JP2005519643A - ニック形成剤を用いる核酸の指数関数的増幅 - Google Patents

ニック形成剤を用いる核酸の指数関数的増幅 Download PDF

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Abstract

本発明は、ニック形成剤を使用する、核酸分子の指数関数的増幅のための方法および組成物を提供する。特定の局面において、この増幅は、等温で実施され得る。本発明は、疾患診断のような多数の領域において有用である。核酸の増幅のための以前に公知の技術と対照的に、本発明は、複数のセットのオリゴヌクレオチドプライマーの使用を必要とせず、転写ベースでもない、核酸増幅のための方法を提供する。さらに、本発明は、等温条件下で実施され得、従って、異なる温度のサイクルを提供するための装置に関連する出費を回避する。本発明は、疾患診断のような種々の適用における有用性を見出し得る。

Description

（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、分子生物学の分野に関し、より具体的には、核酸を含む方法および組成物に関し、そしてなおより具体的には、ニック形成剤を用いる核酸増幅に関連する方法および組成物に関する。
（関連技術の説明）
迅速に核酸を増幅するための多くの方法が開発されてきた。これらとしては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自続配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写ベース増幅系（ＴＡＳ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、およびＱβレプリカーゼでの増幅が挙げられる。核酸の増幅に広く使用されるほとんどの方法（例えばＰＣＲ）は、変性および再アニーリングのサイクルを達成するために異なる温度のサイクルを必要とする。他の方法（これらは等温的に実施され得るが）は、複数のセットのプライマー（例えば、好熱性ＳＤＡのバンパープライマー）を必要とするか、または、転写および／もしくは逆転写をベースとし、これらは、ＲＮＡの分解に対して感受性である（例えば、ＴＡＳ、ＮＡＳＢＡおよび３ＳＲ）。従って、核酸増幅のための単純かつより効率的な方法に対する、当該分野における必要性が長い間感じられてきた。
本発明は、このことおよび下記されるような関連する必要性を満たす。
（発明の簡単な要旨）
核酸の増幅のための以前に公知の技術と対照的に、本発明は、複数のセットのオリゴヌクレオチドプライマーの使用を必要とせず、転写ベースでもない、核酸増幅のための方法を提供する。さらに、本発明は、等温条件下で実施され得、従って、異なる温度のサイクルを提供するための装置に関連する出費を回避する。本発明は、疾患診断のような種々の適用における有用性を見出し得る。
１つの局面において、本発明は、核酸分子を増幅するための方法を提供する（ここで、この増幅された分子は、しばしば、本明細書中で「Ａ２」といわれる）。１つの局面において、本発明の方法は、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を包含する：（Ａ）少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子（「Ｎ１」といわれる）を提供する工程であって、Ｎ１が以下の（ｉ）および（ｉｉ）の１つまたは両方を含む場合、これは、完全に二本鎖である核酸分子であり得、ここで、（ｉ）は、第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列であり、そして（ｉｉ）は、第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列である、工程。（Ｂ）第１のＮＡＲＳを認識する第１のニック形成剤（ＮＡ）、ＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、第１の一本鎖核酸分子（本明細書中で「Ａ１」といわれる）を増幅する工程。この増幅は、Ｎ１の部分をポリメラーゼのテンプレートとして使用する。（Ｃ）第２の一本鎖核酸分子（「Ｔ２」といわれる）を提供する工程。Ｔ２は、Ｔ２の５’末端から３’末端まで連続的に見られ、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の各々を含み、ここで、（ｉ）は、テンプレートヌクレオチド配列であり、（ｉｉ）は、第２のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチドであり、そして（ｉｉｉ）は、少なくとも実質的に（そして必要に応じて正確に）Ａ１に対して相補的であるヌクレオチド配列である。（Ｄ）Ｔ２、Ａ１、第１のＮＡ、第２のＮＡＲＳを認識する第２のＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、第３の一本鎖核酸分子（「Ａ２」といわれる）を増幅する工程であって、ここでＡ２は、Ｔ２のテンプレートヌクレオチド配列の少なくとも一部に対して相補的である。核酸分子を増幅するための本発明のこの方法の任意の実施形態において、以下の基準（ａ）〜（ｋ）の任意の１個、任意の２個、任意の３個、任意の４個、任意の５個、任意の６個、任意の７個、任意の８個、任意の９個、任意の１０個、または１１個全ては、この方法をさらに記載することにおいて使用され得る：（ａ）Ｎ１は、部分的に二本鎖の核酸分子である、（ｂ）Ｎ１は、第１のＮＡＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列を含む、（ｃ）Ｎ１は、第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含む、（ｄ）Ｎ１は、第１のＮＡのＮＳを含む鎖において、５’オーバーハングを含む、（ｅ）Ｎ１は、本発明の方法に従って、第１のＮＡのＮＳを含むように伸長される鎖において、５’オーバーハングを含む、（ｆ）Ｎ１は、第１のＮＡのＮＳを含まない鎖において、３’オーバーハングを含む、（ｇ）Ｎ１は、本発明の方法に従って、第１のＮＡにＮＳを提供するように伸長しない鎖において、３’オーバーハングを含む、（ｈ）Ｎ１は、標的核酸中のヌクレオチド配列に、少なくとも実質的に相補的である（そして必要に応じて正確に相補的である）ヌクレオチド配列を含む５’オーバーハングを含む、（ｉ）Ｎ１は、標的核酸中のヌクレオチド配列に、少なくとも実質的に相補的である（そして必要に応じて正確に相補的である）ヌクレオチド配列を含む３’オーバーハングを含む、（ｊ）Ｎ１は、第１のニック形成剤によってニック形成されない鎖内にヌクレオチド配列を含み、より具体的にはＮＳに対応する位置に対して５’側に位置し、ここで、このヌクレオチド配列は、Ａ１を増幅するためのテンプレートとして機能し、（ｋ）Ｎ１は、本発明に従って、第１のニック形成剤によってニック形成される部位を提供するようには伸長されない鎖内のヌクレオチド配列を含み、ここでこのヌクレオチド配列は、ＮＳに対応する位置に対して５’側に位置し、このヌクレオチド配列は、Ａ１を増幅するためのテンプレートとして機能し、その結果、例えば、本発明は、上に概略されるような核酸分子を増幅するための方法を提供し、ここで、Ｎ１は、部分的に二本鎖である核酸分子であり、これは以下を含む：（１）第１のＮＡＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列、第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列、またはこれらの配列の両方、（２）第１のＮＡによってニック形成されるＮＳを含むか、もしくは本発明に従って第１のＮＡによってニック形成されるＮＳを提供するように伸長されるかのいずれかの鎖における５’オーバーハング、または第１のＮＡによってニック形成されるＮＳを含まず、そして本発明に従って第１のＮＡにＮＳを提供するように伸長されない鎖における３’オーバーハングのいずれかであって、ここで５’オーバーハングまたは３’オーバーハングは（どちらが存在するとしても）、標的核酸に対して、少なくとも実質的に相補的な（そして必要に応じて正確に相補的な）ヌクレオチド配列を含む、５’オーバーハングまたは３’オーバーハング、ならびに（３）第１のＮＡによってニック形成されるＮＳを含まず、本発明に従って、第１のＮＡにＮＳを提供するようには伸長されない鎖内におけるヌクレオチド配列であって、ここでこのヌクレオチド配列は、ＮＳに対応する位置に対して５’側に位置し、このヌクレオチド配列は、Ａ１を増幅するためのテンプレートとして機能する、配列。
別の局面において、本発明は、核酸分子を増幅するための方法を提供し（この増幅された分子は、「Ａ２」といわれる）、ここで、この方法は以下の工程（Ａ）および（Ｂ）を含む：（Ａ）（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）を含む混合物を形成する工程であって、ここで（ｉ）は、第１ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含む少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子（本明細書中で「Ｎ１」といわれる）であり、（ｉｉ）は、分子の５’の方向から３’の方向にみて、成分（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む一本鎖核酸分子（本明細書中で「Ｔ２」といわれる）であり、ここで（ａ）は、テンプレートヌクレオチド配列であり、（ｂ）は、第２のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列であり、そして（ｃ）は、Ｎ１中のＮＡＲＳのアンチセンス鎖に対して５’側に位置するＮ１の部分に対して少なくとも実質的に同一である（そして必要に応じて正確に同一である）ヌクレオチド配列であり、そして（ｉｉｉ）は、第１のＮＡＲＳを認識する第１のニック形成剤（ＮＡ）、第２のＮＡＲＳを認識する第２のＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸である。（Ｂ）（１）テンプレートとしてＮ１の部分を使用して一本鎖核酸分子（本明細書中で「Ａ１」といわれる）を増幅し、そして（２）テンプレートとしてＴ２のテンプレートヌクレオチド配列を使用して一本鎖核酸分子（本明細書中で「Ａ２」といわれる）を増幅する条件下で（Ａ）の混合物を維持する工程。Ｎ１を調製するために１つの方法として、トリガーオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）が、一本鎖標的核酸（本明細書中で「Ｔ１」といわれる）にアニーリングされる方法が提供され、ここでＴ１は、分子の５’方向から３’方向に見る場合、以下を含む：（１）第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列；および（２）トリガーＯＤＮＰの少なくとも一部に対して、少なくとも実質的に相補的である（そして必要に応じて正確に相補的である）ヌクレオチド配列。本発明の１つの実施形態において、（Ａ）で形成された混合物は、さらに、（ｉｖ）一本鎖核酸分子（本明細書中で「Ｔ３」といわれる）を含み、ここでＴ３は、３’方向から５’方向に見ると、成分（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含み、ここで（ａ）は、Ｔ２のテンプレートヌクレオチド配列の少なくとも一部に対して、少なくとも実質的に同一である（そして必要に応じて正確に同一である）ヌクレオチド配列であり、（ｂ）は、第３のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列であり、そして（ｃ）は、第２のテンプレートヌクレオチド配列である。必要に応じて、前記混合物（Ａ）が、成分（ｉｖ）を含む事象において、第２のテンプレートＴ３を形成するヌクレオチド配列の少なくとも一部に対して相補的であるヌクレオチド配列を含む一本鎖核酸分子（Ａ３）を増幅する条件下で維持される。
関連する局面において、本発明は、核酸分子（Ａ２）を増幅するための方法を提供し、ここで、この方法は以下を含む：（Ａ）Ａ２にハイブリダイズし得るテンプレート核酸分子（Ｔ２）を提供する工程。（Ｂ）Ａ２がＴ２にハイブリダイズし得る位置の３’側に存在するＴ２上の位置で、Ｔ２に対してハイブリダイズし得るプライマー核酸分子（Ａ１）を提供する工程。（Ｃ）Ａ１をＴ２にハイブリダイズさせる工程。（Ｄ）Ａ１伸長産物を提供するようにＡ１を伸長する工程であって、ここでＡ１伸長産物は、Ｔ２にハイブリダイズした場合に、ハイブリッドＨ２を形成し、このハイブリッドＨ２は、第２のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）およびＡ２のヌクレオチド配列を含む、工程。（Ｅ）Ｈ２を、第２のニック形成剤（ＮＡ）でニック形成する工程であって、この第２のニック形成剤は、第２のＮＡＲＳを認識し、それによってＡ２を形成する、工程。（Ｆ）工程（Ｅ）および（Ｅ）を繰り返す工程であって、それによってＡ２を増幅する、工程。好ましくは、プライマー核酸分子Ａ１は、以下を含む方法によって形成される：（Ｇ）Ａ１に対してハイブリダイズし得るテンプレート核酸分子（Ｔ１）を提供する工程。（Ｈ）Ａ１がＴ１に対してハイブリダイズし得る位置の３’側に存在する、Ｔ１上の位置で、Ｔ１に対してハイブリダイズし得るトリガーオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）を提供する工程。（Ｉ）トリガーＯＤＮＰをＴ１に対してハイブリダイズする工程。（Ｊ）トリガーＯＤＮＰを、トリガーＯＤＮＰ伸長産物を提供するように伸長する工程であって、ここでトリガーＯＤＮＰ伸長産物は、Ｔ１に対してハイブリダイズする場合、ハイブリッドＨ１を形成し、このハイブリッドＨ１は、第１のＮＡＲＳおよびＡ１のヌクレオチド配列を含む、工程。（Ｋ）Ｈ１を第１のＮＡでニック形成する工程であって、この第１のＮＡは、第１のＮＡＲＳを認識し、それによってＡ１を形成する、工程。
別の局面において、本発明は、核酸分子（本明細書中で「Ａ２」といわれる）を増幅するための方法を提供し、ここで、この方法は以下の（Ａ）および（Ｂ）を含む：（Ａ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の混合物を形成する工程であって、ここで（ｉ）は、少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子であり、そして完全に二本鎖の核酸分子（本明細書中で「Ｎ１」といわれる）であり得、この核酸分子は、第１のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列を含み、（ｉｉ）は、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む一本鎖核酸分子（Ｔ２）であり、これらは、３’から５’であり（すなわち、以下のヌクレオチド配列（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、規定された順３’（ａ）（ｂ）（ｃ）５’で、Ｔ２に存在する）：（ａ）Ｎ１中のＮＥＲＳのセンス鎖に対して３’側に位置されるＮ１のヌクレオチド配列の一部分に対して、少なくとも実質的に相補的である（そして必要に応じて正確に相補的である）ヌクレオチド配列、（ｂ）第２のＮＥＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列、および（ｃ）テンプレートヌクレオチド配列；ならびに（ｉｉｉ）は、第１のＮＥＲＳを認識する第１のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）、第２のＮＥＲＳを認識する第２のＮＥ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸である。（Ｂ）テンプレートとしてＴ２のテンプレートヌクレオチド配列を使用する、一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する条件下で、混合物（Ａ）を維持する工程。必要に応じて、Ｎ１は、トリガーオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）を一本鎖標的核酸（Ｔ１）に対してアニーリングすることによって提供し、ここでＴ１は、Ｔ１の５’から３’の方向に見て、（Ａ）および（Ｂ）の両方を含み、ここで、（Ａ）は、第１のＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列であり、そして（Ｂ）は、トリガーＯＤＮＰの少なくとも一部分に対して、少なくとも実質的に相補的である（そして必要に応じて正確に相補的である）ヌクレオチド配列である。また、必要に応じて、混合物（Ａ）は、さらに成分（ｉｖ）を含み、ここで（ｉｖ）は、３’側から５’側に、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の各々を含む一本鎖核酸分子（Ｔ３）であり、ここで（ａ）は、Ｔ２のテンプレートヌクレオチド配列の少なくとも一部分に対して、少なくとも実質的に同一である（そして必要に応じて同一である）ヌクレオチド配列であり、（ｂ）は、ＮＥＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列であり；そして（ｃ）は、第２のテンプレートヌクレオチド配列である。必要に応じて、混合物（Ａ）は、成分（ｉｖ）を含む場合、この方法は、Ｔ３の第２のテンプレートヌクレオチド配列の少なくとも一部分に対して相補的である一本鎖核酸分子（本明細書中で「Ａ３」といわれる）を増幅する条件下で混合物（Ａ）を維持する工程を含む。必要に応じて、Ｔ３は、Ｔ２のテンプレートヌクレオチド配列の少なくとも一部分に対して正確に同一であるヌクレオチド配列を有する。
別の局面において、本発明は、核酸（Ａ２）を増幅する方法を提供し、ここで、この方法は、以下の工程（Ａ）〜（Ｊ）を含む：（Ａ）第１の二本鎖ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）の１つの鎖のヌクレオチド配列を含み、そしてトリガーオリゴヌクレオチドプライマー（トリガーＯＤＮＰ）に対して、少なくとも実質的に相補的である（そして必要に応じて正確に相補的である）、第１のテンプレート核酸分子（Ｔ１）を提供する工程。（Ｂ）トリガーＯＤＮＰを提供し、このトリガーＯＤＮＰをＴ１に対してハイブリダイズさせる工程。（Ｃ）Ｔ１に対してハイブリダイズされる、伸長されたトリガーＯＤＮＰを含むハイブリッド（Ｈ１）を形成するようにトリガーＯＤＮＰを伸長する工程であって、ここでＨ１は、第１の二本鎖ＮＡＲＳを含む、工程。（Ｄ）ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）を用いてニック形成部位でＨ１をニック形成する工程であって、それによって、ニック形成部位に５’末端を有するフラグメントを提供し、ここでこのフラグメントは、Ａ１と名づけられる、工程。（Ｅ）Ａ１に対して、少なくとも実施的に相補的である（そして必要に応じて正確に相補的である）第２のテンプレート核酸分子（Ｔ２）を提供する工程。（Ｆ）Ｔ２に対してＡ１をハイブリダイズさせる工程。（Ｇ）Ｔ２に対してハイブリダイズされる、伸長されたＡ１を含むハイブリッド（Ｈ２）を形成するようにＡ１を伸長する工程であって、Ｈ２は、第２のＮＡＲＳを含む工程。（Ｈ）第２のＮＡＲＳを認識する第２のＮＡでＨ２をニック形成し、フラグメントを提供する工程であって、ここでこのフラグメントが、ニック形成部位で５’末端を有し、そしてこのフラグメントがＡ２と命名される、工程。（Ｉ）Ｈ２中のニック形成部位で３’末端を伸長し、Ｈ２を再形成する工程。（Ｊ）（Ｈ）工程および（Ｉ）工程を繰り返し、それによってＡ２を増幅する工程。
関連する局面において、本発明は、核酸分子を増幅するための方法を提供し、ここで、この方法は、以下の（Ａ）および（Ｂ）を含む：（Ａ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含む混合物を形成する工程であって、ここで、（ｉ）は、ヌクレオチド配列（Ｓ１）を有する第１の一本鎖核酸分子であり、（ｉｉ）は、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を有する第２の一本鎖核酸分子であり、ここで、Ｓ１に対して、実質的に相補的であるか、または必要に応じて正確に相補的であるヌクレオチド配列は、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列に対して３’側および５’側の両方に存在し、そして（ｉｉｉ）は、ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）、ＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸である、工程。（Ｂ）テンプレートとして、一本鎖核酸分子（Ａ）（ｉｉ）を使用して、一本鎖核酸分子を増幅する条件で混合物（Ａ）を維持する工程。必要に応じて、増幅された核酸分子は、Ｓ１と正確に同一である配列を有する。
別の局面において、本発明は、タンデムな核酸増幅系を提供し、ここでこの系は：第１の一本鎖核酸（Ａ１）を増幅するための第１のプライマー伸長手段を含み、そして第２の一本鎖核酸（Ａ２）を増幅するための第２のプライマー伸長手段もまた含み；ここで、Ａ１は、Ａ２を増幅するための第２のプライマー伸長手段のためのプライマーであり、そして核酸分子の増幅のために、第１および第２のプライマー伸長手段の両方は、１つの反応容器内に含まれ、そしてニック形成剤（ＮＡ）の存在を必要とする。この系の任意の実施形態において：第１のプライマー伸長手段のためのＮＡは、第２のプライマー伸長手段のためのＮＡと同一であり；Ａ１を増幅するための第１の手段は、第１のオリゴヌクレオチドプライマー（トリガーＯＤＮＰ）、第１のテンプレート核酸分子（Ｔ１）（これは、トリガーＯＤＮＰに対して、少なくとも実質的に相補的であり（そして必要に応じて正確に相補的である））、第１のニック形成剤（ＮＡ）、と第１のＤＮＡポリメラーゼとを合わせる工程を含み、ここでテンプレートとしてＴ１を使用するトリガーＯＤＮＰの伸長は、第１のＮＡによって認識され得る第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）を生成する。また、必要に応じて、Ａ２を増幅するための第２の手段は、核酸（Ａ１）、第２のテンプレート核酸（Ｔ２）（Ａ１に対して、少なくとも実質的に相補的であり（そして必要に応じて正確に相補的である））、第２のＮＡ、およびＤＮＡポリメラーゼを含み、ここで、テンプレートとしてＴ２を使用するＡ１の伸長は、第２のＮＡによって認識され得る第２のＮＡＲＳを生成する。必要に応じて、第１のポリメラーゼは、第２のポリメラーゼと同一である。
別の局面において、本発明は、核酸分子（Ａ２）の指数関数的な増幅のための方法を提供し、ここでこの方法は、以下の工程（Ａ）および（Ｂ）を含む：（Ａ）核酸分子（Ａ１）を第１のテンプレート核酸（Ｔ１）を使用して増幅する工程であって、このテンプレート核酸が、第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）の１つの鎖のヌクレオチド配列を含む、工程。この増幅は、第１のＮＡＲＳを認識する第１のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＡ）および第１のＤＮＡポリメラーゼの存在下で実施される。（Ｂ）第２のＮＡおよび第２のＤＮＡポリメラーゼの存在下で、テンプレートとして第２のＮＡＲＳの１つの鎖のヌクレオチド配列を含む第２のテンプレート核酸（Ｔ２）およびプライマーとしてＡ１を使用してＡ２を増幅する工程であって、ここで、第１および第２のポリメラーゼは、必要に応じて、同じポリメラーゼである。＊＊
本発明はまた、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法を提供する。これらの方法は、診断において特に有用である。１つの局面において、本発明は、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法を提供し、ここで、この方法は、以下の工程を包含する：（Ａ）以下を含む混合物を形成する工程：（ｉ）そのサンプルの核酸分子、（ｉｉ）３’から５’へと以下を含む第１の一本鎖核酸分子（Ｔ１）：（ａ）標的核酸分子に少なくとも実質的に相補的であり、そして必要に応じて正確に相補的である、第１のヌクレオチド配列、（ｂ）第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列、および（ｃ）第２のヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）３’から５’へと以下を含む第２の一本鎖核酸分子（Ｔ２）：（ａ）（Ａ）（ｉｉ）（ｃ）（すなわち、Ｔ１の第２のヌクレオチド配列）に少なくとも実質的に同一であり、そして必要に応じて正確に同一である、第１のヌクレオチド配列、（ｂ）第２のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列、および（ｃ）第２の配列、（ｉｖ）第１のＮＡＲＳを認識する第１のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＡ）、第２のＮＡＲＳを認識する第２のＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸。（Ｂ）標的核酸がサンプル中に存在する場合、Ｔ２の第２の配列をテンプレートとして使用して、一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する条件において混合物（Ａ）を維持する工程。（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定する工程。関連する局面において、本発明は、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法を提供し、ここで、この方法は、以下の工程を包含する：（Ａ）以下を含む混合物を形成する工程：（ｉ）そのサンプルの核酸分子；（ｉｉ）３’から５’へと以下を含む第１の一本鎖核酸分子（Ｔ１）：（ａ）標的核酸分子に少なくとも実質的に相補的であり、そして必要に応じて正確に相補的である、ヌクレオチド配列、および（ｂ）第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）３’から５’へと以下を含む第２の一本鎖核酸分子（Ｔ２）：（ａ）第１のＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチドの３’側に配置されるＴ１のヌクレオチドに少なくとも実質的に同一であり、そして必要に応じて正確に同一であるヌクレオチド配列、および（ｂ）第２のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列、ならびに（ｉｖ）第１のＮＡＲＳを認識する第１のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＡ）、第２のＮＡＲＳを認識する第２のＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸。（Ｂ）標的核酸がサンプル中に存在する場合、Ｔ２をテンプレートとして使用して、一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する条件において混合物（Ａ）を維持する工程。（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定する工程。関連する局面において、本発明は、標的核酸分子の存在または非存在を決定するための方法を提供し、ここで、この標的核酸は、第１のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）を含み、この方法は、以下の工程を包含する：（Ａ）以下を含む混合物を形成する工程：（ｉ）そのサンプルの核酸分子、（ｉｉ）３’から５’へと以下を含む一本鎖核酸分子（Ｔ２）：（ａ）第１のＮＥＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチドの５’側に配置される標的核酸分子の一部に少なくとも実質的に同一であり、そして必要に応じて正確に同一である、配列、および（ｂ）第２のＮＥＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列、ならびに（ｉｉｉ）第１のＮＥＲＳを認識する第１のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）；第２のＮＥＲＳを認識する第２のＮＥ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸。（Ｂ）標的核酸がサンプル中に存在する場合、Ｔ２をテンプレートとして使用して、一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する条件において混合物（Ａ）を維持する工程。（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定する工程。関連する局面において、本発明は、サンプル中の第１のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）を含む標的核酸の存在または非存在を決定するための方法を提供し、ここで、この方法は、以下の工程を包含する：（Ａ）以下を含む混合物を形成する工程：（ｉ）そのサンプルの核酸分子、（ｉｉ）標的核酸の一方の鎖に実質的に同一であり、そして必要に応じて正確に同一であり、そして第１のＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列を含む、第１の一本鎖核酸分子（Ｔ１）、（ｉｉｉ）３’から５’へと以下を含む第２の一本鎖核酸分子（Ｔ２）：（ａ）第１のＮＥＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチドの５’側に配置されるＴ１の一部に少なくとも実質的に同一であり、そして必要に応じて正確に同一である、ヌクレオチド配列、および（ｂ）第２のＮＥＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列、ならびに（ｉｖ）第１のＮＥＲＳを認識する第１のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）、第２のＮＥＲＳを認識する第２のＮＥ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸。（Ｂ）標的核酸がサンプル中に存在する場合、Ｔ２をテンプレートとして使用して、一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する条件において混合物（Ａ）を維持する工程。（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定する工程。関連する局面において、本発明は、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法を提供し、ここで、この方法は、以下の工程を包含する：（Ａ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２のＯＤＮＰ、およびサンプルの核酸分子の混合物を形成する工程であって、ここで（ｉ）この標的核酸が、第１の鎖および第２の鎖を有する二本鎖核酸である場合、第１のＯＤＮＰは、第１の制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列および標的核酸の第１の鎖の第１の部分に少なくとも実質的に同一であり、そして必要に応じて正確に同一である、ヌクレオチド配列を含み、そして第２のＯＤＮＰは、標的核酸の第２の鎖の第２の部分に少なくとも実質的に同一であり、そして必要に応じて正確に同一である、ヌクレオチド配列を含み、そして第２のＲＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列を含む（第２の部分は、標的核酸の第２の鎖内の第１の部分の相補体の３’側に配置される）。しかし、（ｉｉ）標的核酸が、一本鎖核酸である場合、第１のＯＤＮＰは、第１のＲＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列および標的核酸の第１の部分に少なくとも実質的に同一であり、そして必要に応じて正確に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして第２のＯＤＮＰは、標的核酸の第２の部分に少なくとも実質的に相補的であり、そして必要に応じて正確に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして第２のＲＥＲＳのセンス鎖の配列を含む（第２の部分は、標的核酸の第１の部分の５’側に配置される）。（Ｂ）標的核酸がサンプル中に存在する場合、以下の条件：（ｉ）第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰを伸長して、第１のＲＥＲＳおよび第２のＲＥＲＳの両方を含む伸長産物を生成し；（ｉｉ）第１のＲＥＲＳおよび第２のＲＥＲＳを認識する１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）の存在下で、工程、（Ｂ）（ｉ）の伸長産物の一方の鎖をテンプレートとして使用して、第１の一本鎖核酸フラグメント（Ａ１）を増幅し；（ｉｉｉ）Ａ１にアニーリングし得る第２の一本鎖核酸分子（Ｔ２）の存在下で、Ａ１をテンプレートとして使用して、第３の一本鎖核酸フラグメント（Ａ２）を増幅し、ここで、Ａ１、Ａ２または両方は、好ましくは、多くとも２５ヌクレオチドを有し、ここで、Ｔ２は、５’から３’へと以下を含む：（ａ）第３のＲＥＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列、および（ｂ）Ａ１に少なくとも実質的に相補的であり、そして必要に応じて正確に相補的である配列、にこの混合物を供する工程。（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定する工程。関連する局面において、本発明は、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法を提供し、ここで、この方法は、以下の工程を包含する：（Ａ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２のＯＤＮＰ、およびサンプルの核酸分子の混合物を形成する工程であり、ここで（ｉ）この標的核酸が、第１の鎖および第２の鎖を有する二本鎖核酸である場合、第１のＯＤＮＰは、第１のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列および標的核酸の第１の鎖の第１の部分に少なくとも実質的に相補的であり、そして必要に応じて正確に相補的である、ヌクレオチド配列を含み、そして第２のＯＤＮＰは、標的核酸の第２の鎖の第２の部分に少なくとも実質的に相補的であり、そして必要に応じて正確に相補的である、ヌクレオチド配列を含み、そして第２のＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列を含む（第２の部分は、標的核酸の第２の鎖内の第１の部分の相補体の３’側に配置される）。（ｉｉ）標的核酸が、一本鎖核酸である場合、第１のＯＤＮＰは、第１のＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列および標的核酸の第１の部分に少なくとも実質的に同一であり、そして必要に応じて正確に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして第２のＯＤＮＰは、標的核酸の第２の部分に少なくとも実質的に相補的であり、そして必要に応じて正確に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして第２のＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含む（第２の部分は、標的核酸の第１の部分の５’側に配置される）。（Ｂ）標的核酸がサンプル中に存在する場合、以下の条件：（ｉ）第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰを伸長して、第１のＮＥＲＳおよび第２のＮＥＲＳの両方を含む伸長産物を生成し；（ｉｉ）第１のＮＥＲＳおよび第２のＮＥＲＳを認識する１つ以上のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、工程（Ｂ）（ｉ）の伸長産物の一方の鎖をテンプレートとして使用して、第１の一本鎖核酸フラグメント（Ａ１）を増幅し；（ｉｉｉ）Ａ１にアニーリングし得る第２の一本鎖核酸分子（Ｔ２）の存在下で、Ａ１をテンプレートとして使用して、第３の一本鎖核酸フラグメント（Ａ２）を増幅し、ここで、Ａ１、Ａ２または両方は、必要に応じて、多くとも２５ヌクレオチドを有し、ここで、Ｔ２は、５’から３’へと以下を含み：（ａ）第３のＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列、および（ｂ）Ａ１に少なくとも実質的に相補的であり、そして必要に応じて正確に相補的である配列、にこの混合物を供する工程。（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定する工程。関連する局面において、本発明は、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法を提供し、ここで、この方法は、以下の工程を包含する：（Ａ）以下を含む混合物を形成する工程：（ｉ）そのサンプルの核酸分子、（ｉｉ）３’から５’へと、標的核酸の５’部分に少なくとも実質的に相補的であり、そして必要に応じて正確に相補的である配列および第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖の配列を含む一本鎖核酸プローブ。（Ｂ）工程（Ａ）において形成されたような、ハイブリダイズされていないプローブからハイブリダイズされているプローブを分離する工程。（Ｃ）第１のＮＡＲＳを認識する第１のニック形成剤（ＮＡ）の存在下で、ハイブリダイズされているプローブを用いて増幅反応を実施する工程。（Ｄ）５’から３’へと以下：（ｉ）第２のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、および（ｉｉ）第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチドの５’側に配置される第１の一本鎖核酸プローブの部分に、少なくとも実質的に同一であり、そして必要に応じて正確に同一である配列、を含む一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程。（Ｅ）第２のＮＡＲＳを認識する第２のＮＡの存在下で、増幅反応を実施する工

程。（Ｆ）工程（Ｅ）の増幅産物の存在または非存在を検出して、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定する工程。関連する局面において、本発明は、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法を提供し、ここで、この方法は、以下の工程を包含する：（Ａ）以下を含む混合物を形成する工程：（ｉ）そのサンプルの核酸分子、（ｉｉ）３’から５’へ、以下：（ａ）標的核酸の３’部分に少なくとも実質的に相補的であり、そして必要に応じて正確に相補的であるヌクレオチド配列、および（ｂ）第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列、を含む一本鎖核酸プローブ。（Ｂ）工程（Ａ）において形成されたような、ハイブリダイズされていないプローブからハイブリダイズされているプローブを分離する工程；（Ｃ）ハイブリダイズされているプローブおよび第１のＮＡＲＳを認識する第１のニック形成剤（ＮＡ）の存在下で、増幅反応を実施する工程。（Ｄ）５’から３’へ、以下：（ｉ）第２のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、および（ｉｉ）第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチドの５’側に配置される第１の一本鎖核酸プローブの部分に少なくとも実質的に相補的であり、そして必要に応じて正確に相補的である配列、を含む一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程。（Ｅ）第２のＮＡＲＳを認識する第２のＮＡの存在下で、増幅反応を実施する工程。（Ｆ）工程（Ｅ）の増幅産物の存在または非存在を検出して、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定する工程。関連する局面において、本発明は、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法を提供し、ここで、この方法は、以下の工程を包含する：（Ａ）以下を含む混合物を形成する工程：（ｉ）そのサンプルの核酸分子、（ｉｉ）以下：（ａ）第１のＮＡＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列、第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列、または両方；および（ｂ）鎖中の５’オーバーハング（この鎖自体またはその伸長産物は、第１のＮＡＲＳを認識する第１のニック形成剤（ＮＡ）によりニック形成され得るニック形成部位（ＮＳ）を含む）または鎖中の３’オーバーハング（この鎖もその伸長産物もＮＳを含まない）（ここでオーバーハングは、標的核酸に少なくとも実質的に相補的であり、そして必要に応じて正確に相補的であるヌクレオチド配列を含む）、を含む部分的に二本鎖の核酸プローブ。（Ｂ）工程（Ａ）の混合物中に形成されるような、ハイブリダイズされていないプローブからハイブリダイズされているプローブを分離する工程。（Ｃ）ハイブリダイズされているプローブおよび第１のＮＡＲＳを認識する第１のニック形成剤（ＮＡ）の存在下で、増幅反応を実施する工程。（Ｄ）５’から３’へ（すなわち、その分子の３’に向かって、以下の構成要素が、Ｔ２内に順次存在する）、以下：（ｉ）第２のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチドの５’側に配置される核酸プローブの部分に少なくとも実質的に同一であり、そして必要に応じて正確に同一であるヌクレオチド配列、を含む一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程。（Ｅ）第２のＮＡＲＳを認識する第２のＮＡの存在下で、増幅反応を実施する工程。（Ｆ）工程（Ｅ）の増幅産物の存在または非存在を検出して、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定する工程。
他の局面において、本発明は、以下の方法を提供する。これらの方法は、例えば、一本鎖標的核酸中の規定された位置での遺伝的バリエーションの存在または非存在を決定する際に有用である。１つの局面において、本発明の方法は、以下の工程を包含する：（Ａ）標的核酸の一部（標的核酸のこの部分は、規定された領域において、ヌクレオチド（ａ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）を含む）に正確に相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖核酸（Ａ１）を提供する工程。Ａ１は、増幅プロセスを介して提供され、これによって、ニック形成剤の存在下で、複数コピーのＡ１が提供される。（Ｂ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）の存在下で増幅反応を実施する工程であって、ここで、（ｉ）は、３’から５’へと、以下：（ａ）Ａ１に少なくとも実質的に相補的であり、そして好ましくは正確に相補的であり、そしてまた遺伝的バリエーションを含む第１のヌクレオチド配列、（ｂ）第２のニック形成剤によって認識可能であるニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列、（ｃ）第２の配列、を含む一本鎖テンプレート核酸（Ｔ２）であり、（ｉｉ）は、第２のニック形成剤であり、（ｉｉｉ）は、ＤＮＡポリメラーゼであり、そして（ｉｖ）は、１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸である。この増幅反応は、Ｔ２分子の第２の配列の少なくとも一部を用いる、一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する条件下で実施される。しかし、この増幅反応は、Ａ１が遺伝的バリエーションの相補的ヌクレオチドを含む場合にのみ起こる。（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出する工程。この検出工程は、標的核酸の規定された位置における遺伝的バリエーションの存在または非存在の決定を可能にする。必要に応じて、Ａ１は、以下の工程によって提供される：（ａ）第１のＯＤＮＰ、第２のＯＤＮＰ、および標的核酸の混合物を形成する工程であって、ここで（ｉ）第１のＯＤＮＰは、第１のＲＥＲＳの一方の鎖のヌクレオチド配列および遺伝的バリエーションの相補体の５’側に配置される標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に同一であり、そして必要に応じて、正確に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして（ｉｉ）第２のＯＤＮＰは、第２のＲＥＲＳの一方の鎖のヌクレオチド配列および遺伝的バリエーションの３’側に配置される標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的であり、そして必要に応じて、正確に相補的であるヌクレオチド配列を含む、工程；（ｂ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸および少なくとも１つの改変されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰを伸長し、第１のＲＥＲＳおよび第２のＲＥＲＳの両方を含む伸長産物を生成する工程；および（ｃ）第１のＲＥＲＳおよび第２のＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）の存在下で、工程（ｂ）の伸長産物の一方の鎖をテンプレートとして使用して、一本鎖核酸フラグメントＡ１を増幅する工程であって、ここで、さらなる任意の実施形態において、第１のＲＥＲＳ、第２のＲＥＲＳ、および第３のＲＥＲＳが互いに同一である、工程。あるいは、Ａ１は、以下の工程によって提供され得る：（ａ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２のＯＤＮＰおよび標的核酸の混合物を形成する工程であって、ここで（ｉ）第１のＯＤＮＰは、遺伝的バリエーションの５’側に配置される標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に同一であり、そして必要に応じて、正確に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして（ｉｉ）第２のＯＤＮＰは、遺伝的バリエーションの３’側に配置される標的核酸のヌクレオチド配列に少なくとも実質的に相補的であり、そして必要に応じて、正確に相補的であるヌクレオチド配列を含み、ここで、第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰは、各々、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列をさらに含む、工程；（ｂ）第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰを伸長し、２つのＮＥＲＳを含む伸長産物を生成する工程；および（ｃ）ＮＥＲＳを認識する１つ以上のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、工程（ｂ）の伸長産物の一方の鎖をテンプレートとして使用して、一本鎖核酸フラグメントＡ１を増幅する工程であって、ここで、必要に応じて、第１のＯＤＮＰ、第２のＯＤＮＰおよびＴ２中のＮＥＲＳが互いに同一である、工程。関連する局面において、本発明は、一本鎖標的核酸中の規定された位置における遺伝的バリエーションを同定するための方法を提供し、ここで、この方法は、以下の工程を包含する：（Ａ）標的核酸の一部に正確に相補的である配列を含む、一本鎖核酸分子（Ａ１）を提供する工程であって、ここで、この標的核酸の部分は、規定された位置において、遺伝的バリエーションを含む、工程。Ａ１は、第１のニック形成剤の存在下で実施される増幅プロセスによって提供される。（Ｂ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）の存在下で増幅反応を実施する工程であって、ここで、（ｉ）は、複数の一本鎖テンプレート核酸（Ｔ２）であり、各Ｔ２は、Ｔ２の３’から５’への方向に見て、以下を含む：（ａ）Ａ１に少なくとも実質的に相補的であり、そして必要に応じて、正確に相補的である第１の配列であって、ここで、この第１の配列はまた、標的核酸の規定された位置において、潜在的な遺伝的バリエーションのうちの１つを含む、配列、（ｂ）第２のニック形成剤によって認識可能であるＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列、および（ｃ）潜在的な遺伝的バリエーションに一意的に相関する第２の配列であって、ここで、複数のＴ２分子は、標的核酸の規定された位置において、全ての潜在的な遺伝的バリエーションを組み合わせて含む、配列、（ｉｉ）第２のニック形成剤、（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および（ｉｖ）１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸。これらの成分（ｉ）〜（ｉｖ）は、Ｔ２分子の第２の配列の少なくとも一部をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子（Ａ２）を選択的に増幅する条件下で増幅され、ここでＴ２分子は、標的核酸の遺伝的バリエーションを含む。配列が、潜在的な遺伝的バリエーションに「一意的に相関する」場合、その配列の検出は、遺伝的バリエーションが存在するかどうか、そして存在する場合、どの形態で存在するかを効果的に示す。（Ｃ）工程（Ｂ）において増幅されたＡ２を特徴づけ、標的核酸の遺伝的バリエーションを同定する工程。この関連する方法において、必要に応じて、以下の基準の１つ以上が、この方法の記載において適用され得る：Ｔ２分子の各々の第２の配列は、同じＴ２分子の第１の配列に少なくとも実質的に同一であり、そして必要に応じて正確に同一である；第２のニック形成剤は、このニック形成剤認識配列のセンス鎖のヌクレオチドの５’側にニック形成する；第２のニック形成剤によりニック形成可能なニック形成部位のすぐ５’側に配置される各Ｔ２分子の第２配列の一部は、同じＴ２分子の第１の配列に正確に同一である。遺伝的バリエーションの検出に関する本発明の方法において、以下の基準が、１方法を記載するためにさらに使用され得、ここで、以下の基準のうちの任意の２つ以上が、この方法を記載する際に組み合され得、ここで、以下の基準は、他の基準が本明細書中の他のところで提供され得ることにおいてのみ例示的であり、ここで、これらの他の基準は、本発明の他の方法との関連において上記のものを提供する基準を含む：遺伝的バリエーションは、単一ヌクレオチド多型である；遺伝的バリエーションは、疾患に関連する；遺伝的バリエーションは、ヒト遺伝性疾患に関連する；遺伝的バリエーションは、病原性微生物の薬剤耐性に関連する；ニック形成剤は、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉである；増幅（例えば、上記の工程（Ｂ））は、等温条件（例えば、５０℃〜７０℃において）実施される；ＤＮＡポリメラーゼは、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＰｈｉＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素、またはそれらの任意の組合せ（例えば、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、または９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ）からなる群より選択される；検出（例えば、上記の工程（Ｃ））は、質量分析法、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光、および電気泳動、またはそれらの任意の組合せから選択される技術の使用によって少なくとも部分的に実施される（例えば、工程（Ｃ）は、液体クロマトグラフィーおよび質量分析法の両方によって少なくとも部分的に実施される）；第１のＯＤＮＰは、固定される；第２のＯＤＮＰは、固定される；第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰの両方は、固定される；標的核酸は、固定される；Ｔ２、または各Ｔ２は、固定される；固定は、共有結合を介する固体支持体への固定である；Ｔ２の第２の配列は、第１の配列に少なくとも実質的に同一であり、そして必要に応じて正確に同一であり、そして遺伝的バリエーションを含む；Ｔ２の第２の配列は、第１の配列に正確に同一であり、そして遺伝的バリエーションを含む；第２のニック形成剤は、ニック形成剤認識配列のセンス鎖のヌクレオチドの５’側にニック形成する；第２のニック形成剤によってニック形成可能なニック形成部位のすぐ５’側に配置されるＴ２の第２の配列の一部は、Ｔ２分子の第１の配列に正確に同一である。
