JP4742025B2 - 変異ニューブラスチンのポリマー結合体 - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２００１年２月１日出願の米国仮特許出願第６０／２６６，０７１号（放棄）からの優先権を主張し、２００２年１月２５日出願の国際公開の米国特許出願公開第０２／０２３１９号からの優先権を主張する。

（発明の分野）
本発明は、タンパク質化学、分子生物学、神経生物学、神経学および疼痛の管理に関する。

（発明の背景）
神経栄養因子は、発生時の神経生存を調節し、成人の神経系の可塑性と構造的完全性を調節する天然タンパク質である。神経栄養因子は、神経組織および非神経組織から単離することができる。この２０年間に多数の神経栄養因子が発見されている。これらの神経栄養因子は、それらの構造および機能に基づいて、スーパーファミリー、ファミリー、サブファミリーおよび個々の種に分類できる。

神経栄養因子スーパーファミリーとしては、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）スーパーファミリー、ニューロトロフィンスーパーファミリー、および形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーが挙げられる。グリア細胞系由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）−関連リガンドは、ＴＧＦ−βスーパーファミリー内のタンパク質ファミリーである。ＧＤＮＦ関連リガンドとしては、ＧＤＮＦ、ペルセフィン（ＰＳＰ）、ニュールチュリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、およびニューブラスチン（ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）（ＮＢＮ；アルテミンまたはエノビンとして知られている）が挙げられる。ＧＤＮＦ関連リガンドファミリーのメンバーは、それらの７つの保存システイン残基によってその他のものと区別される。これらの残基は、分子内および分子間ジスルフィド架橋を形成し、二量化ポリペプチドリガンドの第三次構造および四次構造を生じさせる。また、ファミリーのメンバーは、ＧＦＲαファミリーのグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定補助レセプター、ＧＤＮＦ関連リガンドサブファミリーおよびＲＥＴチロシンキナーゼレセプターからなる多要素レセプター複合体を介して、シグナル伝達を誘導する能力を共通に有している。

活性化ＲＥＴは、少なくとも部分的にＧＤＮＦ関連リガンドの下流効果の原因となるシグナル伝達カスケードを開始させる。したがって、ＲＥＴの活性化は、ＧＦＲのレセプター経路を介して作用し、下流の細胞プロセスに影響を与える療法の望ましい一態様を示し得る。

ニューブラスチンは、７つのシステインモチーフなど、他のＧＤＮＦリガンドとの相同領域を共有しているため（例えば、欧州特許出願公開第０２／０２６９１号、国際公開の米国特許出願公開第０２／０２３１９号および米国特許出願公開第０２／０６３８８号に記載されているとおり）、また、ＧＦＲα複合体の一部としてのＲＥＴレセプターと結合し、それを活性化させる能力があるため、ＧＤＮＦファミリーの中に分類される。特に、ニューブラスチンは、ＧＦＲα３−ＲＥＴレセプター複合体との結合に関して高選択的である。それに関して、ニューブラスチンは、ＧＤＮＦ関連リガンドの他のメンバーに較べて、アミノ酸配列に独特なサブ領域を含有する。

ニューブラスチンは、末梢神経系および中枢神経系において、保護的および再生的な役割を有し得ること、そしてその結果、神経変性疾患の治療薬として有用であることが、現在のデータにより示唆されている。例えば、ニューブラスチンが、背根神経節および三叉神経節からの培養感覚神経ならびに培養黒質ドーパミン作動性神経に対して、生存促進効果を有し得ることが、データにより示唆されている（Ｂａｌｏｈら、Ｎｅｕｒｏｎ ２１：ｐ．１２９１−１３０２（１９９８））。したがって、ニューブラスチンは、感覚神経およびドーパミン作動性神経などの神経集団の生存を促進し得ると考えられる。神経の変性および機能不全は、疾患状態と関連してきたため、このことは重要である。例えば、感覚神経およびドーパミン作動性神経の病変は、各々末梢神経疾患およびパーキンソン病の基礎をなしている。

したがって、例えば、神経の変性および機能不全に関連する疾患の治療に、ニューブラスチンの投与は有用であり得る。しかし、ニューブラスチンは、身体により速やかに排泄され、このことが、治療適用に必要とされるニューブラスチン投与様式に影響を及ぼし得る。このように、生物学的利用能を増大させた修飾ニューブラスチンポリペプチドに対する必要性が存在している。したがって、生物学的利用能の増大を示すニューブラスチンの修飾形態を同定することが、本発明の１つの目的である。

