JP2002531128A - 神経栄養因子ｇｒｎｆ４ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＧＤＮＦ関連神経栄養因子４（ＧＲＮＦ４）と呼ばれる新規な分子に関する。本発明は、ＧＲＮＦ４のクローニング、発現、特徴決定及び使用を含む。ＧＲＮＦ４に関するポリヌクレオチド分子及びアミノ酸配列が記載される。ＧＲＮＦ４は、グリア細胞系由来神経栄養因子と３５％同一であり、ニューロチュリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）と４６％同一である。ＧＲＮＦ４は、主として末梢知覚神経系及び交感神経系において発現しているＧＦＲαファミリーの受容体であるＧＦＲα−３と結合する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 １．発明の領域 本発明は、神経栄養因子に関する。特に、本発明は、グリア細胞系由来神経栄
養因子（ＧＤＮＦ）と関連した新規なタンパク質又はポリペプチドに関する。そ
の分子は、ＧＤＮＦ関連神経栄養因子４（ＧＤＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ｎｅｕｒ
ｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ４）からＧＲＮＦ４と名付けられた。本発明
は、その神経栄養因子をコードするポリヌクレオチドを含む分子、及びその神経
栄養因子を構築するアミノ酸配列を含む分子、並びにそのような分子を含有する
薬学的組成物にさらに関する。

【０００２】 ２．発明の背景 グリア細胞系由来神経栄養因子 グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）は、最初、中脳ドーパミン作用性
ニューロンの生存を増強する強力な神経栄養因子として、ラットＢ４９細胞から
単離され、クローニングされた（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６
０，１１３０−１１３２，１９９３）。この分子は、その他にも多様な生物学的
活性を示し、中枢神経系及び末梢神経系の両方のいくつかの型のニューロンに対
して効果を有することが、研究により示された。中枢神経系（ＣＮＳ）において
、ＧＤＮＦは、哺乳動物の顔面ニューロン及び脊髄運動ニューロンの、軸索切断
により誘導される死亡を抑制すること（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉ
ｎｇｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｏｆ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．９２，９７７１−９７７５，１９９５；Ｏｐｐｅｎｈｅｉ
ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７３，３４４−３４６，１９９５；Ｙａｎ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７３，３４１−３４４，１９９５；Ｈｅｎｄ
ｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６，１０６２−１０６４，１
９９４；Ｚｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ６，１１３−１１
８，１９９４）、及び発達途中のトリ運動ニューロンを自然のプログラム細胞死
から救済すること（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９５（前記））が
示されている。ＧＤＮＦの局所投与は、軸索切断により誘導される変性（Ｋｅａ
ｒｎｓ ａｎｄ Ｇａｓｈ，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６７２，１０４−
１１１，１９９５；Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７３，３３９−
３４１，１９９５）又は神経毒により誘導される変性（Ｓａｕｅｒ ｅｔ ａｌ
．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍ
ｙ Ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．９２，８９３５−８９３９，１９９
５；Ｔｏｍａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７３，３３５−３３９，１９
９５）から、黒質ドーパミン作用性ニューロンを防御することが示されている。
さらに、ＧＤＮＦの局所投与は、ドーパミン作用性ニューロンからの出芽を誘導
し、ドーパミン、ノルアドレナリン及びセロトニンのレベルを増加させ、運動行
動を改善することが示されている（Ｔｏｍａｃ ｅｔ ａｌ．，１９９５（前記
））。

【０００３】 さらに最近、ＧＤＮＦは、脳のノルアドレナリン作用性ニューロン及びプルキ
ンエ細胞のための栄養因子となりうることが報告された。ｉｎ ｖｉｖｏでは、
ＧＤＮＦを異所性発現している繊維芽細胞の移植が、６−ヒドロキシドーパミン
により誘導される変性を抑制し、成体のノルアドレナリン作用性ニューロンの表
現型を促進し（Ａｒｅｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ １５，１４６５−
１４７３，１９９５）、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、外因的に適用されたＧＤＮＦが
、胚のプルキンエ細胞の生存及び形態学的分化を効率的に促進した（Ｍｏｕｎｔ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ａｃａｄｅｍｙ Ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．９２，９０９２−９０
９６，１９９５）。末梢神経系においては、ＧＤＮＦは、下神経節、毛様体神経
節及び交感神経節のニューロン、並びに胚の脊髄神経節（ＤＲＧ）及び三叉神経
節の知覚ニューロンの小集団の生存を促進することが示されている（Ｔｒｕｐｐ
ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３０，
１３７−１４８，１９９５；Ｅｂｅｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ
Ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４０，２７６−２８４，
１９９５；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９５（前記）；Ｙａｎ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９５（前記）；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４
（前記））。ＧＤＮＦは、培養上頸神経節（ＳＣＧ）ニューロンにおけるバソア
クティブ・インテスティナル・ペプチド及びプレプロタキキニン−ＡのｍＲＮＡ
の発現を増強することも報告されており、従って、ＧＤＮＦはＳＣＧニューロン
の表現型に影響を与え、管束様（ｂｕｎｄｌｅ−ｌｉｋｅ）出芽を誘導する（Ｔ
ｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，１９９５（前記））。

【０００４】 ＧＤＮＦの発現は、神経系の多数の異なる細胞型及び構造において観察されて
いる。ＣＮＳにおいて、ＧＤＮＦ ｍＲＮＡ発現は、逆転写酵素ポリメラーゼ連
鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、黒質ドーパミン作用性神経支配の主要な標的で
ある線条に、発達途中のラット及び成体ラットの両方で観察されている。ＧＤＮ
Ｆ ｍＲＮＡ発現は、海馬、皮質、視床、中隔、小脳、脊髄及び延髄を含むその
他の領域にも観察されている（Ａｒｅｎａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５（前記）
；Ｐｏｕｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ １３，１２４５−１２５２，
１９９４；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅ
ｕｒｏｌｏｇｙ １２７，１６７−１７０，１９９４；Ｓｔｒｏｅｍｂｅｒｇ
ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １２４，４０
１−４１２，１９９３；Ｓｃｈａａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ
ｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １２４，３６８−３７１，１９９３）。ヒトにおいて
も、ＧＤＮＦ転写物は、線条に検出されており、尾状核において最もレベルが高
く、被殻において最もレベルが低い。検出可能なレベルは、海馬、皮質及び脊髄
にも見出されるが、小脳には検出されない（Ｓｃｈａａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１３０，３８７−３９３，１９９
４；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４（前記））。末梢においては、
ＧＤＮＦ ｍＲＮＡ発現は、生後１日のラットのＤＲＧ及びＳＣＧ、座骨神経、
並びに新生児シュヴァン細胞の初代培養物において報告されている（Ｔｒｕｐｐ
ｅｔ ａｌ．，１９９５（前記）；Ｈｏｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ １８２，１０７−１１１，１９９４；Ｈｅｎ
ｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４（前記）；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９４（前記））。さらに、最近の研究により、ＧＤＮＦ転写物が、生
後の精巣及び腎臓、胚のホイスカーパッド（ｗｈｉｓｋｅｒ ｐａｄ）、胃及び
皮膚を含む、末梢の非ニューロン臓器において広範に発現していることが示され
た。発現は、胚の筋肉、副腎及び肢芽、並びに生後の肺、肝臓及び卵巣に、比較
的低いレベルで検出されうる（Ｔｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，１９９５（前記）；
Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４（前記））。

【０００５】 ＧＤＮＦポリペプチドの調製及び特徴決定の詳細な説明は、１９９４年５月２
３日に出願された米国特許出願第０８／１８２，１８３号及びその親出願に見出
される（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０７８８８、１９９２年９月１７日に出願されたＷ
Ｏ９３／０６１１６及び欧州特許出願第９２９２１０２２．７号、公開第ＥＰ６
１０２５４号も参照のこと）。さらなるＧＤＮＦポリペプチドは、ＷＯ９７１１
９６４（１９９５年９月２８日に出願された米国特許出願第０８／５３５，６８
１号；ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４９１５）に記載されている。ＧＤＮＦと構造的に
関連している他の神経栄養因子には、「ニューロチュリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ
）」と呼ばれるタンパク質（Ｎａｔｕｒｅ，３８４（５）：４６７−４７０，１
９９６；及びＷＯ９７０８１９６）及び「パーセフィン（ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）
」と呼ばれるタンパク質（Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ
２０（２）：２４５−２５３，１９９８；及びＷＯ９７３３９１１）が含まれる
。

【０００６】 ＧＤＮＦ療法 ＧＤＮＦ療法は、一つ又は複数の型の神経細胞の生存及び／又は適切な機能を
損なう条件により引き起こされた神経損傷の治療において有用である。そのよう
な神経損傷は、極めて多様な異なる原因により起こりうる。神経損傷は、（１）
傷害部位近傍の軸索突起及び神経細胞体の変性を引き起こす物理的傷害、（２）
発作の場合のような、神経系の一部への血流の一時的もしくは恒久的な中止、（
３）神経毒、例えば癌治療用の化学療法剤（例えば、シスプラチン）もしくはエ
イズ治療用のジデオキシシチジン（ｄｄＣ）への意図的もしくは偶発的な曝露、
（４）糖尿病もしくは腎機能不全を含む慢性代謝病、又は（５）特定のニューロ
ン集団の変性から生じる、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬
化症（ＡＬＳ）を含む神経変性性疾患、により一つ又は複数の型の神経細胞に起
こりうる。

【０００７】 ＧＤＮＦ療法は、パーキンソン病における黒質のドーパミン作用性ニューロン
の変性のような神経変性状態の治療において特に有用であることが、いくつかの
研究により示されている。現在のパーキンソン病の唯一の治療法は、線条のドー
パミンレベルを増加させることを目標とした待機療法である。予想されるＧＤＮ
Ｆ療法の影響は、単に線条のドーパミン作用性神経終末におけるドーパミン作用
性神経伝達を増加させること（症状の緩解をもたらすであろう）のみならず、変
性過程の進行を減速させるか、又はさらには停止させ、そして損傷を受けた黒質
線条体経路を修復し、その機能を回復させることである。ＧＤＮＦは、ヒト患者
におけるドーパミン作用性神経細胞に対する他の型の損傷又はそれらの細胞の不
適切な機能の治療においても使用されうる。そのような損傷又は機能異常は、精
神分裂症及びその他の型の精神病において起こりうる。そのような状態の現在の
治療法は、対症療法であり、これらの受容体を保持するニューロン集団を支配す
るドーパミン作用性ニューロンの不適切な機能性が疾患の過程に関与している可
能性があるという所見と一致した、ドーパミン受容体又はドーパミン取り込み部
位に作用する薬物を必要とする。この領域においては、神経栄養因子の相次ぐ発
見及び治療用組成物に関する継続中の研究にもかかわらず、神経損傷の治療及び
／又は適切な神経機能の増強のための化合物が、依然として必要とされている。

【０００８】 発明の概要 本発明の神経栄養因子ポリペプチドは、本明細書において、構造的に関連して
いる神経栄養因子のＧＤＮＦファミリーと呼ばれているファミリーの第４のメン
バーとしての地位を意味する、ＧＤＮＦ関連神経栄養因子４（ＧＤＮＦ−ｒｅｌ
ａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ４）（ＧＲＮＦ４）タン
パク質産物と名付けられている。その新規な分子は、ＧＤＮＦファミリー受容体
−アルファ−３（ＧＦＲα−３）と結合する能力（即ち、ＧＲＮＦ４活性）によ
り機能的に特徴付けられる。その新規なタンパク質及びポリペプチドは、Ｒｅｔ
受容体タンパク質チロシンキナーゼのチロシン残基のリン酸化を媒介又は誘導す
る分子複合体の一部も提供する。ＧＲＮＦ４タンパク質産物の例には、図３のア
ミノ酸配列（配列番号：＿）、図７のアミノ酸配列（配列番号：＿）及び図１８
に示された配列のようなコンセンサス配列（配列番号：＿）からなる群より選択
されるアミノ酸配列が含まれる。

【０００９】 一つの態様において、本発明は、自然に存在する起源からのタンパク質の分離
以外の手段による、ＧＲＮＦ４タンパク質産物の作製を提供する。そのような手
段には、組換えもしくは遺伝子工学の技術又は化学的合成技術が含まれる。別の
実施形態において、ＧＲＮＦ４タンパク質産物は、遺伝子工学技術及び化学的技
術の組み合わせにより作製される。しかし、この以前には未同定であった分子の
、自然又は天然の状態から、精製され単離された状態への単なる分離も、本発明
に特有のものであることが理解されよう。

【００１０】 「自然に存在する」又は「天然の」とは、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞
等のような生物学的材料に関して使用される場合、自然に見出される、人間によ
り操作されていない材料をさす。同様に、「自然に存在しない」又は「非天然の
」とは、本明細書において使用されるように、自然には見出されない材料、又は
人間により構造的に修飾された、もしくは合成された材料をさす。

【００１１】 本発明のもう一つの態様において、ＧＲＮＦ４タンパク質産物は、グリコシル
化型又は非グリコシル化型で作成されうる。ＧＲＮＦ４のタンパク質及びポリペ
プチドの誘導体は、典型的には水溶性ポリマーへのＧＲＮＦ４分子の接着を含む
。例えば、水性環境におけるＧＲＮＦ４タンパク質産物の沈殿を減少させるため
、ＧＲＮＦ４のタンパク質又はポリペプチドを、一つ又は複数のポリエチレング
リコール分子と接合させることができる。

【００１２】 本発明のさらにもう一つの態様は、ＧＲＮＦ４タンパク質産物をコードする様
々なポリヌクレオチドを含む。「単離されたポリヌクレオチド」又は「単離され
たポリヌクレオチド分子」という用語は、本明細書において使用されるように、
ＧＲＮＦ４タンパク質産物をコードするが、自然に見出されない形態、例えばタ
ンパク質産物を発現するよう細胞を遺伝学的に工作する際の使用に適した形態を
とっているポリヌクレオチド、又はＧＲＮＦ４タンパク質産物をコードする化学
的に合成されたポリヌクレオチドをさす。これらのポリヌクレオチドは、真核生
物又は原核生物の宿主細胞におけるＧＲＮＦ４の発現において使用され、ここで
、発現産物又はそれらの誘導体は、ＧＦＲα−３と結合し、Ｒｅｔ受容体タンパ
ク質チロシンキナーゼのチロシン残基のリン酸化を媒介又は誘導する分子複合体
の一部として作用する能力により特徴付けられる。単離されたポリヌクレオチド
及び／もしくはベクター、又はこれらのポリヌクレオチドを含有する遺伝学的に
工作された宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのタンパク質作製のため、そして細胞
療法又は遺伝子治療の適用において使用されうる。適当なポリヌクレオチドには
、図に具体的に示されたポリヌクレオチド、並びに本発明に基づく縮重配列、自
然に存在する対立遺伝子異型及び修飾された配列が含まれる。ポリヌクレオチド
分子の例には、（ａ）図２（配列番号＿）又は図６（配列番号＿）に記載の配列
、（ｂ）（１）（ａ）の相補配列とハイブリダイズし、かつ（２）ＧＲＮＦ４活
性を有するアミノ酸配列をコードする分子、及び（ｃ）遺伝暗号の縮重がなかっ
たならば（ａ）の相補配列とハイブリダイズするであろう、（２）ＧＲＮＦ４活
性を有するアミノ酸配列をコードする分子、が含まれる。配列が、典型的には、
その配列の増幅及び／又は発現を行うことができる一つ又は複数の機能性因子と
機能的に連結している、そのようなポリヌクレオチドを含有するベクターも本明
細書に開示される。そのようなベクターを含有する原核宿主細胞及び真核宿主細
胞の両方が企図される。典型的には、宿主細胞は、ＣＯＳ−７細胞のような哺乳
動物細胞及び大腸菌のような細菌細胞から選択される。本発明は、形質転換又は
トランスフェクトされた宿主細胞を適当な栄養培地中で増殖させ、細胞により発
現されたＧＲＮＦ４タンパク質産物を、場合により、宿主細胞及び／又は栄養培
地から単離する、ＧＲＮＦ４タンパク質産物の組換え作製をさらに含む。細菌発
現が関与する場合には、その方法は神経栄養因子の再折り畳みの工程をさらに含
む。「形質転換又はトランスフェクトされた」とは、本明細書において使用され
るように、もはや天然に存在する形態をとっていない細胞、即ち、ＧＲＮＦ４タ
ンパク質もしくはポリペプチドを発現するよう、組換え的もしくは遺伝学的に工
作又は修飾されている細胞をさす。細胞の形質転換、例えば単離された宿主細胞
の修飾は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで起こりうる。単離された宿主
細胞は、遺伝子治療及びｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質作製の両方において使用す
るため、遺伝学的に工作されうることが、当業者には理解されよう。

【００１３】 「形質転換」という用語は、本明細書において使用されるように、細胞の遺伝
学的特徴の変化をさし、細胞が新たなＤＮＡを含有するよう修飾されている場合
、その細胞は形質転換されている。例えば、細胞がその天然の状態から遺伝学的
に修飾されている場合、その細胞は形質転換されている。トランスフェクション
又は形質導入の後、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体へ物理的に組み込まれるこ
とにより細胞のＤＮＡと組み合わされるかもしれないし、複製されることなくエ
ピソーム因子として一時的に維持されるかもしれないし、プラスミドとして独立
に複製するかもしれない。ＤＮＡが細胞の分裂により複製される場合、その細胞
は安定的に形質転換されていると見なされる。「トランスフェクション」という
用語は、外来又は外因性のＤＮＡの細胞による取り込みをさすために使用され、
外因性ＤＮＡが細胞膜の内部に導入されている場合、細胞は「トランスフェクト
」されている。「形質導入」という用語は、細菌から細菌への、通常ファージに
よる遺伝子の転移をさす。「形質導入」は、レトロウイルスによる真核細胞配列
の獲得及び転移もさす。

【００１４】 宿主細胞は、移植された細胞が本発明の神経栄養因子を発現し分泌するヒト移
植にとって、適当であるか否かによって選択されうる。宿主細胞は、ヒト移植に
適した膜に封入されていてもよい。宿主細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏで形質転換又は
トランスフェクトされうる。神経損傷を治療するための装置の例は、（ａ）移植
に適した膜、及び（ｂ）細胞が本明細書に開示されたような神経栄養因子受容体
を発現し分泌するよう膜内にカプセル化された細胞、を含む。膜は、半透性材料
、即ち神経栄養因子は透過することができるが、カプセル化された細胞にとって
有害な材料は透過することができない材料から選択されうる。

【００１５】 本発明のタンパク質産物の例には、ＧＤＮＦファミリー受容体−アルファ−３
（ＧＦＲα−３）と結合する、本明細書に記載されたようなアミノ酸配列を含む
単離され精製されたタンパク質産物が含まれる。さらなるＧＲＮＦ４タンパク質
産物を提供するため、これらの分子の例から、コンセンサスアミノ酸配列を導出
することもできる。

【００１６】 本発明のＧＲＮＦ４タンパク質産物を、薬学的に許容される担体と組み合わせ
て含む薬学的組成物も、本明細書において開示される。その他の多様な製剤化材
料が、製造、保存、取り扱い、輸送及び／又は効率を容易にするため使用されう
る。

【００１７】 本発明のもう一つの態様は、ＧＲＮＦ４遺伝子及びタンパク質産物の治療的使
用を含む。例えば、循環血中に存在する、又は可溶性のＧＲＮＦ４タンパク質産
物は、神経系の疾患又は神経系に対する傷害の治療において、単独で、又はさら
なる薬剤（例えば、ＧＤＮＦ、ペーセフィン及び／又はニューロチュリンのよう
な他の神経栄養因子を含む）と共に使用されうる。従って、本発明のタンパク質
産物及び薬学的組成物は、不適切に機能するドーパミン作用性神経細胞、パーキ
ンソン病、アルツハイマー病及び筋萎縮性軸索硬化症の治療において使用されう
る。もう一つの実施形態において、筋萎縮性軸索硬化症に罹患した患者における
運動ニューロンのような、ＧＲＮＦ４に対する感受性の増加から利益を得ること
ができる組織の細胞に、組換えＧＲＮＦ４遺伝子を挿入することができる。ＧＲ
ＮＦ４は、末梢知覚ニューロパシー又は不適切に機能する末梢交感神経と関連し
た神経学的疾患の治療においても使用されうる。交感神経及び／又は副交感神経
の活性又は成長の増加が、膀胱及び結腸のような組織の機能に影響を与えるかも
しれないことが認められる場合には、ＧＲＮＦ４を内臓機能の障害の治療におい
て使用しうることも構想される。失禁及び便秘は、ＧＲＮＦ４治療又はＧＲＮＦ
４もしくはその受容体に対する抗体から利益を得ることができる２つの分野であ
る。さらにもう一つの実施形態において、骨粗鬆症、骨形成不全又は悪性の高カ
ルシウム血症のような骨欠損と関連した疾患を治療するために、ＧＲＮＦ４を使
用しうることが構想される。ＧＲＮＦ４は、破骨細胞、骨芽細胞又は軟骨細胞が
豊富に存在し、骨格のリモデリングのため活発に機能している骨粗鬆症の骨から
調製されたｃＤＮＡライブラリーから単離された場合、これらの細胞型の発達に
影響を与えるかもしれない。

【００１８】 本発明のさらなる態様において、ＧＲＮＦ４ヌクレオチド配列に基づくオリゴ
ヌクレオチドプローブが、ＧＲＮＦ４関連分子を同定するために使用されうる。
さらに、本発明は、ＧＲＮＦ４の生理学的役割を研究するための実験モデル系を
提供する。そのような系は、抗ＧＲＮＦ４抗体又はオリゴヌクレオチドプローブ
を含むアッセイ、及び高レベルのＧＲＮＦ４を発現するトランスジェニック動物
、又は内因性ＧＲＮＦ４遺伝子がゲノムから欠失している、胚性幹細胞技術を使
用して得られた動物のような動物モデルを含む。抗ＧＲＮＦ４抗体は、ＧＲＮＦ
４のタンパク質又はポリペプチドのペプチド部分と結合するであろう。抗体には
、ＧＲＮＦ４タンパク質産物の検出及び精製のために使用されうるモノクローナ
ル抗体及びポリクローナル抗体が含まれる。

【００１９】 本発明のさらなる態様及び利点は、本発明の実施を詳述する以下の説明を考慮
することにより、当業者には明らかとなろう。

【００２０】 図面の簡単な説明 図１ａは、ＧＤＮＦのＣ末端活性ドメインとの相同性を示したクローン（ｓｍ
ｃｂ２−０００１１−ｄ２）のオープン・リーディング・フレームをコードする
ヌクレオチドを示す図である。

【００２１】 図１ｂは、ｓｍｃｂ２−０００１１−ｄ２のオープン・リーディング・フレー
ムとニューロチュリンとの比較を示す図である。

【００２２】 図１ｃは、ｓｍｃｂ２−０００１１−ｄ２クローンをさらに配列決定すること
により得られたマウスＧＲＮＦ４の完全配列を示す図である。配列は、ＧＤＮＦ
様相同性及び３’−ＵＴＲを含む。

【００２３】 図２は、マウスＧＲＮＦ４をコードするヌクレオチド配列（配列番号：＿）を
含むポリヌクレオチド分子を示す図である。完全長ＧＲＮＦ４タンパク質産物の
アミノ酸配列はヌクレオチド２１７〜８９１によりコードされている。

【００２４】 図３は、完全長マウスＧＲＮＦ４タンパク質産物の２２４アミノ酸配列（配列
番号：＿）を示す図である。

【００２５】 図４は、マウスＧＲＮＦ４及びニューロチュリンのアミノ酸配列の比較を示す
図である。マウスＧＲＮＦ４は、ニューロチュリンとおよそ３９％同一である。

【００２６】 図５は、マウスＧＲＮＦ４アミノ酸配列とニューロチュリン、パーセフィン及
びＧＤＮＦのアミノ酸配列との比較を示す図である。

【００２７】 図６は、ヒトＧＲＮＦ４のヌクレオチド配列を示す図である。

【００２８】 図７は、ヒトＧＲＮＦ４のアミノ酸配列を示す図である。

【００２９】 図８は、マウスＧＲＮＦ４及びヒトＧＲＮＦ４のアミノ酸配列の比較を示す図
である。

【００３０】 図９は、ヒトＧＲＮＦ４に関するヒト組織のノーザンブロット分析を示す図で
ある。

【００３１】 図１０は、マウスＧＲＮＦ４に関するマウス組織のノーザンブロット分析を示
す図である。

【００３２】 図１１は、非還元（ＮＲ）条件及び還元条件の１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
分画された（^１２５Ｉ）−標識ＧＲＮＦ４のラジオオートグラフである。

【００３３】 図１２は、（^１２５Ｉ）−標識ＧＲＮＦ４と、ＮＳＲ−５細胞（ＧＦＲα−３
を発現する遺伝学的に工作されたマウス神経芽腫Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞）の表面
との結合を示す図である。

【００３４】 図１３は、ＧＲＮＦ４と、可溶性ｆｌａｇタグ付加ＧＦＲα−３タンパク質に
よりコートされたバイオコア（ＢｉｏＣｏｒｅ）表面との結合を示す図である。

【００３５】 図１４は、（^１２５Ｉ）−標識ＧＲＮＦ４と、可溶性ＧＦＲα−３−ヒトＦｃ
融合タンパク質との化学的クロスリンキングを示す図である。

【００３６】 図１５は、（^１２５Ｉ）−標識ＧＲＮＦ４と、ＮＳＲ−５細胞において発現さ
れたＧＦＲα−３及びＲｅｔ受容体との化学的クロスリンキングを示す図である
。

【００３７】 図１６は、ＮＳＲ−５細胞において発現されたＲｅｔ受容体の、ＧＲＮＦ４に
より誘導されるチロシンリン酸化を示す図である。

【００３８】 図１７は、ＮＳＲ−５細胞において発現されたＲｅｔ受容体の、ＧＲＮＦ４に
より誘導されるチロシンリン酸化の用量依存性（図１７、パネルＡ）及びＮＳＲ
−５細胞において発現されたＲｅｔ受容体の、ＧＲＮＦ４により誘導されるチロ
シンリン酸化の動態（図１７、パネルＢ）を示す図である。

【００３９】 図１８は、ＧＲＮＦ４コンセンサス配列を示す図である。

【００４０】 図１９は、ＧＲＮＦ４トランスジーンの発現が、副腎髄質及び隣接するパラガ
ングリオン（いずれも、胚の神経冠細胞に由来）の顕著な形成異常を生じたこと
を示す図である。髄組織は、大きく減少するか、又は消失し、副腎周囲の脂肪へ
と伸長したニューロンの柱と連続していた。対照的に、対照動物の副腎は、明確
な皮膜を境界とする規則的な細胞層からなっていた。ＨＥ染色。

【００４１】 図２０は、ＧＲＮＦ４トランスジーンの発現が、膀胱の外壁、特に三角付近で
、中程度から顕著な程度の神経及び自律神経節の過形成（矢印）を生じたことを
示す図である。対照マウスの匹敵する範囲における神経及び神経節は、極めて小
さかった。ＨＥ染色。

【００４２】 図２１は、ＧＲＮＦ４トランスジーンの発現が、骨盤結合組織（矢印）、特に
尿道付近で、中程度から顕著な程度の神経及び自律神経節の過形成を生じたこと
を示す図である。対照マウスの匹敵する範囲における神経及び神経節は、極めて
小さかった。ＨＥ染色。

【００４３】 図２２は、ＧＲＮＦ４トランスジーンの発現は、５匹の発現マウスにおいて、
結腸の腸管筋の神経節の肥大を生じ、肥大したニューロンの連続した層を形成し
たが、対照マウスにおける同構造は、小から中サイズのニューロンの断続的なク
ラスターからなっていたことを示す図である。

【００４４】 発明の詳細な説明 グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）は、中枢神経系及び末梢神経系の
両方に由来する多様な細胞型に対して広範な生物学的活性スペクトルを示す強力
な神経栄養因子である。それは、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−
β）ファミリーとわずかに関連している（２０％未満の相同性）、グリコシル化
型のジスルフィド結合二量体である。ドーパミン作用性ニューロン及び他のニュ
ーロン集団の生存を増強することができるＧＤＮＦの能力は、それが、パーキン
ソン病及びその他の型の神経損傷又は形成異常の治療のための治療薬となりうる
ことを証明している。

【００４５】 ニューロチュリン神経栄養因子の記載されている生物学的活性には、上頸神経
節交感ニューロンに加え、下神経節知覚ニューロン及び脊髄神経節知覚ニューロ
ンの小集団の生存の促進が含まれる。その活性は、共通又は類似のシグナル伝達
経路の可能性を示唆している。さらに、ニューロチュリンの生物学的活性は、運
動ニューロン及びドーパミン作用性ニューロンにまで及びうる。ＧＤＮＦ及びニ
ューロチュリンの受容体（１９９７年４月１４日に出願された米国特許出願第０
８／８３７，１９９号及びＷＯ９７４０１５２、ＰＣＴ／ＵＳ９７／６２８１に
記載されている）は、構造的に関連していることが証明されている。

【００４６】 本発明は、１９９７年５月３０日に出願された米国特許出願第０８／８６６，
３５４号（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０８４８６）に記載されているＧＤＮＦファミリ
ー受容体−α−３（ＧＦＲα−３）と結合する新規なタンパク質産物の発見に基
づいている。その出願は、３個のＧＦＲα−３タンパク質のクローニング、発現
及び特徴決定の説明を提供している。受容体タンパク質には、グリア細胞系由来
神経栄養因子受容体−α及び関連する受容体タンパク質２及び３（ＧＦＲα−２
及びＧＦＲα−３）が含まれる。

【００４７】 特に、本発明は、新規なＧＤＮＦ関連神経栄養因子（ＧＤＮＦ−ｒｅｌａｔｅ
ｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ）のクローニング、発現及び特徴
決定を含む。この分子は、構造的に関連したタンパク質群の第４のメンバーであ
るため、ＧＲＮＦ４と命名された。ＧＲＮＦ４タンパク質産物に関するヌクレオ
チド配列及びアミノ酸配列が記載されている。シグナルペプチドの特色を有する
疎水性ドメインがアミノ末端に見出される。ＧＲＮＦ４遺伝子は、ＧＤＮＦ及び
ニューロチュリンとの３０〜４０％の相同性を有する２２４アミノ酸の分泌型分
子をコードする。成熟型ＧＲＮＦ４は、１０６アミノ酸長であり、ＧＤＮＦと３
５％同一、ニューロチュリンと４６％同一である。ＧＦＲα−３は末梢知覚神経
系及び交感神経系において排他的に発現しているＧＦＲαファミリーの受容体で
ある。結合実験及び化学的クロスリンキング実験は、可溶性ＧＦＲα−３も、細
胞において発現されたＧＦＲα−３も、成熟型ＧＲＮＦ４と効率的かつ特異的に
結合することを示している。ＧＲＮＦ４とＧＦＲα−３との結合は、さらに、Ｇ
ＲＮＦ４シグナル伝達の開始を示す受容体タンパク質チロシンキナーゼＲｅｔの
自己リン酸化又は活性化を誘導する。これらのデータは、ＧＲＮＦ４がＧＦＲα
−３のコグネイトリガンドであり、そのシグナル伝達が末梢知覚神経系及び交感
神経系の発達及び／又は維持において役割を果たしている可能性を証明している
。従って、ＧＲＮＦ４は、末梢ニューロパシーのような末梢神経系の変性性疾患
を治療するための治療薬候補となりうる。

【００４８】 「成熟ＧＲＮＦ４ポリペプチド」という用語は、リーダー配列が欠如したポリ
ペプチドをさす。成熟ポリペプチドは、アミノ末端（リーダー配列を含むか、も
しくは含まない）及び／又はカルボキシ末端のプロテアーゼ分解によるプロセシ
ング、より大きい前駆体から、より小さいポリペプチドへの分解、Ｎ−結合型及
び／又はＯ−結合型のグリコシル化等も含みうる。

【００４９】 本発明は、ＧＲＮＦ４を発現する標的細胞を選択するための方法を提供するこ
とにより、ＧＲＮＦ４タンパク質産物のクローニングを可能にする。ＧＲＮＦ４
をコードするヌクレオチド配列を濃縮する手段を提供することにより、本発明は
、ＧＲＮＦ４タンパク質産物の精製及びＧＲＮＦ４をコードするＤＮＡの直接ク
ローニングをさらに提供する。ＧＲＮＦ４ヌクレオチド及びアミノ酸配列の本明
細書における記載は、これら及び多様なＧＲＮＦ４タンパク質産物の再生を可能
にするために必要な情報を提供する。この情報を用いれば、当業者に既知の分子
合成、クローニング及びタンパク質発現の任意の手段により、ＧＲＮＦ４タンパ
ク質産物を単離するか、又は生成させることができる。組換え又は合成によるＧ
ＲＮＦ４分子の作製のための多様な手段が、開示される。

【００５０】 本明細書において使用されるように、「ＧＲＮＦ４タンパク質」又は「ＧＲＮ
Ｆ４ポリペプチド」という用語には、ヒト及びマウスのＧＲＮＦ４のような、生
物学的活性を有する、精製された自然のＧＲＮＦ４分子、合成ＧＲＮＦ４分子又
は組換えＧＲＮＦ４分子、並びにそれらと少なくとも８２〜９９．９％同一であ
ることが、当分野において周知の同定されたデフォルトパラメータを用いた一つ
又は複数の配列比較コンピュータプログラムアルゴリズム（例えば、本明細書に
おいて論じられているようなＧＡＰ、ＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴプログラム）に
より決定された分子が含まれる。この８２〜１００％という同一性範囲に含まれ
る分子には、挿入、置換及び欠失の変異を含むアナログ又は異型（例えば、スプ
ライス異型）が含まれるであろう。「ＧＲＮＦ４タンパク質産物」という用語に
は、本明細書において使用されるように、図に示されたようなＧＲＮＦ４のタン
パク質及びポリペプチドのみならず、対立遺伝子異型；スプライス異型；断片；
化学的に修飾された誘導体；置換、欠失及び挿入による異型；融合ポリペプチド
；並びにそれらのオルソログが含まれる。「オルソログ」という用語は、異なる
種から同定されたポリペプチドに対応するポリペプチドをさす。例えば、マウス
及びヒトのＧＲＮＦ４ポリペプチドは、オルソログと見なされる。