他の局面において、本発明は、さらなる方法を提供する。これらの方法は、例えば、ｃＤＮＡ分子中の上流エキソン（エキソンＡ）と下流エキソン（エキソンＢ）との間の連結部の存在または不存在を決定するために用いられ得る。このｃＤＮＡ分子は、１本鎖であっても２本鎖であってもよい。２本鎖ｃＤＮＡ分子は、エキソンＡのセンス鎖およびエキソンＢのセンス鎖を含む鎖を有し、エキソンＡのセンス鎖は、Ｕ（ｍＲＮＡ分子中）がＴ（ＤＮＡ中）に変化ていること以外は、エキソンＡをコードする対応するｍＲＮＡ分子中に見出されるヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を有する。１本鎖ｃＤＮＡ分子は、ちょうど記載されたような２本鎖ｃＤＮＡ分子のいずれかの鎖であり得る。１つの局面において、本発明は、以下を含む方法を提供する：（Ａ）少なくとも部分的に２本鎖であり、１つの実施形態において、完全な２本鎖であり、核酸分子（Ｎ１）を提供する工程であって、ここでＮ１は、特徴（ｉ）および特徴（ｉｉ）を含み、（ｉ）は、ａ）およびｂ）のいずれかまたは両方であり、ここでａ）は、第１のニック形成因子認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列であり、そしてｂ）は、第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列であり、そして（ｉｉ）は、ｃＤＮＡ分子が２本鎖である場合、ｃＤＮＡ分子の一部分の少なくとも一方の鎖であるか、またはｃＤＮＡ分子が１本鎖である場合、ｃＤＮＡの一部分であり、このｃＤＮＡ分子の一部は、エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部を含むと推定される、工程。（Ｂ）第１のＮＡＲＳを認識するニック形成因子（ＮＡ）、ＤＮＡポリメラーゼおよび１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下での、第１の１本鎖核酸分子（Ａ１）を増幅する工程。ポリメラーゼのためのテンプレートとして、この増幅工程は、１本鎖ｃＤＮＡの一部分または２本鎖ｃＤＮＡの一部分の一方の鎖のいずれかを用いる。（Ｃ）５’から３’の向きで以下を含む第２の１本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程：（ｉ）（ａ）または（ｂ）を含む第１のヌクレオチド配列であり、ここで（ａ）は、エキソンＡのセンス鎖の３’部分であり、この３’部分は、その３’末端がエキソンＢのセンス鎖の５’部分に連結しており、この３’部分は５’部分の５’末端に連結しており、そして（ｂ）は、エキソンＡのアンチセンス鎖の５’部分であり、この５’部分は、その５’末端がエキソンＢのアンチセンス鎖の３’部分に連結しており、この５’部分は、この３’部分の３’末端に連結している。ｃＤＮＡが、エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部を含む場合、Ｔ２の第１のヌクレオチド配列は、Ａ１分子に対して少なくとも実質的に相補的であり、そして必要に応じて正確に相補的であるが、このｃＤＮＡが、エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部を含まない場合、Ｔ２の第１のヌクレオチド配列は、このＡ１分子に対して実質的に相補的でない、第１のヌクレオチド配列、（ｉｉ）第２のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、および（ｉｉｉ）第２の配列。（Ｄ）エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部が、標的ｃＤＮＡ分子中に存在する場合、この方法はテンプレートとして、Ｔ２の第２の配列の少なくとも一部を用いて、第３の１本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する増幅反応を実施する。（Ｅ）Ａ２の存在または不存在を検出して、ｃＤＮＡ分子中の連結部の存在または不存在を決定する工程。関連する局面において、本発明は、ｃＤＮＡ分子中の遺伝子の上流エキソン（エキソンＡ）と下流エキソン（エキソンＢ）との間の連結部の存在または不存在を決定するための方法を提供し、ここでこの方法は、以下を含む：（Ａ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２のＯＤＮＰおよびｃＤＮＡ分子の混合物を形成する工程であって、ここで（ｉ）第１のＯＤＮＰは、アンチセンス鎖中のエキソンＡの５’末端近くのエキソンＡのアンチセンス鎖の一部分に対して、少なくとも実質的に相補的であり、そして必要に応じて正確に相補的であるヌクレオチド配列を含み、（ｉｉ）第２のＯＤＮＰは、このセンス鎖中のエキソンＢの５’末端近くのエキソンＢのセンス鎖の一部分に対して、少なくとも実質的に相補的であり、そして必要に応じて正確に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして（ｉｉｉ）第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰの少なくとも一方は、第１のニック形成因子認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列をさらに含む工程。（Ｂ）ｃＤＮＡ中にエキソンＡおよびエキソンＢの両方が存在する場合に第１の１本鎖核酸（Ａ１）を増幅させる条件下で、第１のＮＡＲＳを認識するニック形成因子（ＮＡ）存在下にて第１の増幅反応を実施する工程。（Ｃ）５’から３’に向かって以下を含む第２の１本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程：（ｉ）以下を含む第１の配列：（ａ）３’部分の３’末端で、５’末端の５’末端のエキソンＢのセンス鎖の５’部分に連結したエキソンＡのセンス鎖の３’部分、または（ｂ）５’部分の５’末端で、３’部分の３’末端のエキソンＢのアンチセンス鎖の３’部分に連結したエキソンＡのアンチセンス鎖の５’部分であり、ここで、このｃＤＮＡが、エキソンＡとエキソンＢとの間に連結部を含む場合、Ｔ２の第１の配列は、Ａ１分子に対して、少なくとも実質的に相補的であり、そして必要に応じて正確に相補的であるが、ｃＤＮＡが、エキソンＡとエキソンＢとの間に連結部を含まない場合、Ｔ２は、Ａ１分子に対して、実質的に相補的でない第１の配列、（ｉｉ）第２のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、および（ｉｉｉ）第２の配列。（Ｄ）エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部が、標的ｃＤＮＡ分子中に存在する場合、テンプレートとして、Ｔ２の第２の配列の少なくとも一部を用いて、第３の１本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する増幅反応を実施する工程。（Ｅ）Ａ２の存在または不存在の検出して、このｃＤＮＡ分子中の連結部の存在または不存在を決定する工程。関連の局面において、本発明は、ｃＤＮＡ分子中の遺伝子の上流エキソン（エキソンＡ）と下流エキソン（エキソンＢ）との間の連結部の存在または不存在を決定するための方法を提供し、ここでこの方法は、以下を含む：（Ａ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２のＯＤＮＰおよびｃＤＮＡ分子の混合物を形成し、ここで（ｉ）第１のＯＤＮＰは、以下を含む：（ａ）アンチセンス鎖中のエキソンＡの５’末端近くのエキソンＡのアンチセンス鎖の一部分に対して、少なくとも実質的に相補的であり、そして必要に応じて正確に相補的であるヌクレオチド配列、および（ｂ）第１のニック形成因子認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列；そして（ｉｉ）第２のＯＤＮＰは、以下を含む：（ａ）センス鎖中のエキソンＢの５’末端近くのエキソンＢのセンス鎖の一部分に対して、少なくとも実質的に相補的であり、そして必要に応じて正確に相補的であるヌクレオチド配列、および（ｂ）第２のＮＡＲＳのセンス鎖の配列である工程。（Ｂ）このｃＤＮＡ中にエキソンＡおよびエキソンＢの両方が存在する場合に第１の１本鎖核酸（Ａ１）を増幅させる条件下で、第１のＮＡＲＳを認識する第１のニック形成因子（ＮＡ）および第２のＮＡＲＳを認識する第２のＮＡの存在下にて、第１の増幅反応を実施する工程。（Ｃ）５’から３’に向かって以下を含む第２の１本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程：（ｉ）以下を含む第１の配列（ａ）３’部分の３’末端で、５’末端の５’末端のエキソンＢのセンス鎖の５’部分に連結したエキソンＡのセンス鎖の３’部分、または（ｂ）５’部分の５’末端で、３’部分の３’末端のエキソンＢのアンチセンス鎖の３’部分に連結したエキソンＡのアンチセンス鎖の５’部分であり、ここで、このｃＤＮＡが、エキソンＡとエキソンＢとの間に連結部を含む場合、Ｔ２の第１の配列は、Ａ１分子に対して、少なくとも実質的に相補的であり、そして必要に応じて正確に相補的であるが、ｃＤＮＡが、エキソンＡとエキソンＢとの間に連結部を含まない場合、Ｔ２は、Ａ１分子に対して、実質的に相補的でない、第１の配列、（ｉｉ）第２のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、および（ｉｉｉ）第２の配列。（Ｄ）エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部が、この標的ｃＤＮＡ分子中に存在する場合、テンプレートとして、少なくともＴ２の第２の配列の一部を用いて、第３の１本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する増幅反応を実施する工程。（Ｅ）Ａ２の存在または不存在を検出して、このｃＤＮＡ分子中の連結部の存在または不存在を決定する工程。必要に応じて、第１のＮＡＲＳと、第２のＮＡＲＳと第３のＮＡＥＳとは同一である。さらなる任意の実施形態において、以下の基準のうちの１つ以上を用いて、この方法が説明され得、ここで、これらの基準は、本発明の方法に関連して本明細書中で記載したような、他の基準をまた用いてこの方法をさらに説明し得るので、単なる例示である：Ｎ１は、第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含む；Ｎ１は、第１のＮＡＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列を含み；第１および第２の両方のＮＡは、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）であり、ヌクレオシド三リン酸の少なくとも１つは改変されている；Ａ１は、８〜２４ヌクレオチドの長さである；Ａ１は、１２〜１７ヌクレオチドの長さである；Ａ２は、８〜２４ヌクレオチドの長さである；Ａ２は、１２〜１７ヌクレオチドの長さである；ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損である；ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有する；（Ｂ）および（Ｄ）の各工程は、鎖置換促進因子の存在下で実施される；Ｎ１は、固定化されている；Ｔ２は、固定化されている；ｃＤＮＡは、固定化されている；第１のＯＤＮＰは、固定化されている；第２のＯＤＮＰは、固定化されている；第１および第２の両方のＯＤＮＰは、固定化されている。
以下の基準は、単独でまたは任意の組合せで用いられて、上記および本明細書中の他の所で概説したように本発明の方法をさらに説明し得、ここで、これらの基準は、単なる例示であり、そして他の基準は、本明細書中の他の所で記載され得る：第１のＮＡＲＳは、第２のＮＡＲＳと同一である；第１のニック形成因子は、第２のニック形成因子と同じである；ある方法における任意の１つ以上のＮＡＲＳは、ＮＥＲＳである；第１および第２のＮＡは、両方、ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である；ＮＥは、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉである；ＮＥは、Ｎ．Ａｌｗ Ｉである；第１および第２のＮＥは、両方、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉである；第１または第２のニック形成因子のうちの少なくとも一方は、ニック形成エンドヌクレアーゼである；第１および第２のＮＡは、両方、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）である；第１、第２および第３のＮＡＲＳ（３つのＮＡＲＳが、本発明の実施形態において指定される場合）は、互いに同一である；第１、第２および第３のＮＡＲＳの各々は、ニック形成エンドヌクレアーゼによって認識される；第１、第２および第３のＮＡＲＳの少なくとも１つは、ニック形成エンドヌクレアーゼによって認識される；この方法の工程の、任意の１つの工程、または任意の２つの工程、または任意の３つの工程、または任意の４つの工程、または任意の５つの工程、または任意の６つの工程、または任意の７つの工程、または任意の８つの工程、または任意の９つの工程、または任意の１０の工程など（例えば、工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）、または例えば、工程（ａ）〜（ｊ））は、単一の容器において実施される；１本鎖核酸フラグメントの増幅は、等温条件下で実施される；各増幅反応は、５０℃〜７０℃の範囲内の１以上の温度で実施される；各増幅反応は、６０℃または約６０℃で実施される；各増幅反応は、最高温度と最低温度の間の温度で実施され、ここで最高温度は、最低温度から２０℃の範囲内である；各増幅反応は、最高温度と最低温度との間の温度で実施され、ここで最高温度は、最低温度から１５℃の範囲内である；各増幅反応は、最高温度と最低温度との間の温度で実施され、ここで最高温度は、最低温度から１０℃の範囲内である；各増幅反応は、最高温度と最低温度との間の温度で実施され、ここで最高温度は、最低温度５℃の範囲内である；Ｎ１は、第１のＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列を含む；Ｎ１は、第１のＮＥＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含む；第１および第２の両方のＮＡは、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）である；Ｎ１は、トリガーオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）と１本鎖核酸（Ｔ１）とのアニーリングによって提供され、ここでＴ１は、第１のＮＥＲＳのセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかのヌクレオチド配列を含む；トリガーオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）を１本鎖標的核酸（Ｔ１）（５’から３’に向かって以下を含む：（Ａ）第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列；および（Ｂ）トリガーＯＤＮＰの少なくとも一部分に対して、少なくとも実質的に相補的であり、そして必要に応じて正確に相補的である配列）に対してアニーリングすることによってＮ１が提供される場合、Ｔ１のヌクレオチド（Ｂ）は、このトリガーＯＤＮＰの少なくとも一部分に対して、正確に相補的である；Ｔ１は、実質的にＴ２と同一である；Ｔ２の３’末端は、リン酸基と結合している；Ｔ１の３’末端は、リン酸基と結合している；Ｔ１は、Ｔ２と正確に同一である；Ｔ１は、実質的にも正確にもＴ２と同一でない；Ｎ１中のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の５’側に位置するＮ１の一部分に対して少なくとも実質的に同一であり、そして必要に応じて正確に同一である、Ｔ２のヌクレオチド配列は、実際、第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の５’側に位置するＮ１の一部分と正確に同一である；Ｔ３が、Ｔ２のテンプレートヌクレオチド配列の少なくとも一部分に対して少なくとも実質的に同一であり、そして必要に応じて正確に同一である配列を含む場合、１つの実施形態において、Ｔ３は、テンプレートヌクレオチド配列Ｔ２の少なくとも一部分に対して正確に同一である配列を含む；Ａ２は、Ａ１のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的にに同一であり、そして必要に応じて正確に同一であるヌクレオチド配列を含む；Ａ２は、Ａ１のヌクレオチド配列に対して正確に同一である、ヌクレオチド配列を含む；Ａ１は、Ａ２のヌクレオチド配列に対して少なくとも実質的にに同一であり、そして必要に応じて正確に同一である、ヌクレオチド配列を含む；Ａ１は、Ａ２のヌクレオチド配列に対して正確に同一である、ヌクレオチド配列を含む；Ａ２およびＡ１は同一である；Ａ１は、Ａ２と実質的に同一である；Ａ２は、Ａ１と実質的に同一である；Ａ１は、Ａ２と正確に同一である；Ａ１は、実質的にも正確にもＡ２と同一ではない；Ａ１は、トリガーＯＤＮＰと実質的に同一である；Ａ１は、トリガーＯＤＮＰと正確に同一である；Ａ２は、トリガーＯＤＮＰと実質的に同一である；Ａ２は、トリガーＯＤＮＰと正確に同一である；Ａ１は少なくとも５ヌクレオチドの長さ、または少なくとも６ヌクレオチドの長さ、または少なくとも７ヌクレオチドの長さ、または少なくとも８ヌクレオチドの長さ、または少なくとも９ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１１ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１２ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１３ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１４ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１５ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１６ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１７ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１８ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１９ヌクレオチドの長さ、または少なくとも２０ヌクレオチドの長さ、または少なくとも２１ヌクレオチドの長さ、または少なくとも２２ヌクレオチドの長さ、または少なくとも２３ヌクレオチドの長さ、または少なくとも２４ヌクレオチドの長さ、または少なくとも２５ヌクレオチドの長さであり、一方でさらに、またはあるいはＡ１は、４０ヌクレオチド以下の長さ、または３９ヌクレオチド以下の長さ、または３８ヌクレオチド以下の長さ、または３７ヌクレオチド以下の長さ、または３６ヌクレオチド以下の長さ、または３５ヌクレオチド以下の長さ、または３４ヌクレオチド以下の長さ、または３３ヌクレオチド以下の長さ、または３２ヌクレオチド以下の長さ、または３１ヌクレオチド以下の長さ、または３０ヌクレオチド以下の長さ、または２９ヌクレオチド以下の長さ、または２８ヌクレオチド以下の長さ、または２７ヌクレオチド以下の長さ、または２６ヌクレオチド以下の長さ、または２５ヌクレオチド以下の長さ、または２４ヌクレオチド以下の長さ、または２３ヌクレオチド以下の長さ、または２２ヌクレオチド以下の長さ、または２１ヌクレオチド以下の長さ、または２０ヌクレオチド以下の長さ、または１９ヌクレオチド以下の長さ、または１８ヌクレオチド以下の長さ、または１７ヌクレオチド以下の長さ、または１６ヌクレオチド以下の長さ、または１５ヌクレオチド以下の長さ、または１４ヌクレオチド以下の長さ、または１３ヌクレオチド以下の長さ、または１２ヌクレオチド以下の長さ、または１１ヌクレオチド以下の長さ、または１０ヌクレオチド以下の長さであり、ここでＡ１のヌクレオチドの長さについての任意の指定の上限は、Ａ１のヌクレオチドの長さについての任意の指定の下限と合わせられ得、従って、Ａ１は、例えば、８〜２４ヌクレオチド長、または１２〜１７ヌクレオチド長であり得る；Ａ２は、少なくとも５ヌクレオチドの長さ、または少なくとも６ヌクレオチドの長さ、または少なくとも７ヌクレオチドの長さ、または少なくとも８ヌクレオチドの長さ、または少なくとも９ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１０ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１１ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１２ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１３ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１４ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１５ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１６ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１７ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１８ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１９ヌクレオチドの長さ、または少なくとも２０ヌクレオチドの長さ、または少なくとも２１ヌクレオチドの長さ、または少なくとも２２ヌクレオチドの長さ、または少なくとも２３ヌクレオチドの長さ、または少なくとも２４ヌクレオチドの長さ、または少なくとも２５ヌクレオチドの長さであり、一方でさらに、またはあるいはＡ２は、４０ヌクレオチド以下の長さ、または３９ヌクレオチド以下の長さ、または３８ヌクレオチド以下の長さ、または３７ヌクレオチド以下の長さ、または３６ヌクレオチド以下の長さ、または３５ヌクレオチド以下の長さ、または３４ヌクレオチド以下の長さ、または３３ヌクレオチド以下の長さ、または３２ヌクレオチド以下の長さ、または３１ヌクレオチド以下の長さ、または３０ヌクレオチド以下の長さ、または２９ヌクレオチド以下の長さ、または２８ヌクレオチド以下の長さ、または２７ヌクレオチド以下の長さ、または２６ヌクレオチド以下の長さ、または２５ヌクレオチド以下の長さ、または２４ヌクレオチド以下の長さ、または２３ヌクレオチド以下の長さ、または２２ヌクレオチド以下の長さ、または２１ヌクレオチド以下の長さ、または２０ヌクレオチド以下の長さ、または１９ヌクレオチド以下の長さ、または１８ヌクレオチド以下の長さ、または１７ヌクレオチド以下の長さ、または１６ヌクレオチド以下の長さ、または１５ヌクレオチドの長さ、または１４ヌクレオチド以下の長さ、または１３ヌクレオチド以下の長さ、または１２ヌクレオチド以下の長さ、または１１ヌクレオチド以下の長さ、または１０ヌクレオチド以下の長さであり、ここでＡ２のヌクレオチドの長さについての任意の指定の上限は、Ａ２のヌクレオチドの長さについての任意の指定の下限と合わせられ得、従って、Ａ２は、例えば、８〜２４ヌクレオチド長、または１２〜１７ヌクレオチド長であり得る；Ｔ２分子の最初の数は、Ｔ１分子の最初の数より多い；Ｎ１は、ゲノムＤＮＡに由来する；Ｎ１は、ゲノムＤＮＡの一部分である；標的核酸は、変性した２本鎖核酸の一方の鎖である；標的核酸は、２本鎖のゲノム核酸またはｃＤＮＡのうちの一方の鎖である；標的核酸は、ＲＮＡ分子である；標的核酸は、細菌から得た核酸由来である；標的核酸は、ウイルスから得た核酸由来である；標的核酸は、真菌類から得た核酸由来である；標的核酸は、寄生生物から得た核酸由来である；トリガーＯＤＮＰは、２本鎖のゲノム核酸またはｃＤＮＡのうちの一方の鎖である；トリガーＯＤＮＰは、ＲＮＡ分子である；トリガーＯＤＮＰは、細菌から得た核酸由来である；トリガーＯＤＮＰは、ウイルスから得た核酸由来である；トリガーＯＤＮＰは、真菌類から得た核酸由来である；トリガーＯＤＮＰは、寄生虫から得た核酸由来である；デオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも１つが標識される；デオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも１つが放射性標識と結合している；デオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも１つが酵素標識と結合している；デオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも１つが標識として機能する蛍光色素と結合している；デオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも１つが、標識として機能するジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｄｅｎｉｎ）と結合している；デオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも１つが、ビオチンと結合している；同じ型のＤＮＡポリメラーゼが、方法の全ての工程で用いられる；ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損である；ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損であり、そしてｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、ＤＮＡポリメラーゼ ＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐ

ｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＰｈｉＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホモエンザイムから選択され、ここで、列挙したＤＮＡポリメラーゼの任意の２つ以上を組合せて、本発明の方法において用いられるＤＮＡポリメラーゼが選択される群（例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼは、ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼまたはｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔポリメラーゼである）を形成し得る；ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有する；各増幅反応反応は、鎖置換促進因子の存在下で実施される；鎖置換促進因子は、増幅の間用いられ、ここで鎖置換促進因子は、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット群、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、単純ヘルペスウイルスタンパク質ＩＣＰ８、１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質、仔ウシ胸腺ヘリカーゼ、およびトレハロースの群から選択され、ここで本発明は、列挙した促進因子の任意の２つ以上を組合せて、本発明の１つの実施形態を実施するための促進因子が選択される群を形成し得る；鎖置換促進因子は、トレハロースである。
本発明の任意の方法は、増幅した核酸を検出（例えば、Ａ２の形成を質的または量的のいずれかで検出）する工程を含み得、好ましくはこの工程を含む。１つの実施形態において、検出は、発光分光法または発光分光測定法、蛍光分光法または蛍光分光測定法、質量分析法、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光、および電気泳動から選択される技術によって、少なくとも部分的に実施され、ここで、列挙した技術のうちの任意の２つ、３つ、４つ、またはそれより多くのメンバーを、本発明の実施形態において利用される技術を選択し得る技術のグループ（例えば、検出は、質量分析法または液体クロマトグラフィーによってなされ得る）を形成するように、ともにグループ化し得る。１つの実施形態において、検出は、２本鎖核酸に特異的に結合する蛍光インターカレート剤の使用を伴う。
他の局面において、本発明は、本発明の方法において有用であり得るか、またはそれによって生成され得る組成物を提供する。１つの局面において、本発明は、以下を含む組成物を提供する：（ａ）１本の鎖が、第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含む、第１の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子（第１の実施形態において、本明細書で参照されるようなＮ１であり、一方、第２の実施形態において、本明細書で参照されるようなＨ１である）、（ｂ）一方の鎖が５’→３’に以下：（ｉ）第２のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド、および（ｉｉ）第１の核酸における第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチドに対して５’に位置する配列に対して、少なくとも実質的に同一であり、そして必要に応じて正確に同一であるヌクレオチド配列を含む、第２の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子（第１の実施形態において、本明細書で参照されるようなＮ２であり、一方、第２の実施形態において、本明細書で参照されるようなＨ２である）。必要に応じて、第１のＮＡＲＳは、第１のニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能であり、そして第２のＮＡＲＳは、第２のニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能であり、または第１のＮＡＲＳは、第１の制限エンドヌクレアーゼによって認識可能であり、そして第２のＮＡＲＳは、第２の制限エンドヌクレアーゼによって認識可能である。第１のＮＡＲＳは、第２のＮＡＲＳに対して同一であり得る。必要に応じて、配列（ｂ）（ｉｉ）は、第１の核酸における第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチドに対して５’に位置する配列に対して、正確に同一である。関連する組成物において、本発明は、以下を含む組成物を提供する：（ａ）一方の鎖が、第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列を含む、第１の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子（第１の実施形態において、この分子は、本明細書で参照されるようなＮ１であり、一方、第２の実施形態において、この分子は、本明細書で参照されるようなＨ１である）、（ｂ）一方の鎖が５’→３’に以下：（ｉ）第２のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド、および（ｉｉ）第１の核酸における第１のＮＡＲＳのセンス鎖のヌクレオチドに対して３’に位置するヌクレオチド配列に対して、少なくとも実質的に相補性であり、そして必要に応じて正確に相補性であるヌクレオチド配列を含む、第２の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子（第１の実施形態において、この分子は、本明細書で記載されるようなＮ２であり、一方、第２の実施形態において、この分子は、本明細書で記載されるようなＨ２である）。必要に応じて、ヌクレオチド配列（ｂ）（ｉｉ）は、第１の核酸におけるＮＡＲＳのセンス鎖のヌクレオチドに対して３’に位置する配列に対して、正確に相補性である。本発明はまた、以下を含む組成物を提供する：（ａ）一方の鎖が３’→５’に以下：（ｉ）少なくとも８個のヌクレオチド長である第１の配列（Ｓ１’）、（ｉｉ）第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列および（ｉｉｉ）少なくとも８個のヌクレオチド長であり、そしてＳ１’に対して実質的に同一ではない第２の配列（Ｓ２’）を含む、第１の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子（第１の実施形態において、この分子は、本明細書で記載されるようなＮ１であり、一方、第２の実施形態において、この分子は、本明細書で記載されるようなＨ１である）、（ｂ）一方の鎖が３’→５’に以下：（ｉ）Ｓ２’に対して少なくとも実質的に同一であり、そして必要に応じて正確に同一である配列、（ｉｉ）第２のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）Ｓ１’に対して少なくとも実質的に同一、そして必要に応じて正確に同一であるヌクレオチド配列を含む、第２の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子（必要に応じて、第１の実施形態において、この分子は、本明細書で記載されるようなＮ２であり、一方、必要に応じて、第２の実施形態において、この分子は、本明細書で記載されるようなＨ２である）。
これらの組成物において、以下の付加的な基準および／または成分が、組成物、および本発明の方法に関連する上記の基準を記載するために使用され得る：組成物は、第１のＮＡＲＳを認識する第１のＮＡおよび第２のＮＡＲＳを認識する第２のＮＡをさらに含む；組成物は、第１のＮＡＲＳおよび第２のＮＡＲＳの両方を認識するニック形成剤をさらに含む；組成物は、組成物は、第１のＮＥＲＳおよび第２のＮＥＲＳの両方を認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）をさらに含む；組成物は、第１のＮＡＲＳおよび第２のＮＡＲＳの両方を認識するニック形成剤（ＮＡ）をさらに含む；組成物は、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉをさらに含む；組成物は、ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む；組成物は、５’→３’エキソヌクレアーゼを欠損するＤＮＡポリメラーゼをさらに含む；組成物は、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＰｈｉＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、セクエナーゼ（ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）、ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭ ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホモエンザイムからなる群より選択されるＤＮＡポリメラーゼをさらに含む；組成物は、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼをさらに含む；組成物は、鎖置換促進因子をさらに含む；組成物は、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、単純ヘルペスウイルスタンパク質ＩＣＰ８、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質、仔ウシ胸腺ヘリカーゼ、およびトレハロースの群より選択される鎖置換促進因子をさらに含み、ここで、この群の１以上のメンバーは、促進因子が本発明の実施形態において選択される群を形成するために組み合わされ得る；組成物は、トレハロースを含む；組成物は、標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェートを含む。組成物は、Ｔ２における第２のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチドに対して５’に位置する配列に対して、少なくとも実質的に相補性であり、そして必要に応じて正確な相補性である標識されたオリゴヌクレオチドを含む。組成物は、蛍光インターカレート剤を含む。
他の局面において、本発明は、単離された核酸分子を提供する。例えば、１つの局面において、本発明は、３’→５’に、本質的に以下からなる単離された一本鎖核酸分子を提供する：（ｉ）６〜１００個のヌクレオチド長である配列、（ｉｉ）ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）多くとも１００個のヌクレオチド長であるヌクレオチド配列。この単離された核酸分子は、本発明の組成物を形成するために、配列（ｉ）に対して、少なくとも実質的に相補性であり、そして必要に応じて正確に相補性であるオリゴヌクレオチドプライマー（トリガーＯＤＮＰ）と結合され得る。本発明によって提供される別の単離された一本鎖核酸分子は、ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖に対して同一である少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態において、核酸分子は、多くとも１００個、または９０個、または８０個、または７０個、または６０個、または５０個、または４０個、または３０個のヌクレオチド長である。必要に応じて、２つの最近接の少なくとも２個の配列間の距離は、多くとも７０個、または６０個、または５０個、または４０個、または３５個、または３０個、または３５個、または２０個、または１５個、または１０個のヌクレオチドである。この組成物の種々の局面において、１以上の以下の基準が、組成物を記載するために使用され得る：トリガーＯＤＮＰは、配列（ｉ）に対して正確に相補性である；組成物はまた、ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）を含み、ここで、ＮＡは、必要に応じてニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＡ）であり、ここで、ＮＥは、必要に応じてＮ．ＢｓｔＮＢ ＩまたはＮ．Ａｌｗ Ｉである；組成物は、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼを欠損するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＰｈｉＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、セクエナーゼ、ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホモエンザイム、ならびに鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ））をさらに含む；組成物はまた、鎖置換促進因子（例えば、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、単純ヘルペスウイルスタンパク質ＩＣＰ８、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質、仔ウシ胸腺ヘリカーゼ、およびトレハロースの群より選択される鎖置換促進因子）を含む。組成物は、トレハロースをさらに含む。以下の基準の任意の組み合わせは、単離された核酸分子および／または非単離の形態のこれらの核酸分子を含む組成物をさらに特徴付けるために使用され得る。：ＮＡＲＳは、ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）によって認識可能である；ＮＡＲＳは、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）によって認識可能である；ヌクレオチド配列（ｉ）は、８〜２４個のヌクレオチド長である；ヌクレオチド配列（ｉ）は、１２〜１７個のヌクレオチド長である；単離された核酸分子は、多くとも２００個のヌクレオチド長である；単離された核酸分子は、多くとも１００個のヌクレオチド長である；単離された核酸分子は、多くとも５０個、または４５個、または４０個、または３５個、または３０個のヌクレオチド長である；単離された核酸分子の５’末端における配列（ｉｉｉ）の一部は、少なくとも６個のヌクレオチド長である配列（ｉ）の一部に対して、少なくとも実質的に同一であり、そして必要に応じて正確に同一である；単離された核酸分子の５’末端における配列（ｉｉｉ）の一部は、少なくとも６個のヌクレオチド長である配列（ｉ）の一部に対して、正確に同一である；単離された一本鎖核酸分子は、基材に対して固定化される；単離された一本鎖核酸は、基材に対して共有結合で固定化される；単離された一本鎖核酸は、基材に対して非共有結合で固定化される；単離された一本鎖核酸分子は、少なくとも部分的にシリコン、ガラス、紙、セラミック、金属、メタロイドおよびプラスチックより形成される基材に対して固定化される；単離された一本鎖核酸は、リンカーを介して基材に対して固定化される。
他の局面において、本発明はまた、アレイを提供する。例えば、本発明は、以下を含むアレイを提供する：（ａ）複数の別個の領域を有する基材、（ｂ）複数ある一本鎖核酸が、本明細書に記載される単離された一本鎖核酸分子である、別個の領域に対して固定化された複数の一本鎖核酸。以下の基準が、これらのアレイをさらに記載するために使用され得、ここで、これらの基準は、任意に組み合わせられ得る：別個の領域の任意の１つにおける一本鎖核酸分子は、均質であるが、別の異なる領域における一本鎖核酸分子とは異なる；別個の領域の少なくとも１つにおける一本鎖核酸分子は、異種である；複数の一本鎖核酸は、基材に対して共有結合で固定化される；複数の一本鎖核酸は、基材に対して非共有結合で固定化される；基材は、少なくとも部分的にシリコン、ガラス、紙、セラミック、金属、メタロイドおよびプラスチックから選択される材料より形成される。１つの関連する局面において、本発明は、このアレイの使用のための方法を提供し、ここで、この方法は、１以上の一本鎖核酸分子を増幅させる。この方法は以下の工程を包含する：（Ａ）直前に記載したようなアレイに対して、（ｉ）１以上の核酸増幅反応混合物（ここで、増幅反応を、第１のニック形成剤の存在下で実施した）、または（ｉｉ）（ｉ）の増幅反応の増幅産物を適用する工程、（Ｂ）第２のニック形成剤の存在下で、（Ａ）において処理されたようなアレイ上で増幅反応を実施する工程。アレイの基材に対して固定化される核酸分子は、第２のニック形成剤によって認識されるＮＡＲＳのアンチセンス配列を含む。増幅反応は、１以上の一本鎖核酸を増幅させる。必要に応じて、この方法において、第１のニック形成剤は、第２のニック形成剤と同一である。
ＮＡＲＳを含む本発明の任意の方法あるいは化合物または組成物において、ＮＡＲＳは、すなわち、１以上のミスマッチヌクレオチドを含み得る。言い換えれば、ＮＡＲＳを形成する１以上のヌクレオチド塩基対は、従来のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成法則に従ってハイブリダイズし得ない。しかし、ミスマッチヌクレオチドが、ＮＡＲＳ中に存在する場合は、ＮＡＲＳのセンス鎖を形成するのに必要な少なくとも全てのヌクレオチドは、存在する。１つの実施形態において、ＮＡＲＳは、ミスマッチ塩基対を含む。１つの実施形態において、ＮＡＲＳ中にはミスマッチ塩基対は存在しない。１つの実施形態において、ＮＡＲＳ中に存在する全ての塩基は、従来のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成法則に従うようにマッチする。１つの実施形態において、ＮＡＲＳ中に１つのミスマッチ塩基対が存在し、一方、別の実施形態において、ＮＡＲＳ中に２つのミスマッチ塩基対が存在し、さらに別の実施形態において、ＮＡＲＳを形成する全ての塩基対は、不適性であり、また、別の実施形態において、ＮＡＲＳ（ここで、ｎ個の塩基対が、ＮＡＲＳを形成する）を形成するｎ−１個の塩基対は、ミスマッチである。１つの実施形態において、本発明は、第１のＮＡＲＳおよび第２のＮＡＲＳの両方を利用し、第１のＮＡＲＳに存在するミスマッチはまた、第２のＮＡＲＳにも存在する。１つの実施形態において、本発明は、第１のＮＡＲＳおよび第２のＮＡＲＳの両方を利用し、第１のＮＡＲＳに存在するミスマッチはまた、第２のＮＡＲＳに存在しない。１つの実施形態において、本発明は、第１のＮＡＲＳおよび第２のＮＡＲＳの両方を利用し、第１のＮＡＲＳは、ミスマッチ塩基対を含まないが、第２のＮＡＲＳは、１以上のミスマッチ塩基対を含む。１つの実施形態において、ＮＡＲＳにおいてマッチしないヌクレオチドが存在する。別の実施形態において、ＮＡＲＳのセンス配列を形成する全てのヌクレオチドは、マッチしない。別の実施形態において、ＮＡＲＳは、マッチしないヌクレオチドを含む。
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照することで明らかとなる。さらに、本明細書に明示される種々の参照は、より詳細に特定の手順および組成物を記載するものであり、そして、それゆえに本明細書でその全体において参考として援用される。
（発明の詳細な説明）
本発明は、ニック形成剤を使用して核酸を指数関数的に増幅するための、単純かつ有効な方法およびキットを提供する。この増幅は、等温で行われ得、かつ転写ベースである必要はない。これらの方法およびキットは、多くの領域において、特に、病原体または疾患の診断において有用である。
（Ａ．取り決め／定義）
本発明のより詳細な説明を提供する前に、以下のように、本明細書中で使用される場合の規約を規定して、定義を提供することは、本発明の理解に役立ち得る。さらなる定義もまた、本発明の記載全体を通じて提供される。
用語「３’側」および「５’側」とは、核酸の一本鎖中の特定部位の位置を説明するために本明細書中で使用される。核酸の位置が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列に対して「３’側」であるか、あるいは参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の「３’側」である場合、このことは、その位置が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の３’末端と、その核酸の鎖の３’側のヒドロキシルとの間にあることを意味する。同様に、核酸の位置が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列に対して「５’側」であるか、あるいは参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の「５’側」である場合、このことは、その位置が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の５’末端と、その核酸の鎖の５’側のホスフェートとの間にあることを意味する。さらに、ヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列「に対して直接３’側」であるか、あるいは参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列「の直ぐ３’側」である場合、このことは、その核酸配列が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の３’末端のすぐ隣であることを意味する。同様に、ヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列「に対して直接５’側」であるか、あるいは参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列「の直ぐ５’側」である場合、このことは、その核酸配列が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の５’末端のすぐ隣であることを意味する。
「天然に存在する核酸分子」とは、全長ゲノムＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子のような、天然に存在する核酸分子をいう。
「単離された核酸分子」とは、天然に存在するいかなる核酸分子とも同一でない核酸分子、または３より多い別々の遺伝子に及ぶ、天然に存在するゲノム核酸のいかなるフラグメントとも同一でない核酸分子をいう。
本明細書中で使用される場合、ヌクレオチド配列（「第一の配列」）（これは、他のヌクレオチド配列の５’末端に位置付する別のヌクレオチド配列（「第二の配列」）の一部である）とは、他のヌクレオチド配列の５’末端配列をいう。言い換えると、第一の配列の５’末端は、第二の配列の５’末端と同一である。
本明細書中で使用される場合、「ニック形成」とは、ニック形成を行う酵素によって認識されるヌクレオチド配列に対する特定の位置にて、完全に二本鎖の核酸分子または部分的に二本鎖の核酸分子のうちの一方の鎖のみの切断をいう。核酸がニック形成される特定の位置は、「ニック形成部位」（ＮＳ）と呼ばれる。
「ニック形成剤」（ＮＡ）は、完全に二本鎖の核酸分子または部分的に二本鎖の核酸分子の特定のヌクレオチド配列を認識し、かつこの認識配列に対する特定の位置にて、この核酸分子の一方の鎖のみを切断する、酵素である。完全に二本鎖の核酸分子または部分的に二本鎖の核酸分子が、半改変された（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｙ）認識／切断配列を含む場合、ニック形成剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ニック形成エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ）および制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｈｉｎｃ ＩＩ）（ここで、一方の鎖は、この制限エンドヌクレアーゼによる鎖（誘導体化されたヌクレオチドを含む鎖）の切断を防止する少なくとも１個の誘導体化されたヌクレオチドを含む）。
本明細書中で使用される場合、「ニック形成エンドヌクレアーゼ」（ＮＥ）とは、完全に二本鎖の核酸分子または部分的に二本鎖の核酸分子のヌクレオチド配列を認識し、かつこの認識配列に対する特定の位置において、この核酸分子の一方の鎖のみを切断する、エンドヌクレアーゼをいう。制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）（これは、完全に二本鎖の核酸分子または部分的に二本鎖の核酸分子の誘導体化されたヌクレオチド含有鎖の切断を防止するために、少なくとも１つの誘導体化されたヌクレオチドを含むことによって改変される認識配列を必要とする）とは異なり、ＮＥは、代表的には、ネイティブのヌクレオチドのみから構成されるヌクレオチド配列を認識し、かつこのヌクレオチド配列を含む、完全に二本鎖の核酸分子または部分的に二本鎖の核酸分子の一方の鎖のみを切断する。
本明細書中で使用される場合、「ネイティブのヌクレオチド」とは、アデニル酸、グアニル酸、シチジル酸、チミジル酸またはウリジル酸をいう。「誘導体化ヌクレオチド」は、ネイティブのヌクレオチド以外のヌクレオチドをいう。
ＮＡが認識する、完全に二本鎖の核酸分子または部分的に二本鎖の核酸分子のヌクレオチド配列は、「ニック形成剤認識配列」（ＮＡＲＳ）と呼ばれる。同様に、ＮＥが認識する、完全に二本鎖の核酸分子または部分的に二本鎖の核酸分子のヌクレオチド配列は、「ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列」（ＮＥＲＳ）と呼ばれる。ＲＥが認識する特定の配列は、「制限エンドヌクレアーゼ認識配列」（ＲＥＲＳ）と呼ばれる。本明細書中で使用される場合、「半改変ＲＥＲＳ」とは、二本鎖ＲＥＲＳをいい、ここで認識配列の一方の鎖は、ＲＥＲＳを認識するＲＥによる鎖（すなわち、その認識配列内に誘導体化ヌクレオチドを含む鎖）の切断を防止する少なくとも１つの誘導体化ヌクレオチド（例えば、α−チオデオキシヌクレオチド）を含む。
特定の実施形態において、ＮＡＲＳは、二本鎖ヌクレオチド配列であり、ここで、そのヌクレオチドの一方の鎖中の各ヌクレオチドは、他方の鎖中のその対応する位置にて、このヌクレオチドに相補的である。このような実施形態において、ＮＡＲＳを認識するＮＡによってニック形成可能なＮＳを含む鎖中のＮＡＲＳのヌクレオチドは、「ＮＡＲＳのセンス鎖の配列」または「二本鎖ＮＡＲＳのセンス鎖の配列」と呼ばれ、一方、ＮＳを含まない鎖中のＮＡＲＳのヌクレオチドは、「ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列」または「二本鎖ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列」と呼ばれる。
同様に、ＮＥＲＳが、一方の鎖が他方の鎖に正確に相補的である二本鎖ヌクレオチド配列である実施形態において、ＮＥＲＳを認識するＮＥによってニック形成可能なＮＳを含む鎖中に位置するＮＥＲＳのヌクレオチドは、「ＮＥＲＳのセンス鎖の配列」または「二本鎖ＮＥＲＳのセンス鎖の配列」と呼ばれ、一方、ＮＳを含まない鎖中に位置するＮＥＲＳのヌクレオチドは、「ＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列」または「二本鎖ＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列」と呼ばれる。例えば、例示的なニック形成エンドヌクレアーゼ（Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ）の認識配列およびニック形成部位は、切断部位を示すための「下向き黒三角記号」で、そして任意のヌクレオチドを示すためにＮで、以下に示される：
Figure 2005519643
 Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ認識配列のセンス鎖の配列は、５’−ＧＡＧＴＣ−３’であるが、アンチセンス鎖の配列は、５’−ＧＡＣＴＣ−３’である。
同様に、半改変ＲＥＲＳを認識するＲＥによってニック形成可能なＮＳを含む鎖（すなわち、いかなる誘導体化ヌクレオチドも含まない鎖）中の半改変ＲＥＲＳの配列は、「半改変ＲＥＲＳのセンス鎖の配列」と呼ばれ、半改変ＲＥＲＳ含有核酸の「半改変ＲＥＲＳのセンス鎖」中に位置し、一方、ＮＳを含まない鎖（すなわち、誘導体化ヌクレオチドを含む鎖）中の半改変ＲＥＲＳの配列は、「半改変ＲＥＲＳのアンチセンス鎖の配列」と呼ばれ、半改変ＲＥＲＳ含有核酸の「半改変ＲＥＲＳのアンチセンス鎖」中に位置する。
特定の他の実施形態において、ＮＡＲＳは、１つ以上のヌクレオチドミスマッチを有するが、上記の二本鎖ＮＡＲＳのインタクトなセンス鎖を含む、最大でも部分的に二本鎖のヌクレオチド配列である。本明細書中で使用される慣習に従って、ＮＡＲＳを記載する文脈において、２個の核酸分子が、ハイブリダイズされた産物を形成するように互いにアニーリングし、このハイブリダイズされた産物がＮＡＲＳを含み、そしてこのハイブリダイズされた産物のＮＡＲＳ内に少なくとも１つのミスマッチ塩基対が存在する場合、このＮＡＲＳは、部分的にのみ二本鎖であるとみなされる。このようなＮＡＲＳは、それらのニック形成活性のために二本鎖認識配列の一方の鎖のみを必要とする、特定のニック形成剤（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ）によって認識され得る。例えば、特定の実施形態において、Ｎ．ＢｓｔＮＢ ＩのＮＡＲＳは、以下のようなインタクトなセンス鎖を含み得る：
５’−ＧＡＧＴＣ−３’
３’−ＮＮＮＮＮ−５’
ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドを示し、１つの位置のＮは、他の位置のＮと同一であってもそうでなくてもよいが、この認識配列の中に少なくとも１つのミスマッチ塩基対が存在する。この状況において、ＮＡＲＳは、少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを有するとして特徴付けられる。