（発明の要旨）
本発明は、ポリマーに結合した変異ニューブラスチンダイマーを提供する。各ダイマーは、第１のアミノ末端アミノ酸を含んでなる第１のポリペプチドおよび第２のアミノ末端アミノ酸を含んでなる第２のポリペプチドを含有する。各ポリペプチドは、個々に以下のものを含有する：（ａ）配列番号１のアミノ酸８〜１１３と、少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性があることを特徴とするアミノ酸配列；（ｂ）１６位、４３位、４７位、８０位、８１位、１０９位、および１１１位（配列番号１による番号付け）の各々におけるシステイン残基；（ｃ）以下のアミノ酸残基：１６位にＣ、１８位にＬ、２５位にＶ、２８位にＬ、２９位にＧ、３０位にＬ、３１位にＧ、３６位にＥ、４０位にＦ、４１位にＲ、４２位にＦ、４３位にＣ、４５位にＧ、４７位にＣ、８０位にＣ、８１位にＣ、８２位にＲ、８３位にＰ、９１位にＦ、９３位にＤ、１０５位にＳ、１０６位にＡ、１０９位にＣおよび１１１位にＣ；および（ｄ）ＬＧＬＧの反復（配列番号１の残基２８〜３１）、ＦＲＦＣモチーフ（配列番号１の残基４０〜４３）、ＱＰＣＣＲＰモチーフ（配列番号１の残基７８〜８３）およびＳＡＴＡＧＧＣモチーフ（配列番号１の残基１０５〜１１１）。前記ダイマーは、ポリマーが結合する内部ポリマー結合部位を提供する少なくとも１つのアミノ酸置換（配列番号１に関して）を含む。

また、本発明は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含有するポリマー結合変異ニューブラスチンダイマーを提供し、各ペプチドは、各置換基がポリマーの結合するポリマー結合部位を提供する１つから６つのアミノ酸置換を有する９０から１４０、例えば９５から１２０または１００から１１０のアミノ酸を含有する。本発明のポリペプチドの具体的な例としては、ＮＢＮ１１３（配列番号２）、ＮＢＮ１４０（配列番号６）、ＮＢＮ１１６（配列番号７）、ＮＢＮ１１２（配列番号８）、ＮＢＮ１１１（配列番号９）、ＮＢＮ１１０（配列番号１０）、ＮＢＮ１０９（配列番号１１）、ＮＢＮ１０８（配列番号１２）、ＮＢＮ１０７（配列番号１３）、ＮＢＮ１０６（配列番号１４）、ＮＢＮ１０５（配列番号１５）、ＮＢＮ１０４（配列番号１６）、ＮＢＮ１０３（配列番号１７）、ＮＢＮ１０２（配列番号１８）、ＮＢＮ１０１（配列番号１９）、ＮＢＮ１００（配列番号２０）およびＮＢＮ９９（配列番号２１）が挙げられる。

ダイマーにおける２つのアミノ末端アミノ酸のうちの少なくとも１つは、ポリマーに結合していることが好ましい。好ましいアミノ酸置換としては、リジン残基によるアルギニン残基の置換（Ｒａａ＃Ｋ、ここでａａ＃は、配列番号１に基づくアミノ酸番号）およびリジン残基による、またはアスパルテート残基によるアスパラギン残基の置換（Ｎａａ＃Ｋ）が挙げられる。そのような置換の具体例は、Ｒ１４Ｋ、Ｒ３９Ｋ、Ｒ６８Ｋ、Ｎ５９Ｄ、およびＮ５９Ｋ（配列番号１に基づく番号付け）である。特に好ましい置換は、Ｎ９５Ｋである。

ダイマーにおけるポリマーの分子量を合わせた合計は、２０，０００Ｄａから４０，０００Ｄａであることが好ましい。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは２，０００Ｄａ〜１００，０００Ｄａ、より好ましくは５，０００Ｄａ〜５０，０００Ｄａ、最も好ましくは約１０，０００Ｄａから２０，０００Ｄａである。前記ポリマーは、直鎖状であっても分枝状であってもよい。前記ポリマーは、ポリアルキレングリコール部分、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分であることが好ましい。幾つかの実施形態において、少なくとも１つのポリペプチドはグリコシル化されている。

本発明の幾つかの実施形態において、ポリマー結合ダイマーは、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含有し、ここで、（ａ）各ポリペプチドは、個々に配列番号１の１００から１１０のアミノ酸を含んでなり、（ｂ）各ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸番号９５において、アスパラギンからリジンへの置換を含み、（ｃ）ダイマーは、３つまたは４つのＰＥＧ部分を含んでなり、各ＰＥＧ部分の分子量は、約１０，０００Ｄａであり、また、各ＰＥＧ部分は、アミノ末端、またはリジン９５において結合している。好ましい実施形態は、３（，４）ｘ１０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋと称されるモノマー対を含有するホモダイマーである。