【００５１】 「生物学的活性を有する」又は「ＧＲＮＦ４活性」という用語は、本明細書に
おいて使用されるように、ＧＲＮＦ４のタンパク質及びポリペプチド（及びタン
パク質産物）とＧＦＲα−３との結合をさす。さらに、新規なＧＲＮＦ４のタン
パク質及びポリペプチドとＧＦＲα−３との結合は、Ｒｅｔ受容体タンパク質チ
ロシンキナーゼのチロシン自己リン酸化又は活性化を誘導する。本明細書の開示
を使用すれば、ＧＲＮＦ４タンパク質産物が図に記載されたマウス及びヒトのＧ
ＲＮＦ４分子の活性と等価な生物学的活性を有するか否かを決定することは、十
分に当業者の能力の範囲内である。

【００５２】 本明細書において使用されるように、「ＧＲＮＦ４核酸」又は「ＧＲＮＦ４ポ
リヌクレオチド」という用語は、ポリヌクレオチド分子を記載するために使用さ
れた場合、 ａ）図２もしくは６に記載されたようなヌクレオチド配列を含むポリヌクレオ
チド分子、 ｂ）本明細書に記載されたようなマウスもしくはヒトのＧＲＮＦ４のポリヌク
レオチド配列によりコードされたタンパク質産物と少なくとも７７パーセント同
一であるが、本明細書に記載されたようなマウスもしくはヒトのＧＲＮＦ４のポ
リヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質産物とおよそ７７、７８、７
９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９
１、９２、９３、９４、９５、９６、９７もしくは９８〜９９パーセント同一な
配列を有していてもよいアミノ酸配列を含むタンパク質産物をコードするヌクレ
オチド配列を有するポリヌクレオチド分子、 ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の天然に存在する対立遺伝子異型もしくはオルタネ
ートスプライス異型であるポリヌクレオチド分子、 ｄ）本明細書に提供されたようにして作製された（ａ）〜（ｃ）の核酸異型で
あるポリヌクレオチド分子、 ｅ）（ａ）〜（ｄ）と相補的な配列を有するポリヌクレオチド分子、 ｆ）高ストリンジェンシー条件下で（ａ）〜（ｅ）のいずれかとハイブリダイ
ズするポリヌクレオチド分子、並びに／又は ｇ）任意の成熟ヒトＧＲＮＦ４タンパク質産物の１、２、３、４、５、６、７
、８、９、１０、１５、２０もしくは２５アミノ酸の置換、付加及び／もしくは
欠失（即ち、内因性シグナルペプチドが除去されたＧＲＮＦ４タンパク質産物）
をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子、 又はそれらの断片をさす。

【００５３】 「同一性」とは、当業者に既知であるように、配列を比較することにより決定
されるような、２個以上のポリペプチド配列又は２個以上のポリヌクレオチド配
列の間の関係である。当分野において、「同一性」とは、場合により、そのよう
な配列のストリング間のマッチにより決定されるような、ポリペプチド配列間又
はポリヌクレオチド配列間の配列関連性の度合も意味する。本明細書において使
用されるように、「同一」、「同一性」又は「同一率」とは、特定のアルゴリズ
ムにより処理されたギャップアラインメントを用いた、２個以上の配列間の同一
マッチ率の測定をさす。「類似性」は、関連した概念であるが、「同一性」とは
対照的に、それは同一マッチと保存的置換マッチの両方を測定する。従って、多
くの場合、２個のポリペプチド配列間の類似性の度合は、これら２個の配列間の
同一率よりも高いであろう。「同一性」及び「類似性」は、これらに限定されな
いが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌ
ｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ
ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅ
ｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇ
ｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕ
ｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅ
ｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；及びＳｅｑｕｅｎ
ｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅ
ｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１９９１；及びＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．
，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に
記載された方法を含む、既知の方法により容易に計算されうる。

【００５４】 同一性を決定するための好ましい方法は、試験された配列間の最大のマッチを
与えるよう設計される。同一性及び類似性を決定するための方法は、公に入手可
能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。２個の配列間の同一性
及び類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法（即ち、「アル
ゴリズム」）には、これらに限定されないが、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．
，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）
：３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬ
ＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ
．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））を含む
ＧＣＧプログラムパッケージが含まれる。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラムは、ＮＣＢ
及びその他の供給元（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅ
ｔ ａｌ．ＮＣＢ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ２０８９４；Ａ
ｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３
−４１０（１９９０））から公に入手可能である。周知のスミスウォーターマン
アルゴリズムも、同一性を決定するために使用されうる。

【００５５】 例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅ
ｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉ
ｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、配列同一率を決定したい２個のポリペプチドを、各
アミノ酸の最適なマッチングが得られるよう整列化させる（アルゴリズムにより
決定されるような「マッチド・スパン（ｍａｔｃｈｅｄ ｓｐａｎ）」）。ギャ
ップオープニングペナルティ（ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ）（３
×平均ダイアゴナル（ｄｉａｇｏｎａｌ）として計算される；「平均ダイアゴナ
ル」は、使用された比較マトリックスのダイアゴナルの平均である；「ダイアゴ
ナル」は、特定の比較マトリックスにより各完全アミノ酸マッチに割り当てられ
たスコア又は数である）及びギャップエクステンションペナルティ（ｇａｐ ｅ
ｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）（通常ギャップオープニングペナルティの
１／１０倍である）、並びにＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２のような比較マ
トリックスが、アルゴリズムと共に使用される。標準的な比較マトリックス（Ｐ
ＡＭ２５０比較マトリックスについてはＤａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：
Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ，第５巻，増刊３（１９７８）を参照；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリック
スについてはＨｅｎｔｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８９：１
０９１５−１０９１９（１９９２）を参照）も、アルゴリズムにより使用されう
る。

【００５６】 次いで、以下のようにして同一率を決定することにより、アルゴリズムにより
同一率を計算する。

【００５７】 マッチド・スパン内の同一マッチの総数 × １００ ／ ［（マッチド・スパン内のより長い配列の長さ） ＋ （２個の配列を整列化するために、より長い配列に導入されたギャップの数）］ ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータは、以下のものを含む。

【００５８】 アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０） 比較マトリックス：Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ，ＰＮ
ＡＳ ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）のＢＬＯＳＵＭ６２
ギャップペナルティ：１２ ギャップレングスペナルティ（Ｇａｐ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｅｎａｌｔｙ）：４ 上記のパラメータを用いたＧＡＰプログラムは有用である。

【００５９】 前記のパラメータは、（最後のギャップについてのペナルティなしと共に）ポ
リペプチド比較のためのデフォルトパラメータである。

【００６０】 ポリヌクレオチド配列比較のための好ましいパラメータは、以下のものを含む
。 アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０） 比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０ ギャップペナルティ：５０ ギャップレングスペナルティ：３ 上記のパラメータを用いたＧＡＰプログラムも有用である。前記のパラメータは
、ポリヌクレオチド比較のためのデフォルトパラメータである。

【００６１】 Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅ
ｒｓｉｏｎ ９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９９７に記載のものを含む、アルゴリ
ズム、ギャップオープニングペナルティ、ギャップエクステンションペナルティ
、比較マトリックス等のその他の例は、当業者により使用されうる。行うべき特
定の選択は、ＤＮＡとＤＮＡ、タンパク質とタンパク質、タンパク質とＤＮＡの
ような行うべき特定の比較によって、そしてさらに比較が１対の配列間の比較で
あるか、又は１個の配列と大きな配列データベースとの間の比較（この場合、Ｆ
ＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴＡが好ましい）であるかによって異なるであろう。

【００６２】 図のマウス及びヒトのＧＲＮＦ４の比較により証明されるように、配列は完全
長分子にわたり７８．７％類似しており、７７．４％同一である。マウス及びヒ
トのＧＲＮＦ４のアミノ酸配列の比較（図８）により証明されるように、成熟型
分子の同一率は、８２又は８３〜９２％程度の高さである。従って、当業者は、
ヒトＧＲＮＦ４と比較して７７％又はそれ以上の同一性を有するタンパク質をコ
ードするポリヌクレオチドは、ＧＲＮＦ４分子として認識されることを理解する
であろう。少なくとも８２パーセント同一であるタンパク質産物（例えば、ＧＡ
Ｐプログラムを使用）は、典型的には、野生型ＧＲＮＦ４と比較していくつかの
アミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を有しているであろう。通常、天然残基の
置換は、タンパク質の全体的な正味の電荷、極性又は疎水性にほとんど又は全く
影響がないように、アラニン又は保存的アミノ酸のいずれかであろう。可能な置
換を、表Ｉに記載する。

【００６３】

【表１】

【００６４】 その他の好ましいアミノ酸残基による置換の例：

【００６５】

【表２】

【００６６】 高い同一性を有するＧＲＮＦ４タンパク質産物の起源には、ヒトＧＲＮＦ４タ
ンパク質産物との高度の同一性を有すると予想される（図に示されたような）他
の哺乳動物のＧＲＮＦ４のタンパク質又はポリペプチドが含まれる。例えば、本
明細書に開示されたマウスとヒトのＧＲＮＦ４タンパク質産物の相同性の度合は
、約７７％である。ＧＲＮＦ４のタンパク質又はポリペプチドは、図に示された
マウス又はヒトのＧＲＮＦ４アミノ酸配列に対する抗体との交差反応性により、
そのような哺乳動物から単離されうる。又は、マウスもしくはヒトのＧＲＮＦ４
分子をコードする遺伝子もしくは遺伝子セグメントとのハイブリダイゼーション
により単離されるか、もしくは図に例示されたヌクレオチド配列の相補配列とハ
イブリダイズするポリヌクレオチド分子により、それらを発現させることもでき
る。

【００６７】 「ハイブリダイゼーション」という用語は、核酸鎖が塩基対形成により相補鎖
と結びつく過程をさす。ハイブリダイゼーション法は、核酸鎖間の塩基対形成複
合体を形成させるハイブリダイゼーション工程と、典型的にはその後の数回の洗
浄工程を含む。ハイブリダイゼーション法の「ストリンジェンシー」とは、ハイ
ブリダイゼーション及びその後の洗浄の条件が、高い割合の正確にマッチした塩
基を有するＤＮＡ（又はＲＮＡ）鎖間の安定な複合体の形成をもたらす程度をさ
す。ハイブリダイゼーション工程は、一般的には、必ずしも高いストリンジェン
シーに達することなく鎖の高い会合率にとって有利なように設計された条件下で
実施され、ハイブリダイゼーション法のストリンジェンシーは洗浄条件のストリ
ンジェンシーに大きく依存する。いくつかの一般的に使用されるハイブリダイゼ
ーションの型、及びハイブリダイゼーション及び洗浄の工程を実施するために使
用される条件、並びにストリンジェンシーに影響を与える因子は、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９
８９）に記載されている。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏ
ａｃｈ，チャプター４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，
Ｅｎｇｌａｎｄ）も参照のこと。

【００６８】 高分子量核酸の会合率は、イオン強度に高度に依存し、従って、ＤＮＡハイブ
リダイゼーション工程は通常、０．４Ｍ又はそれ以上のＮａ濃度で実施される。
典型的なハイブリダイゼーションバッファーは、例えば６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ
は０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムを含有し、従って
６×ＳＳＣはおよそ１ＭのＮａ＋を含有する）を含有する。所望により、ハイブ
リダイゼーション率を増加させるため、ハイブリダイゼーション溶液にデキスト
ラン硫酸が添加されうる。非特異的及び／又はバックグラウンドのハイブリダイ
ゼーションを減少させるため、その他の薬剤がハイブリダイゼーション及び／又
は洗浄のバッファーに含まれていてもよい。適当な薬剤には、これらに限定され
ないが、０．１％ウシ血清アルブミン、０１％ポリビニルピロリドン、０．１％
ピロリン酸ナトリウム、０．１ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、フィコール
、デンハルト溶液、超音波処理済みサケ精子ＤＮＡ（又はその他の非相補的ＤＮ
Ａ）が含まれる。これらの添加剤の濃度及び型は、ハイブリダイゼーション条件
のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変化されうることがわか
るであろう。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施
されるが、典型的なイオン強度条件においては、ハイブリダイゼーション率はｐ
Ｈとほぼ無関係である。

【００６９】 高分子量核酸の会合率は、プローブ−標的二重鎖の融解温度（Ｔｍ）よりも約
２５℃低い温度において最適となる。ストリンジェンシーを増加又は減少させる
ため、それよりも高いか又は低い温度を使用することができる。ハイブリダイゼ
ーションをより低い温度で実施することができるように、二重鎖のＴｍを低下さ
せるためには、ホルムアミドを添加することができる。オリゴマープローブの場
合、最適なハイブリダイゼーション温度は、二重鎖の予測Ｔｍに比較的近くなり
うる。

【００７０】 オリゴマーと高分子量との二重鎖のＴｍを推定するための方法は、塩基組成、
長さ、及び塩基対ミスマッチの度合、並びにハイブリダイゼーション及び／又は
洗浄の条件を含む、ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える主要な要因を考慮しよ
うとするものである。ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は、これらの変数
を適応させ、異なる配列関連性を有するＤＮＡにハイブリッドを形成させるため
、当業者により調整されうる。完全にマッチしたＤＮＡ二重鎖の融解温度は、下
記式により推定されうる。

【００７１】 Ｔ_ｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ（Ｎａ＋））＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ
）−６００／Ｎ−０．６３（％ホルムアミド） 式中、Ｎは形成される二重鎖の長さであり、（Ｎａ＋）はハイブリダイゼーショ
ン又は洗浄用の溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃはハイブ
リッド中の（グアニン＋シトシン）塩基の割合である。不完全にマッチしたハイ
ブリッドの場合には、融解温度はミスマッチ１％につきおよそ１℃低下する。こ
の式及びＲＮＡハイブリダイゼーションのための類似の式の使用は、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１
９８９）に論じられている。

【００７２】 「高ストリンジェンシー条件」という用語は、ほぼ完全に（即ち、約９０％超
、好ましくは９５％超）マッチしていないＤＮＡ二重鎖を解離させることを意図
した条件をさす。ＤＮＡのための「高ストリンジェンシー条件」の例は、これら
に限定されないが、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナト
リウム、６８℃；又は０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナ
トリウム、５０％ホルムアミド、４２℃が含まれる。

【００７３】 「中ストリンジェンシー条件」という用語は、高ストリンジェンシー条件下で
起こりうるよりも大きい度合の塩基対ミスマッチングを有するＤＮＡ二重鎖が形
成されうる条件をさす。ＤＮＡのための典型的な中ストリンジェンシー条件の例
は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、５０〜
６０℃；又は０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム
、及び２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。

【００７４】 オリゴヌクレオチド二重鎖はポリマー二重鎖よりも迅速に解離するため、前記
の式は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションにおいては必ずしも有用で
ない。約２０ｎｔまでのオリゴヌクレオチドプローブのための１Ｍ ＮａＣｌに
おける融解温度の推定は、 Ｔｍ＝（Ａ−Ｔ塩基対１個当たり２℃）＋（Ｇ−Ｃ塩基対１個当たり４℃） により与えられる^＊。

【００７５】 ^＊Ｓｕｇｇｓ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｓｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅｓ，６８３頁，Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｆｏｘ編（１９８１）を参照のこと。

【００７６】 比較的長いオリゴヌクレオチドの場合には、この式はＴｍを過剰推定する可能
性が高く、極めて近いＴｍは、この式を使用して同じ％（Ｇ＋Ｃ）を有する長さ
２０のオリゴヌクレオチド二重鎖のＴｍを計算し、次いで、前出の式から６００
／Ｎ項を使用して追加の長さの効果を推定することにより計算されうる。これら
のパラメータを使用すると、例えば３０マーの推定Ｔｍは、同じＧＣ含有量の２
０マーのＴｍよりも（６００／２０−６００／３０）又は（３０−２０）＝１０
℃高い温度となるであろう。

【００７７】 オリゴヌクレオチドのための「高」ストリンジェンシー洗浄条件は、典型的に
は、オリゴヌクレオチドのＴｍよりも０〜５℃低い温度、６×ＳＳＣ及び０．１
％ＳＤＳ、１０〜３０分という時間を含む。「中」ストリンジェンシー洗浄条件
は、高ストリンジェンシー条件の温度よりも約５〜１０℃低い。最適な洗浄条件
は、当業者により経験的に決定されうる。

【００７８】 新規なＧＲＮＦ４タンパク質産物は、典型的には、「単離され精製されている
」。即ち、意図された目的のための本タンパク質産物の使用を妨害する不要な物
質が除去されている。例えば、好ましいＧＲＮＦ４タンパク質産物は、５０％超
「純粋」である。即ち、他のヒト（例えば、非ＧＲＮＦ４）タンパク質性材料又
は病理学的薬剤が、タンパク質産物の５０％未満を構成している。より好ましく
は、ＧＲＮＦ４タンパク質産物は、ＧＲＮＦ４タンパク質産物の製造において使
用された作製技術のために存在しうる他のタンパク質が少なくとも８０％除去さ
れている。最も好ましくは、ＧＲＮＦ４タンパク質産物は、輸送のための製剤化
の前に、他のタンパク質が約９０％、特に好ましくは約９５％、最も好ましくは
約＞９８％除去されている。さらに、本発明は、同種ＧＲＮＦ４タンパク質産物
の製造のためのポリヌクレオチド配列を提供するという独特の利点を与える。

【００７９】 付加、欠失及び置換による異型を含む、多様なＧＲＮＦ４異型が企図される。
例えば、一連の欠失異型は、ＧＲＮＦ４分子のアミノ及び／又はカルボキシ末端
から一つ又は複数のアミノ酸残基を除去することにより、存在するか、又は作成
されうる。

【００８０】 フォン−ヘイン（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ １４，４６８３−４６９０，１９８６）により記載されたような
シグナルペプチド分解の予測のための法則を使用すると、マウスＧＲＮＦ４のシ
グナルペプチド分解は、アミノ酸３９と４０の間（ＴＥＡ−ＳＬ）で起こると予
測される。ヒトＧＲＮＦ４のシグナルペプチド分解は、アミノ酸４７と４８の間
（ＡＥＡ−ＳＬ）で起こると予測される。予測された成熟型のマウス及びヒトの
ＧＲＮＦ４は、Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ分解部位の存在に基づいている
。予測された成熟型は、以下のアミノ酸配列を有する分子を含む。

【００８１】 マウスＧＲＮＦ４ ヒトＧＲＮＦ４ アミノ酸８１−２２４ アミノ酸８１−２２８ アミノ酸１０９−２２４ アミノ酸８９−２２８ アミノ酸１１２−２２４ アミノ酸１１３−２２８ アミノ酸１１９−２２４ アミノ酸１１６−２２８ アミノ酸１２９−２２４ アミノ酸１３３−２２４ このように、ＧＲＦα−３への結合に影響しないでＧＲＮＦ４から１〜８０な
いし１〜１３２の残基のいずれかまたは全てを除去できることを企図している。
周知の分析技術を用いて、最後のシステイン残基までの一つまたはそれ以上のア
ミノ酸残基の除去がＣ末端トランケーションに含まれることもさらに企図してい
る。このようにトランケートされた分子形態であるＧＲＮＦ４タンパク質生成物
はいずれかまたは両方の末端からのアミノ酸残基の欠失を含むこともできる。さ
らにＧＲＮＦ４タンパク質生成物が図１８（配列番号： ）に示される配列を
含んでなる非天然コンセンサス配列を含む、すなわち一つまたはそれ以上のアミ
ノ酸残基を欠失、付加および／または置換し、マウスおよびヒトＧＲＮＦ４に基
づいてコンセンサス配列を形成することを企図している。可能な保存がなされた
、好ましいおよび実例的な付加および置換については前記した。

【００８２】 本発明のＧＲＮＦ４タンパク質生成物およびポリヌクレオチドを処置方法また
は処置用医薬品の製造方法に用いることができる。かかる処置にはＧＲＮＦ４の
ＧＦＲα−３への結合およびＧＦＲα−３によるＲｅｔレセプタータンパク質チ
ロシンキナーゼの活性化に応答する症状の処置などがある。

【００８３】 本発明のその他の実施形態および利点は当業者に明らかであろう。例えばさら
なる用途には新規アッセイ系、トランスジェニック動物および抗体生成などがあ
る。

【００８４】 実験モデル 本発明はＧＲＮＦ４タンパク質生成物活性が、ＧＲＦ３−αおよびＲｅｔを発
現する細胞または細胞系において引き起こされた生理学的応答の測定により検出
できるアッセイ系を提供する。生理学的応答にはＧＤＮＦまたはニュールテュリ
ンの生物学的効果に類似の効果、いくつか挙げるとドーパミンの取り込みの増加
、神経突起の伸長、細胞生存または成長の増強および特定の核酸配列（例えばプ
ロモーター／エンハンサーエレメントおよび構造遺伝子）の転写の活性化、ＧＤ
ＮＦ関連のプロセシング、翻訳またはリン酸化並びにＧＤＮＦにより直接的また
は間接的に誘起される過程に応答する二次的な過程の誘導などが含まれるがこれ
らに限定しない。

【００８５】 例えば過剰なＧＲＮＦ４活性の効果を実験するために用いることができるモデ
ル系を作ることができる。かかる系では、モデル系の細胞における適当なＧＲＦ
α−３および／またはＲｅｔの数を操作してそのように修飾していない細胞に比
較して増加させることにより、ＧＲＮＦ４タンパク質生成物に対する細胞の応答
を増強させることができる。正常にＧＲＦα−３および／またはＲｅｔを発現す
る細胞においてかかるＧＲＦα−３および／またはＲｅｔの数を選択的に増加さ
せるように系を発展させることもできる。ＧＲＦα−３および／またはＲｅｔの
発現を確認するためにＧＲＦα−３および／またはＲｅｔ遺伝子を適当なプロモ
ーター配列の調節下に置くことができる。構成性および／または組織特異的プロ
モーター（ＣＮＳニューロン特異的エノラーゼ、ニューロフィラメント、および
チロシンヒドロキシラーゼプロモーターなどがあるがこれらに限定するものでは
ない）、誘導可能なプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）、ヒ
ト免疫不全ウイルス長末端反復のＵＶ活性化プロモーター（Ｖａｌｅｒｉら、Ｎ
ａｔｕｒｅ、３３３：７８−８１（１９８８））またはＣＭＰプロモーターまた
は発生的に制御されたプロモーターの調節下にＧＲＦα−３遺伝子を置くのが望
ましい。

【００８６】 ＧＲＦα−３および／またはＲｅｔの細胞数を増加させることによりＧＲＮＦ
４タンパク質に対する応答を増強させることができる。モデル系がＧＲＮＦ４タ
ンパク質をわずかしかまたは全く含まない場合、ＧＲＮＦ４を系に添加すること
ができる。過剰なＧＲＮＦ４活性の効果を評価するためにモデル系にさらにＧＲ
ＮＦ４タンパク質生成物を添加するのも望ましい。過剰なＧＲＮＦ４タンパク質
またはポリペプチド発現（またはされたＧＲＮＦ４タンパク質またはポリペプチ
ド分泌）はＧＦＲα−３および／またはＲｅｔをすでに発現する細胞におけるＧ
ＲＮＦ４のレベル上昇の影響を研究するための方法の一つである。

【００８７】 ＧＲＮＦ４タンパク質生成物治療 別の実施形態では、特定の症状がＧＲＮＦ４レベルの上昇により恩恵を受ける
ことができる。これはタンパク質治療で、または細胞もしくは遺伝子治療により
達成でき、それにより適当な細胞におけるＧＲＮＦ４タンパク質またはポリペプ
チドの選択的発現が、例えば組織特異的または誘導可能なプロモーターにより調
節されるＧＲＮＦ４遺伝子を用いることにより、または組換えＧＲＮＦ４遺伝子
を担持する複製不能なウイルスで局所的感染させることにより達成される。

【００８８】 ＧＲＮＦ４タンパク質生成物または組合わせＧＤＮＦまたはニュールテュリン
／ＧＲＮＦ４タンパク質生成物分配により恩恵を受ける徴候には筋萎縮性側索硬
化症などの運動ニューロン障害、糖尿病に関係する神経学的障害、パーキンソン
病、アルツハイマー病およびハンチントン舞踏病など（これらに限定するもので
はない）があることは想定される。ＧＲＮＦ４タンパク質生成物または組合わせ
ＧＤＮＦまたはニュールテュリン／ＧＲＮＦ４タンパク質生成物分配の使用のた
めのさらなる症状について前記したが、さらに：緑内障または網膜ガングリオン
細胞変性を伴うその他の疾患および症状；感覚ニューロンの損傷、傷害または変
性により引き起こされる感覚ニューロパシー；交感神経性症状；光受容体変性を
生じ視力の喪失の原因となっている遺伝性網膜変性および年齢、疾病または損傷
に関係する網膜症のごとき病理学的症状；並びに種々の原因による聴力喪失の防
御および／または処置のための聴細胞および聴ニューロンのごとき内耳感覚細胞
の損傷または変性の処置なども含まれる。加えて、ＧＲＮＦ４を末梢感覚ニュー
ロパシーまたは末梢交感神経の不適切な機能に関係する神経学的障害において使
用することも想定される。さらに別の実施形態ではＧＲＮＦ４を用いて骨喪失例
えば骨粗鬆症、骨形成不全または悪性腫瘍による高カルシウム血症に関係する疾
病を処置できることを企図している。さらにＧＲＮＦ４を用いて破骨細胞、骨芽
細胞または軟骨細胞の発達に影響を与えることができる。

【００８９】 トランスジェニック動物 さらに元来のＧＲＮＦ４ポリペプチドをコードする遺伝子（または複数の遺伝
子）を破壊（「ノックアウト」）してこの遺伝子（または複数の遺伝子）の発現
レベルを有意に低下させるかまたは完全に破壊し、それによりＧＲＮＦ４欠乏細
胞、組織または動物を作るヒト以外の動物例えばマウス、ラットまたはその他の
齧歯類、ウサギ、ヤギもしくはヒツジまたはその他の家畜動物は本発明の範囲内
に含まれる。米国特許第５５５７０３２号に記載のごとき技術および方法を用い
てかかる動物を作ることができる。

【００９０】 本発明はさらに動物のＧＲＮＦ４遺伝子（または複数の遺伝子）の元来の形態
かまたは異種性ＧＲＮＦ４遺伝子（または複数の遺伝子）が動物により過剰発現
され、それにより「トランスジェニック」動物を作るヒト以外の動物例えばマウ
ス、ラットまたはその他の齧歯類、ウサギ、ヤギもしくはヒツジまたはその他の
家畜動物を含む。米国特許第５４８９７４３号およびＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／
２８１２２に記載のごとき周知の方法を用いてかかるトランスジェニック動物を
作ることができる。

【００９１】 本発明はさらに本発明の一つまたはそれ以上のＧＲＮＦ４ポリペプチドのプロ
モーターが（例えば同種組換え法により）活性化または不活性化されており、一
つまたはそれ以上の元来のＧＲＮＦ４ポリペプチドのレベルが変化しているヒト
以外の動物含む。

【００９２】 これらのヒト以外の動物を薬物候補物質のスクリーニングに用いることができ
る。かかるスクリーングでは動物に及ぼす薬物候補物質の影響を測定できる。例
えば、薬物候補物質はＧＲＮＦ４遺伝子の発現を低減または増強できる。特定の
実施形態では、動物を薬物候補物質に暴露した後、生成されるＧＲＮＦ４ポリペ
プチドまたはフラグメントの量を測定できる。さらに、特定の実施形態では動物
に及ぼす薬物の実際の影響を検出できる。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は結
果的に疾病または病理学的症状を招くかまたはこれらに関係し得る。このような
場合、薬物候補物質の遺伝子発現を低下させる能力または病理学的症状を防御ま
たは阻止する能力を試験できる。別の実例ではポリペプチドのフラグメントのご
とき特定の代謝性生成物の生成が結果的に疾病または病理学的症状を招くかまた
はこれらに関係し得る。このような場合、薬物候補物質のかかる代謝性生成物の
生成を低下させる能力または病理学的症状を防御または阻止する能力を試験でき
る。

【００９３】 例えば、組換えＧＲＮＦ４遺伝子を操作してＧＲＮＦ４を不活性化する挿入変
異を含むことができる。トランスフェクション、トランスダクション、インジェ
クションなどのいずれかの慣用される技術により適当なプロモーターの調節下か
かる構築物を細胞例えば胚幹細胞に導入できる。次いで例えばＧ４１８抵抗性に
より構築物を含有する細胞を選別できる。次いで完全なＧＲＮＦ４遺伝子を欠如
する細胞を（例えばサザンブロッティングまたはノーザンブロッティングまたは
発現アッセイにより）同定する。次いで完全なＧＲＮＦ４遺伝子を欠如する細胞
を初期胚細胞と融合しＧＲＮＦ４を欠乏するトランスジェニック動物を作ること
ができる。かかる動物を用いて特定のニューロン集団または、通常ＧＲＮＦ４に
依存するその他のインビボ過程を定義することができる。

【００９４】 診断適用 ＧＲＮＦ４の発現を検出するために用いることができるプローブの種類はオリ
ゴヌクレオチドプローブであり、これを用いてインサイトウ・ハイブリダイゼー
ション、ノーザンブロッティング分析またはＰＣＲ関連技術など（これらに限定
はしない）の当該分野で周知のいずれかの方法によりＧＲＮＦ４コード化ＲＮＡ
を検出できる。検出可能なマーカー（例えば放射性標識およびビオチンのごとき
アイソトープ以外の標識）で本発明の核酸生成物を標識でき、これをハイブリダ
イゼーション過程に用いてヒトＧＲＮＦ４遺伝子位置および／またはいずれかの
関連遺伝子ファミリーの位置を染色体地図に配置することができる。これらをＤ
ＮＡレベルでヒトＧＲＮＦ４遺伝子障害の同定に用いることもでき、遺伝子マー
カーとして近隣遺伝子およびその障害の同定に用いることができる。本明細書に
おいて企図するキットはかかる標識物質を含有する。

【００９５】 本発明のタンパク質生成物を検出可能なマーカー物質または標識（例えば放射
性アイソトープ、蛍光もしくは化学ルミネサンス物質、酵素または当業者に入手
可能なその他の標識）と結合させることにより「標識」し、固体組織および血液
または尿のごとき液体サンプルにおけるＧＲＦα−３の検出および定量に有用な
試薬を提供できる。かかる生成物を用いてＧＲＮＦ４に対する応答性が正常なま
たは低下した状態の細胞および組織を検出することもできる。

【００９６】 試験サンプル中のＧＲＮＦ４の存在を検出するかまたはＧＲＮＦ４レベルを測
定するための別の可能なアッセイは、試験サンプルを、固相に固定されたＧＲＮ
Ｆ４と結合するのに適したＧＦＲα−３タンパク質または抗ＧＲＮＦ４抗体と接
触させ、それによりＧＦＲα−３結合または抗体結合ＧＲＮＦ４を生成すること
からなる。ＧＦＲα−３結合または抗体結合ＧＲＮＦ４を検出試薬例えばＧＲＮ
Ｆ４に特異的な標識抗体と接触させてもよく、それにより検出可能な生成物を形
成できる。かかるアッセイを発展させて試験サンプルを分析するためのアッセイ
装置を作ることができる。基本的な形態では、かかる装置は適当なＧＦＲα−３
タンパク質または抗ＧＲＮＦ４抗体を含有するまたはこれらで被覆した固相を含
む。

【００９７】 本明細書において提供されるアッセイ試薬はキットの一部または製造品目とし
て組み入れることもできる。包装資材および本発明により提供されるポリヌクレ
オチドまたはアミノ酸配列の一つまたはそれ以上の調製物を含んでなる製造品目
をも企図している。かかる包装資材は調製物が生物学的サンプル中のＧＲＮＦ４
の検出に有用であることを示すラベルをも含む。このように、キットはかかる試
験を実施するための物質例えば血液、尿または組織サンプルにおいてタンパク質
分析抗体結合、ＤＮＡまたはＲＮＡハイブリダイゼーション分析またはＰＣＲ分
析を実施するのに有用な試薬を含むことができる。

【００９８】 抗ＧＲＮＦ４抗体 本発明によればＧＲＮＦ４タンパク質生成物を免疫原として用いて抗ＧＲＮＦ
４抗体を作ることができる。抗ＧＲＮＦ４免疫応答を生じる可能性をさらに改善
するために、ＧＲＮＦ４のアミノ酸配列を分析して免疫原性の増強に関与し得る
分子の部分を同定できる。例えばアミノ酸配列をコンピューター分析に供して、
親水性、表面の可能性、柔軟性、抗原インデックス、両親媒性らせん、両親媒性
シートおよびＧＲＮＦ４の２次構造に関するコンピューターによるプロットを呈
する表面エピトープを決定することができる。別法として異なる種のＧＲＮＦ４
のアミノ酸配列を比較し、比較的非相同的な領域を同定できる；これらの非相同
的な領域は種々の種にわたって免疫原になり得る可能性がより高い。

【００９９】 連続したアミノ酸配列またはＧＲＮＦ４内の２次配座の一部のみを複製するポ
リペプチドフラグメントもまた含まれ、このフラグメントは一つの活性（例えば
免疫学的活性）を有するが他の活性（例えばＧＦＲα−３結合活性）を有さない
。このように抗体の生成に抗ペプチド抗体の生成を含むことができる。

【０１００】 培養中連続した細胞系による抗体分子の生成を提供するいずれかの周知の技術
により、ＧＲＮＦ４タンパク質生成物を指向するモノクローナル抗体を製造でき
る。例えば元来ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより開発されたモノクロ
ーナル抗体を生成するハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４
９７（１９７５））、同様にトリオーマ技術、ヒトＢセルハイブリドーマ技術（
Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２（１９８３））
、ＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」アラン・アール・リス
・インコーポレーティッド、７７−９６（１９８５））等を用いることができる
。