特定の他の実施形態において、ＮＡＲＳは、１つ以上の一致していないヌクレオチドを有するが、上記のように、二本鎖ＮＡＲＳのインタクトなセンス鎖を含む、部分的に一本鎖のヌクレオチド配列または完全に一本鎖のヌクレオチド配列である。本明細書中で使用される慣例に従って、ＮＡＲＳを記載する文脈において、２つの核酸分子（すなわち、第一の鎖および第二の鎖）が、互いにアニーリングし、ハイブリダイズされた産物を形成し、このハイブリダイズされた産物が、ＮＡによって認識される第一の鎖中のヌクレオチド配列を含み（すなわち、ハイブリダイズされた産物は、ＮＡＲＳを含む）、そしてＮＡによって認識される配列中の少なくとも１つのヌクレオチドが、ハイブリダイズされた産物が形成される場合に、第二の鎖中のヌクレオチドに対応しない（すなわち、それと向かい合わない）場合、このハイブリダイズされた産物のＮＡＲＳ内に少なくとも１つの一致しないヌクレオチドが存在し、そしてこのＮＡＲＳは、部分的に一本鎖であるかまたは完全に一本鎖であるとみなされる。このようなＮＡＲＳは、特定のニック形成剤（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ）によって認識され得、このニック形成剤は、これらのニック形成活性のために、二本鎖認識配列の一方の鎖のみを必要とする。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ ＩのＮＡＲＳは、特定の実施形態において、以下のようなインタクトなセンス鎖を含み得：
５’−ＧＡＧＴＣ−３’
３’−Ｎ０−４−５’
（ここで、「Ｎ」は、任意のヌクレオチドを示し、０−４は、ヌクレオチド「Ｎ」の数を示し、１つの位置での「Ｎ」は、別の位置での「Ｎ」と同じであってもそうでなくてもよい）、この鎖は、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉの二本鎖認識配列のセンス鎖のヌクレオチドを含む。この例において、相補鎖中の対応するヌクレオチドが存在しないという点において、Ｇ、Ａ、Ｇ、ＴまたはＣの少なくとも１つは、一致しない。この状況は、例えば、ハイブリダイズされた産物中に「ループ」が存在し、そして特に、センス配列がループ内に完全にまたは部分的に存在する場合、生じる。
本明細書中で使用される場合、句「核酸分子を増幅すること」または「核酸分子の増幅」とは、特定の核酸分子の２つ以上のコピーを作製することをいう。「核酸分子を指数関数的に増幅すること」または「核酸分子の指数関数的増幅」は、２つ以上の核酸増幅反応を含むタンデムな増幅系による、特定の核酸分子の増幅をいう。このような系において、第一の増幅反応からの増幅産物は、第二の核酸増幅反応のための増幅プライマーとして機能する。本明細書中で使用される場合、用語「核酸増幅反応」とは、核酸分子（Ｔ）を使用して、核酸分子（Ａ）の１つより多くのコピーを作製するプロセスをいい、この核酸分子（Ｔ）は、テンプレートとして核酸分子Ａのヌクレオチドに相補的な配列を含む。本発明に従って、第一の核酸増幅反応と第二の核酸増幅反応との両方が、ニック形成反応およびプライマー伸長反応を使用する。
本明細書中で使用される場合、「増幅プライマー」は、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含むテンプレート核酸にアニーリングしかつ開始プライマー伸長のためのプライマーとして機能する、オリゴヌクレオチドである。次いで、この開始プライマー伸長から得られる伸長産物、すなわち、増幅プライマーのヌクレオチドを含む鎖は、ニック形成され、次いで、そのニック形成部位において３’末端を含む同じ鎖中のフラグメントは、引き続くプライマー伸長のためのプライマーとして機能する。
「トリガーオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）」は、タンデム核酸増幅系の第一の核酸増幅反応におけるプライマーとして機能するＯＤＮＰである。これは、系の他の必要とされる構成成分（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＮＡ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、第一の増幅反応のためのテンプレート（Ｔ１）、および第二の増幅反応のためのテンプレート（Ｔ２））の存在下で、核酸分子の指数関数的増幅を誘発する。特定の実施形態において、この第一の増幅反応のためのテンプレート（Ｔ１）が、ＮＡＲＳの一方の鎖の配列を含む場合、このトリガーＯＤＮＰは、ＮＡＲＳの他方の鎖の配列を含み得る。トリガーＯＤＮＰは、標的核酸から誘導されても、化学合成されてもよい。
第一の核酸が、第二の核酸の消化産物または第二の核酸分子もしくはその相補体の一部をテンプレートとして使用した増幅産物のいずれかである場合、第一の核酸分子（「第一の核酸」）は、別の核酸分子（「第二の核酸」）「に由来する」かまたは別の核酸分子（「第二の核酸」）「から生じる」。第一の核酸分子は、第２核酸の少なくとも一部と正確に同一である配列または正確に相補的である配列を含まなければならない。
第一の配列の相補体が、所定の反応混合物（例えば、核酸増幅混合物）中の第二の配列にアニーリングし得る場合、この第一の核酸配列は、第二の核酸配列に「少なくとも実質的に同一」である。特定の好ましい実施形態において、第一の配列は、第二の配列に「正確に同一」であり、すなわち、各位置での第一の配列のヌクレオチドは、同じ位置での第二の配列のヌクレオチドと同一であり、かつ第一の配列は、第二の配列と同じ長さである。
第一の配列が、所定の反応混合物（例えば、核酸増幅混合物）中の第二の配列にアニーリングし得る場合、この第一の核酸配列は、第二の核酸配列と「少なくとも実質的に相補的」である。特定の好ましい実施形態において、第一の配列は、第二の配列に正確にまたは完全に相補的であり、すなわち、第一の配列の各ヌクレオチドは、その対応する位置で第二の配列のヌクレオチドと相補的であり、かつ第一の配列は、第二の配列と同じ長さである。
本明細書中で使用される場合、二本鎖核酸の他方の鎖（「第二の鎖」と呼ばれる）中の別の位置（例えば、規定された位置）「に対応する」位置に位置する二本鎖核酸の一方の鎖（「第一の鎖」と呼ばれる）中のヌクレオチドは、この第二の鎖中の対応する位置のヌクレオチドに相補的な第一の鎖中のヌクレオチドをいう。同様に、二本鎖核酸の他方の鎖（「第二の鎖」と呼ばれる）中のニック形成部位に対応する二本鎖核酸の一方の鎖（「第一の鎖」と呼ばれる）中の位置は、ニック形成が生じる第二の鎖中のヌクレオチドに相補的な第一の鎖中の２つのヌクレオチド間の位置のことをいう。
核酸配列が他の核酸配列に対して５’側に位置する場合、この核酸配列（または領域）は、別の核酸配列（または領域）「に対して上流である」。核酸配列が他の核酸配列に対して３’側に位置する場合、この核酸配列（または領域）は、別の核酸配列（または領域）「に対して下流である」。
（Ｂ．核酸の指数関数的増幅のための方法および組成物）
本発明は、ニック形成エンドヌクレアーゼを使用した核酸の指数関数的増幅のための方法および組成物を提供する。以下の節は、この方法の一般的な記述を最初に提供し、続いて、２つの型の核酸増幅方法の記述、核酸増幅のための組成物またはキット、ならびに本発明の方法および組成物の種々の用途を提供する。
（１．一般的説明）
１つの局面では、本発明は、核酸の指数関数的増幅のための単純かつ迅速な方法を提供する。これは、ニック形成剤（ＮＡ）およびＤＮＡポリメラーゼの組合わせによって触媒される、２以上の連結された増幅反応（すなわち、タンデム増幅系）を使用する。各増幅反応は、ＮＡが、ＮＡの認識配列を含む２本鎖または部分的に２本鎖の核酸分子にニックを形成する能力およびＤＮＡポリメラーゼがＮＡのニック形成部位（ＮＳ）での３’末端から伸長する能力に基づく。
第１の増幅反応（図１）では、トリガーＯＤＮＰは、ＮＡＲＳ（「第１ＮＡＲＳ」という）の１つの鎖の配列を含む第１テンプレート核酸（Ｔ１）にハイブリダイズして、２本鎖または部分的に２本鎖の核酸分子（「第１増幅反応の初期核酸分子（Ｎ１）」）を形成する。このトリガーＯＤＮＰは、この第１ＮＡＲＳの他方の鎖を含まず、Ｔ１において、第１ＮＡＲＳのこの鎖の３’側に位置するＴ１の一部分にハイブリダイズするか、またはこの第１ＮＡＲＳの他方の鎖を含み、その結果、Ｔ１に対するそのハイブリダイゼーションが、２本鎖第１ＮＡＲＳを含む核酸分子を形成するかのいずれかである。いずれの場合も、このトリガーＯＤＮＰとＴ１との間でのハイブリダイゼーションによって形成された核酸分子は、「第１増幅反応の初期核酸分子（Ｎ１）」といわれる。その５’末端においてＴ１の一部分が、ＤＮＡポリメラーゼ（「第１ＤＮＡポリメラーゼ」といわれる）の存在下で、Ｎ１における５’オーバーハングを形成する場合、このトリガーＯＤＮＰは、Ｔ１をテンプレートとして用いて伸長されて、この２本鎖第１ＮＡＲＳを含むハイブリッド（Ｈ１）を形成する（図１の工程（ａ））。得られるＨ１は、この第１ＮＡＲＳを認識するＮＡによってニック形成され得、３’末端および５’末端を、このニック形成部位にて生成する（工程（ｂ））。このニック形成部位にて５’末端を含むフラグメントが充分に短い（例えば、１８ヌクレオチド長未満）場合、これは、解離反応条件（例えば、６０℃にて）下で、Ｈ１の他の部分から解離する。しかし、このフラグメントが容易には解離しない場合、これは、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損であって、鎖置換活性を有する第１ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、ＮＳでのその３’末端からこのフラグメントの伸長によって置換され得る（工程（ｄ））。鎖置換はまた、鎖置換促進因子が存在する場合、この第１ＤＮＡポリメラーゼに鎖置換活性が存在しなくても生じ得る。このような伸長は、第１ＮＡにおいてのように、再度ニック形成され得る（「再ニック形成され得る」）、第１ＮＡについての新たなＮＳを再度形成する（工程（ｅ））。新たなＮＳにおいて５’末端を含むフラグメント（「Ａ１」という）は、Ｈ１の他方の部分から再度容易に解離し得るか、またはＮＳにおける３’末端から伸長によって置換され得る（工程（ｆ））。このニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返され得（工程（ｇ））、核酸フラグメントＡ１の線形蓄積／増幅をもたらす。
核酸分子の指数関数的増幅は、この第１増幅反応から増幅されたフラグメントＡ１を介して、上記の第１増幅反応と別の増幅反応（「第２増幅反応」という）とを合わせるかまたは結び付けることによって行われ得る。第２増幅反応（図２）では、Ａ１は、ＮＡＲＳ（「第２ＮＡＲＳ」という）のアンチセンス鎖の配列を含む、別の１本鎖核酸分子（Ｔ２）の一部分へとハイブリダイズする。得られる部分的に２本鎖の核酸分子は、「第２増幅反応の初期核酸分子（Ｎ２）」といわれる。Ｔ２のうちの、Ａ１がハイブリダイズする部分は、第２ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列の３’側に位置し、その結果、Ａ１は、Ｔ２をテンプレートとして用いたプライマー伸長反応についてのプライマーとして機能する。Ａ１からの伸長は、２本鎖の第２ＮＡＲＳを含むハイブリッド（Ｈ２）を生成する（図２の工程（ａ））。第２ＮＡＲＳを認識する第２ＮＡの存在下では、Ｈ２がニック形成され、このニック形成部位にて３’末端および５’末端を生成する（工程（ｂ））。このニック形成部位にて５’末端を含むフラグメントが充分に短い（例えば、１８ヌクレオチド長未満）である場合、これは、特定の反応条件（例えば、６０℃にて）下で、Ｈ２の他方の部分から解離し得る。しかし、このフラグメントがＨ２の他方の部分から容易に解離されない場合、これは、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損であって、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（「第２ＤＮＡポリメラーゼ」という）の存在下で、このＮＳにて３’末端を有するフラグメントの伸長によって置換され得る（工程（ｃ））。鎖置換はまた、この第２ＤＮＡポリメラーゼに鎖置換活性がなくとも、鎖置換促進因子の存在下で生じ得る。このような伸長は、第２ＮＡによって再度ニック形成され得る（「再ニック形成され得る」）、第２ＮＡについての新たなＮＳを再度作製する（工程（ｄ））。この新たなＮＳにて５’末端を含むフラグメント（「Ａ２という」）は、Ｈ２の他方の部分から再度容易に解離し得るか、またはこのＮＳにおける３’末端から伸長によって置換され得る（工程（ｅ））。このニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返され得（工程（ｆ））、この核酸フラグメントＡ２の指数関数的な蓄積／増幅を生じる。この増幅された１本鎖核酸フラグメント（すなわち、Ａ２）は、以下で詳細に記載するように、Ａ１と同一であってもよく、Ａ１と異なっていてもよく、またはＡ１と相補的であってもよい。
核酸増幅の本発明の方法は、２つの核酸増幅反応を一緒に連結することに制限されない。特定の実施形態では、第２増幅反応は、第３増幅反応とさらに結び付けられ得る。言い換えれば、この第２増幅反応の間に増幅された核酸分子Ａ２は、ＮＡＲＳ（「第３ＮＡＲＳ」という）の１つの鎖の配列を含む別の核酸分子「Ｔ３」の一部分へとアニーリングして、第３増幅反応における核酸分子「Ａ３」の増幅を誘発し得る。さらなる増幅反応が、この鎖に付加され得る。例えば、Ａ３は次いで、ＮＡＲＳ（「第４ＮＡＲＳ」という）の１つの鎖をまた含む別の核酸分子「Ｔ４」の一部分へとアニーリングして、第４増幅反応において、核酸分子「Ａ４」の増幅を誘発し得る。その後の各増幅反応は、その以前の増幅反応からの増幅フラグメントの線形増幅をもたらすので、この系の他の成分（例えば、テンプレート核酸分子、ＮＡ、およびＤＮＡポリメラーゼ）が増幅速度もレベルも制限しなければ、増幅系における増幅反応の数が多いほど、増幅レベルが高い。
（ａ．ニック形成剤）
上記のとおり、本発明の指数関数的核酸増幅方法は、２以上の核酸増幅反応を一緒に結び付け、そして各増幅反応は、ＮＡの存在下で行われる。１つの増幅反応についてのＮＡは、別の増幅反応についてのＮＡと異なっていても異なっていなくてもよい。１つの実施形態では、異なる増幅反応についてのＮＡは、互いに同一であり、その結果、たった１つのＮＡが核酸分子の指数関数的増幅に必要とされる。別の実施形態では、２つの異なるＮＡ（例えば、異なるＮＡＲＳを認識する２つのＮＡ）が用いられる。
完全または部分的に２本鎖の核酸の特定のヌクレオチド配列を認識し、そしてこの核酸の１つの鎖のみを切断する任意の酵素が、本発明においてニック形成剤として使用され得る。このような酵素は、ネイティブなヌクレオチドから構成される特定の配列を認識するＮＥ、または半改変認識配列を認識するＲＥであり得る。
ニック形成エンドヌクレアーゼは、その認識配列と重なるニック形成部位を有しても有さなくてもよい。その認識配列の外側にニックを形成する例示的なＮＥは、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉであり、これは、５’−ＧＡＧＴＣ−３’から構成される独特の核酸配列を認識するが、この認識配列の３’末端を４ヌクレオチド超えたところにニック形成する。Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉの認識配列およびニック形成部位を、以下：
Figure 2005519643
 によって示し、ここで、
Figure 2005519643
 は、切断部位を示し、文字Ｎは、任意のヌクレオチドを示す。Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉは、米国特許第６，１９１，２６７号に記載されるようにして、調製および単離され得る。米国特許第６，１９１，２６７号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。このニック形成エンドヌクレアーゼを使用するための緩衝液および条件はまた、この’２６７特許に記載される。その認識配列の外側にニック形成するさらなる例示的なＮＥは、Ｎ．ＡｌｗＩであり、これは、以下の２本鎖認識配列を認識する：
Figure 2005519643
 Ｎ．ＡｌｗＩのニック形成部位もまた、記号：
Figure 2005519643
 により示される。両方のＮＥは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）から入手可能である。Ｎ．ＡｌｗＩはまた、Ｘｕら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１２９９０−５，２００１）に記載されるように、ＩＩｓ型ＲＥ ＡｌｗＩを変異させることによって、調製され得る。
そのＮＥＲＳ内にニック形成する例示的なＮＥとしては、Ｎ．ＢｂｖＣＩ−ａおよびＮ．ＢｂｖＣＩ−ｂが挙げられる。これら２つのＮＥおよびＮＳの認識配列（記号：
Figure 2005519643
 で示す）を、以下に示す：
Figure 2005519643
 両方のＮＥは、ＮＥＢから入手可能である。
さらなる例示的なニック形成エンドヌクレアーゼとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎ．ＢｓｔＳＥ Ｉ（Ａｂｄｕｒａｓｈｉｔｏｖら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｓｋ）３０：１２６１−７，１９９６）、操作されたＥｃｏＲ Ｖ（Ｓｔａｈｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：６１７５−８０，１９９６）、操作されたＦｏｋ Ｉ（Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ ２０３：４３−４９，１９９７）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のエンドヌクレアーゼＶ（Ｈｕａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．４０：８７３８−４８，２００１）、Ｃｖｉ Ｎｉｃｋａｓｅ（例えば、ＣｖｉＮＹ２Ａ、ＣｖｉＮＹＳＩ、Ｍｅｇａｂａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ）（Ｚｈａｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４０：３６６−７５，１９９８；Ｎｅｌｓｏｎら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７９：４２３−８，１９９８；Ｘｉａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：９４７７−８７，１９８８）、および操作されたＭｌｙ Ｉ（すなわち、Ｎ．Ｍｌｙ Ｉ）（ＢｅｓｎｉｅｒおよびＫｏｎｇ，ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２：７８２−６，２００１）。さらなるＮＥは、他の制限エンドヌクレアーゼ、特に、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼを、ＥｃｏＲ Ｖ、ＡｌｗＩ、Ｆｏｋ Ｉおよび／またはＭｌｙ Ｉを操作するための方法と類似の方法を使用して操作することによって、得られ得る。
ニック形成剤として有用なＲＥは、その半改変された認識配列において２本鎖核酸にニック形成する任意のＲＥであり得る。この半改変された２本鎖認識配列にニック形成する例示的なＲＥとしては、Ａｖａ Ｉ、Ｂｓｌ Ｉ、ＢｓｍＡ Ｉ、ＢｓｏＢ Ｉ、Ｂｓｒ Ｉ、ＢｓｔＮ Ｉ、ＢｓｔＯ Ｉ、Ｆｎｕ４Ｈ Ｉ、Ｈｉｎｃ ＩＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩおよびＮｃｉ Ｉが挙げられるがこれらに限定されない。半改変された認識配列にニック形成するさらなるＲＥは、米国特許第５，６３１，１４７号に記載される鎖保護アッセイによってスクリーニングされ得る。
特定の実施形態において、ニック形成剤は、ＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖におけるヌクレオチド配列を認識し得、この二重鎖の一方の鎖にニック形成する。特定の他の実施形態において、ニック形成剤は、２本鎖ＲＮＡにおけるヌクレオチド配列を認識し得、このＲＮＡの一方の鎖にニック形成する。
特定のニック形成剤は、少なくとも部分的に二本鎖の基質核酸中に、２本鎖認識配列のセンス鎖の存在のみを、ニック形成活性のために必要とする。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉは、一方の鎖に、１つ以上のヌクレオチドが、基質核酸の他方の鎖上のヌクレオチドと従来の塩基対（例えば、Ｇ：Ｃ、Ａ：Ｔ、またはＡ：Ｕ）を形成しない、その認識配列「５’−ＧＡＧＴＣ−３’」のセンス鎖の配列を含む基質核酸のニック形成において活性である。Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉのニック形成活性は、その認識配列のセンス鎖における、この基質核酸の他方の鎖中のいずれのヌクレオチドとも従来の塩基対を形成しないヌクレオチド数の増加に伴って低減する。しかし、「５’−ＧＡＧＴＣ−３’」のヌクレオチドのいずれもが、他方の鎖中のヌクレオチドと従来の塩基対を形成しない場合でさえ、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉは、その最適活性の１０％〜２０％を依然として保持し得る。
（ｂ．ＤＮＡポリメラーゼ）
上記のように、本発明の指数関数的核酸増幅方法は、２以上の核酸増幅反応を一緒に結び付け、そして各増幅反応は、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で行われる。１つの増幅反応についてのＤＮＡポリメラーゼは、別の増幅反応についてのＤＮＡポリメラーゼと異なり得る。１つの実施形態では、異なる増幅反応についてのＤＮＡポリメラーゼは、互いに同一であり、その結果、ほんの１つのＤＮＡポリメラーゼが、核酸分子の指数関数的増幅に必要とされる。
本発明において有用なＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損であるが鎖置換活性を有する任意のＤＮＡポリメラーゼであり得る。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、およびｅｘｏ−Ｂｃａが挙げられるがこれらに限定されない。本発明において有用なさらなるＤＮＡポリメラーゼは、スクリーニングされ得るか、または米国特許第５，６３１，１４７号（その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載される方法によって作製され得る。鎖置換活性は、以下に記載されるような鎖置換促進因子の存在によってさらに増強され得る。
あるいは、特定の実施形態において、鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼが、使用され得る。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、Ｔａｑ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、これらのＤＮＡポリメラーゼの使用は、鎖置換促進因子の存在を必要とする。「鎖置換促進因子」は、ＤＮＡポリメラーゼに触媒される、ニック形成部位での３’末端からの核酸伸長の間の鎖置換を促進する任意の化合物または組成物である。本発明において有用な、例示的な鎖置換促進因子の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット（Ｔｓｕｒｕｍｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：７６４８−５３，１９９３）、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質（Ｚｉｊｄｅｒｖｅｌｄおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｔ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８：１１５８−６４，１９９４）、単純ヘルペスウイルスタンパク質ＩＣＰ８（ＢｏｅｈｍｅｒおよびＬｅｈｍａｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：７１１−５，１９９３；ＳｋａｌｉｔｅｒおよびＬｅｈｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０６６５−９，１９９４）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＲｉｇｌｅｒおよびＲｏｍａｎｏ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：８９１０−９，１９９５）、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質（ＶｉｌｌｅｍａｉｎおよびＧｉｅｄｒｏｃ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：１４３９５−４４０４，１９９６）、ウシ胸腺ヘリカーゼ（Ｓｉｅｇｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１３６２９−３５，１９９２）およびトレハロース。１つの実施形態では、トレハロースが、増幅反応混合物中に存在する。
本発明において有用な、さらなる例示的なＤＮＡポリメラーゼとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ファージＭ２ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｇｅｎｅ ８４：２４７，１９８９）、ファージＰｈｉＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：８２８７，１９８７）、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、Ｇｅｎｅ ９７：１３−１９，１９９１）、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ（ＺｈｕおよびＩｔｏ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２１９：２６７−７６，１９９４）、９°Ｎｍ ＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：５２８１−５，１９９６；Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０２：４４７−６２，２０００）およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素（ＫａｂｏｏｒｄおよびＢｅｎｋｏｖｉｃ、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５：１４９−５７，１９９５）。
あるいは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼが使用され得る。例えば、このようなＤＮＡポリメラーゼは、ニック形成の後にテンプレート核酸から自動的に解離する短い核酸フラグメントを増幅するために有用であり得る。
ニック形成剤がＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＤＮＡ鎖にニックを形成する特定の実施形態において、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが使用され得る。ニック形成剤がＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖にニックを形成する他の実施形態において、ＤＮＡプライマーから伸長させるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ））が使用され得る。両方の場合において、標的ｍＲＮＡは、ｃＤＮＡに逆転写される必要はなく、そして標的ｍＲＮＡに対して少なくとも実質的に相補的であるテンプレート核酸分子と直接に混合され得る。
（ｃ．反応条件）
本発明の指数関数的核酸増幅方法は、各々が、増幅を達成する際にニック形成反応およびプライマー伸長反応を利用する、２以上の核酸増幅反応を結び付ける。本発明の方法によれば、各増幅反応において、ＤＮＡポリメラーゼは、ＮＡがテンプレート核酸と混合される前、混合された後、または混合されると同時に、核酸分子（例えば、テンプレート核酸分子）と混合され得る。好ましくは、ニック形成−伸長反応緩衝液は、ＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼの両方に適切であるように最適化される。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ ＩがＮＡであり、ｅｘｏ−ＶｅｎｔがＤＮＡポリメラーゼである場合、ニック形成−伸長緩衝液は、０．５×Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ緩衝液および１×ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液であり得る。例示的な１×Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ緩衝液は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ ＫＣｌ、および１ｍＭ ジチオスレイトール（２５℃にてｐＨ７．５）であり得る。例示的な１×ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液は、１０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃にてｐＨ８．８）、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、および０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００であり得る。当業者は、ＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼについての反応緩衝液を容易に見出し得る。
さらに、ＤＮＡポリメラーゼが解離性である（すなわち、このＤＮＡポリメラーゼは、テンプレート核酸から比較的解離しやすい（例えば、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ））特定の実施形態において、反応混合物中のＮＡ 対 ＤＮＡポリメラーゼの比はまた、全長核酸分子の最大増幅のために最適化され得る。本明細書中で使用される場合、「全長」核酸分子とは、そのテンプレートの５’末端配列に相補的な配列を含む、増幅された核酸分子をいう。言い換えれば、全長核酸分子は、完全な遺伝子伸長反応の増幅産物である。ＤＮＡポリメラーゼの量に対してＮＡの量が過剰である反応混合物において、部分的増幅産物が生成され得る。部分的増幅産物の生成は、ＮＡによる、部分的に増幅された核酸分子の過剰なニック形成およびその後のテンプレートからのこれらの分子の解離に起因し得る。このような解離は、その部分的に増幅された核酸分子がさらに伸長されるのを妨げる。
異なるＮＡまたは異なるＤＮＡポリメラーゼは、異なるニック形成活性またはプライマー伸長活性を有し得るので、全長核酸の最大の増幅に最適な、特定のＮＡ 対 特定のＤＮＡポリメラーゼの比は、その特定のＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼの身元に依存して変化する。しかし、特定のＮＡと特定のＤＮＡポリメラーゼとの所定の組み合わせについては、その比は、異なるＮＡ 対 ＤＮＡポリメラーゼ比を有する反応混合物中で指数関数的な核酸増幅反応を行い、当該分野で公知の技術を使用して（例えば、液体クロマトグラフィーまたは質量分析法により）その増幅産物を特徴付けることにより最適化され得る。全長核酸分子の最大の生成を可能にする比は、将来の増幅反応において使用され得る。
核酸分子の部分増幅が、第１の増幅反応および第２の増幅反応の両方の間に生じ得るけれども、第１増幅反応の間の部分増幅は、通常、全体的な核酸増幅レベルまたは速度に有意には影響を与えないことに注意されたい。第１の増幅反応の間に増幅される核酸分子は、第２の増幅反応の間の開始プライマー伸長のためのＯＤＮＰとして使用されるので、それらの核酸分子が、それらのテンプレートに対する特異的アニーリングを可能にするのに十分長い場合、その意図する用途に十分である。あるいは、全長核酸増幅についてのＮＡ 対 解離ＤＮＡポリメラーゼの最適な比を用いることに加えて、部分増幅産物の量は、増幅反応が一定期間進行した後に（ＤＮＡポリメラーゼではなく）ＮＡを（例えば、熱不活性化により）不活性化し、そして各々の遺伝子伸長反応が完了するまで進行させることによって消滅または減少され得る。
特定の好ましい実施形態において、本発明のニック形成反応および伸長反応は、等温条件下で行われる。本明細書中で使用される場合、「等温的に」および「等温条件」とは、増幅過程の間、反応の温度が本質的に一定に保持された（すなわち、同じ温度であるか、または上限温度と下限温度との差が２０℃以下である同じ狭い温度範囲内である）反応条件のセットをいう。本発明の増幅方法の利点は、上限温度と下限温度との間で温度をサイクルさせる必要がないことである。ニック形成反応および伸長反応の両方が、同じ温度にて、または同じ狭い温度範囲内で行われる。温度を維持するために使用される装置が、反応混合物の温度を少ない程度で変動させることが可能である場合、このような変動は、増幅反応に不利益ではない。等温増幅のための例示的な温度としては、５０℃〜７０℃の間の任意の温度、または５０℃〜７０℃、５５℃〜７０℃、６０℃〜７０℃、６５℃〜７０℃、５０℃〜５５℃、５０℃〜６０℃、もしくは５０℃〜６５℃の間の温度範囲が挙げられるが、これらに限定されない。多くのＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼは、上記の例示的温度にてまたは上記の例示的な温度範囲内で、活性である。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いるニック形成反応およびｅｘｏ− Ｂｓｔポリメラーゼ（ＢｉｏＲａｄ）を用いる伸長反応の両方は、約５５℃にて行われ得る。約５０℃〜７０℃の間で活性な他のポリメラーゼとしては、ｅｘｏ− Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｅｘｏ− Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｅｘｏ−Ｐｆｕ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）、ｅｘｏ−Ｂｃａ（Ｐａｎｖｅｒａ）およびＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｒａｄｅ Ｔａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
（ｄ.開始核酸（Ｎ１））
上で議論されたように、第１の核酸増幅のための開始核酸（すなわち、Ｎ１）は、トリガーＯＤＮＰとテンプレート核酸分子Ｔ１をアニーリングすることにより提供され得る。トリガーＯＤＮＰは、テンプレートとしてＴ１を用いるプライマー伸長のためのプライマーとして機能するので、トリガーＯＤＮＰは、Ｔ１の一部と実質的に相補的でなければならず、そしてトリガーＯＤＮＰはまた、３’末端を有し、そこからプライマー伸長が起こる。
特定の実施形態において、トリガーＯＤＮＰは、核酸分子から誘導される。そのトリガーの３’末端は、当該分野で種々の方法によって生成され得る。例えば、トリガーＯＤＮＰの３’末端は、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）を認識する制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ）を用いて、ＲＥＲＳを有する核酸フラグメントを消化することによって提供され得る。核酸フラグメントにおけるＲＥＲＳは、天然に存在し得るかまたはＲＥＲＳの１つの鎖を含むプライマーを用いることによってフラグメントに組み込まれ得る。あるいは、トリガーＯＤＮＰの３’末端は、ＮＡＲＳを認識するＮＡによって、ＮＡＲＳを有する核酸フラグメントにニックを形成することによって生成され得る。ＮＡＲＳはまた、天然に存在し得るかまたはＮＡＲＳの１つの鎖を含むプライマーを用いることによってフラグメントに組み込まれ得る。さらに、トリガーＯＤＮＰの３’末端は、Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ（米国特許第４，９５３，３５７号）に従うオリゴヌクレオチド特異的切断（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ）によってかまたはＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５６０−４，１９７７）に従う塩基特異的化学切断によって形成され得る。特定の実施形態において、トリガーＯＤＮＰの３’末端は、ＤＮａｓｅＩもしくは他の非特異的ヌクレアーゼで核酸分子を切断することによってかまたは核酸分子をせん断することによって提供され得る。切断産物が二本鎖核酸である状況において、トリガーＯＤＮＰは、二本鎖核酸を変性することによって獲得され得る。
トリガーＯＤＮＰが誘導される核酸分子は、天然に存在し得るかまたは合成され得る。それは、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得、一本鎖または二本鎖であり得る。このような核酸分子としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはその誘導体（例えば、ランダムプライムされた増幅産物または特異的にプライムされた増幅産物）が挙げられる。トリガーＯＤＮＰ自体は、一本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＲＮＡ分子であり得る。
同様に、Ｔ１はまた、酵素切断、化学切断、または機械的切断によって、別の核酸分子から獲得され得る。酵素切断は、例えば、その核酸分子を、その核酸分子内の特定の配列を認識する制限エンドヌクレアーゼで消化することによって達成され得る。あるいは、酵素的切断は、その核酸分子内の特定の配列を認識するニック形成剤でその核酸分子にニックを形成することによって達成され得る。酵素的切断はまた、Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ（米国特許第４，９５３，３５７号）に従うオリゴヌクレオチド特異的切断または発明の名称「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｕｓｉｎｇ Ｎｉｃｋｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ」の米国出願（Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌ Ｎｏ．ＥＶ０６５００４８６８ＵＳ）に記載されるような、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列を含む部分的に二本鎖の核酸であり得る。化学切断および機械的切断は、核酸分子を切断するのに適切な、当該分野で公知の任意の方法（例えば、せん断）によって達成され得る。切断産物が二本鎖核酸である状況において、Ｔ１分子は、二本鎖核酸分子を変性することによって獲得され得る。
上記のように、Ｔ１は、ＮＡＲＳの１つの鎖の少なくとも１つの配列を含む。ＮＡＲＳは、Ｔ１が誘導される核酸分子中に存在し得る。あるいは、ＮＡＲＳは、例えば、ＮＡＲＳの１つの鎖の配列を含むＯＤＮＰを用いることによって、Ｔ１に組み込まれ得る。特定の実施形態において、Ｔ１は２つ以上のＮＡＲＳの１つの鎖（すなわち、独立して選択される、センス鎖またはアンチセンス鎖）の配列を含み得る。代表的には、トリガーＯＤＮＰまたはその一部は、Ｔ１の３’末端に最も近接して位置するＮＡＲＳ鎖（「第１のＮＡＲＳ」と呼ぶ）の３’側の配列に実質的に相補的である。特定の実施形態において、単一のＴ１に存在する複数のＮＡＲＳの配列は、１つ以上のヌクレオチドで分離され得る。他の実施形態において、それらは、互いに直接隣接し得るかまたは部分的に重複さえし得る。複数のＮＡＲＳがＴ１分子中に存在する場合、それらは、互いに同一であり得るかまたは互いに異なり得る。複数のＮＡＲＳが互いに同一である場合、ＮＡＲＳを認識するＮＡとＤＮＡポリメラーゼとの存在下で、ＮＡＲＳ間の配列およびＴ１の５’末端に最も近接して位置するＮＡＲＳ（「最後のＮＡＲＳ」と呼ぶ）の５’側の配列は、それらの相補的配列を増幅するためのテンプレートとして使用されるか（Ｔ１がＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含む場合）、または増幅されるか（Ｔ１が、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含む場合）のいずれかである。特定の好ましい実施形態において、ＮＡＲＳ間の配列および最後のＮＡＲＳの５’側の配列は、互いに同一である。ＮＡＲＳが互いに異なる実施形態において、Ｔ１の特定の領域に相補的な配列の増幅（Ｔ１がＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含む場合）またはＴ１の特定の領域の増幅（Ｔ１がＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含む場合）は、Ｔ１の特定の領域の上流のＮＡＲＳを認識するＮＡを選択することによって達成され得る。
トリガーＯＤＮＰと同様に、Ｔ１分子は、種々の核酸分子から獲得され得る。これらの核酸分子としては、天然に存在する核酸分子および合成核酸が挙げられ、これらのいずれかは、二本鎖核酸分子または一本鎖核酸分子であり得、そしてＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ）またはＲＮＡであり得る。
特定の実施形態において、Ｔ１分子は、３’から５’にむかって、多くとも１００ヌクレオチド長の第１の配列；二本鎖ニック形成剤認識配列の１つの鎖の配列；および多くとも１００ヌクレオチド長の第２の配列を含むかまたはこれらから本質的になる。いくつかの実施形態において、Ｔ１分子は、多くとも２００、１５０、１００、８０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１８、１６、１４、１２、または１０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、第１の配列、第２の配列、またはその両方は、多くとも１００、８０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１８、１６、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、または４ヌクレオチド長であり得る。
（１）Ｔ１がニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そして（２）ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列に隣接するＴ１分子の一部にトリガーＯＤＮＰが相補的である特定の実施形態において、Ｔ１中のニック形成剤認識配列のセンス鎖内の１つ以上のヌクレオチドとトリガーＯＤＮＰにおける対応するヌクレオチドとの間にミスマッチが存在し得る。言い換えると、Ｔ１におけるニック形成剤認識配列のセンス鎖内の１つ以上のヌクレオチドは、トリガーＯＤＮＰ中の任意のヌクレオチドと従来の塩基対を形成し得ない。特定のニック形成剤（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ）は、それらの二本鎖認識配列のセンス鎖のみを含む基質にニックを形成し得るので、Ｔ１へのトリガーＯＤＮＰのアニーリングによって形成される開始核酸（Ｎ１）は、Ｔ１分子中の認識配列のセンス鎖を認識するニック形成剤の存在下で一本鎖核酸（Ａ１）を増幅するためのテンプレートとして使用され得る。二本鎖ニック形成剤認識配列の（インタクトなアンチセンス鎖ではなく）センス鎖の配列のみを含むテンプレート核酸を用いて一本鎖核酸を増幅するためのニック形成剤の使用についての詳細な説明は、発明の名称「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｕｓｉｎｇ Ｎｉｃｋｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ」の米国出願（Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌ Ｎｏ．ＥＶ０６５００４８６８ＵＳ）中に提供される。
トリガーＯＤＮＰ、Ｔ１、またはその両方が核酸分子から獲得される実施形態の代替として、本発明はまた、トリガーＯＤＮＰ、Ｔ１、またはその両方が合成核酸分子である実施形態を含む。オリゴヌクレオチド合成についての当該分野で公知の任意の方法が、トリガーＯＤＮＰおよび／またはＴ１を合成するために使用され得る。例えば、トリガーＯＤＮＰおよび／またはＴ１は、米国特許第６，１６６，１９８号、同第６，０４３，３５３号、同第６，０４０，４３９号、および同第５，９４５，５２４号（それらの全体が、本明細書中に参考として援用される）に開示される固相オリゴヌクレオチド合成方法によって合成され得る。簡単にいうと、固相オリゴヌクレオチド合成は、５’ブロックヌクレオチドを、樹脂に結合された新生オリゴヌクレオチドに連続的に連結し、次いで、酸化および脱ブロック化してリン酸ジエステル結合を形成することによって実施され得る。さらに、トリガーＯＤＮＰおよび／またはＴ１は、カスタマー設計オリゴヌクレオチドを合成する企業から購入され得る。
特定の実施形態において、第１の増幅反応の開始核酸分子（すなわち、Ｎ１）は、テンプレート核酸分子Ｔ１とトリガーＯＤＮＰをアニーリングすること以外によって提供され得る。例えば、Ｎ１は、二本鎖ＮＡＲＳを含む二本鎖核酸分子であり得、いかなる開始プライマー伸長反応（例えば、図１の工程（ａ））も伴わずに、ＮＡＲＳを認識するＮＡによって容易にニック形成され得る（図１の工程（ｃ））。このような場合、Ｎ１分子の各々の鎖は、ＮＡＲＳの１つの鎖の配列を含む。従って、いずれかの鎖は、Ｔ１分子として考慮され得、その相補鎖はトリガーＯＤＮＰとして考慮され得る。二本鎖Ｎ１分子は、例えば、ＮＡＲＳを含む核酸の消化産物であり得る。Ｎ１中のＮＡＲＳの配列は、別の核酸配列に由来するかもしくは獲得され得るか、またはＮＡＲＳの１つの鎖の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーによってもしくはＴ１の化学合成の間にＮ１に組み込まれ得る。
Ｎ１は、二本鎖ＮＡＲＳまたはＮＡＲＳの１つの鎖のみのいずれかを含む、部分的に二本鎖の核酸分子であり得る。例えば、Ｎ１は、２つのＮＡＲＳを含む核酸分子のニック形成産物であるか、またはＮＡＲＳおよびＲＥＲＳの両方を含む核酸分子のニック消化産物であり得る。
（ｅ．Ｔ２分子）
Ｔ１と同様に、Ｔ２はまた、上記のような他の核酸分子内での酵素切断、化学切断、もしくは機械的切断によってか、またはテンプレートとして他の核酸分子を用いる核酸増幅によって、別の核酸分子から獲得され得る。Ｔ２が誘導される他の核酸分子は、天然に存在するかまたは合成性の、二本鎖または一本鎖の核酸（ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）またはＲＮＡ）であり得る。１つの実施形態において、Ｔ２は、化学合成される。
上記のように、Ｔ２は、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の少なくとも１つの配列を含む。ＮＡＲＳは、Ｔ２が誘導される核酸分子中に存在し得る。あるいは、ＮＡＲＳは、例えば、ＮＡＲＳの１つの鎖の配列を含むＯＤＮＰを用いることによってＴ２に組み込まれ得る。特定の実施形態において、Ｔ２は、２つ以上のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含み得る。代表的には、トリガーＯＤＮＰまたはその一部は、Ｔ２の３’末端に最も近接して位置するＮＡＲＳ（「第１のＮＡＲＳ」と呼ぶ）の３’側の配列に実質的に相補的である。特定の実施形態において、Ｔ２のＮＡＲＳの配列は、１つ以上のヌクレオチドで分離されている。他の実施形態において、それらは、互いに直接隣接し得るかまたは部分的に重複さえし得る。複数のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列がＴ２分子中に存在する場合、それらは、互いに同一であり得るかまたは互いに異なり得る。ＮＡＲＳが互いに同一である場合、ＮＡＲＳを認識するＮＡとＤＮＡポリメラーゼとの存在下で、ＮＡＲＳ間の配列およびＴ２の５’末端に最も近接して位置するＮＡＲＳ（「最後のＮＡＲＳ」と呼ぶ）の５’側の配列は、それらの相補的配列を増幅するためのテンプレートとして使用される。特定の好ましい実施形態において、ＮＡＲＳ間の配列および最後のＮＡＲＳの５’側の配列は、互いに同一である。ＮＡＲＳが互いに異なる実施形態において、Ｔ２の特定の領域に相補的な配列の増幅は、Ｔ２の特定の領域の上流のＮＡＲＳを認識するＮＡを選択することによって達成され得る。
増幅反応混合物中のＴ２分子の数は、代表的に、Ｔ１分子の数よりも多い。Ｔ１分子よりも多くの数のＴ２分子に対する優先性は、Ｔ２分子が、テンプレートとしてＴ１分子を用いて増幅された一本鎖核酸分子（すなわち、Ａ１）に対するアニーリングパートナーとして使用されるという事実に起因する。言い換えると、第１の増幅反応の間、各々のＴ１分子は、テンプレートとして使用されて、複数コピーのＡ１を生成する。従って、各々のＴ１分子について、好ましくは、複数のＴ２分子が存在し、テンプレートとして単一のＴ１分子を用いて増幅された複数のＡ１分子に対するアニーリングパートナーを提供する。
特定の実施形態において、Ｔ２分子は、３’から５’にむかって、多くとも１００ヌクレオチド長の第１の配列；二本鎖ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列；および多くとも１００ヌクレオチド長の第２の配列を含むかまたはこれらから本質的になる。いくつかの実施形態において、Ｔ２分子は、多くとも２００、１５０、１００、８０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１８、１６、１４、１２、または１０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、第１の配列、第２の配列、またはその両方は、多くとも１００、８０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１８、１６、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、または４ヌクレオチド長であり得る。
１つの局面において、本発明は、核酸分子（Ａ２）を増幅する方法を提供する。この方法は、（ａ）一本鎖核酸分子（Ａ１）を提供する工程；（ｂ）５’から３’にむかって、（ｉ）「テンプレートヌクレオチド配列」と命名されたヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、および（ｉｉｉ）Ａ１に少なくとも実質的に相補的な配列を含む、第２の一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程；ならびに（ｃ）Ｔ２、Ａ１、ＮＡＲＳを認識するニック形成剤、ＤＮＡポリメラーゼ、および１種以上のデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、第３の一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する工程（ここで、Ａ２は、Ｔ２のテンプレートヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である）を包含する。Ａ１が提供され得る例示の手段は、本明細書中に記載される。
本発明の指数関数的核酸増幅法は、Ｔ２がＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含むことを必要とするが、Ｔ１は、ＮＡＲＳのセンス鎖またはアンチセンス鎖の配列を含み得る。これらの２つの型の核酸増幅反応、および特定の好ましい実施形態は、以下に詳細に記載される。
（２．核酸増幅の第１型）
本発明に従う核酸増幅の第１型は、Ｔ１およびＴ２の両方がＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含む場合である。好ましくは、Ｔ１中のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列は、Ｔ２中のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列と同一である。その認識配列がＴ１およびＴ２の両方に存在する例示のＮＡとしてＮ．ＢｓｔＮＢ Ｉを用いて、この型の核酸増幅が、図３に示される。しかし、当業者は、他のニック形成剤（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ以外のニックエンドヌクレアーゼおよび制限エンドヌクレアーゼ）が代わりに使用され得ることを認識している。