本発明は、本発明によるダイマーを含んでなる薬学的組成物を含む。幾つかの実施形態において、前記組成物は、本発明による２種以上の異なるダイマーを含有する。

本発明は、核酸、例えば、本発明のダイマーに組み込むためのポリペプチドをコードするＤＮＡ発現ベクターを含む。また、本発明は、前記核酸によって形質転換された宿主細胞を含む。

本発明は、哺乳動物における神経障害性疼痛を治療する方法を含む。前記方法は、哺乳動物に本発明のダイマーの治療有効量を投与することを含む。幾つかの実施形態において、治療有効量は、０．１μｇ／ｋｇから１０００μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇから１００μｇ／ｋｇまたは１μｇ／ｋｇから３０μｇ／ｋｇである。前記ダイマーの投与は、種々の経路、例えば、筋肉内、皮下または静脈内により行うことができる。本発明による幾つかの方法において、前記ダイマーは、１週間につき３回投与される。また、本発明は、哺乳動物におけるＰＥＴレセプターを活性化させる方法を提供する。前記方法は、哺乳動物に前記ダイマーの有効量を投与することを含む。

本発明の他の特徴と利点は、以下の詳細な説明および請求項から明らかとなろう。

（発明の詳細な説明）
他に言明しない限り、ニューブラスチンのアミノ酸位置番号の言及は、配列番号１に示された番号付けを言う。

他に定義しない限り、本明細書に用いられている全ての専門用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様な、または同等の方法および材料が、本発明の実践または試験に使用できるが、好適な方法および材料は下記に説明されている。本明細書に挙げられた全ての刊行物、特許出願、特許および引用文献は参照として、それらの全体が組み込まれている。矛盾がある場合は、定義を含む本明細書が規定する。なお、材料、方法および例は、例示目的のみであって限定の意図はない。

本明細書に用いられる「野生型ニューブラスチンポリペプチド」とは、天然のニューブラスチンポリペプチド配列を意味する。野生型ニューブラスチンポリペプチドは、ニューブラスチンの供給源、例えば、ヒト、マウスまたはラットのニューブラスチンによってさらに定義できる（例えば、配列番号２、３、または４を参照）。コンセンサスニューブラスチンポリペプチド配列は、配列番号１として提供される。

本明細書に用いられる「変異ニューブラスチンポリペプチド」とは、野生型ニューブラスチンポリペプチドに関し、少なくとも指定された最小レベルの配列同一性を含有し、野生型ニューブラスチンポリペプチドに関し少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入または融合を含有し、ニューブラスチン活性を示すポリペプチドを意味する（例えば、国際公開の米国特許出願公開第０２／０２３１９号（国際公開第０２／０６０９２９号）に記載されたもの）。

本明細書に用いられる「内部ポリマー結合部位」とは、ポリマー結合に好適な側鎖を提供する、変異ニューブラスチンポリペプチドにおける非末端アミノ酸残基を意味する。

本明細書に用いられる「修飾ニューブラスチンポリペプチド」とは、少なくとも１つの結合されているポリマーを含有するポリペプチドを意味する。

本明細書に用いられる「融合」とは、同じ読み取り枠内でこれらのタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子の遺伝子発現により、対応するペプチド主鎖を介して２つ以上のポリペプチドの共直線性の共有結合を意味する。

本明細書に用いられる「同一性」とは、２つのポリペプチド分子間の、または２つの核酸間の配列類似性を言う。２つの比較された配列の両方におけるある位置が、同一の塩基またはアミノ酸モノマーサブ単位によって占められている場合（例えば、２つのＤＮＡ分子の各々におけるある位置がアデニンによって占められている、または２つのポリペプチドの各々におけるある位置がリジンによって占められている場合）、各々の分子は、その位置において相同である。２つの配列間の「パーセンテージ同一性」は、２つの配列に共有されている対合位置数を比較された位置数で割ったものｘ１００の関数である。例えば、２つの配列において、１０の位置のうち６つが対合していれば、この２つの配列は、６０％同一性を有する。例えば、ＤＮＡ配列のＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴは５０％の相同性を有する（合計６つの位置のうち３つが対合している）。一般に、２つの配列が最大の相同性を与えるように配列されている場合に比較がなされる。このような配列は、例えば、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ社）などのコンピュータプログラムにより簡便に実施されるＮｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８：ｐ．４４３−４５３（１９７０）の方法を用いて提供できる。「類似」配列とは、配列された際、同一の、および類似のアミノ酸残基を共有する配列であり、ここで類似残基は、配列された参照配列における対応するアミノ酸残基残基の保存的置換か、または「許容された点変異」である。これに関して、参照配列における残基の「保存的置換」とは、対応する参照残基と物理的または機能的に類似している、例えば、同様のサイズ、形状、電荷、共有結合または水素結合を形成する能力などの化学的性質などを有する残基による置換である。したがって、「保存的置換変異」配列は、１つ以上の保存的置換または許容された点変異が存在する点で、参照配列または野生型配列と異なる配列である。２つの配列間の「正のパーセンテージ」は、２つの配列に共有された対合残基または保存的置換を含有する位置の数を、比較された位置の数で割ったものｘ１００の関数である。例えば、２つの配列において、１０の位置のうち６つが対合しており、１０の位置のうち２つが保存的置換を含有している場合、この２つの配列は、８０％正の相同性を有している。