【０１０１】 ヒトモノクローナル抗体またはキメラヒト−マウス（またはその他の種）モノ
クローナル抗体をも治療用途に製造でき、当該分野で周知の多くの技術のいずれ
かにより製造できる（例えばＴｅｎｇら、ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：７３０
８−７３１２（１９８３）；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａ
ｙ，４：７２−７９（１９８３）；Ｏｌｓｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ
．９２：３−１６（１９８２））。マウス抗原結合ドメインをヒト定常領域とと
もに含有するキメラ抗体分子を製造できる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＰＮＡＳ Ｕ
．Ｓ．Ａ．８１：６８５１（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ，３１
４：４５２（１９８５））。

【０１０２】 当該分野で周知の種々方法をポリクローナル抗体の生成に用いることもできる
。抗体を生成するためにＧＲＮＦ４ポリペプチドまたはそのフラグメントもしく
は誘導体の注射によりウサギ、マウス、ラット等（これらに限定するものではな
い）の種々宿主動物を免疫できる。選択した宿主の種に依存して種々アジュバン
トを用い、免疫学的応答を増強することができる。有用なアジュバントにはフロ
イントアジュバント（完全または不完全）、ミネラルゲル例えば水酸化アルミニ
ウム、界面活性剤例えばリゾレシチン、プルロン多価アルコール、ポリアニオン
、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール
、およびヒトアジュバント例えばＢＣＧ（カルメット・ゲラン杆菌）およびコリ
ネバクテリウム・パルブムなどがあるがこれらに限定するものではない。

【０１０３】 ＧＲＮＦ４エピトープに対する抗体の分子クローンを周知の技術により製造す
ることもできる。組換えＤＮＡ法（例えばＭａｎｉａｔｉｓら、「Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニ
ューヨーク州（１９８２））を用いてモノクローナル抗体分子またはそれの抗原
結合領域をコードするポリヌクレオチオド分子を構築することができる。

【０１０４】 周知の技術例えば免疫吸着法またはイムノアフィニティークロマトグラフィー
、高速液体クロマトグラフィーのごときクロマトグラフィー法、またはそれらの
組合わせ等により抗体分子を精製できる。本発明は抗体分子およびかかる抗体分
子のフラグメントを提供する。周知の技術により分子のイディオタイプを含有す
る抗体フラグメントを作ることができる。例えば、かかるフラグメントには：抗
体分子のペプシン消化により作ることができるＦ（ａｂ’）２フラグメント；Ｆ
（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィドブリッジを還元することにより作るこ
とができるＦａｂ’フラグメント、および抗体分子をパパインおよび還元剤と反
応させて作ることができるＦａｂフラグメントなどがあるが、これらに限定する
ものではない。かかる選択的結合分子自体をＧＲＮＦ４タンパク質生成物に代用
してもよく、薬学的組成物として処方できる。

【０１０５】 その他の選択的結合物質をＧＲＮＦ４分子から展開することもできることは当
業者に理解されよう。「選択的結合物質」という用語はＧＲＮＦ４に対して特異
性を有する一つまたは複数の分子を意味する。選択的結合物質には可溶性または
結合形態で標識できる抗体、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（
ｍＡｂ）、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、抗体に対する抗イディオタイプ（抗Ｉ
ｄ）抗体、およびそのフラグメント、領域または誘導体などがあり、酵素的切断
、ペプチド合成または組換え技術など（これらに限定するものではない）の周知
の技術により提供される。本発明の抗ＧＲＮＦ４選択的結合物質は例えばＧＲＮ
Ｆ４の部分に結合でき、ＧＲＮＦ４のＧＲＮＦ４レセプターへの結合を阻害する
。

【０１０６】 本明細書で用いる「特異的」および「特異性」という用語は選択的結合物質が
ヒトＧＲＮＦ４タンパク質に結合する能力を意味する。しかしながら、選択的結
合物質はまたＧＲＮＦ４のオーソログ、すなわちＧＲＮＦ４の種間変種、例えば
マウスおよびラットＧＲＮＦ４タンパク質にも結合できることは理解されよう。

【０１０７】 「抗原」という用語は選択的な結合物質例えば抗体が結合できる分子または分
子の一部を意味し、これはさらにその抗原のエピトープに結合できる抗体を動物
に生成させることができる。抗原は一つまたはそれ以上のエピトープを有するこ
とができる。前記で言及した特異的結合反応は、抗原が高度に選択的な様式で対
応する抗体と反応し、その他の抗原により誘起され得る多くのその他の抗体とは
反応しないことを示すことを意味している。

【０１０８】 当該分野で周知の方法によりＧＲＮＦ４タンパク質生成物を用いてＧＲＮＦ４
選択的結合物質を製造できる。このようにＧＲＮＦ４ポリペプチドを結合する抗
体および抗体フラグメントは本発明の範囲内である。抗体フラグメントはＧＲＮ
Ｆ４ポリペプチド上のエピトープに結合する抗体の部分を含む。かかるフラグメ
ントの例としては抗体全長を酵素的に切断することにより生じたＦａｂおよびＦ
（ａｂ‘）フラグメントなどがある。その他の結合フラグメントには組換えＤＮ
Ａ技術、例えば抗体可変領域をコードする核酸配列を含有する組換えプラスミド
の発現により生じたフラグメントなどがある。これらの抗体は例えばポリクロー
ナルモノ特異的ポリクローナル、モノクローナル、組換え、キメラ、ヒト化、ヒ
ト、一本鎖および／または二重特異性でよい。

【０１０９】 別の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は「ヒト化」抗体である。ヒ
ト以外の抗体をヒト化する方法は当該分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は
ヒト以外の供給源からその抗体に導入された一つまたはそれ以上のアミノ酸残基
を有する。当該分野で周知の方法に従って（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２
１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３
２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
３９：１５３４−１５３６（１９８８））齧歯類相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒ
ト抗体の対応する領域と置換することによりヒト化を実施できる。

【０１１０】 ＧＲＮＦ４ポリペプチド、フラグメント、変種および／または誘導体に結合す
るヒト抗体もまた本発明に包含される。ＧＲＮＦ４抗原（すなわち少なくとも６
個の近接するアミノ酸を有する）での免疫によりかかる抗体を生成でき、ＧＲＮ
Ｆ４抗原は内因性の免疫グロブリンを生成しないでヒト抗体のレパートリーを生
成できるトランスジェニック動物（例えばマウス）の担体と結合していてもよい
。例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９
０：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ
，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ
ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）を参照のこと。一つの方法では
、動物の免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする内因性の遺伝子座を無効
にし、そのゲノムにヒト重鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を挿入
することによりかかるトランスジェニック動物を作る。部分的に修飾した動物、
すなわち修飾された補体全てを有してはいない動物を次いで交雑し、望ましい免
疫系修飾の全てを有する動物を得る。免疫原を投与すると、これらのトランスジ
ェニック動物がこれらの抗原に免疫特異的である（例えばネズミではなく）ヒト
抗体などのヒト可変領域を有する抗体を生成する。ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ
９６／０５９２８およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６を参照のこと。さらなる
方法が米国特許第５５４５８０７号、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／２４５
、ＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０７並びにＥＰ５４６０７３Ｂ１およびＥＰ５４６
０７３Ａ１に記載されている。

【０１１１】 またヒト抗体をファージ展示ライブラリーから生成することもできる（Ｈｏｏ
ｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａ
ｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１））。糸状バクテ
リオファージの表面の抗体レパートリーの展示、続いて選択した抗原に結合する
ことによるファージの選別により、これらの過程は免疫選別を擬似する。かかる
技術はＡｄａｍｓらの名のもとに出願されているＰＣＴ出願ＷＯ９９／１０４９
４に記載されており、かかる研究法を用いたＭＰＬ−およびｍｓｋレセプターに
関係する高親和性および機能的アゴニスト性抗体の単離について記載されている
。

【０１１２】 キメラ、ＣＤＲ移植およびヒト化抗体を典型的には組換え法により生成する。
本明細書に記載の材料および方法を用いて抗体をコードする核酸を宿主細胞に導
入し、発現する。好ましい実施形態では哺乳動物宿主細胞例えばＣＨＯ細胞にお
いて抗体を生成する。宿主細胞において組換えＤＮＡを発現させることにより、
または本明細書に記載のハイブリドーマ細胞において発現させることによりヒト
抗体を生成できる。

【０１１３】 診断に適用するために、特定の実施形態では、抗ＧＲＮＦ４抗体を典型的には
検出可能な部分で標識する。検出可能な部分は直接的または間接的のいずれかで
検出可能なシグナルを生成できる何れかの部分にできる。例えば検出可能な部分
は放射性アイソトープ例えば^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓもしくは^１２５Ｉ、
蛍光または化学ルミネサンス化合物例えばフルオレセイン・イソチオシアネート
、ローダミン、もしくはルシフェリン；または酵素例えばアルカリ性ホスファタ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼでよい。Ｂａ
ｙｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８４：１３８−１６３（１９９０）。

【０１１４】 本発明の抗ＧＲＮＦ４抗体をいずれかの周知のアッセイ方法例えば競合結合ア
ッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイ（Ｓｏ
ｌａ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏ
ｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」１４７−１５８（１９８７）（シー・アール・シー
・プレス・インコーポレーティッド））において用いてＧＲＮＦ４ポリペプチド
の検出および定量を行うことができる。抗体は用いるアッセイ法に適当な親和性
でＧＲＮＦ４ポリペプチドと結合する。

【０１１５】 競合結合アッセイは限定された量の抗ＧＲＮＦ４抗体と結合するための試験サ
ンプル分析物（ＧＲＮＦ４ポリペプチド）と競合する標識標準物質（例えばＧＲ
ＮＦ４ポリペプチドまたは免疫学的に反応するその部分）の能力に依存する。試
験サンプル中のＧＲＮＦ４ポリペプチドの量は抗体と結合することになる標準物
質の量と反比例する。結合することになる標準物質の量の決定を容易にするため
に、典型的には競合前または後に抗体を不溶化し、それにより抗体に結合した標
準物質および分析物を、結合せずに残っている標準物質および分析物から都合よ
く分離できる。

【０１１６】 サンドイッチアッセイは典型的には二つの抗体に関与し、各々は検出および／
または定量すべきタンパク質の異なる免疫原性部分、すなわちエピトープに結合
できる。サンドイッチアッセイでは典型的には固体支持体に固定された第１の抗
体が試験サンプル分析物に結合し、その後第２の抗体が分析物に結合して不溶性
の三成分複合体を形成する。例えば米国特許第４３７６１１０号を参照のこと。
第２の抗体はそれ自体検出可能な部分で標識できる（直接的サンドイッチアッセ
イ）か、または検出可能な部分で標識した抗免疫グロブリン抗体を用いて測定で
きる（間接的サンドイッチアッセイ）。例えばサンドイッチアッセイの一つの型
は酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）であり、この場合検出可能な部分は
酵素である。

【０１１７】 本発明の選択的結合物質には抗体などがあり、治療用に用いることができる。
これらの治療用物質は概してアゴニストまたはアンタゴニストであり、故にこれ
らはＧＲＮＦ４ポリペプチドの生物学的活性の少なくとも一つを各々増強するか
または低減する。一つの実施形態において、本発明のアンタゴニスト抗体はＧＲ
ＮＦ４ポリペプチドに特異的に結合できる抗体またはその結合フラグメントであ
り、インビトロまたはインビボでＧＲＮＦ４ポリペプチドの機能的活性を阻害ま
たは排除できる。好ましい実施形態では、アンタゴニスト抗体は少なくとも約５
０％まで、好ましくは約８０％までＧＲＮＦ４ポリペプチドの機能的活性を阻害
する。別の実施形態では、アンタゴニスト抗体はＧＲＮＦ４結合パートナー（リ
ガンドまたはレセプター）と相互作用でき、それによりインビボまたはインビト
ロでＧＲＮＦ４活性を阻害または排除できる。アゴニストおよびアンタゴニスト
抗ＧＲＮＦ４抗体を当該分野で周知のスクリーニングアッセイにより同定する。

【０１１８】 本発明の抗ＧＲＮＦ４抗体はインビボイメージングにも有用である。検出可能
な部分で標識した抗体を動物に、好ましくは血流中に投与し、宿主における標識
抗体の存在および位置を検定する。核磁気共鳴、放射線学または当該分野で周知
のその他の検出手段により動物において検出できるいずれかの部分で抗体を標識
できる。

【０１１９】 本発明はまたＧＲＮＦ４選択的結合物質（例えば抗体）および生物学的サンプ
ル中のＧＲＮＦ４濃度を検出するのに有用なその他の試薬を含んでなるキットに
も関する。かかる試薬には２次活性、検出可能な標識、遮断血清、陽性および陰
性対照サンプルおよび検出試薬などがある。

【０１２０】 ＧＲＮＦ４の組換え発現 本発明はＧＲＮＦ４タンパク質生成物をコードする種々ポリヌクレオチドを提
供する。発現生成物またはその誘導体はＧＤＮＦファミリーレセプターα−３（
ＧＦＲα−３）に結合する能力により特徴づけられる。ポリヌクレオチドはまた
細胞治療または遺伝子治療に適用することもできる。

【０１２１】 本発明によれば、新規ＧＲＮＦ４タンパク質生成物およびかかるタンパク質生
成物の全てまたは部分をコードするＤＮＡが提供される。本発明の新規ポリヌク
レオチド分子は１次構造配座の少なくとも一部分および組換えヒトＧＲＮＦ４の
一つまたはそれ以上の生物学的特徴を有する分子の原核または真核生物宿主細胞
における発現を安定させるのに有用である。ポリヌクレオチド分子を精製および
単離でき、望ましいコーディング配列はＧＲＮＦ４タンパク質生成物を生成する
のに有用である。また別にヌクレオチドを診断の目的に用いることができ、以下
により詳細に記載する。本発明のＤＮＡ分子の実例としては本明細書に記載する
ＧＲＮＦ４ポリペプチドをコードするヌクレオチドなどがある。加えて本発明に
より開示されるＤＮＡ分子は：（ａ）図に示されるＧＲＮＦ４ ＤＮＡ（および
相補鎖）；（ｂ）サブパート（ａ）のＤＮＡまたはそのフラグメントに（本明細
書に開示されるハイブリダイゼーション条件または等価な条件またはよりストリ
ンジェントな条件下で）ハイブリダイズするＤＮＡ；および（ｃ）遺伝コードの
縮重がなく、サブパート（ａ）のＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡを含む。前
記のパート（ｂ）および（ｃ）はヒトＧＲＮＦ４のアレル変種形態をコードする
および／またはその他の哺乳動物種からのＧＲＮＦ４をコードするゲノムＤＮＡ
、並びにＧＲＮＦ４、ＧＲＮＦ４のフラグメントおよびＧＲＮＦ４のアナログを
コードする製造されたＤＮＡ配列を含むことができ、ＤＮＡ配列は微生物宿主に
おけるメッセンジャーＲＮＡの転写および翻訳を促進するコドンを組み込むこと
ができる。当該分野で周知の方法および本明細書に記載の方法により、このよう
に製造された配列を容易に構築できる。

【０１２２】 本明細書に示した記載またはその他の周知の方法に従って実施する組換え発現
技術を用いてこれらのポリヌクレオチドを生成し、種々ＧＲＮＦ４タンパク質生
成物を発現できる。例えばＧＲＮＦ４タンパク質生成物をコードするＤＮＡを適
当なベクターに挿入することにより、当業者は多量の望ましいヌクレオチドを容
易に生成できる。次いで配列を用いて検出プローブまたは増幅プライマーを作る
ことができる。別法としてＧＲＮＦ４をコードするポリヌクレオチドを発現ベク
ターに挿入できる。発現ベクターを適当な宿主に導入することにより、望ましい
ＧＲＮＦ４タンパク質生成物を多量に生成できる。

【０１２３】 さらに本明細書に記載するように、ＤＮＡの増殖および／またはＧＲＮＦ４タ
ンパク質生成物の生成に利用可能な多くの宿主／ベクター系がある。これらには
プラスミド、ウイルス性および挿入ベクターおよび原核および真核生物宿主など
があるが、これらに限定するものではない。当業者は異種性ＤＮＡを増殖または
発現できる宿主／ベクター系を適合させて本発明の配列を生成または発現できる
。

【０１２４】 かかる組換え技術の手段により本発明のＧＲＮＦ４タンパク質生成物を商業的
な量でより高い純度で容易に生成する。さらに本開示が具体的に図に示すＧＲＮ
Ｆ４タンパク質生成物をコードする縮重ヌクレオチドおよびＧＲＮＦ４タンパク
質生成物の変種またはアナログをコードする配列並びにこれらのＤＮＡ分子の補
体に好ましくはストリンジェント条件下でハイブリダイズするこれらのヌクレオ
チドを含む新規ヌクレオチドを提供することは当業者に理解されよう（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ」コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、３８７−
３８９（１９８２）を参照のこと）。ストリンジェントハイブリダイゼーション
条件の実例としては６２ないし６７℃で４ｘＳＳＣにおけるハイブリダイゼーシ
ョン、続いて６２ないし６７℃で約１時間０．１ｘＳＳＣでの洗浄などが挙げら
れる。別法としてストリンジェントハイブリダイゼーション条件の実例としては
４０ないし４５℃で、４５ないし５５％ホルムアミド、４ｘＳＳＣを用いるハイ
ブリダイゼーションなどがある。さらに本発明がまた緩和されたまたはストリン
ジェントハイブリダイゼーション条件下でマウスおよびヒトＧＲＮＦ４の相補的
配列にハイブリダイズし、ＧＲＮＦ４活性を有するタンパク質生成物をコードす
るＤＮＡをも提供することは当業者に理解されよう。かかる緩和されたストリン
ジェントハイブリダイゼーション条件の実例としては４５ないし５５℃で４ｘＳ
ＳＣまたは４０ないし４５℃で３０ないし４０％ホルムアミドを用いるハイブリ
ダイゼーションなどがある。

【０１２５】 ＧＲＮＦ４をコードするポリヌクレオチドの生成 本発明の開示に基づいて化学的合成、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリースク
リーニング、発現ライブラリースクリーニングおよび／またはｃＤＮＡのＰＣＲ
増幅など（これらに限定するものではない）の種々の手段によりＧＲＮＦ４タン
パク質生成物全長またはそのフラグメントをコードするヌクレオチドを容易に製
造または入手できる。これらの方法およびＤＮＡを製造するのに有用なその他の
方法は当該分野で周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー
、ニューヨーク州（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌら編「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」カレント・プロト
コルズ・プレス（１９９４）およびＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ「Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」１５２巻、アカデミック・プレス・
インコーポレーティッド、サンディエゴ、カリフォルニア州（１９８７）に示さ
れている。ＧＲＮＦ４タンパク質生成物をコードする好ましいポリヌクレオチド
分子は哺乳動物の配列である。

【０１２６】 ＧＲＮＦ４タンパク質生成物をコードするＤＮＡの化学合成はまた当該分野で
周知の方法、例えばＥｎｇｅｌｓらにより示された方法（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ
．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．２８：７１６−７３４（１９８９））を用いて達成できる。
これらの方法にはとりわけ核酸配列合成のホスホトリエステル、ホスホラミダイ
トおよびＨホスホン酸塩法などがある。かかる化学合成のための好ましい方法は
標準的なホスホラミダイト化学を用いる重合体支持合成である。典型的には、望
ましいタンパク質生成物をコードするＤＮＡ配列は数百塩基対（ｂｐ）またはヌ
クレオチドの長さである。これらの方法を用いて約１００ヌクレオチドよりも大
きい核酸配列を数個のフラグメントとして合成できる。次いでフラグメントを一
緒にライゲートしてＧＲＮＦ４タンパク質生成物全長またはその部分を発現する
ための配列を形成する。

【０１２７】 別法として、適当なｃＤＮＡライブラリー（すなわちタンパク質を発現すると
考えられる一つまたはそれ以上の組織供給源から製造したライブラリー）または
ゲノムライブラリー（全ゲノムＤＮＡから製造したライブラリー）をスクリーニ
ングすることにより適当なＤＮＡを得ることができる。ｃＤＮＡライブラリーの
供給源は典型的にはＧＲＮＦ４を妥当な量で発現することが見出されているかま
たは発現すると考えられる組織である。典型的には、ゲノムライブラリーの供給
源はＧＲＮＦ４をコードする遺伝子を抱くと考えられる哺乳動物種に由来するい
ずれかの組織または複数の組織である。ライブラリーに存在するＧＲＮＦ４ ｃ
ＤＮＡまたは遺伝子と選択的にハイブリダイズする一つまたはそれ以上のプロー
ブ（例えば本明細書に開示した配列に基づくオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡまた
はゲノムＤＮＡフラグメント）を用いてＧＲＮＦ４ ｃＤＮＡ／遺伝子の存在に
関してライブラリーをスクリーニングできる。かかるライブラリースクリーニン
グに典型的に用いられるプローブは通常ライブラリーを製造した種と同一または
類似の種からのＧＲＮＦ４ ＤＮＡの小さい領域をコードする。別法としてプロ
ーブは本明細書で記載した縮重でよい。

【０１２８】 非特異的結合を防御するが、プローブまたはプライマーと有意な同一性レベル
を有するこれらのクローンとは結合（ハイブリダイゼーション）できるストリン
ジェント条件下でオリゴヌクレオチドプローブまたはｃＤＮＡがライブラリーの
クローンにアニーリングすることにより典型的なライブラリースクリーニングを
達成する。典型的なハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェント条件
はある程度ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドプローブの大きさ（すなわち長さ
におけるヌクレオチド数）に、およびプローブが縮重であるかどうかに依存する
。クローンを得る可能性はまたハイブリダイゼーション溶液の設計においても考
慮される（すなわちｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーがスクリーニングされる
かどうか；それがｃＤＮＡライブラリーである場合、目的のｃＤＮＡが高レベル
で存在する可能性）。

【０１２９】 ＤＮＡフラグメント（例えばｃＤＮＡ）をプローブとして用いる場合、典型的
なハイブリダイゼーション条件にはＡｕｓｕｂｅｌら（編、前記で引用）が示し
た条件などがある。ハイブリダイゼーションの後いくつかの因子例えばプローブ
の大きさ、予測されるクローンに対するプローブの同一性、スクリーニングされ
るライブラリーの型、スクリーニングされるクローンの数等に依存した適当な厳
密性でライブラリーを含有するブロットを洗浄する。ストリンジェント洗浄溶液
の例は（これは通常イオン強度が低く、相対的に高温で使用される）以下のとお
りである。かかるストリンジェント洗浄の一つは５５ないし６５℃で０．０１５
Ｍ ＮａＣｌ、０．００５Ｍ クエン酸ナトリウムおよび０．１％ ＳＤＳであ
る。もう一つのかかるストリンジェントバッファーは４０ないし５０℃で１ｍＭ
Ｎａ_２ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＮａＨＰＯ_４、ｐＨ７．２および１％ ＳＤＳで
ある。さらに別のストリンジェント洗浄は５０ないし６５℃で０．２Ｘ ＳＳＣ
および０．１％ ＳＤＳである。

【０１３０】 オリゴヌクレオチドプローブを用いてｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをス
クリーニングするストリンジェント洗浄条件のための例示的なプロトコルもある
。例えば第１のプロトコルではプローブの長さに依存して約３５から６２℃の温
度で０．０５％ ピロリン酸ナトリウムを含む６Ｘ ＳＳＣを用いる。例えば１
４塩基のプローブは３５ないし４０℃で、１７塩基のプローブは４５ないし５０
℃で、２０塩基のプローブは５２ないし５７℃で、２３塩基のプローブは５７な
いし６３℃で洗浄する。バックグラウンドの非特異的結合が高いと思われる場合
は温度を２ないし３℃高くできる。第２のプロトコルでは洗浄に塩化テトラメチ
ルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を用いる。かかるストリンジェント洗浄溶液の一つ
は３Ｍ ＴＭＡＣ、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０および０．２％ Ｓ
ＤＳである。

【０１３１】 ＧＲＮＦ４タンパク質生成物をコードするポリヌクレオチド分子を得るための
別の適当な方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるものである。この方法
ではポリ（Ａ）＋ＲＮＡまたは全ＲＮＡをＧＲＮＦ４を発現する組織から抽出す
る。次いで逆転写酵素を用いてＲＮＡからｃＤＮＡを製造する（すなわちＲＴ−
ＰＣＲ）。次いで典型的にはＧＲＮＦ４ ｃＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）の２
個の別個の領域に相補的である２個のプライマーをＴａｑポリメラーゼのごとき
ポリメラーゼと共にｃＤＮＡに加え、ポリメラーゼが２個のプライマー間のｃＤ
ＮＡ領域を増幅する。

【０１３２】 望ましいＧＲＮＦ４タンパク質生成物をコードするＤＮＡを製造するための選
択方法においてオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを使用する必要が
ある場合（例えばＰＣＲ、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリースクリーニング）
、プローブまたはプライマーとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は適当な
長さで、ライブラリースクリーニングまたはＰＣＲ増幅の間に生じる非特異的結
合の量を最小限にすることが充分に明らかでなければならない。プローブまたは
プライマーの実際の配列は通常別の生物の同一または類似の遺伝子に由来する保
存されているかまたは高度に同一または相同な配列または領域、例えば本発明に
含まれるマウスポリヌクレオチド分子に基づく。プローブまたはプライマーは全
体的にまたは部分的縮重であってもよい、すなわちプローブ／プライマーの混合
物を含有し、全て同一のアミノ酸配列をコードするが、そのために異なるコドン
を用いていてもよい。縮重プローブを製造する代わりに種によって変化するこれ
らのコドン位置のいくつかまたは全てにイノシンを配置する。前記したＤＮＡの
化学的合成法によりオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを製造するこ
ともできる。

【０１３３】 ＧＲＮＦ４をコードするこれらのＤＮＡに基づくＧＲＮＦ４タンパク質生成物
には変異体または変種配列が含まれ、これもまた本発明により企図される。変異
体または変種配列には野生型配列と比較して一つまたはそれ以上のヌクレオチド
置換、欠失および／または挿入を含み、結果的に野生型アミノ酸配列と比較して
アミノ酸配列変種を発現するこれらの配列などがある。天然アレル変種の存在に
起因して、天然のＧＲＮＦ４アミノ酸変異体または変種が存在する場合もある。
かかる天然の変異体または変種に基づくＧＲＮＦ４タンパク質生成物は本発明に
より想定される。合成変異配列の製造もまた当該分野で周知であり、例えばＷｅ
ｌｌｓら（Ｇｅｎｅ，３４：３１５（１９８５））およびＳａｍｂｒｏｏｋら（
前記で引用）に記載されている。

【０１３４】 天然のＧＲＮＦ４タンパク質またはポリペプチドの変種を製造するのが望まし
い場合がある。位置指定変異誘発またはプライマーが望ましい点変異を有するＰ
ＣＲ増幅を用いて、（一つまたはそれ以上のヌクレオチドが野生型または天然の
ＧＲＮＦ４とは異なるように設計されている）ヌクレオチド変種を製造できる（
変異誘発技術に関してはＳａｍｂｒｏｏｋら、前記で引用、およびＡｕｓｕｂｅ
ｌら、前記で引用を参照のこと）。Ｅｎｇｅｌｓら（前記で引用）に記載される
方法を用いる化学合成を用いてかかる変種を製造することもできる。同様に当業
者に周知のその他の方法を用いてもよい。好ましいＤＮＡ変種は組換えによりＧ
ＲＮＦ４を生成するために用いられる宿主細胞においてコドン優先性の原因とな
るヌクレオチド置換を含有する変種である。その他の好ましい変種は野生型と比
較して保存アミノ酸変化（例えば天然のアミノ酸側鎖の電荷または極性が異なる
アミノ酸で置換されることにより実質的に変化していない）をコードする変種、
および／またはＧＲＮＦ４に新規グリコシル化および／またはリン酸化部位を生
じるように設計されているか、またはＧＲＮＦ４に既存のグリコシル化および／
またはリン酸化部位を削除するように設計されている変種である。さらに別の好
ましい変種は図に示すＧＲＮＦ４コンセンサス配列に基づくＧＲＮＦ４タンパク
質生成物をコードするこれらのＤＮＡである。

【０１３５】 ベクター さらにクローニング（ＤＮＡの増幅）および／または発現するために望ましい
ＧＲＮＦ４タンパク質生成物をコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡをベクタ
ーに挿入する。適当なベクターが市販により入手可能であるか、またはベクター
を特別に構築できる。可能なベクターにはコスミド、プラスミド、または修飾ウ
イルスなどがある（これらに限定するものではない）が、ベクター系は選択した
宿主細胞に適合しなければならない。かかるベクターにはプラスミド例えばブル
ースクリプト（登録商標）プラスミド誘導体（コピー数の多いＣｏｌＥ１基盤の
ファゲミド、ストラッタジーン・クローニング・システムズ・インコーポレーテ
ィッド、ラジョーラ、カリフォルニア州）、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ生成物をクローニ
ングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えばトポ（商標）
ＴＡクローニング（登録商標）キット、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘
導体、インビトローゲン、カルスバッド、カリフォルニア州）および哺乳動物、
酵母またはウイルスベクター例えばバキュロウイルス発現系（ｐＢａｃＰＡＫプ
ラスミド誘導体、クロンテック、パロアルト、カリフォルニア州）などがあるが
これらに限定するものではない。形質転換、トラスンフェクション、感染、エレ
クトロポレーションまたはその他の周知の技術により組換え分子を宿主細胞に導
入できる。

【０１３６】 例えば適当な宿主細胞を形質転換、トランスフェクト、または感染して多くの
ヌクレオチドコピーを作るために用いられるクローニングベクターにＧＲＮＦ４
をコードするＤＮＡを挿入する。これはＤＮＡフラグメントを相補的付着末端を
有するクローニングベクターにライゲートすることにより達成できる。ＤＮＡを
フラグメント化するために用いられる相補的制限部位がクローニングベクターに
存在しない場合、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に修飾できる。制限エンドヌクレア
ーゼ切断部位をポリメラーゼ連鎖反応に用いられるオリゴヌクレオチドプライマ
ーに組み込み、得られたポリヌクレオチド配列をベクターに挿入するのを容易に
することも有利であることが明らかになっている。別法として、ＤＮＡ末端にヌ
クレオチド配列（リンカー）をライゲートすることにより望ましいいずれかの部
位を作ることができ；これらのライゲートされたリンカーは特定の化学的に合成
された制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードするオリゴヌクレオチドを含ん
でなってよい。別法では、切断されたベクターおよびＧＲＮＦ４をコードするＤ
ＮＡをホモポリマーテーリングにより修飾できる。特定の実施形態では、単離さ
れたＧＲＮＦ４遺伝子、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ配列を組み込んだ組換えＤＮ
Ａ分子で宿主細胞を形質転換することにより遺伝子の複数のコピーを作ることが
できる。このように、形質転換体を成長させ、形質転換体から組換えＤＮＡ分子
を単離し、必要な場合、単離された組換えＤＮＡから挿入遺伝子を回収すること
により、ＧＲＮＦ４コード化ヌクレオチドを多量に入手することができる。

【０１３７】 適当なベクターの選択または構築は１）それをＤＮＡ増幅に用いるのか、また
はＤＮＡ発現に用いるのか、２）ベクターに挿入するＤＮＡの大きさ、および３
）ベクターで形質転換される宿主細胞（例えば哺乳動物、昆虫、酵母、菌類、植
物または細菌細胞）に依存する。各々のベクターはその機能（ＤＮＡの増幅また
はＤＮＡの発現）および用いる宿主細胞とのその適合性に依存して種々構成要素
を含有する。ＤＮＡ発現用のベクター構成要素には一つまたはそれ以上の：単一
の配列、複製起点、一つまたはそれ以上の選別またはマーカー遺伝子、エンハン
サーエレメント、プロモーター、転写終止配列等があるが、これらに限定するも
のではない。これらの構成要素は天然の供給源から入手できるか、または周知の
方法により合成できる。本発明のベクターには、一つまたはそれ以上の増幅、発
現調節、制御または選択された宿主細胞においてＤＮＡの増幅または発現を指向
、調節、またはそうでなければ影響することができる類似の機能的エレメントと
機能的に連結した、目的のＧＲＮＦ４タンパク質生成物をコードするＤＮＡなど
がある。

【０１３８】 ＧＲＮＦ４ ＤＮＡインサートを含有する発現ベクターを三つの一般的な研究
法により同定できる：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション；（ｂ）「
マーカー」遺伝子機能の存在または不在；および（ｃ）挿入された配列の発現。
第１の研究法では、挿入されたＧＲＮＦ４コード化分子に相同である配列を含ん
でなるプローブを用いてＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションにより発現ベク
ターに挿入された外来性ヌクレオチド配列の存在を検出できる。第２の研究法で
は、外来性ヌクレオチドのベクターへの挿入により誘起される特定の「マーカー
」遺伝子機能（例えばチミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する抵抗性、形質転
換表現型、バキュロウイルスにおける封入体形成等）の存在または不在に基づい
て、組換えベクター／宿主系を同定し選別できる。例えば、ＧＲＮＦ４コード化
配列をベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入した場合、マーカー遺伝子機能の
喪失によりＧＲＮＦ４インサートを含有する組換え体を同定できる。第３の研究
法では、組換えヌクレオチドにより発現される外来性分子の検出により組換え発
現ベクターを同定できる。かかるアッセイは発現されたＧＲＮＦ４タンパク質生
成物の物理的または機能的特性、例えばＧＲＮＦ４タンパク質生成物のＧＲＮＦ
４を直接認識する抗体との結合を基盤にすることができる。

【０１３９】 シグナル配列 シグナル配列をベクターの構成要素にできるかまたは、ベクターに挿入される
ＧＲＮＦ４ ＤＮＡの一部にできる。元来のＧＲＮＦ４ ＤＮＡはタンパク質の
アミノ末端でシグナル配列をコードし、これは分子の翻訳後プロセシングの間に
切断され、成熟ＧＲＮＦ４タンパク質生成物を形成する。元来のシグナル配列を
有するＧＲＮＦ４ヌクレオチドおよび元来のシグナル配列が欠失し、異種性のシ
グナル配列で置換されているＧＲＮＦ４ヌクレオチドは本発明の範囲内に包含さ
れる。選択される異種性シグナル配列は宿主細胞により認識され、プロセシング
される、すなわちシグナルペプチダーゼにより切断されるものでなければならな
い。元来のＧＲＮＦ４シグナル配列を認識してプロセシングすることがない原核
生物宿主細胞では、例えばアルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼまたは熱
安定性エンテロトキシンＩＩリーダーからなる群から選択される原核生物シグナ
ル配列によりシグナル配列が置換される。酵母分泌では元来のＧＲＮＦ４シグナ
ル配列が酵母インベルターゼ、アルファ因子または酸ホスファターゼリーダーに
より置換される。哺乳動物細胞発現では元来のシグナル配列で十分であるが、そ
の他の哺乳動物シグナル配列も適しているかもしれない。

