」(Cold Spring Harbor Press、第3版、2001)およびAusubelら、「Short Protocols in Molecular Biology」(1999)(本明細書でその全体が参考として援用される)。核酸単離キットはまた、多数の企業から商業的に入手可能であり、そして単離プロセスを簡素化および促進するために使用され得る。
【0169】
標的核酸は、1以上の正体不明のヌクレオチド(すなわち、遺伝子バリエーション)を含む。本発明は、未知のヌクレオチドの正体が分かり、それによって遺伝子バリエーションが同定される、組成物および方法を提供する。正体不明の塩基は、ヌクレオチド座(または「規定された位置(position)」あるいは「規定された位置(location)」)に存在し、それは、標的核酸上に正確な位置を有する1、2、3、4、5、6、7、またはそれ以上のヌクレオチドを含む特定のヌクレオチドまたは領域をいう。
【0170】
用語「多型性」は、集団における小さい領域(すなわち、1〜数個(例えば、2、3、4、5、6、7、または8)のヌクレオチド長)中の、2以上の遺伝子決定された代替配列または対立遺伝子の存在をいう。2以上の遺伝子決定された代替配列または対立遺伝子は各々、「遺伝子バリエーション」として言及され得る。遺伝子バリエーションは、選択された集団において最も頻繁に生じる対立遺伝子形態であり得、それはまた、「野生型形態」または他の対立遺伝子形態の1つとして言及され得る。二倍体生物は、対立遺伝子形態に対して同型接合または異型接合であり得る。
【0171】
遺伝子バリエーションは、発現レベルおよび発現生成物(すなわち、コードされたペプチド)を含む遺伝子発現に対する作用を有してもよいし、または有さなくてもよい。遺伝子発現に作用する遺伝子バリエーションはまた、点変異、フレームシフト変異、調節性変異、ナンセンス変異、およびミスセンス変異を含む「変異」として言及される。「点変異」は、野生型塩基(すなわち、A、C、G、またはT)が、核酸サンプル内の規定されたヌクレオチド座で、他の標準的な塩基の1つと置換される変異をいう。点変異は、塩基置換または塩基欠失によって引き起こされ得る。「フレームシフト変異」は、小さい欠失または挿入によって引き起こされ、これは次に、遺伝子の読み取り枠のシフトを引き起こし、従って、新規なペプチドが形成される。「調節性変異」は、非コード領域(例えば、イントロン)(正確な遺伝子発現(例えば、生成量、タンパク質の局在性、発現の時期)に作用するコード領域に対して5’側または3’側に位置する領域)における変異をいう。「ナンセンス変異」は、単一のヌクレオチド変化であって、ペプチド伸長の未成熟な終結(すなわち、短縮されたペプチド)を引き起こす「停止」コドンとして読まれる三重鎖コドン(ここで変異が生じる)が結果として生じる。「ミスセンス」変異は、異なるアミノ酸に交換される1個のアミノ酸が生じる変異である。このような変異は、ペプチドのフォールディング(3次元構造)および/または多量体タンパク質における他のペプチドとのその適切な会合において変化を引き起こし得る。
【0172】
本発明の1つの局面において、遺伝子バリエーションは、「単一ヌクレオチド多型」(SNP)であり、これは、任意の単一のヌクレオチド配列改変、好ましくは、生物の集団において一般的であり、そしてメンデル様式で遺伝される単一ヌクレオチド配列改変をいう。代表的には、SNPは、2個の可能性のある塩基のいずれかであり、そして、SNP部位で第3のヌクレオチド実体または第4のヌクレオチド実体を見出す可能性はない。
【0173】
遺伝子バリエーションは、疾患または障害と関連しうるか、またはそれらを引き起こし得る。本明細書で使用される用語「関連する」は、遺伝子バリエーションの発生と宿主における疾患または障害の存在との間の正の相関の存在をいう。このような疾患または障害は、ヒト遺伝性疾患または障害であり得、これらとしては、以下に限定されないが、嚢胞性線維症、膀胱癌、結腸直腸の腫瘍、鎌状血球貧血、サラセミア、al−抗トリプシン(al−antitrypsin)欠損、レッシュ−ナイハン症候群、嚢胞性線維症/ムコビシドーシス、デュシェーヌ/ベッカー筋ジストロフィー、アルツハイマー病、X染色体依存性精神遅滞、およびハンティングトン舞踏病、フェニルケトン尿症、ガラクトース血症、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、重症複合免疫不全、α−1−抗トリプシン欠損、白皮症、アルカプトン尿症、リソソーム蓄積症、エーレルス−ダンロー症候群、血友病、グルコース−6−ホスフェートデヒドロゲナーゼ障害、無ガンマグロブリン血症、尿崩症、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、ファブリー病、脆弱X症候群、家族性高コレステロール血症、多発性嚢胞腎臓症、遺伝性球状赤血球病、マルファン症候群、ヴォン・ヴィレブランド病、神経線維腫症、結節硬化症、遺伝性出血性毛細管拡張症、家族性結腸ポリポーシス、エーレルス−ダンロー症候群、筋緊張性ジストロフィー、骨形成不全症、急性間欠性ポルフィリン症、およびフォン・ヒッペル−リンダウ病が挙げられる。
【0174】
標的核酸は、以下に記載されるように、初回核酸に組み込まれる前に増幅され得る。核酸を増幅させるための任意の公知の方法が、使用され得る。例示的な方法としては、以下に限定されないが、Qβレプリカーゼ、鎖置換増幅(Walkerら、Nucleic Acid Research 20:1691〜6、1995)、転写媒介増幅(Kwohら、PCT国際特許出願公開番号WO88/10315)、RACE(Frohman、Methods Enzymol.218:340〜56、1993)、片側PCR(Oharaら、Proc.Natl.Acad.Sc.86:5673〜7、1989)、およびギャップ−LCR(Abravayaら、Nucleic Acids Res.23:675〜82、1995)の使用が挙げられる。引用された文献およびPCT国際特許出願は、本明細書でその全体が参考として援用される。
【0175】
(2.初回核酸分子(N1))
遺伝子バリエーションの検出のために有用な初回核酸分子は、種々のアプローチによって提供され得る。例えば、N1は、T1分子に対する、トリガーオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングによって得られ得、ここでトリガープライマーは、標的核酸分子由来であり、そして標的核酸における遺伝子バリエーションを囲む(例えば、図14)。あるいは、N1は、(例えば、図15に示されるように制限エンドヌクレアーゼによる標的核酸の消化によって)二本鎖標的核酸より直接誘導され得る。N1はまた、適切なオリゴヌクレオチドプライマー対の使用によって調製され得る(例えば、図16〜18)。初回核酸分子を提供するための幾つかの例示的な手段は、以下に記載される。
【0176】
(a.N1分子を提供するための第1の型の例示的な方法)
上記のように、N1は、T1分子に対するトリガーオリゴヌクレオチドのアニーリングによって提供され得る。トリガープライマーは、標的核酸の遺伝子バリエーションを囲む必要がある。N1分子を提供するためのこの型の例示的な方法が、図14において示される。この図に示されるように、二本鎖標的核酸(例えば、ゲノムDNA)は、認識配列が、遺伝子バリエーションが存在する規定された位置に近い制限エンドヌクレアーゼによって、まず切断される。消化生成物は、変性され得、次いで、潜在的な遺伝子バリエーションを含む消化生成物の鎖は、テンプレート核酸(T1)に対してアニールするためにトリガーオリゴヌクレオチドプライマーとして使用され得る。T1は、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、その結果、DNAポリメラーゼおよび認識配列を認識するニック形成剤の存在下において、標的核酸の遺伝子バリエーションの相補的なヌクレオチドを含む一本鎖核酸フラグメント(A1)が、増幅される。
【0177】
(b.N1分子を提供するための第2の型の例示的な方法)
本発明の特定の実施形態において、N1は、潜在的な遺伝子バリエーション、ニック形成剤認識配列、および制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む標的核酸から直接誘導される。例示的なニック形成剤認識配列として、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列の外側にニック形成するニック形成エンドヌクレアーゼ(例えば、N.BstNB I)によって認識可能な認識配列を用いる実施形態が、図15に示される。この図において示されるように、標的核酸は、標的核酸における配列を認識する制限エンドヌクレアーゼによって消化され得る。ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を含む消化生成物は、一本鎖核酸(A1)フラグメントを増幅するための初回核酸分子(N1)として機能し得る。遺伝子バリエーション(「X」)は、ニック形成剤によって生成されるニック形成部位に対応する位置と制限エンドヌクレアーゼの制限切断部位との間に存在する必要がある。このような位置によって、増幅されたフラグメント(A1)が、遺伝子バリエーションの相補体(「X])を含むことが可能となる。
【0178】
(c.N1分子を提供するための第3の型の例示的な方法)
本発明の特定の実施形態において、初回核酸分子N1は、種々のODNP対を使用して生成される完全に二本鎖の核酸分子か、または部分的に二本鎖の核酸分子である。N1分子を調製するためにODNP対を使用する方法は、図16〜18と合わせて、以下に簡単に記載される。より詳細な説明は、米国仮出願番号60/305,637および同60/345,445に見出され得る。
【0179】
特定の実施形態において、N1に対する前駆体は、二本鎖ニック形成剤認識配列および制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。ニック形成剤認識配列および制限エンドヌクレアーゼ認識配列は、プライマー対を使用して前駆体へ組み込まれる。例示的なニック形成剤認識配列として、ニック形成剤認識配列の外側にニック形成するニック形成剤(例えば、N.BstNB I)によって認識可能な認識配列、および例示的な制限エンドヌクレアーゼ認識配列として、IIs型制限エンドヌクレアーゼ認識配列(TRERS)を用いる実施形態が、図16に示される。この図に示されるように、第1のプライマーは、ニック形成剤認識配列の一方の鎖の配列を含み、一方、第2のODNPは、IIs型制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含む。これらの2つのODNPが、標的核酸の一部を増幅するためにプライマーとして使用される場合に、生じる増幅生成物(すなわち、N1に対する前駆体)は、二本鎖NERSおよび二本鎖TRERSの両方を含む。さらに、第1のプライマーは、遺伝子バリエーションの相補体に対して3’側に位置する標的核酸の一方の鎖の一部にアニールするように設計されるのに対し、第2のプライマーは、遺伝子バリエーションに対して3’側に位置する標的核酸の一方の鎖の一部にアニールするように設計される。このような設計によって、N1に対する前駆体が、遺伝子バリエーションおよびその相補体を囲むことが可能になる。TRERSを認識するIIs型制限エンドヌクレアーゼの存在下では、増幅生成物は、二本鎖NERSを含む部分的に二本鎖の核酸分子N1を生成するように消化される。
【0180】
他の実施形態において、N1に対する前駆体は、2つの二本鎖ニック形成剤認識配列を含む。2つのニック形成剤認識配列は、2つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、N1に対する前駆体へ組み込まれる。例示的なニック形成剤認識配列として、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列の外側にニック形成するニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能な認識配列を用いた実施形態が、図17に示される。この図に示されるように、両方のプライマーは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含む。さらに、第1のプライマーが、遺伝子バリエーションの相補体に対して3’側に位置する標的核酸の一方の鎖の一部にアニールするように設計されるのに対し、第2のプライマーは、遺伝子バリエーションに対して3’側に位置する標的核酸の一方の鎖の一部にアニールするように設計される。これらの2つのプライマーが、標的核酸の一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合に、生じる増幅生成物(すなわち、以下に記載されるN1aおよびN1bに対する前駆体)は、遺伝子バリエーションおよびその相補体、ならびに2つのニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。これらの2つの認識配列は、互いに同一であっても、または同一でなくてもよいが、好ましくは、それらは同一である。ニック形成エンドヌクレアーゼまたは認識配列を認識するニック形成エンドヌクレアーゼの存在下で、増幅生成物は、二本鎖ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列の1つを各々含む2つの部分的に二本鎖の核酸分子(N1aおよびN1b)を生成するために、2回(各鎖に対して1回)ニック形成される。
【0181】
例示的なニック形成剤認識配列として半改変された(hemimodified)制限エンドヌクレアーゼ認識配列を用いる別の実施形態が、図18に示される。この図に示されるように、第1のプライマーおよび第2のプライマーの両方は、制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含む。さらに、第1のプライマーは、遺伝子バリエーションの相補体に対して3’側に位置する標的核酸の一方の鎖の一部にアニールするように設計されるのに対し、第2のプライマーは、遺伝子バリエーションに対して3’側に位置する標的核酸の一方の鎖の一部にアニールするように設計される。これらの2つのプライマーが、改変されたデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、標的核酸の一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合に、生じる増幅生成物(すなわち、以下に記載されるN1aおよびN1bに対する前駆体)は、遺伝子バリエーションおよびその相補体、ならびに2つの半改変された制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。これらの2つの半改変された認識配列は、互いに同一であってよいし、または同一でなくてもよい。制限エンドヌクレアーゼおよび半改変された認識配列を認識する制限エンドヌクレアーゼの存在下で、上記増幅生成物は、1つの半改変された制限エンドヌクレアーゼ認識配列の少なくとも一方の鎖の配列を各々含む、2つの部分的に二本鎖の核酸分子(N1aおよびN1b)を生成するようにニック形成される。
【0182】
上記第1のODNP、第2のODNP、またはその両方は、特定の実施形態において固体支持体に固定化され得る。他の実施形態において、標的核酸を含むサンプルの核酸分子が、固定化される。
【0183】
(3.A1分子)
以上に記載されたように、A1分子は、N1の一部をテンプレートとして使用して増幅される。このN1の一部は、標的核酸の遺伝子バリエーションまたはその相補体を含み、その結果、A1は、遺伝子バリエーションの相補体または遺伝子バリエーション自体を含む。A1は、比較的短いものであり得、そして多くとも25個、20個、17個、15個、10個、8個のヌクレオチドを有する。このような短い長さは、N1分子を作製する際に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを適切に設計することによって達成され得る。例えば、N1分子を提供する第3の型について(図16〜18)、ODNP対は、それらが標的核酸にアニールする場合に、互いに近接となるように設計され得る。上記の本発明の診断適用と類似して、A1分子の長さを短くすることは、増幅効率および増幅速度を増加させ、鎖置換活性を有さないDNAポリメラーゼの使用を可能にし、A1分子および/またはA1が、例えば、質量分析のような特定の技術を介して初回増幅プライマーとして使用されるその後の増幅反応の生成物(A2)の検出を容易にする。
【0184】
(4.T2分子)
本発明のT2分子は、NARSのセンス鎖の配列、およびテンプレートとして開始核酸分子N1の一部を使用して増幅される一本鎖核酸分子(A1)に少なくとも実質的に相補的である(このNARSのセンス鎖の配列に対して3’側に位置する)配列を含む。T2は、ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤およびDNAポリメラーゼの存在下で、その認識配列のセンス鎖の配列を含むので、A1は、開始核酸伸長のためのプライマーとして使用され、続いて、別の一本鎖核酸フラグメント(A2)を増幅するためのテンプレートとして使用される。上記のように、A1は、標的核酸の遺伝子バリエーションまたはその相補体を含む。従って、A2は、遺伝子バリエーションの相補体または遺伝子バリエーションそれ自体を含む。従って、A2の特徴付けは、その標的核酸の遺伝子バリエーションの検出および/または同定を可能にする。
【0185】
本発明の診断適用と同様に、本発明に従う遺伝子バリエーション検出の特定の実施形態において、さらなるT2分子は、第二の増幅反応のために必要でない。これらの実施形態において、N1分子を生成する際に使用される第二のODNPは、3’末端配列を有し、この3’末端配列は、第二のODNPがA1にアニーリングするのを可能にする。この第二のODNPはまた、NARSのセンス鎖の配列を含む。従って、この第二のODNPをテンプレートとして使用するA1の伸長により、二本鎖NARSが作製される。DNAポリメラーゼおよびNARSを認識するNAの存在下で、一本鎖核酸(A2)は、A1をテンプレートとして使用して増幅される。
【0186】