（変異ニューブラスチンポリペプチド類）
本発明の変異ニューブラスチンポリペプチド類は、神経栄養性活性を保持し、野生型ニューブラスチンポリペプチドに比して増強した生物学的利用能を有する。例えば、本発明の変異ニューブラスチン類は、野生型ニューブラスチンがＲＥＴを活性化するアッセイにおいて、ＲＥＴ遺伝子産物を活性化する。一般に変異ニューブラスチンポリペプチドは、以下の特徴のうち、少なくとも１つを保持するが、それに加えて内部ポリマー結合部位が生じるような少なくとも１つの変更を含んでなる：
（ｉ）配列番号１〜４により番号付けした１６位、４３位、４７位、８０位、８１位、１０９位、および１１１位における７つの保存システイン残基；
（ｉｉ）以下のアミノ酸残基：各々、配列番号１〜４により番号付けした１６位にＣ、１８位にＬ、２５位にＶ、２８位にＬ、２９位にＧ、３０位にＬ、３１位にＧ、３６位にＥ、４０位にＦ、４１位にＲ、４２位にＦ、４３位にＣ、４５位にＧ、４７位にＣ、８０位にＣ、８１位にＣ、８２位にＲ、８３位にＰ、９１位にＦ、９３位にＤ、１０５位にＳ、１０６位にＡ、１０９位にＣおよび１１１位にＣ；
（ｉｉｉ）ＬＧＬＧ反復単位（配列番号１の残基２８〜３１）、ＦＲＦＣモチーフ（配列番号１の残基４０〜４３）、ＱＰＣＣＲＰモチーフ（配列番号１の残基７８〜８３）およびＳＡＴＡＧＧＣモチーフ（配列番号１の残基１０５〜１１１）。

幾つかの実施形態において、本発明は、切断変異ニューブラスチンポリペプチドを提供し、ここで切断ニューブラスチンポリペプチドは、成熟ニューブラスチンポリペプチドの１つ以上のアミノ末端アミノ酸を欠如しているが、内部ポリマー付加を有するように変異している。前記切断変異ニューブラスチンポリペプチドは、二量化した際、ＲＥＴポリペプチドを活性化することが好ましい。幾つかの実施形態において、変異ニューブラスチンポリペプチドは、ＲＥＴポリペプチドの二量化を誘導する。当業者には明らかであると思われるが、このような誘導には、さらなるポリペプチドまたは補因子を必要とし得る。

ヒトおよびマウスのニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列が、国際公開第００／０１８１５号に開示されている。本発明による野生型ニューブラスチンポリペプチドの例は、表１Ａに示されている。ニューブラスチンコンセンサス配列（ヒト、マウスおよびラットに関してコンセンサス）は、表１Ｂに記載されている。

幾つかの実施形態において、表１Ａにおいて太字で示されたアルギニン（ＡｒｇまたはＲ）またはアスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）残基の少なくとも１つは、異なるアミノ酸残基によって置換されている。好ましい一実施形態において、変異ニューブラスチンポリペプチドは、表１Ａに星印で示された９５位のアミノ酸において、アスパラギンの代わりにリジン（ＬｙｓまたはＫ）残基を有し、ＮＢＮ−Ｎ９５Ｋと称される。一般に、Ｎ９５Ｋ置換は、溶解度の改善を生じる。これは高濃度での処方物に役立つ。

本発明は、例えば、配列番号１の８〜１１３のアミノ酸（やはり表１に示されている）に少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含んでなるポリマーに結合した変異ニューブラスチンポリペプチドを含む。一実施形態において、１４位。３９位、６８位のアルギニンまたは９５位のアスパラギンのうちの１つ以上が、アルギニンまたはアスパラギン以外のアミノ酸によって置換される。一実施形態において、野生型アミノ酸は、リジンまたはシステインにより置換される。