図３に示される例示の実施形態において、開始核酸分子Ｎ１は、トリガーＯＤＮＰと、３つの領域（領域Ｘ１、Ｙ１、およびＺ１）を有するＴ１とをアニーリングすることによって形成される、部分的に二本鎖の核酸分子である。領域Ｘ１、Ｙ１、およびＺ１は、それぞれ、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ認識配列のアンチセンス鎖の配列のすぐ３’側の領域、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉの認識配列のアンチセンス鎖の配列の３’末端からトリガーＯＤＮＰの伸長産物中のＮ．ＢｓｔＮＢ Ｉのニック形成部位の３’末端ヌクレオチドに対応するヌクレオチドまでの領域（すなわち、３’−ＣＡＣＡＧＮＮＮＮ−５’（ここで、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣであり得る））、および領域Ｙ１のすぐ５’側の領域として規定される。トリガーＯＤＮＰは、領域Ｘ１に少なくとも実質的に相補的であり、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で核酸伸長のためのプライマーとして機能する。トリガーの伸長は、トリガーＯＤＮＰの５’末端配列が、領域Ｘ１の３’末端配列にアニールするか否かに依存して、二本鎖核酸フラグメント（Ｈ１）または部分的に二本鎖の核酸フラグメント（Ｈ１）を生じる。得られるＨ１は、二本鎖Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ認識配列を含み、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉによりニックを形成され得る。好ましい実施形態において、Ｔ１の３’末端は、例えば、リン酸基によりブロックされ、その結果、この末端からの伸長が防止される。トリガーＯＤＮＰの配列を含むニック形成産物は、ＤＮＡポリメラーゼによって、ニック形成部位で、その３’末端から再度伸長され得、ニック形成部位で、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉによって生成される５’末端を含む鎖Ａ１を置換する。ニック形成−伸長サイクルは、複数回反復され、置換された鎖Ａ１が蓄積される。次いで、Ａ１は、Ｔ２の領域Ｘ２（これはまた、さらなる２つの領域（領域Ｙ２およびＺ２）を含む）にアニーリングされ、第２の増幅反応のための開始核酸分子Ｎ２が形成される。領域Ｙ２は、領域Ｙ１と類似する配列（すなわち、３’−ＣＴＣＡＧＮＮＮＮ−５’（ここで、領域Ｙ２におけるＮは、領域Ｙ１における同じ位置のＮと同一であり得るかまたは異なり得る））を有し、領域Ｘ２およびＺ２は、それぞれ、領域Ｙ２の３’末端および５’末端にすぐ隣接する領域をいう。Ｔ２をテンプレートとして用いるＡ１の伸長により、Ａ１の５’末端配列が、領域Ｘ２の３’末端配列にアニーリングするか否か依存して、二本鎖核酸フラグメント（Ｈ２）または部分的に二本鎖の核酸フラグメント（Ｈ２）が生じる。得られるＨ２は、二本鎖Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ認識配列を含み、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩによりニック形成され得る。ニック形成部位の３’末端は、ＤＮＡポリメラーゼによって、再度伸長され得、ニック形成部位に５’末端を含む鎖Ａ２を置換する。ニック形成−伸長サイクルは、複数回反復され、置換された鎖Ａ２が蓄積／増幅される。Ａ２の増幅は、親数関数的である。なぜならば、それは、２つの関連した線形増幅反応の最終増幅産物であるからである。
Ａ２は、領域Ｚ２をテンプレートとして用いて増幅されるので、領域Ｚ２がＡ１に少なくとも実質的に相補的な配列またはＡ１に実質的には相補的でない配列を有するよう設計することによって、Ａ１と少なくとも実質的に同一な配列またはＡ１と異なる配列を有するよう、Ａ２は設計され得る。１つの実施形態において、領域Ｚ２は、Ａ１と少なくとも実質的に相補的であり、その結果、領域Ｘ２およびＺ２の両方は、Ａ１にアニーリングし得る。しかし、Ｚ２へのＡ１のアニーリングは、Ａ１の３’末端またはＨ２のニック形成産物の３’末端からの伸長によってニック形成部位で置換され得、従ってＡ２増幅の速度に有意には影響を与えない。この実施形態において、Ａ２は、Ａ１と少なくとも実質的に同一であり、そして必要に応じて正確に同一であるので、Ａ２はまた、領域Ｘ２にもアニーリングし得、そしてそれ自体の増幅を開始し得る。このような増幅は、Ａ２増幅の速度およびレベルを劇的に増大し得る。
核酸増幅系において核酸が増幅される速度を増大する代替の方法は、Ａ１が、Ｔ１に対するトリガーＯＤＮＰの配列と同一（または実質的に同一）の配列を有するようＴ１を設計することである。例えば、図４に示される例示の認識配列としてＮ．ＢｓｔＮＢＩの認識配列を用いる実施形態において、領域Ｘ１および領域Ｚ１は、両方とも、トリガーＯＤＮＰの配列（「Ｓ１」と呼ぶ）と実質的にまたは正確に相補的である同一の配列（「Ｓ１’」と呼ぶ）を含み得る。第１の増幅の間、Ａ１は、テンプレートとして領域Ｚ１を用いて増幅されるので、Ａ１は、Ｓ１と同一の配列を有する。次いで、Ａ１は、Ｔ１の別の分子をテンプレートとして用いる第２の増幅反応のためのオリゴヌクレオチドプライマーとして機能し得る。第１の増幅反応のためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびテンプレートは、それぞれ、第２の増幅反応のためのプライマーおよびテンプレートと同一の配列を有するので、第２の増幅反応から生じる増幅された核酸フラグメント（Ａ２）は、第１の増幅反応から増幅された核酸フラグメント（Ａ１）と同一の配列を有する。次いで、Ａ２は、Ｔ１の別の分子をテンプレートとして用いる第３の増幅反応のためのオリゴヌクレオチドプライマーとして機能し得、Ａ２と同一の核酸フラグメント（Ａ３）を増幅する。上記プロセスは、全てのＴ１分子がトリガーＯＤＮＰ分子もしくは増幅されたフラグメント（すなわち、Ａ１、Ａ２、Ａ３など）とアニーリングするまで、または核酸増幅反応のほかの必要な成分の１つ（例えば、デオキシヌクレオシド三リン酸）が消滅するまで複数回反復され得る。
上記核酸増幅プロセスの間、トリガーＯＤＮＰの存在により、その後の増幅反応のための増幅プライマーとして機能する、以前の増幅反応から増幅された核酸フラグメントによって連結された複数の増幅反応が開始される。各々の反応は、テンプレートとしてＴ１分子を使用し、そしてトリガーＯＤＮＰと同一の配列を有する核酸フラグメントを増幅する。最終結果は、テンプレートＴ１分子の存在下でのトリガーＯＤＮＰの非常に迅速な増幅である。この増幅プロセスは、テンプレートとしてＴ１分子のみを使用するので、それはまた、「トリガーＯＤＮＰの１テンプレート増幅」と称される。
トリガーＯＤＮＰの１テンプレート増幅のいくつかの実施形態において、領域Ｘ１は、トリガーＯＤＮＰの配列（Ｓ１）に少なくとも実質的に相補的な配列（Ｓ１ｘ’）以外のさらなる配列を含み得る。このさらなる配列は、Ｓ１ｘ’とＴ１中のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列との間に存在し得、そして５、１０、１５、２０、２５、５０、または１００以下のヌクレオチドを含み得る。同様に、領域Ｚ１はまた、Ｓ１ｘ’と少なくとも実質的に同一、および必要に応じて正確に同一の配列（Ｓ１ｚ’）以外のさらなる配列を含み得る。しかし、このようなさらなる配列が、領域Ｚ１中に存在する場合、Ｓ１ｚ’は、領域Ｙ１またはその３’部分に相補的でない限り、Ｔ１の５’末端に位置する必要があり、その結果、Ａ１が別のＴ１分子をテンプレートとして用いて伸長されるのを防止するために、Ａ１の３’末端にさらなる配列が存在しない。いくつかの実施形態において、そのさらなる配列は、Ｔ１中のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列とＳ１ｚ’との間に存在し、そして５、１０、１５、２０、２５、５０、または１００以下のヌクレオチドを含む。
関連の実施形態において、Ｔ２分子は、Ｔ１分子の代わりに、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列の３’側に位置する配列に、少なくとも実質的に同一であり、そして必要に応じてこれに完全に同一である、２本鎖ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の５’側に位置する配列を有する。従って、１本鎖核酸分子（Ａ１）（これは増幅反応における増幅生成物である）がＴ２分子にアニーリングする場合、別の１本鎖核酸分子（Ａ２）が指数的に増幅される。このＡ２は、Ａ１分子に少なくとも実質的に同一であり、そして必要に応じてこれに完全に同一であり、そして特定の実施形態において、Ａ１分子に完全に同一であり得る。
トリガーＯＤＮＰの１本テンプレート増幅の特定の実施形態において、Ｔ１は、多くとも、５０ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、１５０ヌクレオチド長または２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、Ｓ１ｘ’および／またはＳ１ｚ’は、少なくとも、６ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長または２０ヌクレオチド長である。いくつかの好ましい実施形態において、Ｓ１ｘ’および／またはＳ１ｚ’は、少なくとも、８〜２４ヌクレオチド長であり、より好ましくは、１２〜１７ヌクレオチド長である。
関連する方法において、トリガーＯＤＮＰは、上記のようなトリガー−ＯＤＮＰの１本テンプレート増幅におけるような１本のみのテンプレートの代わりに、２つのテンプレートＴ１およびＴ２を使用して、迅速に増幅され得る。例示的なＮＡＲＳ（この認識配列が、Ｔ１およびＴ２の両方に存在する）としてＮ．ＢｓｔＮＢ Ｉの認識配列を使用する、例示の実施形態を図５に例示する。図５に示すように、Ｓ１は、第１テンプレートＴ１（これはＳ１に相補的な配列（Ｓ１’）を有する）の領域Ｘ１にアニーリングするこによって第１増幅プロセス（工程（ａ））を開始する。領域Ｘ１に加えて、Ｔ１はまた、配列３’−ＣＴＣＡＧＮＮＮＮ−５’を有する領域Ｘ１の直ぐ５’側に、領域Ｙ１を有し、そして配列Ｓ２’（これはＳ１’とは異なる）を有する領域Ｙ１の直ぐ５’側に、領域Ｚ１を有する。第１増幅反応（工程（ｃ））の間に、配列Ｓ２（これは、Ｓ２’に相補的である）を有する核酸フラグメントＡ１が、増幅される。次いで、Ａ１は第２テンプレートＴ２の領域Ｘ２にアニーリングする。（工程（ｄ））。領域Ｘ２に加えて、Ｔ２はまた、配列３’−ＣＴＣＡＧＮＮＮＮ−５’（領域Ｙ２における各Ｎは、領域Ｙ１の対応する位置における配列と同一であるか、またはこれら配列とは異なる）を有する領域Ｘ２の直ぐ５’側に領域Ｙ２を有し、そして配列Ｓ１’（これはＳ１に相補的である）を有する領域Ｙ２の直ぐ５’側に領域Ｚ２を有する。第２増幅反応の間（工程（ｆ））、配列Ｓ１を有する核酸フラグメントＡ２（これは、領域Ｚ２中のＳ１’に相補的である）が増幅される。この増幅された核酸フラグメントＡ２は、トリガーＯＤＮＰに同一な配列を有するので、これはＴ１にアニーリングし得、そしてＡ１増幅の別のラウンド（すなわち、第３の増幅反応）を開始し得る。次いで、増幅されたＡ１は、Ａ２の増幅の別のラウンド（第４の増幅反応）を開始する。Ａ１およびＡ２のこのタンデム増幅は、複数回繰り返されて、トリガーＯＤＮＰ（これは、Ａ２に同一である）の迅速な蓄積／増幅を生じ得る。
核酸増幅の第１型の別の実施形態（すなわち、Ｔ１およびＴ２の両方がＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含む場合）は、２本のテンプレートの代わりに、１本のみのテンプレート（Ｔ１）を使用することである。ＮＡＲＳの１本鎖アンチセンス（「第１ＮＡＲＳ」）を有する代わりに、Ｔ１は別のＮＡＲＳ（「第２のＮＡＲＳ」）のさらなるアンチセンス鎖を有する。特定の実施形態において、第１のＮＡＲＳは、第２のＮＡＲＳとは異なる。しかし、好ましくは、第１のＮＡＲＳは第２のＮＡＲＳと同一である。この方法の例示的な実施形態を、図６に示し、ここで、第１のＮＡＲＳおよび第２のＮＡＲＳの両方は、それぞれの認識配列内でニックを形成するＮＡによって認識可能である。当業者は、対応する認識配列の外側でニック形成するＮＡ（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ）によって、認識可能であるＮＡＲＳもまた（あるいは代替的に）、Ｔ１分子中に存在し得ることを理解する。
図６を参照して、Ｔ１は第１ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列（Ｎ１）、および第２ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列（Ｎ２）の両方を含む。Ｎ１の３’側の配列、Ｎ１とＮ２との間の配列、およびＮ２の５’側の配列は、それぞれ、配列Ｓ１、配列Ｓ２および配列Ｓ３と称される。Ｓ１は、トリガーＯＤＮＰに少なくとも実質的に相補であり、その結果このトリガーＯＤＮＰがＴ１にアニーリングし得、そしてＤＮＡポリメラーゼの存在下でのプライマー伸長のためのプライマーとして機能し得る配列を、含有する。ＤＮＡポリメラーゼおよび第１ＮＡＲＳを認識するＮＡの存在下で、５’から３’方向に、部分的Ｎ１配列に相補的な配列、Ｓ２に相補的である配列（Ｓ２’）、Ｎ２に相補的な配列（Ｎ２’）およびＳ３に相補的である配列（Ｓ３’）を含む、核酸分子（「Ａ１」）が増幅される。次いで、Ａ１は、別の占有されていないＴ１分子（すなわち、別の分子（例えば、トリガーＯＤＮＰおよびＡ１分子）にアニーリングしていないＴ１分子）にアリーリングし得る。上記のＤＮＡポリメラーゼ（または別のＤＮＡポリメラーゼ）および第２ＮＡＲＳを認識するＮＡの存在下で、５’から３’方向に、部分的Ｎ２配列に相補的な配列およびＳ３に相補的な配列を含む核酸分子（Ａ２）が、増幅される。
特定の関連する実施形態において、Ｔ１分子は、２つより多くのＮＡＲＳのアンチセンス鎖配列を含み得る。ＮＡＲＳの複数のアンチセンス配列の存在は、Ｔ１分子の５’末端に最も近くに位置するＮＡＲＳの５’側の配列に相補的な配列の、増幅速度を増大させる。本発明の種々の実施形態において、このＴ１分子は、５０ヌクレオチド以下、７５ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下、１５０ヌクレオチド以下、または２００ヌクレオチド以下を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｔ１中のＮＡＲＳの複数のアンチセンス鎖配列のうちの２つの間の最短距離は、２５ヌクレオチド以下、５０ヌクレオチド以下、７５ヌクレオチド以下、または１００ヌクレオチド以下である。
特定の他の関連する実施形態において、Ｔ２分子のみ（Ｔ１分子のみ、またはＴ１分子およびＴ２分子の両方の代わりに）は、２つ以上のＮＡＲＳのアンチセンス鎖配列を含み得る。ＮＡＲＳの複数のアンチセンス鎖配列の存在は、Ｔ２分子の５’末端に最も近くに位置するＮＡＲＳの５’側の配列に相補的な配列の、増幅速度を増大させる。種々の実施形態において、このＴ２分子は、５０ヌクレオチド以下、７５ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下、１５０ヌクレオチド以下、または２００ヌクレオチド以下を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｔ２中のＮＡＲＳの複数のアンチセンス鎖配列のうちの２つの間の最短距離は、２５ヌクレオチド以下、５０ヌクレオチド以下、７５ヌクレオチド以下、または１００ヌクレオチド以下である。
（３．第２型の核酸増幅）
本発明に従う第２型の核酸増幅は、Ｔ１が第１ＮＡＲＳのセンス鎖配列を含み、そしてＴ２が第２ＮＡＲＳのアンチセンス鎖配列を含む場合である。好ましくは、この第１ＮＡＲＳは、第２ＮＡＲＳに同一である。センス鎖配列がＴ１中に存在し、かつアンチセンス鎖配列がＴ２中に存在する例示的なＮＡＲＳとして、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉを使用する、この型の核酸増幅を、図７に例示する。しかし、当業者は、他のニック形成試薬（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ以外のニック形成エンドヌクレアーゼ）が、代替的に使用され得ることを認識する。
図７に示される実施形態において、開始核酸分子Ｎ１は、トリガーＯＤＮＰを、３つの領域（領域Ｘ１、領域Ｙ１および領域Ｚ１）を有するＴ１とアニーリングすることによって形成される、部分的に２本鎖の核酸分子である。領域Ｘ１、領域Ｙ１および領域Ｚ１は、それぞれ、Ｎ．ＢｓｔＮＢ ＩによるＮ１の伸長産物（すなわちＨ１）のニック形成部位の直ぐ３’側の領域、ニック形成部位からＮ．ＢｓｔＮＢ Ｉの認識配列（すなわち、５’−ＧＡＧＴＣＮＮＮＮ−３’（ここで、ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣであり得る））のセンス鎖配列の５’末端側までの領域、および領域Ｙ２の直ぐ５’側の領域として規定される。このトリガーＯＤＮＰは、領域Ｘ１またはその一部に相補的であり、そしてＤＮＡポリメラーゼの存在下で核酸伸長のためのプライマーとして機能する。この伸長産物は、トリガーＯＤＮＰの５’末端配列が、領域Ｘ１の３’末端配列にアニーリングするかどうかに依存して、２本鎖核酸フラグメント（Ｈ１）または部分的２本鎖核酸フラグメント（Ｈ１）を生成する。この得られたＨ１は、２本鎖のＮ．ＢｓｔＮＢ Ｉ認識配列（これは、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉによってニック形成される）を含む。好ましい実施形態において、Ｔ１の３’末端は、この末端からの伸長を妨げるために、リン酸基でブロックされる。Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉの認識配列のセンス鎖を含むニック形成産物は、ＤＮＡポリメラーゼによって、ニック形成部位でのその３’末端から再度伸長されて、ニック形成部位で、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉによって生成される５’末端を含むＡ１鎖を置換し得る。このニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返されて、置換されたＡ１鎖の蓄積を生じる。次いでＡ１は、Ｔ２（これは、２つのさらなる領域、すなわち領域Ｙ２および領域Ｚ２を含む）の領域Ｘ２にアニーリングされて、第２増幅反応のための開始核酸分子Ｎ２を形成する。領域Ｙ２は、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉの認識配列のアンチセンス鎖配列、およびＢｓｔＮＢ Ｉの認識配列（すなわち、５’−ＮＮＮＮＧＡＣＴＣ−３’（ここで、ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣであり得る））のアンチセンス鎖配列の直ぐ５’側に位置する４つのヌクレオチドを、有する。領域Ｘ２および領域Ｚ２は、それぞれ、領域Ｙ２の３’末端および５’末端の直ぐ隣りの領域をいう。テンプレートとしてＴ２を使用するＡ１の伸長は、Ａ１の５’末端配列が領域Ｘ２の３’末端配列にアニーリングするかどうかに依存して、２本鎖核酸分子（Ｈ２）または部分的２本鎖核酸分子（Ｈ２）を生成する。この得られたＨ２は、２本鎖Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ認識配列を含み、これはＮ．ＢｓｔＮＢ Ｉによってニックを形成され得る。ニック形成部位での３’末端は、ＤＮＡポリメラーゼによって再度伸長されて、ニック形成部位で、５’末端を含むＡ２鎖を置換し得る。このニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返されて、置換されたＡ２鎖の蓄積／増幅を生じる。Ａ２のこの蓄積は、指数的である。なぜなら、これは２つの連結された直鎖増幅反応の最終増幅産物であるからである。
第１型の核酸増幅と同様に、Ａ２はまた、少なくとも実質的にＡ１に相補的である配列または実質的にＡ１に相補的でない配列を有するように領域Ｚ２を設計することによって、少なくとも実質的にＡ１に同一である配列またはＡ１とは異なる配列を有するように設計され得る。領域Ｚ２が、少なくとも実質的にＡ１に相補的である場合、Ａ２は領域Ｚ２をテンプレートとして使用して増幅されるので、Ａ２は少なくとも実質的にＡ１に同一であり、そして必要に応じてＡ１に完全に同一である。従って、Ａ２はまた、Ａ１のように、領域Ｘ２にアニーリングし得、そしてそれ自体の増幅を開始し得る。このような増幅は、Ａ２増幅の速度およびレベルを多いに増大させ得る。
（４．核酸増幅のための核酸、組成物またはキット）
１つの局面において、本発明は、核酸の指数増幅のための組成物およびキットを提供する。この組成物は一般に、少なくとも二本鎖核酸分子Ｎ１（またはＨ１）とＮ２（またはＨ２）との組合せを含む。例えば、第１のタイプの核酸増幅について、この組成物は、以下を含み得る：（１）第１の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子（すなわち、Ｎ１またはＨ１）であって、このうち１つの鎖は、第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む、第１核酸分子、ならびに（２）第２の少なくとも部分的に二本鎖の核酸（Ｎ２またはＨ２）であって、このうち１つの鎖は、５’→３’方向で、以下を含む：（ｉ）第２のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および（ｉｉ）この第１の核酸中の第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列の５’側に位置する配列に少なくとも実質的に同一であり、かつ必要に応じて正確に同一である、配列。第２のタイプの核酸増幅について、この組成物は、以下を含み得る：（１）第１の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子（Ｎ１またはＨ１）であって、このうち１つの鎖は、第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列を含む、第１の核酸分子、ならびに（２）第２の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子（Ｎ２またはＨ２）であって、このうち１つの鎖は、５’→３’方向で、以下を含む：（ｉ）第２のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、および（ｉｉ）この第１の核酸中の第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列の３’側に位置する配列に少なくとも実質的に相補的である核酸。
本発明のキットは、上記の組成物のうちの１つを含み得る。あるいは、このキットは、上記の第１または第２のいずれかのタイプの核酸増幅において機能するように設計された一本鎖核酸分子Ｔ１とＴ２との組合せを含み得る。例えば、第１のタイプの核酸増幅について、この組成物は、Ｔ１ならびにＴ２を含み、このＴ１は、第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含み、そしてこのＴ２は、５’→３’方向で、以下を含む：第２のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、およびＴ１中の第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列の５’側に位置する配列に少なくとも実質的に同一であり、かつ必要に応じて正確に同一である、配列。第２のタイプの核酸増幅について、この組成物は、Ｔ１ならびにＴ２を含み得、このＴ１は、第１のＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含み、そしてこのＴ２は、５’→３’方向で、以下を含む：第２のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、およびＴ１中の第１のＮＡＲＳのセンス鎖の配列の３’側に位置する配列に少なくとも実質的に相補的な配列。好ましくは、両方のタイプの核酸増幅について、第１のＮＡＲＳは、第２のＮＡＲＳと同一である。
さらに、本発明はまた、トリガーＯＤＮＰの１テンプレート増幅のための核酸分子Ｔ１を提供する。Ｔ１は、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、およびこのＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列の５’側および３’側の両方に位置するヌクレオチド配列を含み得る。上記のヌクレオチド配列は、一般に、少なくとも８ヌクレオチド長、好ましくは、少なくとも、９、１０、１１、１２、１３、１４ヌクレオチド長であり、トリガーＯＤＮＰとＴ１中のオリゴヌクレオチド配列との間の特異的アニーリングを可能にする。
本発明はさらに、トリガーＯＤＮＰまたはこのトリガーＯＤＮＰに実質的に同一なオリゴヌクレオチドの２テンプレート増幅のための組成物またはキットを提供する。一般に、この組成物は、少なくとも２つの一本鎖核酸分子Ｔ１およびＴ２を含む。Ｔ１は、３’→５’方向で、以下を含む：オリゴヌクレオチド配列（Ｓ１’）、第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、およびＳ１’とは実質的に同一ではない別のオリゴヌクレオチド配列（Ｓ２’）。一方、Ｔ２は、３’→５’方向で、以下を含む：Ｓ２’と少なくとも実質的に同一であり、かつ必要に応じて正確に同一である、オリゴヌクレオチド配列、第２のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、およびＳ１’と少なくとも実質的に同一である配列。一般に、Ｓ１’およびＳ２’の両方は、少なくとも８ヌクレオチド長であり、トリガーＯＤＮＰとＴ１中のＳ１’との間、およびテンプレートとしてＴ１中のＳ２’を使用して増幅された核酸分子（Ａ１）とＴ２中のＳ２’に少なくとも実質的に同一な配列との間の特異的アニーリングを可能にする。特定の実施形態において、Ｔ１もしくはＴ２、またはその両方は、少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４ヌクレオチド長であり得る。好ましくは、第１のＮＡＲＳは、第２のＮＡＲＳと同一である。
上記の核酸分子に加えて、本発明のキット（または組成物）は、以下の成分の少なくとも１つ、２つ、いくつか、または各々をさらに含み得る：（１）Ｔ１中のＮＡＲＳの１つの鎖の配列に対して３’側のＴ１の配列に対して、特異的にアニーリングし得るトリガーＯＤＮＰ；（２）一方の鎖の配列がＴ１、Ｔ２または両方に存在するＮＡＲＳを認識するニック形成剤（例えば、ＮＥまたはＲＥ）；（３）ニック形成剤（２）に対する緩衝液；（４）プライマー伸長について有用なＤＮＡポリメラーゼ；（５）ＤＮＡポリメラーゼ（４）に対する緩衝液；（６）デオキシヌクレオシド三リン酸；（７）改変されたデオキシヌクレオシド三リン酸；（８）コントロールＴ１、Ｔ２および／またはトリガーＯＤＮＰ；ならびに（９）鎖置換促進因子（例えば、トレハロース）。上記成分の多くについての詳細な記載は、上記に提供される。
特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＮＡに対して特異的な緩衝液もＤＮＡポリメラーゼに対して特異的な緩衝液も含まない。代わりに、本発明の組成物は、ニック形成剤およびＤＮＡポリメラーゼ両方に対して適切な緩衝液を含む。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉがニック形成剤であり、ｅｘｏ−ＶｅｎｔがＤＮＡポリメラーゼである場合、ニック形成伸長緩衝液は、０．５×Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ緩衝液および１×ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ緩衝液であり得る。
本発明の組成物は、これらの成分を単に混合することによってか、または本発明の組成物の形成を生じる反応を実施することによってかによって作製され得る。本発明のキットは、これらの成分のいくつかを混合することによって調製されても、これらの成分の各々を、個々の容器中に保持してもよい。
（５．核酸の固定化および核酸のアッセイ）
特定の実施形態において、本発明に従う指数関数的核酸増幅に関与する核酸またはオリゴヌクレオチドは、固相支持体（「基材」ともいわれる）に固定化され得る。固定化され得る核酸またはオリゴヌクレオチドとしては、標的核酸、開始核酸を調製するために有用なオリゴヌクレオチドプライマー（下記）、トリガーＯＤＮＰ、Ｔ１分子、およびＴ２分子が挙げられる。特定の実施形態において、このような核酸またはオリゴヌクレオチドは、これらが一本鎖である場合、これらの５’末端または３’末端によって固定化されるか、あるいはこれらが二本鎖である場合、これらの１つの鎖の５’末端または３’末端によって固定化される。
核酸またはオリゴヌクレオチドを固定化するための方法は、当該分野で公知である。特定の実施形態において、本発明の核酸またはオリゴヌクレオチドは、アレイを形成するように基材に固定化される。本明細書中で使用される場合、「アレイ」は、異なる領域で固相支持体に配置された核酸またはオリゴヌクレオチドの集団である。各領域は、いくらかの距離で隔離され、この距離において、核酸またはオリゴヌクレオチドは、結合も配置もされない。いくつかの実施形態において、領域の大きさは、２０〜５００ミクロンであり、隣接した領域の中心間の距離は、５０〜１５００ミクロンの範囲である。本発明のアレイは、２〜９、１０〜１００、１０１〜４００、４０１〜１，０００、または１，０００を超える異なる領域を含み得る。
一般的に、核酸またはオリゴヌクレオチドは、以下の２つの方法において基材に固定化され得る：（１）基材上で直接、核酸またはオリゴヌクレオチドを合成する方法（しばしば、「インサイチュ合成」といわれる）、あるいは（２）核酸またはオリゴヌクレオチドを別々に合成し、そうでなければ調製し、次いで、基材にこれらを配置または結合する方法（時々、「合成後結合」といわれる）。インサイチュ合成について、主要な技術は、フォトリソグラフィーである。簡潔には、この技術は、固相支持体の表面を光不安定性基で改変する工程を包含し、この光不安定性基は、例えば、結合エレメントによって基材に付着された酸素原子を保護する。この保護されたヒドロキシル基のアレイは、フォトリソグラフィーのマスクを通して照射され、照射された領域において反応性ヒドロキシル基を生成する。次いで、５’ヒドロキシルにおいて、同じ光不安定性基を用いて保護された３’−Ｏ−ホスホロアミダイト活性化デオキシヌクレオシドが、表面に対して提示され、カップリングが、照射された領域でヒドロキシル基を介して生じる。さらなる化学反応の後、基材はリンスされ、その表面は、さらなるヒドロキシル基がカップリングのために曝露されるように第２のマスクで照射される。第２の５’保護化３’−Ｏ−ホスホロアミダイト活性化デオキシヌクレオシドが、表面に対して提示される。選択的光保護とカップリングとのサイクルは、所望される生成物のセットが得られるまで繰り返される。アレイの製造におけるフォトリソグラフィーの使用の詳細な記載は、以下の特許または公開特許出願において見出され得る：米国特許第５，１４３，８５４号；同第５，４２４，１８６号；同第５，８５６，１０１号；同第５，５９３，８３９号；同第５，９０８，９２６号；同第５，７３７，２５７号；および公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ９９／４０１０５；ＷＯ９９／６０１５６；ＷＯ００／３５９３１。
合成後付着アプローチは、前もって準備するオリゴヌクレオチドを基材に付着するための方法を必要とする。１つの方法は、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を用いる。簡単に述べれば、ビオチンとストレプトアビジンとが、共有結合ではないが、強度において共有結合に等価であると考えられ得る非常に強い相互作用を形成することが周知である。あるいは、予め合成されたかまたは予め調製された核酸またはオリゴヌクレオチドを、基材に共有結合し得る。例えば、カルボジイミドは、３つの異なるアプローチで一般に用いられ、ＤＮＡを固体支持体に結合する。１つのアプローチでは、支持体は、次に、カルボジイミドおよびカルボキシ改変オリゴヌクレオチドで処理されるヒドラジド基でコートされる。あるいは、複数のカルボン酸基をもつ基材は、アミノ改変オリゴヌクレオチドおよびカルボジイミドで処理され得る。エポキシドを基礎にした化学もまた、アミン改変オリゴヌクレオチドと用いられる。予め存在するオリゴヌクレオチドを基材に付着するための方法の詳細な記載は、以下の参考文献中に見出され得る：米国特許第６，０３０，７８２号；同第５，７６０，１３０号；同第５，９１９，６２６号；公開されたＰＣＴ特許出願番号ＷＯ００／４０５９３；Ｓｔｉｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：６３７９〜６３８３（１９９５）；Ｂｅａｔｔｉｅら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１：７００〜７０６（１９９５）；Ｌａｍｔｕｒｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２１２１〜２１２５（１９９４）；Ｃｈｒｉｓｅｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：３０３１〜３０３９（１９９６）；およびＨｏｌｍｓｔｒｏｍら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９：２７８〜２８３（１９９３）。
主要な合成後付着技法は、インクジェットおよび機械的スポットを含む。インクジェットは、インクジェットプリンティング工業に由来するディスペンサを用いて核酸またはオリゴヌクレオチドを散布することを含む。この核酸またはオリゴヌクレオチドは、供給源プレートからプリントヘッド中に上に引き抜かれ、そして次に基材の上の位置に移動される。次いで、核酸またはオリゴヌクレオチドは、小オリフィスを通じて押され、プリントヘッドから基材の表面上に小滴の射出を引き起こす。アレイ製作においてインクジェットを用いる詳細な記載は、以下の特許中に見出され得る：米国特許第５，７００，６３７号；第６，０５４，２７０号；第５，６５８，８０２号；同５，９５８，３４２号；同６，１３６，９６２号および同第６，００１，３０９号。
機械的スポットは、剛直性のピンの使用を含む。ピンは、核酸またはオリゴヌクレオチド溶液中に浸漬され、それによって少量の溶液をピンの先端上に移す。ピン先端を基材に触れさせてスポットを残し、その直径は、ピン、核酸またはオリゴヌクレオチド溶液、および基材の表面エネルギーによって決定される。機械的スポットは、一回の核酸またはオリゴヌクレオチドローディグで複数のアレイをスポットするために用いられ得る。アレイ製作において機械的スポットを用いる詳細な記載は、以下の特許および公開された特許出願中に見出され得る：米国特許第６，０５４，２７０号；同第６，０４０，１９３号；同第５，４２９，８０７号；同第５，８０７，５２２号；同第６，１１０，４２６号；同第６，０６３，３３９号；および同第６，１０１，９４６号；ならびに公開されたＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９９／３６７６０；ＷＯ９９／０５３０８；ＷＯ００／０１８５９；およびＷＯ００／０１７９８。
当業者は、上記に記載した技法の他に、他の方法もまた、基材に核酸またはオリゴヌクレオチドを固定することにおいて用いられ得ることを認識する。このような方法の記載は、制限されないで、以下の特許または公開された特許出願中に見出され得る：米国特許第５，６７７，１９５号；同第６，０３０，７８２号；同第５，７６０，１３０号；および同第５，９１９，６２６号；ならびに公開されたＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９８／０１２２１；ＷＯ９９／４１００７；ＷＯ９９／４２８１３；ＷＯ９９／４３６８８；ＷＯ９９／６３３８５；ＷＯ００／４０５９３；ＷＯ９９／１９３４１；およびＷＯ００／０７０２２。
本発明の核酸またはオリゴヌクレオチドを固定してアレイを形成する基材は、適切な物質から調製される。この基材は、好ましくは、強固であり、かつ実質的に平坦な表面を有する。いくつかの実施形態において、この表面は、線引きしたエリアに対して盛り上がった部分を有し得る。このような線引（ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ）は、互いから別の領域で増幅反応混合物を分離し、そして別々の領域での増幅産物を個々に分析しそして特徴付けることを可能にする。適切な物質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ケイ素、ガラス、紙、セラミック、金属、メタロイド（ｍｅｔａｌｌｏｉｄ）およびプラスチック。代表的な基材は、シリコンウエハおよびホウケイ酸塩のスライド（例えば、顕微鏡のガラススライド）である。特に有用な固体支持体の例はシリコンウエハであり、これは通常、集積回路の構築における電子産業において、使用される。このウエハは、高度に研磨され、かつ片面は反射性であり、そして種々のリンカー（例えば、シラン化学反応を使用した、ポリ（エチレンイミン））で、容易にコーティングされ得る。ウエハは、ＷａｆｅｒＮｅｔ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡのような会社から市販される。
企図される適用に依存して、当業者は、本発明のアレイの固定分子の組成を変化し得る。例えば、本発明のＴ１分子またはＴ２分子は、そのアレイのどの個々の領域に固定されていても固定されていなくてもよい。好ましくは、アレイの個々の領域中の核酸またはオリゴヌクレオチドは、均質である。より好ましくは、その核酸またはオリゴヌクレオチドが固定されるアレイのうちのどの個々の領域中の核酸またはオリゴヌクレオチドも、均質である。用語「均質」とは、本明細書中で使用される場合、個々の領域中の各核酸分子またはオリゴヌクレオチド分子が、同じ領域中の別の核酸分子またはオリゴヌクレオチド分子と同じ配列を有することを示す。あるいは、アレイの個々の領域のうちの少なくとも１つにおける核酸またはオリゴヌクレオチドが、均質である。用語「不均質」とは、本明細書中で使用される場合、個々の領域中の少なくとも１つの核酸分子またはオリゴヌクレオチド分子が、その領域中の別の核酸分子またはオリゴヌクレオチド分子とは異なる配列を有することを示す。いくつかの実施形態において、上記の核酸またはオリゴヌクレオチド以外の分子もまた、アレイの個々の領域のうちのいくつかまたはすべてに存在し得る。例えば、アレイの品質について内部コントロールとして有用な分子が、アレイの個々の領域のうちのいくつかまたはすべてに結合され得る。そのような分子についての別の例は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの指標として有用な核酸であり得る。他の実施形態において、アレイのどの個々の領域中の核酸またはオリゴヌクレオチドの組成も、同じである。そのようなアレイは、選択された生物集団中の特定の遺伝子における遺伝的バリエーションを決定するため、または特定の遺伝子における変異と関連する疾患もしくは障害の並行診断において、有用であり得る。
企図される適用に依存して、本発明の固定された核酸またはオリゴヌクレオチド（例えば、Ｔ１分子またはＴ２分子）は、種々の標的核酸と少なくとも実質的に相補的であるかまたは少なくとも実質的に同一である、オリゴヌクレオチド配列を含み得る。そのような標的核酸としては、動物における遺伝性疾患と関連する遺伝子、オンコジーン、疾患の素因と関連する遺伝子、法医学的決定のために有用なゲノムＤＮＡおよび／もしくは父系決定のために有用なゲノムＤＮＡ、植物もしくは動物における望ましい特徴に関連する遺伝子または植物もしくは動物において望ましい特徴を付与する遺伝子、ならびに感染性生物のゲノムＤＮＡもしくは感染性生物のエピソームＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のアレイは、個々の領域において標的核酸の特定の型と少なくとも実質的に相補的であるかまたは少なくとも実質的に同一である、核酸またはオリゴヌクレオチドを含み得る。例えば、アレイは、第１の個々の領域において、疾患の素因に関連する第１遺伝子と少なくとも実質的に相補的であるかまたは少なくとも実質的に同一である、核酸またはオリゴヌクレオチドを有し得、第２の個々の領域において、これもまた疾患の素因に関連する第２遺伝子と少なくとも実質的に相補的であるかまたは少なくとも実質的に同一である別の核酸またはオリゴヌクレオチドを有し得、さらに、第３の個々の領域において、これもまた疾患の素因に関連する第３の遺伝子と少なくとも実質的に相補的であるかまたは少なくとも実質的に同一である別の核酸またはオリゴヌクレオチドを有し得るなどである。そのようなアレイは、個々の動物（ヒトを含む）または植物の疾患の素因を決定するために有用である。あるいは、アレイは、標的の機能により分類される複数の型の標的核酸と少なくとも実質的に相補的であるかまたは少なくとも実質的に同一である、核酸またはオリゴヌクレオチドを有し得る。
さらに、アレイは、種々の可能な遺伝子変化を含む標的核酸の一部と少なくとも実質的に相補的であるかまたは少なくとも実質的に同一である、核酸またはオリゴヌクレオチドを含み得る。例えば、そのアレイの第１領域は、その標的の１つの対立遺伝子の遺伝子変化を含む標的遺伝子の一部と少なくとも実質的に相補的であるかまたは少なくとも実質的に同一である、固定された核酸または固定されたオリゴヌクレオチドを含み得る。そのアレイの第２領域は、その標的の別の対立遺伝子の遺伝子変化を含む標的遺伝子の一部と少なくとも実質的に相補的であるかまたは少なくとも実質的に同一である、固定された核酸または固定されたオリゴヌクレオチドを含み得る。そのアレイは、その標的のさらなる対立遺伝子の遺伝子変化を含む標的遺伝子の一部と少なくとも実質的に相補的であるかまたは少なくとも実質的に同一である、固定された核酸または固定されたオリゴヌクレオチドを含む、さらなる領域を有し得る。
一般に、アレイ環境における首尾良い性能のために、その固定された核酸または固定されたオリゴヌクレオチドは、種々の処理（例えば、ハイブリダイゼーション、洗浄、または増幅反応が実施される温度でのインキュベーション）の間に安定でなければならず、解離すべきではない。この固定された核酸または固定されたオリゴヌクレオチドの密度は、その後の分析にために十分でなければならない。本発明の方法のために適切なアレイについて、代表的には、１０００個〜１０１２個、好ましくは１０００〜１０６個、１０６個〜１０９個、または１０９個〜１０１２個のＯＤＮＰ分子が、少なくとも１つの個々の領域中で固定される。しかし、基材への他の核酸の最小の非特異的結合はしか存在してはならない。この固定プロセスは、指数関数的核酸増幅に必要な固定された核酸または固定されたオリゴヌクレオチドの能力に干渉すべきではない。
特定の実施形態において、本発明の核酸またはオリゴヌクレオチドをリンカーを介して基質に間接的に結合させることが、望ましくあり得る。このリンカー（「リンカーエレメント」とも呼ばれる）は、その核酸またはオリゴヌクレオチドを基材から隔てるように作用する化学物質鎖を含む。特定の実施形態において、そのリンカーは、切断可能であり得る。リンカーエレメントを位置付けるための多数の方法が存在する。１つの一般的アプローチにおいて、その基材は、多数の反応端／反応部位をリンカーエレメントに提供する、ポリマー層でコートされる。一般的例は、ポリリジンでコートされたスライドガラスであり、これは市販されている。別の例は、公開されたＰＣＴ出願番号ＷＯ９９／０４８９６および米国特許第６，１５０，１０３号に記載されるような、ポリ（エチレンイミン）でコートされた基材である。
本発明のアレイは、本発明の核酸増幅が適用可能である、種々の分析の高スループットを可能にする。例えば、Ｔ２分子のアレイは、複数の標的核酸を増幅するために使用され得る。標的核酸の存在下で実施される増幅反応の反応混合物または反応産物は、一緒にプールされ得、そしてそのＴ２分子アレイに適用される。あるいは、異なる増幅反応の反応混合物または増幅産物が、そのアレイの異なる領域に適用され得る。その後、別の増幅反応ラウンド（「第２ラウンド」）が、アンチセンス鎖がＴ２分子中に存在するニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で、このアレイに対して実施され得る。このアレイにて実施される第２ラウンドの反応の増幅産物は、一緒にプールされ得、そして分析され得る。そのアレイ（例えば、マイクロウェルアレイ）が、特定の物理的障壁により線引きされた個々の領域を有する場合、個々のアレイ中の第２ラウンドの反応の増幅産物は、個々に分析され得る。
アレイを形成しない本発明の核酸分子について、本発明の核酸分子は、アレイを調製する際に有用な上記の方法を介して固定され得る。さらに、当該分野で公知の任意の方法が、使用され得る。例えば、本発明の標的核酸は、固定剤または組織プリントの使用により固定され得る。本発明の標的核酸はまた、まず、単離または精製され得、その後、核酸またはオリゴヌクレオチドに結合する基材（例えば、ニトロセルロース膜またはナイロン膜）に移される。
（Ｃ．核酸増幅方法および核酸増幅組成物の診断用途）
本明細書中で上記に詳細に記載されるように、本発明は、核酸の指数関数的増幅のための方法および組成物を提供する。これらの方法およびこれらの組成物は、核酸分子を迅速に増幅することが望ましい広範な種類の適用において用途を見出し得る。そのような迅速な増幅は、診断適用（例えば、生物学的サンプルにおける病原体（例えば、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物）の存在を迅速に検出することが望ましい場合）において特に望ましくあり得る。以下の節は、診断用途に特に適用可能な種々の例示的実施形態を記載する；しかし、そのような実施形態はまた、他の適用においても有用であり得る。
（１．概要）
本発明は、生物学的サンプルにおいて標的核酸分子を検出するために有用である。その標的核酸は、病原性生物から誘導されるかまたは病原性生物に由来する、核酸分子を含む。そのサンプル中の標的核酸の存在または非存在に依存して、増幅産物は、テンプレートとして標的核酸またはその一部を使用するように設計された増幅系において検出されても、検出されなくてもよい。その標的核酸またはその一部は、まず、第１の増幅反応においてテンプレートとして使用されるべき開始核酸分子（Ｎ１）中に組込まれる。その開始核酸分子はまた、第１のＮＡＲＳの少なくとも１つの鎖を含み、従って、ＤＮＡポリメラーゼと、第１のＮＡＲＳを認識するＮＡとの存在下で、第１の増幅反応を誘発する。その後、この第１の増幅反応からの産物（Ａ１）が、別のテンプレート核酸分子（Ｔ２）にアニールする。Ｔ２は、第２のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含み、従って、ＤＮＡポリメラーゼと、第２のＮＡＲＳを認識するＮＡとの存在下で、第２の増幅反応を誘発する。この第１の増幅反応の産物（Ａ１）の存在もしくは非存在および／または第２の増幅反応の産物（Ａ２）の存在もしくは非存在の決定は、生物学的サンプル中の標的核酸の存在または非存在を示す。
（２．開始核酸分子（Ｎ１））
診断適用のために有用な開始核酸分子は、種々のアプローチにより提供され得る。例えば、Ｎ１は、Ｔ１分子へのトリガーＯＤＮＰのアニーリングにより得られ得、ここで、このトリガーＯＤＮＰは、病原性生物に由来する核酸分子から誘導される。あるいは、Ｎ１は、病原性生物に由来する二本鎖核酸分子から直接誘導され得る。Ｎ１はまた、標的核酸に由来しかつ一本鎖核酸増幅のためのテンプレートとして機能する、突出を有する部分的に二本鎖の核酸分子であり得るか、または標的核酸とハイブリダイズ可能であるが一本鎖核酸増幅のためのテンプレートとして機能しない、突出を有する部分的に二本鎖の核酸分子であり得る。診断適用に関連するＮ１を提供するためのこれらの手段および他の手段が、下記に記載される。
（ａ．Ｎ１分子を提供するための第１の型の例示的方法）
Ｔ１分子にトリガーＯＤＮＰをアニーリングすることによりＮ１が提供される本発明の特定の実施形態において、このトリガーＯＤＮＰは、病原性生物に由来するＤＮＡ分子（例えば、ゲノムＤＮＡ分子）またはＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ分子）のいずれかから誘導され得る。病原性生物に由来する核酸分子が一本鎖である場合、その核酸分子は、トリガーＯＤＮＰとして直接使用され得る。あるいは、その一本鎖核酸は、より短いフラグメントを生成するように切断され得、ここで、これらのフラグメントのうちの１つ以上は、トリガーＯＤＮＰとして使用されるべきであり得る。病原性生物に由来する核酸分子が二本鎖である場合、その核酸は、変性され得てトリガーＯＤＮＰとして直接使用され得るか、またはその変性産物が、より短い複数の一本鎖フラグメントを提供するように切断され得、ここで、これらのフラグメントのうちの１つ以上が、ＯＤＮＰトリガーとして機能し得る。あるいは、この核酸は、より短い複数の二本鎖フラグメントを得るようにまず切断され得、その後、そのより短いフラグメントが、１つ以上のトリガーＯＤＮＰを提供するように変性される。
上記のように、Ｔ１分子は、トリガーＯＤＮＰと少なくとも実質的に相補的でなければならない。さらに、増幅反応混合物中のＴ１分子の数は、好ましくは、トリガーＯＤＮＰにアニーリングするための二本鎖核酸分子に由来するトリガーＯＤＮＰの相補鎖と有効に競合するために、トリガーＯＤＮＰの数よりも多い。
Ｎ１分子を調製するための第１の型の方法の例が、図８に示される。この図に示されるように、二本鎖ゲノムＤＮＡは、まず、制限エンドヌクレアーゼにより切断され得る。この消化産物は、変性され得、そしてその消化産物のうちの１つの一本の鎖が、核酸増幅反応を開始するためのトリガーＯＤＮＰとして使用され得る。
特定の好ましい実施形態において、Ｔ１は、３’から５’方向に、トリガーＯＤＮＰと少なくとも実質的に同一である第１配列、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および第１配列と少なくとも実質的に同一である第２配列を含み得る。そのようなＴ１分子は、さらなるいかなるテンプレート核酸分子も伴わずに、トリガーＯＤＮＰ、またはトリガーＯＤＮＰと実質的に同一である核酸フラグメントの指数関数的増幅を可能にする。
（ｂ．Ｎ１分子を提供するための第２の型の例示的方法）
トリガーＯＤＮＰをＴ１分子にアニールすることによりＮ１が提供される本発明の特定の実施形態において、トリガーＯＤＮＰは、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含む。そのトリガーＯＤＮＰは、病原性生物に由来する標的核酸（例えば、ゲノム核酸）から誘導され得る。Ｎ１が、その認識配列の外側にニック形成するニック形成エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ）により認識可能なＮＥＲＳを含む、特定の実施形態が、図９に示される。この図により示されるように、ＮＥＲＳを含むゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントが、変性され、そのゲノムＤＮＡの１本の鎖またはその鎖のフラグメントが、Ｔ１分子にアニールする。このＴ１分子は、ゲノムＤＮＡの、ＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列を含むもう一方の鎖の一部である。このＴ１分子にトリガーＯＤＮＰをアニーリングすると、増幅反応のための開始核酸分子Ｎ１が提供される。増幅反応混合物中のＴ１分子の数は、好ましくは、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含むゲノムＤＮＡ鎖もしくはそのフラグメントの鎖の数よりも多い。
トリガーＯＤＮＰが標的核酸から誘導されかつＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含む関連する実施形態において、Ｔ１分子が、そのプローブの３’部分にてトリガーＯＤＮＰと少なくとも実質的に相補的（その５’部分においてはそうではない）であり得る。Ｔ１の３’部分は、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含み、その結果、トリガーＯＤＮＰにＴ１をアニーリングすることにより形成される開始核酸は、二本鎖ＮＡＲＳを含む。ＮＡＲＳを認識するＮＡの存在下で、Ｎ１分子がニック形成される。その後、ニック形成部位の３’末端が、Ｔ１分子中のＮＡＲＳのアンチセンスの配列に対して５’側の領域をテンプレートとして使用して、伸長される。生じた増幅生成物は、トリガーＯＤＮＰの一部ではなくＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列の５’側に位置するＴ１の領域と相補的である、一本鎖核酸分子である。
（ｃ．Ｎ１分子を提供するための第３の型の例示的方法）
本発明の特定の実施形態において、Ｎ１は、ＮＡＲＳおよびＲＥＲＳの両方を含むゲノム核酸から直接誘導された、二本鎖核酸であり、ここで、ＮＡＲＳに対応するＮＳが、ＮＡＲＳとＲＥＲＳとの間に存在し、ＲＥＲＳは、ＮＡＲＳ付近に位置する。その認識配列の外側にニック形成するニック形成エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ）により認識可能なＮＥＲＳを例示的ＮＡＲＳとして用いる実施形態が、図１０に示される。この図に示されるように、ゲノムＤＮＡが、そのゲノムＤＮＡ中のＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼにより消化され得る。ＮＥＲＳを含む消化産物は、開始核酸分子（Ｎ１）として機能し得る。ＮＥがＮ１中のＮＥＲＳを認識しかつＮＳにてＮ１にニック形成する場合、その後の増幅反応において少なくとも開始増幅プライマーとして機能する短いフラグメント（Ａ１）が、生成される。複数のＡ１コピーが、ＮＳでの反復ニック形成およびＮＳからの伸長の際に、生成される。Ａ１は、特定の品質のゲノムＤＮＡがサンプル中に存在する場合にのみ、生成される。
（ｄ．Ｎ１分子を提供するための第４の型の例示的方法）
本発明の特定の実施形態において、開始核酸Ｎ１は、種々のＯＤＮＰ対を使用して生成された、完全に二本鎖であるかまたは部分的に二本鎖である、核酸分子である。Ｎ１分子を調製するためにＯＤＮＰ対を使用するための方法が、図１１〜１３とともに下記に記載されている。
１つの実施形態において、Ｎ１に対する前駆体は、二本鎖ＮＡＲＳおよびＲＥＲＳを含む。このＮＡＲＳおよびＲＥＲＳは、ＯＤＮＰ対を使用してその前駆体中に組込まれる。ＮＥの認識配列の外側にニック形成するＮＥ（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ）により認識可能なＮＥＲＳを例示的ＮＡＲＳとして用い、そしてＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）を例示的ＲＥＲＳとして用いる実施形態が、図１１に示される。この図に示されるように、第１のＯＤＮＰは、ＮＥＲＳの一本の鎖の配列を含み、一方、第２のＯＤＮＰは、ＴＲＥＲＳの一本の鎖の配列を含む。これら２つのＯＤＮＰが標的核酸の一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、生じる増幅生成物（すなわち、Ｎ１に対する前駆体）は、二本鎖ＮＥＲＳおよび二本鎖ＴＲＥＲＳの両方を含む。ＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの存在下で、増幅生成物は、二本鎖ＮＥＲＳを含む核酸分子Ｎ１を生成するように消化される。
別の実施形態において、Ｎ１に対する前駆体は、２つの二本鎖ＮＡＲＳを含む。この２つのＮＡＲＳは、２つのＯＤＮＰを使用して、Ｎ１に対する前駆体中に組込まれる。その認識配列の外側にニック形成するニック形成エンドヌクレアーゼにより認識可能なＮＥＲＳを例示的ＮＡＲＳとして用いる実施形態が、図１２に示される。この図に示されるように、両方のＯＤＮＰは、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含む。これら２つのＯＤＮＰが、標的核酸の一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、生じる増幅生成物は、２つのＮＥＲＳを含む。これらの２つのＮＥＲＳは、互いに同一であっても同一ではなくてもよいが、好ましくは、それらは同一である。ＮＥＲＳを認識するＮＥの存在下で、増幅生成物は、２回ニック形成され（各鎖に対して１回）、二本鎖ＮＥＲＳを各々含む２つの核酸分子（Ｎ１ａおよびＮ１ｂ）が生成される。