特定の実施形態において、このT2分子は、好ましくは、その5’末端を介して、固体支持体に固定化され得る。他の実施形態において、このT2分子は、固定化されていなくてもよい。
【0187】
(5.増幅された一本鎖核酸の特徴付け)
標的核酸における潜在的な遺伝子バリエーションは、増幅産物(すなわち、A1およびA2)を特徴付けることによって、検出または同定され得る。一本鎖核酸分子を特徴付けするのに適切な任意の方法が、使用され得る。例示的な技術としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:クロマトグラフィー(例えば、液体クロマトグラフィー)、質量分析法および電気泳動。種々の例示的な方法の詳細な説明は、米国仮特許出願番号60/305,637および60/345,445において見出され得る。
【0188】
増幅された一本鎖核酸フラグメントを特徴付けするための多くの方法論をまた使用して、増幅反応混合物中の特定の増幅された一本鎖核酸フラグメントの量を測定し得る。例えば、増幅された一本鎖核酸分子が、液体クロマトグラフィーによってその増幅反応混合物中の他の分子から最初に分離され、次いで質量分光分析に供される実施形態において、この増幅された一本鎖核酸分子の量は、核酸分子を含む画分の液体クロマトグラフィーによってか、または核酸分子に対応する質量分光ピークのイオン電流測定値のいずれかによって、定量され得る。
【0189】
このような方法論を使用して、標的核酸の対立遺伝子改変体もまた存在し得る核酸集団内の標的核酸の対立遺伝子頻度を決定し得る。「対立遺伝子改変体」とは、標的核酸の規定された位置以外でその標的核酸と同一の配列を有する、核酸分子をいう。「核酸集団内の標的核酸の対立遺伝子頻度」とは、標的核酸である核酸集団内での標的核酸およびその対立遺伝子改変体の総量の割合をいう。N1に対する前駆体を調製する際に使用されるプライマー対は、標的の規定された位置における潜在的な遺伝子バリエーションの各部位においてその標的核酸の一部にアニーリングするように設計されているので、このプライマー対をプライマーとして使用し、この標的核酸を含む核酸集団をテンプレートとして使用する増幅は、この標的核酸の規定された位置において遺伝子バリエーションを含む核酸フラグメントを生じ、そして対立遺伝子改変体がこの核酸集団内に存在する場合、その標的核酸の対立遺伝子改変体の同じ位置において遺伝子バリエーションを含む核酸フラグメントを生じる。標的核酸およびその対立遺伝子改変体の配列は、その規定された位置においてのみ異なるので、標的核酸および対立遺伝子改変体をそれぞれテンプレートとして使用して、N1に対する前駆体は、同一または類似の効率で増幅される。同様に、標的核酸の遺伝子バリエーションまたはその相補体を含む一本鎖核酸分子(A1)は、対立遺伝子改変体の遺伝子バリエーションまたはその相補体を含む一本鎖核酸分子の増幅と同一または類似の効率で増幅される。さらに、標的およびその対立遺伝子改変体をそれぞれテンプレートとして使用して、同じ効率で増幅されたA1分子にアニーリングするT2分子が使用される場合、開始テンプレートとして標的を用いて増幅されたA2分子 対 開始テンプレートとして改変体を使用して増幅されたA2分子の比は、その核酸集団内の標的 対 その改変体の比を反映する。従って、反応混合物中のA1(またはA2)分子の相対量の測定値は、この核酸集団内の標的核酸の相対量を示す。
【0190】
(6.遺伝子バリエーションの検出に有用な組成物およびキット)
遺伝子バリエーションの検出に有用な組成物およびキットは、指数関数的核酸増幅について上記される組成物およびキットと同じであり得る。特定の実施形態において、これらのキットは、増幅産物を特徴付けする際に有用な1つ以上のさらなる構成要素をさらに備え得る。例えば、このさらなる構成要素は、以下の(1)〜(5)であり得る:(1)クロマトグラフィーカラム;(2)核酸のクロマトグラフィーによる特徴付けまたは分離を実施するための緩衝液;(3)マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルプレート;(4)液体クロマトグラフィーおよび/または質量分析法のための、オリゴヌクレオチド標準(例えば、6マー、7マー、8マー、10マー、12マー、14マー、および16マー);ならびに、(5)このキットを使用するための指示書冊子。
【0191】
(7.本発明の遺伝子バリエーション検出方法の適用)
上で詳細に記載されるように、本発明は、標的核酸における遺伝子バリエーションを検出および/または同定するための方法を提供する。本発明に従う方法は、遺伝子バリエーションを同定または測定することが望ましいかまたは必要である、広範な種々の適用における有用性を見出し得る。このような適用としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:遺伝性の転移性疾患についての遺伝子分析、腫瘍診断、疾患の素因、法医学、親子鑑定、植物栽培もしくは動物の繁殖の促進、細胞機能および/もしくは疾患マーカー遺伝子の発現プロファイリング、ならびに植物もしくは動物において感染性疾患を引き起こし、そして/もしくは食物安全性に関連する感染性生物の同定および/または特徴付けが挙げられる。
【0192】
例えば、本発明は、法医学的目的のための遺伝子分析において有用であり得る。DNA配列バリエーションのレベルにおける個体の同定は、従来基準(例えば、指紋、血液型または身体的特徴)よりも有利である。大部分の表現型マーカーとは対照的に、DNA分析は、親子鑑定において必要とされるような個体間の関連性の推定を容易に可能にする。遺伝子分析は、密接に関連したドナー細胞とレシピエント細胞との間を識別する必要がある骨髄移植において、高度に有用であることが証明されている。本発明は、サンプルDNAの多型を特徴付けする際に、従って法医学的DNA分析において、有用である。例えば、サンプル中の22の別個の遺伝子配列の分析(各々1つずつが、集団において2つの異なる形態で存在する)が、1010の異なる結果を生み出し、このことは、ヒトの個体の唯一の識別を可能にする。
【0193】
ウイルス性または細胞性の癌遺伝子の検出は、核酸診断の適用の別の重要な分野である。ウイルス性癌遺伝子(v癌遺伝子)は、レトロウイルスにより伝播され、一方で、これらの細胞性の対応物(c癌遺伝子)は、正常な細胞内にすでに存在する。しかし、細胞性癌遺伝子は、特定の改変(例えば、(膀胱癌および結腸直腸癌におけるc−K−ras癌遺伝子におけるような)点変異)、小さな欠失および小さな挿入により活性化され得る。この活性化プロセスの各々は、さらなる縮重プロセスと組み合わせて、増加した制御されていない細胞増殖を導く。さらに、点変異、小さい欠失または挿入はまた、いわゆる「劣性癌遺伝子」を不活性化し得、そしてそれにより(網膜芽細胞腫(Rb)遺伝子および骨肉腫におけるような)腫瘍の形成を導く。本発明は、癌遺伝子を活性化するかまたは劣性癌遺伝子を不活性化する(これらは、次いで、癌を引き起こす)点変異、小さい欠失、および小さい変異の検出または識別において有用である。
【0194】
本発明はまた、移植分析において有用であり得る。移植された組織の拒絶反応が、特定のクラスの組織適合抗原(HLA)によって決定的に制御される。これらは、抗原提示血液細胞(例えば、マクロファージ)の表面上で発現される。HLAと外来抗原との間の複合体は、細胞表面上の対応するT細胞レセプターを介してTヘルパー細胞により認識される。HLA、抗原、およびT細胞レセプターの間の相互作用は、複雑な防御反応を引き起こし、これは、身体に対するカスケード様免疫応答を導く。
【0195】
異種外来抗原の認識は、抗体反応に類似して、T細胞レセプターの抗原特異的可変領域により媒介される。従って、移植片の拒絶において、外来抗原に適合する特異的なT細胞レセプターを発現するT細胞は、T細胞プールから排除され得る。そのような分析は、抗原特異的な可変DNA配列の同定により可能であり、ここでこの配列は、PCRにより増幅され、従って選択的に増加される。特異的な増幅反応は、特異的なT細胞レセプターの、単一の細胞に特異的な同定を可能にする。
【0196】
同様の分析が、若年性糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、または脳脊髄炎のような自己免疫疾患の同定のために本明細書において実施される。
【0197】
本発明は、種々の外来抗原の認識に関連する抗原特異的な可変領域をコードするT細胞レセプター遺伝子における遺伝子バリエーションを決定するために有用である。従って、本発明は、移植された組織の拒絶反応の可能性を予測する際に有用であり得る。
【0198】
本発明はまた、ゲノム診断において有用であり得る。全ての新生児の4%が、遺伝的欠損を有して生まれる;たった1つの遺伝子の改変により引き起こされる、記載された3,500の遺伝性疾患のうち、原発性の分子の欠損は、それらのうち約400についてのみ知られている。
【0199】
遺伝性疾患は、長い間、表現型分析(病歴(例えば、血液の欠乏:サラセミア))、染色体分析(核型(例えば、モンゴリズム:21トリソミー))または遺伝産物分析(改変タンパク質(例えば、フェニルケトン尿症:フェニルピルビン酸の増強されたレベルを生じる、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素の欠損))により診断されてきた。核酸検出方法のさらなる使用は、ゲノム診断の範囲を非常に増大させる。
【0200】
特定の遺伝子疾患の場合、2つの対立遺伝子のうちたった1つの改変が、疾患のために十分である(優性に伝播された単一遺伝子欠損);多くの場合、両方の対立遺伝子は、改変されなくてはならない(劣性に伝播された単一遺伝子欠損)。第3の型の遺伝子欠損において、この疾患の発症は、遺伝子の改変によってだけでなく、食習慣(糖尿病または動脈硬化の場合)またはライフスタイル(癌の場合)のような要因によっても決定される。非常にしばしば、これらの疾患は、高齢者において生じる。精神分裂病、躁うつ病または癲癇のような疾患は、また、この文脈において、言及されるべきである;これらの場合において、この疾患の発症が、環境要因および異なる染色体位置におけるいくつかの遺伝子の改変に依存するか否かは、調査中である。
【0201】
直接的および間接的なDNA分析を用いて、以下の一連の遺伝子疾患の診断が可能になっている:膀胱癌、結腸直腸癌、鎌状赤血球貧血、サラセミア、a1−抗トリプシン欠損、レッシュ−ナイハン症候群、嚢胞性線維症/ムコビシドーシス、デュシェーヌジストロフィー/ベッカー型筋ジストロフィー、アルツハイマー病、X染色体依存性精神遅滞、およびハンティングトン舞踏病、フェニルケトン尿症、ガラクトース血症、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、重症複合型免疫不全、α1−抗トリプシン欠損、白皮症、アルカプトン尿症、リソソーム蓄積症(lysosomal storage disease)、エーレルス−ダンロー症候群、血友病、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ障害、無ガンマグロブリン血症、潜伏性糖尿病、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、ファブリー病、ぜい弱X症候群、家族性高コレステロール血症、多発性嚢胞腎疾患、遺伝性球状赤血球症、マルファン症候群、ヴォン・ヴィレブランド病、神経線維腫症、結節硬化症、遺伝性出血性毛細管拡張症、家族性結腸ポリープ症、エーレルス−ダンロー症候群、筋緊張性ジストロフィー、骨形成不全症、急性間欠性ポルフィリン症、およびフォン・ヒッペル−リンダウ症候群。本発明は、規定された位置での点変異、小さい欠損または小さい挿入により引き起こされる任意の遺伝子疾患の診断に有用である。
【0202】
関連した局面において、本発明は、疾患感受性についての試験において使用され得る。特定の遺伝子バリエーションは、直接的に疾患を引き起こさないが、これらは、疾患に関連する。言い換えれば、被験体によるこれらの遺伝子のバリエーションの保持は、被験体を、これらの疾患に対して感受性にする。本発明の方法を用いるそのような遺伝子バリエーションの検出は、特定の疾患の疑いのある被験体の識別および引き続く予防方法の実施を可能にする。
【0203】
本発明はまた、薬理ゲノム学にも適用可能である。例えば、それは、薬物耐性に関連する遺伝子(例えば、チトクロムP450遺伝子の種々の対立遺伝子)を検出または同定するために用いられ得る。
【0204】
さらに、本発明は、残留する疾患の検出または特徴付けのために有用な方法を提供する。言い換えれば、本発明の方法は、特定の処置(例えば、化学療法手術)の後の癌のような残留する変異体遺伝子型を検出または同定するために用いられ得る。それは、新性の変異体(例えば、病原性生物に薬物耐性を与える特定の遺伝子における遺伝子バリエーション)の同定においても有用であり得る。
【0205】
(D.プレmRNAの選択的スプライシング分析における核酸増幅方法および組成物の使用)
指数関数的核酸増幅のための方法および組成物はまた、プレmRNA選択的スプライシング分析のために使用され得る。特定のエキソン−エキソン連結部を含むと疑われている標的cDNAまたはその部分は、第一の増幅反応においてテンプレートとして使用される開始核酸分子(N1)に、最初に取り込まれる。この開始核酸分子はまた、第一のニック形成剤認識配列の少なくとも一方の鎖を含み、従って、DNAポリメラーゼおよびこの第一のニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で、第一の増幅反応を可能にする。この第一の増幅反応からの生成物(A1)は、特定のエキソン−エキソン連結部またはその相補的な部分を含むことが疑われる標的核酸の部分を含む。次いで、A1は、別のテンプレート核酸(T2)にアニーリングする。T2は、第二のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、従って、DNAポリメラーゼおよびこの第二のニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で、第二の増幅反応を可能にする。A1および/またはA2のこの特徴は、標的が特定のエキソン−エキソン連結部を含むか否かを示す。
【0206】
(1.定義)
本明細書で用いられる「エキソン」は、成熟RNA産物中で提示される、中断された遺伝子の任意のセグメントである。「イントロン」は、転写されるが、そのいずれかの側で配列(エキソン)をともにスプライスすることにより転写物内から除かれるセグメントをいう。
【0207】
本明細書で用いられるcDNA分子の「センス鎖」は、mRNA中のヌクレオチド「U」がcDNA分子ではヌクレオチド「T」により置換されることを除けば、このcDNA分子が派生するmRNA分子と同一の配列を有する鎖をいう。一方、cDNA分子の「アンチセンス鎖」は、cDNA分子が派生するmRNA分子に相補的である鎖をいう。
【0208】
エキソン(エキソンA)は、エキソンAのセンス鎖の配列がエキソンBのセンス鎖の配列に対して5’側にあるとき、同一遺伝子内で別のエキソン(エキソンB)に対し「上流」にある。エキソンAおよびエキソンBは、さらに、それぞれ、上流エキソンおよび下流エキソンと称され得る。
【0209】
標的cDNA分子は、目的の遺伝子に由来するcDNA分子をいう。言い換えると、それは、目的の遺伝子の転写から得られるmRNA分子の逆転写の産物である。標的cDNA分子は、部分配列を有し得る(すなわち、部分的なmRNA分子から逆転写される)が、好ましくは、全長配列である。
【0210】
第一のODNPと第二のODNPを取り囲む核酸フラグメントは、1つの鎖が第一のODNPの配列、第二のODNPの相補配列、および第一のODNPと第二のODNPの相補配列との間の配列からなり;その一方、他方の鎖が、第一のODNPの相補配列、第二のODNPの配列、および第一のODNPの相補配列と第二のODNPの配列との間の配列からなる、二本鎖核酸フラグメントと称される。
【0211】
「差次的(differetial)スプライシング」または「選択的スプライシング」は、1つの遺伝子の同じ転写物からの、少なくとも2つの異なるmRNA分子の生成である。例えば、転写物の特定のセグメントは、mRNA分子の1つに存在し得るが、他のmRNA分子からスプライシング除去され得る。
【0212】
「2つの特定のエキソンの連結部であると疑われる位置」または「2つの特定のエキソンの疑わしい連結部の位置」とは、比較的上流のエキソンのセンス鎖の3’末端および/またはそのエキソンのアンチセンス鎖の5’末端をいう。
【0213】
標的cDNAにおける「エキソンAおよびエキソンBの連結部」とは、標的cDNAのセンス鎖中の位置(ここで、エキソンAの3’末端は、エキソンBの5’末端と接合している)および/または標的cDNAのアンチセンス鎖中の位置(ここで、エキソンAの5’末端は、エキソンBの3’末端と接合している)をいう。
【0214】
(2.開始核酸分子(N1))
差次的スプライシング分析のために有用な開始核酸分子は、種々のアプローチによって提供され得る。例えば、N1は、トリガーオリゴヌクレオチドプライマーのT1分子へのアニーリングによって得られ得る。ここで、このトリガープライマーは、標的cDNAから誘導され、かつ2つのエキソンの連結部であると疑われる位置を包含する(例えば、図19)。あるいは、N1は、(例えば、図20に示されるように、制限エンドヌクレアーゼを用いた標的cDNAの消化によって)二本鎖標的cDNAから直接誘導され得る。N1はまた、適切なオリゴヌクレオチドプライマー対の使用によって調製され得る(例えば、図21〜24)。開始核酸分子N1を提供するためのいくつかの例示的な手段が、以下に記載される。
【0215】
(a.N1分子を提供するための例示的な方法の第一型)
上記のように、N1は、トリガーオリゴヌクレオチドプライマーをT1分子にアニーリングすることによって提供され得る。このトリガープライマーは、特定のエキソン−エキソン連結部であると疑われる位置を包含する必要がある。N1分子を提供するための方法のこの型の例は、図19に例示される。この図に示されるように、二本鎖標的cDNAは、制限エンドヌクレアーゼによって最初に切断され、その認識配列は、特定のエキソン−エキソン連結部であると疑われる位置に近接している。この消化産物は変性され得、次いで、特定のエキソン−エキソン連結部であると疑われる位置を含む消化産物の鎖は、テンプレート核酸(T1)にアニーリングするためのトリガーオリゴヌクレオチドプライマーとして使用され得る。T1は、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、その結果、DNAポリメラーゼおよびその認識配列を認識するニック形成剤の存在下で、特定のエキソン−エキソン連結部であると疑われる位置を含む一本鎖核酸フラグメント(A1)が増幅される。