【０１４０】 複製起源 発現およびクローニングベクターは一般に、ベクターが選択された１個以上の
宿主細胞にて複製できるようにするポリヌクレオチド分子を含む。クローニング
ベクターにおいて、この配列は通常、宿主染色体ＤＮＡとは無関係に複製できる
ようにする配列であり、複製起源または自律的複製配列を含む。このような配列
は各種の細菌、酵母およびウィルスで周知である。プラスミドｐＢＲ３２２（製
品番号３０３−３Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ベバリー、マ
サチューセッツ州）による複製起源は大半のグラム陰性細菌に適しており、各種
起源（たとえば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウィルス、水疱性口炎ウイルス
（ＶＳＶ）あるいは、ＨＰＶまたはＢＰＶなどの乳頭腫ウイルス）は哺乳類細胞
におけるベクターのクローニングに有用である。一般に哺乳類発言ベクターには
、複製起源成分は必要ない（たとえば、ＳＶ４０起源は、単に初期プロモータを
含むという理由だけでよく使用される）。

【０１４１】 選択遺伝子 発現およびクローニングベクターは選択遺伝子を含むことがある。この遺伝子
は、形質転換された宿主細胞を選択的培地中で培養する際に、その生存および増
殖に必要な「マーカー」タンパク質をコードする。ベクターによって形質転換さ
れていない宿主細胞は選択遺伝子を含まないため、培養液中では生存しない。典
型的な選択遺伝子は、（ａ）たとえばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキ
セートまたはテトラサイクリンなどの抗生物質または他の毒素に対する耐性を付
与し；（ｂ）栄養要求性欠乏症を保管し、または（ｃ）培地から得られない重要
な栄養素を供給するタンパク質をコードする。

【０１４２】 他の選択遺伝子は、発現される遺伝子の増幅に用いられることがある。増幅と
は、成長に欠かせないタンパク質の生成に非常に必要とされる遺伝子が、組換え
細胞の連続世代の染色体内でタンデムに反復されるプロセスである。哺乳類細胞
の適切な選択可能マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）お
よびチミジンキナーゼが挙げられる。哺乳類細胞の形質転換細胞は、ベクター内
に存在するマーカーにより、その形質転換細胞のみが唯一生存に適するという、
選択圧のもとに置かれている。選択圧は、培地中の選択薬剤の濃度が連続的に変
化し、その結果、選択遺伝子およびＧＲＮＦ４をコードするＤＮＡの両者が増幅
されるという条件の下で、形質変換細胞を培養することによって課せられる。

【０１４３】 たとえば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競
合的拮抗薬であるメトトレキセートを含む培養液中ですべての形質転換細胞を培
養することによって、最初に確認される。野生型ＤＨＦＲを使用する場合の適切
な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性欠乏性のチャイニーズハムスター卵巣細胞系である
（たとえば、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ、ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．，
７７（７）：４２１６−４２２０、１９８０を参照）。次に、形質変換細胞をレ
ベルを上昇させたメトトレキセートに曝露した。これにより、ＤＨＦＲ遺伝子の
複数のコピー、および付随的に、発現ベクター中に存在する、ＧＲＮＦタンパク
質生成物をコードするＤＮＡなど、他のＤＮＡの複数のコピーが合成される。

【０１４４】 プロモータ 本発明の発現およびクローニングベクターは通常、ホスト組織によって認識さ
れ、ＧＲＮＦ４タンパク質生成物をコードする分子に機能的に結合されるプロモ
ータを含む。プロモータとは、ＧＲＮＦ４をコードする配列のように、特定の分
子の転写および翻訳を制御する（一般に約１００〜１０００ｂｐ以内の）構造遺
伝子の開始コドンの上流（５’）に位置する非翻訳の配列である。プロモータは
従来、２種類のプロモータ、すなわち誘導プロモータおよび構成プロモータのど
ちらかに分類される。誘導プロモータは、栄養素の有無または温度変化などの培
養条件のある変化に対応して、制御下にあるＤＮＡから、上昇したレベルの転写
を開始する。各種の潜在的宿主細胞によって認識された、多数のプロモータが周
知である。これらのプロモータは、制限酵素消化によってソースＤＮＡからプロ
モータを除去し、ベクターに望ましいプロモータ配列を挿入することによって、
ＧＲＮＦ４をコードするＤＮＡに機能的に結合される。未変性のＧＲＮＦ４プロ
モータ配列を使用して、ＧＲＮＦ４ ＤＮＡの増幅および／または発現を指示す
ることもできる。しかし、未変性プロモータに比較して、転写が多く、発現タン
パク質の収率が高い場合、および使用するために選択された宿主細胞系に適合す
る場合は、非相同プロモータが好ましい。

【０１４５】 原核宿主と使用するのに適したプロモータとしては、β−ラクタマーゼおよび
ラクトースプロモータ系；アルカリホスフェターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）
プロモータ系；およびｔａｃプロモータなどのハイブリッドプロモータが挙げら
れる。他の周知のバクテリアプロモータも適している。その配列は公表されてい
るため、当業者は、必要な制限部位を供給するために必要に応じてリンカーまた
はアダプタを使用して、それらを望ましいＤＮＡ配列に連結することができる。

【０１４６】 酵母宿主とともに使用される適切な促進配列も当業界で周知である。酵母エン
ハンサは酵母プロモータとともに都合よく使用される。哺乳類宿主細胞とともに
使用される適切なプロモータは周知であり、ポリオーマウィルス、鶏痘ウィルス
、アデノウィルス（アデノウィルス２など）、ウシ乳頭腫ウィルス、鳥類肉腫ウ
ィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルスなどのウィ
ルス、最も好ましくはシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）のゲノムより得られた
プロモータを含む。他の適切な哺乳類プロモータとしては、たとえば熱ショック
プロモータおよびアクチンプロモータなどの非相同哺乳類プロモータが挙げられ
る。

【０１４７】 ＧＲＮＦ４発現の制御に関係するその他のプロモータとしては、これに限定さ
れるわけではないが、ＳＶ４０初期プロモータ領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ ａｎｄ
Ｃｈａｍｂｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２９０：３０４−３１０，１９８１）；ＣＭ
Ｖプロモータ；Ｒｏｕｓ肉腫ウィルスの３’末端反復配列（Ｙａｍａｍｏｔｏ，
ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７，１９８１）；ヘルペスチミジ
ンキナーゼプロモータ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．
，７８：１４４−１４４５，１９８１）；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（
Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２，１９８
２）；β−ラクタマーゼプロモータなどの原核発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａ
ｍａｒａｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７−３
７３１，１９７８）；またはｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，
ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：２１−２５，１９８３）が挙げられる。組織特
異性を示し、遺伝子導入動物で利用されている、以下の動物転写制御領域も関係
がある；膵臓腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗ
ｉｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３８；６３９−６４６，１９８４；Ｏｒｉｎ
ｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑ
ｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９，１９８６；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，
Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５，１９８７）；膵臓β細胞において
活性であるインシュリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３１
５：１１５−１２２，１９８５）；リンパ系細胞において活性である免疫グロブ
リン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３８：
６４７−６５８，１９８４；Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１
８：５３３−５３８，１９８５；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４，１９８７）；睾丸、胸部、リン
パ系およびマスト細胞において活性であるマウスマウス乳腺癌ウィルス制御領域
（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４５：４８５−４９５，１９８６）；
肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６，１９８７）；肝
臓において活性であるアルファフェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａ
ｕｆ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８，
１９８５；Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８
，１９８７）；肝臓において活性であるα ｌ−抗トリプシン遺伝子制御領域（
Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１
７１，１９８７）；骨髄細胞において活性であるβ−グロブリン遺伝子制御領域
（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０，１９
８５；Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４，１９８６
）；脳の希突起膠細胞において活性である骨髄塩基性タンパク質遺伝子制御領域
（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４８：７０３−７１２，１９８
７）；骨格筋において活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ．
Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−２８６，１９８５）；視床下部において活性で
あるゴナドロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−１３７８，１９８６）。

【０１４８】 エンハンサ要素 エンハンサ配列はベクター内に挿入して、高等真核生物による本発明のＧＲＮ
Ｆ４タンパク生成物をコードするＤＮＡの転写を増強できる。エンハンサは、通
常、長さが約１０−３００ｂｐのＤＮＡのｃｉｓ−作用要素であり、プロモータ
に作用して、その転写を増強する。エンハンサは比較的、方向および位置に依存
しない。エンハンサは転写単位に対して５’および３’であることがわかってい
る。哺乳類遺伝子から入手できるエンハンサ配列がいくつか周知である（たとえ
ばグロビン、エラスターゼ、アルブミン、αーフェト−タンパク質およびインシ
ュリン）。しかし一般に、ウィルスによるエンハンサが使用される。ＳＶ４０エ
ンハンサ、サイトメガロウィルス初期プロモータエンハンサ、ポリオーマエンハ
ンサ、アデノウィルスエンハンサは、真核プロモータの活性化のための促進要素
の例である。エンハンサはＧＲＡＮＦ４ＤＮＡに対して位置５’および３’でベ
クターにスプライスできるが、通常はプロモータより部位５’に配置される。

【０１４９】 転写停止 真核ホスト細胞で使用される発現ベクター（酵母、菌類、昆虫、植物、動物、
ヒト、または他の多細胞生物による有核細胞）も、転写の停止とｍＲＮＡの安定
化に必要な配列を含む。このような配列は、一般に真核ＤＮＡまたはｃＤＮＡの
５’、場合によっては３’非翻訳領域から得られる。これらの領域は、ＧＲＮＦ
４タンパク質生成物をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化断片
として転写されたヌクレオチド断片を含む。

【０１５０】 望ましいＧＲＮＦ４コード分子とともに、上に挙げた構成成分を１個以上含む
適切なベクターの構造は、標準連結法によって達成される。単離プラスミドまた
はＤＮＡ断片は好ましい順序で開裂、変更および再連結して、必要なプラスミド
を生成する。正しい配列が構成されたことを確認するために、連結混合物を使用
してＥ ｃｏｌｉを形質転換し、上述したようなアンピシリンまたはテトラサイ
クリン耐性などの、既知の手法によって正常な形質転換細胞を選択できる。次に
、形質転換細胞によるプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化によっ
て分析し、および／または配列して、望ましい作成物の存在を確認できる。

【０１５１】 哺乳類細胞におけるＧＲＮＦ４タンパク質生成物の過渡発現を行うベクターも
使用できる。一般に過渡発現は、宿主細胞によって発現ベクターの多くのコピー
が蓄積され、次に発現ベクターによってコードされた高レベルの望ましいタンパ
ク質が合成されるように、宿主細胞内で効率良く複製できる発現ベクターを使用
することを含む。適切な発現ベクターおよび宿主細胞より成る過渡発現システム
によって、クローンニングされたＤＮＡによってコードされたタンパク質を都合
よく陽性同定できることはもちろん、このようなタンパク質を好ましい生物学的
または生理学的特性についてスクリーニングすることもできる。したがって、過
渡発現システムは特に、タンパク質の変異体を同定するのに有用である。

【０１５２】 宿主細胞の選択および形質転換 組換えＧＲＮＦ４タンパク質生成物の発現に使用するためのポリヌクレオチド
分子によって形質転換された宿主細胞（たとえば細菌、哺乳類、昆虫、酵母また
は植物細胞）も本発明によって提供される。「宿主細胞」という語は、細胞によ
って発現される、選択された興味のある遺伝子を持つベクターによって形質転換
された細胞、または形質転換可能な細胞を呼ぶために用いる。この語は、子孫が
形態学または遺伝子構成が元の親細胞と同一であるかどうかにかかわらず、選択
された遺伝子が存在する限り、親細胞の子孫を含む。形質転換宿主細胞は、ヌク
レオチド配列の発現を可能にする適切な条件下で培養される。形質転換、培養、
増幅、スクリーニングおよび生成物製造および精製のための適切な宿主細胞およ
び方法の選択は、当業界で周知である。たとえば、Ｇｅｔｈｉｎｇ ａｎｄ Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ，Ｎａｔｕｒｅ ２９３：６２０−６２５（１９８１）、あるい
はＫａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５（７）：１
７５０−１７５９（１９８５）またはＨｏｗｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第
４，４１９，４４６号を参照すること。追加の典型的な物質および方法を本明細
書で述べる。形質転換された宿主細胞は適切な培地で培養し、次に、当業者に周
知の適切な手段によって、発現されたＧＲＮＦ４タンパク質生成物を随意に培地
から（または細胞内で発現された場合には細胞から）回収、単離および精製する
。

【０１５３】 種々の宿主細胞が、タンパク質の翻訳および翻訳後の処理および修飾（たとえ
ば、グリコシル化、開裂）のための特性および特定の機構を備えている。適切な
細胞系または宿主系を選択して、発現された異質タンパク質の望ましい修飾およ
び処理を行うことができる。たとえば、細菌系における発現を用いて、非グリコ
シル化コアタンパク質またはポリペプチドを生成することができる。酵母におけ
る発現を使用して、グリコシル化生成物を生成することができる。哺乳類細胞に
おける発現を使用して、非相同ＧＲＮＦ４タンパク質またはポリペプチドの未変
性グルコシル化を行うことができる。さらに、各種のベクター／宿主発現系は、
タンパク質分解開裂などの処理反応に、さまざまな程度の影響を与える。

【０１５４】 本明細書で開示されているベクターのクローニングまたは発現のための適切な
宿主細胞は、原核、酵母または高等真核細胞である。糸状菌または酵母などの真
核微生物は、ＧＲＮＦ４タンパク質生成物の発現に適した宿主となる。サッカロ
ミケス、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは一般のパン酵母は、下等真核宿主微生物の
中で最もよく使われるが、多くのその他の属、種および菌株が周知であり、一般
に入手できる。

【０１５５】 グルコシル化ＧＲＮＦ４タンパク質生成物の発現に使用される宿主細胞も、多
細胞生物に由来する。このような宿主細胞は、複雑な処理およびグリコシル化活
性が可能である。原則として、植物および昆虫細胞を含め、いずれの高等真核細
胞培養も、そのような培養が脊椎動物または無脊椎動物の細胞を含むかどうかに
かかわらず使用できる。培養における脊椎動物の繁殖（組織培養）は、周知の手
順である。有用な哺乳類宿主細胞系の例としては、これに限定されるわけではな
いが、ＳＶ４０（ＣＯＳ７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系、ヒト胎
腎臓系（懸濁培養で増殖させるためにサブクローニングした２９３または２９３
細胞）、ベビーハムスター腎臓系、チャイニーズハムスター卵巣細胞が挙げられ
る。他の適切な哺乳類細胞系としては、これに限定されるわけではないが、Ｈｅ
Ｌａ、マウスＬ−９２９細胞、スイス由来の３Ｔ３系、Ｂａｌｂ−ｃ、またはＮ
ＩＨマウス、ＢＨＫまたはＨａｋハムスター細胞系（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、ロックビル、メリー
ランド州）が挙げられる。これらの細胞系はそれぞれ、タンパク質発現の当業者
には周知であり、入手可能である。

【０１５６】 適切な宿主細胞には原核細胞も含まれる。原核宿主細胞としては、これに限定
されるわけではないが、たとえばＥ ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｉｌｉｓなどのＢａ
ｃｉｌｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒ
ｃｅｓｃａｎｓなどの、グラム陰性またはグラム陽性細胞などの細菌細胞が挙げ
られる。たとえば、Ｅ ｃｏｌｉの各種菌株（たとえばＨＢ１０１、ＤＨ５ａ、
ＤＨ１０、ＸＬ−１ブルーおよびＭＣ１０６１）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアル
ト、カリフォルニア州およびＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ、ラ・ホーヤ、カリフォルニ
ア州）は、バイオテクロノジーの分野では宿主細胞として周知である。ストレプ
トミセスｓｐｐなどの各種菌株も使用できる。ＧＲＮＦ４タンパク質生成物の生
成するための現在好ましい宿主細胞は、細菌細胞（たとえばＥｓｃｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）および哺乳類細胞（たとえば、チャイニーズハムスター卵巣細胞
、ＣＯＳ細胞など）。

【０１５７】 宿主細胞を上記の発現またはクローニングベクターを用いて形質移入、好まし
くは形質転換し、従来の培養液中で培養する。前記培養液は、プロモータを誘発
し、形質転換細胞を選択し、あるいは望ましい配列をコードする遺伝子を増幅す
るために、適切に改変してもよい。形質移入および形質転換は、当業者に周知で
あり、関係する宿主細胞に合うように選択した標準法を用いて実施する。たとえ
ば、細胞壁のない哺乳類細胞では、リン酸カルシウム沈殿法が使用できる。電気
穿孔、マイクロインジェクションおよびその他の既知の方法も使用できる。

【０１５８】 宿主細胞の培養 本発明のＧＲＮＦ４タンパク質生成物の生成に使用する形質転換細胞は、適切
な培地中で培養する。前記培地は必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成
長因子（インシュリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子など）、塩（塩化
ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸など）、緩衝液（ＨＥＰＥ
Ｓなど）、ヌクレオシド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ゲンタ
マイシンなど）、微量元素（通常、マイクロモルの範囲の最終濃度で存在する無
機化合物と定義される）、グルコースまたは他のエネルギー源を補充してもよい
。当業者に認識されるように、他の補充物を適切な濃度だけ含めてもよい。選択
した宿主細胞に使用するための温度、ｐＨなどの適切な培養条件も、当業者には
周知である。

【０１５９】 いったんＧＲＮＦ４タンパク質生成物が生成されたら、クロマトグラフィー（
たとえばイオン交換、親和性およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠
心分離、溶解度差を含む標準方法によって、またはタンパク質精製のためのその
他の標準法によって、単離および精製する。たとえばＧＲＮＦ４タンパク質生成
物は、固定担体に結合した抗ＧＲＮＦ４抗体より成る親和性カラムに結合させて
分離することができる。

【０１６０】 相同組換え さらに、相同組換えによって、あるいはＧＲＮＦ４をコードするＤＮＡをすで
に含んでいる細胞内に導入した制御要素を利用する組換え生成方法を用いて、Ｇ
ＲＮＦ４タンパク質生成物を生成することも想定されている。たとえば、相同組
換え方法を用いて、正常に転写された沈黙ＧＲＮＦ４遺伝子を含む、あるいは発
現遺伝子の下で、細胞を修飾して、ＧＲＮＦ４を発現する細胞を生成することが
できる。相同組換えは当初、転写活性遺伝子において変異を誘発または補正する
ための遺伝子を標的とするために開発された手法である（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａ
ｔｉ，Ｐｒｏｇ．ｉｎ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．３６：３０１，１９８９）。基本的な手法は、特定の変異を哺乳類ゲノムの
特定領域に導入する方法（Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４４：４１
９−４２８，１９８６；Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ
５１：５０３−５１２，１９８７；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮ
ＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８５８３−８５７８，１９８８）、または欠陥遺伝子
内の特定の変異を補正する方法（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３３０：５７６−５７８，１９７８）として開発された。相同組換え法
の例は、Ｕ．Ｓ．５，２７２，０７１（ＥＰ ９１ ９０ ３０５１，ＥＰ公開
第５０５ ５００号；ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２、国際公開 第ＷＯ ９
１／０９９５５号）に記載されている。

【０１６１】 相同組換えによって、ゲノム内に挿入されたＤＮＡ配列はターゲティングＤＮ
Ａに付着させて、関係する遺伝子の特定領域に方向付けられる。ターゲティング
ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの特定領域に対して相補的な（相同的な）ＤＮＡである
。ゲノムの特定領域に対して相補的なターゲティングＤＮＡの小片を、ＤＮＡ複
製プロセス時に親鎖に接触させて置く。ハイブリダイズし、そのために共有相同
領域を通じて外因性ＤＮＡの他の断片と再結合することは、細胞内に挿入された
ＤＮＡの一般的な特性である。この相補鎖が、変異またはＤＮＡの他の配列を含
むオリゴヌクレオチドに付着すると、組換えの結果として、これも新たに合成さ
れた鎖に組込まれる。プルーフリーディング機能の結果として、ＤＮＡの新しい
配列がテンプレートとして作用することが可能である。したがって、転写された
ＤＮＡはゲノムに組込まれる。

【０１６２】 本明細書で示したＧＲＮＦ４のヌクレオチド配列などの特定の遺伝子の配列が
既知である場合、遺伝子の選択領域に相補的なＥＤＮＡの断片を合成する、ある
いはそうでなければ、関係する領域に結合されているテク低の認識部位にて未変
性ＤＮＡを適切に制限することなどによって得ることができる。前記断片は、細
胞内に挿入された時点でターゲティング配列として作用し、ゲノム内で相同領域
に対してハイブリダイズする。ＤＮＡ複製の間にこのハイブリダイゼーションが
起こる場合、ＤＮＡのこの断片、およびそれに付着したすべての追加配列は、オ
カザキ断片として作用し、ＤＮＡの新たに合成された娘鎖内にバックスティッチ
される。したがって本発明は、ＧＲＮＦ４分子をコードするヌクレオチド配列を
含み、このヌクレオチドはターゲティング配列として使用されることがある。

【０１６３】 ターゲティングＤＮＡのこれらの断片に付着するのは、ＧＲＮＦ４タンパク質
生成物の発現と相互作用するＤＮＡの領域である。たとえば、プロモータ／エン
ハンサ要素、抑圧遺伝子、または外因性転写調節要素を、望ましいＧＲＮＦ４タ
ンパク質生成物をコードするＤＮＡの転写に影響を及ぼすために、対象とする宿
主細胞のゲノムの十分近くに挿入する。制御要素はＧＲＮＦ４をコードしないが
、代わりに宿主細胞ゲノムに存在するＤＮＡの一部を制御する。したがってＧＲ
ＮＦ４タンパク質生成物の発現は、ＧＲＮＦ４遺伝子自体をコードするＤＮＡの
形質移入によってではなく、むしろ、ＤＮＡ調節断片と結合した（関係する外因
性遺伝子と相同の領域を含む）ターゲティングＤＮＡの利用によって実施できる
。前記ＤＮＡ調節断片は、ＧＲＮＦ４タンパク質生成物の転写のための認識可能
な信号を持つ外因性遺伝子配列を与える。

【０１６４】 Ａ．ＧＲＮＦ４変異体 上述したように、本明細書で開示するＧＲＮＦ４タンパク質生成物は、図に示
したものを含め、天然ＧＲＮＦ４のアミノ酸配列からアミノ酸を欠失した（「欠
失変異体」）分子、前記アミノ酸配列にアミノ酸が挿入された（「付加変異体」
）分子あるいは前記アミノ酸配列内の残基と置換した（「置換変異体」）分子を
含む。このような変異体は、ＧＲＮＦ４分子をコードするＤＮＡへの適切なヌク
レオチド変化の導入か、望ましいタンパク質またはポリペプチドの生体外化学合
成によって調製する。当業者は、最終分子がＧＲＮＦ４活性を保持するという条
件で、成人ＧＲＮＦ４などのアミノ酸配列に対する欠失、挿入および置換の多く
の組合せが実施できることを認識するであろう。

【０１６５】 複数の種はもちろん、それに由来するコンセンサス配列による特定のアミノ酸
配列に関する本明細書の記述に基づいて、図に示したのものとは、１個以上の残
基の性質と位置が異なる一次配座を持つ、タンパク質生成物の組換え（たとえば
微生物の）発現への使用に適した各種ヌクレオチドを、ただちに設計および製造
できる。ヌクレオチドによってコードされる選択された１個以上のアミノ酸残基
を置換、挿入および欠失するための変異法は、当業者には周知である（たとえば
米国特許第４，５１８，５８４）。置換変異体の構造には、主に２つの変数があ
る：変異部位の位置と変異特性である。ＧＲＮＦ置換変異体を設計する場合、変
異部位および変異特性の選択は、修飾されるＧＲＮＦ４の性質によって変わる。
変異の部位は、たとえば（１）得られる結果によって、最初に保存するアミノ酸
修飾を、次にさらに遊離した選択を置換する、（２）標的のアミノ酸残基を欠失
する、または（３）アミノ酸残基を配置部位の隣に挿入することによって、個々
に、あるいは連続して変更することができる。１〜８の近接残基における保存的
変更が好ましい。タンパク質分解酵素によって、Ｎ−末端およびＣ−末端欠失Ｇ
ＲＮＦ４変異体も生成できる。

【０１６６】 ＧＲＮＦ４欠失変異体では、欠質は一般に約１〜８の近接残基の範囲であり、
さらに一般的には約１〜４の近接残基の範囲であり、典型的には１〜２の近接残
基の範囲である。Ｎ−末端、Ｃ−末端および内部配列内欠失が予測される。欠失
は、ＧＲＮＦ４の活性を変更するために、非ヒトＧＲＮＦ４との同一性の低い分
子の領域に導入できる。実質的に非ヒトＧＲＮＦ４配列と相同的な領域における
欠失は、ＧＲＮＦ４生理活性を大きく変更する傾向が強い。連続欠失の数は通常
、影響を受ける領域のＧＲＮＦ４タンパク質生成物の三次構造、たとえばシステ
イン架橋を保つように選択される。欠失変異体の非制限的な例としては、Ｎ−末
端またはＣ−末端アミノ酸残基を欠いた切断ＧＲＮＦ４分子が挙げられる。

【０１６７】 ＧＲＮＦ４付加変異体では、アミノ酸配列付加は通常、Ｎ−末端および／また
はＣ−末端融合、あるいは残基１個から１００個以上のアミノ酸残基を含むポリ
ペプチドの範囲にわたる末端付加はもちろん、１個または複数のアミノ酸残基の
内部または中間付加も含む。本発明のタンパク質生成物は、（望ましいポリペプ
チドの最初のアミノ酸残基に対して−１の位置に）初期メチオニンアミノ酸残基
を含むこともある。内部付加は一般に、約１〜８の近接残基の範囲であり、さら
に典型的には約１〜４の近接残基の範囲であり、通常は１〜２の近接残基の範囲
である。Ｎ−末端付加変異体の例としては、組換え宿主細胞から成熟ＧＲＮＦ４
の分泌を促進し、その結果、収集または生体利用度を向上させる、ＧＲＮＦ４の
Ｎ−末端に対する相同Ｎ−末端信号配列を含むＧＮＲＦ４が挙げられる。このよ
うな信号配列は一般に、対象とする宿主細胞種より得るために、前記宿主細胞種
と相同である。付加には、他の神経栄養性因子の配列由来のアミノ酸配列も含ま
れることがある。たとえば、ＧＦＮＦおよびＧＲＮＦ４またはｎｅｕｒｔｕｒｉ
ｎおよびＧＲＮＦ４の融合タンパク質は、連結配列の有無にかかわらず生成する
ため、単一分子の治療用要素が作成されるということが予想される。

【０１６８】 ＧＲＮＦ４置換変異体は、ＧＲＮＦ４の１個以上のアミノ酸残基が除去され、
その場所に別の残基が挿入されている。このような置換変異体としては、対立変
異体が挙げられる。対立変異体は、アミノ酸変化を生じたり、生じなかったりす
る、種の集合における天然ヌクレオチド配列変化を特徴としている。他の変異体
形と同様に、置換変異体は単一または近接アミノ酸残基の置換が１ヵ所以上で行
われる。

【０１６９】 ＧＲＮＦ４アミノ酸配列の特異的変異としては、グリコシル化部位への修飾が
挙げられる（たとえば、セリン、スレオニンまたはアスパラギン）。グリコシル
化または部分的なグルコシル化は、任意のアスパラギン連結グリコシル化認識部
位、またＯ−連結炭水化物の添加によって修飾される分子の任意の部位における
アミノ酸の置換または欠失が原因である。アスパラギン連結グルコシル化認識部
位は、適切な細胞グリコシル化酵素によって特異的に認識されるトリペプチド配
列より成る。これらのトリペプチド配列は、Ａｓｎ−Ｘａａ−ＴｈｒまたはＡｓ
ｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒであって、ＸａａはＰｒｏ以外のどのアミノ酸でもよい。グ
リコシル化認識部位の第１または第３アミノ酸位置の一方または両方における様
々なアミノ酸の置換または欠失（および／または第２位置におけるアミノ酸の欠
失）は、修飾トリペプチド配列における非グリコシル化を生じる。したがって、
適切な改変ヌクレオチド配列の発現は、その部位がグリコシル化されていない変
異体を生成する。あるいは、ＧＲＮＦ４アミノ酸配列を修飾して、グリコシル化
部位を付加することができる。

【０１７０】 ＧＲＮＦ４アミノ酸残基または領域の変異を識別するある方法は、Ｃｕｎｎｉ
ｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５，
１９８９）が述べるているように、「アラニン走査変異」と呼ばれる。この方法
では、アミノ酸残基または標的残基の基が識別され（たとえば、Ａｒｇ、Ａｓｐ
、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＧｌｕなどの荷電残基）、中性または負に荷電したアミ
ノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）によって置換されて、アミ
ノ酸と細胞内外の周囲の水性環境との相互作用に影響を与える。次に、置換に対
して機能感受性を示すこれらの領域は、置換部位に追加または代わりの残基を導
入することによって精製される。したがって、アミノ酸配列変異を導入する標的
部位が決定され、ＤＮＡ配列の該当する標的コドンまたは領域にてアラニン走査
またはランダム変異が実施され、発現されたＧＲＮＦ４変異体は望ましい活性お
よび活性の程度の最適な組み合わせについてスクリーニングされる。

【０１７１】 アミノ酸配列に対する保存的修飾（およびコードヌクレオチドに対する該当す
る修飾）は、天然ＧＲＮＦ４に似た機能的および化学的特性をもつＧＲＮＦ４タ
ンパク質を生成することが予想される。これに対して、ＧＲＮＦ４タンパク質生
成物の機能的および化学的特性における実質的な修飾は、（ａ）たとえばシート
またはらせん配座などの、置換領域における分子主鎖構造、（ｂ）標的部位にお
ける分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクの維持に対する影響が
著しく異なる置換を選択することによって行える。天然残基は、一般的な側鎖特
性に基づいて以下のグループに分けられる： １） 疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ ２） 中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ ３） 酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ ４） 塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ ５） 鎖の配向に影響を与える：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ ６） 芳香性：Ｔｒｙ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ 非保存的置換としては、これらのクラスの１個のメンバーを、別のクラスの他
のメンバーと交換することが挙げられる。このような置換残基は、非ヒトＧＲＮ
Ｆ４と相同性であるヒトＧＲＮＦ４分子の領域、あるいはその分子の非相同性領
域に導入できる。

【０１７２】 したがって、ＧＲＮＦ４タンパク質生成物は、図に示したアミノ酸配列の全部
または一部はもちろん、アミノ酸残基置換によって沈黙変化が生じるコンセンサ
スおよび修飾配列も含んでいる、これらの生理活性分子を含むことが想定される
。たとえば、配列内の１個以上のアミノ酸残基は、機能的に同等に作用する、同
様の極性を持つ別のアミノ酸と置換することが可能であり、沈黙変質が行われる
。配列内のアミノ酸置換は、配列内のアミノ酸の置換は、前記アミノ酸が属する
グラスの他のメンバーから選択される。たとえば、非極性（疎水性）アミノ酸と
しては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラ
ニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性の中性アミノ酸とし
ては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンお
よびグルタミンが挙げられる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アル
ギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負に荷電した（酸性）アミノ酸
としては、アスパラギン酸、グルタミン酸がある。ＧＲＮＦ４タンパク質生成物
は翻訳中または翻訳後に、たとえばリン酸化、グルコシル化、架橋、アシル化、
タンパク質開裂、抗体分子、膜分子または他のリガンドとの結合によって差次的
に修飾可能なことも予想される。

【０１７３】 Ｂ．ＧＲＮＦ４誘導体 ＧＲＮＦ４またはＧＲＮＦ４類似体の化学修飾された誘導体は、本開示に基づ
いて当業者によって調製される。誘導体化に最適な化学成分に、水溶性ポリマー
がある。水溶性ポリマーは、付着するタンパク質が、生理的環境などの水性環境
で沈殿しないため望ましい。ポリマーは、治療用生成物または組成物の調製のた
めに薬学的に許容可能であることが好ましい。当業者は、ポリマー／タンパク質
結合体が治療的に使用されるかどうか、使用される場合は望ましい投与量、循環
時間、タンパク質分解耐性などの考慮事項、およびその他の考慮事項に基づいて
、望ましいポリマーを選択することができる。誘導体化の有効性は、誘導体を望
ましい形（たとえば浸透圧ポンプによって、あるいはさらに好ましくは注射また
は点滴、あるいは経口、肺または他の送達経路用にさらに処方して）で投与し、
その有効性を判定することによって確認できる。

【０１７４】 適切な水溶性ポリマーとしては、これに限定されるわけではないが、ポリエチ
レングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カ
ルボキシメチルセルロース、デキトラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピ
ロリドン、ポリ−１，３−ジオキシラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エ
チレン／マレイン酸無水物コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはラン
ダムポリマー）、デキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレ
ングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／
エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（たとえばグリセ
ロール）、ポリビニルアルコール、およびその混合物が挙げられる。ポリエチレ
ングリコールプロピオンアルデヒドは水中における安定性のため、製造する際に
有利である。

【０１７５】 ポリマーは、いかなる分子量でもよく、分岐していても、分岐していなくても
よい。ポリエチレングリコールでは、好ましい分子量は、取り扱いおよび製造を
容易にするために約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａである（「約」という語は、ポリ
エチレングリコールの調製時に、一部の分子の重量が表示された分子量よりも大
きく、一部は小さいことを示す）。望ましい治療特性（たとえば望ましい徐放持
続時間；ある場合は、生理活性に対する影響；取り扱い易さ；抗原性の程度また
は欠如、治療用タンパク質または変異体に対するポリエチレングリコールのその
他の既知の影響）によって、他のサイズを使用してもよい。