なお別の実施形態において、Ｎ１に対する前駆体は、２つの半改変（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＲＥＲＳを含む。この２つの半改変ＲＥＲＳが、２つのＯＤＮＰの使用により、前駆体に組込まれる。この実施形態は、図１３に示される。この図に示されるように、第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰの両方が、ＲＥＲＳの一本の鎖の配列を含む。これらの２つのＯＤＮＰが、改変デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で標的核酸の一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、生じる増幅生成物は、２つの半改変ＲＥＲＳを含む。これらの２つの半改変ＲＥＲＳは、互いに同一であっても、同一ではなくてもよい。半改変ＲＥＲＳを認識するＲＥの存在下で、上記増幅生成物は、半改変ＲＥＲＳの少なくとも１本の鎖の配列を各々が含む部分的に二本鎖の２つの核酸分子（Ｎ１ａおよびＮ１ｂ）を生成するようにニック形成される。
（ｅ．Ｎ１分子を提供する例示的な方法の第５の型）
本発明の他の実施形態において、開始核酸分子Ｎ１は、ＮＡＲＳおよび標的核酸に少なくとも実質的に相補的であるオーバーハングを有する部分的に二本鎖の核酸分子であるが、一本鎖核酸増幅のためのテンプレートとしては機能しない。例示的ＮＡＲＳとしてＮ１がその認識配列の外側にニック形成するニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能であるＮＥＲＳを有する、例示的な実施形態は、図１４に示される。この図に示されるように、Ｎ１分子は、ＮＳを含むかまたは伸長の際にＮＳを形成するかのいずれかである鎖中に５’オーバーハングを含み得る。あるいは、このＮ１分子は、ＮＳを含むかまたは伸長の際にＮＳを形成するかのいずれかである鎖中に３’オーバーハングを含み得る。存在する場合に、目的の生物学的サンプル中で標的核酸分子にアニールし得るように、このＮ１分子のオーバーハングは、標的核酸分子に対して少なくとも実質的に相補的でなければならない。次いで、標的核酸にアニールしないＮ１分子が除去される。標的核酸（そのサンプル中に存在する場合）にアニールする残りのＮ１分子は、一本鎖核酸分子Ａ１を増幅するために使用される。
標的核酸にアニールしないＮ１分子の除去は、図１４に示されるように、生物学的サンプル中の核酸分子を固体支持体に固定化することによって容易にされ得る。このような固定化は、当該分野で公知の任意の方法によって実施され得、この方法としては、固定液の使用または組織プリンティングが挙げられるが、これらに限定されない。次いで、特定の標的核酸分子に対して実質的に相補的な、オーバーハングを有するＮ１分子は、サンプルに適用される。この標的核酸がサンプル中に存在する場合、Ｎ１は、そのオーバーハングを介して標的核酸にハイブリダイズする。ＤＮＡポリメラーゼおよびＮ１中のＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼの存在下で、一本鎖の核酸分子Ａ１は、増幅される。適切なＴ２分子のさらなる存在下で、別の一本鎖核酸分子Ａ２が増幅される。しかし、サンプル中に標的核酸が存在しない場合、Ｎ１は、サンプル中のどの核酸分子にもハイブリダイズし得ず、その結果サンプルから洗い落とされる。したがって、洗われた生物学的サンプルが、核酸増幅反応混合物（すなわち、Ｎ１分子中のＮＥＲＳを認識するＮＥおよびＤＮＡポリメラーゼのように、テンプレートとしてＮ１の一部を使用する一本鎖核酸増幅のために必要な成分全てを含有する混合物）と共にインキュベートされる場合、Ｎ１の上記の相補的な一本鎖核酸分子は全く増幅されない。
標的核酸分子の固定化に加えて、標的Ｎ１複合体は、始めにＮ１分子を生物学的サンプル中の標的核酸分子とハイブリダイズさせ、次いで、標的核酸に結合している官能基によって複合体を単離することによって精製され得る。例えば、この標的核酸は、ビオチン分子で標識され得、そして標的Ｎ１複合体は、続いて、固定化されたストレプトアビジンとの複合体を沈殿させるような、標的に結合したビオチン分子を介して精製され得る。
特定の関連する実施形態において、Ｎ１は、一本鎖Ｔ１分子を有する生物学的サンプルから、固定化された標的核酸をハイブリダイズすることによって形成される。これらの実施形態の例は、標的核酸が固定化されないが、上記のようなＴ１分子は、その５’末端を介して固体支持体に固定化される場合である。標的核酸がサンプル中に存在する場合、サンプルの核酸の、Ｔ１に対するハイブリダイゼーションは、固体支持体が洗浄される場合に、標的を、その固体支持体に結合されたままにする。ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下において、そのアンチセンス鎖はＴ１およびＤＮＡポリメラーゼ中に存在し、一本鎖核酸分子は、Ｔ１中の認識配列のアンチセンス鎖の配列の５’側に位置する配列をテンプレートとして使用して増幅される。標的がサンプル中に存在しない場合、サンプルの核酸は、Ｔ１が結合されている固体支持体から洗い落とされる。したがって、どの一本鎖核酸分子も、Ｔ１の一部をテンプレートとして使用して増幅されない。
ＮＡＲＳの外側にニックを形成するニック形成剤によって認識可能なＮＡＲＳを使用する、上記の実施形態の別の例は、図１５に示される。この図に示されるように、生物学的サンプルの核酸は、これらの５’末端を介して固定化される。次いで、得られる固定化核酸は、Ｔ１分子とハイブリダイズされる。このＴ１分子は、３’から５’の方向で、生物学的サンプル中に存在することが疑われる標的核酸に少なくとも実質的に相補的な配列およびＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含む。標的核酸が、生物学的サンプル中に存在する場合、Ｔ１分子は、標的核酸にハイブリダイズしてＮ１分子を形成する。このＮ１分子は、標的核酸が結合している固体相を洗浄することによって、ハイブリダイズされていないＴ１分子から分離される。ＤＮＡポリメラーゼおよびＮＡＲＳを認識するニック形成剤の存在下において、Ｎ１は、一本鎖核酸分子Ａ１を増幅するためのテンプレートとして使用される。しかし、標的核酸がサンプル中に存在しない場合、Ｔ１は、サンプル中のどの標的核酸分子にもハイブリダイズし得ず、よって固体支持体から洗い落とされる。結果的に、固体支持体に結合されるＮ１は形成され得ず、そしてＮ１の一部に相補的な一本鎖核酸分子は、少しも増幅され得ない。
ＮＡＲＳの外側にニックを形成するニック形成剤によって認識され得るＮＡＲＳを使用する、上記の実施形態の別の例は、図１９に示される。この図に示されるように、Ｔ１分子は、その５’末端を介して固体支持体に固定化される。このＴ１分子は、５’から３’の方向で、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列および標的核酸の３’側部分に実質的に相補的な配列を含む。このＴ１分子は、生物学的サンプル由来の核酸と混合される。標的核酸がサンプル中に存在する場合、このＴ１分子は、標的にハイブリダイズしてテンプレート分子を形成する。Ｔ１分子が結合されている固体支持体が洗浄される場合、この標的は、Ｔ１分子とのそのハイブリダイゼージョンによって固体支持体に結合されたままである。ＤＮＡポリメラーゼの存在下において、この標的は、Ｔ１分子をテンプレートとして使用して、その３’末端から伸長する。標的の伸長産物Ｔ１分子の伸長産物との間に形成された二重鎖は、と二本鎖ＮＡＲＳを含む。ＮＡＲＳを認識するニック形成剤およびＤＮＡポリメラーゼの存在下において、一本鎖核酸分子は、標的核酸の一部をテンプレートとして使用して増幅される。しかし、標的核酸がサンプル中に存在しない場合、このＴ１分子は、標的とハイブリダイズし得ない。従って、どの一本鎖核酸分子も、標的をテンプレートとして使用して増幅されない。
上記の実施形態の別の例は、図２０に示される。この例において、固定化されたＴ１分子は、標的核酸に対して実質的に相補的であるが、標的の３’側部分に必ずしも相補的ではない。このＴ１もまた、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む。標的が生物学的サンプル中に存在する場合、Ｔ１分子は、サンプル中で核酸と混合されると、標的とハイブリダイズし得る。Ｔ１が結合している固体支持体が洗浄される場合、この標的は、Ｔ１とのハイブリダイゼージョンによって固体支持体に結合したままである。ＤＮＡポリメラーゼおよびＮＡＲＳを認識するニック形成剤の存在下において、ＮＡＲＳのセンス鎖配列中の１以上のヌクレオチドが標的中のヌクレオチドと従来の塩基対を形成しないかもしれない場合でさえも、特定の状況において、一本鎖核酸は、標的の一部をテンプレートとして使用して増幅され得る。テンプレート核酸が二本鎖ＮＡＲＳを含まない場合に一本鎖核酸が増幅される状況についての詳細な説明は、「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｕｓｉｎｇ Ｎｉｃｋｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ」という表題の米国特許出願に提供される。しかし、標的核酸がサンプル中に存在しない場合、このプローブは、標的とハイブリダイズし得ない。従って、一本鎖核酸分子は、標的をテンプレートとして使用して少しも増幅されない。
（３．特異性）
本発明の方法は、サンプル中の特定の病原性生物の存在もしくは非存在を検出するため、および密接に関連するいくつかの病原性生物の存在を検出するために、使用され得る。例えば、上記の第１の型および第２の型の例示的方法に関して、Ｔ１分子がアニールするトリガーＯＤＮＰの一部は、検出されるべき特定の病原性生物に特異的な標的核酸もしくはその一部から誘導され得る。あるいは、そのようなトリガーＯＤＮＰの一部は、密接に関連するいくつかの病原性生物のうちで実質的に保存されているかまたは完全に保存されているが、より遠縁の他の病原性生物もしくは関連しない他の病原性生物には存在しない、標的核酸もしくはその一部から誘導され得る。
本明細書中で使用される場合、特定の病原性生物に「特異的な」標的核酸またはその一部は、特定の生物中に存在するが他のどの生物（その特定の生物と密接に関連する生物を含む）にも存在しない配列を有する、標的核酸もしくはその一部を指す。さらに、本明細書中で使用される場合、密接に関連するいくつかの病原性生物のうちで「実質的に保存されている」標的核酸中の領域とは、適切な条件下ではその密接に関連するいくつかの生物の各々における対応する領域とハイブリダイズ可能であるが、同一の条件下で、より遠縁の生物もしくは関連しない生物由来の標的核酸中の類似領域とはハイブリダイズ不可能である、核酸分子が存在する標的核酸中の領域を指す。また、本明細書中で使用される場合、密接に関連する病原性生物のうちで「完全に保存された」標的核酸中の領域とは、その密接に関連するいくつかの病原性生物の各々に由来する標的核酸中に同一の配列を有する領域を指す。
同様に、上記の第４の型の例示的方法に関して、プライマー対を用いて増幅される標的核酸部分は、特定の病原性生物に特異的な領域であり得るか、または密接に関連するいくつかの病原性生物のうちで実質的に保存されているかもしくは完全に保存されているが遠縁の他の病原性生物もしくは関連しない病原性生物においては存在しない領域であり得る。さらに、標的核酸の増幅された部分は、密接に関連するいくつかの病原性生物のうちで、標的核酸における可変領域であり得る。本明細書中で使用される場合、標的核酸中の「可変」領域とは、密接に関連する生物由来の標的核酸のうちで５０％未満の配列同一性を有するが、密接に関連する同じ生物由来の標的核酸のうちで８０％を超える配列同一性を有する領域により両側を囲まれている、領域を指す。本明細書中で使用される場合、２つの核酸の配列同一性パーセントは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０，１９９０）のＢＬＡＳＴプログラムをそのデフォルトパラメータとともに使用して、決定される。これらのプログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３〜７，１９９３）において改変されたＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４〜８，１９９０）を実行する。ＢＬＡＳＴプログラムは、例えば、ウェッブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにて入手可能である。
同様に、上記の第５型の例示的方法について、Ｎ１分子のオーバーハングは、病原性生物に対して特異的な標的核酸中の領域または種々の密接に関連するいくつかの病原性生物の間で実質的にかまたは完全に保存される標的核酸中の領域に少なくとも実質的に相補的であり得る。オーバーハングが特定の生物由来の標的核酸またはその一部に完全に相補的であるが、１つ以上の密接に関連する生物由来の標的核酸またはその一部にも実質的に相補的である場合、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーを変更して、特定の生物の存在を検出し得るか、任意の１つの密接に関連する生物の存在を検出し得る。例えば、Ｎ１分子は、高度なストリンジェント条件下で生物学的サンプル由来の核酸とハイブリダイズされる場合、テンプレートとしてＮ１分子の一部を使用する、ハイブリダイズされていないＮ１分子の除去の後の核酸増幅は、生物学的サンプル中の特定の生物の存在を示し得る。他方、Ｎ１分子が中程度または低いストリンジェント条件下で、生物学的サンプル由来の核酸とハイブリダイズされる場合、核酸増幅（Ｎ１分子の一部をテンプレートとして使用してハイブリダイズされていないＮ１分子を除去した後）は、特定の生物および／または特定の生物に密接に関連する１つ以上の生物の存在を示し得る。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを調節することは、当該分野で周知であり、そして詳細な議論が、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，２００１に見出され得る。
開始核酸分子（Ｎ１）がＴ１分子にトリガーＯＤＮＰをアニーリングすることによって提供される実施形態において、トリガーＯＤＮＰまたはその一部およびＴ１中のＮＡＲＳの一方の鎖の配列に対して３’側に位置するＴ１分子の一部は、互いに完全に相補的であるよりもむしろ実質的に相補的であり得る。例えば、トリガーＯＤＮＰが、いくつかの密接に関連する病原性生物の間で実質的に保存される標的核酸の領域から誘導され、そして任意の種々の生物の存在が検出される必要がある場合、トリガーＯＤＮＰに実質的に相補的なＴ１分子が使用され得る。このような環境において、プライマー伸長反応は、トリガーＯＤＮＰがＴ１分子にアニーリングするのを防ぐか、またはトリガーＯＤＮＰがテンプレートとしてＴ１分子の一部を使用して伸長されるのを防ぐにはあまりにもストリンジェントでない条件下で実行される必要がある。しかし、このような条件はまた、Ｔ１分子がトリガーＯＤＮＰ以外の核酸分子に非特異的なアニーリングするのを防ぐのに十分にストリンジェントである必要がある。トリガーＯＤＮＰまたはその一部が、Ｔ１分子の一部に実質的に相補的である場合の核酸増幅に適切な条件は、反応温度および／または反応緩衝液の組成または濃度を調節することによって、よい結果となり得る。一般的に、ハイブリダイゼーション反応に類似して、反応温度の上昇は、増幅反応のストリンジェンシーを増加する。
（４．Ｔ２分子）
本発明のＴ２分子は、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列およびＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列の３’側に位置する配列（この配列は、開始核酸分子Ｎ１の一部をテンプレートとして使用して増幅される一本鎖核酸分子（Ａ１）に少なくとも実質的に相補的である）を含む。好ましくは、Ｔ２分子は、Ａ１分子に完全に相補的である配列を含む。特定の好ましい実施形態において、Ｔ２分子はまた、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列の５’側に位置する配列を含み、この配列は、Ａ１に実質的に相補的であるかまたは完全に相補的であるかのいずれかである。
また、上記のように、例示的な方法の上記の第４の型において、プライマー対で増幅される標的核酸の一部は、特定の病原性生物に特異的な領域であり得るか、または密接に関連するいくつかの病原性生物のうちで実質的に保存されているかもしくは完全に保存されているが遠縁の他の病原性生物もしくは関連しない病原性生物においては存在しない領域であり得る。さらに、標的核酸の増幅された部分は、いくつかの密接に関連する病原性生物における標的核酸中の可変領域であり得る。増幅された領域が実質的に保存される場合、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列の３’側に位置する配列を含むＴ２分子を使用し得、この配列は、高度にストリンジェントな条件下（例えば、特定の生物以外の生物由来のＡ１分子の、Ｔ２分子とのハイブリダイズを防ぐ比較的高い増幅温度）で増幅反応を実施することによって特定の生物の存在を検出するために特定の生物から増幅された領域の一方の鎖と同一である。あるいは、特定の生物の存在ならびにその特定の生物に密接に関連する１つ以上の生物の存在を、中程度または低度にストリンジェントな条件下（例えば、特定の生物に密接に関連する生物由来のＡ１分子が、Ｔ２分子とハイブリダイズするのを可能にし、そしてＴ２分子の一部をテンプレートとして使用して伸長するのを可能にするための、比較的低い増幅温度）で増幅反応を行なうことによって検出するために同一のＴ２分子を使用し得る。
さらに、増幅された領域が、密接に関連する生物における可変領域である実施形態において、Ｔ２分子は、上記の密接に関連する生物における特定の生物由来のＮ１分子を使用して増幅されたＡ１分子に少なくとも実質的に相補的である配列を含み得る。Ｔ２分子の一部をテンプレートとして使用する一本鎖核酸分子の増幅は、生物学的サンプル中の特定の生物の存在を示す。
（５．増幅された一本鎖核酸の検出および／または特徴付け）
病原性生物を起源とする標的核酸の存在は、増幅産物（例えば、Ａ１、Ａ２など）を検出および／または特徴付けることによって検出され得る。一本鎖核酸分子を検出または特徴付けるために適切な任意の方法が使用され得る。例えば、この増幅反応は、標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で実施され得、その結果この標識は、増幅された核酸分子に取りこまれる。核酸フラグメントに取りこむために適切な標識およびこのフラグメントの引き続く検出のための方法は当該分野で公知であり、例示的な標識としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：３２Ｐ、３３Ｐ、１２５Ｉまたは３５Ｓのような放射性標識、アルカリホスファターゼのような着色反応生成物を生成し得る酵素、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）のような蛍光標識、ビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン、抗原、ハプテン、または蛍光色素。
あるいは、増幅された核酸分子は、実質的に、好ましくは完全に、増幅された核酸分子と相補的な標識された検出（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）オリゴヌクレオチドの使用によって検出され得る。標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸と同様に、検出オリゴヌクレオチドはまた、放射活性タグ、化学発光タグ、または蛍光タグ（蛍光偏光または蛍光共鳴エネルギー移動を使用する検出のための適切なものを含む）などで標識され得る。Ｓｐａｒｇｏら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ７：３９５−４０４，１９９３；Ｈｅｌｌｙｅｒら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １７３：９３４−４１，１９９６；Ｗａｌｋｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：３４８−５３，１９９６；Ｗａｌｋｅｒら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２：９−１３，１９９６；Ｓｐｅａｒｓら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７：１３０−７，１９９７；Ｍｅｈｒｐｏｕｙａｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ１１：３３７−４７，１９９７；およびＮａｄｅａｕら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７６：１７７−８７，１９９９を参照のこと。
特定の実施形態において、増幅された核酸分子は、さらに特徴付けられ得る。この特徴付けにより、これらの核酸分子の同一性が確認され得、それによって生物学的サンプル中の病原性生物由来の標的核酸の存在を確認し得る。このような特徴付けは、一本鎖核酸フラグメントを特徴付けるために適切な任意の公知の方法を介して実施され得る。例示的な技術としては、液体クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー、質量分析法、および電気泳動が挙げられるが、これらに限定されない。種々の例示的な方法の詳細な説明は、米国仮特許出願番号６０／３０５，６３７および６０／３４５，４４５（これらは、その全体が本明細書中で援用される）に見出され得る。
増幅産物を検出および／または特徴付けして、生物学的サンプル中の標的核酸の存在を検出することに加えて、標的核酸の存在は、増幅反応において生じた完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子（例えば、それらのＨ１生成物、Ｈ２生成物またはニック形成生成物）を検出することによって検出され得る。好ましい実施形態において、二本鎖核酸分子の検出は、二本鎖核酸分子に特異的に結合し、二本鎖核酸分子に結合する際に蛍光性になる色素（すなわち、蛍光インターカレート剤）を増幅混合物に付加することによって行われ得る。蛍光インターカレート剤の付加により、核酸増幅のリアルタイムモニタリングが可能になる。あるいは、二本鎖核酸分子（例えば、Ｈ１およびＨ２）の生成を最大にするために、ニック形成伸長反応混合物中のＮＥ（ＤＮＡポリメラーゼではない）を、不活性化し得る（例えば、熱処理によって）。ＮＥの不活性化により、反応混合物中の全てのニック形成された核酸分子が、二本鎖核酸分子を生成するために伸長することが可能になる。
種々の蛍光インターカレート剤は、当該分野で公知であり、本発明において使用され得る。例示的な薬剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：米国特許第４，１１９，５２１号；同第５，５９９，９３２号、同第５，６５８，７３５号；同第５，７３４，０５８号；同第５，７６３，１６２号；同第５，８０８，０７７号；同第６，０１５，９０２号；同第６，２５５，０４８号および同第６，２８０，９３３号において開示されているもの、ＧｌａｚｅｒおよびＲｙｅ，Ｎａｔｕｒｅ ３５９：８５９−６１，１９９２において議論されているもの、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ色素、ならびにＳＹＢＲ（登録商標）色素（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ、およびＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＩＩ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ ＷＡ。蛍光インターカレート剤により生成される蛍光は、種々の検出器（ＰＭＴ、ＣＣＤカメラ、蛍光ベースの顕微鏡、蛍光ベースの走査装置、蛍光ベースのミクロプレートリーダー、蛍光ベースのキャピラリーリーダーを含む）により検出され得る。
（６．診断において有用な組成物およびキット）
病原体診断において有用な組成物およびキットは、核酸の指数関数的増幅について上に記載されるものと同じであり得る。特定の実施形態において、これらの組成物およびキットは、増幅産物の検出を容易にするさらなる構成要素をさらに含み得る。例えば、このさらなる成分は、増幅産物中に取り込まれる標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸であり得る。あるいは、標識された検出器（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）オリゴヌクレオチドであり得る。特定の好ましい実施形態において、さらなる構成要素は、蛍光インターカレート剤であり得る。
（７．本発明の診断用途）
本発明は、目的の任意の標的核酸の存在を迅速に検出する際に有用である。特定の実施形態において、この標的核酸は、病原性生物（例えば、感染性疾患を引き起こす生物）に由来するか、病原体生物に起源を有する。このような病原性生物としては、炭疽および痘瘡のような生物の脅威（ｂｉｏ−ｔｈｒｅａｔ）を強いるものが挙げられる。さらに、上記のように、本発明の方法は、特定の病原性生物の存在を検出するため、およびいくつかの密接に関連した病原性生物の存在を検出するために使用され得る。本発明はまた、特定の抗生物質に対して耐性である生物を検出するために使用され得る。例えば、本発明の方法、組成物またはキットを使用して、抗生物質または抗生物質の特定の組合せで処置された被験体における特定の病原性生物を検出し得る。さらに、いくつかの実施形態における核酸増幅を検出するための蛍光インターカレート剤の使用は、生物学的サンプル中の標的核酸の実時間検出を提供する。
（Ｄ．遺伝的バリーエーションの検出における核酸増幅方法および組成物の使用）
指数関数的核酸増幅のための方法および組成物はまた、標的核酸における規定された位置における遺伝的バリエーションを検出するために使用され得る。遺伝的バリエーションを含む標的核酸またはその部分は、開始核酸分子（Ｎ１）に最初に組み込まれて、第１増幅反応においてテンプレートとして使用される。この開始核酸分子はまた、第１ニック形成剤認識配列の少なくとも１つの鎖を含み、それによりＤＮＡポリメラーゼ、および第１ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で第１増幅反応を可能にする。第１増幅反応からの産物（Ａ１）は、標的核酸における規定された位置のヌクレオチドまたは上記のヌクレオチドの相補的ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態において、標的核酸が特定の遺伝的バリエーションを含むか否かを決定することが望ましい。このような実施形態において、一本鎖テンプレート核酸Ｔ２は、上記のように増幅されたＡ１分子にアニーリングするために使用される。このＴ２分子は、３’側から５’側に：（ａ）Ａ１に少なくとも実質的に相補的であり、かつ特定の遺伝的バリエーションまたはその補体を含む第１の配列、（ｂ）第２のニック形成剤により認識可能であるニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および（ｃ）第２の配列、を含む。次いで、Ａ１が特定の遺伝的バリエーションまたはその補体を含む場合にのみ、Ｔ２分子の第２の配列の少なくとも一部を使用して、一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する条件下で増幅反応を実施する。次いで、この反応混合物を、任意のＡ分子が増幅されたか否かを決定するために分析する。この混合物中のＡ２分子の存在は、標的核酸が規定された位置に特定の遺伝的バリエーションを含むことを示すが、一方Ａ２分子の非存在は、標的核酸が特定の遺伝的バリエーションを含まないことを示す。
特定の他の実施形態において、標的核酸中の規定された位置における遺伝的バリエーションを同定することが望ましくあり得る。このような実施形態において、複数の一本鎖点プレート核酸（Ｔ２分子）は、上記のように増幅されたＡ１分子と接触するたｍねい使用される。このＴ２分子は、それぞれ、３’側から５’側に：（ａ）Ａ１分子に少なくとも実質的に相補的であり、かつ標的核酸の規定された位置において潜在的な遺伝的バリエーションのうちの１つまたは潜在的な遺伝的バリエーションの補体を含む、第１の配列、（ｂ）第２ニック形成剤により認識可能であるニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および（ｃ）潜在的な遺伝的バリエーションに対して独自に相関する第２の配列、を含む。潜在的な遺伝的バリエーションに対して「独自に相関する」配列とは、標的核酸の特定の潜在的遺伝的バリエーションまたは特定の潜在的な遺伝的バリエーションの補体を含むＴ２分子中に存在するが、標的核酸の別の潜在的遺伝的バリエーションまたは他の潜在的な遺伝的バリエーションの補体を含むＴ２分子には存在しない配列をいう。複数のＴ２分子は、組み合わせて、標的核酸の規定された位置において潜在的な遺伝的バリエーションの一部もしくは全部または潜在的な遺伝的バリエーションの一部もしくは全部の補体を含む。
Ａ１が、複数のＴ２分子と混合された後、次いで、増幅反応は、テンプレートとして標的核酸の遺伝的バリエーションまたは遺伝的バリエーションの補体を含むＴ２分子の第２の配列の一部を使用して、一本鎖核酸分子（Ａ２）を選択的に増幅する条件下で行われる。次いで、増幅されたＡ２分子を、Ａ２分子の増幅のためのテンプレートとしてどのＴ２分子が使用されたかを決定するために特徴付けする。テンプレートとして機能化されたＴ２分子の同定は、Ａ１分子が標的の遺伝的バリエーションの補体を含む場合に、標的核酸分子が、Ｔ２分子の第１の配列中に存在する遺伝的バリエーションを含むこと、あるいは、Ａ１分子が、標的核酸の遺伝的バリエーションを含む場合に、標的核酸が、その補体がＴ２分子の第１の配列に存在する遺伝的バリエーションを含むことを示す。
（１．標的核酸）
遺伝的バリエーションの同定に関連する本発明の標的核酸は、参照として野生型核酸配列を使用する遺伝的バリエーションを含み得る任意の核酸分子である。これは、固体支持体に固定されてもされなくてもよい。標的核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれでもあり得る。一本鎖標的核酸は、変性二本鎖ＤＮＡの１つの鎖であり得る。あるいは、これは、いずれの二本鎖ＤＮＡにも由来しない一本鎖核酸であり得る。一局面において、この標的核酸は、ＤＮＡである（ゲノムＤＮＡ、リボソームＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む）。別の局面において、この標的はＲＮＡである（ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡを含む）。
１つの局面において、天然に存在する核酸であるかまたは天然に存在する核酸由来のいずれかである。標的核酸は、天然に存在する標的核酸は、生物学的サンプルから得られる。好ましい生物学的サンプルとしては、１つ以上の哺乳動物組織、好ましくはヒト組織（例えば、血液、血漿／血清、毛髪、皮膚、リンパ節、脾臓、肝臓など）および／または細胞もしくは細胞株が挙げられる。生物学的サンプルは、１つ以上のヒト組織および／または細胞を含み得る。哺乳動物組織および／またはヒト組織および／または細胞は、１つ以上の腫瘍組織および／または細胞をさらに含み得る。
生物学的サンプルから核酸の集団を単離する方法論は、本発明の技術分野の当業者に周知でありかつ容易に利用可能である。例示的な技術は、例えば、以下の研究室用研究マニュアルに記載される：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，第３版、２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌら、「Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９９９）（本明細書中にその全体が参考として援用される）。核酸単離キットもまた、多数の企業から市販されており、そして単離プロセスを単純化しかつ加速するために使用され得る。
標的核酸は、未知のアイデンティティーの１つ以上のヌクレオチドを含む（すなわち、遺伝的バリエーション）。本発明は、組成物および方法を提供し、これらの組成物および方法により、未知のヌクレオチドのアイデンティティーが、既知となり、それにより遺伝的バリエーションが同定される。未知のアイデンティティーの塩基は、「ヌクレオチド遺伝子座」（または「規定された位置（ｄｅｆｉｎｅｄ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）」もしくは「規定された位置（ｄｅｆｉｎｅｄ ｌｏｃａｔｉｏｎ）」）に存在する。「ヌクレオチド遺伝子座」は、標的核酸において正確な位置を有する特定のヌクレオチドまたは１、２、３、４、５、６、７、もしくはそれ以上のヌクレオチドを含む領域をいう。
用語「多型」とは、集団における小さな領域（すなわち、長さが１〜いくつか（例えば、２、３、４、５、６、７または８）ヌクレオチド）中の２以上の遺伝子的に決定された代替の配列または対立遺伝子の存在をいう。２以上の遺伝子的に決定された代替の配列または対立遺伝子は、それぞれ「遺伝的バリエーション（遺伝子バリエーション）」といわれ得る。この遺伝的バリエーションは、「野生型形態」ともいわれる、選択された集団中の最も頻繁に存在する対立遺伝子形態、または他の対立遺伝子形態であり得る。二倍体生物は、対立遺伝子形態についてホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。
遺伝的バリエーションは、遺伝子発現に対する影響（発現レベルおよび発現産物（すなわちコードされたペプチド）を含む）があってもなくてもよい。遺伝子発現に影響を及ぼす遺伝的バリエーションはまた、「変異」ともいわれ、点変異、フレームシフト変異、調節性変異、ナンセンス変異、およびミスセンス変異が挙げられる。「点変異」とは、野生型塩基（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）が、核酸サンプル内の規定されたヌクレオチド座にて他の標準的塩基のうちの１つで置換されている変異をいう。これは、塩基置換または塩基欠失により生じ得る。「フレームシフト変異」は、小さな欠失または挿入により引き起こされ、続いて、遺伝子のリーディングフレームをシフトさせ、従って、新規のペプチドが形成される。「調節性変異」とは、正確な遺伝子発現（例えば、産物の量、タンパク質の局在、発現のタイミング）に影響を及ぼす非コード領域（例えば、イントロン）、コード領域に対して５’または３’側に位置する領域中の変異をいう。「ナンセンス変異」は、ペプチド伸長の成熟前終結（すなわち、短縮化ペプチド）を引き起こす「終止」コドンとして読まれる、トリプレトコドン（ここで変異が生じる）において生じる単一ヌクレオチド変化をいう。「ミスセンス変異」は、異なるアミノ酸に交換される、１つのアミノ酸を生じる変異である。このような変異は、ペプチドの折りたたみ（三次元構造）および／またはマルチマータンパク質における他のペプチドとのその適切な会合の変化を生じ得る。
本発明の１つの局面において、遺伝的バリエーションは、「単一ヌクレオチド多型」（ＳＮＰ）であり、これは、任意の単一のヌクレオチド配列バリエーション、好ましくは、生物の集団に共通し、メンデルの様式にて遺伝するバリエーションをいう。代表的には、ＳＮＰは、２つの可能な塩基のうちのいずれかであり、ＳＮＰ部位の第３および第４のヌクレオチドのアイデンティティーを見いだす可能性はない。
遺伝的バリエーションは、疾患もしくは障害と関連し得るか、または疾患もしくは障害を引き起こし得る。本明細書中で使用される場合、用語「と関連する（した）」とは、遺伝的バリエーションの出現と、宿主における疾患もしくは障害の存在との間のポジティブな相関の存在をいう。このような疾患もしくは障害は、ヒトの遺伝疾患または遺伝障害であり得、これらとしては、嚢胞性線維症、膀胱癌種、結腸直腸腫瘍、鎌状赤血球貧血、サラセミア、ａｌ−アンチトリプシン欠損、レッシュ−ナイハン症候群、嚢胞性線維症／ムコビシドーシス、デュシェンヌ／ベッカー筋ジストロフィー、アルツハイマー病、Ｘ染色体依存性精神薄弱、およびハンチントン舞踏病、フェニルケトン尿症、ガラクトース血症、ウィルソン病、血色素症、重症複合免疫不全、α−１−アンチトリプシン欠損、白皮症、アルカプトン尿症、リソソーム蓄積症、エーラス−ダンロス症候群、血友病、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ障害、無ガンマグロブリン血症、尿崩症、ウィスコット−アルドリッチ症候群、ファブリーズ病、脆弱Ｘ染色体症候群、家族性高コレステロール血症、多発性嚢胞腎、遺伝性球状赤血球症、メルファラン症候群、フォンウィルブランド病、神経線維腫症、結節硬化症、遺伝性出血性毛細血管拡張症、家族性結腸ポリープ症、エーラス−ダンロス症候群、筋ジストロフィー、骨形成不全症、急性間歇性ポルフィリン症、およびフォンヒッペル−リンダウ病が挙げられるが、これらに限定されない。
標的核酸は、以下に記載される開始核酸に組み込まれる前に、増幅され得る。核酸を増幅するための任意の公知の方法が使用され得る。例示的な方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｑβレプリカーゼの使用、鎖置換増幅（Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：１６９１−６，１９９５）、転写媒介性増幅（Ｋｗｏｈら、ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ８８／１０３１５）、ＲＡＣＥ（Ｆｒｏｈｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１８：３４０−５６，１９９３）、片側ＰＣＲ（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ ＰＣＲ）（Ｏｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ．８６：５６７３−７，１９８９）、およびギャップ−ＬＣＲ（Ａｂｒａｖａｙａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６７５−８２，１９９５）。これらの引用された学術文献およびＰＣＴ国際特許出願は、それらの全体が、本明細書中に参考として援用される。
（２．開始核酸分子（Ｎ１））
遺伝的バリエーション検出に有用な開始核酸分子は、種々のアプローチにより提供され得る。例えば、Ｎ１は、トリガーオリゴヌクレオチドプライマーのＴ１分子へのアニーリングにより獲得され得る。トリガープライマーは、標的核酸に由来し、そして標的核酸中の遺伝的バリエーションを含む（例えば、図２１）。あるいは、Ｎ１は、（例えば、図２２に示されるように、標的核酸を制限エンドヌクレアーゼで消化することによって）二本鎖標的核酸に直接由来し得る。Ｎ１はまた、適切なオリゴヌクレオチドプライマー対を使用することによって調製され得る（例えば、図２３〜２５）。開始核酸分子を提供するためのいくつかの例示の手段が、以下に記載される。
（ａ．Ｎ１分子を提供するための第１の型の例示の方法）
上記のように、Ｎ１は、トリガーオリゴヌクレオチドプライマーをＴ１分子にアニーリングすることによって提供され得る。トリガープライマーは、標的核酸の遺伝的バリエーションを含む必要がある。Ｎ１分子を提供するこの型の方法の例が、図２１に示される。この図に示されるように、二本鎖標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）はまず、制限エンドヌクレアーゼによって切断される（この制限エンドヌクレアーゼの認識配列が、遺伝的バリエーションが存在する規定された位置に近接して存在する）。消化産物は変性され得、次いで、潜在的遺伝的バリエーションを含む消化産物の鎖が、トリガーオリゴヌクレオチドプライマーとして使用され、テンプレート核酸（Ｔ１）とアニーリングされ得る。Ｔ１は、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、ＤＮＡポリメラーゼおよびその認識配列を認識するニック形成剤の存在下で、標的核酸の遺伝的バリエーションの相補ヌクレオチドを含む一本鎖核酸フラグメント（Ａ１）が、増幅される。
（ｂ．Ｎ１分子を提供するための第２の型の例示の方法）
本発明の特定の実施形態において、Ｎ１は、潜在的遺伝的バリエーション、ニック形成剤認識配列、および制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む標的核酸から直接誘導される。例示のニック形成剤認識配列として、その認識配列（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ）の外側にニックを形成するニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能な認識配列を有する実施形態が、図２２に示される。この図に示されるように、標的核酸は、標的核酸中の配列を認識する制限エンドヌクレアーゼによって消化され得る。ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を含む消化産物は、一本鎖核酸フラグメント（Ａ１）を増幅するための開始核酸分子（Ｎ１）として機能し得る。遺伝的バリエーション（「Ｘ」）は、ニック形成剤によって生成されるニック形成部位に対応する位置と、制限エンドヌクレアーゼの制限切断部位との間である必要がある。このような位置により、増幅されたフラグメント（Ａ１）に、遺伝的バリエーションの相補鎖（「Ｘ」）が含まれ得る。
（ｃ．Ｎ１分子を提供するための第３の型の例示の方法）
本発明の特定の実施形態において、開始核酸分子Ｎ１は、種々のＯＤＮＰ対を用いて生成される、完全にかまたは部分的に二本鎖の核酸分子である。Ｎ１分子を調製するのにＯＤＮＰ対を使用する方法は、図１６〜１８と組み合わせて、以下に簡単に記載される。より詳細な説明は、米国仮出願番号６０／３０５，６３７および６０/３４５，４４５に見出され得る。
特定の実施形態において、Ｎ１に対する前駆体は、二本鎖ニック形成剤認識配列および制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。ニック形成剤認識配列および制限エンドヌクレアーゼ認識配列は、プライマー対を用いて、前駆体に組み込まれる。例示のニック形成剤認識配列としての、その認識配列（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ）の外側にニックを形成するニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能な認識配列、および例示の制限エンドヌクレアーゼ認識配列としての、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）を有する実施形態が、図２３に示される。この図に示されるように、第１のプライマーは、ニック形成剤認識配列の１つの鎖の配列を含み、第２のＯＤＮＰは、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列の１つの鎖の配列を含む。これらの２つのＯＤＮＰが、標的核酸の一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、得られる増幅産物（すなわち、Ｎ１に対する前駆体）は、二本鎖ＮＥＲＳおよび二本鎖ＴＲＥＲＳの両方を含む。さらに、第１のプライマーは、遺伝的バリエーションの相補鎖の３’側に位置する標的核酸の一方の鎖の一部とアニーリングするよう設計され、第２のプライマーは、遺伝的バリエーションの３’側に位置する標的核酸の他方の鎖の一部とアニーリングするよう設計される。このような設計は、Ｎ１に対する前駆体が、遺伝的バリエーションおよびその相補鎖を含むことを可能にする。ＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの存在下において、増幅産物は、二本鎖ＮＥＲＳを含む部分的に二本鎖の核酸分子Ｎ１を生成するよう設計される。
他の実施形態では、Ｎ１に対する前駆体は、２つの二本鎖ニック形成剤認識配列を含む。この２つのニック形成剤認識配列は、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、Ｎ１に対する前駆体に組み込まれる。例示的なニック形成剤認識配列としてその認識配列の外側にニックを形成するニック形成剤エンドヌクレアーゼによって認識可能な認識配列を用いた実施形態を、図２４に例示する。この図に示されるように、両方のプライマーは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含む。さらに、第１プライマーは、遺伝的バリエーションの相補体に対して３’側に位置づけられる標的核酸の一方の鎖の一部分に対してアニールするように設計され、一方で、第２プライマーは、遺伝的バリエーションに対して３’側に位置づけられる標的核酸の他方の鎖の一部分に対してアニールするように設計される。これらの２つのプライマーが、標的核酸の一部分を増幅するためのプライマーとして使用される場合、生じる増幅産物（すなわち、以下に記載されるＮ１ａおよびＮ１ｂに対する前駆体）は、遺伝的バリエーションおよびその相補体、ならびに２つのニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。これらの２つの認識配列は、互いに対して同一であっても同一でなくてもよいが、好ましくはこれらは同一である。認識配列を認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（１つまたは複数）の存在下において、増幅産物は、２回ニック形成されて（各鎖において１回）、二本鎖ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のうちの１つを各々が含む、２つの部分的に二本鎖の核酸分子（Ｎ１ａおよびＮ１ｂ）を生成する。
例示的なニック形成剤認識配列として半改変制限エンドヌクレアーゼ認識配列を用いた別の実施形態を、図２５に例示する。この図に示されるように、第１プライマーおよび第２プライマーの両方は、制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含む。さらに、第１プライマーは、遺伝的バリエーションの相補体に対して３’側に位置づけられる標的核酸の一方の鎖の一部分に対してアニールするように設計され、一方で、第２プライマーは、遺伝的バリエーションに対して３’側に位置づけられる標的核酸の他方の鎖の一部分に対してアニールするように設計される。これらの２つのプライマーが、改変デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下において標的核酸の一部分を増幅するためのプライマーとして使用される場合、生じる増幅産物（すなわち、以下に記載されるＮ１ａおよびＮ１ｂに対する前駆体）は、遺伝的バリエーションおよびその相補体、ならびに２つの半改変制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。これらの２つの半改変認識配列は、互いに対して同一であっても同一でなくてもよい。この半改変認識配列を認識する制限エンドヌクレアーゼ（１つまたは複数）の存在下において、上記の増幅産物は、ニック形成されて、半改変制限エンドヌクレアーゼ認識配列のうちの一方の少なくとも１つの鎖の配列を各々が含む、２つの部分的に二本鎖の核酸分子（Ｎ１ａおよびＮ１ｂ）を生成する。
上記の第１のＯＤＮＰ、第２のＯＤＮＰ、またはその両方は、特定の実施形態では、固体支持体に固定され得る。他の実施形態では、サンプルの核酸分子（標的核酸を含む）が固定される。
（３．Ａ１分子）
上記のように、Ａ１分子は、テンプレートとしてＮ１の一部分を使用して増幅される。Ｎ１のこの部分は、標的核酸の遺伝的バリエーションまたはその相補体を含み、その結果、Ａ１は、遺伝的バリエーションの相補体または遺伝的バリエーション自体を含む。Ａ１は、比較的短いものであり得、そして最大で２５ヌクレオチド、最大で２０ヌクレオチド、最大で１７ヌクレオチド、最大で１５ヌクレオチド、最大で１０ヌクレオチド、または最大で８ヌクレオチドを有する。このような短い長さは、Ｎ１分子の作製において使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを適切なように設計することによって達成され得る。例えば、Ｎ１分子を提供する第３の型について（図１６〜１８）、ＯＤＮＰ対は、それらが標的核酸にアニールする場合に互いに対して近接となるように設計され得る。上記の本発明の診断的適用と同様に、Ａ１分子が短い長さであることは、増幅の効率および速度を増加させ、鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼの使用を可能にし、そして質量分析法による分析のような特定の技術を介して、Ａ１分子および／または以後の増幅反応（ここでは、Ａ１が、初回増幅プライマーとして使用される）の生成物（Ａ２）の検出を容易にする。さらに、Ａ１が短い長さであることは、標的核酸の遺伝的バリエーションに由来するＡ１分子のヌクレオチド（１つまたは複数）に対して相補的であるヌクレオチド（１つまたは複数）を含むＴ２分子に対してＡ１のみがハイブリダイズする反応条件の容易な同定を可能にする。
（４．Ｔ２分子）
上記のように、本発明のＴ２分子は、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、ならびに、その認識配列のセンス鎖の配列に対して３’側に位置づけられ、テンプレートとして初回核酸分子Ｎ１の一部分を使用して増幅される一本鎖核酸分子（Ａ１）に対して少なくとも実質的に相補的な配列、を含む。標的核酸が特定の遺伝的バリエーションを含むか否かを決定することが所望される特定の実施形態では、Ｔ２分子は、３’→５’に、以下を含み得る：（ａ）Ａ１に対して少なくとも実質的に相補的でありかつ特定の遺伝的バリエーションまたはその相補体を含む第１配列、（ｂ）第２のニック形成剤によって認識可能なニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および（ｃ）第２配列。
標的核酸中の規定された位置において遺伝的バリエーションを同定することが所望される他の実施形態では、複数の一本鎖テンプレート核酸（Ｔ２分子）が使用される。このＴ２分子は各々、３’→５’に、以下を含む：（ａ）Ａ１分子に対して少なくとも実質的に相補的でありかつ標的核酸の規定された位置における潜在的な遺伝的バリエーションまたはその潜在的な遺伝的バリエーションの相補体の１つを含む、第１配列、（ｂ）第２のニック形成剤によって認識可能なニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および（ｃ）潜在的な遺伝的バリエーションに対して独特に関連する第２配列。複数のＴ２分子は、組み合わせにおいて、標的核酸の規定された位置における潜在的な遺伝的バリエーションのいくつかもしくはすべてを含むか、またはすべての潜在的な遺伝的バリエーションの相補体を含む。
特定の実施形態において、複数のＴ２分子のうちの１つ以上（好ましくは、すべて）について、Ｔ２分子の第２配列は、同じＴ２分子の第１配列に対して少なくとも実質的に同一であり得、その結果、この第２配列をテンプレートとして使用した増幅産物（Ａ２）は、第１配列にアニールするＡ１分子に対して同一となる。従って、Ａ２分子の特徴付けにより、Ａ１分子の正体が直接的に示され得、それにより、標的核酸における遺伝的バリエーションの正体が示され得る。
Ｔ２分子は、特定の実施形態において、好ましくはその５’末端を介して、固体支持体に固定され得る。さらに、複数の固定されたＴ２分子がアレイを形成し得る。他の実施形態では、Ｔ２分子は、固定されていなくてもよい。
（５．反応条件）
上記のように、標的核酸における特定の遺伝的バリエーションの存在または非存在を決定するための実施形態に関して、増幅反応は、Ａ１がその特定の遺伝的バリエーションまたはその相補体を含む場合にのみ、Ｔ２分子の第２配列の少なくとも一部分を使用してＡ２が増幅される条件下で実施される。分子（例えば、Ａ１分子）を、規定された位置を除いて同一の配列を有する複数の分子（例えば、Ｔ２分子）のうちの１つに選択的にアニールさせ、そしてプライマーの伸長を開始させる条件を同定するための方法は、当該分野で公知である。例えば、このような条件は、反応温度、Ａ１分子の長さ、反応混合物の組成などを変更することによって解明され得る。一般的に、反応温度が高くなればなるほど、Ａ１とＴ２分子の第１配列との間のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは高くなる。さらに、Ａ１分子と、標的核酸の規定された位置でＡ１分子のヌクレオチドに由来する、Ａ１分子のヌクレオチドの相補体を有するＴ２分子との間のハイブリダイゼーションを依然として可能にする程度まで、Ａ１分子を短くすればするほど、Ａ１分子が、上記のＴ１分子にハイブリダイズするが、標的核酸の規定された位置でＡ１分子のヌクレオチドに由来するＡ１分子のヌクレオチドの相補体を有さないことを除いて上記のＴ１分子と同一である別のＴ１分子にはハイブリダイズしないという条件を同定することはより容易になる。さらに、適切な反応条件は、コントロールとして既知の遺伝的バリエーションを有する１つ以上の標的核酸を使用して、最適化または確認され得る。
標的核酸における規定された位置での遺伝的バリエーションを同定するための実施形態に関して、増幅反応は、複数のＴ２分子の存在下で実施される。これらのＴ２分子は、組み合わせにおいて、標的核酸の規定された位置における潜在的な遺伝的バリエーションのいくつかもしくはすべて、または潜在的な遺伝的バリエーションのすべての相補体を含む。増幅反応は、標的核酸の遺伝的バリエーションまたはその遺伝的バリエーションの相補体を含むＴ２分子の第２配列の一部分をテンプレートとして使用して、一本鎖核酸分子（Ａ２）が選択的に増幅される条件下で実施される。言い換えれば、上記のＡ２分子のみが増幅され、そしてＡ２分子は、標的においてその遺伝的バリエーションまたはその相補体を含まないことを除いて上記のＴ２分子と同一である別のＴ２分子の一部分を使用することにより増幅されない。このような反応条件は、標的核酸における特定の遺伝的バリエーションの存在または非存在を決定するための反応条件と同様にして同定され得る：このような反応条件はまた、Ａ１分子と、標的核酸の遺伝的バリエーションに由来するＡ１分子のヌクレオチドの相補体を含むＴ２分子との間の選択的なハイブリダイゼーションを可能にする。
（６．増幅された一本鎖核酸の特徴付け）