変異ニューブラスチンポリペプチドにおいて置換される残基は、置換されるアミノ酸におけるポリマー、例えば、ポリアルキレングリコールポリマーの結合を助けるために選択できる。有利な変更部位は、ニューブラスチンポリペプチドにおける溶媒受容領域における部位である。そのような部位は、その結晶構造が、Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．４：ｐ．４３５−３８、１９９７年に記載されているＧＤＮＦなどの関連神経栄養因子の結晶構造の検査に基づいて選択できる。また、その結晶化と構造決定が、下記に記載されているニューブラスチンの結晶構造に基づいて部位を選択できる。また、ペルセフィン／ニューブラスチンキメラタンパク質に関して提供された構造−機能情報に基づいて部位を選択できる。これらのキメラは、Ｂａｌｏｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：ｐ．３４１２−２０、２０００年に記載されている。この方法論により同定された溶媒接触可能な、または表面露出したニューブラスチンアミノ酸の例示的一覧は表２に記載されている。

表２は、表面露出していると考えられるヒトニューブラスチンの残基と番号の一覧である。第１列は、Ａ鎖およびＢ鎖（ＰＤＢコード１ＡＧＱ）により形成されたラットＧＤＮＦの構造を調べることにより、また、残基が、その構造の表面にあるかどうかを決定することによって決定された表面露出残基を表す。次に、この構造を、ＧＤＮＦの配列アラインメントおよびＢａｌｏｈら、Ｎｅｕｒｏｎ ２１：ｐ．１２９１−１３０２、１９９８年におけるニューブラスチンと比較してニューブラスチンにおける適切な残基を決定した。第２列と第３列は、各々Ａ鎖およびＢ鎖により形成されたヒトニューブラスチンダイマーの構造を調べることにより決定された表面露出残基を表す。表２における番号付けの概要は、表１に示されたものである。

ｎは、その残基がＧＤＮＦまたはニューブラスチンの構造内に存在しないことを示す。ＧＤＮＦ（６８〜７１残基）に関連するニューブラスチンにおける構造デザイン、屈曲性領域または挿入のいずれかによる。
−は、その残基が埋め込まれていて表面にはないか、またはジスルフィド結合に含まれるシステイン残基であることを示す。
＋は、６６〜７５残基を含有するループが、ＧＤＮＦモノマーの１つ（屈曲性と思われる）だけに見られるが、この残基がＧＤＮＦ構造において、またはニューブラスチン構造において表面露出していることを示す。

幾つかの実施形態において、ニューブラスチンポリペプチドは、ＧＤＮＦサブファミリーおよびＴＧＦ−ベータスーパーファミリーの特徴である７つの保存Ｃｙｓ残基を保持する。

ヒトの完全長プレプロＮＢＮポリペプチド（配列番号５）の配列が表３に示されている。ニューブラスチンポリペプチドの３つの成熟形態が同定された。これらの形態としては以下のものが挙げられる：
（ｉ）配列番号６と称されるアミノ酸配列を有する、本明細書においてＮＢＮ１４０と称される１４０ＡＡポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号７と称されるアミノ酸配列を有する、本明細書においてＮＢＮ１１６と称される１１６ＡＡポリペプチド；および
（ｉｉｉ）配列番号２と称されるアミノ酸配列を有する、本明細書においてＮＢＮ１１３と称される１１３ＡＡポリペプチド。

表３は、開示された本発明のプレプロニューブラスチンポリペプチド配列間の関係を示している。ライン１は、配列番号５のポリペプチドを提供しており、ライン２は、配列番号６のポリペプチドを提供しており、ライン３は、配列番号７のポリペプチドを提供しており、ライン４は、配列番号２のポリペプチドを提供している。７つの保存システイン残基は、成熟二量化ニューブラスチンリガンドにおいて形成された分子内（^＊による^＊、＃による＃、＋による＋）および分子間（「｜」）ジスルフィド架橋を示すために記号（「^＊」、「＃」、「＋」および「｜」）によって示されている。挿入記号（「＾」）は、ＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋにおいて、アミノ酸９５位におけるリジンにより置換されたアスパラギン残基を示している。

代替の実施形態において、上記に同定されたニューブラスチンポリペプチドの配列は、それらのアミノ末端アミノ酸配列において切断されている。これらの例としては、以下のものが挙げられる：
（ｉｖ）ニューブラスチンポリペプチドの１１２カルボキシ末端アミノ酸、例えば配列番号６（配列番号８）の２９〜１４０のアミノ酸または配列番号１、３または４の２〜１１３のアミノ酸を有する、本明細書においてＮＢＮ１１２と称される１１２ＡＡポリペプチド配列。