【0216】
特定の実施形態において、標的cDNA分子は、固体支持体に固定化され得る。他の実施形態において、T1分子は、好ましくは、その5’末端を介して固定化され得る。
【0217】
(b.N1分子を提供するための第2の型の例示的方法)
本発明の特定の実施形態において、N1は、特定のエキソン−エキソン連結部であると疑われる位置を含み、ニック形成剤認識配列および制限エンドヌクレアーゼ認識配列をさらに含む標的cDNAから直接誘導され得る。例示的ニック形成剤認識配列としてその認識配列の外側にニック形成するニック形成エンドヌクレアーゼ(例えば、N.BstNB I)により認識されうる認識配列を有する実施形態は、図20に例示される。この図に示されるように、標的cDNAは、標的核酸における配列を認識する制限エンドヌクレアーゼにより消化され得る。ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を含む消化産物は、開始核酸分子(N1)として機能して、一本鎖核酸フラグメント(A1)を増幅し得る。特定のエキソン−エキソン連結部であると疑われる位置は、その位置が、増幅されたA1フラグメントへ移入されるかまたは組み込まれるように、ニック形成剤により生成されるニック形成部位と、制限エンドヌクレアーゼの切断部位との間にあることが必要である。
【0218】
(c.N1分子を提供するための第3の型の例示的方法)
特定の実施形態において、開始核酸分子(N1)は、種々のプライマー対を使用して生成される、完全に二本鎖のまたは部分的に二本鎖の核酸分子である。以下の節は、まず、上記の開始核酸分子を提供するための一般的方法を記載し(図21)、次いで、一般的方法のある特定の実施形態を提供する(図22〜24)。
【0219】
上流エキソン(エキソンA)と下流エキソン(エキソンB)との連結部の存在または非存在を決定するために、以下の2つのプライマーから構成されるプライマー対が、使用されうる:(1)エキソンAのアンチセンス鎖においてエキソンAの5’末端付近にエキソンAのアンチセンス鎖の一部に相補的な配列を含む第1プライマー、および(2)エキソンBのセンス鎖においてエキソンBの5’末端付近にエキソンBのセンス鎖の一部に相補的な配列を含む第2プライマー(図21)。第1のODNPとエキソンAのアンチセンス鎖の一部との間の相補性は、正確である必要はないが、このODNPが、エキソンAのその一部に特異的にアニールすることが可能であるに十分でなければならない。同様に、第2のODNPと、エキソンBのセンス鎖の一部との間の相補性は、正確である必要はないが、このODNPがエキソンBのその一部に特異的にアニールすることが可能であるに十分でなければならない。エキソンの鎖の一部は、その一部が、その鎖中のその末端から100ヌクレオチド、90ヌクレオチド、80ヌクレオチド、70ヌクレオチド、60ヌクレオチド、50ヌクレオチド、40ヌクレオチド、35ヌクレオチド、30ヌクレオチド、25ヌクレオチド、20ヌクレオチド、15ヌクレオチド、または10ヌクレオチド以内にある場合、そのエキソンの一方の末端付近にある。ODNP対の2つのODNPの間のこのような間隔を空けた配置は、エキソンAとエキソンBとの連結部が標的cDNA中に存在する場合に、標的cDNAをテンプレートとして使用して、第1のプライマーおよび第2のプライマーを包含する比較的短いフラグメントの増幅を可能にする。
【0220】
各プライマーとその対応するエキソンの一方の鎖との間の配列相補性に加えて、第1のプライマーまたは第2のプライマーのいずれかが、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列をさらに含まなければならない。認識シーケンサーは、ニック形成エンドヌクレアーゼまたは制限エンドヌクレアーゼによって認識可能であり得る。特定の好ましい実施形態において、第1のプライマーおよび第2のプライマーの両方が、ニック形成剤認識配列を含む。認識配列の存在は、第1のプライマーおよび第2のプライマーを含む増幅核酸フラグメントが、DNAポリメラーゼと認識配列を認識するニック形成剤との存在下で一本鎖核酸フラグメント(A1)を増幅するためのテンプレート核酸として機能することを可能にする。
【0221】
プライマーおよび標的cDNAが増幅反応において組み合わされる場合、増幅産物の存在(または非存在)および組成は、エキソンAおよびエキソンBの接合部の存在または非存在を反映する。エキソンAのみまたはエキソンBのみが標的cDNAに存在する場合、プライマーとしての上記プライマーおよびテンプレートとしての標的cDNAを使用して、いかなる増幅産物も作製されない。エキソンAおよびエキソンBの両方が標的cDNAに存在する場合、第1のプライマーおよび第2のプライマーを含む増幅産物(すなわち、N1分子またはN1に対する前駆体)が作製される。エキソンAおよびエキソンBの接合部が標的cDNAに存在する場合、増幅産物は、この接合物を含む(図21A)。エキソンAとエキソンBとの接合部が存在しない(すなわち、エキソンAとエキソンBとの間に配列が存在する)場合、増幅産物は、接合部を含まないが、2つのエキソンの間の配列を含む(図21B)。従って、テンプレートとしてN1を使用して増幅される一本鎖核酸分子(A1)および/またはテンプレートとしてA1を使用する別の一本鎖核酸分子(A2)を特徴付けることは、標的cDNAがエキソンAとエキソンBとの接合部を含むか否かを示す。
【0222】
上記一般的方法の特定の実施形態が、図22に示される。この図に示されるように、第1のプライマーは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含み、そしてエキソンAのアンチセンス鎖の一部にアニールし、第2のプライマーは、IIs型制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含み、そしてエキソンBのセンス鎖の一部にアニールする。これらの2つのプライマーが標的cDNAの一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、増幅産物(すなわち、N1に対する前駆体)は、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列の両方の鎖およびIIs型制限エンドヌクレアーゼ認識配列の両方の鎖を含む。さらに、増幅産物はまた、接合部が標的cDNAに存在する場合、エキソンAとエキソンBとの接合部を含む。IIs型制限エンドヌクレアーゼ認識配列を認識するIIs型エンドヌクレアーゼの存在下で、増幅産物が消化されて、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列の両方の鎖を含み、かつまた接合部が標的cDNAに存在する場合には、エキソンAとエキソンBとの接合部も含む、部分的に二本鎖の核酸分子N1を生成する。
【0223】
上記一般的な方法の別の特定の実施形態が、図23に示される。この図に示されるように、両方のプライマーは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。さらに、第1のプライマーは、エキソンAのアンチセンス鎖の一部にアニールするように設計され、第2のプライマーは、エキソンBのセンス鎖の一部にアニールするように設計される。これらの2つのプライマーが標的cDNAの一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、増幅産物(すなわち、N1に対する前駆体)は、接合部が標的cDNAに存在する場合には、エキソンAとエキソンBとの接合部、ならびに2つの二本鎖ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。これらの2つの認識配列は、互いに同一であっても良く同一でなくても良いが、好ましくは、これらは、同一である。上記認識配列を認識するニック形成エンドヌクレアーゼの存在下において、増幅産物は、それぞれがニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のうちの1つを含む2つの部分的に二本鎖の核酸分子(N1aおよびN1b)を生成するために、2回(各鎖で1回)ニック形成される。さらに、これら2つの分子のそれぞれの突出部(overhang)はまた、接合部が標的cDNAに存在する場合には、エキソンAとエキソンBとの接合部を含む。
【0224】
上記一般的な方法のさらなる特定の実施形態を、図24に示す。この図に示されるように、両方のプライマーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。さらに、第1のプライマーは、エキソンAのアンチセンス鎖の一部にアニールするように設計され、第2のプライマーは、エキソンBのセンス鎖の一部にアニールするように設計される。これら2つのプライマーが、改変デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で標的cDNAの一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、増幅産物(すなわち、N1に対する前駆体)は、接合部が標的cDNAに存在する場合には、エキソンAとエキソンBとの接合部、ならびに2つの半改変制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。これらの2つの半改変認識配列は、互いに同一であっても良いし、同一でなくても良いが、好ましくは、これらは、同一である。上記認識配列を認識する制限エンドヌクレアーゼの存在下で、増幅産物は、それぞれが半改変認識配列の1つの一方の鎖の配列を含む、2つの部分的に二本鎖の核酸分子(N1aおよびN1b)を生成するために、2回(各鎖で1回)ニック形成される。さらに、これら2つの分子のそれぞれの突出部はまた、接合部が標的cDNAに存在する場合には、エキソンAとエキソンBとの接合部を含む。
【0225】
上記第1のODNP、第2のODNPまたは両方が、特定の実施形態において固体支持体に固定され得る。他の実施形態において、標的cDNA分子が固定化される。
【0226】
(3.A1分子)
上記のように、A1分子は、テンプレートとしてN1の一部を使用して増幅される。N1のこの部分は、特定のエキソン−エキソン接合部であると推定される位置を含み、その結果、この位置が、A1に移されるかまたは組み込まれる。特定の実施形態において、A1の長さは、特定のエキソンーエキソン接合部が標的cDNAに存在する場合に比較的短いように調整され得る。例えば、N1分子を提供する第3の型(図21〜24)について、ODNP対は、それらが標的cDNAにアニールする場合、互いに近接するように設計され得る。より詳細には、第1のプライマーは、エキソンAの5’末端に近い標的cDNAのアンチセンス鎖の一部にアニールするように設計され得るが、第2のプライマーは、エキソンBの5’末端に近い標的cDNAのセンス鎖の一部にアニールするように設計され得る。上記の本発明の診断的使用および遺伝的バリエーションの検出と同様に、A1分子の短い長さは、増幅効率および速さを増大し、鎖置換活性を有しないDNAポリメラーゼの使用を可能にし、そして質量分析のような特定の技術を介してA1分子および/または引き続く増幅反応(ここで、開始増幅プライマーとしてA1が使用される)の生成物(A2)の検出を促進する。
【0227】
(4.T2分子)
本発明のT2分子は、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列、ならびにその認識配列のセンス鎖の配列の3’側に位置する配列(すなわち、テンプレートとして、開始核酸分子N1の一部を使用して増幅される一本鎖核酸分子(A1)に対して少なくも実質的に相補性である配列)を含む。T2がニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含むので、その認識配列を認識するニック形成剤とDNAポリメラーゼとの存在下で、A1は、開始増幅プライマーとして使用され、続いて、別の一本鎖核酸フラグメント(A2)を増幅するためのテンプレートとして使用される。上記のように、A1は、特定のエキソン−エキソン接合部であると推定される位置を含む。この位置は、続いて、A2に移されるかまたは組み込まれる。従って、A2の特徴付けは、その位置の各側における配列を決定し得、従って、特定のエキソン−エキソン接合部が標的cDNA内に存在するか否かを決定し得る。
【0228】
本発明の診断適用と同様に、本発明に従うプレmRNA選択的スプライシング分析の特定の実施形態において、第2増幅反応のために、さらなるT2分子は必要ではない。これらの実施形態において、N1モジュールを作製する際に使用される第2のプライマーが、第2プライマーをA1にアニールさせる3’末端配列を有する。第2のプライマーはまた、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む。従って、テンプレートとして第2のプライマーを使用するA1の伸長は、二本鎖ニック形成剤認識配列を作製する。DNAポリメラーゼとこの認識配列を認識するニック形成剤との存在下において、一本鎖核酸(A2)は、テンプレートとしてA1を使用して増幅される。
【0229】
T2分子は、特定の実施形態において、固体支持体に、好ましくはその5’末端を介して固定され得る。他の実施形態において、T2は、固定されていなくてもよい。
【0230】
(5.増幅された一本鎖核酸の特徴付け)
標的cDNA分子における特定のエキソン−エキソン接合部の存在が、増幅生成物(すなわち、A1またはA2)を特徴付けることにより決定され得る。一本鎖核酸分子を特徴付けするために適切な任意の方法が、使用され得る。例示的な技術としては、クロマトグラフィー(例えば、液体クロマトグラフィー)、質量分析法、および電気泳動が挙げられるが、これらに限定されない。種々の例示的な方法の詳細な記載が、米国特許仮出願第60/305,637号および同第60/345,445号に見出され得る。
【0231】
増幅された一本鎖核酸フラグメントの特徴(例えば、質量分析により得られる質量 対 電荷比)は、続いて、テンプレート核酸フラグメントを調製する際に使用されるプライマーの位置および組成を考慮して推定される一本鎖核酸フラグメントの特徴と、および2つのエキソン(これらに対してプライマーが相補的である)の間の接合部が存在するという仮定と比較される。増幅され推定された核酸フラグメントの特徴が同一である場合、標的cDNA分子中に存在すると仮定された特定のエキソン−エキソン接合部は、実際に標的cDNA分子中に存在する。増幅される一本鎖核酸フラグメントの配列および特徴(例えば、質量 対 電荷比)の推定は、エキソン−イントロン接合部付近のコンセンサス配列についての知見に基づく。この知見は、当業者が、そのエキソン−イントロン接合部を正確に特定し、従って、2つのエキソンの間のイントロンがスプライシングによって除去された場合にエキソン−エキソン接合部の正確な位置を推定することを、可能にする。
【0232】
(6.プレmRNA差示的スプライシング分析において有用な組成物およびキット)
プレmRNA差示的スプライシング分析において有用な組成物およびキットは、指数関数的核酸増幅についての上記の組成物およびキットと同じであり得る。特定の実施形態において、これらのキットは、増幅産物を特徴付ける際に有用な1以上のさらなる成分をさらに含み得る。例えば、そのさらなる成分は、(1)クロマトグラフィーカラム;(2)核酸のクロマトグラフィーによる特徴付けまたは分離を行うための緩衝液;(3)マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルプレート;(4)液体クロマトグラフィーおよび/または質量分析法のためのオリゴヌクレオチド標準(例えば、6マー、7マー、8マー、10マー、12マー、14マー、および16マー);(5)逆転写酵素;(6)逆転写酵素のための緩衝液;および(7)このキットを使用するための説明書冊子。
【0233】
(7.本発明のプレmRNA差示的スプライシング分析の適用)
本発明は、目的の任意のmRNA差示的スプライシングを検出する際に有用である。選択的プレmRNAスプライシングは、高等真核生物における遺伝子発現を調節するために重要な機構である。最近の評価によると、ヒト遺伝子の約30%の一次転写産物が、選択的スプライシングに供され、しばしば、通常の発生の間に特定の空間的パターン/時間的パターンにて調節される。複雑な遺伝子においては、選択的スプライシングは、1つの転写産物から、数十個から数百個もの異なるmRNAアイソフォームを生成し得る(BreitbartおよびNadal−Ginard,Annu.Rev.Biochem.56:467−95,1987;MisslerおよびSudhof,Trends Genet 14:20−6,1988;Gascardら、Blood 92:4404−14,1998)。多くの場合、選択的スプライシングされたエキソンは、触媒活性または結合相互作用にとって機能的に重要なタンパク質ドメインをコードし、生じたタンパク質は、異なる活性または拮抗的活性すら示し得る。
【0234】
本明細書中上記で詳細に議論されるように、本発明は、プレmRNA選択的スプライシングを検出(cDNA分子またはcDNA集団中の遺伝子の特定のエキソンの末端における選択的スプライシングの検出およびcDNA分子またはcDNA集団中の遺伝子の全てのエキソンの全ての末端における選択的スプライシングの検出を包含する)するための方法、組成物、およびキットを提供する。プレmRNAスプライシングの重要性に起因して、これらの方法、組成物およびキットは、疾患の診断、素因、および処置、作物栽培、ならびに動物の繁殖、植物および動物の発生調節、薬物開発、ならびに外部刺激(例えば、極端な温度、毒物、および光)に対する生物の応答の操作のような、広範な種々の適用における有用性が見出される。
【0235】