標的核酸における潜在的な遺伝的バリエーションは、増幅産物（すなわち、Ａ１またはＡ２）を特徴付けることによって検出または同定され得る。一本鎖核酸分子を特徴付けるために適切な任意の方法が使用され得る。例示的な技術としては、液体クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー、質量分析法、および電気泳動が挙げられるが、限定はされない。種々の例示的な方法に関する詳細な説明は、米国仮特許出願番号６０／３０５，６３７および同６０／３４５，４４５に見出され得る。
増幅された一本鎖核酸フラグメントを特徴付けるための多くの方法論はまた、増幅反応混合物中において特定の増幅された一本鎖核酸フラグメントの量を測定するために使用され得る。例えば、増幅された一本鎖核酸分子がまず、液体クロマトグラフィーによって増幅反応混合物中の他の分子から分離され、次いで質量分析法の分析に供される実施形態において、増幅された一本鎖核酸分子の量は、その核酸分子を含む画分の液体クロマトグラフィー、またはその核酸分子に対応する質量分析ピークのイオン電流測定のいずれかによって定量され得る。
このような方法論は、標的核酸の対立遺伝子改変体もまた存在し得る核酸集団中における標的核酸の対立遺伝子頻度を決定するために使用され得る。「対立遺伝子改変体」は、標的核酸の規定された位置を除いて標的核酸に対して同一の配列を有する核酸分子をいう。「核酸集団中における標的核酸の対立遺伝子頻度」は、標的核酸である核酸集団中における、標的核酸およびその対立遺伝子改変体の総数のパーセンテージをいう。Ｎ１に対する前駆体を調製するにおいて使用されるプライマー対は、標的中の規定された位置での潜在的な遺伝的バリエーションの各端において、標的核酸の部分に対してアニールするように設計されるので、プライマーとしてこのプライマー対を使用し、かつテンプレートとして標的核酸を含む核酸集団を使用する増幅により、標的核酸の規定された位置で遺伝的バリエーションを含む核酸フラグメント、ならびに改変体がその核酸集団中に存在する場合には、標的核酸の対立遺伝子改変体の同じ位置で遺伝的バリエーションを含む核酸フラグメントが生成される。標的核酸およびその対立遺伝子改変体の配列は、その規定された位置においてのみ異なるので、個々のテンプレートとして標的核酸および対立遺伝子改変体を使用して、Ｎ１に対する前駆体は、同じかまたは類似した効率で増幅される。同様に、標的核酸の遺伝的バリエーションまたはその相補体を含む一本鎖核酸分子（Ａ１）は、対立遺伝子改変体の遺伝的バリエーションまたはその相補体を含む一本鎖核酸分子の効率と同じかまたは類似した効率で増幅される。さらに、個々のテンプレートとして標的およびその対立遺伝子改変体を使用して増幅されるＡ１分子に同じ効率でアニールするＴ２分子が使用される場合、初回テンプレートとして標的を用いて増幅されるＡ２分子と、初回テンプレートとして改変体を用いて増幅されるＡ２分子との比率は、核酸集団中における標的 対 その改変体の比率を反映する。従って、反応混合物中におけるＡ１（またはＡ２）分子の相対的な量の測定は、核酸集団中における標的核酸の相対的な量を示す。
（７．遺伝的バリエーションの検出において有用な組成物およびキット）
遺伝的バリエーションの検出において有用な組成物およびキットは、指数関数的な核酸増幅について上記に記載されたものと同じであり得る。特定の実施形態において、これらのキットはさらに、増幅産物を特徴付けるにおいて有用な１つ以上のさらなる成分を含み得る。例えば、このさらなる成分は、以下であり得る：（１）クロマトグラフィーカラム；（２）クロマトグラフィーによる核酸の特徴付けまたは分離を実施するための緩衝液；（３）マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルプレート；（４）液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析法のためのオリゴヌクレオチド標準（例えば、６マー、７マー、８マー、１０マー、１２マー、１４マー、および１６マー）；ならびに（５）そのキットの使用に関する取り扱い説明書。
（８．本発明の遺伝的バリエーション検出方法の適用）
上記に詳細に記載されたように、本発明は、標的核酸中における遺伝的バリエーションの検出および／または同定のための方法を提供する。本発明に従う方法は、遺伝的バリエーションの同定または測定が所望されるかまたは必要とされる広範な種々の適用において用途を見出し得る。このような適用としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：遺伝性移行疾患（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｉｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ）、腫瘍診断、疾患の素因、法医学、父子鑑定、作物栽培または動物育種における増強、細胞機能および／または疾患マーカー遺伝子の発現プロフィール、ならびに植物もしくは動物において感染性疾患を引き起こすかおよび／もしくは食物の安全性に関連する感染性生物の同定ならびに／または特徴付けについての遺伝的分析。
例えば、本発明は、法医学的目的のための遺伝子分析において有用であり得る。ＤＮＡ配列のバリエーションレベルでの個体の同定は、フィンガープリント、血液型または身体的特徴のような従来の判断基準よりも有益である。大半の表現型マーカーとは対照的に、ＤＮＡ分析は容易に、父子試験において必要とされるような、個体間の関連性の推論を可能にする。遺伝子分析は、骨髄移植（ここでは、密接に関連したドナーとレシピエント細胞との間を識別することが必要とされる）おいて非常に有用であることが証明されている。本発明は、サンプルＤＮＡの多型性を特徴付けるにおいて有用であり、従って、法医学的ＤＮＡ分析において有用である。例えば、１つのサンプル中における２２の分離遺伝子配列（それぞれは、集団中において２つの異なる形態で存在する）の分析は、１０１０の異なる結果を生じ得、ヒト個体の独特な特徴付けを可能にする。
ウイルス性または細胞性のオンコジーンの検出は、核酸診断の別の重要な適用分野である。ウイルス性オンコジーン（ｖ−オンコジーン）は、レトロウイルスによって伝えられ、一方その細胞性対応物（ｃ−オンコジーン）は、正常細胞において既に存在する。しかし、細胞性オンコジーンは、点変異（膀胱癌腫および結腸直腸腫瘍におけるｃ−Ｋ−ｒａｓオンコジーンにおけるように）、小さな欠失および小さな挿入のような特定の改変によって活性化され得る。各活性化プロセスは、さらなる変性プロセスと組み合わせられて、細胞増殖の増加および制御不能へと導く。さらに、点変異、小さな欠失または挿入はまた、いわゆる「抑制性オンコジーン」を不活性化し得、それにより、腫瘍の形成へと導く（網膜芽腫（Ｒｂ）遺伝子および骨肉腫におけるように）。本発明は、オンコジーンを活性化するかまたは抑制性オンコジーンを不活性化し、それにより次いで癌を引き起こす、点変異、小さな欠失および小さな変異を検出または同定するにおいて有用である。
本発明はまた、移植分析において有用であり得る。移植された組織の拒絶反応は、特定のクラスの組織適合抗原（ＨＬＡ）によって決定的に制御される。これらは、抗原提示血液細胞（例えば、マクロファージ）の表面において発現される。ＨＬＡと外来抗原との間の複合体は、Ｔヘルパー細胞によって、その細胞表面上の対応するＴ細胞レセプターを通して認識される。ＨＬＡと抗原とＴ細胞レセプターとの間の相互作用は、複雑な防御反応を誘発し、これが、身体におけるカスケード様の免疫応答を導く。
異なる外来抗原の認識は、Ｔ細胞レセプターの可変性の抗原特異的な領域によって媒介される（抗体反応と類似）。従って、移植片拒絶において、外来抗原に合う特定のＴ細胞レセプターを発現するＴ細胞は、Ｔ細胞プールから排除され得る。このような分析は、ＰＣＲによって増幅され、そしてそれにより選択的に増加される抗原特異的な可変ＤＮＡ配列の同定によって可能になる。このような特異的な増幅反応は、特定のＴ細胞レセプターの単一細胞特異的な同定を可能にする。
同様の分析が、現在、若年性糖尿病のような自己免疫疾患、動脈硬化、多発性硬化症、慢性関節リウマチまたは脳脊髄炎の同定のために実施されている。
本発明は、種々の外来抗原の認識に関与する可変性の抗原特異的な領域をコードするＴ細胞レセプター遺伝子における遺伝的バリエーションを決定するために有用である。従って、本発明は、移植される組織の拒絶反応の確率を予測するにおいて有用であり得る。
本発明はまた、ゲノム診断において有用である。全新生児のうちの４％が、遺伝的欠損を有して生まれてくる；そのうちの３，５００の遺伝性疾患は、単一の遺伝子のみの改変によって引き起こされることが記載されており、主な分子欠損は、そのうちの約４００について知られているに過ぎない。
遺伝性疾患は、表現型分析（病歴（例えば、血液の欠損：サラセミア））、染色体分析（核型（例えば、蒙古症：２１トリソミー））または遺伝子産物の分析（改変されたタンパク質（例えば、フェニルケトン尿：フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素の欠損が、フェニルピルビン酸のレベルの増大を生じさせる））によって診断されるようになってから長い。核酸検出方法のさらなる使用は、ゲノム診断の範囲をかなり増大させている。
特定の遺伝子疾患の場合では、２つの対立遺伝子のうちのたった１つの改変が、疾患に十分であり（優性遺伝される単一遺伝子の欠損）；多くの場合には、両方の対立遺伝子が改変されなければならない（劣性遺伝される単一遺伝子の欠損）。第３の型の遺伝子欠損では、疾患の蔓延は、遺伝子改変によって決定されるのみならず、食習慣（糖尿病または動脈硬化症の場合）、または生活習慣（癌の場合）のような要因によっても決定される。非常にしばしば、これらの疾患は、高齢において生じる。精神分裂病、躁うつ病、または癲癇のような疾患もまた、この状況で言及されるべきである；これらは、これらの場合における疾患の蔓延が、環境要因に依存するのか否か、ならびに、異なる染色体位置におけるいくつかの遺伝子の改変に依存するのか否かについて研究されているところである。
直接的および間接的なＤＮＡ分析を使用して、以下の一連の遺伝子疾患の診断が可能となる：膀胱癌腫、結腸直腸腫瘍、鎌状赤血球貧血、サラセミア、ａｌ−アンチトリプシン欠損、レッシュ−ナイハン症候群、嚢胞性線維症／ムコビシドーシス、デュシェーヌ／ベッカー筋ジストロフィー、アルツハイマー病、Ｘ染色体依存性精神遅滞、およびハンティングトン舞踏病、フェニルケトン尿症、ガラクトース血症、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、重症複合免疫不全、α−１−アンチトリプシン欠損、白皮症、アルカプトン尿症、リソソーム蓄積病、エーレルス−ダンロー症候群、血友病、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ障害、無ガンマグロブリン血症、尿崩症、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、ファブリー病、ぜい弱Ｘ症候群、家族性高コレステロール血症、多発性嚢胞腎臓病、遺伝性球状赤血球症、マルファン症候群、ヴォン・ヴィレブランド病、神経線維腫症、結節硬化症、遺伝性出血性毛細管拡張症、家族性大腸ポリープ、エーレルス−ダンロー症候群、筋緊張性ジストロフィー、骨形成不全、急性間欠性ポルフィリン症、およびフォン・ヒッペル‐リンダウ症候群。本発明は、規定された位置における点変異、小さな欠失または小さな挿入によって引き起こされる任意の遺伝子疾患の診断において有用である。
関連の局面において、本発明は、疾患の感受性を試験するにおいて有用であり得る。特定の遺伝的バリエーションは、それらが直接的に疾患を引き起こすわけではなくても、疾患と関連付けられる。言い換えれば、被験体によってその遺伝的バリエーションが保有されることは、その被験体をその疾患に対して感受性にする。本発明の方法を使用して、このような遺伝的バリエーションを検出することは、特定の疾患に対して感受性であり得る被験体の同定を可能にし、引き続いて予防的な測定の実行を可能にする。
本発明はまた、薬理ゲノム学（ｐｈａｒｍｏｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）に適用可能である。例えば、薬物耐性に関係する遺伝子（例えば、シトクロムＰ４５０遺伝子の種々の対立遺伝子）を検出または同定するために使用され得る。
さらに、本発明は、残存性の疾患を検出または特徴付けるために有用な方法を提供する。言い換えると、本発明は、特定の処置（例えば、化学療法の手術）後の癌におけるような残存する変異遺伝子型を検出または同定するために使用され得る。本発明はまた、病原性生物薬物耐性を与える特定の遺伝子における遺伝的バリエーションのような出現する変異を同定する際に有用であり得る。
（Ｅ．プレｍＲＮＡ選択的スプライシング分析における核酸増幅方法および組成物の使用）
指数関数的な核酸の増幅のための方法および組成物はまた、プレｍＲＮＡ選択的スプライシング分析を実施するために使用され得る。上流エキソン（エキソンＡ）と下流エキソン（エキソンＢ）との間に連結部を含むと推定される標的ｃＤＮＡまたはその一部を、最初に、第１の増幅反応におけるテンプレートとして使用されるべき開始核酸分子（Ｎ１）に組み込む。開始核酸分子はまた、第１のニック形成剤認識配列の少なくとも一方の鎖を含み、従って、ＤＮＡポリメラーゼおよび第１のニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で、第１の増幅反応が可能になる。第１の増幅反応からの生成物（Ａ１）は、特定のエキソン−エキソン連結部またはその相補的部分を含むと推定される標的の一部を含む。次いで、Ａ１は、別のテンプレート核酸（Ｔ２）と混合される。Ｔ２分子は、５’から３’へ以下を含む：（ｉ）第１の配列であって、以下：（ａ）エキソンＡのセンス鎖の３’部分であって、３’部分の３’末端において、エキソンＢのセンス鎖の５’部分に、５’部分の５’末端において連結される、エキソンＡのセンス鎖の３’部分、または（ｂ）エキソンＡのアンチセンス鎖の５’部分であって、５’部分の５’末端において、エキソンＢのアンチセンス鎖の３’部分に、３’部分の３’末端において連結されたエキソンＡのアンチセンス鎖の５’部分を含み、ここで、ｃＤＮＡが、エキソンＡとエキソンＢとの間で連結部を含む場合、Ｔ２の第１の配列は、Ａ１分子に対して少なくとも実質的に相補的であるが、ｃＤＮＡが、エキソンＡとエキソンＢとの間に連結部を含まない場合、Ｔ２は、Ａ１分子に対して実質的に相補性でない、第１の配列；（ｉｉ）第２のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列；および（ｉｉｉ）第２の配列。次いで、エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部が、標的ｃＤＮＡ分子内に存在する場合、テンプレートとしてＴ２分子の第２の配列の少なくとも一部を使用して、別の一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する増幅反応を実施する。次いで、任意のＡ２分子が増幅されたか否かを決定するために、反応混合物を、分析する。混合物中のＡ２分子の存在は、標的核酸が、エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部を含むことを示し、Ａ２分子の非存在は、標的核酸がエキソンＡとエキソンＢとの間の連結部を含まないことを示す。
（１．定義）
「エキソン」とは、成熟ＲＮＡ産物中に示される中断された遺伝子の任意のセグメントをいう。「イントロン」とは、転写されるが、そのいずれかの側において配列（エキソン）とともにスプライシングによって転写物内から除去されるＤＮＡのセグメントをいう。
ｃＤＮＡ分子の「センス鎖」とは、ｍＲＮＡ内のヌクレオチド「Ｕ」が、ｃＤＮＡ分子内のヌクレオチド「Ｔ」によって置換されることを除いて、ｃＤＮＡ分子が由来するｍＲＮＡ分子と同一の配列を有する鎖をいう。他方、ｃＤＮＡ分子の「アンチセンス鎖」とは、ｃＤＮＡ分子が由来するｍＲＮＡ分子と相補的である鎖をいう。
エキソンの鎖の「３’部分」とは、エキソンの鎖の３’末端を含むエキソンの鎖の一部をいう。同様に、エキソンの鎖の「５’部分」とは、エキソンの鎖の５’末端を含むエキソンの鎖の一部をいう。
エキソン（エキソンＡ）は、エキソンＡのセンス鎖の配列がエキソンＢのセンス鎖の配列に対して５’側にある場合、同じ遺伝子内で、別のエキソン（エキソンＢ）に対して「上流」である。エキソンＡおよびエキソンＢは、それぞれ、上流エキソンおよび下流エキソンとして、さらに呼ばれ得る。
標的ｃＤＮＡ分子とは、目的の遺伝子由来のｃＤＮＡ分子をいう。言い換えると、これは、目的の遺伝子の転写物から生じたｍＲＮＡ分子の逆転写の産物である。標的ｃＤＮＡ分子は、部分配列を有し得る（すなわち、部分ｍＲＮＡ分子から逆転写される）が、好ましくは、全長配列を有し得る。
第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰを含む核酸フラグメントとは、一方の鎖が、第１のＯＤＮＰの配列、第２のＯＤＮＰの相補配列、および第１のＯＤＮＰと第２のＯＤＮＰの相補配列との間の配列からなり；一方、他方の鎖が、第１のＯＤＮＰの相補配列、第２のＯＤＮＰの配列、および第１のＯＤＮＰの相補配列と第２のＯＤＮＰの配列との間の配列からなる、二本鎖核酸フラグメントをいう。
「差示的スプライシング」または「選択的スプライシング」は、遺伝子の同じ転写物からの少なくとも２つの異なるｍＲＮＡ分子の産生である。例えば、転写物の特定のセグメントは、ｍＲＮＡ分子の１つに存在し得るが、他のｍＲＮＡ分子からスプライシングによって除かれ得る。
「２つの特定のエキソンの連結部であると推定される位置」または「２つの特定のエキソンの推定される連結部の位置」とは、比較的上流のエキソンのセンス鎖の３’末端および／またはそのエキソンのアンチセンス鎖の５’末端をいう。
標的ｃＤＮＡにおける「エキソンＡおよびエキソンＢの連結部」とは、エキソンＡの３’末端が、エキソンＢの５’末端と接合する標的ｃＤＮＡのセンス鎖内の位置、および／またはエキソンＡの５’末端が、エキソンＢの３’末端と接合する標的ｃＤＮＡのアンチセンス鎖内の位置をいう。
（２．開始核酸分子（Ｎ１））
差示的スプライシング分析に有用な開始核酸分子は、種々のアプローチによって提供され得る。例えば、Ｎ１は、二本鎖標的ｃＤＮＡから直接的に誘導され得る（例えば、図２６において示されるように、制限エンドヌクレアーゼを用いる標的ｃＤＮＡの消化による）。あるいは、Ｎ１はまた、適切なオリゴヌクレオチドプライマー対（例えば、図２７〜３０）の使用によって調製され得る。開始核酸分子Ｎ１を提供するためのいくつかの例示的な手段は、以下に記載される。
（ａ．Ｎ１分子を提供するための第１の型の例示的な方法）
本発明の特定の実施形態において、Ｎ１は、特定のエキソン−エキソン連結部であると推定される位置を含み、さらに、ニック形成剤認識配列および制限エンドヌクレアーゼ認識配列をさらに含む、標的ｃＤＮＡから直接由来する。例示的なニック形成剤認識配列としてその認識配列の外側でニック形成するニック形成エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ）によって認識可能な認識配列を用いる実施形態が、図２６に示される。この図において示されるように、標的ｃＤＮＡは、標的核酸中の配列を認識する制限エンドヌクレアーゼによって消化され得る。ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を含む消化産物は、一本鎖核酸フラグメント（Ａ１）を増幅するための開始核酸分子（Ｎ１）として機能し得る。特定のエキソン−エキソン連結部であると推定される位置は、ニック形成剤によって産生されるニック形成部位と制限エンドヌクレアーゼの切断部位との間であることが必要であり、その結果、その位置は、増幅されたＡ１フラグメント内に移されるかまたは組み込まれる。
（ｂ．Ｎ１分子を提供するための第２の型の例示的な方法）
特定の実施形態において、開始核酸分子Ｎ１は、種々のプライマー対を使用して作製された完全にかまたは部分的に二本鎖の核酸分子である。以下の節は、最初に、上記開始核酸分子を提供するための一般的方法（図２７）を記載し、次いで、一般的方法のある特定の実施形態を提供する（図２８〜３０）。
上流のエキソン（エキソンＡ）と下流のエキソン（エキソンＢ）の連結部の存在または非存在を決定するために、以下の２つのプライマーから構成されるプライマー対を使用し得る：（１）アンチセンス鎖内のエキソンＡの５’末端近くのエキソンＡのアンチセンス鎖の一部に相補的な配列を含む第１のプライマー、および（２）センス鎖内のエキソンＢの５’末端近くのエキソンＢのセンス鎖の一部に相補的な配列を含む第２のプライマー（図２７）。第１のＯＤＮＰとエキソンＡのアンチセンス鎖の一部との間の相補性は、正確である必要はないが、ＯＤＮＰが、エキソンＡのその部分に特異的にアニールし得るのに十分でなければならない。同様に、第２のＯＤＮＰとエキソンＢのセンス鎖の一部との間の相補性は、正確である必要はないが、ＯＤＮＰが、エキソンＢのその部分に特異的にアニールし得るのに十分でなければならない。エキソンの鎖の一部は、その部分がその鎖のその末端から１００ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、または１０ヌクレオチド以内である場合、エキソンの末端の１つの近くにある。ＯＤＮＰ対の２つのＯＤＮＰ間のこのような空間的配置は、エキソンＡおよびエキソンＢの連結部が、標的ｃＤＮＡ内に存在する場合、テンプレートとして標的ｃＤＮＡを使用して、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む比較的短いフラグメントの増幅を可能にする。
各プライマーとその対応するエキソンの一方の鎖との間の配列相補性に加えて、第１の
プライマーまたは第２のプライマーのいずれかが、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列をさらに含まなければならない。認識シーケンサーは、ニック形成エンドヌクレアーゼまたは制限エンドヌクレアーゼによって認識可能であり得る。特定の好ましい実施形態において、第１のプライマーおよび第２のプライマーの両方が、ニック形成剤認識配列を含む。認識配列の存在は、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む増幅核酸フラグメントが、ＤＮＡポリメラーゼおよび認識配列を認識するニック形成剤の存在下で一本鎖核酸フラグメント（Ａ１）を増幅するたのテンプレート核酸として、機能することを可能にする。
プライマーおよび標的ｃＤＮＡが増幅反応において組み合わされる場合、増幅産物の存在（または非存在）および組成は、エキソンＡおよびエキソンＢの連結部の存在または非存在を反映する。エキソンＡのみまたはエキソンＢのみが標的ｃＤＮＡに存在する場合、増幅産物は、プライマーとしての上記プライマーおよびテンプレートとしての標的ｃＤＮＡを使用して作製されない。エキソンＡおよびエキソンＢの両方が標的ｃＤＮＡに存在する場合、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む増幅産物（すなわち、Ｎ１分子またはＮ１に対する前駆体）が作製される。エキソンＡおよびエキソンＢの連結部が標的ｃＤＮＡに存在する場合、増幅産物は、この接合物を含む（図２７Ａ）。エキソンＡおよびエキソンＢの連結部が存在しない（すなわち、エキソンＡとエキソンＢとの間に配列が存在する）場合、増幅産物は、連結部を含まないが、２つのエキソンの間の配列を含む（図２７Ｂ）。従って、テンプレートとしてＮ１を使用して増幅される一本鎖核酸分子（Ａ１）および／またはテンプレートとしてＡ１を使用する別の一本鎖核酸分子（Ａ２）を特徴付けることは、標的ｃＤＮＡがエキソンＡおよびエキソンＢの連結部を含むか否かを示す。
上記一般的方法の特定の実施形態は、図２８に示される。この図に示されるように、第１のプライマーは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含み、そしてエキソンＡのアンチセンス鎖の一部にアニールし、第２のプライマーは、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含み、そしてエキソンＢのセンス鎖の一部にアニールする。これらの２つのプライマーが標的ｃＤＮＡの一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、増幅産物（すなわち、Ｎ１に対する前駆体）は、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列の両方の鎖およびＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列の両方の鎖を含む。さらに、増幅産物はまた、連結部が標的ｃＤＮＡに存在する場合、エキソンＡおよびエキソンＢの連結部を含む。ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列を認識するＩＩｓ型エンドヌクレアーゼの存在下で、増幅産物が消化されて、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列の両方の鎖を含み、そして連結部が標的ｃＤＮＡに存在する場合、エキソンＡおよびエキソンＢの連結部も含む、部分的に二本鎖の核酸分子Ｎ１を生成する。
上記一般的な方法の別の特定の実施形態は、図２９に示される。この図に示されるように、両方のプライマーは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。さらに、第１のプライマーは、エキソンＡのアンチセンス鎖の一部にアニールするように設計され、第２のプライマーは、エキソンＢのセンス鎖の一部にアニールするように設計される。これらの２つのプライマーが標的ｃＤＮＡの一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、増幅産物（すなわち、Ｎ１に対する前駆体）は、連結部が標的ｃＤＮＡに存在する場合、エキソンＡおよびエキソンＢの連結部、ならびに２つの二本鎖ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。これらの２つの認識配列は、互いに同一であっても良く同一でなくても良いが、好ましくは、これらは、同一である。認識配列を認識するニック形成エンドヌクレアーゼの存在下において、増幅産物は、それぞれがニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列の１つを含む２つの部分的に二本鎖の核酸分子（Ｎ１ａおよびＮ１ｂ）を生成するために、２回（各鎖で１回）ニック形成される。さらに、これら２つの分子のそれぞれのオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）はまた、連結部が標的ｃＤＮＡに存在する場合、エキソンＡおよびエキソンＢの連結部を含む。
上記一般的な方法のさらなる特定の実施形態を、図３０に示す。この図に示されるように、両方のプライマーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。さらに、第１のプライマーは、エキソンＡのアンチセンス鎖の一部にアニールするように設計され、第２のプライマーは、エキソンＢのセンス鎖の一部にアニールするように設計される。これら２つのプライマーが、改変デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で標的ｃＤＮＡの一部を増幅するためのプライマーとして使用される場合、増幅産物（すなわち、Ｎ１への前駆体）は、連結部が標的ｃＤＮＡに存在する場合、エキソンＡおよびエキソンＢの連結部、ならびに２つの半改変制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。これらの２つの半改変認識配列は、互いに同一であっても良いし、同一でなくても良いが、好ましくは、これらは、同一である。認識配列を認識する制限エンドヌクレアーゼの存在下で、増幅産物は、それぞれが半改変認識配列の１つの一方の鎖の配列を含む、２つの部分的に二本鎖の核酸分子（Ｎ１ａおよびＮ１ｂ）を生成するために、２回（各鎖で１回）ニック形成される。さらに、これら２つの分子のそれぞれのオーバーハングはまた、連結部が標的ｃＤＮＡに存在する場合、エキソンＡおよびエキソンＢの連結部を含む。
上記第１のＯＤＮＰ、第２のＯＤＮＰまたは両方が、特定の実施形態において固体支持体に固定され得る。他の実施形態において、標的ｃＤＮＡ分子が固定化される。
（３．Ａ１分子）
上記のように、Ａ１分子は、テンプレートとしてＮ１の一部を使用して増幅される。Ｎ１のこの部分は、特定のエキソン−エキソン連結部であると推定される位置を含み、その結果、この位置が、Ａ１に移されるかまたは組み込まれる。特定の実施形態において、Ａ１の長さは、特定のエキソンーエキソン連結部が標的ｃＤＮＡに存在する場合に比較的短いように調整され得る。例えば、Ｎ１分子を提供する第２の型（図２７〜３０）について、ＯＤＮＰ対は、それらが標的ｃＤＮＡにアニールする場合、互いに近接するように設計され得る。より詳細には、第１のプライマーは、エキソンＡの５’末端に近い標的ｃＤＮＡのアンチセンス鎖の一部にアニールするように設計され得、第２のプライマーは、エキソンＢの５’末端に近い標的ｃＤＮＡのセンス鎖の一部にアニールするように設計され得る。上記の本発明の診断的使用および遺伝的バリエーションの検出と同様に、Ａ１分子の短い長さは、増幅効率および速さを増大し、鎖置換活性を有しないＤＮＡポリメラーゼの使用を可能にし、そして質量分光分析のような特定の技術を介してＡ１分子の検出を促進する。さらに、第２のＯＤＮＰがアニールするエキソンＢの一部の３’末端とエキソンＢのセンス鎖の３’末端との間の短い距離は、エキソンＡとエキソンＢと間の標的核酸中の余分な配列が存在する場合、Ａ１分子が、Ｔ２分子にハイブリダイズすることを妨げる。
（４．Ｔ２分子）
上記のように、プレｍＲＮＡ選択的スプライシング分析に適切なＴ２分子は、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、ならびに認識配列のセンス鎖の配列の３’側に配置される配列を含む（すなわち、開始核酸が誘導される標的ｃＤＮＡが、目的のエキソン−エキソン連結部（例えば、上流エキソン−エキソンＡ、および下流エキソン−エキソンＢ）を含む場合、テンプレートとして開始核酸分子Ｎ１の一部を使用して増幅される一本鎖核酸分子（Ａ１）に少なくとも実質的に相補的である）。
より詳細には、Ｔ２分子は、５’から３’への以下を含む：（ｉ）標的核酸の一部を含む第１の配列であって、この標的核酸は、以下を含む：（ａ）エキソンＡのセンス鎖の３’部分であって、３’部分の３’末端において、エキソンＢのセンス鎖の５’部分に、５’部分の５’末端において連結される、エキソンＡのセンス鎖の３’部分、または（ｂ）エキソンＡのアンチセンス鎖の５’部分であって、５’部分の５’末端において、エキソンＢのアンチセンス鎖の３’部分に、３’部分の３’末端において連結される、エキソンＡのアンチセンス鎖の５’部分を含み、ここで、ｃＤＮＡが、エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部を含む場合、Ｔ２の第１の配列は、Ａ１分子に対して少なくとも実質的に相補的であるが、ｃＤＮＡが、エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部を含まない場合、Ｔ２は、Ａ１分子に対して実質的に相補性でない、第１の配列；（ｉｉ）第２のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列；および（ｉｉｉ）第２の配列。
Ｔ２分子が、標的ｃＤＮＡがエキソン−エキソン連結部を含まない場合に増幅されるＡ１分子に実質的に相補的でないことを確実にするために、Ｔ２分子の第１の配列におけるエキソンＡのセンス鎖の３’部分またはエキソンＢのアンチセンス鎖の３’部分は、３’部分のみ（すなわち、第１の配列の残りの部分なしで）が３’部分の相補部分を含むＡ１分子にアニールし得るほど長くない。そうでなければ、本発明の方法は、標的ｃＤＮＡが特定のエキソン−エキソン連結部を有する状況と、標的ｃＤＮＡが、上流エキソンと下流エキソンとの間の余分な配列を有する状況とを区別することができない。言い換えると、上流エキソンと下流エキソンとの間の余分な配列を有する標的ｃＤＮＡの一部を使用して増幅されるＡ１分子は、テンプレートとしてＴ２分子の一部を使用して別の分子（Ａ２）の増幅を開始するために、上流エキソンのセンス鎖の長い３’部分、または下流エキソンのアンチセンス鎖の長い３’部分を有するＴ２分子にアニールすることが可能である。
特定の実施形態において、Ｔ２分子は、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列に対して３’側に配置される第１の配列に実質的に同一であるかまたは完全に同一であるかのいずれかであるＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列の５’側に配置される第２の配列を含む。
Ｔ２分子は、特定の実施形態において、固体支持体に、好ましくは、その５’末端を介して、固定され得る。他の実施形態において、Ｔ２分子は、固定化されなくても良い。
（５．増幅された一本鎖核酸の特徴付け）
標的ｃＤＮＡ分子が、特定のエキソン−エキソン連結部を有するか否かが、増幅生成物（すなわち、Ａ１またはＡ２）を特徴付けることにより検出または同定され得る。一本鎖核酸分子を特徴付けするために適切な任意の方法が、使用され得る。例示的な技術としては、クロマトグラフィー（例えば、液体クロマトグラフィー）、質量分析法、および電気泳動が挙げられるが、これらに限定されない。種々の例示的な方法の詳細な記載は、米国仮特許出願第６０／３０５，６３７号および同第６０／３４５，４４５号に見いだされ得る。
増幅された一本鎖核酸フラグメントの特徴（例えば、質量分析により得られる質量 対 電荷比）は、続いて、テンプレート核酸フラグメントを調製する際に使用されるプライマーの位置および組成を考慮して推定される一本鎖核酸フラグメントの特徴と、および２つのエキソン（これらに対してプライマーが相補的である）の間の連結部が存在するという仮定と比較される。増幅され、推定された核酸フラグメントの特徴が同一である場合、標的ｃＤＮＡ分子中に存在すると仮定された特定のエキソン−エキソン連結部が、実際に標的ｃＤＮＡ分子中に存在する。増幅される一本鎖核酸フラグメントの配列の推定および特徴（例えば、質量 対 電荷比）は、エキソン−イントロン連結部付近のコンセンサス配列についての知見に基づく。この知見は、当業者が、エキソン−イントロン連結部を正確に特定し、従って、２つのエキソンの間のイントロンがスプライシングによって除去された場合に、エキソン−エキソン連結部の正確な位置を推定することを可能にする。
（６．プレｍＲＮＡ差示的スプライシング分析において有用な組成物およびキット）
プレｍＲＮＡ差示的スプライシング分析において有用な組成物およびキットは、指数関数的核酸増幅についての上記の組成物およびキットと同じであり得る。特定の実施形態において、これらのキットは、増幅産物を特徴付ける際に有用な１以上のさらなる成分をさらに含み得る。例えば、さらなる成分は、（１）クロマトグラフィーカラム；（２）核酸のクロマトグラフィーによる特徴付けまたは分離を行うための緩衝液；（３）マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルプレート；（４）液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析法のためのオリゴヌクレオチド標準（例えば、６マー、７マー、８マー、１０マー、１２マー、１４マー、および１６マー）；（５）逆転写酵素；（６）逆転写酵素のための緩衝液；および（７）このキットを使用するための説明書冊子。
（７．本発明のプレｍＲＮＡ差示的スプライシング分析の適用）
本発明は、目的の任意のｍＲＮＡ差示的スプライシングを検出する際に有用である。プレｍＲＮＡ選択的スプライシングは、高等真核生物における遺伝子発現を調節するために重要な機構である。最近の評価によると、ヒト遺伝子の約３０％の一次転写産物が、選択的スプライシングに供され、しばしば、通常の発生の間に特定の空間的／時間的パターンにて調節される。複雑な遺伝子においては、選択的スプライシングは、１つの転写産物から、十数個から数百個もの異なるｍＲＮＡアイソフォームを生成し得る（ＢｒｅｉｔｂａｒｔおよびＮａｄａｌ−Ｇｉｎａｒｄ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：４６７−９５，１９８７；ＭｉｓｓｌｅｒおよびＳｕｄｈｏｆ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １４：２０−６，１９８８；Ｇａｓｃａｒｄら、Ｂｌｏｏｄ ９２：４４０４−１４，１９９８）。多くの場合、選択的スプライシングされたエキソンは、触媒活性または結合相互作用にとって機能的に重要なタンパク質ドメインをコードし、生じたタンパク質は、異なるまたは拮抗的活性すら示し得る。
本明細書中上記で詳細に議論されるように、本発明は、プレｍＲＮＡ選択的スプライシングを検出（ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ集団中の遺伝子の特定のエキソンの末端における選択的スプライシングおよびｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ集団中の遺伝子の全てのエキソンの全ての末端における選択的スプライシングの検出を包含する）するための方法、組成物、およびキットを提供する。プレｍＲＮＡスプライシングの重要性に起因して、これらの方法、組成物およびキットは、疾患の診断、素因、および処置、作物栽培、ならびに動物の繁殖、植物および動物の発生調節、薬物開発、ならびに外部刺激（例えば、極端な温度、毒物、および光）に対する生物の応答の操作のような、広範な種々の適用における有用性が見いだされる。
例えば、本発明は、病理的条件に独特のプレｍＲＮＡスプライシングパターンを同定および／または特徴付けするために使用され得る。多くの遺伝子における異常なプレｍＲＮＡスプライシングは、種々の疾患または障害（特に癌）に関与している。小細胞性肺癌腫において、タンパク質ｐ１３０の遺伝子（これは、網膜芽細胞腫のタンパク質ファミリーに属する）は、コンセンサススプライシング部位にて変異される。この変異は、結果として、エキソン２が除去され、未成熟終止コドンの存在に起因してタンパク質の合成がない。同様に、特定の非小細胞性肺癌において、タンパク質ｐ１６ＩＮＫ４Ａ（サイクリン依存性キナーゼｃｄｋ４およびｃｄｋ６のインヒビターである）の遺伝子は、ドナースプライシング部位にて変異される。この変異は、短縮化された短い半減期のタンパク質の生成を生じる。さらに、ＷＴ１（ウィルムス腫瘍サプレッサ遺伝子）は、選択的スプライシングによって生成されるいくつかのメッセンジャーＲＮＡに転写される。乳癌において、異なる改変体の相対的割合は、健常な組織と比較して改変され、従って、診断ツール、または腫瘍進行におけるＷＴ１の種々の機能的ドメインの重要性を理解するに当たっての知見が得られる。細胞形質転換の間の異なるｍＲＮＡ形態およびタンパク質アイソフォームの間の比に影響を及ぼす類似の別のプロセスはまた、ニューロフィブリンＮＦ１において見いだされる。さらに、頭部および頸部の癌において、ｐ５３が不活性化される機構の１つが、コンセンサススプライシング部位における変異を含んでいた。さらに、ＩＲＦ−１腫瘍サプレッサー遺伝子転写物の改変されたスプライシングパターンは、この腫瘍サプレッサーの不活性化を生じ、そしてＩＲＦ−１ ｍＲＮＡにおけるエキソンスキッピングの加速は、脊髄形成異常症候群からの顕在白血病、急性骨髄性白血病、および脊髄形成異常症候群を含む多くの造血障害の指標である（米国特許第５，６４３，７２９号）。
本発明の方法は、疾患（または障害）状態と関連することが知られるかまたは疑われる遺伝子の転写物のスプライシングパターンを比較するため、およびその存在または不在が疾患（または障害）状態に特有であるエキソンを同定するため、または疾患（または障害）状態に特有の異なるスプライシング改変体間の比率における改変を同定するために用いられ得る。疾患（または障害）状態に不在であるエキソンの同定は、これらエキソンによりコードされるドメインが、健常細胞の正常機能に重要であること、しかも、このようなドメインを含むシグナル伝達経路が、治療目的のために回復され得ることを示し得る。その一方、疾患（または障害）状態に特有に存在するエキソンの同定は、診断ツールとして用いられ得、そしてそのコードされるドメインは、これらドメインにより媒介されるシグナル伝達と拮抗することが意図される低分子量化合物のスクリーニング標的として考慮され得る。さらに、これらドメインに対する特異的親和性をもつ抗体はまた、この疾患（または障害）状態の診断ツールとして用いられ得る。
本発明はまた、生物発生において重要なプレｍＲＮＡ差次的スプライシングを同定および／または特徴付けるために用いられ得る。選択的スプライシングは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおける性決定、ヒトにおける抗体応答、および他の組織または発生ステージ特異的プロセスにおいて主要な役割を演じている（Ｃｈａｂｏｔ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：４７２〜８；Ｓｍｉｔｈら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２３：５２７〜７７、１９８９；Ｂｒｅｉｔｂａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４９：７９３〜８０３、１９８７）。従って、本発明の方法は、異なる発生ステージで発生調節に含まれることが知られるか、または疑われる遺伝子のプレｍＲＮＡスプライシングパターンを比較するために用いられ得る。この遺伝子における差次的スプライシングの存在の同定および／または特徴付けは、所望の形質（例えば、より大きな果実、より高いタンパク質または油含量種子、より高いミルク生産）を得るための対応する発生プロセスを調節することで指針を提供し得る。
本発明の方法はまた、種々の外部刺激に対する生物の応答において重要なプレｍＲＮＡ差次的スプライシングを同定および／または特徴付けるために用いられ得る。非処置生物の特定の刺激（例えば、病原体の攻撃）に対する応答で役割を演じていることが知られるか、または疑われる遺伝子のプレｍＲＮＡスプライシングパターンは、この刺激を受けた生物のプレｍＲＮＡスプライシングパターンと比較され得る。刺激を受けた生物に特有のスプライシングパターンの同定および／または特徴付けは、この応答を増大するため（この応答が所望される場合）、または低減／なくす（この応答が所望されない場合）に、対応する応答プロセスを操作することで指針を提供し得る。
以下の実施例は、制限ではなく、例示により提供される。
（実施例１）
（核酸配列の指数関数的増幅）
この実施例は、ニック形成制限エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡポリメラーゼを使用する、特定の核酸配列の指数関数的増幅を記載する。
この実施例において使用されるオリゴヌクレオチドを、ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）から入手した。それらの配列を、以下に示す（Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ認識配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖の配列には、下線を付している）。
Figure 2005519643
 以下の反応混合物を、室温にて合わせた：
７５μｌ 水
１０μｌ １０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（ＮＥＢ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）製）
５μｌ １０×Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ（ＮＥＢ製）
５μｌ Ｔ１（０．２ｎｍｏｌ／μｌ）
５μｌ ＴＯＰ１（０．２ｎｍｏｌ／μｌ）。
この混合物を、９５℃に加熱し、次いで、５０℃に冷却し、５０℃に１０分間保持した。５０℃でのインキュベーションの後、以下の二重鎖（Ｎ１）を形成した：
Figure 2005519643
 上記の混合物を、以下を含有する反応混合物へと希釈した：
２５μｌ １０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（ＮＥＢ製）
１２．５μｌ １０×Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ（ＮＥＢ製）
０．５μｌの上記二重鎖混合物
１０μｌ ２５ｍＭ ｄＮＴＰ（ＮＥＢ製）
１００μｌ １Ｍ トレハロース（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）製）
２５単位 Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉニック形成酵素（ＮＥＢ製）
５単位 ｅｘｏ−ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ製）
５μｌ Ｔ２
１０２μｌ 水。
この反応系を、６０℃にて１５分間インキュベートした。１５分後、１０μｌの反応物をサンプリングし、質量分析に供した。
６０℃でのインキュベーションの間、以下の二重鎖（Ｈ１）を、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉのニック形成部位を示す「下向き黒三角」を、ＤＮＡポリメラーゼの作用によって埋め込んだ。
Figure 2005519643
 このニック形成酵素は、Ｈ１の上方鎖を切断し、配列５’−ｃｃａｇｔｃｇｔａｇｇｔ−３’（「Ａ１」といわれる）を有するフラグメントを遊離する。このフラグメント（すなわちＡ１）が生成される場合、以下の二重鎖（Ｎ２）が、６０℃の反応混合物中に形成される。
Figure 2005519643
 そのポリメラーゼは、二重鎖を埋め込んで、以下のフラグメント（Ｈ２）を形成する：
Figure 2005519643
 Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉは、その二重鎖にニック形成し、配列５’−ｔｔｃｃａｇｔｃｇｔａｇｇｔ−３’（「Ａ２」といわれる）を有するフラグメントを生成し、これは、Ｔ２をプライムして、以下の部分的二本鎖フラグメントを形成し得る：
Figure 2005519643
 上記の部分的二本鎖フラグメントを、そのＤＮＡポリメラーゼによって埋め込んで、以下の二重鎖を形成する：
Figure 2005519643
 次いで、この二重鎖を、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉによりニック形成して、フラグメント５’−ｔｔｃｃａｇｔｃｇｔａｇｇｔ−３’（すなわち、Ａ２）を生成する。ニック形成および伸長プロセスを、複数回反復し、Ａ２分子の増幅をもたらす。
増幅されたフラグメントＡ２は、以下のような推定質量／電荷プロフィールを有する：
Figure 2005519643
 増幅されたフラグメントＡ２の質量分析を、図１６に示す。上側のパネルは、１４４８．６の質量／電荷比を有するフラグメントのイオン電流を示す。総イオン電流は、２２９単位である。中間のパネルは、ダイオードアレイのトレースを示す。下側のパネルは、質量分析器に由来する総イオン電流を示す。
コントロール実験における質量分析を、図１７に示す。上側のパネルは、質量分析器に由来する総イオン電流を示す。中間のパネルは、１４４８．６の質量／電荷比を有するフラグメントのイオン電流を示す。総イオン電流は、４３単位であり、これは、バックグラウンドのみを示す。下側のパネルは、ダイオードアレイのトレースを示す。
上記の結果は、フラグメントＡ２の指数関数的増幅があったこと（１０９倍の増幅が認められた）およびＴＯＰ１が省略されたコントロール実験において、生成物がなかったことを示す。
（実施例２：トリガーオリゴヌクレオチドの指数関数的増幅）
この実施例は、テンプレートオリゴヌクレオチドを使用する、トリガーオリゴヌクレオチドの指数関数的増幅を記載する。
この実施例において使用されるオリゴヌクレオチド配列は、以下のとおりであり、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ認識配列のアンチセンス鎖の配列に下線を付している：
Figure 2005519643
 上記のテンプレートおよびトリガーは、これらが互いにアニールする場合に、以下の二重鎖を形成する：
Figure 2005519643
 ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔまたは９°ＮｍＴＭ）の存在下で、上記の二重鎖は、トリガーオリゴヌクレオチドの３’末端から伸長して、以下の伸長産物を形成する（Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉの認識配列の両鎖の配列に下線を付している）：
Figure 2005519643
 Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉの存在下で、上記の伸長産物にニック形成し、この伸長産物は、部分的二本鎖の核酸およびトリガーオリゴヌクレオチドと同一な配列を有する一本鎖核酸フラグメント（Ａ１）を生成する：
Figure 2005519643
 上記の伸長およびニック形成を複数回繰り返して、Ａ１分子の増幅がもたらされ得る。さらに、Ａ１分子は、一本鎖Ｔ１分子とアニールして、Ａ１分子のさらなる増幅がもたらされ得る。
以下の反応混合物を、４℃にて合わせた：
１００μｌ １０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液
５０μｌ １０×Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ緩衝液
１６μｌ ２５ｍＭ ｄＮＴＰ
０．５μｌ Ｔ１（１００ｐｍｏｌ／μｌ）
８０μｌ ２０００単位／ｍｌ Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ（ＮＥＢ）
２４μｌ ９°ＮｍＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）
１０μｌ ４００×ＳＹＢＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ ＷＡ製）
７４０μｌ 水。
反応混合物を、４℃にて激しく混合した。反応混合物うちの１５０μｌを、第１のチューブに入れ、１００μｌを９つのさらなるチューブに入れた。トリガーを、水中で１００倍希釈し、次いで、１μｌを第１のチューブに入れた。次いで、９つの３倍希釈液を作製した。
各反応物の３０μｌを、光サイクラーキャピラリーに加えた。このキャピラリーを、６０℃にて示された時間にわたりインキュベートした。代表的な結果を、図１８に示す。この図は、時間の関数として、光サイクラーキャピラリーのうちの１つにおける蛍光の蓄積を示す。データを、以下の表にまとめる：
Figure 2005519643
 上記の結果は、約２０，０００倍の範囲が存在し、この範囲に対して、トリガーオリゴヌクレオチドの開始濃度の差異が、測定および比較され得ることを示す。
（実施例３：固定化テンプレートを使用するオリゴヌクレオチドの増幅）
この実施例は、テンプレートとして固定化テンプレートオリゴヌクレオチド（Ｔ２）を使用するオリゴヌクレオチドの増幅を記載する。このオリゴヌクレオチドを、トリガーオリゴヌクレオチドおよび可溶性テンプレートオリゴヌクレオチド（Ｔ１）を使用して最初に増幅した。次いで、溶液中の増幅されたオリゴヌクレオチドを、固定化Ｔ２にアニールした。Ｔ２分子は、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉの二本鎖認識配列のアンチセンス配列の配列を含む。これはまた、アンチセンス配列の配列に対して５’側に位置した第１の配列（これは、そのアンチセンス配列の配列に対して５’側に位置する第２の配列に正確に同一である）を含む。Ｎ．ＢｓｔＮＢ ＩおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下で、そのオリゴヌクレオチドを、テンプレートとして固定化Ｔ２の一部を使用して、さらに増幅した。
トリガーオリゴヌクレオチドの配列、可溶性テンプレートオリゴヌクレオチド（Ｔ１）および固定化オリゴヌクレオチド（Ｔ２）を、以下に示し、ニック形成剤認識配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列に、下線を付す。Ｔ２を、ヘキシルアミン基を介したＰＥＩコーティングチップにその５’末端を付着させることにより固定化した：
Figure 2005519643
 溶液中、トリガーオリゴヌクレオチドおよびＴ１分子は、以下の二重鎖を形成した：
Figure 2005519643
 この二重鎖は、溶液中に０．０１ｆｍｏｌ／５０μｌにて存在した。この二重鎖を、ＤＮＡポリメラーゼで埋め込んだ場合、以下の二重鎖が形成された：
Figure 2005519643
 Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉの存在下で、上記の二重鎖にニック形成し、以下のオリゴヌクレオチドを遊離した：
Figure 2005519643
 伸長およびニック形成サイクルを複数回繰り返して、上記のオリゴヌクレオチドの増幅がもたらされ得る。
増幅されたオリゴヌクレオチドは、固定化テンプレートＴ２にアニールし、以下の二重鎖を形成した：
Figure 2005519643
 上記二重鎖を、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で伸長して、以下の二重鎖を形成した。
Figure 2005519643
 Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉの存在下で、上記の二重鎖にニック形成し、配列３’−ＧＧＡＴＧＣＡＧＴＣＣ−５’を有するオリゴヌクレオチドを遊離した。伸長およびニック形成サイクルを複数回繰り返して、上記のオリゴヌクレオチドの増幅がもたらされ得る。このオリゴヌクレオチドは、別の固定化テンプレートＴ２にアニールし得、オリゴヌクレオチド自体のさらなる増幅が開始され得る。
増幅されたオリゴヌクレオチドは、１２４６のｍ／ｚ値を有する。１２４６のｍ／ｚ値を有するオリゴヌクレオチドの約２単位は、約１０分間で作製された。これは、約１０１２分子に対応する。
前述より、本発明の特定の実施形態が例示の目的で本明細書中に記載されたが、種々の改変が、本発明の本質および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲を除いて限定されない。
本明細書中で参照され、そして／または出願データシートに列挙される、上記の全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国の特許、外国の特許出願、ならびに非特許文献は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