（ｖ）ニューブラスチンポリペプチドの１１１カルボキシ末端アミノ酸、例えば配列番号６（配列番号９）の３０〜１４０のアミノ酸または配列番号１、３または４の３〜１１３のアミノ酸を有する、本明細書においてＮＢＮ１１１と称される１１１ＡＡポリペプチド配列。

（ｖｉ）ニューブラスチンポリペプチドの１１０カルボキシ末端アミノ酸、例えば配列番号６（配列番号１０）の３１〜１４０のアミノ酸または配列番号１、３または４の４〜１１３のアミノ酸を有する、本明細書においてＮＢＮ１１０と称される１１０ＡＡポリペプチド配列。

（ｖｉｉ）ニューブラスチンポリペプチドの１０９カルボキシ末端アミノ酸、例えば配列番号６（配列番号１１）の３２〜１４０のアミノ酸または配列番号１、３または４の５〜１１３のアミノ酸を有する、本明細書においてＮＢＮ１０９と称される１０９ＡＡポリペプチド配列。

（ｖｉｉｉ）ニューブラスチンポリペプチドの１０８カルボキシ末端アミノ酸、例えば配列番号６（配列番号１２）の３３〜１４０のアミノ酸または配列番号１、３または４の６〜１１３のアミノ酸を有する、本明細書においてＮＢＮ１０８と称される１０８ＡＡポリペプチド配列。

（ｉｘ）ニューブラスチンポリペプチドの１０７カルボキシ末端アミノ酸、例えば配列番号６（配列番号１３）の３４〜１４０のアミノ酸または配列番号１、３または４の７〜１１３のアミノ酸を有する、本明細書においてＮＢＮ１０７と称される１０７ＡＡポリペプチド配列。

（ｘ）ニューブラスチンポリペプチドの１０６カルボキシ末端アミノ酸、例えば配列番号６（配列番号１４）の３５〜１４０のアミノ酸または配列番号１、３または４の８〜１１３のアミノ酸を有する、本明細書においてＮＢＮ１０６と称される１０６ＡＡポリペプチド配列。

（ｘｉ）ニューブラスチンポリペプチドの１０５カルボキシ末端アミノ酸、例えば配列番号６（配列番号１５）の３６〜１４０のアミノ酸または配列番号１、３または４の９〜１１３のアミノ酸を有する、本明細書においてＮＢＮ１０５と称される１０５ＡＡポリペプチド配列。

（ｘｉｉ）ニューブラスチンポリペプチドの１０４カルボキシ末端アミノ酸、例えば配列番号６（配列番号１６）の３７〜１４０のアミノ酸または配列番号１、３または４の１０〜１１３のアミノ酸を有する、本明細書においてＮＢＮ１０４と称される１０４ＡＡポリペプチド配列。

（ｘｉｉｉ）ニューブラスチンポリペプチドの１０３カルボキシ末端アミノ酸、例えば配列番号６（配列番号１７）の３８〜１４０のアミノ酸または配列番号１、３または４の１１〜１１３のアミノ酸を有する、本明細書においてＮＢＮ１０３と称される１０３ＡＡポリペプチド配列。

（ｘｉｖ）ニューブラスチンポリペプチドの１０２カルボキシ末端アミノ酸、例えば配列番号６（配列番号１８）の３９〜１４０のアミノ酸または配列番号１、３または４の１２〜１１３のアミノ酸を有する、本明細書においてＮＢＮ１０２と称される１０２ＡＡポリペプチド配列。

（ｘｖ）ニューブラスチンポリペプチドの１０１カルボキシ末端アミノ酸、例えば配列番号６（配列番号１９）の４０〜１４０のアミノ酸または配列番号１、３または４の１３〜１１３のアミノ酸を有する、本明細書においてＮＢＮ１０１と称される１０１ＡＡポリペプチド配列。

（ｘｖｉ）ニューブラスチンポリペプチドの１００カルボキシ末端アミノ酸、例えば配列番号６（配列番号２０）の４１〜１４０のアミノ酸または配列番号１、３または４の１４〜１１３のアミノ酸を有する、本明細書においてＮＢＮ１００と称される１００ＡＡポリペプチド配列。

（ｘｖｉｉ）ニューブラスチンポリペプチドの９９カルボキシ末端アミノ酸、例えば配列番号６（配列番号２１）の４２〜１４０のアミノ酸または配列番号１、３または４の１５〜１１３のアミノ酸を有する、本明細書においてＮＢＮ９９またはＮ−１４と称される９９ＡＡポリペプチド配列。