【０１７６】 そのように付着するポリマー分子の数は変化させることも可能であり、当業技
術者は機能に対する影響を確認できる。モノ誘導化が可能であり、同一または異
なる化学成分（たとえば、分子量の異なるポリエチレングリコールなどのポリマ
ー）との誘導化のジ−、トリ−、テトラ−または他の組合せも行える。ポリマー
分子とタンパク質（またはポリペプチド）分子の比は、反応混合物中の濃度と同
様に変化する。一般に、最適比率（過剰な未反応タンパク質またはポリマーがな
い場合の反応有効性に関して）は、望ましい程度の誘導化（たとえばモノ、ジ−
、トリ−など）、選択したポリマーの分子量、ポリマーの分岐の有無、反応条件
などの因子によって決まる。

【０１７７】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学成分）は、タンパク質の機能ま
たは抗原領域に対する影響を考慮して、タンパク質に付着させる必要がある。当
業者は多数の付着方法を利用できる。たとえばＥＰ ０ ４０１ ３８４（ＰＥ
ＧのＧ−ＣＳＦへの結合）を参照、Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍ
ａｔｏｌ．２０：１０２８−１０３５、１９９２（塩化トレシルを使用したＧＭ
−ＣＳＦのレポーティングＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ））も参照。たとえ
ば、ポリエチレングリコールは、遊離アミノまたはカルボキシル基などの反応基
経由でアミノ酸残基によって、共有結合できる。反応基とは、活性化ポリエチレ
ングリコール分子が結合する基である。遊離アミノ基を持つアミノ酸残基は、リ
ジン残基およびＮ−末端アミノ酸残基を含むことがある。遊離カルボキシル基を
持つアミノ酸残基は、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、Ｃ−末端アミノ
酸残基が含むことがある。スルフヒドリル基も、ポリエチレングリコールを付着
させるための反応基として使用できる。治療目的のためには、Ｎ−末端またはリ
ジン木などのアミノ基における付着が好ましい。レセプター結合が好ましい場合
は、レセプター結合に重要な残基における付着は避ける必要がある。

【０１７８】 特にＮ−末端化学修飾タンパク質が望ましい。ポリエチレングリコールを本組
成物の例として使用する場合、各種のポリエチレングリコール分子（分子量、分
岐などによる）、反応混合物におけるポリエチレングリコール分子とタンパク質
（ペプチド）分子の比、実施されるｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ反応の種類、選択され
たＮ−末端ｐｅｇｙｌａｔｅｄタンパク質を得る方法から選択することができる
。Ｎ−末端ｐｅｇｙｌａｔｅｄ調合物を得る方法（すなわち、必要ならば他のモ
ノｐｅｇｙｌａｔｅｄ成分からこの成分を分離すること）は、Ｎ−末端ＰＥＧ化
物質をＰＥＧ化タンパク質分子の集合から精製することによる。選択的Ｎ−末端
化学修飾は、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な、異なる種類の１
級アミノ基の差別的反応性を利用する還元アルキル化によって実施できる。適切
な反応条件下では、ポリマーを含むカルボニル基を用いた、Ｎ−端末におけるタ
ンパク質の実質的な選択的誘導体化が実施される。たとえば、タンパク質のリジ
ン残基のｅ−アミノ基とＮ−末端残基のａ−アミノ基のｐＫａ差を利用可能なｐ
Ｈにて反応を行って、タンパク質を選択的にＮ端末ＰＥＧ化することができる。
このような選択的誘導体化によって、水溶性ポリマーのタンパク質への付着が制
御される：タンパク質のＮ−末端でポリマーとの結合が支配的に行われ、リジン
側鎖アミノ基などの他の反応基は著しく修飾されない。還元アルキル化を使用す
ると、水溶性ポリマーは上述の種類のポリマーであり、タンパク質に結合するた
めに１個の反応性アルデヒドを持つ必要がある。１個の反応性アルデヒドを含む
ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドを使用できる。

【０１７９】 本発明は、少なくとも１個のポリエチレングリコール分子に結合された原核発
現ＧＲＮＦ４である誘導体の使用はもちろん、アシルまたはアルキル結合によっ
て１個以上のポリエチレンに付着したＧＲＮＦ４の使用も検討する。

【０１８０】 ＰＥＧ化は、当業界で周知のどのＰＥＧ化反応によって実施してもよい。たと
えば：Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，３（２）：４−１０
，１９９２；ＥＰ ０ １５４ ３１６；ＥＰ ０ ４０１ ３８４；本明細書
で引用した、ＰＥＧ化に関係する他の文献を参照。ＰＥＧ化は、反応性ポリエチ
レングリコール分子（あるいは類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化また
はアルキル化によって実施できる。

【０１８１】 アシル化によるｐｅｇｙｌａｔｉｏｎは一般に、ポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）の活性エステル誘導体をＧＲＮＦ４分子と反応させることを含む。周知の
、またはその後発見された反応性ＰＥＧ分子を用いて、ＧＲＮＦ４のＰＥＧ化を
実施できる。好ましい活性化ＰＥＧエステルは、ＰＥＧエステル化されてＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）になる。本明細書で使用されているように、
「アシル化」は、以下の種類の、治療的タンパク質とＰＥＧなどの水溶性ポリマ
ー間の結合：アミド、カルバミン酸、ウレタンなどを制限なく含むことが予想さ
れている。Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０，１９９
４を参照。反応条件は、ＰＥＧ化の分野で既知の、またはその後開発された条件
から選択できるが、修飾されるＧＲＮＦタンパク質またはポリペプチドを不活性
化する温度、溶媒およびｐＨなどの条件を避ける必要がある。

【０１８２】 アシル化によるＰＥＧ化は、ポリＰＥＧ化ＧＲＮＦ４タンパク質生成物を一般
にもたらす。好ましくは、連結結合はアミドである。得られる生成物が、実質的
に（例えば、＞９５％）モノＰＥＧ化、ジＰＥＧ化またはトリＰＥＧ化されるだ
けであることもまた好ましい。しかし、ＰＥＧ化度がより大きないくつかの化学
種が、使用された特定の反応条件に依存する量で形成されることがある。所望す
る場合には、より精製されたＰＥＧ化種を、混合物から、特に未反応の化学種か
ら、標準的な精製技術によって分離することができる。そのような精製技術には
、特に、透析、塩析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロ
マトグラフィーおよび電気泳動が含まれる。

【０１８３】 アルキル化によるＰＥＧ化には、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体を還元剤の存
在下でＧＲＮＦ４と反応することが一般に含まれる。アルキル化によるＰＥＧ化
もまた、ポリＰＥＧ化ＧＲＮＦ４タンパク質生成物をもたらし得る。さらに、反
応条件を、ＧＲＮＦ４のＮ末端のａ−アミノ基でのみの実質的なＰＥＧ化（すな
わち、モノＰＥＧ化タンパク質）が有利であるように操作することができる。モ
ノＰＥＧ化またはポリＰＥＧ化のいずれかの場合においても、ＰＥＧ基は、好ま
しくは−ＣＨ_２−ＮＨ−基を介してタンパク質に結合している。−ＣＨ_２−基を
特に参照することにより、このタイプの結合は、本明細書中では「アルキル」結
合と呼ばれる。

【０１８４】 モノＰＥＧ化生成物を製造する還元的アルキル化による誘導体化には、誘導体
化のために利用できる異なるタイプの一級アミノ基（リシン対Ｎ末端）の特徴的
な反応性が利用される。反応は、リシン残基のｅ−アミノ基と、タンパク質のＮ
末端残基のａ−アミノ基のｐＫａとのｐＫａ差が利用できるようなｐＨで行われ
る。そのような選択的な誘導体化により、アルデヒドなどの反応性基を含有する
水溶性のポリマーのタンパク質への結合が制御される：ポリマーとの結合がタン
パク質のＮ末端で優勢的に生じ、リシンの側鎖アミノ基などの他の反応性基の著
しい修飾は生じない。１つの重要な局面において、本発明は、モノポリマー／Ｇ
ＲＮＦ４結合体分子（これは、ポリマー分子が１つの位置でのみ実質的に（すな
わち、＞９５％）結合しているＧＲＮＦ４タンパク質またはポリペプチドを意味
する）の実質的に均一な調製物の使用が考えられる。より詳細には、ポリエチレ
ングリコールが使用される場合、本発明はまた、抗原性と考えられる結合基を含
まずに、ポリエチレングリコール分子がＧＲＮＦ４タンパク質またはポリペプチ
ドに直接結合しているＰＥＧ化ＧＲＮＦ４タンパク質またはポリペプチドの使用
が考えられる。

【０１８５】 従って、本発明によるＧＲＮＦ４タンパク質生成物には、ＰＥＧ基（１つまた
は２つ以上）がアシル基またはアルキル基を介して結合しているＰＥＧ化ＧＲＮ
Ｆ４が含まれる。上記に議論されているように、そのような生成物は、モノＰＥ
Ｇ化またはポリＰＥＧ化され得る（例えば、２個〜６個のＰＥＧ基を含み、好ま
しくは２個〜５個のＰＥＧ基を含む）。ＰＥＧ基は、一般にはアミノ酸のａ−ア
ミノ基またはｅ−アミノ基においてタンパク質に結合するが、ＰＥＧ基を、タン
パク質に結合している任意のアミノ基に結合させ得ることもまた考えられる。そ
のようなアミノ基は十分な反応性であり、好適な反応条件のもとでＰＥＧ基に結
合するようになる。

【０１８６】 アシル化およびアルキル化の両方の方法において使用されるポリマー分子は、
上記に記載されているように水溶性ポリマーの中から選択することができる。選
択されたポリマーは、好ましくは、アシル化の場合には活性エステル、またはア
ルキル化の場合にはアルデヒドなどの単一の反応基を有するように修飾すること
が望ましく、その結果、ポリマー化度を、本発明の方法において提供されている
ように制御することができる。例示的な反応性ＰＥＧアルデヒドは、水溶性であ
るポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドであり、あるいはそのＣ１〜Ｃ
１０アルコキシ誘導体またはアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５
２，７１４号を参照のこと）。ポリマーは分枝状または非分枝状であり得る。ア
シル化反応の場合、選択されたポリマーは、単一の反応性エステル基を有するこ
とが望ましい。本発明の還元的アルキル化の場合、選択されたポリマーは、単一
の反応性アルデヒド基を有することが望ましい。一般に、水溶性ポリマーは、天
然に存在するグリコシル残基から選択されない。これらは、一般に、哺乳動物の
組換え発現システムによってより都合良く作製されるからである。ポリマーは任
意の分子量であってもよく、分枝状または非分枝状であり得る。

【０１８７】 本明細書中において使用される例示的な水溶性ポリマーはポリエチレングリコ
ールである。本明細書中で使用されるポリエチレングリコールは、モノ−（Ｃ１
〜Ｃ１０）アルコキシエチレングリコールまたはモノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アリー
ルオキシエチレングリコールなどの、他のタンパク質を誘導体化するために使用
されているＰＥＧの任意の形態を含むことを意味する。

【０１８８】 一般に、化学的な誘導体化は、生物学的に活性な物質を活性化ポリマー分子と
反応させるために使用される任意の好適な条件のもとで行うことができる。ＰＥ
Ｇ化ＧＲＮＦ４を調製する方法は、一般に、（ａ）ＧＲＮＦ４タンパク質または
ポリペプチドを、この分子が１つまたは２つ以上のＰＥＧ基に結合するようにな
る条件下でポリエチレングリコール（ＰＥＧの反応性のエステル誘導体またはア
ルデヒド誘導体など）と反応させる工程、および（ｂ）反応生成物を得る工程を
含む。一般に、アシル化反応に関して最適な反応条件は、知られているパラメー
ターおよび所望する結果に基づいて個々に決定される。例えば、ＰＥＧ：タンパ
ク質の比が大きいほど、ポリＰＥＧ化生成物の割合が大きくなる。

【０１８９】 モノポリマー／ＧＲＮＦ４の実質的に均一な集団を得る還元的アルキル化は、
一般に、（ａ）ＧＲＮＦ４タンパク質またはポリペプチドを、還元的アルキル化
条件下、ＧＲＮＦ４のアミノ末端におけるａ−アミノ基の選択的な修飾を可能に
する好適なｐＨで反応性ＰＥＧ分子と反応させる工程、および（ｂ）反応生成物
を得る工程を含む。

【０１９０】 モノポリマー／ＧＲＮＦ４の実質的に均一な集団の場合、還元的アルキル化反
応条件は、水溶性ポリマー成分がＧＲＮＦ４のＮ末端に選択的に結合することを
可能にする条件である。そのような反応条件は、一般に、リシンのアミノ基とＮ
末端におけるａ−アミノ基とのｐＫａ差から得られる（ｐＫａは、アミノ基の５
０％がプロトン化され、５０％がプロトン化されていないｐＨである）。ｐＨは
また、使用されるポリマー対タンパク質の比に影響する。一般に、ｐＨが低くな
ると、ポリマー対タンパク質のより大きな過剰が望ましくなる（すなわち、Ｎ末
端のａ−アミノ基の反応性が小さくなるほど、より多くのポリマーが、最適な条
件を達成するために必要となる）。ｐＨが高くなると、ポリマー：タンパク質の
比はそれほど大きくする必要はない（すなわち、より大きな反応性の基が得られ
、その結果、より少ないポリマー分子が必要となる）。本発明のためには、ｐＨ
は、一般には３〜９の範囲内であり、好ましくは３〜６の範囲内である。

【０１９１】 別の重要な検討項目はポリマーの分子量である。一般に、ポリマーの分子量が
大きくなるほど、少数のポリマー分子がタンパク質に結合し得る。同様に、これ
らのパラメーターを最適化するときには、ポリマーの分枝れを考慮に入れなけれ
ばならない。一般に、分子量（または分枝れ）が大きくなるほど、ポリマー：タ
ンパク質の比は大きくなる。一般に、本明細書中において考えられるＰＥＧ化反
応の場合、好ましい平均分子量は約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａである。好ましい
平均分子量は約１５ｋＤａ〜約５０ｋＤａであり、特に好ましくは約１２ｋＤａ
〜約２５ｋＤａである。水溶性ポリマー対ＧＲＮＦ４の比は、一般には１：１〜
１００：１の範囲であり、特に１：１〜２０：１（ポリＰＥＧ化の場合）および
１：１〜５：１（モノＰＥＧ化の場合）の範囲である。

【０１９２】 上記に示された条件を使用して、還元的アルキル化により、アミノ末端にａ−
アミノ基を有するＧＲＮＦ４分子へのポリマーの選択的な結合が得られ、そして
モノポリマー／ＧＲＮＦ４結合体の実質的に均一な調製物が得られる。用語「モ
ノポリマー／ＧＲＮＦ４結合体」は、この場合、１分子のＧＲＮＦ４に結合した
１つのポリマー分子から構成される組成物を意味するために使用されている。モ
ノポリマー／ＧＲＮＦ４結合体は、典型的には、リシンの側鎖アミノ基ではなく
、Ｎ末端に位置するポリマー分子を有する。この調製物は、一般に、モノポリマ
ー／ＧＲＮＦ４結合体が９０％を越え、より通常的にはモノポリマー／ＧＲＮＦ
４結合体が９５％を越え、残りの測定可能な分子は反応していない（すなわち、
ポリマー成分を有しないタンパク質）。ＧＲＮＦ４タンパク質生成物は、融合タ
ンパク質または結合したＧＲＮＦ４および神経栄養因子（ＧＲＮＦ４分子および
ＧＤＮＦ分子、またはＧＲＮＦ４分子およびニューチュリン分子など）を含むＰ
ＥＧ化分子の調製物を含み得ることもまた考えられる。

【０１９３】 本発明の還元的アルキル化の場合、還元剤は、水溶液中で安定でなければなら
ず、好ましくは、還元的アルキル化の初期過程において形成されるシッフ塩基の
みを還元し得ることが望ましい。好適な還元剤は、ホウ水素化ナトリウム、シア
ノホウ水素化ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボランおよ
びピリジンボランから選択することができる。特に好適な還元剤はシアノホウ水
素化ナトリウムである。他の反応パラメーター（溶媒、反応時間、温度など）、
および生成物の精製手段は、水溶性ポリマーによるタンパク質の誘導体化に関す
る発表された情報に基づいて個々に決定することができる（本明細書中に引用さ
れた刊行物を参照のこと）。

【０１９４】 Ｃ．ＧＲＮＦ４の薬学的組成物 ＧＲＮＦ４タンパク質生成物の薬学的組成物は、典型的には、投与様式との適
合性により選択された１つまたは２つ以上の薬学的または生理学的に許容可能な
配合用材料と混合された治療または予防に効果的な量のＧＲＮＦ４タンパク質生
成物を含む。本明細書中において使用されている「効果的な量」および「治療的
有効量」という用語は、本明細書中に示されているＧＲＮＦ４ポリペプチドの１
つまたは２つ以上の生物学的活性の測定可能なレベルを支持するために使用され
るＧＲＮＦ４ポリペプチド分子またはＧＲＮＦ４核酸分子の量をいう。好適な配
合用材料には、酸化防止剤、保存剤、着色剤、風味剤および希釈剤、乳化剤、懸
濁剤、溶媒、充填剤、増量剤、緩衝剤、送達用ビヒクル、希釈剤、または他の薬
学的な賦形剤もしくはアジュバントが含まれるが、これらに限定されない。例え
ば、好適なビヒクルは、非経口投与用の組成物に共通する他の物質を補充するこ
とができる注射用水、生理学的な生理食塩水溶液、または人工的な脳脊髄液であ
り得る。中性の緩衝化生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水
は、さらなる例示的なビヒクルである。本明細書中において使用されている用語
「薬学的に許容可能なキャリア」または用語「生理学的に許容可能なキャリア」
は、薬学的組成物としてのＧＲＮＦ４タンパク質生成物の送達を達成または増強
するのに好適な配合用材料をいう。

【０１９５】 ビヒクルにおける主要な溶媒は水性または非水性のいずれかであり得る。さら
に、ビヒクルは、配合物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明性、色、無菌性、安定性、
溶解速度または臭気を改変または維持するために他の配合用材料を含有すること
ができる。同様に、ビヒクルは、ＧＲＮＦ４タンパク質生成物の放出速度を改変
または維持するために、あるいはＧＲＮＦ４タンパク質生成物の吸収またはＧＲ
ＮＦ４タンパク質生成物の血液脳関門の通過を促進させるためにさらなる配合用
材料を含有することができる。

【０１９６】 治療的な薬学的組成物が一旦配合されると、薬学的組成物は、溶液、懸濁物、
ゲル、エマルション、固体あるいは脱水粉末または凍結乾燥粉末として無菌のバ
イアルで保存することができる。そのような配合物は、容易に使用できる形態、
あるいは投与前の再構成を必要とする形態（例えば、凍結乾燥された形態）のい
ずれかで保存することができる。

【０１９７】 最適な薬学的配合物は、目的とする投与経路、送達様式および所望する投薬量
に依存して当業者により決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（１９９０、Ｍａｃｋ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ １８０４２）、１４５３
頁〜１７１２頁を参照のこと。そのような組成物は、本発明のＧＲＮＦ４タンパ
ク質生成物の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、およびインビボでの
クリアランス速度に影響を及ぼし得る。

【０１９８】 （１）徐放性配合物、（２）吸入用ミスト、または（３）経口的に活性な配合
物などの効果的な投与形態物が考えられる。ＧＲＮＦ４タンパク質生成物の薬学
的組成物はまた、非経口投与のために配合することができる。そのような非経口
的に投与される治療的組成物は、典型的には、パイロジェンを含まず、ＧＲＮＦ
４タンパク質生成物を薬学的に許容可能なビヒクルに含む非経口的に許容可能な
水溶液の形態である。１つの好ましいビヒクルは生理学的な生理食塩水である。
ＧＲＮＦ４タンパク質生成物の薬学的組成物はまた、ポリ乳酸、ポリグリコール
酸などのポリマー化合物の粒状調製物をリポソーム内に含ませることができる。
ヒアルロン酸もまた使用することができ、これは、循環における持続した継続を
促進する効果を有し得る。

【０１９９】 非経口的な注入に関して特に好適なビヒクルは、ＧＲＮＦ４タンパク質生成物
が無菌の等張溶液として配合され、適正に保存される無菌の蒸留水である。さら
に別の調製には、タンパク質生成物の制御された放出または持続した放出をもた
らし、注入可能なマイクロスフェア、生分解性の粒子またはビーズ、あるいはリ
ポソームなどの薬剤とともにＧＲＮＦ４タンパク質生成物を配合することが含ま
れ得る。この場合、これらはデポ注入物として送達され得る。ＧＲＮＦ４タンパ
ク質生成物の導入に関する他の好適な手段には、ＧＲＮＦ４タンパク質生成物を
含有する埋め込み可能な薬物送達デバイスが含まれる。

【０２００】 本発明の調製物は、当分野でよく知られているような他の成分を含むことがで
き、例えば、非経口的に許容可能な保存剤、張性剤、共溶媒、湿潤化剤、錯化剤
、緩衝化剤、抗菌剤、酸化防止剤および界面活性剤を含むことができる。例えば
、好適な張性増強剤には、ハロゲン化アルカリ金属（好ましくは、塩化ナトリウ
ムまたは塩化カリウム）、マンニトールおよびソルビトールなどが含まれる。好
適な保存剤には、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、フェネチルアルコール
、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジンおよびソルビン酸など
が含まれるが、これらに限定されない。過酸化水素もまた保存剤として使用する
ことができる。好適な共溶媒は、例えば、グリセリン、プロピレングリコールお
よびポリエチレングリコールである。好適な錯化剤は、例えば、カフェイン、ポ
リビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−
シクロデキストリンである。好適な界面活性剤または湿潤化剤には、ソルビタン
エステル、ポリソルベート８０などのポリソルベート、トロメタミン、レシチン
、コレステロールおよびチロキサパルなどが含まれる。緩衝剤は、ホウ酸塩、ク
エン酸塩、リン酸塩、重炭酸塩またはＴｒｉｓ−ＨＣｌなどの従来の緩衝剤であ
り得る。

【０２０１】 配合成分は、投与部位に許容可能な濃度で存在する。例えば、緩衝剤は、組成
物を、生理学的なｐＨあるいはわずかに低いｐＨで、典型的には約５から約８ま
でのｐＨ範囲に維持するために使用される。

【０２０２】 薬学的組成物は吸入用に配合することができる。例えば、ＧＲＮＦ４タンパク
質生成物は吸入用の乾燥粉末として配合することができる。ＧＲＮＦ４タンパク
質生成物の吸入用溶液もまた、エアロゾル送達用の液化噴射剤中に配合すること
ができる。さらに別の配合物においては、溶液を霧化することができる。

【０２０３】 ＧＲＮＦ４タンパク質生成物を含有するある種の配合物は経口投与できること
もまた考えられる。この様式で投与されるＧＲＮＦ４タンパク質生成物は、錠剤
およびカプセル剤などの固体の投薬形態の配合において従来的に使用されている
そのようなキャリアとともに、あるいはキャリアの非存在下で配合することがで
きる。例えば、カプセル剤は、配合物の活性部分が胃腸管内の所定のところで放
出されるように設計することができ、その際、生物利用性が最大にされ、全身以
前での分解が最小限にされる。さらなる配合用材料を、ＧＲＮＦ４タンパク質生
成物の吸収を促進させるために含ませることができる。希釈剤、風味剤、低融点
ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤および結合剤もまた用いること
ができる。

【０２０４】 別の調製物は、効果的な量のＧＲＮＦ４タンパク質生成物を、錠剤の製造に好
適な非毒性の賦形剤との混合物で含むことができる。錠剤を無菌水または他の適
切なビヒクルに溶解することによって、溶液剤を単位用量形態で調製することが
できる。好適な賦形剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムまたは重炭酸ナト
リウム、ラクトース、またはリン酸カルシウムなどの不活性な希釈剤；デンプン
、ゼラチンまたはアラビアゴムなどの結合剤；あるいはステアリン酸マグネシウ
ム、ステアリン酸またはタルクなどの滑沢剤が含まれるが、これらに限定されな
い。

【０２０５】 ＧＲＮＦ４タンパク質生成物のさらなる配合物が当業者には明かであり、これ
には、ＧＲＮＦ４タンパク質生成物を１つまたは２つ以上の神経栄養因子との組
合せで含む配合物が含まれる。リポソームキャリア、生分解性マイクロ粒子また
は多孔性ビーズおよびデポ注入剤などの様々な他の持続送達手段または制御送達
手段を配合する手段もまた当業者には知られている。例えば、薬学的組成物の送
達に関する放出が制御された多孔性ポリマーマイクロ粒子のＳｕｐｅｒｓａｘｏ
他の記載（国際特許公開第ＷＯ９３／１５７２２号；国際特許出願第ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ９３／００８２９号）を参照のこと。

【０２０６】 Ｄ．ＧＲＮＦ４の投与 ＧＲＮＦ４タンパク質生成物は、皮下送達、筋肉内送達、静脈内送達、経肺的
送達、経皮的送達、髄膜内送達および脳内送達を含む様々な経路によって非経口
的に投与することができる。さらに、血液脳関門を容易に通過しない分子は、脳
内に直接投与することができ、あるいはそうでなければ、そのような分子を輸送
して関門を通過させる他のエレメントと組み合わせて投与することができる。例
えば、ＧＲＮＦ４タンパク質生成物は、脳室内に、あるいは脳または脊髄のくも
膜下空間に投与することができる。ＧＲＮＦ４タンパク質生成物はまた、脳実質
組織内に直接脳内投与することができる。ＧＲＮＦ４タンパク質生成物は、血液
脳関門を通過するように化学修飾またはパッケージされた形態で、あるいはＧＲ
ＮＦ４タンパク質生成物の関門進入を促進し得る１つまたは２つ以上の薬剤とと
もに脳外に投与することができる。例えば、ＮＧＦとモノクローナル抗トランス
フェリン受容体抗体との結合体は、トランスフェリン受容体への結合を介して脳
に輸送されることが示されている。

【０２０７】 ＧＲＮＦ４タンパク質生成物の所望するレベルを達成するために、反復した毎
日の注射物または低頻度の注射物を投与することができ、あるいはＧＲＮＦ４タ
ンパク質生成物は、定流量埋め込みポンプまたは流量プログラム可能な埋め込み
ポンプから連続的または定期的に注入することができる。生分解性ポリマーマト
リックスに埋め込まれた神経栄養因子を含有する緩速放出性埋め込み物もまた、
ＧＲＮＦ４タンパク質生成物を送達することができる。投薬頻度は、配合された
ＧＲＮＦ４タンパク質生成物の薬物動態学的パラメーターならびに投与経路およ
び投与部位に依存する。

【０２０８】 投与様式に関わらず、特定の用量を、体重、体表面積または臓器サイズに従っ
て計算することができる。上記に言及された配合物のそれぞれを含む適切な処置
投薬量を決定するために必要な計算のさらなる精密化は、当業者により日常的に
行われ、そして当業者が日常的に行う作業の範囲に含まれる。適切な投薬量は、
適切な用量応答データを使用することにより確認することができる。

【０２０９】 特定の傷害または状態を処置する方法に含まれる投薬計画は主治医によって決
定される。一般に、ＧＲＮＦ４タンパク質生成物の効果的な量は、薬物の作用を
変える様々な要因、例えば、患者の年齢、状態、体重、性別および食事、何らか
の感染の重篤度、投与時期および他の臨床的要因を考慮することによって決定さ
れる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ（上記）の６９７頁〜７７３頁を参照のこと。例えば、ＧＦＲα−３がＧＲ
ＮＦ４作用を増強するために使用される場合、ＧＦＲα−３の用量は、ＧＲＮＦ
４治療に必要とされる用量に類似するように選択されることが考えられる。ＧＦ
Ｒα−３がＧＲＮＦ４作用を中和するために使用される場合、ＧＦＲα−３の用
量はＧＲＮＦ４の用量の数倍にされる。投薬は、１日に１回または数回とするこ
とができ、あるいはより少なくすることができ、そして本明細書中に記載されて
いるように他の組成物との組合せにすることができる。本発明は、本明細書中に
示されている投薬に限定されないことに留意しなければならない。

【０２１０】 ＧＲＮＦ４タンパク質産物の連続的な投与または維持送達は、従来の治療に対
して利点がある可能性があることが想像される。連続的な投与を、浸潤ポンプの
ような機械的手段を介して行ってよい一方で、連続的または連続的に近い投与の
他の方法を実施してもよいことが企図される。たとえば、化学的誘導またはカプ
セル挿入が、結果として、決定した用量計画に基づいて予想可能な量で、血流中
に連続的に存在させる効果を持つ、分子の保持放出形態となりうる。したがって
、ＧＲＮＦ４タンパク質産物には、誘導された、またさもなければ、そのような
連続投与を実施するように処方されたタンパク質が含まれる。ＧＲＮＦ４の徐放
性形態は、望ましい１日または１週間の効果的用量を提供するように処方されう
る。

【０２１１】 ＧＲＮＦ４タンパク質産物が、ＧＤＮＦおよび／またはニューロチュリンとの
結合形態で投与してよいことがさらに企図される。あるいは、ＧＲＮＦ４タンパ
ク質産物は、連続的にまたは同時に、神経組織栄養因子とは別に投与してもよい
。

【０２１２】 以上で言及したように、さらなる神経組織栄養またはニューロン栄養因子が、
いくつかのニューロン細胞集団または傷または疾患のいくつかの型を処理するの
に有用であるか必要である可能性があることも企図される。ＧＲＮＦ４、または
ＧＲＮＦ４とＧＤＮＦ、ペルセフィンまたはニューロチュリンのような神経組織
栄養因子との組合せと共にで使用してよい他の因子には、インシュリン、インシ
ュリン様増殖因子、上皮増殖因子、血管作用性増殖因子、下垂体アデニル酸シク
ラーゼ活性化ポリペプチド、インターフェロンおよびソマトスタチンのようなマ
イトジェン、神経増殖因子、脳誘導神経組織栄養因子、ニューロトロフィン−３
、ニューロトロフィン−４／５、ニューロトロフィン−６、インシュリン様増殖
因子、毛様体神経組織栄養因子、酸性または塩基性繊維芽細胞増殖因子、繊維芽
細胞増殖因子−５、トランスホーミング増殖因子−β、コカイン−アンフェタミ
ン調節転写物（ＣＡＲＴ）のような神経組織栄養因子、および上皮増殖因子、白
血病阻害因子、インターロイキン、インターフェロン、およびコロニー刺激因子
のような他の増殖因子、またこれらの因子と機能的に同等な分子および物質が含
まれるが、これらに限定はしない。

【０２１３】 本明細書で記述したように、ＧＲＮＦ４は、特定の神経集団の変性の結果であ
る、パーキンソン病、アルツハイマー病およびＡＬＳを含む神経変性疾病の処置
で使用してよい。さらに、ＧＲＮＦ４タンパク質産物は、（１）軸索工程および
／または傷部位近くの神経細胞体の変性を引き起こす、物理的傷、（２）発作で
のような、神経系の部分への血流の一過性または永久乾酪変性、（３）たとえば
癌の処置のための化学治療剤（たとえばシスプラチン）またはＡＩＤＳの処置の
ためのジデオキシシチジン（ｄｄＣ）のような意図的または偶発的な神経毒への
曝露、（４）糖尿病または腎不全を含む慢性代謝疾患による、１つまたはそれ以
上の型の神経細胞に起こる可能性のある神経障害の処置で使用してよい。ＧＲＮ
Ｆ４はまた、末梢感覚神経障害または末梢交感神経を異常に機能化することに関
連した神経学的疾病の処置で使用してもよい。ＧＲＮＦ４を、骨粗鬆症、骨形成
不全症または悪性疾患のカルシウム過剰血症のような骨欠失に関連する疾患を処
置するのに使用してよいことも企図される。

【０２１４】 Ｅ．ＧＲＮＦ４細胞治療および遺伝子治療 ＧＲＮＦ４細胞治療、たとえばＧＲＮＦ４産生細胞の移植などもまた企図され
る。この実施形態には、ＧＲＮＦ４の生物学的な活性形態を合成し、分泌するこ
とが可能である患者細胞への移植が含まれる。そのようなＧＲＮＦ４−産生細胞
は、ＧＲＮＦ４の天然のプロデューサーである細胞であってよく、またはそのＧ
ＲＮＦ４を産生する能力が、望ましいＧＲＮＦ４分子をコードしている遺伝子の
形質転換によって増加した組換え細胞であってよい。そのような改変は、遺伝子
を送達するのに、およびその発現および分泌を促進する好適なベクターの使用に
よって行ってよい。ＧＲＮＦ４タンパク質または外来種のポリペプチドを投与し
た患者での潜在的な免疫学的反応を最小化するために、ＧＲＮＦ４を産生してい
る天然の細胞が、ヒト由来であり、ヒトＧＮＲＦ４を産生するのが好ましい。同
様に、ＧＲＮＦ４を産生している組換え体細胞に、ヒトＧＲＮＦ４分子をコード
している遺伝子を含んでいる発現ベクターを形質導入することが好ましい。

【０２１５】 移植した細胞は、周囲の組織の浸潤をさけるためにカプセルに封入してよい。
ヒトまたは非ヒト動物細胞は、ＧＲＮＦ４の放出を許容し、しかし患者の免疫系
または他の周囲の組織からの有害な因子による細胞の破壊を防ぐ生体適合性の、
半透性重合封入または膜で患者に移植してよい。あるいは、ｅｘ ｖｉｖｏでＧ
ＲＮＦ４を産生するように形質導入した患者の固有の細胞は、そのようなカプセ
ル挿入なしに、患者に直接移植できる。