図１は、本発明のタンデム増幅システムの第１の増幅反応の主要な工程の概略図である。 図２は、本発明のタンデム増幅システムの第２の増幅反応の主要な工程の概略図である。 図３は、本発明に従う核酸増幅のための例示的な方法の主要な工程の概略図であり、ここで、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉの認識配列は、例示的なＮＡＲＳとして使用され、そして第１のテンプレート（Ｔ１）および第２のテンプレート（Ｔ２）の両方は、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列（すなわち、５’−ＧＡＣＴＣ−３’）を含む。 図４は、本発明に従うトリガーＯＤＮＰの１プレート増幅の例示的な方法の主要な工程の概略図であり、ここで、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉの認識配列は、例示的なＮＡＲＳとして使用される。 図５は、本発明に従うトリガーＯＤＮＰの２プレート増幅の例示的な方法の主要な工程の概略図であり、ここで、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉの認識配列は、例示的なＮＡＲＳとして使用される。 図６は、本発明に従う核酸増幅についての別の例示的な方法の主要な工程の概略図であり、ここで、それらの各認識配列内にニック形成するＮＡによって認識可能であるＮＡＲＳが、例示的なＮＡＲＳとして使用される。この例示的な方法では、２つのＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含むただ１つのテンプレート（Ｔ１）しか、別の核酸分子（Ａ２）の指数関数的な増幅のために必要とされない。 図７は、本発明に従う核酸増幅のための別の例示的な方法の主要な工程の概略図であり、ここで、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉの認識配列は、例示的なＮＡＲＳとして使用され、第１のテンプレート（Ｔ１）は、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列（すなわち、５’−ＧＡＧＴＣ−３’）を含み、そして第２のテンプレート（Ｔ２）は、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列（すなわち、５’−ＧＡＣＴＣ−３’）を含む。 図８は、第１のテンプレートＴ１に対して、ゲノムＤＮＡ由来のトリガーＯＤＮＰをアニールすることによる、初回核酸分子Ｎ１の調製と、それに続く一本鎖核酸分子Ａ１の増幅についての主要な工程の概略図を示す。 図９は、ゲノムＤＮＡ由来の初回核酸分子Ｎ１の調製と、それに続く、一本鎖核酸分子Ａ１の増幅についての主要な工程の概略図を示す。ゲノムＤＮＡは、ニック形成剤認識配列を含む。Ｎ１分子は、ゲノムＤＮＡフラグメントの一方の鎖を、ゲノムＤＮＡフラグメントの他方の鎖の一部である第１のテンプレート（Ｔ１）に対して、アニールすることによって生成される。 図１０は、ゲノムＤＮＡ由来の初回核酸分子Ｎ１の調製と、それに続く、核酸分子Ａ１の増幅についての主要な工程の概略図を示す。ゲノムＤＮＡは、ニック形成剤認識配列および制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列の外側でニック形成するニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能であるニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列は、例示的なニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列として使用される。 図１１は、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用した、標的核酸由来の初回核酸分子Ｎ１の調製と、それに続く、核酸分子Ａ１の増幅についての主要な工程の概略図を示す。１つのプライマーは、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、一方、他のプライマーは、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）の一方の鎖を含む。 図１２は、２つのＯＤＮＰを使用した、初回核酸分子Ｎ１ａおよび初期核酸分子Ｎ１ｂの調製と、それに続く、核酸分子Ａ１ａおよび核酸分子Ａ１ｂの増幅についての主要な工程の概略図を示す。この例示的な実施形態において、ＯＤＮＰの両方は、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含む。 図１３は、２つのＯＤＮＰを使用する１つの例示的な実施形態において、初期核酸分子Ｎ１を調製することと、それに続く、核酸分子Ａ１の増幅についての主要な工程の概略図である。ＯＤＮＰの両方は、ＲＥＲＳの一方の鎖の配列を含む。増幅は、α−チオデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下において実施され、それは、改変されたチオデオキシヌクレオシド三リン酸の例として使用される。 図１４は、ＮＡＲＳを含む部分的に二本鎖の初回核酸分子Ｎ１を使用して、固定化された標的核酸を検出するための方法の概略図を示す。その認識配列の外側をニック形成するＮＥ（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ）によって認識可能であるＮＥＲＳは、例示的なＮＡＲＳとして使用される。 図１５は、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含む一本鎖核酸分子Ｔ１を使用して、固定化された標的核酸を検出するための方法の概略図を示す。 図１６は、増幅されたＤＮＡフラグメントの質量分析を示す。上図は、１４４８．６の質量／荷電比のフラグメントについてのイオン電流を示す。中図は、ダイオードアレイからの追跡を示す。下図は、質量分析計からの全イオン電流を示す。 図１７は、コントロール実験における質量分析を示す。上図は、ダイオードアレイからの追跡を示す。上図は、質量分析計からの全イオン電流を示す。中図は、１４４８．６の質量／荷電比のフラグメントについてのイオン電流を示す。下図は、ダイオードアレイの追跡を示す。 図１８は、時間の関数としての、代表的な核酸増幅反応混合物の蛍光の累積を示す。 図１９は、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列および標的核酸の３’部分に対して、少なくとも実質的に相補性であり、必要に応じて正確に相補性である配列を含む固定化されたＴ１分子を使用して、標的核酸の存在を検出するための方法の概略図を示す。 図２０は、固定化Ｔ１分子を使用する際に標的核酸の存在を検出するための方法の概略図を示す。この固定化Ｔ１分子は、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含み、かつその標的核酸に少なくとも実質的に相補的であり、かつ必要に応じて、その標的核酸に正確に相補的である。 図２１は、標的核酸から開始核酸分子Ｎ１を調製するための主要な工程、およびその後の一本鎖核酸分子Ａ１の増幅の概略図を示す。この標的核酸は、制限エンドヌクレアーゼ認識配列、および潜在的な遺伝的バリエーションを含む。 図２２は、標的核酸から開始核酸分子Ｎ１を調製するための主要な工程、およびその後の一本鎖核酸分子Ａ１の増幅の概略図を示す。この標的核酸は、ニック形成剤認識配列、制限エンドヌクレアーゼ認識配列、およびこれら２つの認識配列間の遺伝的バリエーションを含む。 図２３は、２つのプライマーを使用して標的核酸から開始核酸分子Ｎ１を調製するための主要な工程、およびその後の核酸分子Ａ１の増幅の概略図を示す。この標的核酸は、遺伝的バリエーション（「Ｘ」）を含む。第一のプライマーは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含み、一方、第二のプライマーは、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含む。 図２４は、２つのプライマーを使用して標的核酸から開始核酸分子（Ｎ１ａおよびＮ１ｂ）を調製するための主要な工程、ならびにその後の核酸分子Ａ１ａおよびＡ１ｂの増幅の概略図を示す。この標的核酸は、遺伝的バリエーション（「Ｘ」）を含む。両方のプライマーは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含む。 図２５は、２つのプライマーを使用して標的核酸から開始核酸分子（Ｎ１ａおよびＮ１ｂ）を調製するための主要な工程、ならびにその後の核酸分子Ａ１ａおよびＡ１ｂの増幅の概略図を示す。この標的核酸は、遺伝的バリエーション（「Ｘ」）を含む。両方のプライマーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖を含む。 図２６は、標的ｃＤＮＡから開始核酸分子（Ｎ１）を調製するための主要な工程、およびその後の核酸分子（Ａ１）の増幅の概略図を示す。この標的ｃＤＮＡは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列、制限エンドヌクレアーゼ認識配列、およびこれら２つの認識配列間の特定のエキソン−エキソン連結部であると推測される位置を含む。 図２７Ａおよび２７Ｂは、標的ｃＤＮＡから開始（Ｎ１）を調製するためのプロセス、およびその後の核酸分子（Ａ１）の増幅を示す。この標的ｃＤＮＡは、エキソンＡ、およびエキソンＡの直ぐ下流にあるエキソンＢ（図２７Ａ）、ならびにエキソンＡとエキソンＢとの間の配列（図２７Ｂ）を含む。 図２８は、２つのプライマーを使用して標的ｃＤＮＡから開始核酸分子（Ｎ１）を調製するための主要な工程、およびその後の核酸分子（Ａ１）の増幅の概略図を示す。この標的ｃＤＮＡは、エキソンＡおよびエキソンＢを含む。第一のプライマーは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含み、エキソンＡのアンチセンス鎖の一部にアニールする。第二のプライマーは、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み、エキソンＢのセンス鎖の一部にアニールする。 図２９は、２つのプライマーを使用して標的ｃＤＮＡから開始核酸分子（Ｎ１ａおよびＮ１ｂ）を調製するための主要な工程、およびその後の核酸分子（Ａ１ａおよびＡ１ｂ）の増幅の概略図を示す。この標的ｃＤＮＡは、エキソンＡおよびエキソンＢを含む。両方のプライマーは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含む。第一のプライマーは、エキソンＡのアンチセンス鎖の一部にアニールし、一方、第二のプライマーは、エキソンＢのセンス鎖の一部にアニールする。 図３０は、２つのプライマーを使用して標的ｃＤＮＡから開始核酸分子（Ｎ１ａおよびＮ１ｂ）を調製するための主要な工程、およびその後の核酸分子（Ａ１ａおよびＡ１ｂ）の増幅の概略図を示す。この標的ｃＤＮＡは、エキソンＡおよびエキソンＢを含む。両方のプライマーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含む。第一のプライマーは、エキソンＡのアンチセンス鎖の一部にアニールし、一方、第二のプライマーは、エキソンＢのセンス鎖の一部にアニールする。

Claims (292)

  1. 核酸分子（Ａ２）を増幅するための方法であって、該方法は、以下の（Ａ）〜（Ｄ）：
    （Ａ）以下の（ｉ）および（ｉｉ）：
    （ｉ）第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列および
    （ｉｉ）該第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列；
    のうち少なくとも１つを含む少なくとも部分的に二本鎖となっている核酸分子（Ｎ１）を提供する工程；
    （Ｂ）第１のＮＡＲＳを認識する第１のニック形成剤（ＮＡ）、ＤＮＡポリメラーゼおよび１以上のデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で第１の一本鎖核酸分子（Ａ１）を増幅する工程であって、ここで、該増幅する工程は、ポリメラーゼのためのテンプレートとして該Ｎ１の一部分を使用する、工程；
    （Ｃ）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
    （ｉ）テンプレートヌクレオチド配列、
    （ｉｉ）第２のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列および
    （ｉｉｉ）Ａ１に対して少なくとも実質的に相補的な配列
    を５’から３’の方向で含む第２の一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程；ならびに
    （Ｄ）Ｔ２、Ａｌ、第１のＮＡ、第２のＮＡＲＳを認識する第２のＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で第３の一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する工程であって、ここで、Ａ２は、Ｔ２のテンプレートヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的である、工程
    を包含する、方法。
  2. 前記第１のＮＡＲＳが前記第２のＮＡＲＳと同一である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第１および第２の両方のＮＡが、ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である、請求項１に記載の方法。
  4. 工程（Ａ）〜（Ｄ）が単一の容器の中で実施される、請求項１に記載の方法。
  5. 前記第１のＮＡＲＳは、少なくとも１つの誤対合した塩基対を含む、請求項１に記載の方法。
  6. Ｎ１が前記第１のＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含む、請求項１に記載の方法。
  7. Ｎ１が前記第１のＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列を含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記第１および第２の両方のＮＡが制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）である、請求項７に記載の方法。
  9. Ｎ１が、トリガーヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）と前記第１のＮＥＲＳのセンス鎖またはアンチセンス鎖の配列を含む一本鎖核酸（Ｔ１）とをアニーリングすることによって提供される、請求項１に記載の方法。
  10. Ａ２がＡ１と少なくとも実質的に同一である、請求項１に記載の方法。
  11. Ａ２がＡ１に正確に同一である、請求項１に記載の方法。
  12. Ａ１が８〜２４のヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
  13. Ａ１が１２〜１７のヌクレオチド長である、請求項１２に記載の方法。
  14. Ａ２が８〜２４のヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
  15. Ａ２が１２〜１７のヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
  16. Ｔ２の開始番号がＴ１の開始番号よりも大きい、請求項１に記載の方法。
  17. Ｎ１はゲノムＤＮＡ由来である、請求項１に記載の方法。
  18. Ｎ１はゲノムＤＮＡの一部分である、請求項１に記載の方法。
  19. 請求項１に記載の方法であって、ここで、Ｎ１は、以下の（ａ）〜（ｃ）：
    （ａ）前記第１のＮＡＲＳのセンス鎖の配列、該第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列または両方；および
    （ｂ）その鎖自体またはそれらの伸長産物のいずれかが第１のＮＡによって生じるニック形成部位（ＮＳ）を含む鎖における５’オーバーハング、あるいはその鎖自体もそれらの伸長産物もＮＳを含まない鎖における３’オーバーハングのいずれか（ここで、オーバーハングの各々は、標的配列に対して少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含む）；
    （ｃ）その鎖もそれらの伸長産物もＮＳを含まない鎖における配列であって、ＮＳに対応する位置に対して、５’側に位置しており、かつ、Ａ１を増幅するためのテンプレートとして機能する、配列
    を含む部分的に二本鎖となっている核酸分子である、方法。
  20. 前記標的核酸が、変性した二本鎖核酸のうち一方の鎖である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記二本鎖核酸がゲノム核酸またはｃＤＮＡである、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記標的核酸がＲＮＡ分子である、請求項１９に記載の方法。
  23. 前記標的核酸が、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物から選択される供給源から得られる核酸に由来する、請求項１９に記載の方法。
  24. 核酸分子（Ａ２）を増幅するための方法であって、該方法は、以下の（Ａ）〜（Ｂ）：
    （Ａ）以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
    （ｉ）第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖の配列を含む少なくとも部分的に二本鎖となっている核酸分子（Ｎ１）；
    （ｉｉ）以下の（ａ）〜（ｃ）：
    （ａ）テンプレートヌクレオチド配列、
    （ｂ）第２のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列および
    （ｃ）Ｎ１中のＮＡＲＳのアンチセンス鎖に対して５’側に位置するＮ１の一部分に少なくとも実質的に同一である配列
    を、５’から３’の方向で含む、一本鎖核酸分子（Ｔ２）；
    （ｉｉｉ） 第１のＮＡＲＳを認識する第１のニック形成剤（ＮＡ）；第２のＮＡＲＳを認識する第２のＮＡ；
    ａ ＤＮＡポリメラーゼ；および１以上のデオキシヌクレオシド三リン酸
    を含む混合物を提供する工程；ならびに
    （Ｂ）Ｎ１の一部分をテンプレートとして使用して一本鎖核酸分子（Ａ１）を増幅する条件で前記混合物を維持して、そして、Ｔ２のテンプレートヌクレオチド配列をテンプレートして使用して別の一本鎖核酸分子（Ａ２）をさらに増幅する工程
    を包含する、方法。
  25. 前記第１のＮＡＲＳが第２のＮＡＲＳと同一である、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記第１のＮＡＲＳが少なくとも１つの誤対合した塩基対を含む、請求項２４に記載の方法。
  27. 前記第１および第２の両方のＮＡがａニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である、請求項２４に記載の方法。
  28. 前記ＮＡが、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）である、請求項２４に記載の方法。
  29. ＴＩがＴ２に実質的に同一である、請求項２４に記載の方法。
  30. Ｔ１が、Ｔ２と正確に同一である、請求項２４に記載の方法。
  31. Ｔ１が、Ｔ２に実質的同一でも正確に同一でもない、請求項２４に記載の方法。
  32. Ａｌが、Ａ２に実質的に同一である、請求項２４に記載の方法。
  33. Ａ１が、Ａ２と正確に同一である、請求項２４に記載の方法。
  34. Ａ１が、Ａ２に対して、実質的に同一でもなく、または正確にも同一ではない、請求項２４に記載の方法。
  35. 配列（Ａ）（ｉｉ）（ｃ）が、前記第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖に対して５’側に位置するＮ１の一部分と正確に同一である、請求項２４に記載の方法。
  36. Ｔ２の３’末端がリン酸基に連結している、請求項２４に記載の方法。
  37. 請求項２４に記載の方法であって、Ｎ１が、一本鎖標的核酸（Ｔ１）に対するトリガーヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）のアニーリングによって提供され、該一本鎖標的核酸（Ｔ１）は、５’から３’の方向で、（Ａ）第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列；および（Ｂ）少なくとも一部分のトリガーＯＤＮＰに少なくとも実質的に相補的である配列を含む、方法。
  38. Ａ１が前記トリガーＯＤＮＰに実質的に同一である、請求項３７に記載の方法。
  39. Ａ１が前記トリガーＯＤＮＰと正確に同一である、請求項３７に記載の方法。
  40. Ａ２が前記トリガーＯＤＮＰと実質的に同一である、請求項３７に記載の方法。
  41. Ａ２が、前記トリガーＯＤＮＰと正確に同一である、請求項３７に記載の方法。
  42. Ｔ１の配列（Ｂ）が少なくとも一部分のトリガーＯＤＮＰに正確に相補的である、請求項３７に記載の方法。
  43. Ｔ１の３’末端がリン酸基に連結している、請求項３７に記載の方法。
  44. 前記トリガーＯＤＮＰが、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物から選択される供給源より得られる核酸に由来する、請求項３７に記載の方法。
  45. 少なくとも１つのデオキシヌクレオシド三リン酸が標識されている、請求項２４に記載の方法。
  46. 請求項４５に記載の方法であって、前記標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸が、放射性標識、酵素、蛍光色素、ジゴキシゲニンおよびビオチンからなる群より選択される標識に連結されるデオキシヌクレオシド三リン酸である、方法。
  47. Ａ２の検出をさらに包含する、請求項２４に記載の方法。
  48. 請求項４７に記載の方法であって、前記検出が、ルミネセンス分光法またはルミネセンス分光測定法、蛍光分光法または蛍光分光測定法、質量分析法、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光法および電気泳動からなる群より選択される技術によって少なくとも部分的に実施される、方法。
  49. 前記検出が蛍光インターカレート剤の存在下で実施される、請求項４７に記載の方法。
  50. 請求項２４に記載の方法であって、前記混合物が、さらに、（ｉｖ）３’から５’の方向で、以下の（ａ）〜（ｃ）：
    （ａ）Ｔ２のテンプレートヌクレオチド配列の一部分に少なくとも実質的に同一である配列；
    （ｂ）第３のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列；および
    （ｃ）第２のテンプレートヌクレオチド配列を含む一本鎖核酸分子（Ｔ３）をさらに含み；そして、
    （Ｃ）Ｔ３の第２のテンプレートヌクレオチド配列の少なくとも一部分に対して相補的な一本鎖核酸分子（Ａ３）を増幅する条件下で該混合物を維持する工程をさらに包含する、方法。
  51. 第１、第２および第３のＮＡＲＳが互いに同一である、請求項５０に記載の方法。
  52. Ｔ３の配列（ａ）が、Ｔ２の少なくとも一部分のテンプレートヌクレオチド配列に正確に同一である、請求項５０に記載の方法。
  53. 核酸分子（Ａ２）を増幅するための方法であって、該方法は、以下の（Ａ）〜（Ｂ）：
    （Ａ）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
    （ｉ）第１のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖の配列を含む少なくとも部分的に二本鎖となっている核酸分子（Ｎ1）；
    （ｉｉ）以下の（ａ）〜（ｃ）：
    （ａ）Ｎ１におけるＮＥＲＳのセンス鎖の３’側に位置するＮ１の一部分に対して少なくとも実質的に相補的な配列
    （ｂ）第２のＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列および
    （ｃ）テンプレートヌクレオチド配列；
    を、３’から５’の方向で含む、一本鎖核酸分子（Ｔ２）
    （ｉｉｉ）第１のＮＥＲＳを認識する第１のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）；第２のＮＥＲＳを認識する第２のＮＥ；ＤＮＡポリメラーゼ；および１以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；
    を含む混合物を形成する工程；ならびに
    （Ｂ）テンプレートしてＴ２のテンプレートヌクレオチド配列を使用して一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する条件下で、該混合物を維持する工程
    を包含する、方法。
  54. 前記第１のＮＥＲＳが前記第２のＮＥＲＳと同一である、請求項８２に記載の方法。
  55. 配列（ｉｉ）（ａ）が、前記ＮＥＲＳのセンス鎖に対して３’側に位置するＮ１の一部分に正確に相補的である、請求項８２に記載に方法。
  56. Ｔ２の３’末端がリン酸基に連結している、請求項８２に記載の方法。
  57. 請求項８２に記載の方法であって、ここで、Ｎ１が、一本鎖標的核酸（ＴＩ）に対してトリガーヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）をアニーリングすることによって提供され、該一本鎖標的核酸（ＴＩ）が、（Ａ） 第１のＮＥＲＳのセンス鎖の配列；および（Ｂ）少なくとも一部分のトリガーＯＤＮＰに少なくとも実質的に相補的である配列を５’から３’の方向で含む、方法。
  58. 配列（Ａ）が、少なくとも一部分のトリガーＯＤＮＰに相補的である、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記トリガーＯＤＮＰが、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物から選択される供給源より得られる核酸に由来する、請求項５７に記載の方法。
  60. 少なくとも１つのデオキシヌクレオシド三リン酸が標識されている、請求項５３に記載の方法。
  61. 請求項６０に記載の方法であって、前記標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸が、放射性標識、酵素、蛍光色素、ジゴキシゲニンおよびビオチンからなる群より選択される標識に連結されるデオキシヌクレオシド三リン酸である、方法。
  62. Ａ２の検出をさらに包含する、請求項５３に記載の方法。
  63. 請求項６２に記載の方法であって、前記検出が、ルミネセンス分光法またはルミネセンス分光測定法、蛍光分光法または蛍光分光測定法、質量分析法、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光法および電気泳動からなる群より選択される技術によって少なくとも部分的に実施される、方法。
  64. 前記検出は、二本鎖核酸分子に特異的に結合する蛍光標識化合物の存在下で実施される、請求項６２に記載の方法。
  65. 請求項５３に記載の方法であって、前記混合物が、（ｉｖ）一本鎖核酸分子（Ｔ３）をさらに含み、該一本鎖核酸分子（Ｔ３）は、以下の（ａ）〜（ｃ）：
    （ａ）Ｔ２の一部分のテンプレートヌクレオチド配列に少なくとも実質的に同一である配列；
    （ｂ）前記ＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列；および
    （ｃ）第２のテンプレートヌクレオチド配列；
    を３’から５の方向で含み、そして、該方法は、以下：
    （Ｃ）Ｔ３の第２のテンプレートヌクレオチド配列少なくとも一部分に相補的な一本鎖核酸分子（Ａ３）を増幅する条件下において、該混合物を維持する工程
    をさらに包含する、方法。
  66. Ｔ３の配列（ａ）は、Ｔ２のテンプレートヌクレオチド配列の少なくとも一部分に正確に同一である、請求項６５に記載の方法。
  67. 第１、第２および第３のＮＥＲＳは互いに同一である、請求項６５に記載の方法。
  68. 核酸分子（Ａ２）を増幅するための方法であって、該方法は、以下の（ａ）〜（ｆ）：
    （ａ）Ａ２にハイブリダイズし得るテンプレート核酸分子（Ｔ２）を提供する工程；
    （ｂ）Ａ２がＴ２にハイブリダイズし得る位置の３’側の位置でＴ２に対してハイブリダイスし得るプライマー核酸分子（Ａ１）を提供する工程；
    （ｃ）Ｔ２に対してＡ１をハイブリダイズする工程；
    （ｄ）Ａ１を伸長して、Ａ１伸長産物を提供して、ここで、該Ａ１伸長産物は、Ｔ２にハイブリダイズされるときに、第２のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）およびＡ２のヌクレオチド配列を含むハイブリッドＨ２を形成する、工程；
    （ｅ）第２のＮＡＲＳを認識する第２のニック形成剤（ＮＡ）用いてＨ２にニック形成し、それによってＡ２を形成する工程；
    （ｆ）工程（ｄ）および（ｅ）を反復してそれによってＡ２を増幅する工程であって、ここで、該プライマー核酸分子Ａ１は、以下の（ｇ）〜（ｋ）を包含する方法によって、形成される工程：
    （ｇ）Ａ１にハイブリダイズし得るテンプレート核酸分子（Ｔ１）を提供する工程；
    （ｈ）Ａ１がＴ１にハイブリダイズし得る位置の３’側の位置でＴ１にハイブリダイズし得るトリガーオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）を提供する工程；
    （ｉ）Ｔ１にトリガーＯＤＮＰをハイブリダイズする工程；
    （ｊ）該トリガーＯＤＮＰを伸長して、トリガーＯＤＮＰ伸長産物を提供し、ここで、該トリガーＯＤＮＰ伸長産物が、Ｔ１に対してハイブリダイズしたときに、第１のＮＡＲＳおよびＡ１のヌクレオチド配列を含むハイブリッドのＨ１を形成する工程；および
    （ｋ）第１のＮＡＲＳを認識する第１ＮＡを用いてＨ１にニック形成して、それによって、Ａ１を形成する工程；
    を包含する、方法。
  69. 前記第１のＮＡＲＳが前記第２のＮＡＲＳと同一である、請求項６８に記載の方法。
  70. 工程（ａ）〜（ｊ）が単一の容器の中で実施される、請求項６８に記載に方法。
  71. 前記第１のＮＡＲＳが誤対合した塩基対を含む、請求項６８に記載の方法。
  72. 前記第１および第２の両方のＮＡがニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である、請求項６８に記載の方法。
  73. 第１および第２の両方のＮＡが制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）である、請求項６８に記載の方法。
  74. 核酸（Ａ２）を増幅する方法であって、該方法は、以下の（ａ）〜（ｊ）：
    （ａ）第１の二本鎖ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のうちの１つの鎖の配列を含み、
    かつトリガーオリゴヌクレオチドプライマー（トリガーＯＤＮＰ）に少なくとも実質的に相補的である、第１のテンプレート核酸（ＴＩ）を提供する工程；
    （ｂ）該トリガーＯＤＮＰをＴ１にハイブリダイズさせる工程；
    （ｃ）該トリガーＯＤＮＰを伸長して、ハイブリッド（Ｈ１）を形成する工程であって、該ハイブリッド（Ｈ１）は、Ｔ１にハイブリダイズしている伸長したトリガーＯＤＮＰを含み、ここで、Ｈ１は第１の二本鎖ＮＡＲＳを含む、工程；
    （ｄ）該ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）を用いて、ニック形成部位でＨ１にニック形成する工程であって、該ニック形成部位における５’末端を有するフラグメントは、Ａ１と称される、工程；
    （ｅ）Ａ１に少なくとも実質的に相補的な第２のテンプレート核酸（Ｔ２）を提供する工程；
    （ｆ）Ａ１をＴ２にハイブリダイズさせる工程；
    （ｇ）Ａ１を伸長してハイブリッド（Ｈ２）を形成し、該ハイブリッド（Ｈ２）は、Ｔ２にハイブリダイズした伸長したＡ１を含み、ここで、Ｈ２は、第２のＮＡＲＳを含む、工程；
    （ｈ）第２のＮＡＲＳを認識する第２のＮＡを用いてＨ２にニック形成し、ここで、該ニック形成部位における５’末端を有するフラグメントは、Ａ２と称される、工程；
    （ｉ）Ｈ２中の該ニック形成部位における該３’末端部を伸長して、Ｈ２を再形成する工程；および
    （ｊ）工程（ｈ）および（ｉ）を反復して、それによって、Ａ２を増幅する工程、
    を包含する、方法。
  75. 前記第１のＮＡＲＳが第２のＮＡＲＳと同一である、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記第１のＮＡＲＳが誤対合した塩基対を含む、請求項７４に記載の方法。
  77. 工程（ａ）〜（ｊ）が単一の容器の中で実施される、請求項７４に記載の方法。
  78. 前記第１および第２の両方のＮＡがニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である、請求項７４に記載の方法。
  79. 第１および第２の両方のＮＡが制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）である、請求項７４に記載の方法。
  80. Ａ１が、８〜２４のヌクレオチド長である、請求項７４に記載の方法。
  81. Ａ２が、８〜２４のヌクレオチド長である、請求項７４に記載の方法。
  82. タンデム核酸増幅システムであって、以下（ａ）〜（ｂ）：
    （ａ）第１の一本鎖核酸（Ａｌ）を増幅するための第１のプライマー伸長手段；および
    （ｂ）第２の一本鎖核酸（Ａ２）を増幅するための第２のプライマー伸長手段
    を備え；ここで、
    Ａ１が、Ａ２を増幅するための第２のプライマー伸長手段のためのプライマーであり、そして、該第１および第２の両方のプライマー伸長手段が単一の反応容器に含まれ、かつニック形成剤（ＮＡ）の存在が必要とされる、
    システム。
  83. 前記第１のプライマー伸長手段のためのＮＡが、第２のプライマー伸長手段のためのＮＡと同一である、請求項８２に記載のタンデム核酸増幅システム。
  84. 請求項８２に記載のタンデム核酸増幅システムであって、ここで、
    （ａ）Ａ１を増幅するための第１の手段が、第１のオリゴヌクレオチドプライマー（トリガーＯＤＮＰ）、該トリガーＯＤＮＰに少なくとも実質的に相補的である第１のテンプレート核酸（Ｔ１）、第１のニック形成剤（ＮＡ）、第１のＤＮＡポリメラーゼを含み、ここで、Ｔ１をテンプレートとして使用して該トリガーＯＤＮＰの伸長することによって、第１のＮＡによって認識可能である第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）を生成し；そして、
    （ｂ）Ａ２を増幅するための第２の手段が、該核酸（Ａ１）、Ａ１に少なくとも実質的に相補的な第２のテンプレート核酸（Ｔ２）、第２のＮＡ、該ＤＮＡポリメラーゼを含み、ここで、Ｔ２をテンプレートして使用してＡ１を伸長することによって、第２のＮＡにより認識可能である第２のＮＡＲＳを生成する、
    システム。
  85. 第１のＮＡが第２のＮＡと同一である、請求項８４に記載の核酸増幅システム。
  86. 前記第１のポリメラーゼが前記第２のポリメラーゼと同一である、請求項８４または８５に記載の核酸増幅システム。
  87. 第１のＮＡＲＳが誤対合した塩基対を含む、請求項８４に記載の核酸増幅システム。
  88. 前記第１のＮＡおよび第２のＮＡの両方がニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である、請求項８４に記載の核酸増幅システム。
  89. 前記第１および第２の両方のＮＡが制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）である、請求項８４に記載の核酸増幅システム。
  90. Ｔ１が、Ｔ２と実質的同一である、請求項８４に記載の核酸増幅システム。
  91. Ｔ１が、Ｔ２と正確に同一である、請求項８４に記載の核酸増幅システム。
  92. Ａ１が、前記トリガーＯＤＮＰと実質的同一である、請求項８４に記載の核酸増幅システム。
  93. Ａ１が、前記トリガーＯＤＮＰと正確に同一である、請求項８４に記載の核酸増幅システム。
  94. Ａ２が前記トリガーＯＤＮＰと実質的に同一である、請求項８４に記載の核酸増幅システム。
  95. Ａ２が前記トリガーＯＤＮＰと正確に同一である、請求項８４に記載の核酸増幅システム。
  96. Ａ１がＡ２と実質的に同一でない、請求項９５に記載の核酸増幅システム。
  97. Ａ１が、前記トリガーＯＤＮＰと実質的同一である、請求項８４に記載の核酸増幅システム。
  98. Ａ１が、前記トリガーＯＤＮＰと正確に同一である、請求項８４に記載の核酸増幅システム。
  99. Ａ１が８〜２４ヌクレオチド長である、請求項８４に記載に核酸増幅システム。
  100. Ａ２が８〜２４ヌクレオチド長である、請求項８４に記載に核酸増幅システム。
  101. 核酸分子Ａ２を指数関数的に増幅するための方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）第１のＮＡＲＳを認識する第１のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＡ）および第１のＤＮＡポリメラーゼの存在下で、第１のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のうちの１つの鎖の配列を含む第１のテンプレート核酸（Ｔ１）をテンプレートとして使用して核酸分子（Ａｌ）を増幅する工程；および
    （ｂ）第２のＮＡおよび第２のＤＮＡポリメラーゼの存在下で、第２のＮＡＲＳのうちの１つの鎖の配列を含む第２のテンプレート核酸（Ｔ２）をテンプレートとして、そしてＡ１をプライマーとして使用して核酸分子（Ａｌ）を増幅する工程；
    を包含する、方法。
  102. 第１のＮＡＲＳが前記第２のＮＡＲＳと同一である、請求項１０１に記載の方法。
  103. 第１のＮＡＲＳが誤対合した塩基対を含む、請求項１０１に記載の方法。
  104. 前記第１のＤＮＡポリメラーゼが前記第２のＤＮＡポリメラーゼと同一である、請求項１０１または請求項１０２に記載の方法。
  105. 工程（ａ）および（ｂ）が単一の容器で実施される、請求項１０１に記載の方法。
  106. 前記ＮＡがニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である、請求項１０１に記載の方法。
  107. 前記ＮＡが、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）である、請求項１０６に記載の方法。
  108. 核酸分子を増幅するための方法であって、該方法は、以下の（Ａ）〜（Ｂ）：
    （Ａ）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
    （ｉ）配列（Ｓ１）を有する第１の一本鎖核酸分子；
    （ｉｉ）ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖の配列を有する第２の一本鎖核酸分子であって、ここで、Ｓ１に実質的に相補的な配列が、該ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列に対して３’側および５’側の両方で存在する、第２の一本鎖核酸分子；
    （ｉｉｉ）ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）；ＤＮＡポリメラーゼ；および１以上のデオキシヌクレオシド三リン酸
    を含む混合物を形成する工程；ならびに
    （Ｂ）一本鎖核酸分子（Ａ）（ｉｉ）をテンプレートとして使用して、１本鎖核酸分子を増幅する条件下で、該混合物を維持する工程
    を包含する、方法。
  109. 前記Ｓ１に少なくとも実質的に相補的な一本鎖核酸分子（Ａ）（ｉｉ）における配列が、Ｓ１に正確に相補的である、請求１０８に記載に方法。
  110. 前記増幅した核酸分子が、Ｓ１と正確に同一である配列を有している、請求項１０８に記載の方法。
  111. 前記ＮＥがＮ．ＢｓｔＮＢ ＩまたＮ．Ａｌｗ Ｉである、請求項３、２７、５３、７２、７８、８８、および１０６のいずれか１項に記載の方法。
  112. 第１および第２の両方のＮＥが、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉである、請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記増幅が、等温度条件下で実施される。請求項１、２４、５３、６８、７４および１０８のいずれか１項に記載の方法。
  114. 増幅反応の各々が５０℃〜７０℃で実施される、請求項１１３に記載の方法。
  115. 増幅反応の各々が６０℃で実施される、請求項１１３に記載の方法。
  116. 請求項１〜１０１に記載の方法であって、ここで、増幅反応の各々が、最高温度と最低温度との間の温度で実施され、ここで、最高温度が、最低温度から２０℃以内にある、方法。
  117. 最高温度が、最低温度から15℃以内にある、請求項１１６に記載の方法。
  118. 最高温度が、最低温度から１０℃以内にある、請求項１１６に記載の方法。
  119. 最高温度が、最低温度から５℃以内にある、請求項１１６に記載の方法。
  120. 前記ＤＮＡポリメラーゼが５’→３’エンドヌクレアーゼ欠損である、請求項１〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
  121. 請求項１２０に記載の方法であって、ここで、前記５’→３’エンドヌクレアーゼ欠損のＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２ ＤＮＡ ポリメラーゼ、ファージＰｈｉＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホモエンザイムからなる群より選択される、方法。
  122. 請求項１２０に記載の方法であって、ここで、前記５’→３’エンドヌクレアーゼ欠損のＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼまたはｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔポリメラーゼである、方法。
  123. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換活性を有する、請求項１、２４、５３、６８、７４、１０１、および１０８のいずれか１項に記載の方法。
  124. 増幅反応の各々が、鎖置換促進因子の存在下で実施される、請求項１〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
  125. 請求項１２４に記載の方法であって、前記鎖置換促進因子が、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、単純ヘルペスウイルスタンパク質ＩＣＰ８、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質、胎仔ウシ胸腺へリカーゼ、およびトレハロースからなる群より選択される、方法。
  126. 前記鎖置換促進因子が、トレハロースである、請求項１２５に記載の方法。
  127. 組成物であって、以下（ａ）〜（ｂ）：
    （ａ）１つの鎖が第１のニック形成認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖の配列を含む第１の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子；および
    （ｂ）第２の少なくとも部分的に二本鎖である核酸分子であって、該二本鎖である核酸分子のうちの１つの鎖は、以下の（ｉ）〜（ｉｉ）：
    （ｉ）第２のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列および
    （ｉｉ）該第１の核酸における第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列に対して５’側に位置付けられる配列と少なくとも実質的に同一である配列、
    を５’から３’の方向で含む、組成物。
  128. 前記第１のＮＡＲＳが、第１のニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能であり、そして第２のＮＡＲＳがａ第２のニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能である、請求項１２７に記載の組成物。
  129. 前記第１のＮＡＲＳが第１の制限エンドヌクレアーゼによって認識可能であり、そして第２のＮＡＲＳが、第２の制限エンドヌクレアーゼによって認識可能である、請求項１２７に記載の組成物。
  130. 前記第１のＮＡＲＳが前記第２のＮＡＲＳと同一である、請求項１２７に記載の組成物。
  131. 前記第１および第２の両方のＮＡＲＳが、１つのニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）によって認識可能である、請求項１３０に記載の組成物。
  132. 第１および第２の両方のＮＡＲＳが、１つの制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）によって認識可能である、請求項１３０に記載の組成物。
  133. 配列（ｂ）（ｉｉ）が、第１の核酸の第１のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列に対して５’側に位置付けられる配列と正確に同一である、請求項１２７に記載の組成物。
  134. 組成物であって、以下：
    （ａ）一方の鎖が第一のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列を含む、第一の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子；ならびに
    （ｂ）第二の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子であって、該第二の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子の一方の鎖が、以下：
    （ｉ）第二のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、および
    （ｉｉ）該第一の核酸における該第一のＮＡＲＳのセンス鎖の配列の３’側に位置する配列に少なくとも実質的に相補的である配列、
    を、５’から３’方向で含む、第二の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子
    を含む、組成物。
  135. 前記第一のＮＡＲＳが、第一のニック形成エンドヌクレアーゼにより認識され、そして前記第二のＮＡＲＳが、第二のニック形成エンドヌクレアーゼにより認識される、請求項１３４に記載の組成物。
  136. 前記第一のＮＡＲＳが、第一の制限エンドヌクレアーゼにより認識され、そして前記第二のＮＡＲＳが、第二の制限エンドヌクレアーゼにより認識される、請求項１３４に記載の組成物。
  137. 前記第一のＮＡＲＳが、前記第二のＮＡＲＳと同一である、請求項１３４に記載の組成物。
  138. 前記第一のＮＡＲＳおよび第二のＮＡＲＳが、１つのニック形成エンドヌクレアーゼにより認識される、請求項１３７に記載の組成物。
  139. 前記第一のＮＡＲＳおよび第二のＮＡＲＳが、１つの制限エンドヌクレアーゼにより認識される、請求項１３７に記載の組成物。
  140. 配列（ｂ）（ｉｉ）が、前記第一の核酸中の前記ＮＡＲＳのセンス鎖の配列の３’側に位置する配列に正確に相補的である、請求項１３４に記載の組成物。
  141. 請求項１２７または請求項１３４に記載の組成物であって、該組成物は、第一のＮＡおよび第二のＮＡをさらに含み、該第一のＮＡは、前記第一のＮＡＲＳを認識し、そして該第二のＮＡは、前記第二のＮＡＲＳを認識する、組成物。
  142. 前記第一のＮＡＲＳおよび前記第二のＮＡＲＳの両方を認識するニック形成剤をさらに含む、請求項１３０または請求項１３７に記載の組成物。
  143. 前記第一のＮＥＲＳおよび前記第二のＮＥＲＳの両方を認識するニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）をさらに含む、請求項１３１または請求項１３８に記載の組成物。
  144. 前記第一のＮＡＲＳおよび前記第二のＮＡＲＳの両方を認識する制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）をさらに含む、請求項１３２または請求項１３９に記載の組成物。
  145. 前記ＮＥがＮ．ＢｓｔＮＢ Ｉである、請求項１４３に記載の組成物。
  146. ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１２７または請求項１３４に記載の組成物。
  147. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損である、請求項１４６に記載の組成物。
  148. 請求項１４６に記載の組成物であって、前記ＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−ＤｅｅｐＶｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＰｈｉＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＲＰＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホモエンザイムからなる群より選択される、組成物。
  149. 前記５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼまたはｅｘｏ−ＤｅｅｐＶｅｎｔポリメラーゼである、請求項１４６に記載の組成物。
  150. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換活性を有する、請求項１４６に記載の組成物。
  151. 鎖置換促進因子をさらに含む、請求項１２７または請求項１３４に記載の組成物。
  152. 請求項１５１に記載の組成物であって、前記鎖置換促進因子が、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、単純疱疹ウイルスタンパク質ＩＣＰ８、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質、ウシ胸腺ヘリカーゼおよびトレハロースからなる群より選択される、組成物。
  153. 前記鎖置換促進因子が、トレハロースである、請求項１５２に記載の組成物。
  154. ＤＮＡポリメラーゼおよび鎖置換促進因子をさらに含む、請求項１４３に記載の組成物。
  155. ＤＮＡポリメラーゼおよび鎖置換促進因子をさらに含む、請求項１４４に記載の組成物。
  156. 請求項１２７または請求項１５４に記載の組成物であって、該組成物は、標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸、標識されたオリゴヌクレオチド、または蛍光インターカレート剤をさらに含み、該標識されたオリゴヌクレオチドは、Ｔ２中の前記第二のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の５’側に位置する配列に少なくとも実質的に相補的である、組成物。
  157. 請求項１３４または請求項１５５に記載の組成物であって、該組成物は、標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸、標識されたオリゴヌクレオチド、または蛍光インターカレート剤をさらに含み、該標識されたオリゴヌクレオチドは、Ｔ２中の前記第二のＮＥＲＳのアンチセンス鎖の５’側に位置する配列に少なくとも実質的に相補的である、組成物。
  158. 単離された一本鎖核酸分子であって、３’から５’方向で、実質的に以下：
    （ｉ）６〜１００ヌクレオチド長である配列；
    （ｉｉ）ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖の配列；および
    （ｉｉｉ）多くても１００ヌクレオチド長である配列、
    からなる、単離された一本鎖核酸分子。
  159. 前記ＮＡＲＳがニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）により認識される、請求項１５８に記載の単離された一本鎖核酸分子。
  160. 前記ＮＡＲＳが制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）により認識される、請求項１５８に記載の単離された一本鎖核酸分子。
  161. 配列（ｉ）が８〜２４ヌクレオチド長である、請求項１５８に記載の単離された一本鎖核酸分子。
  162. 配列（ｉ）が１２〜１７ヌクレオチド長である、請求項１５８に記載の単離された一本鎖核酸分子。
  163. 前記単離された核酸分子が、多くても２００ヌクレオチド長である、請求項１５８に記載の単離された一本鎖核酸分子。
  164. 前記単離された核酸分子が、多くても１００ヌクレオチド長である、請求項１５８に記載の単離された一本鎖核酸分子。
  165. 前記単離された核酸分子が、多くても５０ヌクレオチド長である、請求項１５８に記載の単離された一本鎖核酸分子。
  166. 前記単離された核酸分子が、多くても３０ヌクレオチド長である、請求項１５８に記載の単離された一本鎖核酸分子。
  167. 請求項１５８に記載の単離された一本鎖核酸分子であって、ここで、該単離された核酸分子の５’末端の配列（ｉｉｉ）の一部が、配列（ｉ）の一部に少なくとも実質的に同一であり、該配列（ｉ）の一部が、少なくとも６ヌクレオチド長である、単離された一本鎖核酸分子。
  168. 請求項１５８に記載の単離された一本鎖核酸分子であって、ここで、該単離された核酸分子の５’末端の配列（ｉｉｉ）の一部が、配列（ｉ）の一部に正確に同一であり、該配列（ｉ）の一部が、少なくとも６ヌクレオチド長である、単離された一本鎖核酸分子。
  169. 前記単離された一本鎖核酸分子が基材に固定化されている、請求項１５８および請求項１６７に記載の単離された一本鎖核酸分子。
  170. 前記単離された一本鎖核酸が前記基材に共有結合で固定化されている、請求項１６９に記載の単離された一本鎖核酸分子。
  171. 前記単離された一本鎖核酸が前記基材に非共有結合で固定化されている、請求項１６９に記載の単離された一本鎖核酸分子。