ＮＢＮ１１３からＮＢＮ９９に関するこれらの切断ニューブラスチンポリペプチドのポリペプチド配列は、表４に示されている。ジスルフィド架橋形成は表３に記載されているとおりである。

本発明による変異ニューブラスチンポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸８〜１１３と、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であり得る。幾つかの実施形態において、変異ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列は、変異ニューブラスチンポリペプチドの１〜９４および９６〜１１３のアミノ酸において、天然のラット、ヒトまたはマウスのニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列を含み、例えば、前記ポリペプチドは、これらの位置に配列番号２、３または４のアミノ酸配列を有する。

配列番号１〜４に開示されている配列と異なった配列の変異ニューブラスチンポリペプチドは、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含み得る。あるいは、またはそれに加えて、変異ニューブラスチンポリペプチドは、１つ以上の非保存的アミノ酸置換により、または欠失または挿入により、異なり得る。前記の置換、挿入または欠失によって単離されたタンパク質の生物的活性が損なわれないことが好ましい。

保存的置換は、１つのアミノ酸と同様な特徴を有する他のアミノ酸との置換である。保存的置換としては、以下の群内の置換が挙げられる：バリン、アラニンとグリシン；ロイシン、バリンとイソロイシン；アスパラギン酸とグルタミン酸；アスパラギンとグルタミン；セリン、システインとトレオニン；リジンとアルギニン；ならびにフェニルアラニンとチロシン。非極性疎水性アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正電荷（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負電荷（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。上記の極性基、塩基性基または酸性基の１メンバーの、同じ群の他のメンバーによるいずれの置換も保存的置換と考えることができる。

他の置換は、通常の当業者により容易に同定できる。例えば、アミノ酸、アラニンに対しては、Ｄ−アラニン、グリシン、ベータ−アラニン、システインおよびＤ−システインのうち、任意のものを採用できる。リジンに対しては、Ｄ−リジン、アルギニン、Ｄ−アルギニン、ホモ−アルギニン、メチオニン、Ｄ−メチオニン、オルニチンまたはＤ−オルニチンのうち、任意のものの置換ができる。一般に、単離ポリペプチドの性質の変化を誘導すると考えることのできる、機能的に重要な領域における置換は、以下の置換である：（ｉ）極性残基、例えば、セリンまたはトレオニンと疎水性残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンまたはアラニンとの置換；（ｉｉ）システイン残基と他の任意の残基との置換；（ｉｉｉ）正電荷側鎖を有する残基、例えば、リジン、アルギニンまたはヒスチジンと、負電荷側鎖を有する残基、例えば、グルタミン酸、またはアスパラギン酸との置換；または（ｉｖ）かさ高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンと、そのような側鎖を有さない残基、例えばグリシンとの置換。前述の非保存的置換の１つが、タンパク質の機能特性を変化させる可能性は、そのタンパク質の機能的に重要な領域に関する置換の位置にも関連している。したがって、幾つかの非保存的置換は、生物学的性質に殆ど影響を及ぼさないか、全く影響を及ぼさない。

多くの場合、ポリマー結合変異ニューブラスチンポリペプチドは、ポリマー不在下における野生型ポリペプチドまたは変異ポリペプチドの血清半減期に較べて、より長い血清半減期を有している。幾つかの実施形態において、ポリマー結合変異ニューブラスチンポリペプチドは、ポリマー不在下におけるポリペプチドまたはグリコシル化ポリペプチドの効力に較べて、著しく増強したインビボ効力を有している。

ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドは、少なくとも１種のポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドを含むダイマーとして提供し得る。幾つかの実施形態において、前記ダイマーは、ポリマー結合変異ニューブラスチンポリペプチドのホモダイマーである。他の実施形態において、前記ダイマーは、ポリマー結合変異切断ニューブラスチンポリペプチドのホモダイマーである。他の実施形態において、前記ダイマーは、１種のポリマー結合変異ニューブラスチンポリペプチドおよび１種の野生型ニューブラスチンポリペプチドを含むヘテロダイマーである。他の実施形態において、前記ダイマーは、ポリマー結合がアミノ末端にあり、ポリペプチドが切断されていても、いなくてもよい１種のポリマー結合変異ニューブラスチンポリペプチドおよび１種のポリマー結合野生型ニューブラスチンポリペプチドを含むヘテロダイマーである。他のダイマーとしては、切断されていても、いなくてもよいポリマー結合変異ニューブラスチンポリペプチド体のヘテロダイマーまたはホモダイマーが挙げられる。