【０２１６】 生細胞のカプセル封入のための技術は当業者に熟知されたものであり、カプセ
ル封入した細胞の調製およびその患者への移植は、過度の実験なしに行ってよい
。たとえば、Ｂａｅｔｇｅ ｅｔ ａｌ．（国際公開番号第ＷＯ９５／０５４５
２号、国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９）は、生物学的な活性物質の効
果的な送達のための遺伝子的に作製した細胞を含む膜カプセルを記述している。
カプセルは、生体適合性であり、簡単に回収できる。カプセルは、哺乳動物宿主
内への移植に際し、ｉｎ ｖｉｖｏでのダウンレギュレーションを受けないよう
なプロモーターと機能的に連結した、生物学的な活性分子をコードしているＤＮ
Ａ配列を含む組換え体ＤＮＡ分子をトランスフェクトした細胞を封入する。生細
胞からの分子の患者内の特定の部位への送達のために方法が提供される。さらに
、米国特許第４，８９２，５３８号、第５，０１１，４７２号、第５，１０６，
６２７号を参照のこと。生細胞をカプセル封入するための系は、Ａｅｂｉｓｃｈ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．のＰＣＴ出願第ＷＯ９１／１０４２５号に記述されている。
またＡｅｂｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．のＰＣＴ明細書第ＷＯ９１／１０４７０
号、Ｗｉｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１３：３２２−３２
９，１９９１、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ
．１１１；２６９−２７５，１９９１、Ｔｒｅｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，ＡＳＡＩ
Ｏ ３８：１７−２３，１９９２を参照のこと。

【０２１７】 ＧＲＮＦ４のｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子治療送達がま
た構想される。ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療は、ポリヌクレオチド分子の局所注入
または他の適切な送達ベクターを介して細胞内にＧＲＮＦ４をコードしている遺
伝子を導入することで行ってよい（Ｈｅｆｔｉ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
２５：１４１８−１４３５，１９９４）。たとえば、ＧＲＮＦ４をコードして
いるポリヌクレオチド分子は、標的細胞内への送達のためのアデノ関連ウイルス
ベクター内に含まれてよい（たとえば、Ｊｏｈｎｓｏｎ、国際公開明細書第ＷＯ
９５／３４６７０号、国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８号）。組換え体
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムは、機能的なプロモーターおよびポリアデ
ニル化配列に機能的に結合した神経組織栄養因子をコードしているＤＮＡ配列に
隣接したＡＡＶ転化末端繰り返しを含む。

【０２１８】 他のウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペス
ウイルスおよびパピローマウイルスベクターが含まれるが限定はされない。米国
特許第５，６７２，３４４号（ミシガン大学、Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．に付
与され、１９９７年９月３０日に発行された）は、組換え体神経組織栄養ＨＳＶ
−１ベクターを含むｉｎ ｖｉｖｏウイルス仲介遺伝子送達系を開示している。
米国特許第５，３９９，３４６号（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｐａ
ｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓに
付与され、１９９５年３月２１日に発行された）は、治療的タンパク質をコード
しているＤＮＡセグメントを挿入するようにｉｎ ｖｉｔｒｏで処理したヒト細
胞の送達によって治療的タンパク質を患者に提供するための工程の例を提供して
いる。遺伝子治療技術の実施のためのさらなる方法および物質は、アデノウイル
スベクターを含む米国特許第５，６３１，２３６号（Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂ
ａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９７年５月２０日
に発行）、レトロウイルスベクターを含む米国特許第５，６７２，５１０号（Ｅ
ｇｌｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｉｎｃ．、１
９９７年９月３０日に発行）、およびサイトカインを発現しているレトロウイル
スベクターを含む米国特許第５，６３５，３９９号（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ ｅｔ
ａｌ．，Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、１９９７年６月３日に発行）
で記述されている。

【０２１９】 非ウイルス送達方法には、リポソーム仲介送達、裸ＤＮＡ送達（直接注入）、
レセプター仲介送達（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リ
ン酸カルシウム沈殿および微少粒子衝撃（たとえば遺伝子ガン）が含まれる。遺
伝子治療物質および方法にはまた、誘導可能プロモーター、組織特異的エンハン
サー−プロモーター、部位特異的挿入のために設計したＤＮＡ配列、親細胞より
も選択的な利点を提供可能なＤＮＡ配列、形質導入した細胞を同定するための標
識、ネガティブ選択系および発現対照系（安全性測定）、細胞特異的結合剤（細
胞標的に対して）、細胞特異的内面化因子、ベクターおよびベクター作製の方法
による発現を促進するための転写因子を含んでよい。遺伝子治療技術の実施のた
めのそのようなさらなる方法および材料は、エレクトロポレーション技術、米国
特許第４，９７０，１５４号（Ｄ．Ｃ．Ｃｈａｎｇ，Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅ
ｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９０年１１月１３日に発行された）、核リ
ガンド、第ＷＯ９６４０９５８号（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｙｌｏｒ
Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、９６１２２１９に発行）、遺伝子送
達のためのリポタンパク質含有系に関する米国特許第５，６７９，５５９号（Ｋ
ｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、１９９７年１０月２１日に発行された）、リポソー
ム担体を含む米国特許第５，６７６，９５４号（Ｋ．Ｌ．Ｂｒｉｇｈａｍ，Ｖａ
ｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、１９９７年１０月１４日に発行）、
リン酸カルシウムトランスフェクト方法に関する米国特許第５，５９３，８７５
号（Ｗｕｒｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、１９９７年１月
１４日に発行）、および生物学的に活性な粒子を、粒子が細胞の表面に浸潤し、
細胞の内部に挿入されるようになる速度で細胞に推進する、米国特許第４，９４
５，０５０号（Ｓａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、１９９０年７月３１日に発行）で記述されている
。発現制御技術には、化学的誘導調節（たとえば第ＷＯ９６４１８６５およびＷ
Ｏ９７３１８９９）、改変ステロイドホルモンレセプター系でのプロゲステロン
アンタゴニストの使用（たとえば米国特許第５，３６４，７９１号）、エクジソ
ン制御系（たとえば第ＷＯ９６３７６０９号）、陽性テトラサイクリン制御可能
トランスアクティベイター（たとえば米国特許第５，５８９，３６２号、米国特
許第５，６５０，２９８号、および米国特許第５，６５４，１６８号）が含まれ
る。用語「ベクター」が、本明細書で、宿主細胞にコードしている情報を送達す
るのに使用した任意の分子（たとえば核酸、プラスミド、ウイルスまたは非ウイ
ルス物質）を表すのに使用されていることは、当業者によって理解されるであろ
う。

【０２２０】 ＧＲＮＦ４遺伝子治療または細胞治療が、さらに、第二神経栄養因子の送達を
含んでよいことも企図される。たとえば、宿主細胞はＧＲＮＦ４およびＧＤＮＦ
、またはＧＲＮＦ４およびニューロチュリン両方を発現し、放出するように改変
してよい。またはＧＲＮＦ４およびＧＤＮＦ、またはＧＲＮＦ４およびニューロ
チュリンは、別々の細胞で発現し、放出されてよい。そのような細胞は、別々に
患者に導入してよく、または細胞は上記のカプセル封入膜のような単一の移植手
段を含んでよい。

【０２２１】 本明細書で記述したＧＲＮＦ４処方は、ヒト適用と同様に獣医学で使用してよ
く、用語「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」は限定して解釈されるべきでないことを考
慮すべきである。獣医学適用での場合、用量範囲は上記のように決定してよい。

【０２２２】 実施例 実施例１ ｃＤＮＡライブラリーの構築 ｃＤＮＡライブラリーをオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）欠損マウスの骨を使
用して構築した。トータルＲＮＡをＯＰＧノックアウトマウスの大腿骨および脛
骨から単離した。骨を６週齢メスマウスより切り出し、筋肉および結合組織を取
り除いてきれいにした。骨を、７．２μｌ β−メルカプトエタノールを使用し
たそれぞれの１ｍｌ緩衝液に加えて、ＰｈａｒｍａｃｉａのＲＮＡ Ｅｘｔｒａ
ｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（製品番号２７−９２７０−０１、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅ
ｙ，ＵＳＡ）からの抽出緩衝液中で、Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザーによって
ホモジネートした。ホモジナイズの後、不溶性物質を１５℃にて２０分間、５，
０００ｇ回転で沈殿させた。上清を、ポリアロマーチューブ（製品番号３３１３
７２、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏ
ｎ．Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）中で（Ｐｈａｒｍａｃｉａキットからの）
６ｍｌのトリフルオロ酢酸セシウム溶液の緩衝剤上に載せ、ＳＷ４ｌ Ｔｉロー
ターで３０，０００ｒｐｍ、１５℃にて２０時間遠心した。ＲＮＡ沈殿物をジエ
チルピロ炭酸塩中に懸濁させ、水で処理し、エタノール沈殿した。ポリＡ＋ Ｒ
ＮＡを約１ｍｇの４匹のメスＯＰＧノックアウトマウスからプールしたトータル
ＲＮＡより、ＤｙｎａｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）_２５（製品
番号６１０．０５、Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を用いて単離した。
ポリＡ＋ ＲＮＡを２回のＤｙｎａｂｅａｄｓへの結合で精製した。

【０２２３】 ＯＰＧノックアウト粉砕骨ｃＤＮＡを、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬのＳｕｐｅｒｓｃ
ｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（製品番号１８２４８−０１３
、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して
３μｇのポリＡ＋ ＲＮＡより合成した。ｃＤＮＡをオリゴｄＴに満たした。キ
ットに含まれたＮｏｔＩプライマーアダプターを第一鎖ｃＤＮＡを合成するのに
使用した。

【０２２４】 ＮｏｔＩプライマーアダプター

【０２２５】

【化１】

【０２２６】 第二鎖合成についで、ＳａｌＩリンカー（製品番号１８２４８−０１３、ＧＩ
ＢＣＯ ＢＲＬ）を二本鎖ｃＤＮＡに加えた。 ＳａｌＩアダプター

【０２２７】

【化２】

【０２２８】 ＳａｌＩ−ＮｏｔＩ末端を持つｃＤＮＡをキットに含まれていたカラムでのカ
ラムクロマトグラフィーによってサイズ選別した。カラム画分８（またプール８
とも呼ぶ）からのｃＤＮＡを、（キット内に含まれた）ＳａｌＩ−ＮｏｔＩで切
断したｐＳｐｏｒｔＩ（製品番号１８２４８−０１３、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）内
にライゲーションした。ライゲーションしたＤＮＡをＥｌｅｃｔｒｏｍａｘ Ｄ
Ｈ１０Ｂ細胞（製品番号１８２９０−０１５、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）内にエレク
トロポレートした。平均挿入サイズは２．３ｋｂであった。

【０２２９】 実施例２ ネズミＧＲＮＦ４の同定および単離 ＯＰＧノックアウト粉砕骨ライブラリーの再配列および共通ｃＤＮＡプローブ
でのサブトラクションに続き、ライブラリーからの数千のクローンを５’末端よ
り配列決定した。サブトラクションに関して、いくつかのライブラリーのもっと
も豊富なクローンからのｃＤＮＡを、３４，０００ライブラリークローンの配列
を含むフィルターへのハイブリッド形成のための放射活性プローブを作製するた
めに使用した。これらのプローブにハイブリッド形成しなかった選択したクロー
ンを配列決定した。１つのクローン、ｓｍｃｂ２−０００１１−ｄ２（図１ａ）
は、ＧＤＮＦのＣ−末端活性領域と相同性を示すオープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）をコードしていた。ＴＧＦ−βファミリーのメンバーの特徴であるす
べての７つのシステイン残基が、ｓｍｃ２−０００１１−ｄ２によってコードさ
れた予想されたオープンリーディングフレーム内に存在した。予想されたＯＲＦ
は、ニューロチュリンに４７％同一であり、構造的にＧＤＮＦに関連する（図１
ｂ）。ＲＸＸＲ（Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ）開裂部位（一般的にＴＧＦ
−βファミリーメンバーで見られる）もまた存在し、したがって発現配列タグ（
ＥＳＴ）は、新規のＧＤＮＦファミリーメンバーの活性部分の配列をコードして
いると予測された。二本鎖配列の確認の後に、この分子をＧＲＮＦ４と名付けた
（ＧＤＮＦ−関連脳組織栄養因子４：ＧＤＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｔ
ｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ４）。

【０２３０】 ＧＲＮＦ４の３’非翻訳領域をｓｍｃｂ２−０００１１−ｄ２クローンのさら
なるシークエンシングによって入手した（図１ｃ）。ＧＲＮＦ４の５’末端を、
ｓｍｃｂ２−０００１１−ｄ２クローンからの５’ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ（たとえばＦｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ
．（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１８：３４０
−３５８に記述されたようなＲＡＣＥ）によってクローン化した。４つのオリゴ
ヌクレオチドを、ｓｍｃｂ２−０００１１−ｄ２クローンのｃＤＮＡ配列に基づ
いて合成した。これらのオリゴヌクレオチドを、ＧＲＮＦ４の全長コード領域を
得るために５’ＲＡＣＥのための潜在的供給源を選別するために使用した。

【０２３１】

【表３】

【０２３２】 オリゴヌクレオチド対（２０３７−９９＋２０３８−０１）を潜在的供給源を
探索するために使用し、３０６ｂｐの断片を増幅した。Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅ
ａｄｙ ｃＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ 製
品番号７４５０−１）は断片の陽性同定を示し、これが５’ＲＡＣＥのための適
切な供給源であったことを示唆している。ＰＣＲ物質は以下のようであった。

【０２３３】 ５μｌ Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ ｃＤＮＡ
（０．１μｇ／μｌ） １μｌ オリゴヌクレオチド２０３７−９９（２０μＭ） １μｌ オリゴヌクレオチド２０３８−０１（２０μＭ） １μｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、製品番号７４１１−１
） ５μｌ １０×ｃＤＮＡ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、（Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ、製品番号７４１１−１） １μｌ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（５
０×）、（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、製品番号７４１１−１） ３６μｌ ｄＨ_２Ｏ ＰＣＲの^＊条件は、９４℃２分間の変性、続いて３０サイクルの、９４℃３０
秒間（変性）、６２℃３０秒間（アニール）、７２℃３０秒間（伸張）であった
。最後に、反応液を最終伸張のために７２℃にて７分間インキュベートした。（ ^＊ ９４℃／２分間；（９４℃／３０秒間、６２℃／３０秒間、７２℃／２分間）
×３０サイクル；７２℃／７分間）。

【０２３４】 第一５’ＲＡＣＥをオリゴヌクレオチド２０３８−０３＋ＡＰ１で行った。Ｐ
ＣＲ増幅の条件を前記のようであった。５’ＲＡＣＥからのＰＣＲ産物を精製し
た（たとえばＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，
Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，製品番号２８１０４）。精製し
た産物を０．１μｇ／μｌまで希釈した。

【０２３５】 第一ＲＡＣＥ産物を、上述したのと同様の反応条件（＋または−）水にて容量
を調整した５μｌ ０．５Ｍ ＧＣ Ｍｅｌｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、製品番号８
４１９−１）を用いてオリゴ２０３８−０１＋ＡＰ２でネスト化した。ネスト化
したＰＣＲ産物のゲル電気泳動によって、およそ９００ｂｐおよび１５００ｂｐ
のバンドが＋または−ＣＧ ｍｅｌｔ両方で見られた。バンドを抽出し、ＤＮＡ
をＱｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、製品番号２８７０４）で精製した。

【０２３６】 挿入確認ＰＣＲを用いた断片の確認の後に、断片を取扱説明書にしたがってＰ
ＣＲクローニングプラスミド（すなわちｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ−ＴＡ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ Ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号Ｋ４５００−４０）内にサ
ブクローン化した。細菌への形質転換の後、クローンを取扱説明書にしたがって
Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，製品番号２７１０４）で
精製した。クローンを、上記したＰＣＲ条件での、オリゴヌクレオチド対（２０
３７−９９＋２０３８−０１）を使用した挿入確認ＰＣＲ、およびＥｃｏＲＩ消
化（０．５μｇ ＤＮＡ、２μｌ １０×Ｂｕｆｆｅｒ Ｈ、１μｌ ＥｃｏＲ
Ｉ（１０ｕ／μｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａ
ｐｏｌｉｓ，ＩＮ．ＵＳＡ，製品番号７０３ ７３７）、ｄＨ_２Ｏで２０μｌに
調製）にかけた。ＤＮＡを３７℃にて３０分間のインキュベーションによって消
化した。消化したＤＮＡを１％アガロースゲル／１×ＴＢＥ（ＧＩＢＣＯ ＢＲ
Ｌ，製品番号１５５１０−０２７）上で解析した。

【０２３７】 クローンの配列決定を行った。本来のＥＳＴの５’末端が延びたいくつかのク
ローンを得た。新規遺伝子の配列を図２で示した。開始Ｍｅｔ（予想されるＯＲ
Ｆ）は２１７ｂｐの位置で始まった。この全長ネズミＧＲＮＦ４遺伝子によって
コードされた予想された２２４アミノ酸ＯＲＦは上流終止を含む予想されたシグ
ナルペプチドを含んだ。ＧＤＮＦファミリーのうち、全長ＧＲＮＦ４が最もニュ
ーロチュリンに関連し、アミノ酸レベルでおよそ３８％同一であった。ネズミＧ
ＲＮＦ４およびニューロチュリンアミノ酸配列の比較を図４に示す。ネズミＧＲ
ＮＦ４アミノ酸配列とニューロチュリン、ペルセフィン、ＧＤＮＦのアミノ酸配
列の比較を図５に示す。タンパク質の相対的な大きさは以下のようであった。

【０２３８】 ＧＤＮＦネズミ： ２４１ａａ ニューロチュリンネズミ： １９６ａａ ペルセフィンネズミ： １５７ａａ ＧＲＮＦ４ネズミ： ２２４ａａ 実施例３ ヒトＧＲＮＦ４の同定と単離 マウスクローン、ｓｍｃｂ２−０００１１−ｄ２（実施例２、図１Ａ）の推定
されるコード領域を使用し、相同性配列に対して公的なデータベースを検索した
。相同性配列は、十分に同一性（アミノ酸レベルで＞２０〜２５％）を持つ配列
として定義し、配列が関連することを示した（すなわち配列をコードしている遺
伝子は共通の祖先遺伝子の重複から由来する）。２つのヒトゲノムクローン（受
け入れ番号ＡＣ００５０３８およびＡＣ００５０５１）は、ｓｍｃｂ２−０００
１１−ｄ２と高い相同性を持つ領域を含んでいた（すなわちアミノ酸レベルで８
３％またはそれ以上の同一性（ＢＬＡＳＴＰ）、本来のＥＳＴにおよぶ領域上で
ヒトおよびマウスＧＲＮＦ４間での核酸相同性を示している）。この領域にはマ
ウスＧＲＮＦ４の活性部分および３’転写終止コドンが含まれた。さらに、この
領域の約４００ｂｐ上流はマウスｃＤＮＡの５’末端に相同的な領域であり、こ
のことはイントロンの存在を示唆している。転写開始コドンがこの上流領域で見
られた。したがって、転写開始および終止コドンの周辺の領域がマウスｃＤＮＡ
配列に対する相同性に基づいて同定された。

【０２３９】 転写開始および終止コドンの周辺のいくつかのオリゴヌクレオチドプライマー
を、ＰＣＲ方法によってヒトｃＤＮＡコード領域をクローン化するように設計し
た。プローブは表２に示す。

【０２４０】

【表４】

【０２４１】 ＧＲＮＦ４はヒト胎盤で高度に発現されることがわかったので（実施例８以降
、図９参照）、ヒト胎盤からのＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ，製品番号７４１１−１）を鋳型の元として使用した。オリゴヌク
レオチド対（２０５８−５９＋２０２０−２７）を使用して初期ＰＣＲ反応を行
った。材料及び条件は以下 の通りである： ５μｌ Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ヒト胎盤ｃＤＮＡ（０．１μｇ／μ
ｌ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，製品番号７４１１−１） ５μｌ ＧＣ−ｍｅｌｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，製品番号８４１９−１） １μｌ オリゴヌクレオチド２０５８−５９（２０μＭ） １μｌ オリゴヌクレオチド２０２０−２７（２０μＭ） １μｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、製品番号７４１１−１
） ５μｌ １０× ｃＤＮＡ ＰＣＲ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、（Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ、製品番号７４１１−１） １μｌ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（５
０×）、（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、製品番号７４１１−１） ３１μｌ ｄＨ_２Ｏ ９４℃／２分間；（９４℃／３０秒間、５８℃／３０秒間、７２℃／１分間）
×２５サイクル；７２℃／７分間。

【０２４２】 このＰＣＲ反応は識別可能なバンドを産生しなかった。したがって、このＰＣ
Ｒ反応の１：１０希釈を鋳型として使用して、ネスト化したプライマー対（２０
５８−６０＋２０３５−２８）での第二ＰＣＲ反応を行った。物質および条件は
以下であった。

【０２４３】 １μｌ 第一ＰＣＲ反応の１：１０希釈 ５μｌ ＧＣ−ｍｅｌｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、製品番号８４１９−１） １μｌ オリゴヌクレオチド２０５８−６０（２０μＭ） １μｌ オリゴヌクレオチド２０３５−２８（２０μＭ） １μｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、製品番号７４１１−１
） ５μｌ １０ ×ｃＤＮＡ ＰＣＲ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、（Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ、製品番号７４１１−１） １μｌ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（５
０×）、（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、製品番号７４１１−１） ３５μｌ ｄＨ_２Ｏ ９４℃／２分間；（９４℃／３０秒間、５８℃／３０秒間、７２℃／４５秒間
）×２５サイクル；７２℃／７分間。

【０２４４】 このＰＣＲ反応で、約７３０塩基対を持つヌクレオチドが作製された。この断
片をＱｉａｑｕｉｃｋ ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、ｐ
ＣＲ２．１ ＴＯＰＯ−ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
）内にクローン化した。

【０２４５】 ヒトＧＲＮＦ４に対するヌクレオチド配列を図６に図示する。ヒトＧＲＮＦ４
に対するアミノ酸配列を図７に図示する。

【０２４６】 図８はマウスおよびヒトＧＲＮＦ４間のタンパク質配列比較を図示する。この
比較はマウスとヒト配列が、全長コード領域上で７８．７％類似であり、７７．
４％同一であることを示している。

【０２４７】 実施例４ ネズミＧＲＮＦ４の産生 ＧＲＮＦ４の成熟型をコードしているＤＮＡ断片をＰＣＲを用いて増幅した。
この反応のためのプライマーとして使用したオリゴヌクレオチドは、それぞれ遺
伝子の５’および３’末端でＸｂａＩおよびＸｈｏＩ制限部位を置き換えるよう
に設計した。増幅したＰＣＲ産物を適切な酵素で消化し、ＧＲＮＦ４の組換え体
発現下で、上述したようなプラスミドまたは発現ベクター内にクローン化した。

【０２４８】 ついでＧＲＮＦ４プラスミドをＧＲＮＦ４タンパク質の発現のために大腸菌（
Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞内に形質転換した。導入の後、ＧＲＮＦ４タンパク質の
発現をＳＤＳ ＰＡＧＥによって視覚化した。

【０２４９】 ＧＲＮＦ４は大腸菌内の封入体で発現した。封入体を、１時間室温にて６Ｍ
グアニチジンＨＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８ｍＭ ＤＴＴ中で可溶化した。可
溶化した封入体を２Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１６０ｍＭ アルギニン、３
ｍＭ システイン、ｐＨ８．５内に２５倍希釈し、低温（４℃）で一晩攪拌した
。この混合液を遠心によって不純物を取り除き、約１０倍濃縮し、１．５Ｍ 尿
素、５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９で３倍に希釈した。得られた混合液を遠心にて不
純物を取り除き、ｐＨを（リン酸にて）６．８にあわせ、１０ｍＭ リン酸Ｎａ
、０．２Ｍ アルギニン、ｐＨ６．８で平衡化したイオン交換カラム（ＳＰ−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅカラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅ
ｃｋ）上に載せた。カラムに載せ、同一の緩衝液にて洗浄した後に、ＧＲＮＦ４
を、同一の緩衝液中の０〜１Ｍ ＮａＣｌの勾配を使用してカラムから溶出した
。ピーク画分をため、ｐＨを４．５にあわせた。硫酸アンモニウムを０．８Ｍま
で加え、混合液を１０ｍＭ 酢酸Ｎａ、０．８Ｍ 硫酸アンモニウムで平衡化し
た疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（Ｂｕｔｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ
クロマトグラフィーカラム、ＴｏｓｏＨａａｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌ
ｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）上に載せた。載せ、同一の緩衝液で洗浄した後、ＧＲＮＦ４
を同一の緩衝液中の０．８〜０Ｍ硫酸アンモニウム勾配を使用して溶出した。つ
いでＧＲＮＦ４を１０ｍＭ 酢酸Ｎａ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ４．５中で
透析した。

【０２５０】 実施例５ ＧＲＮＦ４の調製およびヨウ素化 予想される成熟型ＧＲＮＦ４を実施例４で記述したように大腸菌に発現させた
。この分子をラクトペルオキシダーゼ剤を用いて（^１３５Ｉ）で放射標識化した
。図１１は、非還元（ＮＲ）および還元条件下での１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
って画分化された（^１３５Ｉ）標識化ＧＲＮＦ４の放射能写真を示している。（ ^１３５ Ｉ）ＧＲＮＦ４のはっきりとした分子量は非還元条件下で〜２４ｋＤ（ホ
モダイマー）、還元条件下で〜１２ｋＤ（モノマー）である。

【０２５１】 実施例６ ＧＦＲα−３を発現している細胞へのＧＲＮＦ４結合 結合アッセイを、Ｊｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１０，２８３−２９４，１９９０）によってすでに記述さ
れたアッセイ方法にしたがって行った。アッセイには、（実施例５で記述された
ような）（^１３５Ｉ）ＧＲＮＦ４の、ＮＳＲ−１、ＮＳＲ−５およびＮＳＲ−１
９細胞への結合が含まれた。これらの細胞は、ＧＦＲα−３を発現するようにト
ランスフェクトされたＮｅｕｒｏ−２ａ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１３１）のク
ローンである。これらのクローンを作製するために、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞に、
取り扱い指示にしたがってＣａｌｃｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｔｒａｎｓｆ
ｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いてＧＦＲα−３発現
ベクター（ｐＢＫＲＳＶにクローン化したＧＦＲα−３ ｃＤＮＡ、Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）をトランスフェクトした。トランスフェ
クトした細胞を、４００ｍｇ／ｍｌのＧ４１８抗生物質（Ｓｉｇｍａ）中での増
殖によってプラスミドの発現に関して選別した。Ｇ４１８抵抗性クローンを増殖
させ、ＧＦＲα−３ ｃＤＮＡをプローブとして使用したノザンブロットによっ
てＧＦＲα−３の発現に関して解析した。 ＧＦＲα−３を発現しているクローン化した細胞（すなわちＮＳＲ−１、ＮＳＲ
−５およびＮＳＲ−１９）をアッセイの２４時間前に、１．５×１０^５細胞／ｃ
ｍ^２の濃度でポリオルニチンおよびラミニンであらかじめコートした２４ウェル
Ｃｏｓｔａｒ組織培養プレート中にまいた。細胞を５〜１０分間氷上に置いたま
まにし、氷冷洗浄緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を含んだダルベッ
コ変法イーグル培地（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ））で１回洗浄し、４℃にて４時間、
５０ｎＭの非標識化ＧＲＮＦ４の存在下または非存在下で０．１ｎＭの（^１３５ Ｉ）ＧＲＮＦ４を含む０．２ｍｌの結合緩衝液（２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む洗
浄緩衝液）と共にインキュベートした。細胞を４回、０．５ｍｌの氷冷洗浄緩衝
液で洗浄し、０．５ｍｌの１Ｍ ＮａＯＨで溶解した。溶解物を１４７０ Ｗｉ
ｚａｒｄ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｇａｍｍａ Ｃｏｕｎｔｅｒで計数した。

【０２５２】 この解析の結果を図１２に示す。本実験は、組換え体ＧＲＮＦ４がＧＦＲα−
３を特異的に発現している細胞に結合することを示唆している。さらに、より高
いレベルのＧＦＲα−３を発現している細胞（たとえばＮＳＲ−５）は、よりＧ
ＲＮＦ４に結合する。

【０２５３】 実施例７ 可溶性ＧＦＲα−３タンパク質でコートしたＢｉｏＣｏｒｅ表面へのＧＲＮＦ
４の結合 ＧＲＮＦ４は、可溶性フラッグタグ化ＧＦＲα−３レセプターによってコート
された表面に特異的に結合することが知られている（表面プラズモン共鳴解析、
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）相互作用を研究するためのバイオセンサー基礎解析
器具、ＢｉａＣｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。ＧＲＮＦ４は
ＧＦＲα−１またはＧＦＲ−２レセプタータンパク質に特異的に結合はしなかっ
た。本解析の結果を図１３に示す。

【０２５４】 実施例８ ＧＲＮＦ４ ｍＲＮＡの組織分布 マウスおよびヒト両方でのＧＲＮＦ４の組織分布を、ノザンブロット解析を使
用して試験した。ヒトＧＲＮＦ４プローブをヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ）からのＰＣＲ反応によって調製した。プローブ領域は図６でのヌクレオチド
４８４〜６７２に相当する。この断片を適切なプライマーを用いて作製し、ｐＣ
Ｒ２．１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）内にクローン化し、配列を確認した。このクロー
ンからの２０ｎｇのＥｃｏＲＩ断片を、ＲｅｄｉｐｒｉｍｅＩＩキット（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ）を用いて^３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識化した。Ｈｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉ
ｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ（図９Ａ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
）およびＨｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｔｈｅｒｎ Ｂｌ
ｏｔ ＩＩ（図９Ｂ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、６０℃にて１４時間、１０ｍｌの
Ｅｘｐｒｅｓｓｈｙｂ溶液中で４×１０^６ｃｐｍ／ｍｌのプローブでハイブリッ
ド形成させた。ブロットを２回、０．５％ＳＤＳ、２×ＳＳＣ溶液にて３０分間
室温で洗浄した。さらに０．１％ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣ中で５５℃にて３０分
間、３回洗浄した。ついでこれらの膜をＸ−Ｏｍａｔ ＡＲフィルム（Ｋｏｄａ
ｋ）下で３日間、−８０℃にて感光させた。プローブは、特に胎盤、膵臓および
前立腺で４．３および１，７ｋＢで２つの強いバンドを検出した（図９）。精巣
、卵巣、小腸、大腸（粘膜系）、腎臓および心臓でいくらかの弱い発現が観察さ
れた。興味深いことに肝臓では１．７ｋＢのバンドのみが観察された。さらなる
組織をＨｕｍａｎ ＲＮＡ マスターブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、データは示
していない）で調査し、結果はノザンブロット解析を確かにした。さらに、さら
なる発現シグナルが下垂体、胎児腎臓、胎児肺および成体気管で観察された。

【０２５５】 マウスｃＤＮＡの部分（図２でのヌクレオチド６４９〜９５４）をＰＣＲ標識
化反応にて^３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識化した。４×１０^６ｃｐｍ／ｍｌのプローブ
をマウス多重組織ノザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、図１０）をハイブリッド
形成するのに使用したことを除いて、ヒトノザンブロット解析でのものと同様の
ハイブリッド形成および洗浄プロトコールを使用した。１．４および１．０のバ
ンドが精巣で検出された。ヒト発現解析でのように、マウスＲＮＡマスターブロ
ット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してさらなる組織を調査した。精巣および卵巣
が強いＧＲＮＦ４発現を示し、一方で、甲状腺、前立腺および精巣上体が中間の
発現を示した。

【０２５６】 実施例９ ＧＲＮＦ４のＧＦＲα−３との化学架橋 ＧＲＮＦ４の結合特性および分子特性を研究するために、化学架橋実験を行っ
た。この実験には、可溶性ＧＦＲα−３／ヒトＦｃ融合タンパク質に結合したか
、またはＧＦＲα−３および（実施例６で記述した）ＮＳＲ−５細胞の表面上に
発現したＲｅｔレセプターに結合した（^１２５Ｉ）ＧＲＮＦ４が含まれる。

【０２５７】 可溶性ＧＦＲα−３レセプターを使用した架橋に関して、（^１２５Ｉ）ＧＤＮ
Ｆまたは（^１２５Ｉ）ＧＲＮＦ４のどちらかを、ＧＦＲα−１、ＧＦＲα−２ま
たはＧＦＲα−３／ｈＦｃ融合タンパク質を発現している２９３Ｔ細胞の１×条
件培地１ｍｌに、２ｎＭの最終濃度まで加えた。可溶性ＧＦＲα−３／ｈＦｃタ
ンパク質は、融合ＧＦＲα−ヒトＦｃ ｃＤＮＡｓを含むプラスミドのトランス
フェクションによって、２９３Ｔ細胞（２９３細胞、ＳＶ４０大Ｔ抗原を発現し
ているＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３：Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｌａｖａｌｌｅｔｔｅ，Ｎｅｗ Ｊｅｒ
ｓｅｙ，ＵＳＡによって改変され、得られた）に一過性に発現させた。２９３Ｔ
細胞のトランスフェクションは、取扱説明書にしたがって、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＩＢＣＯ／Ｂ
ＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて行った。細胞を、１μＭの非
標識化ＧＤＮＦ、ニューロチュリン、またはＧＲＮＦ４の存在下、非存在下で４
℃にて４時間インキュベートした。化学架橋剤、スベリン酸Ｂｉｓ（ＢＳ^３ Ｐ
ｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を最終濃度１ｍＭまで加え、さらに室温
で３０分間インキュベートした。架橋反応を、室温でさらに１５分間、５０ｍＭ
のグリシンと共にインキュベートして終了させた。架橋した（^１２５Ｉ）ＧＲＮ
Ｆ４−ＧＦＲα−３／ｈＦｃ複合体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａセファロースビーズ
によって沈殿させ、７．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ビス：アクリルアミド＝１：
２００）上で分画化した。結果は図１４に示した。