  172. 前記基材が、ケイ素、ガラス、紙、セラミック、金属、メタロイド、およびプラスチックからなる群より選択される物質を含む、請求項１６９に記載の単離された一本鎖核酸分子。
  173. 前記単離された一本鎖核酸が前記基材にリンカーを介して固定化されている、請求項１６９に記載の単離された一本鎖核酸分子。
  174. 請求項１５８に記載の単離された一本鎖核酸分子およびオリゴヌクレチドプライマー（トリガーＯＤＮＰ）を含む、組成物であって、該オリゴヌクレオチドプライマーが配列（ｉ）に少なくとも実質的に相補的である、組成物。
  175. 前記トリガーＯＤＮＰが、配列（ｉ）に正確に相補的である、請求項１７４に記載の組成物。
  176. 前記ＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）をさらに含む、請求項１７４に記載の組成物。
  177. 前記ＮＡが、ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である、請求項１７６に記載の組成物。
  178. 前記ＮＥが、Ｎ．ＢｓｔＮＢ ＩまたはＮ．ＡｌｗＩである、請求項１７７に記載の組成物。
  179. 前記ＮＥが、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉである、請求項１７８に記載の組成物。
  180. ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１７４または請求項１７７に記載の組成物。
  181. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損である、請求項１８０に記載の組成物。
  182. 請求項１８１に記載の組成物であって、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−ＤｅｅｐＶｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＰｈｉＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＲＰＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホモエンザイムからなる群より選択される、組成物。
  183. 前記５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼまたはｅｘｏ−ＤｅｅｐＶｅｎｔポリメラーゼである、請求項１８２に記載の組成物。
  184. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換活性を有する、請求項１８０に記載の組成物。
  185. 鎖置換促進因子をさらに含む、請求項１７４、１７６および１８０のいずれか一項に記載の組成物。
  186. 請求項１８５に記載の組成物であって、前記鎖置換促進因子が、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、単純疱疹ウイルスタンパク質ＩＣＰ８、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質、ウシ胸腺ヘリカーゼおよびトレハロースからなる群より選択される、組成物。
  187. 前記鎖置換促進因子が、トレハロースである、請求項１８５に記載の組成物。
  188. アレイであって、該アレイは、以下：
    （ａ）複数の別項の領域を有する基材；および
    （ｂ）該別個の領域に固定化された複数の一本鎖核酸、
    を含み、ここで、該複数のうち１つの一本鎖核酸が、請求項１５８または請求項１５８０の単離された一本鎖核酸である、アレイ。
  189. 前記別個の領域のいずれか１つにおける前記一本鎖核酸分子が、均質であるが、別の別個の領域における一本鎖核酸分子と異なる、請求項１８８に記載のアレイ。
  190. 前記別個の領域のうち少なくとも１つにおける前記一本鎖核酸分子が、均質である、請求項１８８に記載のアレイ。
  191. 前記複数の単離された一本鎖核酸が基材に共有結合で固定化されている、請求項１８８に記載のアレイ。
  192. 前記複数の単離された一本鎖核酸が前記基材に非共有結合で固定化されている、請求項１８８に記載のアレイ。
  193. 前記基材が、ケイ素、ガラス、紙、セラミック、金属、メタロイド、およびプラスチックからなる群より選択される物質から作製される、請求項１８８に記載のアレイ。
  194. 組成物であって、該組成物は、以下：
    （ａ）第一の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子；および
    （ｂ）第二の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子
    を含み、
    該第一の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子のうち一方の鎖は、３’から５’の方向で、以下：
    （ｉ）少なくとも８ヌクレオチド長の第一の配列（Ｓ１’）、
    （ｉｉ）第一のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、および
    （ｉｉｉ）少なくとも８ヌクレヌクレオチド長であり、Ｓ１’と実質的に同一ではない第二の配列（Ｓ２’）、
    を含み、
    該第二の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子はのうち一方の鎖は、３’から５’の方向で、以下：
    （ｉ）Ｓ２’に少なくとも実質的に同一である配列、
    （ｉｉ）第二のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、および
    （ｉｉｉ）Ｓ１’に少なくとも実質的に同一である配列、
    を含む、組成物。
  195. 前記第一のＮＡＲＳが、前記第二のＮＡＲＳと同一である、請求項１９４に記載の組成物。
  196. 前記第一のＮＡＲＳおよび第二のＮＡＲＳの両方が、１つのニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）により認識される、請求項１９４に記載の組成物。
  197. 前記第一のＮＡＲＳおよび第二のＮＡＲＳの両方が、１つの制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）により認識される、請求項１９４に記載の組成物。
  198. 配列（ｂ）（ｉ）がＳ２’と正確に同一である、請求項１９４に記載の組成物。
  199. 配列（ｂ）（ｉｉｉ）がＳ１’と正確に同一である、請求項１９４に記載の組成物。
  200. ニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖の、少なくとも２つの配列を含む、単離された一本鎖核酸分子。
  201. 前記核酸分子が、多くても１００ヌクレオチド長である、請求項２００に記載の単離された一本鎖核酸分子。
  202. 前記少なくとも２つの配列の間の最も短い距離が、５０ヌクレオチド以下である、請求項２００に記載の単離された一本鎖核酸分子。
  203. 前記少なくとも２つの配列の間の最も短い距離が、２５ヌクレオチド以下である、請求項２００に記載の単離された一本鎖核酸分子。
  204. サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
    （Ａ）以下を含む混合物を形成する工程：
    （ｉ）該サンプルの核酸分子
    （ｉｉ）第一の一本鎖核酸分子（Ｔ１）であって、該第一の一本鎖核酸分子は、３’から５’の方向で、以下：
    （ａ）該標的核酸に少なくとも実質的に相補的である第一の配列、
    （ｂ）第一のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖の配列、および
    （ｃ）第二の配列
    を含む、第一の一本鎖核酸分子、
    （ｉｉｉ）第二の一本鎖核酸分子（Ｔ２）であって、該第二の一本鎖核酸分子は、３’から５’の方向で、以下：
    （ａ）該Ｔ１の第二の配列と少なくとも実質的に同一である第一の配列、
    （ｂ）第二のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、および
    （ｃ）第二の配列
    を含む、第二の一本鎖核酸分子；ならびに
    （ｉｖ）該第一のＮＡＲＳを認識する第一のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＡ）、該第二のＮＡＲＳを認識する第二のＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；
    （Ｂ）該標的核酸が該サンプル中に存在する場合、テンプレートとしてＴ２の第二の配列を用いて、一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する条件で該混合物を維持する工程；ならびに
    （Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
    を包含する、方法。
  205. 前記第一のＮＡＲＳおよび前記第二のＮＡＲＳが、同一であり、そして１つのニック形成エンドヌクレアーゼにより認識される、請求項２０４に記載の方法。
  206. サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
    （Ａ）以下を含む混合物を形成する工程：
    （ｉ）該サンプルの核酸分子、
    （ｉｉ）第一の一本鎖核酸分子（Ｔ１）であって、該第一の一本鎖核酸分子は、３’から５’の方向で、以下：
    （ａ）該標的核酸に少なくとも実質的に相補的である配列、および
    （ｂ）第一のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列、
    を含む、第一の一本鎖核酸分子、
    （ｉｉｉ）第二の一本鎖核酸分子（Ｔ２）であって、該第二の一本鎖核酸分子は、３’から５’の方向で、以下：
    （ａ）該第一のＮＥＲＳのセンス鎖の配列の３’側に位置する該Ｔ１の配列と少なくとも実質的に相補的である配列、および
    （ｂ）第二のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、
    を含む、第二の一本鎖核酸分子；ならびに
    （ｉｖ）該第一のＮＡＲＳを認識する第一のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＡ）、該第二のＮＡＲＳを認識する第二のＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；
    （Ｂ）該標的核酸が該サンプル中に存在する場合、テンプレートとしてＴ２を用いて、一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する条件で該混合物を維持する工程；ならびに
    （Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
    を包含する、方法。
  207. 前記第一のＮＡＲＳと前記第二のＮＡＲＳとが同一である、請求項２０６に記載の方法。
  208. サンプル中の第一のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）を含む標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
    （Ａ）以下を含む混合物を形成する工程：
    （ｉ）該サンプルの核酸分子
    （ｉｉ）一本鎖核酸分子（Ｔ２）であって、該一本鎖核酸分子は、３’から５’の方向で、以下：
    （ａ）該第一のＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列の５’側に位置する該標的核酸の一部に少なくとも実質的に同一である配列、および
    （ｂ）第二のＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列、
    を含む、一本鎖核酸分子、ならびに
    （ｉｉｉ）該第一のＮＥＲＳを認識する第一のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）、該第二のＮＥＲＳを認識する第二のＮＥ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；
    （Ｂ）該標的核酸が該サンプル中に存在する場合、テンプレートとしてＴ２を用いて、一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する条件で該混合物を維持する工程；ならびに
    （Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
    を包含する、方法。
  209. 前記第一のＮＥＲＳが前記第二のＮＥＲＳと同一である、請求項２０８に記載の方法。
  210. サンプル中の第一のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）を含む標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
    （Ａ）以下を含む混合物を形成する工程：
    （ｉ）該サンプルの核酸分子
    （ｉｉ）第一の一本鎖核酸分子（Ｔ１）であって、該第一の一本鎖核酸分子は、該標的核酸の一方の鎖に実質的に同一であり、そして該第一のＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列を含む、第一の一本鎖核酸分子、
    （ｉｉｉ）第二の一本鎖核酸分子（Ｔ２）であって、該第二の一本鎖核酸分子は、３’から５’の方向で、以下：
    （ａ）該第一のＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列の５’側に位置するＴ１の一部に少なくとも実質的に同一である配列、および
    （ｂ）第二のＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列、
    を含む、第二の一本鎖核酸分子、ならびに
    （ｉｖ）該第一のＮＥＲＳを認識する第一のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）、該第二のＮＥＲＳを認識する第二のＮＥ、ＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；
    （Ｂ）該標的核酸が該サンプル中に存在する場合、テンプレートとしてＴ２を用いて、一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する条件で該混合物を維持する工程；ならびに
    （Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
    を包含する、方法。
  211. 前記第一のＮＥＲＳが前記第二のＮＥＲＳと同一である、請求項２１０に記載の方法。
  212. Ａ２が、多くても２５ヌクレオチドを有する、請求項２１０に記載の方法。
  213. サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
    （Ａ）第一のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第二のＯＤＮＰ、および該サンプルの核酸分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
    （ｉ）該標的核酸が第一の鎖および第二の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
    該第一のＯＤＮＰは、第一の制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的核酸の第一の鎖の第一の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして
    該第二のＯＤＮＰは、該標的核酸の第二の鎖の第二の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ第二のＲＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、該第二の部分は、該標的核酸の第二の鎖の中の第一の部分の相補鎖の３’側に位置するか、
    または、
    （ｉｉ）該標的核酸が一本鎖核酸である場合、
    該第一のＯＤＮＰは、第一のＲＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的核酸の第一の部分と少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
    該第二のＯＤＮＰは、該標的核酸の第二の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ第二のＲＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、該第二の部分は、該標的核酸の中の第一の部分の相補鎖の５’側に位置する、工程；
    （Ｂ）該混合物を、以下の条件：該標的核酸が該サンプル中に存在する場合、
    （ｉ）該第一のＯＤＮＰおよび該第二のＯＤＮＰを伸長して、該第一のＲＥＲＳおよび該第二のＲＥＲＳの両方を含む伸長産物を産生し；
    （ｉｉ）該第一のＲＥＲＳおよび該第二のＲＥＲＳを認識する１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）の存在下で、テンプレートとして工程（Ｂ）（ｉ）の伸長産物の一方の鎖を用いて第一の一本鎖核酸フラグメント（Ａ１）を増幅し；
    （ｉｉｉ）Ａ１にアニーリングし得る第二の一本鎖核酸分子（Ｔ２）の存在下で、テンプレートとしてＡ１を用いて、第三の一本鎖核酸フラグメント（Ａ２）を増幅する条件であって、ここで、Ａ１、Ａ２またはこれらの両方が、多くても２５ヌクレオチドを有し、そして、ここで、Ｔ２が、５’から３’の方向で、以下：
    （ａ）第三のＲＥＲＳのアンチセンス鎖の配列、および
    （ｂ）Ａ１に少なくとも実質的に相補的である配列
    を含む、条件、
    に供する工程；ならびに
    （Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
    を包含する、方法。
  214. 前記第一のＲＥＲＳが前記第二のＲＥＲＳと同一である、請求項２１３に記載の方法。
  215. サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
    （Ａ）第一のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第二のＯＤＮＰ、および該サンプルの核酸分子を含む混合物を形成する工程であって、ここで、
    （ｉ）該標的核酸が第一の鎖および第二の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
    該第一のＯＤＮＰは、第一のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的核酸の第一の鎖の第一の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして
    該第二のＯＤＮＰは、該標的核酸の第二の鎖の第二の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ第二のＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、該第二の部分は、該標的核酸の第二の鎖の中の第一の部分の相補鎖の３’側に位置するか、
    または、
    （ｉｉ）該標的核酸が一本鎖核酸である場合、
    該第一のＯＤＮＰは、第一のＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的核酸の第一の部分と少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
    該第二のＯＤＮＰは、該標的核酸の第二の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ第二のＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、該第二の部分は、該標的核酸の中の第一の部分の５’側に位置する、工程；
    （Ｂ）該標的核酸が該サンプル中に存在する場合、該混合物を、以下の条件：
    （ｉ）該第一のＯＤＮＰおよび該第二のＯＤＮＰを伸長して、該第一のＮＥＲＳおよび該第二のＮＥＲＳの両方を含む伸長産物を産生し；
    （ｉｉ）該第一のＮＥＲＳおよび該第二のＮＥＲＳを認識する１つ以上のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、テンプレートとして工程（Ｂ）（ｉ）の伸長産物の一方の鎖を用いて第一の一本鎖核酸フラグメント（Ａ１）を増幅し；
    （ｉｉｉ）Ａ１にアニーリングし得る第二の一本鎖核酸分子（Ｔ２）の存在下で、テンプレートとしてＡ１を用いて、第三の一本鎖核酸フラグメント（Ａ２）を増幅する条件であって、ここで、Ａ１、Ａ２またはこれらの両方が、多くても２５ヌクレオチドを有し、そして、ここで、Ｔ２が、５’から３’の方向で、以下：
    （ａ）第三ＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列、および
    （ｂ）Ａ１に少なくとも実質的に相補的である配列
    を含む、条件、
    に供する工程；ならびに
    （Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
    を包含する、方法。
  216. 前記第一のＮＥＲＳ、前記第二のＮＥＲＳ、および前記第三のＮＥＲＳが、同一である、請求項２１５に記載の方法。
  217. サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
    （Ａ）以下を含む混合物を形成する工程：
    （ｉ）該サンプルの核酸分子
    （ｉｉ）第一の一本鎖核酸プローブであって、該第一の一本鎖核酸プローブは、３’から５’の方向で、該標的核酸の５’部分に少なくとも実質的に相補的である配列、および第一のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のアンチセンス鎖の配列、を含む、第一の一本鎖核酸プローブ；
    （Ｂ）工程（Ａ）の混合物から、ハイブリダイズしていないプローブを除去する工程；
    （Ｃ）該第一のＮＡＲＳを認識する第一のニック形成剤（ＮＡ）の存在下で、増幅反応を実施する工程；
    （Ｄ）一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程であって、該一本鎖核酸分子は、５’から３’の方向で、以下：
    （ｉ）第二のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、および
    （ｉｉ）該第一のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列の５’側に位置する該第一の一本鎖核酸プローブの一部と少なくとも実質的に同一である配列、
    を含む工程；
    （Ｅ）該第二のＮＡＲＳを認識する第二のＮＡの存在下で、増幅反応を実施する工程；
    （Ｆ）工程（Ｅ）の増幅産物の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
    を包含する、方法。
  218. 前記第一のＮＡＲＳと前記第二のＮＡＲＳとが同一である、請求項２１７に記載の方法。
  219. サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
    （Ａ）以下を含む混合物を形成する工程：
    （ｉ）該サンプルの核酸分子
    （ｉｉ）一本鎖核酸プローブであって、該一本鎖核酸プローブは、５’から３’の方向で、該標的核酸の３’部分に少なくとも実質的に相補的である配列、および第一のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、を含む、一本鎖核酸プローブ；
    （Ｂ）工程（Ａ）の混合物から、ハイブリダイズしていないプローブを除去する工程；
    （Ｃ）該第一のＮＡＲＳを認識する第一のニック形成剤（ＮＡ）の存在下で、増幅反応を実施する工程；
    （Ｄ）一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程であって、該一本鎖核酸分子は、５’から３’の方向で、以下：
    （ｉ）第二のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、および
    （ｉｉ）該第一のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列の５’側に位置する該第一の一本鎖核酸プローブの一部に少なくとも実質的に相補的である配列、
    を含む工程；
    （Ｅ）該第二のＮＡＲＳを認識する第二のＮＡの存在下で、増幅反応を実施する工程；ならびに
    （Ｆ）工程（Ｅ）の増幅産物の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
    を包含する、方法。
  220. 前記第一のＮＡＲＳおよび第二のＮＡＲＳが同一である、請求項２１９に記載の方法。
  221. サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するための方法であって、以下の工程：
    （Ａ）以下を含む混合物を形成する工程であって：
    （ｉ）該サンプルの核酸分子；
    （ｉｉ）部分的に二本鎖の核酸プローブであって、該部分的に二本鎖の核酸プローブは、以下：
    （ａ）第一のＮＡＲＳのセンス鎖の配列、該第一のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、またはこれら両方；および
    （ｂ）該鎖中の５’オーバーハングであって、該鎖自体もしくはその伸長産物が、該第一のＮＡＲＳを認識する第一のニック形成剤（ＮＡ）によってニック形成され得るニック形成部位（ＮＳ）を含む、５’オーバーハング、または
    該鎖中の３’オーバーハングであって、該鎖もその伸長産物も、ＮＳを含まない、３’オーバーハング、
    を含み、ここで、各オーバーハングは、該標的核酸と少なくとも実質的に相補的である核酸配列を含む、工程；
    （Ｂ）工程（Ａ）の混合物から、ハイブリダイズしていないプローブを除去する工程；
    （Ｃ）該第一のＮＡＲＳを認識する第一のニック形成剤（ＮＡ）の存在下で増幅産物を形成する工程；
    （Ｄ）一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程であって、該一本鎖核酸分子（Ｔ２）は、５’から３’の方向で、以下：
    （ｉ）第二のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、および
    （ｉｉ）該第一のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列に対して５’側に位置する該核酸プローブの部分に対して少なくとも実質的に同一な配列、
    を含む、工程；
    （Ｅ）該第二のＮＡＲＳを認識する第二のＮＡの存在下で増幅反応を実施する工程；
    （Ｆ）工程（Ｅ）の増幅産物の存在または非存在を検出して、該サンプル中の該標的核酸の存在または非存在を決定する工程、
    を包含する、方法。
  222. 前記第一のＮＡＲＳおよび第二のＮＡＲＳが同一である、請求項２２１に記載の方法。
  223. 一本鎖標的核酸中の規定された位置において遺伝的バリエーションの存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
    （Ａ）該標的核酸の一部に対して正確に相補的な配列を含む一本鎖核酸（Ａ１）を提供する工程であって、該標的核酸の部分は、該規定された位置のヌクレオチドを含み、該Ａ１は、第一のニック形成剤の存在下で増幅される、工程；
    （Ｂ）以下：
    （ｉ）一本鎖テンプレート核酸（Ｔ２）であって、該一本鎖テンプレート核酸（Ｔ２）は、３’から５’の方向で、以下：
    （ａ）該Ａ１と少なくとも実質的に相補的であり、かつ該遺伝的バリエーションを含む第一の配列、
    （ｂ）第二のニック形成剤によって認識される、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、
    （ｃ）第二の配列、
    を含む、一本鎖テンプレート核酸（Ｔ２）、
    （ｉｉ）該第二のニック形成剤、
    （ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および
    （ｉｖ）１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸、
    の存在下で増幅反応を実施する工程であって、該増幅反応は、該Ａ１が該遺伝的バリエーションの相補的なヌクレオチドを含む場合にのみ、該Ｔ２分子の第二の部分の少なくとも一部を使用して、一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する条件下で実施される、工程；ならびに
    （Ｃ）該Ａ２分子の存在または非存在を検出して、該標的核酸の規定された位置における遺伝的バリエーションの存在または非存在を決定する工程、
    を包含する、方法。
  224. 前記第一のニック形成剤が、前記第二のニック形成剤と同一である、請求項２２３に記載の方法。
  225. 前記一本鎖標的核酸が、変性した二本鎖核酸の一方の鎖である、請求項２２３に記載の方法。
  226. 前記Ａ１が、最大で２５ヌクレオチド長である、請求項２２３に記載の方法。
  227. 前記Ａ１が、最大で１７ヌクレオチド長である、請求項２２３に記載の方法。
  228. 前記Ａ１が、最大で１２ヌクレオチド長である、請求項２２３に記載の方法。
  229. 請求項２２３に記載の方法であって、前記Ａ１が、以下：
    （ａ）第一のＯＤＮＰ、第二のＯＤＮＰおよび前記標的核酸の混合物を形成する工程であって、ここで、
    （ｉ）該第一のＯＤＮＰが、第一のＲＥＲＳの一方の鎖のヌクレオチド配列、および前記遺伝的バリエーションに対して５’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含み、そして
    （ｉｉ）該第二のＯＤＮＰが、第二のＲＥＲＳの一方の鎖の配列、および３’側に位置する該標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、工程；
    （ｂ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸および少なくとも１つの改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で、該第一のＯＤＮＰおよび第二のＯＤＮＰを伸長させて、該第一のＲＥＲＳおよび第二のＲＥＲＳの両方を含む伸長産物を生成する工程；ならびに
    （ｃ）該第一のＲＥＲＳおよび第二のＲＥＲＳを認識する制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）の存在下で、テンプレートとして工程（ｂ）の伸長産物の一方の鎖を使用して、一本鎖核酸フラグメントＡ１を増幅する工程、
    によって提供される、方法。
  230. 前記第一、第二および第三のＲＥＲＳが互いに同一である、請求項２２９に記載の方法。
  231. 請求項２２３に記載の方法であって、前記Ａ１が、以下：
    （ａ）第一のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第二のＯＤＮＰおよび前記標的核酸の混合物を形成する工程であって、ここで、
    （ｉ）該第一のＯＤＮＰが、前記遺伝的バリエーションの５’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に同一なヌクレオチド配列を含み、そして
    （ｉｉ）該第二のＯＤＮＰが、該遺伝的バリエーションの３’側に位置する標的核酸のヌクレオチド配列と少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、
    該第一のＯＤＮＰおよび第二のＯＤＮＰが、各々、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列をさらに含む、工程；
    （ｂ）該第一のＯＤＮＰおよび第二のＯＤＮＰを伸長させて、２つのＮＥＲＳを含む伸長産物を生成する工程；ならびに
    （ｃ）該ＮＥＲＳを認識する１つ以上のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、テンプレートとして工程（ｂ）の伸長産物の一方の鎖を使用して、一本鎖核酸フラグメントＡ１を増幅する工程、
    によって提供される、方法。
  232. 前記第一のＯＤＮＰ中のＮＥＲＳ、前記第二のＯＤＮＰおよびＴ２が互いに同一である、請求項２３１に記載の方法。
  233. 前記遺伝的バリエーションが、単一ヌクレオチド多型である、請求項２２３に記載の方法。
  234. 前記遺伝的バリエーションが、疾患に関連する、請求項２２３に記載の方法。
  235. 前記疾患が、ヒトの遺伝的疾患である、請求項２２３に記載の方法。
  236. 前記遺伝的バリエーションが、病原性微生物の薬物耐性に関連する、請求項２２３に記載の方法。
  237. 前記ニック形成剤が、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉである、請求項２２４に記載の方法。
  238. 前記工程（Ｂ）が、等温条件下で実施される、請求項２２３に記載の方法。
  239. 前記工程（Ｂ）が、５０℃〜７０℃で実施される、請求項２３８に記載の方法。
  240. 請求項２２３に記載の方法であって、前記ＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＰｈｉＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホモエンザイムからなる群より選択される、方法。
  241. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｂｃａまたは９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼである、請求項２４０に記載の方法。
  242. 前記工程（Ｃ）が、質量分析法、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光法および電気泳動からなる群より選択される技術の使用によって、少なくとも部分的に実施される、請求項２２３に記載の方法。
  243. 前記工程（Ｃ）が、液体クロマトグラフィーの使用によって少なくとも部分的に実施される、請求項２２３に記載の方法。
  244. 前記工程（Ｃ）が、質量分析法の使用によって少なくとも部分的に実施される、請求項２２３に記載の方法。
  245. 前記工程（Ｃ）が、液体クロマトグラフィーおよび質量分析法の両方の使用によって少なくとも部分的に実施される、請求項２２３に記載の方法。
  246. 請求項２２９または請求項２３１に記載の方法であって、前記第一のＯＤＮＰ、前記第二のＯＤＮＰまたはこれら両方が固定化されている、方法。
  247. 前記標的核酸が固定化されている、請求項２２３に記載の方法。
  248. 前記Ｔ２が、固体支持体に固定化されている、請求項２２３に記載の方法。
  249. 請求項２２３または請求項２４８に記載の方法であって、前記Ｔ２の第二の配列が、前記第一の配列と少なくとも実質的に同一であり、かつ前記遺伝的バリエーションを含む、方法。
  250. 請求項２４９に記載の方法であって、前記第二のニック形成剤が、前記ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列に対して５’側にニック形成し、ここで、前記第二のニック形成剤によってニック形成可能なニック形成部位の直ぐ５’側に位置する前記Ｔ２の第二の配列の前記一部が、該Ｔ２分子の第一の配列と正確に同一である、方法。
  251. 一本鎖標的核酸中の規定された位置において、遺伝的バリエーションを同定するための方法であって、該方法は、以下：
    （Ａ）該標的核酸の一部と正確に相補的な配列を含む一本鎖核酸（Ａ１）を提供する工程であって、該標的核酸の一部は、該規定された位置において遺伝的バリエーションを含み、該Ａ１は、第一のニック形成剤の存在下で増幅される、工程；
    （Ｂ）以下：
    （ｉ）複数の一本鎖テンプレート核酸（Ｔ２）であって、該複数の一本鎖テンプレート核酸の各々が、３’から５’の方向で、以下：
    （ａ）該Ａ１と少なくとも実質的に相補的であり、かつ該標的核酸の規定された領域において潜在的な遺伝的バリエーションのうち１つを含む、第一の配列、
    （ｂ）第二のニック形成剤によって認識され得るニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、
    （ｃ）該潜在的な遺伝的バリエーションと独自に相関する第二の配列、
    を含み、ここで、該複数のＴ２分子は、該標的核酸の規定された位置における潜在的な遺伝的バリエーションの全てを組み合わせて含む、複数の一本鎖テンプレート核酸（Ｔ２）、
    （ｉｉ）該第二のニック形成剤、
    （ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および
    （ｉｖ）１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸、
    の存在下で増幅反応を実施する工程であって、該増幅反応は、Ｔ２分子の第二の配列の少なくとも一部をテンプレートとして使用して、一本鎖核酸分子（Ａ２）を選択的に増幅する条件下で実施され、該Ｔ２分子は、該標的核酸の遺伝的バリエーションを含む、工程；
    （Ｃ）工程（Ｂ）において増幅されたＡ２を特徴付けて、該標的核酸の遺伝的バリエーションを同定する工程、
    を包含する、方法。
  252. 前記Ｔ２分子の各々の第二の配列が、同じＴ２分子の第一の配列と少なくとも実質的に同一である、請求項２５１に記載の方法。
  253. 請求項２５２に記載の方法であって、前記第二のニック形成剤が、該ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列に対して５’側にニック形成し、そしてここで、前記第二のニック形成剤によってニック形成可能なニック形成部位の直ぐ５’側に位置するＴ２分子の各々の第二の配列の一部が、同じＴ２分子の第一の配列と正確に同一である、方法。
  254. 請求項１５８、請求項１５９または請求項１６０に記載の方法であって、前記Ｔ２分子の各々が、固体支持体に固定化されている、方法。
  255. 前記一本鎖標的核酸が、変性した二本鎖核酸の一方の鎖である、請求項２５１に記載の方法。
  256. ｃＤＮＡ分子中の上流エキソン（エキソンＡ）と下流エキソン（エキソンＢ）との間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
    （Ａ）少なくとも部分的に二重鎖の核酸分子（Ｎ１）を提供する工程であって、該少なくとも部分的に二重鎖の核酸分子（Ｎ１）は、以下：
    （ｉ）第一のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列および該第一のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列のうち、少なくとも１つ、ならびに
    （ｉｉ）該ｃＤＮＡ分子が二本鎖である場合には該ｃＤＮＡ分子の一部の少なくとも一方の鎖、または該ｃＤＮＡ分子が一本鎖である場合には該ｃＤＮＡの一部であって、該一部は、エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部を含むことが疑われる、工程；
    （Ｂ）該第一のＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）、ＤＮＡポリメラーゼおよび１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、第一の一本鎖核酸分子（Ａ１）を増幅する工程であって、該増幅する工程は、該ポリメラーゼについてのテンプレートとして該ｃＤＮＡの一部を使用する、工程；
    （Ｃ）第二の一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程であって、該第二の一本鎖核酸分子（Ｔ２）は、５’から３’の方向で、以下：
    （ｉ）以下を含む第一の配列：
    （ａ）３’部分の３’末端にて、５’部分の５’末端にてエキソンＢのセンス鎖の該５’部分に連結された、エキソンＡのセンス鎖の該３’部分、または
    （ｂ）５’部分の５’末端にて、３’部分の３’末端にてエキソンＢのセンス鎖の該３’部分に連結された、エキソンＡのアンチセンス鎖の該５’部分、
    ここで、該ｃＤＮＡが、エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部を含む場合には、該Ｔ２の第一の配列は、該Ａ１分子と少なくとも実質的に相補的であるが、該ｃＤＮＡが、エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部を含まない場合には、該Ｔ２は、該Ａ１分子と実質的に相補的でない、第一の配列、
    （ｉｉ）第二のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、および
    （ｉｉｉ）第二の配列、
    を含む、工程；
    （Ｄ）エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部が該標的ｃＤＮＡ分子中に存在する場合、Ｔ２の第二の配列の少なくとも一部をテンプレートとして使用して、第三の一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する増幅反応を実施する工程；ならびに
    （Ｅ）該Ａ２の存在または非存在を検出して、該ｃＤＮＡ分子中の連結部の存在または非存在を決定する工程、
    を包含する、方法。
  257. 前記第一のＮＡＲＳが、前記第二のＮＡＲＳと同一である、請求項２５６に記載の方法。
  258. 前記第一のＮＡおよび第二のＮＡの両方が、ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である、請求項２５６に記載の方法。
  259. 前記第一のＮＡおよび第二のＮＡの両方が、Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉでる、請求項２５８に記載の方法。
  260. 前記第一のＮＡおよび第二のＮＡの両方が、ニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）である、請求項２５７に記載の方法。
  261. 前記工程（Ａ）〜（Ｄ）が、単一の容器中で実施される、請求項２５６に記載の方法。
  262. 前記Ｎ１が、前記第一のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含む、請求項２５６に記載の方法。
  263. 前記Ｎ１が、前記第一のＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含む、請求項２５６に記載の方法。
  264. 前記第一のＮＡおよび第二のＮＡの両方が、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）であり、そして前記ヌクレオシド三リン酸の少なくとも１つが改変されている、請求項２６３に記載の方法。
  265. 前記Ａ１が、８〜２４ヌクレオチド長である、請求項２５６に記載の方法。
  266. 前記Ａ１が、１２〜１７ヌクレオチド長である、請求項２６５に記載の方法。
  267. 前記Ａ２が、８〜２４ヌクレオチド長である、請求項２５６に記載の方法。
  268. 前記Ａ２が、１２〜１７ヌクレオチド長である、請求項２６７に記載の方法。
  269. 前記工程（Ｂ）および（Ｄ）の各々が、等温条件下で実施される、請求項２５６に記載の方法。
  270. 前記工程（Ｂ）および（Ｄ）の各々が、５０℃〜７０℃で実施される、請求項２６９に記載の方法。
  271. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損である、請求項２５６に記載の方法。
  272. 請求項２７１に記載の方法であって、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＰｈｉＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭポリメラーゼおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホモエンザイムからなる群より選択される、方法。
  273. 前記５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔポリメラーゼまたは９°ＮｍＴＭポリメラーゼである、請求項２７２に記載の方法。
  274. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換活性を有する、請求項２５６に記載の方法。
  275. 前記工程（Ｂ）および（Ｄ）の各々が、鎖置換促進因子の存在下で実施される、請求項２５６に記載の方法。
  276. 請求項２７５に記載の方法であって、前記鎖置換促進因子が、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、単純疱疹ウイルスタンパク質ＩＣＰ８、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質、ウシ胸腺ヘリカーゼおよびトレハロースからなる群より選択される、方法。
  277. 前記鎖置換促進因子が、トレハロースである、請求項２７６に記載の方法。
  278. 請求項２５６に記載の方法であって、前記工程（Ｅ）が、質量分析法、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光法および電気泳動からなる群より選択される技術の使用によって少なくとも部分的に実施される、方法。
  279. 前記工程（Ｅ）が、液体クロマトグラフィーの使用によって少なくとも部分的に実施される、請求項２７８に記載の方法。
  280. 前記工程（Ｅ）が、質量分析法の使用によって少なくとも部分的に実施される、請求項２７８に記載の方法。
  281. 前記Ｎ１が固定化されている、請求項２５６に記載の方法。
  282. 前記Ｔ２が固定化されている、請求項２８１に記載の方法。
  283. ｃＤＮＡ分子中の遺伝子の上流エキソン（エキソンＡ）と下流エキソン（エキソンＢ）との間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
    （Ａ）第一のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第二のＯＤＮＰおよび該ｃＤＮＡ分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
    （ｉ）該第一のＯＤＮＰは、アンチセンス鎖中のエキソンＡの５’末端の近傍で、エキソンＡのアンチセンス鎖の一部と少なくとも実質的に相補的な配列を含み、
    （ｉｉ）該第二のＯＤＮＰは、センス鎖中のエキソンＢの５’末端の近傍で、エキソンＢのセンス鎖の一部と少なくとも実質的に相補的な配列を含み、そして
    （ｉｉｉ）該第一のＯＤＮＰおよび該第二のＯＤＮＰのうち少なくとも１つが、第一のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列をさらに含む、工程；
    （Ｂ）エキソンＡおよびエキソンＢの両方が該ｃＤＮＡ中に存在する場合に、第一の一本鎖核酸（Ａ１）を増幅する条件下で、該第一のＮＡＲＳを認識するニック形成剤（ＮＡ）の存在下で第一の増幅反応を実施する工程；
    （Ｃ）第二の一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程であって、該第二の一本鎖核酸分子（Ｔ２）は、５’から３’の方向で、以下：
    （ｉ）第一の配列であって、以下：
    （ａ）３’部分の３’末端にて、５’部分の５’末端にてエキソンＢのセンス鎖の該５’部分に連結された、エキソンＡのセンス鎖の該３’部分、または
    （ｂ）５’部分の５’末端にて、３’部分の３’末端にてエキソンＢのセンス鎖の該３’部分に連結された、エキソンＡのアンチセンス鎖の該５’部分、
    を含み、ここで、該ｃＤＮＡが、エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部を含む場合には、該Ｔ２の第一の配列は、該Ａ１分子と少なくとも実質的に相補的であるが、該ｃＤＮＡが、エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部を含まない場合には、該Ｔ２は、該Ａ１分子と実質的に相補的でない、第一の配列、
    （ｉｉ）第二のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、および
    （ｉｉｉ）第二の配列、
    を含む、工程；
    （Ｄ）エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部が該標的ｃＤＮＡ分子中に存在する場合、Ｔ２の第二の配列の少なくとも一部をテンプレートとして使用して、第三の一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する増幅反応を実施する工程；ならびに
    （Ｅ）該Ａ２の存在または非存在を検出して、該ｃＤＮＡ分子中の連結部の存在または非存在を決定する工程、
    を包含する、方法。
  284. 前記第一のＮＡＲＳが前記第二のＮＡＲＳと同一である、請求項２８３に記載の方法。
  285. 前記ｃＤＮＡ分子が固定化されている、請求項２８３に記載の方法。
  286. 前記第一のＯＤＮＰ、前記第二のＯＤＮＰまたはこれら両方が固定化されている、請求項２８３に記載の方法。
  287. ｃＤＮＡ分子中の遺伝子の上流エキソン（エキソンＡ）と下流エキソン（エキソンＢ）との間の連結部の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
    （Ａ）第一のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第二のＯＤＮＰおよび該ｃＤＮＡ分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
    （ｉ）該第一のＯＤＮＰは、以下：
    （ａ）アンチセンス鎖中のエキソンＡの５’末端の近傍で、エキソンＡのアンチセンス鎖の一部と少なくとも実質的に相補的な配列、および
    （ｂ）第一のニック形成剤認識配列（ＮＡＲＳ）のセンス鎖の配列、
    を含み、
    （ｉｉ）該第二のＯＤＮＰは、以下：
    （ａ）センス鎖中のエキソンＢの５’末端の近傍で、エキソンＢのセンス鎖の一部と少なくとも実質的に相補的な配列、および
    （ｂ）第二のＮＡＲＳのセンス鎖の配列、
    を含む、工程；
    （Ｂ）該第一のＮＡＲＳを認識する第一のニック形成剤（ＮＡ）および第二のＮＡＲＳを認識する第二のＮＡの存在下で、エキソンＡおよびエキソンＢの両方が該ｃＤＮＡ中に存在する場合に、第三の一本鎖核酸（Ａ１）を増幅する条件下で、第一の増幅反応を実施する工程；
    （Ｃ）第二の一本鎖核酸分子（Ｔ２）を提供する工程であって、該第二の一本鎖核酸分子（Ｔ２）は、５’から３’の方向で、以下：
    （ｉ）第一の配列であって、以下：
    （ａ）３’部分の３’末端にて、５’部分の５’末端にてエキソンＢのセンス鎖の該５’部分に連結された、エキソンＡのセンス鎖の該３’部分、または
    （ｂ）５’部分の５’末端にて、３’部分の３’末端にてエキソンＢのセンス鎖の該３’部分に連結された、エキソンＡのアンチセンス鎖の該５’部分、
    を含み、ここで、該ｃＤＮＡが、エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部を含む場合には、該Ｔ２の第一の配列は、該Ａ１分子と少なくとも実質的に相補的であるが、該ｃＤＮＡが、エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部を含まない場合には、該Ｔ２は、該Ａ１分子と実質的に相補的でない、第一の配列、
    （ｉｉ）第二のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列、および
    （ｉｉｉ）第二の配列、
    を含む、工程；
    （Ｄ）エキソンＡとエキソンＢとの間の連結部が該標的ｃＤＮＡ分子中に存在する場合、Ｔ２の第二の配列の少なくとも一部をテンプレートとして使用して、第三の一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する増幅反応を実施する工程；ならびに
    （Ｅ）該Ａ２の存在または非存在を検出して、該ｃＤＮＡ分子中の連結部の存在または非存在を決定する工程、
    を包含する、方法。
  288. 前記第一、第二および第三のＮＡＲＳが同一である、請求項２８７に記載の方法。
  289. 前記ｃＤＮＡ分子が固定化されている、請求項２８７に記載の方法。
  290. 前記第一のＯＤＮＰ、前記第二のＯＤＮＰまたはこれらの長方が固定化されている、請求項２８７に記載の方法。
  291. １つ以上の一本鎖核酸を増幅するための方法であって、該方法は、以下の工程：
    （ａ）請求項１８８に記載のアレイに、以下：
    （ｉ）１つ以上の核酸増幅反応混合物であって、ここで、該増幅反応が、第一のニック形成剤の存在下で実施されている、１つ以上の核酸増幅反応混合物、または
    （ｉｉ）（ｉ）の増幅反応の増幅産物、
    を適用する工程；ならびに
    （ｂ）アンチセンス鎖が該アレイの基材に固定化された単離された核酸分子中に存在するニック形成剤認識配列を認識する第二のニック形成剤の存在下で増幅反応を実施して、１つ以上の一本鎖核酸を増幅する工程、
    を包含する、方法。
  292. 前記第一のニック形成剤が、前記第二のニック形成剤と同一である、請求項２９１に記載の方法。
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