例えば、本発明の方法は、病理的条件に特有のプレmRNAスプライシングパターンを同定および/または特徴付けするために使用され得る。多くの遺伝子における異常なプレmRNAスプライシングは、種々の疾患または障害(特に癌)に関与している。小細胞性肺癌腫において、タンパク質p130の遺伝子(これは、網膜芽細胞腫タンパク質ファミリーに属する)は、コンセンサススプライシング部位にて変異される。この変異の結果として、エキソン2が除去され、未成熟終止コドンの存在に起因してタンパク質の合成がない。同様に、特定の非小細胞性肺癌において、タンパク質p161NK4A(サイクリン依存性キナーゼcdk4およびcdk6のインヒビターである)の遺伝子は、ドナースプライシング部位にて変異される。この変異は、短縮化された短い半減期のタンパク質の生成を生じる。さらに、WT1(ウィルムス腫瘍サプレッサー遺伝子)は、選択的スプライシングによって生成されるいくつかのメッセンジャーRNAへと転写される。乳癌において、異なる改変体の相対的割合は、健常な組織と比較して改変され、従って、診断ツール、または腫瘍進行におけるWT1の種々の機能的ドメインの重要性を理解するに当たっての知見が得られる。細胞形質転換の間の異なるmRNA形態およびタンパク質アイソフォームの間の比に影響を及ぼす類似の変化プロセスはまた、ニューロフィブリンNF1において見出される。さらに、頭部および頸部の癌において、p53が不活性化される機構の1つが、コンセンサススプライシング部位における変異を含んでいた。さらに、IRF−1腫瘍サプレッサー遺伝子転写物の改変されたスプライシングパターンは、この腫瘍サプレッサーの不活性化を生じ、そしてIRF−1 mRNAにおけるエキソンスキッピングの加速は、脊髄形成異常症候群からの顕在白血病、急性骨髄性白血病、および脊髄形成異常症候群を含む多くの造血障害の指標である(米国特許第5,643,729号)。
【0236】
本発明の方法は、疾患(または障害)状態と関連することが知られているかまたは疑われる遺伝子の転写物のスプライシングパターンを比較するため、およびその存在または不在が疾患(または障害)状態に特有であるエキソンを同定するため、または疾患(または障害)状態に特有の異なるスプライシング改変体間の比率における変化を同定するために、用いられ得る。疾患(または障害)状態に存在していないエキソンの同定は、これらエキソンによりコードされるドメインが、健常細胞の正常機能に重要であること、そして、このようなドメインを含むシグナル伝達経路が、治療目的のために回復され得ることを、示し得る。その一方、疾患(または障害)状態に特有に存在するエキソンの同定は、診断ツールとして用いられ得、そしてそのコードされるドメインは、これらドメインにより媒介されるシグナル伝達と拮抗することが意図される低分子量化合物についてのスクリーニング標的として考慮され得る。さらに、これらドメインに対する特異的親和性を有する抗体はまた、この疾患(または障害)状態の診断ツールとして用いられ得る。
【0237】
本発明はまた、生物発生において重要なプレmRNA差次的スプライシングを同定および/または特徴付けるために用いられ得る。選択的スプライシングは、Drosophilaにおける性決定、ヒトにおける抗体応答、および他の組織特異的プロセスまたは発生段階特異的プロセスにおいて主要な役割を演じている(Chabot、Trends Genet.12:472〜8;Smithら、Annu.Rev.Genet.23:527〜77、1989;Breitbartら、Cell 49:793〜803、1987)。従って、本発明の方法は、異なる発生段階で発生調節に関与することが知られているかまたはそれが疑われる遺伝子のプレmRNAスプライシングパターンを比較するために用いられ得る。この遺伝子における差次的スプライシングの存在の同定および/または特徴付けは、所望の形質(例えば、より大きな果実、より高いタンパク質含有量の種子またはより高い油含量の種子、より高いミルク生産)を得るために対応する発生プロセスを調節することにおける指針を提供し得る。
【0238】
本発明の方法はまた、種々の外部刺激に対する生物の応答において重要なプレmRNA差次的スプライシングを同定および/または特徴付けるために用いられ得る。非処置生物の特定の刺激(例えば、病原体の攻撃)に対する応答において役割を演じていることが知られているかまたはそれが疑われる遺伝子のプレmRNAスプライシングパターンは、この刺激を受けた生物のプレmRNAスプライシングパターンと比較され得る。その刺激を受けた生物に特有のスプライシングパターンの同定および/または特徴付けは、この応答を増大するため(この応答が所望される場合)、または低減/排除するため(この応答が所望されない場合)に、対応する応答プロセスを操作することにおける指針を提供し得る。
【0239】
本明細書中で参照され、そして/または出願データシートに列挙される、上記の全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国の特許、外国の特許出願、ならびに非特許刊行物は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【0240】
前述より、本発明の特定の実施形態が例示の目的で本明細書中に記載されたが、種々の改変が、本発明の本質および範囲から逸脱することなくなされ得ることが、理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲を除いて限定されない。
【図面の簡単な説明】
【0241】
【図1】図1は、本発明のタンデム型増幅系の第1の増幅反応の主要な工程の概略図である。
【図2】図2は、本発明のタンデム型増幅系の第2の増幅反応の主要な工程の概略図である。
【図3】図3は、本発明に従う核酸増幅のための例示的な方法の主要な工程の概略図であり、ここで、N.BstNB Iの認識配列は、例示的NARSとして使用され、第1のテンプレート(T1)はNARSのアンチセンス鎖の配列(すなわち、5’−GACTC−3’)を含み、そして第2のテンプレート(T2)はNARSのセンス鎖の配列(すなわち、5’−GAGTC−3’)を含む。
【図4】図4は、本発明に従う核酸増幅のための例示的な方法の主要な工程の概略図であり、ここで、N.BstNB Iの認識配列は、例示的NARSとして使用され、第1のテンプレート(T1)および第2のテンプレート(T2)は、両方、NARSのセンス鎖の配列(すなわち、5’−GAGTC−3’)を含む。
【図5】図5は、ゲノムDNA由来のトリガーODNPを第1のテンプレートT1にアニーリングすることによって開始核酸分子N1を調製し、その後一本鎖核酸分子A1を増幅するための主要な工程の概略図を示す。このトリガーODNPは、ゲノムDNAを消化し、次いで消化されたゲノムDNAを変性させることによって調製される。
【図6】図6は、ゲノムDNAから開始核酸分子N1を調製し、その後一本鎖核酸分子A1を増幅するための主要な工程の概略図を示す。このゲノムDNAは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。このN1分子は、ゲノムDNAフラグメントの一方の鎖をそのゲノムDNAフラグメントの他方の鎖の一部(すなわち、T1)でアニーリングすることによって生成される。
【図7】図7は、ゲノムDNAから開始核酸分子N1を調製し、その後一本鎖核酸分子A1を増幅するための主要な工程の概略図を示す。このゲノムDNAは、ニック形成剤認識配列を含む。N1分子は、ゲノムDNAフラグメントの一方の鎖を第1のテンプレート(T1)(これは、ゲノムDNAの3’側部分ではそのゲノムDNAの鎖に相補的であるが、5’側部分では相補的ではない)にアニーリングすることによって生成される。
【図8】図8は、ゲノムDNAから開始核酸分子N1を調製し、その後核酸分子A1を増幅するための主要な工程の概略図を示す。このゲノムDNAは、ニック形成剤認識配列および制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。その認識配列の外側にニックを形成するニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能な、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列は、例示的なニック形成剤認識配列として使用される。
【図9】図9は、2つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、標的核酸から開始核酸分子N1を調製し、その後核酸分子A1を増幅するための主要な工程の概略図を示す。一方のプライマーは、NERSのセンス鎖の配列を含むが、他方は、IIs型制限エンドヌクレアーゼ認識配列(TRERS)の一方の鎖を含む。
【図10a】図10aは、2つのODNPを使用して、開始核酸分子N1aおよびN1bを調製し、その後核酸分子A1aおよびA1bを増幅するための主要な工程の概略図を示す。この例示的な実施形態において、両方のODNPは、NERSのセンス鎖の配列を含む。
【図10b】図10bは、図10aのA1aおよびA1bをそれぞれのテンプレートとして使用して、核酸分子A2aおよびA2bを増幅するための主要な工程の概略図を示す。この例示的な実施形態において、図10aの第1のプライマーおよび第2のプライマーをA1bおよびA1aにそれぞれアニールし、N2b分子およびN2a分子を形成する。
【図11】図11は、2つのODNPを使用して、例示的な実施形態において開始核酸分子N1を調製し、その後核酸分子A1を増幅するための主要な工程の概略図を示す。両方のODNPとも、RERSの一方の鎖の配列を含む。この増幅は、例示的な改変デオキシヌクレオシド三リン酸として使用される、α−チオデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で実施される。
【図12】図12は、NERSを含む、部分的に2本鎖の開始核酸分子N1を使用して、固定化された標的核酸を検出するための方法の概略図を示す。
【図13】図13は、NERSのアンチセンス鎖の配列を含む、一本鎖核酸分子T1を使用して、固定化された標的核酸を検出するための方法の概略図を示す。
【図14】図14は、標的核酸から開始核酸分子N1を調製し、その後一本鎖核酸分子A1を増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的核酸は、制限エンドヌクレアーゼ認識配列および潜在性遺伝的バリエーションを含む。
【図15】図15は、標的核酸から開始核酸分子N1を調製し、その後一本鎖核酸分子A1を増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的核酸は、ニック形成剤認識配列、制限エンドヌクレアーゼ認識配列、およびこれら2つの認識配列間の遺伝的バリエーションを含む。
【図16】図16は、2つのプライマーを使用して、標的核酸から開始核酸分子N1を調製し、その後核酸分子A1を増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的核酸は、遺伝的バリエーション(「X」)を含む。この第1のプライマーは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含むが、第2のプライマーは、IIs型制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含む。
【図17】図17は、2つのプライマーを使用して、標的核酸から開始核酸分子(N1aおよびN1b)を調製し、その後核酸分子A1aおよびA1bを増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的核酸は、遺伝的バリエーション(「X」)を含む。両方のプライマーとも、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含む。
【図18】図18は、2つのプライマーを使用して、標的核酸から開始核酸分子(N1aおよびN1b)を調製し、その後核酸分子A1aおよびA1bを増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的核酸は、遺伝的バリエーション(「X」)を含む。両方のプライマーとも、制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含む
【図19】図19は、標的cDNAから開始核酸分子(N1)を調製し、その後核酸分子(A1)を増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的cDNAは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列および特定のエキソン−エキソン接合部であると疑われる位置を含む。
【図20】図20は、標的cDNAから開始核酸分子(N1)を調製し、その後核酸分子(A1)を増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的cDNAは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列、制限エンドヌクレアーゼ認識配列、およびこれらの2つの認識配列間の特定のエキソン−エキソン接合部であると疑われる位置を含む。
【図21】図21Aおよび21Bは、標的cDNAから開始核酸分子(N1)を調製し、その後核酸分子(A1)を増幅するためのプロセスの概略図を示す。この標的cDNAは、エキソンAおよびエキソンAに対して直接的に下流にあるエキソンBを含むか(図21A)、またはエキソンA、エキソンB、およびエキソンAとエキソンBとの間の配列を含む(図21B)。
【図22】図22は、2つのプライマーを使用して、標的cDNAから開始核酸分子(N1)を調製し、その後核酸分子(A1)を増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的cDNAは、エキソンAおよびエキソンBを含む。第1のプライマーは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含み、エキソンAのアンチセンス鎖の一部にアニールする。第2のプライマーは、IIs型制限エンドヌクレアーゼ認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み、エキソンBのセンス鎖の一部にアニールする。
【図23】図23は、2つのプライマーを使用して、標的cDNAから開始核酸分子(N1aおよびN1b)を調製し、その後核酸分子(A1aおよびA1b)を増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的cDNAは、エキソンAおよびエキソンBを含む。両方のプライマーとも、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含む。第一のプライマーは、エキソンAのアンチセンス鎖の一部にアニールするが、第2のプライマーは、エキソンBのセンス鎖の一部にアニールする。
【図24】図24は、2つのプライマーを使用して、標的cDNAから開始核酸分子(N1aおよびN1b)を調製し、その後核酸分子(A1aおよびA1b)を増幅するための主要な工程の概略図を示す。この標的cDNAは、エキソンAおよびエキソンBを含む。両方のプライマーとも、制限エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含む。第一のプライマーは、エキソンAのアンチセンス鎖の一部にアニールするが、第2のプライマーは、エキソンBのセンス鎖の一部にアニールする。
【図25】図25は、NARSのセンス鎖の配列および標的核酸の3’側部分に少なくとも実質的に相補的である配列を含む固定化されたT1分子を使用して、標的核酸の存在を検出するための方法の概略図を示す。
【図26】図26は、NARSのセンス鎖の配列を含み、標的核酸に対して少なくとも実質的に相補的である、固定化されたT1分子を使用して、標的核酸の存在を検出するための方法の概略図を示す。
Claims (216)
- 核酸分子(A2)を増幅するための方法であって、該方法は、以下の(A)〜(D):
(A)以下の(i)および(ii):
(i)第1のニック形成剤認識配列(NARS)のセンス鎖の配列および
(ii)該第1のNARSのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列;
のうち少なくとも1つを含む少なくとも部分的に二本鎖となっている核酸分子(N1)を提供する工程;
(B)該第1のNARSを認識する第1のニック形成剤(NA)、DNAポリメラーゼおよび1以上のデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で第1の一本鎖核酸分子(A1)を増幅する工程であって、ここで、該増幅する工程は、該ポリメラーゼのためのテンプレートとして該N1の一部分を使用する、工程;
(C)以下の(i)〜(ii):
(i)第2のNARSのセンス鎖の配列および
(ii)A1に対して少なくとも実質的に相補的な配列
を5’から3’の方向で含む第2の一本鎖核酸分子(T2)を提供する工程;ならびに
(D)T2、Al、第1のNA、第2のNARSを認識する第2のNA、DNAポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で第3の一本鎖核酸分子(A2)を増幅する工程であって、ここで、A2は、A1に対して少なくとも実質的に相補的な配列であって、かつA1、A2または両方が、長くとも25ヌクレオチド長である、工程
を包含する、方法。 - 前記第1のNARSが第2のNARSに同一である、請求項1に記載の方法。
- 前記第1および第2のNARSがニック形成エンドヌクレアーゼである、請求項2に記載の方法。
- 前記第1および第2のNAの両方が、ニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)である、請求項1に記載の方法。
- 工程(A)〜(D)が単一の容器の中で実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記N1が固定されている、請求項1に記載の方法。
- 前記T2が固定されている、請求項1に記載の方法。
- N1が前記第1のNARSのアンチセンス鎖の配列を含む、請求項1に記載の方法。