【０２５８】 （^１２５Ｉ）ＧＲＮＦ４の細胞表面上に発現しているＧＦＲα−３およびＲｅ
ｔへの結合を評価するために、以下の細胞を使用した。ＮＧＲ−３８、ＮＮＲ−
９およびＮＳＲ−５細胞。これらのクローンを上記実施例６で記述したように作
製した。Ｎｕｒｏ−２ａ細胞に、取り扱い指示にしたがってＣａｌｃｉｕｍ Ｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＩＢＣＯ／Ｂ
ＲＬ）を使用してそれぞれのＧＦＲα ｃＤＮＡを含む発現ベクターをトランス
フェクトした。トランスフェクトした細胞を、４００ｍｇ／ｍｌのＧ４１８抗生
物質（Ｓｉｇｍａ）での増殖によってプラスミドの発現に関して選別した。Ｇ４
１８抵抗性クローンを増殖させ、それぞれ個別のＧＦＲα ｃＤＮＡをプローブ
として使用し、ノザンブロットによってＧＦＲαそれぞれの発現について解析し
た。ＮＧＲ−３８細胞はＧＦＲαおよびＲｅｔを発現し、ＮＮＲ−９細胞はＧＦ
Ｒα−２およびＲｅｔを発現し、ＮＳＲ−５細胞はＧＦＲα−３およびＲｅｔ細
胞を発現している。

【０２５９】 細胞を実験の２４時間前に、１．５×１０^５細胞／ｃｍ^２の濃度で６−ウェル
組織培養プレートにまいた。細胞を１０〜１５分間氷上に置き、（上述した）洗
浄緩衝液で１回洗浄し、１μＭの非標識化ＧＲＮＦ４の存在下または非存在下で
、４℃にて４時間、２ｎＭの（^１２５Ｉ）ＧＲＮＦ４とともにインキュベートし
た。ＢＳ^３を１ｍＭまで加え、４℃にて３０分間インキュベートした。架橋反応
を、室温にてさらに１５分間、５０ｍＭのグリシンとともにインキュベートして
終了させた。細胞を氷冷洗浄緩衝液で４回洗浄し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶
解緩衝液にて溶解させた。細胞溶解物を、抗Ｒｅｔ抗体を使用して免疫沈降し、
免疫沈降物を７．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。

【０２６０】 細胞結合解析の結果を図１５に示す。ＧＦＲα−１／ｈＦｃおよびＧＦＲα−
２／ｈＦｃ融合タンパク質はＧＲＮＦ４結合能力を示さなかった。ＧＦＲα−３
タンパク質は、強く（^１２５Ｉ）ＧＲＮＦ４に結合した。ＮＧＲ−３８およびＮ
ＮＲ−９細胞上に発現したＧＦＲα−１およびＧＦＲα−２はＧＲＮＦ４に結合
しなかった。ＮＳＲ−５細胞上に発現したＧＦＲα−３は十分にＧＲＮＦ４に結
合した。さらに、ＧＦＲα−３の非存在下ではなく、存在下で、ＧＲＮＦ４はま
たＲｅｔレセプターに結合する。架橋した（^１２５Ｉ）ＧＲＮＦ４−ＧＦＲα−
３複合体は、抗Ｒｅｔ抗体を用いて（^１２５Ｉ）ＧＲＮＦ４−Ｒｅｔ複合体と共
沈殿し、このことはＧＲＮＦ４の存在下でのＧＦＲα−３とＲｅｔの間の強い非
共有相互作用を示唆している。この結合は、１μＭの非標識化ＧＲＮＦ４によっ
てほとんど完全に阻害され、このことは野生型ＧＲＮＦ４の発現レセプターへの
特異的結合を示唆している。

【０２６１】 実施例１０ ＧＲＮＦ４によって誘導されたＲｅｔレセプタータンパク質チロシンキナーゼ
の自己リン酸化 ＮＳＲ−５細胞でのＧＮＲＦ４−誘導Ｒｅｔチロシンリン酸化を免疫ブロッテ
ィングによって測定した。（実施例９で記述したような）ＮＧＲ−３８、ＮＮＲ
−９またはＮＳＲ−５細胞培養物を、３７℃にて１０分間、５０ｎＭのＧＤＮＦ
、ニューロチュリン、ペルセフィンおよびＧＲＮＦ４で処理した。細胞を溶解し
、細胞溶解物を抗Ｒｅｔ抗体を用いた免疫沈降および抗リン酸チロシン抗体を用
いたウエスタンブロットにかけた。この解析の結果を図１６に示す。ＧＤＮＦで
処理したＮＧＲ−３８細胞およびニューロチュリンで処理したＮＮＲ−９細胞の
ように、ＧＦＲα−３を発現しているＮＳＲ−５の、ＧＲＮＦ４での処理は、Ｒ
ｅｔレセプタータンパク質チロシンキナーゼ上のチロシンリン酸化を効率よく誘
導した。

【０２６２】 実施例１１ ＧＲＮＦ４−誘導Ｒｅｔリン酸化の用量依存性および速度論 ＮＳＲ−５細胞を、３７℃にて１０分間、さまざまな濃度のＧＲＮＦ４で（図
１７パネルＡ）、または３７℃にて図で示したさまざまな間隔で、２ｎＭのＧＲ
ＮＦ４で（図１７パネルＢ）処理した。細胞を溶解し、細胞溶解物を抗Ｒｅｔ抗
体を用いた免疫沈降および抗リン酸チロシン抗体を用いたウエスタンブロット解
析にかけた。ＧＲＮＦ４によって誘導されたＲｅｔレセプターのチロシンリン酸
化の強度は使用したＧＲＮＦ４の濃度および処理時間に依存して変化する。ＧＲ
ＮＦ４は、２ｐＭのように低いＧＲＮＦ４濃度でＮＳＲ−５細胞内のＲｅｔリン
酸化を誘発し、このことはＧＲＮＦ４とそのレセプター間の高いアフィニティー
相互作用を示唆している。さらに、ＧＲＮＦ４は、１分以内に明らかにＲｅｔリ
ン酸化を誘発することができ、このことはＧＲＮＦ４によって誘導されたＲｅｔ
キナーゼのとてもはやい活性化を示唆している。

【０２６３】 実施例１２ ＧＦＲα−３によるＧＲＮＦ４の安定化 ＧＦＲαレセプターは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結
合によって細胞膜を固定する。可溶性ＧＦＲαがｉｎ ｖｉｖｏで存在するかど
うかははっきりしていないが、いくつかのＧＰＩ結合分子が部分的に膜より分泌
される。ＧＲＮＦ４が可溶性ＧＦＲα−３レセプターに結合し、それによって架
橋されうるという事実は、ＧＲＮＦ４−ＧＦＲα−３複合体の形成が、この分子
のどちらかまたは両方を安定化するのを助ける可能性があることを示唆している
。ＧＲＮＦ４−ＧＦＲα−３複合体の形成は、ｉｎ ｖｉｖｏでＧＲＮＦ４の一
定の濃度を保持するのを助ける可能性もあり、これは、高濃度のＧＲＮＦ４に関
連した潜在的な毒性を減少させる。

【０２６４】 実施例１３ ＧＲＮＦ４パーセント同定 ワシントン大学Ｂｌａｓｔ検索を、ネズミＧＲＮＦ４アミノ酸配列を用いて行
った。検索は表３で示した結果を提供した。

【０２６５】

【表５】

【０２６６】 ＢＬＡＳＴ検索を、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ
、ワシントン大学、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩを参照のこと）のデフォルトパラメー
タを用いて行った。この検索で、照会配列（ＧＲＮＦ４ ２２４アミノ酸配列）
を、Ｎｏｎｒｅｄｕｎｄａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースでの３０７，９３
２配列と比較した。最も高い相同性適合は、ヒトおよびマウスニューロチュリン
、マウス、ヒトおよびラットペルセフィン、マウスヒトおよびラットグリア誘導
神経組織栄養因子に対してであった。これらの分子は、神経組織栄養因子のＧＤ
ＮＦファミリーのすでに公知のメンバーを形成する。これらの結果は、ＧＲＮＦ
４は、ＧＤＮＦファミリーの新規メンバーであることを示しており、このファミ
リーの４番目のメンバーであることを示している。

【０２６７】 このデータから見られるように、関連したファミリーメンバーを示唆している
有意な適合性に対する「最小合計確率」値は４．２ｅ−１２〜１ｅ−２０である
。マウスまたはヒトＧＲＮＦ４と等しいタンパク質に対する最小合計確率は、４
．９ｅ−２１〜１．２ｅ−２４１のスコアを持つ可能性があった（後者の値はヒ
ト分子、たとえばニューロチュリンのそれ自身に対する適合性に関して得られた
）。

【０２６８】 実施例１４ ＧＲＮＦ４コンセンサス配列 ＧＲＮＦ４コンセンサス配列を図１８に記す。この配列は、マウスおよびヒト
ＧＲＮＦ４のアミノ酸配列の比較に基づいており、そこで「Ｘａａ」はアミノ酸
残基の欠失、添加または置換を表す。

【０２６９】 実施例１５ 遍在性β−アクチンプロモーターによって駆動されたＧＲＮＦ４のトランスジ
ェニック過剰発現 ネズミＧＲＮＦ４の全コード領域を、トランスジェニックマウスでの偏在性発
現のためにそれをヒトβ−アクチンプロモーターおよびエンハンサーの制御下に
配置した発現ベクター内にサブクローン化した（Ｋｌｅｂｉｇ−ＭＬ，ｅｔ ａ
ｌ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９２：４７２８−４７３２，１９９５；Ｒａｙ−Ｐ．ｅ
ｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ５：２２６５−２２７
３，１９９１）。ネズミＧＲＮＦ４ ｃＤＮＡを鋳型として使用し、ＰＣＲ増幅
し、ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ断片をβ−アクチン発現ベクター内にクローン化した
。オリゴヌクレオチドを、ＳａｌＩ制限部位およびコザックコンセンサス（ＧＣ
ＣＡＣＣ）配列が直接的にＧＲＮＦ４ ｃＤＮＡのＡＴＧ（開始コドン）の前に
あり、ＢａｍＨＩ制限部位が３’ＵＴＲの終止コドンに続くように設計した。

【０２７０】

【表６】

【０２７１】 上記したオリゴヌクレオチド対を使用してＰＣＲを行った。物質および条件は
以下のようであった。

【０２７２】 ５μｌ ＧＲＮＦ４ ｃＤＮＡ（０．５μｇ／μｌ） １μｌ オリゴヌクレオチド２０８７−３７（２０μＭ） １μｌ オリゴヌクレオチド２０８７−３８（２０μＭ） １μｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、製品番号７４１１−１
） １０μｌ ５× ＧＣ ｃＤＮＡ ＰＣＲ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、製品番号１９０７−ｙ） １μｌ Ｃｌｏｎｅｄ Ｐｆｕ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ、製品番号６００１５４） ３１μｌ ｄＨ_２Ｏ ９４℃／２分間；（９４℃／３０秒間、５２℃／３０秒間、７２℃／１分間）
×５サイクル；（９４℃／３０秒間、６２℃／３０秒間、７２℃／１分間）×２
５サイクル；７２℃／７分間。

【０２７３】 増幅したＰＣＲ産物（およそ７００塩基）を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ 精
製キット（Ｑｉａｇｅｎ、製品番号２８１０４）を用いて３０μｌの１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．５内に精製し、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ（Ｒｏｃｈ
ｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、それぞれ製品番号３４８
７８３、２２０ ６１２）で消化した。ＰＣＲ産物のＳａｌＩでの消化は以下
のように行った。３０μｌ ＤＮＡ、５μｌ １０×Ｂｕｆｆｅｒ Ｈ（Ｒｏｃ
ｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、製品番号３４８ ７８３）、２μｌ Ｓａｌ
Ｉ、１３μｌ ｄＨ_２Ｏ、３７℃２時間の消化。ＰＣＲ産物をＱｉａｑｕｉｃｋ
ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で記述したのと同様の手順に従って３０μ
ｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．５内に精製した。ＰＣＲ産物のさらな
る消化をＢａｍＨＩで行った。３０μｌ ＤＮＡ、５μｌ １０×Ｂｕｆｆｅｒ
Ｂ（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、製品番号２２０ ６１２）、２
μｌ ＢａｍＨＩ、１３μｌ ｄＨ２Ｏ、３７℃１時間の消化。ＰＣＲ産物をＱ
ｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で記述したのと同様の手順
に従って３０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．５内に精製した。

【０２７４】 ＰＣＲ産物を、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、製品番号４８１ ２２０）を用いて、ＳａｌＩ
およびＢａｍＨＩで切断したβ−アクチン発現ベクター内にクローン化し、ＧＲ
ＮＦ４プラスミドを形成した。ライゲーション反応は以下のようであった。２０
μＬ ＰＣＲ産物、５μＬベクター（０．１μｇ／μＬ）、３μＬ １０× Ｔ
４ Ｌｉｇａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ、３μＬ Ｔ４ Ｌｉｇａｓｅ、１４℃、一晩
インキュベーション。

【０２７５】 ついでＧＲＮＦ４プラスミドをＯｎｅ Ｓｈｏｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉ
ｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｏｐ １０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号
Ｋ４６００−０１）を用いて大腸菌宿主細胞内に形質転換し、ついでＬＢ−アン
ピシリン（５０μｇ／ｍｌ）アガロースプレート上にまき、３７℃にて一晩イン
キュベートした。

【０２７６】 コロニーを拾い上げ、挿入に関して選別した。コロニーを、取扱説明書にした
がってＳｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、製品番号２７１０
４）で精製した。クローンを、ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ二重消化（０．５μｇ Ｄ
ＮＡクローン、２μＬ １０× Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ、１μｌ ＳａｌＩ、１μｌ
ＢａｍＨＩ、ｄＨ_２Ｏにて２０μＬにした（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，それぞれ製品番号３４８ ７８３、２２０ ６１
２）、３７℃、１．５時間インキュベーションによる挿入確認にかけた。１つの
クローンをシークエンシングにかけ、１００％同一性を確認した。

【０２７７】 ５００μｇのＤＮＡを取扱説明書にしたがってＭａｘｉ ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ
Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、製品番号１２２６２）を用いて作製
した。ＤＮＡ（１０μｇ）をＣｌａＩによって消化し、マイクロインジェクショ
ン断片を摘出した。１０μｇ ＤＮＡ、５μＬ Ｂｕｆｆｅｒ Ｈ、２μＬ Ｃ
ｌａＩ、ｄＨ_２Ｏにて５０μＬにした（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ
、製品番号４０４ ２１７）、３７℃にて２時間のインキュベート。ＤＮＡを０
．７％アガロース／１×ＴＢＥ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、製品番号１５５１０−０
２７）上で分離した。マイクロインジェクション断片をゲルより摘出し、Ｑｉａ
ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ キット（Ｑｉａｇｅｎ、製品番号
２８７０４）で同様の手順にしたがって、３０μｌ ５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
、ｐＨ７．４／０．２ｍＭ ＥＤＴＡ内に精製し、ついで同一の緩衝液内で２ｎ
ｇ／μＬまで希釈した。（ＢＤ×ＢＤ）Ｆ_１交配マウスからの単細胞胚に、注入
ニードルを傾け、使用前にシリコン処理したことを除いて、基本的に、Ｂｒｉｎ
ｓｔｅｒ−ＲＬ，ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８２：４４３８−４４４２，
１９８５で記述したように注入した。胚を一晩、ＣＯ_２インキュベーター内で培
養し、１５〜２０の二細胞胚を偽妊娠ＣＤ１メスマウスの卵管に移した。胚は、
移植の日に、妊娠１．５日であると見なした。トランスジェニック子孫を、以下
のＰＣＲプロトコールの後に、Ｓｉｍｏｎｅｔ ＷＳＳ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｉｎｖｅｓ．９４：１３１０−１３１９，１９９４で記述されたように生
検耳から調製したＤＮＡ中のＳＶ４０ポリＡシグナル領域に関して選別すること
で同定した。

【０２７８】

【表７】

【０２７９】 ２５μＬとするｄＨ_２Ｏ中、１μＬの耳のＤＮＡ、１μＬのオリゴヌクレオチ
ド２１５０−５４（２０ｎＭ）、１μＬのオリゴヌクレオチド２１５０−２２（
２０ｎＭ）及びＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ−Ｂｅａｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製
、製品番号２７−９５５３−０１）を用いる。

【０２８０】 ９４℃／３分；（９４℃／３０秒、６０℃／３０秒、７２℃１分）ｘ３０サイ
クル；７２℃／７分。

【０２８１】 偏在する標的としたトランスジーンとしてＧＲＮＦ４を含む若い成熟トランス
ジェニックマウスとコントロールマウスを屠殺し、分析用に検死した。そのマウ
スは、イソフルラン吸入によって深く麻酔し、血液を心臓穿刺により抜き出した
。脾臓のウェッジは、トランスジーンの発現を検出するため液体窒素中で凍結し
た。選択した内臓を取りだし、秤量した。最後に、全身ラジオグラフ（Ｆａｘｉ
ｔｒｏｎセッティング：０．３ｍＡ、５５ＫＶＰで４９秒）を得て、さらに骨と
脳を試料とした。全ての組織は総体異常性について検査し、そして亜鉛ホルマリ
ン中に浸漬して固定化した。

【０２８２】 全血と血清はそれぞれ、血液学及び臨床化学パネル用に採取した。固定後、選
択した組織は勾配アルコール中で脱水し、キシレン中でクリアにし、パラフィン
中に包埋した。６μｍ厚切片をヘマトキシリンとエオシン（ＨＥ）で染色した。
形態学的病変の深刻度は、５段階スケール：なし、最小、軽度、中程度、又は顕
著、を用いて半定量的に等級付けした。何匹かのマウスにおいて、付加の神経ま
たは内分泌組織（例えば、自律神経節、腸の神経節、上皮小体）は、試験した器
官の切片に偶然に隣接して含まれた。これらの補助的な組織における変化は、２
段階スケール：影響なし又は影響を受けた、を用いてそれらを評価したが非常に
とらえにくかった。幾つかの器官における神経病変の後ｈｏｃ（ｐｏｓｔ ｈｏ
ｃ）分析は、ニューロン（神経繊維タンパク質）、副腎髄質（チロシン加水分解
酵素）、及びエピネフリン生産髄質細胞（髄質の役７５％を含み、フェニルエタ
ノールアミン Ｎ−メチルトランスフェラーゼ、又はＰＮＭＴにより選択的に染
色した）、及び分割細胞（ＢＲＤＵ）の輪郭を描くための試薬で一連の切片を染
色することにより実行した。これらの付加の終点は、これら分子マーカーの分散
を決定するために定性的に評価した。データは、ＪＭＰ統計ソフトウエア（ｖ．
３．２．１；ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いて評価した
。値は非パラメトリック試験を用いて遺伝型（”陽性”又は”陰性”）で検査し
た。

【０２８３】 トランスジーンの発現分析は、ＲＴ−ＰＣＲにより行った。全ての細胞のＲＮ
Ａは、製造者のプロトコルに従いＰｅｒｆｅｃｔ ＲＮＡ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＭｉｃｒｏＳｃａｌｅ社製）（５プライム３プ
ライム、製造番号２−０３６３６４）を用いて脾臓切片から単離した。２つのオ
リゴヌクレオチドをトランスジーンのｍＲＮＡをスクリーンするために設計した
。

【０２８４】

【表８】

【０２８５】 材料と条件は次の通りとした： 反応容量−５０μＬ（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＥｚｒＴｔｈ ＲＮＡ Ｐ
ＣＲ Ｋｉｔ，ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、製造番号Ｎ８０８−０１７９） マスターミックス： １０μＬ ５ｘ ＥＺ緩衝液 １．５μＬ ｄＧＴＰ １．５μＬ ｄＣＴＰ １．５μＬ ｄＡＴＰ １．５μＬ ｄＴＴＰ ２μＬ ｒＴｈ ＤＮＡポリメラーゼ ５μＬ ２５ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）_２ ２４μＬ ｄＨ_２Ｏ 反応： １μＬ ２１９４−０８（２０ｎＭ） １μＬ ２１９５−８３（２０ｎＭ） １μＬ全ＲＮＡ ４７μＬマスターミックス ＲＴ−ＰＣＲ条件：６５℃／３０分；９４℃／３分；（９４℃／１５秒、
６０℃／１５秒、７２℃／３０秒）ｘ３０サイクル；７２℃／７分 結果と考察： 特記しない限り、両方の性別についての測定を評価用にプールした。表現型応
答において潜在的に性別に関連した相違を定義することが必要であった場合に、
それぞれの性別用のパラメータを個別に考慮した。値は、パーセントとして（指
定した参考値に対して）又は平均値±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）としてリスト化した
。そのテキストはＧＲＮＦ４−処理動物だけに異常な所見を示す。

【０２８６】 検死データ 肉眼的所見：肉眼的病変は検査の間にいずれのマウスにも見出されなかった。
体重と器官重量データ：ほとんどの場合、平均と個々の絶対体重及び器官重量な
らびに全ての体重対器官重量割合は、陽性及び陰性マウスで共通であった。唯一
の例外は、それぞれが絶対及び相対腎臓重量の顕著な減少と控えめな増加を示し
たトランスジェニック雄ｎｏ．３６とトランスジェニック雌ｎｏ．５７における
腎臓重量であった。トランスジェニック雄ｎｏ．２４もまた、絶対腎臓における
増加を示した。

【０２８７】 臨床病理学データ 血液学：血液学の値は発現レベルに関係なく、陽性と陰性マウスで同様であっ
た。２つの発現体、ｎｏ．３６と５２は、多重細胞クラス（主要な好中球、リン
パ球、及び単球）における増加に起因した全循環白血球（ＷＢＣ）の数値が顕著
に上昇していた。

【０２８８】 臨床化学：臨床化学の値は、典型的には陽性と陰性マウスで同等であり、トラ
ンスジーン発現のレベルに従って変化しない。発現体ｎｏ．３６は、血清グロブ
リン濃度が非常に上昇していた。発現体ｎｏ．３７と５２は、血液採取における
困難の結果と思われる、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のみならずアラニン（ＡＬＴ
）およびアスパラギン酸（ＡＳＴ）アミノトランスフェラーゼの血清レベルが顕
著に増加していた。

【０２８９】 組織病理学所見： トランスジーンと潜在的に関連した病変：幾つかの器官における神経要素の顕
微鏡的病変は、トランスジーンＲＮＡの発現と関係付けられた。影響を受けた組
織は、末梢自律神経系から得られた。一つの顕著な所見は、５匹の発現体におい
てある程度まで生じた、副腎髄質とそれに隣接した自律神経節における神経堤−
由来細胞の形成異常であった（図１９）。この病変は、神経節の即座のデモンス
トレーション（コントロールマウスにおいて、これらの器官では典型的には見出
すことが困難である）および副腎髄質の細胞による神経節ニューロンの付着又は
合併によって特徴付けられた。第２の主要な所見は、６匹の発現体における膀胱
の外壁における自律神経と神経節の顕著な過形成であった（図２０）。その膀胱
壁は、大きなニューロンを含んでいる無定形神経節に変化を持たせる蛇行性の神
経から部分的にほとんど完全に構成された；その変化は膀胱三角において最も顕
著であった（即ち、尿道と括約筋の起源近傍の膀胱頸部）。一方、これらの神経
と神経節は膀胱においてほとんど見られない。これらの要素は、コントロールマ
ウスではほとんど見られない。他の有力な所見は、膀胱三角に近い結合組織にお
ける自律神経と神経節の過形成であった（図２１）。最後に、結腸の腸管筋は、
コントロールにおいて同じ構造が小乃至中位サイズのニューロンの間欠性クラス
ターからなっている一方で、５匹の発現体における肥大したニューロンの連続層
を形成した（図２２）。中枢および末梢体性神経系は、トランスジェニックマウ
スにおいて影響のないことが示された。野生型動物は、これらの所見を示さない
。

【０２９０】 付随病変：可変的な程度の僅かの所見が陽性又は陰性の動物のいずれか、ある
いは両方で観測された（データは示さず）。主要な病変は、脾髄及び／又は肝臓
洞様毛細血管における髄外造血、腺又は粘膜上皮の萎縮（多重器官において、中
身からの圧力のため）、変性（副腎）又は再生、および炎症の散在した病変であ
った。これらの変化の全ては、この年齢および系統のマウスからの組織における
バックグラウンド病原の成分であった。

【０２９１】 水腎症に随伴した重篤な片側性尿管炎がこれらのマウス（ｎｏｓ．３６、５２
、５７）で発生し、変化した腎臓重量と臨床病理学データのための事実と思われ
る説明を提供する。その病変は、尿管と腎盤の内層粘膜の顕著な乳頭状増殖と関
連した広範な炎症（主として好中球）によって特徴付けられる。この病変は、１
匹のマウス（ｎｏ．３６）の骨髄中の顆粒球直系の散在性の、しかし最小の過形
成を伴った。

【０２９２】 結論 ＥＳＴ配列、ＧＲＮＦ４をコードしているｓｍｃｂ２−０００１１−ｄ２は、
末梢自律神経系における幾つかの病変を誘導した。一つの顕著な所見は、７匹の
発現体の５匹において隣接した又は等分に合併した、副腎髄質およびそれに隣接
した自律神経節における神経堤−由来細胞の異常形成であった。加えて、自律神
経および神経節の顕著な過形成が７匹の発現体の６匹において膀胱の外壁に発生
した。結腸の腸管筋神経節が幾つかの発現体で連続層を形成した。野生型動物は
これらの所見を示さない。

【０２９３】 これらの神経の変化は、たとえその欠陥の経時的および本質（例えば、神経前
駆体の減少した死滅対迷走移動対増加した増殖）が定義できないとしても、神経
堤細胞中のトランスジーン−誘導発達欠陥と一致した。例えば、副腎は皮質性の
（約Ｅ１１−１２で体腔上皮（内胚葉）に由来）および髄質性の（約Ｅ１３−１
４皮質性素質が浸透した交感神経芽細胞（外胚葉）から生じる）組織からなる。
髄質はカテコールアミンを生産し、その機能は腎動脈の起源近くにあるパラガン
グリオンによって共有される。正常な動物において、パラガングリオンは２−３
週令に最大であり、初期の約３−４週令で消散する（Ｔｉｓｃｈｌｅｒ ＡＳ，
Ｓｈｅｌｄｏｎ Ｗ： Ａｄｒｅｎａｌ ｍｅｄｕｌｌａ，ｉｎ Ｐａｔｈｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ａｇｉｎｇ Ｍｏｕｓｅ，Ｖｏｌ．１，ＩＬＳＩ
Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９６）。

【０２９４】 トランスジェニックマウスの他の組織（脳、脊髄、末梢神経、およびエンドク
リン器官）は重大な変化を示さなかった。

【０２９５】 水腎症に随伴した顕著な片側性尿管炎がこれらのマウス（ｎｏｓ．３６、５２
、５７）で発生し、変化した腎臓重量と循環する白血球の増加した数のための説
明を提供する。最も信憑性ある説明は、細菌感染増加である。この病変の低い付
随が最近のＥＳＴ研究からのマウス（コントロールとトランスジェニック）から
観測されている。それ故、我々は、粘膜内層に向かうこの成長因子の栄養効果と
一致しおよび一致しない本実験の３匹のマウスにおけるこの変化の存在を考慮す
る。

【０２９６】 実施例１６ ヒト肝臓分泌アポリポタンパク質Ｅプロモーターで作動したＧＲＮＦ４のトラ
ンスジェニック過剰発現 ネズミの完全コード配列は、トランスジェニックマウスにおける肝臓発現用の
ヒトＡｐｏＥプロモーターとエンハンサーの制御下、それを配置している発現ベ
クターの中にサブクローンした（Ｓｉｍｏｎｅｔ−ＷＳＳら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ．９４：１３１０−１３１９，１９９４）。ネズミＧＲＮＦ４は、Ａ
ｐｏＥ発現ベクター内にクローンするためＳｐｅＩ／ＮｏｔＩフラグメントをＰ
ＣＲ増幅するための鋳型として用いた。そのオリゴヌクレオチドは、ＳｐｅＩ制
限部位とコザックコンセンサス（ＧＣＣＡＣＣ）配列がＧＲＮＦ４ｃＤＮＡのＡ
ＴＧ（スタートコドン）の直前となり、且つＮｏｔＩ制限部位が３’ＵＴＲ中の
終止コドンに続くように設計した。

【０２９７】

【表９】

【０２９８】 前記オリゴヌクレオチド対はＰＣＲを実行するために用いた。材料と条件は次
の通りである： ５μｌ ＧＲＮＦ４ ｃＣＮＡ（０．５μｇ／ｍｌ） １μｌ オリゴヌクレオチド２２２０−５１（２０μＭ） １μｌ オリゴヌクレオチド２２２０−５３（２０μＭ） １μｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、製造番号
７４１１−１） １０μｌ ５ｘ ＧＣ ｃＤＮＡ ＰＣＲ反応緩衝液、（Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ社製、製造番号１９０７−ｙ） １μｌ クローン化Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ社製、製造番号６００１５４） ３１μｌ ｄＨ_２Ｏ ９４℃／２分；（９４℃／３０秒、５２℃／３０秒、７２℃／１分）
ｘ５サイクル；（９４℃／３０秒、６２℃／３０秒、７２℃／１分）ｘ２５サイ
クル；７２℃／７分 増幅したＰＣＲ生産物（ほぼ７００塩基）は、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製
キット（Ｑｉａｇｅｎ社製、製造番号２８１０４）を用いて３０μｌ １０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．５中で精製し、さらにＳｐｅＩとＮｏｔＩ（Ｒｏｃ
ｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、それぞれ製造番号
１ ００８ ９４３，１ ０１４ ７０６）で消化した。ＳｐｅＩ／ＮｏｔＩに
よるＰＣＲ生産物の消化は、次の通り実行した：３０μｌ ＤＮＡ、５μｌ １
０ｘ緩衝液Ｈ、２μｌ ＳｐｅＩ、２μｌ ＮｏｔＩ、１１μｌ ｄＨ_２Ｏ；３
７℃２時間で消化。ＰＣＲ生産物はＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉ
ａｇｅｎ社製、製造番号２８１０４）に記述されたと同じ手順に従い３０μｌ
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．５中で精製した。

【０２９９】 挿入物は、Ｒａｐｉｄ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，製造番号１ ６３５ ３７９）を用いてＳｐ
ｅＩとＮｏｔＩで切断したＡｐｏＥ発現ベクター中でクローンした。その連結反
応は次の通り実行した：５０μｇ ＰＣＲ生産物、２００μｇベクター（０．１
μｇ／ｍＬ）、２μｌ ５ｘ ＤＮＡ希釈緩衝液、１０μｌまでのｄＨ_２Ｏ；混
合ウェル；１０μｌ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（２ｘ）、１μｌ Ｔ４ Ｄ
ＮＡリガーゼを加える；室温、３０分インキュベーション。

【０３００】 次いでＧＲＮＦ４プラスミドは、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｏｐ １０ ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
社製，製造番号Ｋ４６００−０１）を用いて大腸菌宿主細胞中に形質転換し、さ
らに３７℃にインキュベートしたＬＢ−アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）アガロ
ース平板培地上で一晩平板培養した。

【０３０１】 コロニーを釣菌し、挿入物の存在についてスクリーンした。クローンは、製造
者の指示に従ってＳｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製，製
造番号２７１０４）で精製した。クローンはＳｐｅＩ／ＮｏｔＩ二重消化（０．
５μｇ ＤＮＡクローン、２μｌ １０ｘ緩衝液Ｈ、１μｌ ＳｐｅＩ、１μｌ
ＮｏｔＩ、２０μｌまでのｄＨ_２Ｏ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、それぞれ製造番号１ ００８ ９４３，１ ０１４
７０６））；３７℃、１時間半インキュベーション、によって挿入物チェック
にかけた。一つのクローンは１００％同一性を確認するために配列決定に供した
。

【０３０２】 ＤＮＡ（５００μｇ）は、製造者の指示に従ってＭａｘｉ ＱＩＡ ｆｉｌｔ
ｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製、製造番号１２２６２）を用
いて作製した。ＤＮＡ（１０μｇ）は微小注入フラグメントを削るためＡｓｅＩ
／ＣｌａＩで消化した：１０μｇ ＤＮＡ、５μＬ １０ｘＮＥＢ緩衝液３、２
μＬ ＣｌａＩ、２μＬ ＡｓｅＩ、５０μＬまでのｄＨ_２Ｏ（Ｒｏｃｈｅ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、製造番号４０４ ２１７；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製，製造番号５２６Ｓ）；３７℃で２時間インキュベート
。ＤＮＡは０．７％アガロース／１ｘＴＢＥ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製、製造番
号１５５１０−０２７）上で分離した。微小注入フラグメントはゲルから削り取
り、Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ
社製、製造番号２８７０４）において同じ手順に従って３０μｌ ５ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４／０．２ｍＭ ＥＤＴＡ中で精製した；次いで同じ緩衝
液で２ｎｇ／μＬまで希釈した。（ＢＤｘＢＤ）Ｆ_１飼育マウスからの単細胞胚
は、注射針を斜めにし且つ使用の前にシリコンで処理した例外とともに、本質的
にＢｒｉｎｓｔｅｒ−ＲＬら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８２：４４３８−４４４２，
１９８５中に記載の通り注射した。胚はＣＯ_２インキュベーター中で一晩培養し
、１５−２０の２細胞胚を偽妊娠ＣＤ１雌マウスの卵管に移入した。胚は、移植
の日が妊娠発育の１．５日であると見なした。トランスジェニック子孫は、Ｓｉ
ｍｏｎｅｔ−ＷＳＳら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ．９４：１３１０−１３１９
，１９９４中に記述の通りバイオプシーした耳から調製したＤＮＡ中のＳＶ４０
ポリＡシグナル領域をスクリーニングすること及び次のＰＣＲプロトコルを用い
て同定した：

【０３０３】

【表１０】

【０３０４】 ２５μＬとするｄＨ_２Ｏ中、１μＬの耳のＤＮＡ、１μＬのオリゴヌクレオチ
ド２１５０−５４（２０ｎＭ）、１μＬのオリゴヌクレオチド２１５０−２２（
２０ｎＭ）及びＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ−Ｂｅａｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製
、製品番号２７−９５５３−０１）を用いる。

【０３０５】 ９４℃／３分；（９４℃／３０秒、６０℃／３０秒、７２℃１分）ｘ３０サイ
クル；７２℃／７分。

【０３０６】 肝臓分泌トランスジーンとしてＧＲＮＦ４を含む若い成熟トランスジェニック
マウスとコントロールマウスを屠殺し、分析用に検死した。そのマウスは、イソ
フルラン吸入によって深く麻酔し、血液を心臓穿刺により抜き出した。肝臓のウ
ェッジは、トランスジーンの発現を検出するため液体窒素中で凍結した。選択し
た内臓を取りだし、秤量した。最後に、全身ラジオグラフ（Ｆａｘｉｔｒｏｎセ
ッティング：０．３ｍＡ、５５ＫＶＰで４９秒）を得て、さらに骨と脳を試料と
した。全ての組織は総体異常性について検査し、そして亜鉛ホルマリン中に浸漬
して固定化した。

【０３０７】 全血と血清はそれぞれ、血液学及び臨床化学パネル用に採取した。固定後、選
択した組織は勾配アルコール中で脱水し、キシレン中でクリアにし、パラフィン
中に包埋した。６μｍ厚切片をヘマトキシリンとエオシン（ＨＥ）で染色した。
形態学的病変の深刻度は、５段階スケール：なし、最小、軽度、中程度、又は顕
著、を用いて半定量的に等級付けした。何匹かのマウスにおいて、付加の神経ま
たは内分泌組織（例えば、自律神経節、腸の神経節、上皮小体）は、試験した器
官の切片に偶然に隣接して含まれた。これらの補助的な組織における変化は、２
段階スケール：影響なし又は影響を受けた、を用いてそれらを評価したが非常に
とらえにくかった。幾つかの器官における神経病変の後ｈｏｃ（ｐｏｓｔ ｈｏ
ｃ）分析は、ニューロン（神経繊維タンパク質）、副腎髄質（チロシン加水分解
酵素）、及びエピネフリン生産髄質細胞（髄質の役７５％を含み、フェニルエタ
ノールアミン Ｎ−メチルトランスフェラーゼ、又はＰＮＭＴにより選択的に染
色した）、及び分割細胞（ＢＲＤＵ）の輪郭を描くための試薬で一連の切片を染
色することにより実行した。これらの付加の終点は、これら分子マーカーの分散
を決定するために定性的に評価した。データは、ＪＭＰ統計ソフトウエア（ｖ．
３．２．１；ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いて評価した
。値は非パラメトリック試験を用いて遺伝型（”陽性”又は”陰性”）で検査し
た。

【０３０８】 ＡｐｏＥプロモーター作動トランスジーンの発現分析は、ノーザンブロットを
用いて行った。全ての細胞のＲＮＡは、製造者のプロトコルに従い、Ｐｅｒｆｅ
ｃｔ ＲＮＡ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｃｒｏ
Ｓｃａｌｅ社製）（５プライム３プライム、製造番号２−０３６３６４）を用い
て肝臓切片から単離した。全ＲＮＡ（１０μｇ）は、ホルムアルデヒドゲルとと
もに１％アガロース／１ｘＭＯＰＳにかけた。そのゲルは５０ｍＭ ＮａＯＨ／
１５０ｍＭ ＮａＣｌ中で変性し、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０／
１５０ｍＭ ＮａＣｌ中で中性化した。ＲＮＡは、Ｄｕａｌｏｎ−ＵＶ膜（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ社製、製造番号４２０１０１）上に移し、ＵＶ照射により膜上
に架橋した。

【０３０９】 プローブはＧＲＮＦ４内部ＰＣＲフラグメントから作製した。ＧＲＮＦ４ｃＤ
ＮＡは、内部ＰＣＲフラグメントを得るため、オリゴヌクレオチド２０２９−４
９と２００３−４３とともに鋳型として用いた。使用した手順と条件は後述され
る。

【０３１０】

【表１１】

【０３１１】 ２ｎｇ ＧＲＮＦ４ｃＤＮＡ、１μｌ オリゴヌクレオチド２０２９−４９（
２０ｎＭ）、１μｌ オリゴヌクレオチド２００３−４３（２０ｎＭ）、１μｌ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、製造番号７４１１−１）、
１０μｌ １０ｘ富ＧＣ ＰＣＲ緩衝液、１μｌ富ＧＣ Ｔａｑポリメラーゼ（
Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、製造番号２
１４０ ３０６）、３５μｌ ｄＨ_２Ｏ。９４℃／３分；（９４℃／３０秒、
６１℃／３０秒、７２℃／３０秒）ｘ３５サイクル；７２℃／７分。

【０３１２】 このＧＲＮＦ４フラグメントは、製造者の指示に従ってＲｅｄｉＰｒｉｍｅ
ＩＩ ｒａｎｄｏｍ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社
製、製造番号ＲＰＮ１６３３）によって該プローブを作製するために用いた。該
プローブは、製造者の指示に従ってＧ２５セファデックスカラム（Ｒｏｃｈｅ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、製造番号１２７３−９２
２）を用いて精製した。ブロットは、製造者の指示に従ってＥｘｐｒｅｓｓ Ｈ
ｙｂ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，製造番号８０１５−２）を用いてプローブし、さらに
Ｘ線フィルムに暴露した。

【０３１３】 結果と考察： 特記しない限り、両方の性別についての測定を評価用にプールした。表現型応
答において潜在的に性別に関連した相違を定義することが必要であった場合に、
それぞれの性別用のパラメータを個別に考慮した。値は、パーセントとして（指
定した参考値に対して）又は平均値±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）としてリスト化した
。そのテキストはＧＲＮＦ４−処理動物だけに異常な所見を示す。

【０３１４】 検死データ ラジオグラフィー：骨及び軟組織異常性は、何れの動物のラジオグラフィーに
おいても現れなかった。非常に高い発現体ｎｏ．６３のプロファイルはごく小さ
かった。

【０３１５】 肉眼的所見：非常に高い発現体（ｎｏｓ．２０、６３）の両方及び１匹の低い
発現体（ｎｏ．６７）の副腎は、非発現マウスのそれらに比べて明らかに拡大し
た。

【０３１６】 体重及び器官重量データ：ほとんどの場合、平均と個々の絶対体重及び器官重
量同じく全ての体重対器官重量割合は、陽性及び陰性マウスで共通であった。非
常に高い発現体の雌ｎｏ．６３の全体重は、この実験における他のマウスに対し
て低かったが、この系統のマウスの史的範囲内であった。中程度の発現体ｎｏ．
７０は、その総体肝臓重量における限られた増加を示した。

【０３１７】 臨床病理学データ 血液学：血液学の値は発現レベルに関係なく、陽性と陰性マウスで同様であっ
た。

【０３１８】 臨床化学：臨床化学の値は、陽性と陰性マウスで同等であり、トランスジーン
発現のレベルに従って変化しない。低い発現体ｎｏ．６７は、血液採取における
困難の結果と思われる、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）およびアスパラギン酸（ＡＳ
Ｔ）アミノトランスフェラーゼの血清レベルが顕著に増加していた。

【０３１９】 組織病理学所見： トランスジーンと潜在的に関連した病変：幾つかの器官における神経要素の顕
微鏡的病変は、トランスジーンＲＮＡの発現と関係付けられた。影響を受けた組
織は、末梢自律神経系から得られた。

【０３２０】 一つの顕著な所見は、８匹の発現体の全てにおいてある程度まで生じた、副腎
髄質とそれに隣接した自律神経節における神経堤−由来細胞の形成異常であった
（β−アクチンプロモーターで観測された所見に類似する、図１９）。この病変
は、神経節の即座のデモンストレーション（コントロールマウスにおいて、これ
らの器官では典型的に見出すことが困難である）および副腎髄質の細胞による神
経節ニューロンの付着又は合併によって特徴付けられた。その範囲は、中程度の
又は顕著な病変を有する大部分の動物について最小乃至顕著まで変動した。その
ような神経節は陰性マウスにおいては非常な困難を伴い見出され、且つ神経要素
は副腎髄質において欠いていた。

【０３２１】 別の主要な所見は、尿道と膀胱の接合部に近い結合組織において自律神経及び
神経節の顕著な過形成であった（β−アクチンプロモーターで観測された所見に
類似する、図２０）。この変化は、８匹の発現体の７匹（８８％）に発生した。
その病変の程度は、副腎の変化の深刻度に関連した。３匹のマウス（３８％）に
おいて、膀胱三角に近い膀胱壁中の神経節が拡大した。一方、これらの神経及び
神経節は、コントロールマウスの膀胱及び隣接結合組織ではほとんど見られない
。

【０３２２】 結腸の腸管筋神経節中のニューロンは、コントロールにおいて同じ構造が小乃
至中位サイズのニューロンの間欠性クラスターからなっている一方で、４匹の発
現体（５０％）において肥大したことが示された。しかしながら、全ての動物か
らの結腸の２つの独立した組織病理学的分析は、陰性とトランスジェニックマウ
スの間を確実に区別できなかった。中枢および末梢体性神経系は、トランスジェ
ニックマウスにおいて影響ないことが見られた。野生型動物は、これらの所見を
示さない。

【０３２３】 結論 ＥＳＴ配列、ＧＲＮＦ４をコードしているｓｍｃｂ２−０００１１−ｄ２は、
β−アクチンプロモーターの制御下で偏在して発現した場合、末梢自律神経病変
を誘導することが示されている。本実験において、同じ配列は、アポリポタンパ
ク質Ｅプロモーターの制御下で肝臓分泌タンパク質として発現する時、匹敵する
分布と深刻度の変化を誘導した。２つの主な所見は、副腎髄質及びそれに隣接し
た自律神経節における神経堤−由来細胞の形成異常、及び骨盤の結合組織中の自
律神経及び神経節の顕著な過形成であった。トランスジェニックマウスの他の組
織（脳、脊髄、末梢神経、およびエンドクリン器官）は重大な変化を示さなかっ
た。

【０３２４】 本発明は、好ましい実施態様及び実例のポリヌクレオチド分子とアミノ酸配列
に関して記載されている一方、それは変形及び変更が当業者に行われるであろう
と解される。それ故に、添付した請求の範囲は、請求したような本発明の範囲内
にあるそのような全ての同等の変形例を包含することを意図する。この明細書中
に引用した参考文献の開示はここに参考として組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【図１ａ】 ＧＤＮＦのＣ末端活性ドメインとの相同性を示したクローン（ｓｍｃｂ２−０
００１１−ｄ２）のオープン・リーディング・フレームをコードするヌクレオチ
ドを示す図である。

【図１ｂ】 ｓｍｃｂ２−０００１１−ｄ２のオープン・リーディング・フレームとニュー
ロチュリンとの比較を示す図である。

【図１ｃ】 ｓｍｃｂ２−０００１１−ｄ２クローンをさらに配列決定することにより得ら
れたマウスＧＲＮＦ４の完全配列を示す図である。配列は、ＧＤＮＦ様相同性及
び３’−ＵＴＲを含む。

【図２】 マウスＧＲＮＦ４をコードするヌクレオチド配列（配列番号：＿）を含むポリ
ヌクレオチド分子を示す図である。完全長ＧＲＮＦ４タンパク質産物のアミノ酸
配列はヌクレオチド２１７〜８９１によりコードされている。

【図３】 完全長マウスＧＲＮＦ４タンパク質産物の２２４アミノ酸配列（配列番号：＿
）を示す図である。

【図４】 マウスＧＲＮＦ４及びニューロチュリンのアミノ酸配列の比較を示す図である
。マウスＧＲＮＦ４は、ニューロチュリンとおよそ３９％同一である。

【図５】 マウスＧＲＮＦ４アミノ酸配列とニューロチュリン、パーセフィン及びＧＤＮ
Ｆのアミノ酸配列との比較を示す図である。

【図６】 ヒトＧＲＮＦ４のヌクレオチド配列を示す図である。

【図７】 ヒトＧＲＮＦ４のアミノ酸配列を示す図である。

【図８】 マウスＧＲＮＦ４及びヒトＧＲＮＦ４のアミノ酸配列の比較を示す図である。

【図９】 ヒトＧＲＮＦ４に関するヒト組織のノーザンブロット分析を示す図である。

【図１０】 マウスＧＲＮＦ４に関するマウス組織のノーザンブロット分析を示す図である
。

【図１１】 非還元（ＮＲ）条件及び還元条件の１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画された
（^１２５Ｉ）−標識ＧＲＮＦ４のラジオオートグラフである。

【図１２】 （^１２５Ｉ）−標識ＧＲＮＦ４と、ＮＳＲ−５細胞（ＧＦＲα−３を発現する
遺伝学的に工作されたマウス神経芽腫Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞）の表面との結合を
示す図である。

【図１３】 ＧＲＮＦ４と、可溶性ｆｌａｇタグ付加ＧＦＲα−３タンパク質によりコート
されたバイオコア（ＢｉｏＣｏｒｅ）表面との結合を示す図である。

【図１４】 （^１２５Ｉ）−標識ＧＲＮＦ４と、可溶性ＧＦＲα−３−ヒトＦｃ融合タンパ
ク質との化学的クロスリンキングを示す図である。

【図１５】 （^１２５Ｉ）−標識ＧＲＮＦ４と、ＮＳＲ−５細胞において発現されたＧＦＲ
α−３及びＲｅｔ受容体との化学的クロスリンキングを示す図である。

【図１６】 ＮＳＲ−５細胞において発現されたＲｅｔ受容体の、ＧＲＮＦ４により誘導さ
れるチロシンリン酸化を示す図である。

【図１７】 ＮＳＲ−５細胞において発現されたＲｅｔ受容体の、ＧＲＮＦ４により誘導さ
れるチロシンリン酸化の用量依存性（図１７、パネルＡ）及びＮＳＲ−５細胞に
おいて発現されたＲｅｔ受容体の、ＧＲＮＦ４により誘導されるチロシンリン酸
化の動態（図１７、パネルＢ）を示す図である。

【図１８】 ＧＲＮＦ４コンセンサス配列を示す図である。

【図１９】 ＧＲＮＦ４トランスジーンの発現が、副腎髄質及び隣接するパラガングリオン
（いずれも、胚の神経冠細胞に由来）の顕著な形成異常を生じたことを示す図で
ある。髄組織は、大きく減少するか、又は消失し、副腎周囲の脂肪へと伸長した
ニューロンの柱と連続していた。対照的に、対照動物の副腎は、明確な皮膜を境
界とする規則的な細胞層からなっていた。ＨＥ染色。

【図２０】 ＧＲＮＦ４トランスジーンの発現が、膀胱の外壁、特に三角付近で、中程度か
ら顕著な程度の神経及び自律神経節の過形成（矢印）を生じたことを示す図であ
る。対照マウスの匹敵する範囲における神経及び神経節は、極めて小さかった。
ＨＥ染色。

【図２１】 ＧＲＮＦ４トランスジーンの発現が、骨盤結合組織（矢印）、特に尿道付近で
、中程度から顕著な程度の神経及び自律神経節の過形成を生じたことを示す図で
ある。対照マウスの匹敵する範囲における神経及び神経節は、極めて小さかった
。ＨＥ染色。

【図２２】 ＧＲＮＦ４トランスジーンの発現は、５匹の発現マウスにおいて、結腸の腸管
筋の神経節の肥大を生じ、肥大したニューロンの連続した層を形成したが、対照
マウスにおける同構造は、小から中サイズのニューロンの断続的なクラスターか
らなっていたことを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/16 Ｃ０７Ｋ 14/48 25/28 16/22 Ｃ０７Ｋ 14/48 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/22 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 5/10 33/577 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 33/577 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｂ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ミン，ホースン アメリカ合衆国、カリフオルニア・91320、 ニユーベリー・パーク、コナー・コート・ 3875 (72)発明者 チン，シユーチエン アメリカ合衆国、カリフオルニア・91362、 サウザンド・オークス、ボーデロ・レイ ン・3254 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA21 BA43 CA01 CA04 CA11 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 GA03 GA11 HA01 HA03 HA15 4B064 AG13 AG27 CA01 CA19 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 AB02 BA01 BA08 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA01 AA07 BA01 BA02 BA20 BA21 BA34 NA14 ZA02 ZA16 ZA20 ZA97 ZC21 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA53 CA40 DA21 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）図３（配列番号： ）、 ｂ）図３のアミノ酸残基８１乃至２２４（配列番号： ）、 ｃ）図３のアミノ酸残基１０９乃至２２４（配列番号： ）、 ｄ）図３のアミノ酸残基１１２乃至２２４（配列番号： ）、 ｅ）図３のアミノ酸残基１１９乃至２２４（配列番号： ）、 ｆ）図３のアミノ酸残基１２９乃至２２４（配列番号： ）、 ｇ）図７（配列番号： ）、 ｈ）図７のアミノ酸残基８１乃至２２８（配列番号： ）、 ｉ）図７のアミノ酸残基８９乃至２２８（配列番号： ）、 ｊ）図７のアミノ酸残基１１３乃至２２８（配列番号： ）、 ｋ）図７のアミノ酸残基１１６乃至２２８（配列番号： ）、 ｌ）図７のアミノ酸残基１３３乃至２２８（配列番号： ）、 ｍ）図１８（配列番号： ）、 ｎ）図１８のアミノ酸残基ＰＰＰ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）、 ｏ）図１８のアミノ酸残基ＡＡＲ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）、 ｐ）図１８のアミノ酸残基ＡＧＸａａ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）、及び ｑ）図１８のアミノ酸残基ＬＲＳ乃至ＣＬＧ（配列番号： ） からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離し且つ精製したタンパク質。
2. 【請求項２】 グリコシル化された請求項１に記載のタンパク質。
3. 【請求項３】 グリコシル化されていない請求項１に記載のタンパク質。
4. 【請求項４】 請求項１、２又は３のタンパク質と製薬上許容される担体の
   混合物を含む薬学的組成物。
5. 【請求項５】 請求項１に記載のタンパク質とアミノ酸配列が少なくとも８
   ２％同一であるタンパク質をコードする単離したポリヌクレオチド分子であって
   、前記タンパク質はＧＤＮＦファミリー受容体−アルファ−３（ＧＦＲα−３）
   に結合し、前記同一パーセントは標準デフォールトパラメータを用いてＧＡＰ、
   ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡによって決定される、ポリヌクレオチド分子。
6. 【請求項６】 請求項１に記載のタンパク質とアミノ酸配列が少なくとも９
   ０％同一であるタンパク質をコードする単離したポリヌクレオチド分子であって
   、前記タンパク質はＧＤＮＦファミリー受容体−アルファ−３（ＧＦＲα−３）
   に結合し、前記同一パーセントは標準デフォールトパラメータを用いてＢＬＡＳ
   ＴＰによって決定される、ポリヌクレオチド分子。
7. 【請求項７】 ａ）図２のヌクレオチド（配列番号： ）又はその相補体を
   含む分子、 ｂ）図３のアミノ酸残基８１乃至２２４（配列番号： ）を含むポリペプチド
   をコードしている分子、 ｃ）図３のアミノ酸残基１０９乃至２２４（配列番号： ）を含むポリペプチ
   ドをコードしている分子、 ｄ）図３のアミノ酸残基１１２乃至２２４（配列番号： ）を含むポリペプチ
   ドをコードしている分子、 ｅ）図３のアミノ酸残基１１９乃至２２４（配列番号： ）を含むポリペプチ
   ドをコードしている分子、 ｆ）図３のアミノ酸残基１２９乃至２２４（配列番号： ）を含むポリペプチ
   ドをコードしている分子、 ｇ）図６（配列番号： ）のヌクレオチドまたはその相補体を含む分子、 ｈ）図７のアミノ酸残基８１乃至２２８（配列番号： ）を含むポリペプチド
   をコードしている分子、 ｉ）図７のアミノ酸残基８９乃至２２８（配列番号： ）を含むポリペプチド
   をコードしている分子、 ｊ）図７のアミノ酸残基１１３乃至２２８（配列番号： ）を含むポリペプチ
   ドをコードしている分子、 ｋ）図７のアミノ酸残基１１６乃至２２８（配列番号： ）を含むポリペプチ
   ドをコードしている分子、 ｌ）図７のアミノ酸残基１３３乃至２２８（配列番号： ）を含むポリペプチ
   ドをコードしている分子、 ｍ）図３のアミノ酸配列（配列番号： ）を含むタンパク質をコードしている
   分子、 ｎ）図７のアミノ酸配列（配列番号： ）を含むタンパク質をコードしている
   分子、 ｏ）図１８のアミノ酸配列（配列番号： ）を含むタンパク質をコードしてい
   る分子、 ｐ）図１８のアミノ酸残基ＰＰＰ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）を含むタンパク
   質をコードしている分子、 ｑ）図１８のアミノ酸残基ＡＡＲ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）を含むタンパク
   質をコードしている分子、 ｒ）図１８のアミノ酸残基ＡＧＸａａ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）を含むタン
   パク質をコードしている分子、及び ｓ）図１８のアミノ酸残基ＬＲＳ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）を含むタンパク
   質をコードしている分子 からなる群から選択される単離したポリヌクレオチド分子。
8. 【請求項８】 ａ）請求項５のポリヌクレオチド分子の相補配列にストリン
   ジェント条件下でハイブリダイズする分子；及び ｂ）遺伝コードの縮重がなければ請求項５のポリヌクレオチド分子の相補配列
   にストリンジェント条件下でハイブリダイズする分子、 からなる群から選択される単離したポリヌクレオチド分子であり、ＧＤＮＦファ
   ミリー受容体−アルファ−３（ＧＦＲα−３）を結合するタンパク質をコードす
   る、単離したポリヌクレオチド分子。
9. 【請求項９】 請求項５、６、７又は８に記載のポリヌクレオチド分子を含
   むベクター。
10. 【請求項１０】 前記ポリヌクレオチド分子の増幅又は発現を達成し得る１
    またはそれ以上の作動要素をさらに含む、請求項９に記載のベクター。
11. 【請求項１１】 ａ）図３のアミノ酸残基８１乃至２２４（配列番号： ）
    を含むポリペプチドをコードしている分子、 ｂ）図３のアミノ酸残基１０９乃至２２４（配列番号： ）を含むポリペプチ
    ドをコードしている分子、 ｃ）図３のアミノ酸残基１１２乃至２２４（配列番号： ）を含むポリペプチ
    ドをコードしている分子、 ｄ）図３のアミノ酸残基１１９乃至２２４（配列番号： ）を含むポリペプチ
    ドをコードしている分子、 ｅ）図３のアミノ酸残基１２９乃至２２４（配列番号： ）を含むポリペプチ
    ドをコードしている分子、 ｆ）図７のアミノ酸残基８１乃至２２８（配列番号： ）を含むポリペプチド
    をコードしている分子、 ｇ）図７のアミノ酸残基８９乃至２２８（配列番号： ）を含むポリペプチド
    をコードしている分子、 ｈ）図７のアミノ酸残基１１３乃至２２８（配列番号： ）を含むポリペプチ
    ドをコードしている分子、 ｉ）図７のアミノ酸残基１１６乃至２２８（配列番号： ）を含むポリペプチ
    ドをコードしている分子、 ｊ）図７のアミノ酸残基１３３乃至２２８（配列番号： ）を含むポリペプチ
    ドをコードしている分子、 ｋ）図１８のアミノ酸残基ＰＰＰ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）を含むタンパク
    質をコードしている分子、 ｌ）図１８のアミノ酸残基ＡＡＲ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）を含むタンパク
    質をコードしている分子、 ｍ）図１８のアミノ酸残基ＡＧＸａａ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）を含むタン
    パク質をコードしている分子、及び ｎ）図１８のアミノ酸残基ＬＲＳ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）を含むタンパク
    質をコードしている分子 からなる群から選択されるポリヌクレオチド分子を含むベクター。
12. 【請求項１２】 請求項５、６、７又は８に記載のポリヌクレオチド分子を
    含む遺伝子操作した宿主細胞。
13. 【請求項１３】 請求項５、６、７又は８に記載のポリヌクレオチド分子を
    含む単離した宿主細胞。
14. 【請求項１４】 ａ）図３のアミノ酸配列（配列番号： ）、 ｂ）図３のアミノ酸残基８１乃至２２４（配列番号： ）、 ｃ）図３のアミノ酸残基１０９乃至２２４（配列番号： ）、 ｄ）図３のアミノ酸残基１１２乃至２２４（配列番号： ）、 ｅ）図３のアミノ酸残基１１９乃至２２４（配列番号： ）、 ｆ）図３のアミノ酸残基１２９乃至２２４（配列番号： ）、 ｇ）図７のアミノ酸配列（配列番号： ）、 ｈ）図７のアミノ酸残基８１乃至２２８（配列番号： ）、 ｉ）図７のアミノ酸残基８９乃至２２８（配列番号： ）、 ｊ）図７のアミノ酸残基１１３乃至２２８（配列番号： ）、 ｋ）図７のアミノ酸残基１１６乃至２２８（配列番号： ）、 ｌ）図７のアミノ酸残基１３３乃至２２８（配列番号： ）、 ｍ）図１８のアミノ酸配列（配列番号： ）、 ｎ）図１８のアミノ酸残基ＰＰＰ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）、 ｏ）図１８のアミノ酸残基ＡＡＲ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）、 ｐ）図１８のアミノ酸残基ＡＧＸａａ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）、及び ｑ）図１８のアミノ酸残基ＬＲＳ乃至ＣＬＧ（配列番号： ） からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質を発現し、前記タンパ
    ク質がＧＤＮＦファミリー受容体−アルファ−３（ＧＦＲα−３）に結合し得る
    、遺伝子操作した宿主細胞。
15. 【請求項１５】 請求項１０に記載のベクターを含む遺伝子操作した宿主細
    胞。
16. 【請求項１６】 前記細胞がヒトへの移植用に適し、前記細胞が前記ポリヌ
    クレオチド分子を発現し且つ分泌する、請求項１２に記載の遺伝子操作した宿主
    細胞。
17. 【請求項１７】 前記細胞がヒトへの移植用に適する、請求項１３に記載の
    単離した宿主細胞。
18. 【請求項１８】 前記細胞がヒトへの移植用に適する半透膜に包囲された請
    求項１６又は１７に記載の単離した宿主細胞。
19. 【請求項１９】 ＧＤＮＦファミリー受容体−アルファ−３（ＧＦＲα−３
    ）に結合し得るタンパク質の製造方法であり、 ａ）前記宿主細胞による前記タンパク質の発現に適した条件下で、請求項５、
    ６、７又は８に記載の単離したポリヌクレオチド分子を含む宿主細胞を培養する
    工程；及び ｂ）任意に、前記宿主細胞で発現した前記タンパク質を単離する工程 を含む、タンパク質の製造方法。
20. 【請求項２０】 ＧＤＮＦファミリー受容体−アルファ−３（ＧＦＲα−３
    ）に結合し得るタンパク質の製造方法であって、 ａ）前記宿主細胞による前記タンパク質の発現に適した条件下で、請求項１に
    記載のタンパク質をコードしているポリヌクレオチド分子を含む単離した宿主細
    胞を培養する工程；及び ｂ）任意に、前記宿主細胞で発現した前記タンパク質を単離する工程 を含む、タンパク質の製造方法。
21. 【請求項２１】 前記ポリヌクレオチド分子が、 ａ）図３のアミノ酸残基８１乃至２２４（配列番号： ）、 ｂ）図３のアミノ酸残基１０９乃至２２４（配列番号： ）、 ｃ）図３のアミノ酸残基１１２乃至２２４（配列番号： ）、 ｄ）図３のアミノ酸残基１１９乃至２２４（配列番号： ）、又は ｅ）図３のアミノ酸残基１２９乃至２２４（配列番号： ） を含むタンパク質をコードする、請求項１９に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記ポリヌクレオチド分子が、 ａ）図７のアミノ酸残基８１乃至２２８（配列番号： ）、 ｂ）図７のアミノ酸残基８９乃至２２８（配列番号： ）、 ｃ）図７のアミノ酸残基１１３乃至２２８（配列番号： ）、 ｄ）図７のアミノ酸残基１１６乃至２２８（配列番号： ）、 ｅ）図７のアミノ酸残基１３３乃至２２８（配列番号： ）、 ｆ）図１８のアミノ酸残基ＰＰＰ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）、 ｇ）図１８のアミノ酸残基ＡＡＲ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）、 ｈ）図１８のアミノ酸残基ＡＧＸａａ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）、又は ｉ）図１８のアミノ酸残基ＬＲＳ乃至ＣＬＧ（配列番号： ） を含むタンパク質をコードする、請求項１９に記載の方法。
23. 【請求項２３】 請求項１９に記載の方法に従い作製した単離し且つ精製し
    たタンパク質。
24. 【請求項２４】 請求項２０に記載の方法に従い作製した単離し且つ精製し
    たタンパク質。
25. 【請求項２５】 （ａ）宿主細胞によるタンパク質の発現に適した条件下で
    、 ｉ）図２のヌクレオチド（配列番号： ）又はその相補体を含む分子、 ｉｉ）図３のアミノ酸残基８１乃至２２４（配列番号： ）を含むポリペプチ
    ドをコードしている分子、 ｉｉｉ）図３のアミノ酸残基１０９乃至２２４（配列番号： ）を含むポリペ
    プチドをコードしている分子、 ｉｖ）図３のアミノ酸残基１１２乃至２２４（配列番号： ）を含むポリペプ
    チドをコードしている分子、 ｖ）図３のアミノ酸残基１１９乃至２２４（配列番号： ）を含むポリペプチ
    ドをコードしている分子、 ｖｉ）図３のアミノ酸残基１２９乃至２２４（配列番号： ）を含むポリペプ
    チドをコードしている分子、 ｖｉｉ）図６のヌクレオチド（配列番号： ）またはその相補体を含む分子、 ｖｉｉｉ）図７のアミノ酸残基８１乃至２２８（配列番号： ）を含むポリペ
    プチドをコードしている分子、 ｉｘ）図７のアミノ酸残基８９乃至２２８（配列番号： ）を含むポリペプチ
    ドをコードしている分子、 ｘ）図７のアミノ酸残基１１３乃至２２８（配列番号： ）を含むポリペプチ
    ドをコードしている分子、 ｘｉ）図７のアミノ酸残基１１６乃至２２８（配列番号： ）を含むポリペプ
    チドをコードしている分子、 ｘｉｉ）図７のアミノ酸残基１３３乃至２２８（配列番号： ）を含むポリペ
    プチドをコードしている分子、 ｘｉｉｉ）図３のアミノ酸配列（配列番号： ）を含むタンパク質をコードし
    ている分子、 ｘｉｖ）図７のアミノ酸配列（配列番号： ）を含むタンパク質をコードして
    いる分子、 ｘｖ）図１８のアミノ酸配列（配列番号： ）を含むタンパク質をコードして
    いる分子、 ｘｖｉ）図１８のアミノ酸残基ＰＰＰ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）を含むタン
    パク質をコードしている分子、 ｘｖｉｉ）図１８のアミノ酸残基ＡＡＲ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）を含むタ
    ンパク質をコードしている分子、 ｘｖｉｉｉ）図１８のアミノ酸残基ＡＧＸａａ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）を
    含むタンパク質をコードしている分子、及び ｘｉｘ）図１８のアミノ酸残基ＬＲＳ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）を含むタン
    パク質をコードしている分子 からなる群から選択されるポリヌクレオチド分子を含む宿主細胞を培養する工程
    ；及び （ｂ）任意に、前記宿主細胞で発現した前記タンパク質を単離する工程 を含む製造方法で作製した、ＧＤＮＦファミリー受容体−アルファ−３（ＧＦＲ
    α−３）に結合し得るタンパク質。
26. 【請求項２６】 図３（配列番号： ）、図７（配列番号： ）又は図１８
    （配列番号： ）のアミノ酸配列を含むペプチドに結合する抗体。
27. 【請求項２７】 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項２６に記載の
    抗体。
28. 【請求項２８】 前記抗体がポリクローナル抗体である請求項２６に記載の
    抗体。
29. 【請求項２９】 図３（配列番号： ）、図７（配列番号： ）又は図１８
    （配列番号： ）のアミノ酸配列を含むペプチドで動物を免疫化することによっ
    て生産される抗体。
30. 【請求項３０】 図３（配列番号： ）、図７（配列番号： ）又は図１８
    （配列番号： ）のアミノ酸配列を含むペプチドに結合するモノクローナル抗体
    を生産するハイブリドーマ。
31. 【請求項３１】 （ａ）移植に適する膜；及び （ｂ）請求項１に記載のタンパク質を分泌する、前記膜中に被包された細胞； を含む装置であり、前記膜は、前記タンパク質は透過し、前記細胞に不利益な物
    質は不透過である、装置。
32. 【請求項３２】 （ａ）移植に適する膜；及び （ｂ）前記膜中に被包された細胞、 を含む装置であって、前記細胞は： ｉ）図２のヌクレオチド（配列番号： ）を含む分子、 ｉｉ）図６のヌクレオチド（配列番号： ）を含む分子、 ｉｉｉ）図７のアミノ酸残基８１乃至２２８（配列番号： ）を含むタンパク
    質をコードしている分子、 ｉｖ）図７のアミノ酸残基８９乃至２２８（配列番号： ）を含むタンパク質
    をコードしている分子、 ｖ）図７のアミノ酸残基１１３乃至２２８（配列番号： ）を含むタンパク質
    をコードしている分子、 ｖｉ）図７のアミノ酸残基１１６乃至２２８（配列番号： ）を含むタンパク
    質をコードしている分子、 ｖｉｉ）図７のアミノ酸残基１３３乃至２２８（配列番号： ）を含むタンパ
    ク質をコードしている分子、 ｖｉｉｉ）図１８のアミノ酸残基ＰＰＰ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）を含むタ
    ンパク質をコードしている分子、 ｉｘ）図１８のアミノ酸残基ＡＡＲ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）を含むタンパ
    ク質をコードしている分子、 ｘ）図１８のアミノ酸残基ＡＧＸａａ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）を含むタン
    パク質をコードしている分子、及び ｘｉ）図１８のアミノ酸残基ＬＲＳ乃至ＣＬＧ（配列番号： ）を含むタンパ
    ク質をコードしている分子、 からなる群から選択されるポリヌクレオチド分子を含み、前記細胞は前記タンパ
    ク質を発現し且つ分泌し、 且つ前記膜は前記タンパク質を透過し、前記細胞に不利益な物質は不透過であ
    る、装置。
33. 【請求項３３】 薬学的組成物の製造のための請求項１に記載の単離し且つ
    精製したタンパク質の使用。
34. 【請求項３４】 薬学的に許容される担体と組み合わせて請求項１に記載の
    タンパク質を含む薬学的組成物。