- N1が前記第1のNARSのセンス鎖の配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1および第2の両方のNAが制限エンドヌクレアーゼ(RE)であり、かつ前記ヌクレオシド三リン酸のうちの少なくとも1つが改変されている、請求項9に記載の方法。
- N1が、トリガーオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)と前記第1のNARSのセンス鎖またはアンチセンス鎖の配列を含む一本鎖核酸分子(T1)とをアニーリングすることによって提供される、請求項1に記載の方法。
- A1が8〜24のヌクレオチド長である、請求項1に記載の方法。
- A1が12〜17のヌクレオチド長である、請求項12に記載の方法。
- A2が8〜24のヌクレオチド長である、請求項1に記載の方法。
- A2が12〜17のヌクレオチド長である、請求項14に記載の方法。
- T2の開始番号がT1の開始番号よりも大きい、請求項1に記載の方法。
- N1はゲノムDNA由来である、請求項1に記載の方法。
- N1はゲノムDNAの一部分である、請求項1に記載の方法。
- 核酸分子(A2)を増幅するための方法であって、該方法は、以下の(A)〜(B):
(A)以下(i)〜(iii):
(i)第1のニック形成剤認識配列(NARS)のアンチセンス鎖の配列を含む少なくとも部分的に二本鎖となっている核酸分子(N1);
(ii)以下の(a)〜(b):
(a)N1中の第1のNARSのアンチセンス鎖の配列に対して5’側に位置するN1の一部分に少なくとも実質的に同一である配列;および
(b)第2のNERSのアンチセンス鎖の配列;
を、3’から5’の方向で含む、一本鎖核酸分子(T2);
(iii) 該第1のNARSを認識する第1のニック形成剤(NA);該第2のNARSを認識する第2のNA;DNAポリメラーゼ;および1以上のデオキシヌクレオシド三リン酸
を含む混合物を提供する工程;ならびに
(B)一本鎖核酸分子(A2)を指数関数的に増幅する条件下で該混合物を維持する工程であって、ここで、A2が長くて25ヌクレオチド長である、工程
を包含する、方法。 - 前記第1および第2のNAがニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)である、請求項19に記載の方法。
- 前記第1および第2のNAが同一である、請求項20に記載の方法。
- 前記N1が固定されている、請求項19に記載の方法。
- 前記T2が固定されている、請求項19に記載の方法。
- 配列(A)(ii)(a)がN1中の前記第1のNARSのアンチセンス鎖に対して5’側に位置するN1の一部分に正確に同一である、請求項19に記載の方法。
- 請求項19に記載の方法であって、N1が、一本鎖標的核酸(T1)に対するトリガーヌクレオチドプライマー(ODNP)のアニーリングによって提供され、ここで、T1は、5’から3’の方向で、
(A)該第1のNARSのアンチセンス鎖の配列;および
(B)少なくとも一部分のトリガーODNPに少なくとも実質的に相補的であって、該第1のNARSのアンチセンス鎖に対して3’側に位置付けられる、配列を含む、方法。 - 前記T1が固定される、請求項25に記載の方法。
- T1の配列(B)が少なくとも一部分の前記トリガーODNPに正確に相補的である、請求項25に記載の方法。
- T1の3’末端がリン酸基に連結している、請求項25に記載の方法。
- 請求項19に記載に方法であって、N1中の前記第1のNARSのアンチセンス鎖の配列に対して5’側にある配列が、標的核酸分子から誘導され、かつ遺伝的バリエーションを含む、方法。
- 前記標的核酸分子の中の遺伝的バリエーションを同定するためにA2を特徴付ける工程をさらに包含する、請求項29に記載の方法。
- 請求項19に記載の方法であって、N1中の第1のNARSのアンチセンス鎖の配列に対して5’側にある配列が、cDNA分子から誘導され、かつ2つの特定のエキソンの間の連結部を含むことが疑われる、方法。
- 前記cDNAが前記2つの特定のエキソンの連結部を含む否かを決定するために、A2を特徴付ける工程をさらに包含する、請求項31に記載の方法。
- 請求項30または32に記載の方法であって、前記特徴付ける工程が、質量分析法、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光法および電気泳動からなる群より選択される技術の使用によって少なくとも部分的に実施される、方法。
- 前記特徴付ける工程が、液体クロマトグラフィーの使用によって少なくとも部分的に実施される、請求項33に記載の方法。
- 前記特徴付ける工程が、質量分析法の使用によって少なくとも部分的に実施される、請求項33に記載の方法。
- 核酸分子(A2)を増幅するための方法であって、該方法は、以下の(A)〜(B):
(A)以下の(i)〜(iii):
(i)第1のニック形成剤認識配列(NARS)のセンス鎖の配列を含む少なくとも部分的に二本鎖となっている核酸分子(N1);
(ii)以下の(a)〜(b):
(a)N1における第1のNARSのセンス鎖の3’側に位置するN1の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列および
(b)第2のNARSのセンス鎖の配列
を、3’から5’の方向で含む、一本鎖核酸分子(T2)ならびに
(iii)該第1のNARSを認識する第1のニック形成剤(NA);第2のNARSを認識する第2のNA;DNAポリメラーゼ;および1以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;
を含む混合物を形成する工程;ならびに
(B)一本鎖核酸分子(A2)を増幅する条件下で、該混合物を維持する工程であって、ここでA2が長くても25ヌクレオチド長である、工程
を包含する、方法。 - 前記第1および第2の両方のNAがニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)である、請求項36に記載の方法。
- 前記第1および第2のNAが同一である、請求項37に記載の方法。
- 前記第1および第2の両方のNAが制限エンドヌクレアーゼ(RE)であり、かつ前記デオキシヌクレオシド三リン酸のうちの少なくとも1つが改変されている、請求項36に記載の方法。
- 前記N1が固定される、請求項36に記載の方法。
- 前記T2が固定される、請求項36に記載の方法。
- 配列(ii)(a)が、前記第1のNARSのセンス鎖に対して3’側に位置するN1の一部分に正確に相補的である、請求項36に記載の方法。
- 請求項36に記載の方法であって、ここで、N1が、一本鎖標的核酸(T1)に対してトリガーオリゴヌクレオチド(ODNP)をアニーリングすることによって提供され、該一本鎖標的核酸(T1)が、
(A)前記第1のNARSのセンス鎖の配列;および
(B)該トリガーODNPの少なくとも一部分に少なくとも実質的に相補的である配列
を5’から3’の方向で含む、方法。 - 前記トリガーODNPが標的核酸から誘導され、そして該標的核酸の遺伝的バリエーションを含む、請求項43に記載の方法。
- 前記標的核酸における遺伝的バリエーションを同定するためにA2を特徴付ける工程をさらに包含する、請求項44に記載の方法。
- 請求項43に記載の方法であって、前記トリガーODNPがcDNA分子からから誘導され、かつ2つの特定のエキソンの間の連結部を含むことが疑われる、方法。
- 前記cDNAが前記2つの特定のエキソンの間の連結部を含む否かを決定するために、A2を特徴付ける工程をさらに包含する、請求項46に記載の方法。
- 前記T1が固定される、請求項43に記載の方法。
- T1の配列(B)が、前記トリガーODNPの少なくとも一部分に正確に相補的である、請求項43に記載の方法。
- タンデム核酸増幅システムであって、以下:
第1の一本鎖核酸(Al)を増幅するための第1のプライマー伸長手段;および第2の一本鎖核酸(A2)を増幅するための第2のプライマー伸長手段を備え;ここで、
(i)A1が、A2を増幅するための第2のプライマー伸長手段のための開始プライマーであり;
(ii)該第1および第2のプライマー伸長手段が単一の反応容器に含まれ、かつニック形成剤(NA)の存在が必要とされ;
(iii)A1、A2、またはそれらの両方が長くて25ヌクレオチド長であり;そして
(iv)A2がA1に対して少なくとも実質的に相補的である、
タンデム核酸増幅システム。 - 請求項50に記載のタンデム核酸増幅システムであって、ここで、前記第1のプライマー伸長手段のためのNAが前記第2のプライマー伸長手段のためのNAと同一である、タンデム核酸増幅システム。
- 請求項50に記載のタンデム核酸増幅システムであって、ここで、
(a)A1を増幅するための第1の手段が、第1のオリゴヌクレオチドプライマー(トリガーODNP)、該トリガーODNPに少なくとも実質的に相補的である第1のテンプレート核酸(T1)、第1のニック形成剤(NA)、第1のDNAポリメラーゼを含み、ここで、T1をテンプレートとして使用して該トリガーODNPの伸長することによって、第1のNAによって認識可能である第1のニック形成剤認識配列(NARS)を生成し;そして、
(b)A2を増幅するための第2の手段が、該核酸(A1)、A1に少なくとも実質的に相補的な第2のテンプレート核酸(T2)を含み、そして、第2のNARSのセンス鎖の配列、該第2のNARSを認識する第2のNAおよび第2のDNAポリメラーゼを含む、
システム。 - 前記第1のNAが前記第2のNAと同一である、請求項52に記載の方法。
- 前記第1のポリメラーゼが前記第2のポリメラーゼと同一である、請求項52または53に記載の方法。
- 前記第1および第2の両方のNAがニック形成エンドヌクレアーゼである、請求項52に記載の核酸増幅システム。
- 前記第1および第2の両方のNAが制限エンドヌクレアーゼである、請求項52に記載の核酸増幅システム。
- 前記トリガーODNPが固定されている、請求項52に記載の核酸増幅システム。
- 前記T1が固定されている、請求項52に記載の核酸増幅システム。
- 前記T2が固定されている、請求項52に記載の核酸増幅システム。
- 核酸分子A2を指数関数的に増幅するための方法であって、該方法は、以下:
(a)第1のNARSを認識する第1のニック形成エンドヌクレアーゼ(NA)および第1のDNAポリメラーゼの存在下でのプライマー伸長反応によって、第1のニック形成剤認識配列(NARS)のうちの1つの鎖の配列を含む第1のテンプレート核酸(T1)をテンプレートとして使用して核酸分子(Al)を増幅する工程;ならびに
(b)第2のNAおよび第2のDNAポリメラーゼの存在下でのプライマー伸長反応によって、第2のNARSのセンス鎖の配列を含む第2のテンプレート核酸(T2)をテンプレートとして、そしてA1を開始プライマーとして使用してA2を増幅する工程であって、ここで、A1、A2、またはその両方は長くても25ヌクレオチド長である、工程;
を包含する、方法。 - 第1のNARSが前記第2のNARSと同一である、請求項60に記載の方法。
- 前記第1のDNAポリメラーゼが前記第2のDNAポリメラーゼと同一である、請求項60または請求項61に記載の方法。
- 工程(a)および(b)が単一の容器で実施される、請求項60に記載の方法。
- 前記NAがニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)である、請求項61に記載の方法。
- 前記NAが、制限エンドヌクレアーゼ(RE)である、請求項61に記載の方法。
- 前記T1が固定される、請求項60に記載の方法。
- 前記T2が固定される、請求項60に記載の方法。
- 前記NEが、N.BstNB IまたはN.Alw Iである、請求項3、20および37のいずれか1項に記載の方法。
- 第1および第2の両方のNEが、N.BstNB Iである、請求項68に記載の方法。
- 前記増幅が、等温度条件下で実施される、請求項1、19および36のいずれか1項に記載の方法。
- 増幅反応の各々が、50℃〜70℃で実施される、請求項70に記載の方法。
- 請求項1、19、および36のいずれか1項に記載の方法であって、ここで、前記DNAポリメラーゼが、exo−Vent、exo−Deep Vent、exo−Bst、exo−Pfu、exo−Bca、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、T5 DNAポリメラーゼ、Phi29 DNAポリメラーゼ、ファージM2 DNA ポリメラーゼ、ファージPhiPRD1 DNAポリメラーゼ、Sequenase、PRD1 DNAポリメラーゼ、9°NmTMDNAポリメラーゼおよびT4 DNAポリメラーゼホモエンザイムからなる群より選択される、方法。
- 請求項74に記載の方法であって、ここで、前記5’→3’エンドヌクレアーゼ欠損のDNAポリメラーゼが、exo−Bstポリメラーゼ、exo−Bcaポリメラーゼ、exo−Ventポリメラーゼ、9°NmTMDNAポリメラーゼまたはexo−Deep Ventポリメラーゼである、方法。
- 組成物であって、以下(A)〜(B):
(A)第1の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子であって、該二本鎖である核酸分子のうちの1つの鎖は、以下の(i)〜(ii):
(i)長くて25ヌクレオチド長の配列、および
(ii)第1のニック形成剤認識配列(NARS)のアンチセンス鎖の配列
を5’から3’の方向で含む、核酸分子
;ならびに
(B)第2の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子であって、該二本鎖である核酸分子のうちの1つの鎖は、以下の(i)〜(ii):
(i)第2のNARSのセンス鎖の配列および
(ii)該第1の核酸分子における第1のNARSのアンチセンス鎖の配列に対して5’側に位置付けられる配列と少なくとも実質的に同一である配列、
を5’から3’の方向で含む、核酸分子
を含む、組成物。 - 前記第1のNARSが、第1のニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)によって認識可能であり、かつ、前記第2のNARSが第2のNEによって認識可能である、請求項74に記載の組成物。
- 前記第1のNARSが、制限エンドヌクレアーゼによって認識可能であり、かつ、第2のNARSがニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能である、請求項74に記載の組成物。
- 前記第1の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子が固定される、請求項74に記載の組成物。
- 前記第2の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子が固定される、請求項74に記載の組成物。
- 配列(B)(ii)が、第1の核酸分子の第1のNERSのアンチセンス鎖の配列に対して5’側に位置付けられる配列と正確に同一である、請求項74に記載の組成物。
- 前記第1のNARSが、前記第2のNARSと同一である、請求項74に記載の組成物。
- 前記第1および第2のNARSが、1つのNEにより認識可能である、請求項80に記載の組成物。
- 以下の(a)および(b):
(a)第1の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子であって、該核酸分子の1つの鎖が、第1のニック形成剤認識配列(NARS)のセンス鎖の配列を含む、第1の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子;ならびに
(b)第2の少なくとも二本鎖の核酸分子であって、該核酸分子の1つの鎖が、5’から3’にむかって、以下の(i)および(ii):
(i)第2のNARSのセンス鎖の配列、および
(ii)該第1の核酸分子中の該第1のNARSの該センス鎖の配列の3’側に位置する配列に少なくとも実質的に相補的な配列、
を含む、第2の少なくとも二本鎖の核酸分子
を含み、ここで、該第1のNARSを認識するニック形成剤、DNAポリメラーゼ、および1つ以上のヌクレオシド三リン酸の存在下で、テンプレートとして該第1の核酸分子を用いて増幅された一本鎖核酸フラグメントは、多くて25ヌクレオチドを有する、組成物。 - 前記第1のNARSが第1のニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)によって認識可能であり、そして前記第2のNARSが第2のNEによって認識可能である、請求項82に記載の組成物。
- 前記第1のNARSが第1の制限エンドヌクレアーゼ(RE)によって認識可能であり、そして前記第2のNARSが第2のREによって認識可能である、請求項82に記載の組成物。
- 前記第1の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子が固定化されている、請求項82に記載の組成物。
- 前記第2の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子が固定化されている、請求項85に記載の組成物。
- 配列(b)(ii)が、前記第1の核酸分子中の前記第1のNARSの前記センス鎖の配列の3’側に位置する配列に正確に相補的である、請求項82に記載の組成物。
- 前記第1のNARSが、前記第2のNARSと同一である、請求項82に記載の組成物。
- 前記第1および第2のNARSが、1つのNEにより認識可能である、請求項88に記載の組成物。
- 前記第1のNARSを認識する第1のNAおよび前記第2のNARSを認識する第2のNAをさらに含む、請求項72または82に記載の組成物。
- 前記第1および第2のNARSの両方を認識するNAをさらに含む、請求項80または88に記載の組成物。
- 前記第1および第2のNARSの両方を認識するNEをさらに含む、請求項81または89に記載の組成物。
- 前記NEが、N.BstNB Iである、請求項93に記載の組成物。
- DNAポリメラーゼをさらに含む、請求項74、82、および90のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記DNAポリメラーゼが、exo−Vent、exo−Deep Vent、exo−Bst、exo−Pfu、exo−Bca、DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメント、T5 DNAポリメラーゼ、Phi29 DNAポリメラーゼ、ファージM2 DNAポリメラーゼ、ファージPhiPRD1 DNAポリメラーゼ、シーケナーゼ、PRD1 DNAポリメラーゼ、9°NmTMDNAポリメラーゼ、およびT4 DNAポリメラーゼホモエンザイムからなる群より選択される、請求項94に記載の組成物。
- 前記5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼが、exo−Bstポリメラーゼ、exo−Bcaポリメラーゼ、exo−Ventポリメラーゼ、exo−Deep Ventポリメラーゼ、または9°NmTMDNAポリメラーゼである、請求項94に記載の組成物。
- ゲノム核酸またはcDNA分子における遺伝子バリエーションを同定する方法であって、ここで、遺伝子バリエーションが、ゲノム核酸またはcDNA分子中の第1のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)のアンチセンス鎖の配列の5’側に位置し、該方法は、以下の(A)〜(C)の工程:
(A)以下の(i)〜(iii):
(i)ゲノム核酸またはcDNA分子、
(ii)3’から5’にむかって、以下の(a)および(b):
(a)該第1のNERSの該アンチセンス鎖の配列の5’側に位置するゲノム核酸またはcDNA分子の一部に少なくとも実質的に同一の配列、および
(b)第2のNERSのセンス鎖の配列
を含む、一本鎖核酸分子(T2)、ならびに
(iii)該第1のNERSを認識する第1のニック形成エンドヌクレアーゼ(NE);該第2のNERSを認識する第2のNE、DNAポリメラーゼ、および1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸、
を含む混合物を形成する工程;
(B)該混合物を、一本鎖核酸分子(A2)を指数関数的に増幅する条件で維持する工程;ならびに
(C)該ゲノム核酸またはcDNA分子中の該遺伝子バリエーションを同定するためにA2を特徴付ける工程、
を包含する、方法。 - 前記第1のNERSが、前記第2のNERSと同一である、請求項97に記載の方法。
- 標的核酸中の規定された位置の遺伝子バリエーションを同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)第1のオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第2のODNP、および該標的核酸の混合物を形成する工程であって、ここで、
(i)該標的核酸が、第1の鎖および第2の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
該第1のODNPは、第1のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)のセンス鎖のヌクレオチド配列および該遺伝子バリエーションの相補鎖の3’側に位置する該標的核酸の該第1の鎖のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして、
該第2のODNPは、該遺伝子バリエーションの3’側に位置する該標的核酸の該第2の鎖のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして必要に応じて、制限エンドヌクレアーゼ認識配列(RERS)の1つの鎖の配列を含むか、
または、
(ii)該標的核酸が一本鎖核酸である場合、
該第1のODNPは、第1のNERSのセンス鎖のヌクレオチド配列および該遺伝子バリエーションの5’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に同一のヌクレオチド配列を含み、そして
該第2のODNPは、該遺伝子バリエーションの3’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして必要に応じて、RERSを含む、工程;
(b)該第1および該第2のODNPを伸長して、該第1のODNPおよび該第2のODNPを含む伸長産物を生成する工程;
(c)必要に応じて、工程(b)の伸長産物を、該RERSを認識する制限エンドヌクレアーゼで消化し、消化産物を生成する工程;
(d)該第1のNERSを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)の存在下で、工程(b)の伸長産物または工程(c)の消化産物の1つの鎖をテンプレートとして用いて第1の一本鎖核酸フラグメント(A1)を増幅する工程;
(e)A1にアニーリングする第2の一本鎖核酸分子(T2)を提供する工程であって、該T2は、5’から3’にむかって、以下の(i)および(ii):
(i)第2のNERSのセンス鎖の配列、および
(ii)A1に少なくとも実質的に相補的な配列、
を含む、工程;
(f)テンプレートとしてA1を用いて第3の一本鎖核酸フラグメント(A2)を増幅する工程;ならびに
(e)該標的核酸中の該遺伝子バリエーションを同定するためにA2を特徴付ける工程、
を包含し、ここで、A1、A2、またはこれら両方が多くて25ヌクレオチドを有する、方法。 - 前記第1のNERSが、前記第2のNERSと同一である、請求項99に記載の方法。
- 標的核酸中の規定された位置の遺伝子バリエーションを同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)第1のODNP、第2のODNP、および該標的核酸の混合物を形成する工程であって、ここで、
(i)該標的核酸が、第1の鎖および第2の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
該第1のODNPは、第1の制限エンドヌクレアーゼ認識配列(RERS)の1つの鎖のヌクレオチド配列および該遺伝子バリエーションの相補鎖の3’側に位置する該標的核酸の該第1の鎖のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして、
該第2のODNPは、第2のRERSの1つの鎖のヌクレオチド配列および該遺伝子バリエーションの3’側に位置する該標的核酸の該第2の鎖のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むか、
または、
(ii)該標的核酸が一本鎖核酸である場合、
該第1のODNPは、第1のRERSの1つの鎖のヌクレオチド配列および該遺伝子バリエーションの相補鎖の5’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に同一のヌクレオチド配列を含み、そして
該第2のODNPは、第2のRERSの1つの鎖の配列および該遺伝子バリエーションの3’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、工程;
(b)デオキシリボヌクレオシド三リン酸および少なくとも1つの改変されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で該第1および該第2のODNPを伸長して、該第1および該第2のRERSの両方を含む伸長産物を生成する工程;
(c)該第1のRERSおよび該第2のRERSを認識する制限エンドヌクレアーゼ(RE)の存在下で、工程(b)の伸長産物をテンプレートとして使用して一本鎖核酸フラグメントを指数関数的に増幅する工程であって、該一本鎖核酸フラグメントは、25ヌクレオチド長以下である、工程;ならびに
(d)該遺伝子バリエーションを同定するために、工程(c)の一本鎖フラグメントの少なくとも1つを特徴付ける工程、
を包含する、方法。 - 前記第1のRERSが、前記第2のRERSと同一である、請求項101に記載の方法。
- 前記第1のODNP、前記第2のODNP、または両方のODNPが固定化されている、請求項101に記載の方法。
- 前記標的核酸が固定化されている、請求項101に記載の方法。
- 標的核酸中の規定された位置の遺伝子バリエーションを同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)第1のODNP、第2のODNP、および該標的核酸の混合物を形成する工程であって、ここで、
(i)該標的核酸が、第1の鎖および第2の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
該第1のODNPは、第1の制限エンドヌクレアーゼ認識配列(RERS)の1つの鎖のヌクレオチド配列および該遺伝子バリエーションの相補鎖の3’側に位置する該標的核酸の該第1の鎖のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして、
該第2のODNPは、第2のRERSの1つの鎖のヌクレオチド配列および該遺伝子バリエーションの3’側に位置する該標的核酸の該第2の鎖のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むか、
または、
(ii)該標的核酸が一本鎖核酸である場合、
該第1のODNPは、第1のRERSの1つの鎖のヌクレオチド配列および該遺伝子バリエーションの相補鎖の5’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に同一のヌクレオチド配列を含み、そして
該第2のODNPは、第2のRERSの1つの鎖の配列および該遺伝子バリエーションの3’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、工程;
(b)デオキシリボヌクレオシド三リン酸および少なくとも1つの改変されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で該第1および該第2のODNPを伸長して、該第1および該第2のRERSの両方を含む伸長産物を生成する工程;
(c)該第1のRERSおよび該第2のRERSを認識する制限エンドヌクレアーゼ(RE)の存在下で、テンプレートとして工程(b)の伸長産物の1つの鎖を用いて、第1の一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程;ならびに
(d)A1にアニーリングする第2の一本鎖核酸分子(T2)を提供する工程であって、該T2は、5’から3’にむかって、以下の(i)および(ii):
(i)第3のRERSのセンス鎖の配列、および
(ii)A1に少なくとも実質的に相補的な配列、
を含む、工程;
(e)テンプレートとしてA1を用いて第3の一本鎖核酸フラグメント(A2)を増幅する工程;ならびに
(f)該遺伝子バリエーションを同定するために、工程(c)の一本鎖フラグメントの少なくとも1つを特徴付ける工程、
を包含する、方法。 - 前記第1、第2、および第3のRERSが、互いに同一である、請求項105に記載の方法。
- 標的核酸中の規定された位置の遺伝子バリエーションを同定する方法であって、該方法は、以下:
(a)第1のオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第2のODNP、および該標的核酸の混合物を形成する工程であって、ここで、
(i)該標的核酸が、第1の鎖および第2の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
該第1のODNPは、該遺伝子バリエーションの相補鎖の3’側に位置する該標的核酸の該第1の鎖のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして、
該第2のODNPは、該遺伝子バリエーションの3’側に位置する該標的核酸の該第2の鎖のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むか、
または、
(ii)該標的核酸が一本鎖核酸である場合、
該第1のODNPは、該遺伝子バリエーションの5’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に同一のヌクレオチド配列を含み、そして
該第2のODNPは、該遺伝子バリエーションの3’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、
該第1および該第2のODNPは各々、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)のセンス鎖のヌクレオチド配列をさらに含む、工程;
(b)該第1および該第2のODNPを伸長して、2つのNERSを含む伸長産物を生成する工程;
(c)該NERSを認識する1つ以上のニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)の存在下で、テンプレートとして工程(b)の伸長産物を用いて一本鎖核酸フラグメントを指数関数的に増幅する工程であって、該一本鎖核酸フラグメントは、多くて25ヌクレオチドを有する、工程;ならびに
(d)工程(c)の一本鎖フラグメントの少なくとも1つを特徴付けることによって、該遺伝子バリエーションを同定する工程、
を包含する、方法。 - 前記第1のODNP中の前記NERSが、前記第2のODNP中の前記NERSと同一である、請求項107に記載の方法。
- 前記遺伝子バリエーションが、単一ヌクレオチド多型である、請求項107に記載の方法。
- 前記遺伝子バリエーションが、疾患に関連する、請求項107に記載の方法。
- 前記疾患が、ヒトの遺伝的疾患である、請求項107に記載の方法。
- 前記遺伝子バリエーションが、病原性微生物の薬物耐性と関連する、請求項107に記載の方法。
- 前記ニック形成剤が、N.BstNB Iである、請求項108に記載の方法。
- 前記工程(c)が、等温条件下で実施される、請求項107に記載の方法。
- 前記工程(c)が、50℃〜70℃で実施される、請求項114に記載の方法。
- 前記工程(c)が、exo−Vent、exo−Deep Vent、exo−Bst、exo−Pfu、exo−Bca、DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメント、T5 DNAポリメラーゼ、Phi29 DNAポリメラーゼ、ファージM2 DNAポリメラーゼ、ファージPhiPRD1 DNAポリメラーゼ、シーケナーゼ、PRD1 DNAポリメラーゼ、9°NmTMDNAポリメラーゼ、およびT4 DNAポリメラーゼホモエンザイムからなる群より選択されるDNAポリメラーゼの存在下で実施される、請求項107に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼが、exo−Ventポリメラーゼ、exo−Deep Ventポリメラーゼ、exo−Bstポリメラーゼ、exo−Bcaポリメラーゼ、または9°NmTMDNAポリメラーゼである、請求項116に記載の方法。
- 前記工程(c)の前記増幅された一本鎖フラグメントが、17ヌクレオチド以下を含む、請求項107に記載の方法。
- 前記工程(c)の前記増幅された一本鎖フラグメントが、12ヌクレオチド以下を含む、請求項118に記載の方法。
- 前記工程(c)の前記増幅された一本鎖フラグメントが、8ヌクレオチド以下を含む、請求項119に記載の方法。
- 前記工程(d)の特徴付けが、少なくとも部分的に、質量分析、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光、および電気泳動からなる群より選択される技術の使用により実施される、請求項107に記載の方法。
- 前記工程(d)の特徴付けが、少なくとも部分的に、液体クロマトグラフィーの使用により実施される、請求項121に記載の方法。
- 前記工程(d)の特徴付けが、少なくとも部分的に、質量分析の使用により実施される、請求項121に記載の方法。
- 前記工程(d)の特徴付けが、少なくとも部分的に、液体クロマトグラフィーおよび質量分析の両方により実施される、請求項121に記載の方法。
- 前記第1のODNP、前記第2のODNP、またはその両方が固定化されている、請求項107に記載の方法。
- 前記標的核酸が固定化されている、請求項107に記載の方法。
- 標的核酸中の規定された位置の遺伝的バリエーションを同定するための方法であって、該方法は、以下:
(a)第一のオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第二のODNP、および該サンプルの核酸分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
(i)該標的核酸が第一の鎖および第二の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
該第一のODNPは、該遺伝的バリエーションの相補鎖の3’側に位置する標的核酸の第一の鎖のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして
該第二のODNPは、該遺伝的バリエーションの3’側に位置する標的核酸の第二の鎖のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むか、
または、
(ii)該標的核酸が一本鎖核酸である場合、
該第一のODNPは、該遺伝的バリエーションの5’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含み、そして
該第二のODNPは、該遺伝的バリエーションの3’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、工程であって、
該第一のODNPおよび該第二のODNPは、各々、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)のセンス鎖のヌクレオチド配列をさらに含む、工程;
(b)該第一のODNPおよび該第二のODNPを伸長して、2つのNERSを含む伸長産物を産生する工程;
(c)該NERSを認識する1つ以上のニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)の存在下で、テンプレートとして工程(b)の伸長産物の一方の鎖を用いて第一の一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程;
(d)A1にアニーリングするような第二の一本鎖核酸分子(T2)を提供する工程であって、T2は、5’から3’の方向で、以下:
(i)NERSのセンス鎖の配列、および
(ii)A1に少なくとも実質的に相補的な配列
を含む工程;
(e)テンプレートとしてA1を用いて、第三の一本鎖核酸フラグメント(A2)を増幅する工程;
(f)工程(c)の一本鎖核酸フラグメントを特徴付け、それにより該遺伝的バリエーションを同定する工程、
を包含し、ここで、A1、A2またはこれらの両方が長くても25のヌクレオチドを有する、方法。 - 前記第一のODNP中のNERS、前記第二のODNP中のNERS、およびT2中のNERSが互いに同一である、請求項127に記載の方法。
- 前記遺伝的バリエーションが、一塩基多型である、請求項127に記載の方法。
- 前記遺伝的バリエーションが、疾患に関連する、請求項127に記載の方法。
- 前記疾患が、ヒト遺伝病である、請求項127に記載の方法。
- 前記遺伝的バリエーションが病原性微生物の薬物耐性に関連する、請求項127に記載の方法。
- 前記ニック形成剤が、N.BstNB Iである、請求項128に記載の方法。
- 工程(c)が、等温条件下で実施される、請求項127に記載の方法。
- 工程(c)が、50℃〜70℃で実施される、請求項134に記載の方法。
- 工程(c)が、exo−Vent、exo−Deep Vent、exo−Bst、exo−Pfu、exo−Bca、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、T5 DNAポリメラーゼ、Phi29 DNAポリメラーゼ、ファージM2 DNAポリメラーゼ、ファージPhiPRD1 DNAポリメラーゼ、Sequenase、RPD1 DNAポリメラーゼ、9°NmTMDNAポリメラーゼおよびT4 DNAポリメラーゼホモエンザイムからなる群より選択される、DNAポリメラーゼの存在下で実施される、請求項127に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼが、exo−Vent、exo−Deep Vent、exo−Bst、exo−Bca、または9°NmTMDNAポリメラーゼである、請求項136に記載の方法。
- 前記工程(c)の増幅された一本鎖フラグメントが、17以下のヌクレオチドを含む、請求項127に記載の方法。
- 前記工程(c)の増幅された一本鎖フラグメントが、12以下のヌクレオチドを含む、請求項138に記載の方法。
- 前記工程(c)の増幅された一本鎖フラグメントが、8以下のヌクレオチドを含む、請求項139に記載の方法。
- 工程(d)の特徴付ける工程が、質量分析法、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光法、および電気泳動より選択される技術を少なくとも部分的に用いることにより実施される、請求項127に記載の方法。
- 工程(d)の特徴付ける工程が、液体クロマトグラフィーを少なくとも部分的に用いることによって実施される、請求項141に記載の方法。
- 工程(d)の特徴付ける工程が、質量分析法を少なくとも部分的に用いることによって実施される、請求項141に記載の方法。
- 工程(d)の特徴付ける工程が、液体クロマトグラフィーおよび質量分析法の両方を少なくとも部分的に用いることによって実施される、請求項141に記載の方法。
- 前記第一のODNP、前記第二のODNP、またはそれらの両方が、固定されている、請求項127に記載の方法。
- 前記標的核酸が、固定されている、請求項127に記載の方法。
- サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下:
(A)以下を含む混合物を形成する工程:
(i)該サンプルの核酸分子
(ii)第一の一本鎖核酸分子(T1)であって、該第一の一本鎖核酸分子は、3’から5’の方向で、以下:
(a)該標的核酸に少なくとも実質的に相補的である第一の配列、
(b)第一のニック形成剤認識配列(NARS)のアンチセンス鎖の配列、および
(c)長くても25ヌクレオチドを有する第二の配列
を含む、第一の一本鎖核酸分子、
(iii)第二の一本鎖核酸分子(T2)であって、該第二の一本鎖核酸分子は、3’から5’の方向で、以下:
(a)該T1の第二の配列と少なくとも実質的に同一である配列、および
(b)第二のNARSのセンス鎖の配列
を含む、第二の一本鎖核酸分子;ならびに
(iv)該第一のNARSを認識する第一のニック形成エンドヌクレアーゼ(NA)、該第二のNARSを認識する第二のNA、DNAポリメラーゼ、および1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;
(B)該標的核酸が該サンプル中に存在する場合、一本鎖核酸分子(A2)を指数関数的に増幅する条件で該混合物を維持する工程;ならびに
(C)A2の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記第一のNARSおよび前記第二のNARSが同一であり、かつ1つのニック形成エンドヌクレアーゼにより認識可能である、請求項147に記載の方法。
- 前記T1が固定されている、請求項147に記載の方法。
- 前記T2が固定されている、請求項147に記載の方法。
- 前記標的核酸が、固定されている、請求項147に記載の方法。
- サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下:
(A)以下を含む混合物を形成する工程:
(i)該サンプルの核酸分子
(ii)第一の一本鎖核酸分子(T1)であって、該第一の一本鎖核酸分子は、3’から5’の方向で、以下:
(a)該標的核酸に少なくとも実質的に相補的である第一の配列、および
(b)第一のニック形成剤認識配列(NARS)のセンス鎖の配列、
を含む、第一の一本鎖核酸分子、
(iii)第二の一本鎖核酸分子(T2)であって、該第二の一本鎖核酸分子は、3’から5’の方向で、以下:
(a)該第一のNARSのセンス鎖の配列の3’側に位置するT1の配列に少なくとも実質的に相補的な配列、および
(b)第二のNARSのセンス鎖の配列
を含む、第二の一本鎖核酸分子;ならびに
(iv)該第一のNARSを認識する第一のニック形成エンドヌクレアーゼ(NA)、該第二のNARSを認識する第二のNA、DNAポリメラーゼ、および1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;
(B)一本鎖核酸分子(A2)を増幅する条件で該混合物を維持する工程であって、該一本鎖核酸分子は、
(i)該標的核酸に少なくとも実質的に相補的であり、かつ
(ii)長くても25ヌクレオチドを有する、
工程;ならびに
(C)A2の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記第一のNARSと前記第二のNARSとが、同一である、請求項152に記載の方法。
- 前記T1が固定されている、請求項152に記載の方法。
- 前記T2が固定されている、請求項152に記載の方法。
- 前記標的配列が固定されている、請求項152に記載の方法。
- サンプル中の、第一のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)を含む標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下:
(A)以下を含む混合物を形成する工程:
(i)該サンプルの核酸分子
(ii)一本鎖核酸分子(T2)であって、該一本鎖核酸分子は、3’から5’の方向で、以下:
(a)該第一のNERSのアンチセンス鎖の配列の5’側に位置する標的核酸の位一部分に少なくとも実質的に相補的である配列、および
(b)第二のNERSのセンス鎖の配列、
を含む、一本鎖核酸分子、
(iii)該第一のNERSを認識する第一のニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)、該第二のNERSを認識する第二のNE、DNAポリメラーゼ、および1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸;
(B)該標的核酸が該サンプル中に存在する場合に、一本鎖核酸分子(A2)を指数関数的に増幅する条件で該混合物を維持する工程;ならびに
(C)A2の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記第一のNERSが、前記第二のNERSと同一である、請求項157に記載の方法。
- サンプル中の、第一のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)を含む標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下:
(A)以下:
(i)該標的核酸分子
(ii)第一の一本鎖核酸分子(T1)であって、該第一の一本鎖核酸分子は、該標的核酸の1つの鎖に実質的に同一であり、かつ該第一のNERSのアンチセンス鎖の配列を含む、第一の一本鎖核酸分子、
(iii)第二の一本鎖核酸分子(T2)であって、該第二の一本鎖核酸分子は、3’から5’の方向で、以下:
(a)該第一のNERSのアンチセンス鎖の配列の5’側に位置するT1の一部分に少なくとも実質的に同一な配列、および
(b)第二のNERSのセンス鎖の配列
を含む、第二の一本鎖核酸分子;
(iv)該第一のNERSを認識する第一のニック形成エンドヌクレアーゼ(NE);該第二のNERSを認識する第二のNE、DNAポリメラーゼ、および1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸、
を含む混合物を形成する工程;
(B)該標的核酸が該サンプル中に存在する場合に、一本鎖核酸分子(A2)を指数関数的に増幅する条件で該混合物を維持する工程;ならびに
(C)A2の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記第一のNERSが、前記第二のNERSと同一である、請求項159に記載の方法。
- A2が、長くても25ヌクレオチドを有する、請求項159に記載の方法。
- 前記T1が固定されている、請求項159に記載の方法。
- 前記標的核酸が固定されている、請求項159に記載の方法。
- サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下:
(A)第一のオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第二のODNP、および該サンプルの核酸分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
(i)該標的核酸が第一の鎖および第二の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
該第一のODNPは、第一の制限エンドヌクレアーゼ認識配列(RERS)のセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的核酸の第一の鎖の第一の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして
該第二のODNPは、該標的核酸の第二の鎖の第二の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ第二のRERSのセンス鎖の配列を含み、該第二の部分は、該標的核酸の第二の鎖の中の第一の部分の相補鎖の3’側に位置するか、
または、
(ii)該標的核酸が一本鎖核酸である場合、
該第一のODNPは、第一のRERSのセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的核酸の第一の部分と少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
該第二のODNPは、該標的核酸の第二の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ第二のRERSのセンス鎖の配列を含み、該第二の部分は、該標的核酸の中の第一の部分の相補鎖の5’側に位置する、工程;
(B)該混合物を、以下の条件:該標的核酸が該サンプル中に存在する場合、該第一のRERSおよび該第二のRERSを認識する制限エンドヌクレアーゼ(RE)、デオキシリボヌクレオシド三リン酸ならびに少なくとも1つの改変されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸、ならびにDNAポリメラーゼの存在下で、一本鎖核酸フラグメント(A2)を指数関数的に増幅する条件で維持する工程であって、ここで、A2は、25ヌクレオチド長以下である、工程;ならびに
(C)A2の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記第一のRERSが、前記第二のRERSと同一である、請求項164に記載の方法。
- サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下:
(A)第一のオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第二のODNP、および該サンプルの核酸分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
(i)該標的核酸が第一の鎖および第二の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
該第一のODNPは、第一のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)のセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的核酸の第一の鎖の第一の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして
該第二のODNPは、該標的核酸の第二の鎖の第二の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ第二のRERSのセンス鎖の配列を含み、該第二の部分は、該標的核酸の第二の鎖の中の第一の部分の相補鎖の3’側に位置するか、
または、
(ii)該標的核酸が一本鎖核酸である場合、
該第一のODNPは、第一のNERSのセンス鎖の配列、および該標的核酸の第一の部分と少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
該第二のODNPは、該標的核酸の第二の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ第二のNERSのセンス鎖の配列を含み、該第二の部分は、該標的核酸の中の第一の部分の相補鎖の5’側に位置する、工程;
(B)該混合物を、以下の条件:該標的核酸が該サンプル中に存在する場合、該第一のNERSおよび該第二のNERSを認識するニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ならびにDNAポリメラーゼの存在下で、一本鎖核酸フラグメント(A2)を指数関数的に増幅する条件で維持する工程であって、ここで、A2は、25ヌクレオチド長以下である、工程;ならびに
(C)A2の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記第一のRERSが、前記第二のRERSと同一である、請求項166に記載の方法。
- サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下:
(A)第一のオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第二のODNP、および該サンプルの核酸分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
(i)該標的核酸が第一の鎖および第二の鎖を有する二本鎖核酸である場合に、
該第一のODNPは、第一のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)のセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的核酸の第一の鎖の第一の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして
該第二のODNPは、該標的核酸の第二の鎖の第二の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ第二のNERSのセンス鎖の配列を含み、該第二の部分は、該標的核酸の第二の鎖の中の第一の部分の相補鎖の3’側に位置するか、
または、
(ii)該標的核酸が一本鎖核酸である場合、
該第一のODNPは、第一のNERSのセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的核酸の第一の部分と少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
該第二のODNPは、該標的核酸の第二の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ第二のNERSのセンス鎖の配列を含み、該第二の部分は、該標的核酸の中の第一の部分の相補鎖の5’側に位置する、工程;
(B)該混合物を、以下の条件:該標的核酸が該サンプル中に存在する場合、
(i)該第一のODNPおよび該第二のODNPを伸長して、該第一のNERSおよび該第二のNERSの両方を含む伸長産物を産生し;
(ii)該第一のNERSおよび該第二のNERSを認識する1つ以上のニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)の存在下で、テンプレートとして工程(b)の伸長産物の一方の鎖を用いて第一の一本鎖核酸フラグメント(A1)を増幅し;
(iii)A1にアニーリングし得る第二の一本鎖核酸分子(T2)の存在下で、テンプレートとしてA1を用いて、第三の一本鎖核酸フラグメント(A2)を増幅する条件であって、ここで、A1、A2またはこれらの両方が、長くても25ヌクレオチドを有し、そして、ここで、T2が、5’から3’の方向で、以下:
(a)第三のNERSのセンス鎖の配列、および
(b)A1に少なくとも実質的に相補的である配列
を含む、条件、
に供する工程;ならびに
(C)A2の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記第一、第二および第三のNERSが同一である、請求項168に記載の方法。
- サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程:
(A)以下:
(i)該サンプルの核酸分子、
(ii)一本鎖核酸プローブ(T1)であって、該一本鎖核酸プローブ(T1)は、3’から5’の方向で、該標的核酸の5’部分と少なくとも実質的に相補的な配列、および第一のニック形成剤認識配列(NARS)のアンチセンス鎖の配列を含む、一本鎖核酸プローブ(T1)、
を含む混合物を形成する工程;
(B)存在する場合、該標的核酸にハイブリダイズしたプローブ分子を、該標的核酸にハイブリダイズしなかったプローブ分子から分離する工程;
(C)存在する場合、該標的核酸にハイブリダイズしたプローブ分子、および該第一のNARSを認識する第一のニック形成剤(NA)の存在下で、増幅反応を実施する工程;
(D)一本鎖核酸分子(T2)を提供する工程であって、該一本鎖核酸分子(T2)は、5’から3’の方向で、以下:
(i)第二のNARSのセンス鎖の配列、および
(ii)該第一のNARSのアンチセンス鎖の配列に対して5’側に位置する該第一の一本鎖核酸プローブの一部と少なくとも実質的に同一である配列、
を含む、工程;
(E)該第二のNARSを認識する第二のNAの存在下で増幅反応を実施する工程;
(F)工程(E)の増幅産物の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記第一のNARSおよび第二のNARSが同一である、請求項170に記載の方法。
- 前記サンプルの核酸分子が、一本鎖であるかまたは一本鎖に変性されており、そしてその5’末端を介して固定化されている、請求項170に記載の方法。
- 前記サンプルの核酸分子が固定化されている、請求項170に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸プローブT1が固定化されている、請求項170に記載の方法。
- サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程:
(A)以下:
(i)該サンプルの核酸分子、
(ii)部分的に二本鎖の核酸プローブであって、該部分的に二本鎖の核酸プローブは、以下:
(a)第一のNARSのセンス鎖の配列、該第一のNARSのアンチセンス鎖の配列またはこれら両方;および
(b)該鎖自体またはその伸長産物が、該第一のNARSを認識する第一のニック形成剤(NA)によってニック形成可能なニック形成部位(NS)を含む、該鎖中の5’オーバーハング、または
該鎖もその伸長産物も該NSを含まない、該鎖中の3’オーバーハングを含む、部分的に二本鎖の核酸プローブ、
を含む混合物を形成する工程であって、ここで、各オーバーハングは、該標的核酸と少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含む、工程;
(B)存在する場合、該標的核酸にハイブリダイズしたプローブ分子を、該標的核酸にハイブリダイズしなかったプローブ分子から分離する工程;
(C)存在する場合、該標的核酸にハイブリダイズしたプローブ分子、および該第一のNARSを認識する第一のニック形成剤(NA)の存在下で、増幅反応を実施する工程;
(D)一本鎖核酸分子(T2)を提供する工程であって、該一本鎖核酸分子(T2)は、5’から3’の方向で、以下:
(i)第二のNARSのセンス鎖の配列、および
(ii)該第一のNARSのアンチセンス鎖の配列の5’側に位置する該核酸プローブの一部と少なくとも実質的に相同な配列、
を含む、工程;
(E)該第二のNARSを認識する第二のNAの存在下で増幅反応を実施する工程;
(F)工程(E)の増幅産物の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記第一のNARSおよび第二のNARSが同一である、請求項175に記載の方法。
- 前記サンプルの核酸分子が固定化されている、請求項175に記載の方法。
- cDNA分子中の2つの特定のエキソン間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程:
(A)少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子(N1)を提供する工程であって、該少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子(N1)は、以下:
(i)第一のニック形成剤認識配列(NARS)のセンス鎖の配列および該第一のNARSのアンチセンス鎖の配列のうち、少なくとも1つ、ならびに
(ii)該cDNA分子の一部の少なくとも1つの鎖であって、該一部は、該2つのエキソン間の連結部を含むと疑われる、一部、
を含む、工程;
(B)第一のNARSを認識するニック形成剤(NA)、DNAポリメラーゼおよび1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、第一の一本鎖核酸分子(A1)を増幅する工程であって、ここで、該増幅する工程は、該cDNAの一部を該ポリメラーゼについてのテンプレートとして使用する、工程;
(C)第二の一本鎖核酸分子(T2)を提供する工程であって、該第二の一本鎖核酸分子(T2)は、5’から3’の方向で、以下:
(i)第二のNARSのセンス鎖の配列、および
(ii)A1と少なくとも実質的に相補的な配列、
を含む、工程;
(D)T2、A1、該第一のNA、該第二のNARSを認識する第二のNA、該DNAポリメラーゼ、および該デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、第三の一本鎖核酸分子(A2)を増幅する工程であって、ここで、A2は、A1と少なくとも実質的に相補的である、工程;ならびに
(E)A2を検出および/または特徴づけして、該cDNA分子中の連結部の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記第一のNARSが、前記第二のNARSと同一である、請求項178に記載の方法。
- 前記第一のNAおよび前記第二のNAの両方が、ニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)である、請求項178に記載の方法。
- 前記第一のNAおよび前記第二のNAの両方が、N.BatNB Iである、請求項180に記載の方法。
- 前記第一のNAおよび前記第二のNAの両方が、ニック形成エンドヌクレアーゼ(NE)である、請求項179に記載の方法。
- 前記工程(A)〜(D)が単一の容器中で実施される、請求項178に記載の方法。
- 前記N1が、前記第一のNARSのアンチセンス鎖の配列を含む、請求項178に記載の方法。
- 前記N1が、前記第一のNARSのセンス鎖の配列を含む、請求項178に記載の方法。
- 前記第一のNAおよび前記第二のNAの両方が、制限エンドヌクレアーゼ(RE)であり、そして前記ヌクレオシド三リン酸のうち少なくとも1つが改変されている、請求項185に記載の方法。
- 前記A1が、8〜24ヌクレオチド長である、請求項178に記載の方法。
- 前記A1が、12〜17ヌクレオチド長である、請求項187に記載の方法。
- 前記A2が、8〜24ヌクレオチド長である、請求項178に記載の方法。
- 前記A2が、12〜17ヌクレオチド長である、請求項189に記載の方法。
- 前記工程(B)および(D)の各々が、等温条件下で実施される、請求項178に記載の方法。
- 前記工程(B)および(D)の各々が、50℃〜70℃で実施される、請求項191に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼが、5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損である、請求項178に記載の方法。
- 請求項193に記載の方法であって、前記5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼが、exo−Vent、exo−DeepVent、exo−Bst、exo−Pfu、exo−Bca、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、T5 DNAポリメラーゼ、Phi29 DNAポリメラーゼ、ファージM2 DNAポリメラーゼ、ファージPhiPRD1 DNAポリメラーゼ、Sequenase、RPD1 DNAポリメラーゼ、9°NmTMポリメラーゼおよびT4 DNAポリメラーゼホモエンザイムからなる群より選択される、方法。
- 請求項194に記載の方法であって、前記5’→3’エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼが、exo−Bstポリメラーゼ、exo−Bcaポリメラーゼ、exo−Ventポリメラーゼ、exo−DeepVentポリメラーゼまたは9°NmTMポリメラーゼである、方法。
- 前記DNAポリメラーゼが、鎖置換活性を有する、請求項178に記載の方法。
- 前記工程(B)および(D)の各々が、鎖置換活性促進因子の存在下で実施される、請求項178に記載の方法。
- 請求項197に記載の方法であって、前記鎖置換促進因子が、BMRF1ポリメラーゼアクセサリーサブユニット、アデノウイルスDNA結合タンパク質、単純疱疹ウイルスタンパク質ICP8、一本鎖DNA結合タンパク質、ファージT4遺伝子32タンパク質、ウシ胸腺ヘリカーゼおよびトレハロースからなる群より選択される、方法。
- 前記鎖置換促進因子が、トレハロースである、請求項198に記載の方法。
- 請求項178に記載の方法であって、前記工程(E)が、質量分析法、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光および電気泳動からなる群より選択される技術の使用によって、少なくとも部分的に実施される、方法。
- 前記工程(E)が、液体クロマトグラフィーの使用によって、少なくとも部分的に実施される、請求項200に記載の方法。
- 前記工程(E)が、質量分析法の使用によって、少なくとも部分的に実施される、請求項200に記載の方法。
- 前記N1が固定化されている、請求項178に記載の方法。
- 前記T2が固定化されている、請求項203に記載の方法。
- cDNA分子中の2つのエキソン間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、ここで、該連結部は、存在する場合、該cDNA分子中の第一のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列(NERS)のアンチセンス鎖の配列に対して5’側に位置し、該方法は、以下の工程:
(A)以下:
(i)cDNA分子、
(ii)一本鎖核酸分子(T2)であって、該一本鎖核酸分子(T2)は、3’から5’の方向で、以下:
(a)該第一のNERSのアンチセンス鎖の配列に対して5’側に位置する該cDNA分子の一部と少なくとも実質的に同一な配列、および
(b)第二のNERSのセンス鎖の配列、
を含む、一本鎖核酸分子(T2)、ならびに
(iii)該第一のNERSを認識する第一のニック形成エンドヌクレアーゼ(NE);該第二のNERSを認識する第二のNE、DNAポリメラーゼ、および1つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸、
を含む混合物を形成する工程;
(B)一本鎖核酸分子(A2)を指数関数的に増幅する条件下で該混合物を維持する工程;ならびに
(C)該A2を特徴付けて、該cDNA分子中の連結部の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記第一のNERSが、前記第二のNERSと同一である、請求項205に記載の方法。
- cDNA分子中の遺伝子の上流エキソン(Exon A)と下流エキソン(Exon B)との間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程:
(A)第一のオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第二のODNPおよび該cDNA分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
(i)該第一のODNPは、アンチセンス鎖中のExon Aの5’末端の近傍に、Exon Aのアンチセンス鎖の一部と少なくとも実質的に相補的な配列を含み、
(ii)該第二のODNPは、センス鎖中のExon Bの5’末端の近傍に、Exon Bのセンス鎖の一部と少なくとも実質的に相補的な配列を含み、そして
(iii)該第一のODNPおよび該第二のODNPのうち少なくとも1つは、第一のニック形成剤認識配列(NARS)のセンス鎖の配列をさらに含む、工程;ならびに
(B)Exon AおよびExon Bの両方が該cDNA中に存在する場合、第一の一本鎖核酸(A1)を増幅する条件下で、該第一のNARSを認識するニック形成剤(NA)の存在下で、第一の増幅反応を実施する工程;
(C)第二の一本鎖核酸分子(T2)を提供する工程であって、該第二の一本鎖核酸分子(T2)は、5’から3’の方向で、以下:
(i)第二のNARSのセンス鎖の配列、および
(ii)A1と少なくとも実質的に相補的な配列、
を含む、工程;
(D)Exon AおよびExon Bの両方が該cDNA中に存在する場合、A1をテンプレートとして使用して、第三の一本鎖核酸フラグメント(A2)を増幅する条件下で、該第二のNARSを認識する第二のNAの存在下で第二の増幅反応を実施する工程;ならびに
(G)該A2を検出および/または特徴付けて、該cDNA分子中のExon AとExon Bとの間の連結部の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記第一のNARSが前記第二のNARSと同一である、請求項207に記載の方法。
- 前記cDNA分子が固定化されている、請求項207に記載の方法。
- 前記第一のODNP、前記第二のODNPまたはこれら両方が固定化されている、請求項207に記載の方法。
- cDNA分子中の遺伝子の上流エキソン(Exon A)と下流エキソン(Exon B)との間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程:
(A)第一のオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第二のODNPおよび該cDNA分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
(i)該第一のODNPが、以下:
(a)アンチセンス鎖中のExon Aの5’末端の近傍に、Exon Aのアンチセンス鎖の一部と少なくとも実質的に相補的な配列、および
(b)第一のニック形成剤認識配列(NARS)のセンス鎖の配列、を含み;そして
(ii)該第二のODNPが、以下:
(a)センス鎖中のExon Bの5’末端の近傍に、Exon Bのセンス鎖の一部と少なくとも実質的に相補的な配列、および
(b)第二のNARSのセンス鎖の配列、を含む、工程;
(B)該第一のNARSを認識する第一のニック形成剤(NA)および第二のNARSを認識する第二のNAの存在下で、Exon AおよびExon Bの両方が該cDNA分子中に存在する場合に、第一の一本鎖核酸(A1)を増幅する条件下で、第一の増幅反応を実施する工程;
(C)第二の一本鎖核酸分子(T2)を提供する工程であって、該第二の一本鎖核酸分子(T2)が、5’から3’の方向で、以下:
(i)第三のNARSのセンス鎖の配列、および
(ii)A1と少なくとも実質的に相補的な配列、を含む、工程;
(D)Exon AおよびExon Bの両方が該cDNA分子中に存在する場合に、A1をテンプレートとして使用して、第三の一本鎖核酸フラグメント(A2)を増幅する条件下で、該第二のNARSを認識する第三のNAの存在下で、第二の増幅反応を実施する工程;
(E)該A2を検出および/または特徴付けて、該cDNA分子中のExon AとExon Bとの間の連結部の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記第一、第二および第三のNARSが同一である、請求項211に記載の方法。
- cDNA分子中の遺伝子の上流エキソン(Exon A)と下流エキソン(Exon B)との間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程:
(A)第一のオリゴヌクレオチドプライマー(ODNP)、第二のODNPおよび該cDNA分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
(i)該第一のODNPが、以下:
(a)アンチセンス鎖中のExon Aの5’末端の近傍に、Exon Aのアンチセンス鎖の一部と少なくとも実質的に相補的な配列、および
(b)第一のニック形成剤認識配列(NARS)のセンス鎖の配列、を含み;そして
(ii)該第二のODNPが、以下:
(a)センス鎖中のExon Bの5’末端の近傍に、Exon Bのセンス鎖の一部と少なくとも実質的に相補的な配列、および
(b)第二のNARSのセンス鎖の配列、を含む、工程;
(B)Exon AおよびExon Bの両方が該cDNA分子中に存在する場合に、一本鎖核酸フラグメント(A2)を指数関数的に増幅する条件で、該混合物を維持する工程;ならびに
(C)該A2を検出および/または特徴付けて、該cDNA分子中のExon AとExon Bとの間の連結部の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記第一のNERSおよび第二のNERSが同一である、請求項213に記載の方法。
- 前記cDNA分子が固定化されている、請求項213に記載の方法。
- 前記第一のODNP、前記第二のODNPまたはこれら両方が固定化されている、請求項213に記載の方法。
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