本発明において、配列番号５で提供され、本明細書においてＮＢＮ＃（＃は、参照ニューブラスチンに残っているカルボキシ末端残基の数を表す）と称されるようなプレプロＮＢＮポリペプチドのカルボキシ最末端アミノ酸残基を含む成熟および切断変異ポリペプチド配列が提供される。生物活性ニューブラスチンダイマーに存在するポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドは、プロテアーゼ開裂反応または化学的開裂反応の生成物であり得るか、または組替えＤＮＡ構築体から発現できるか、または合成できる。ニューブラスチンポリペプチドの例としては、例えば、ＮＢＮ１４０、ＮＢＮ１１６、およびＮＢＮ１１３が挙げられる。本発明の他のニューブラスチンポリペプチドとしては、ＮＢＮ１１２、ＮＢＮ１１１、ＮＢＮ１１０、ＮＢＮ１０９、ＮＢＮ１０８、ＮＢＮ１０７、ＮＢＮ１０６、ＮＢＮ１０５、ＮＢＮ１０４、ＮＢＮ１０３、ＮＢＮ１０２、ＮＢＮ１０１、ＮＢＮ１００およびＮＢＮ９９（配列番号８〜２１）が挙げられる。

好ましいポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドは、３つの１０ｋＤａ ＰＥＧ部分（「３ｘ１０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋ」）または４つの１０ｋＤａ ＰＥＧ部分（「４ｘ１０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋ」）のいずれかに結合したＮＢＮ １０６−Ｎ９５Ｋのホモダイマーである。また、３つの１０ｋＤａ ＰＥＧ部分または４つの１０ｋＤａ ＰＥＧ部分のいずれかに結合した、本明細書において「３（，４）ｘ１０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋ」と称されるＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋホモダイマーの混合集団もまた好ましい。また、２つのアミノ末端アミノ酸がＰＥＧ部分に共有結合しており、３番目および／または４番目のＰＥＧ部分が置換Ｎ９５Ｋ残基（１つまたは複数）の１つまたは両方と共有結合している３（，４）ｘ１０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋもまた好ましい。

幾つかの実施形態において、ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドは、配列番号１のコンセンサス配列に基づいている。一定の実施形態において、ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドは、アミノ酸８〜１１３に加えて、配列番号１のアミノ酸１〜７を含む。

幾つかの実施形態において、ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドが二量化した場合、ＧＦＲα３と結合する。幾つかの実施形態において、ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドが二量化した場合、それ自体で、またはＧＦＲα３と結合した場合に、ＲＥＴポリペプチドのチロシンリン酸化を刺激する。

幾つかの実施形態において、ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドが二量化した場合、ニューロンの生存率を高める。例えば、感覚ニューロンの生存率を高める。

幾つかの実施形態において、ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドが二量化した場合、感覚ニューロンなどのニューロンの病理学的変化を減少または逆転させる。

幾つかの実施形態において、ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドが二量化した場合、ニューロン、例えば、自律神経ニューロンまたはドーパミン作動性ニューロンの生存率を高める。

幾つかの実施形態において、ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドは、そのポリマー結合ポリペプチドのアミノ酸配列の１４位におけるアルギニン以外のアミノ酸、そのポリマー結合ポリペプチドのアミノ酸配列の３９位におけるアルギニン以外のアミノ酸、そのポリマー結合ポリペプチドのアミノ酸配列の６８位におけるアルギニン以外のアミノ酸、およびそのポリマー結合ポリペプチドのアミノ酸配列の９５位におけるアスパラギン以外のアミノ酸からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態において、１４位、３９位、６８位および９５位におけるアミノ酸の１つ以上のアミノ酸におけるアミノ酸はリジンである。ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドの８〜９４のアミノ酸および９６〜１１３のアミノ酸は、配列番号１の８〜９４のアミノ酸および９６〜１１３のアミノ酸に少なくとも９０％同一であることが好ましい。前記アミノ酸配列は、それに少なくとも９５％同一であることがより好ましい。ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドの８〜９４のアミノ酸および９６〜１１３のアミノ酸に天然のヒト、マウスまたはラットのニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列を含むことが最も好ましい。例えば、ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドの８〜９４のアミノ酸および９６〜１１３のアミノ酸は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４の８〜９４のアミノ酸および９６〜１１３のアミノ酸のアミノ酸配列を含み得る。上記実施形態において、９５位のアミノ酸における好ましい残基は、リジンまたはシステインである。

本発明は、ポリマー結合ニューブラスチン融合タンパク質、例えば、配列番号３６で提供されるポリヒスチジン（Ｈｉｓ）−タグ化ニューブラスチンまたは融合部分が、免疫グロブリン（Ｉｇ）ポリペプチド、血清アルブミンポリペプチドまたはレプリカーゼ誘導ポリペプチドであるニューブラスチン融合タンパク質を含有するヘテロダイマーまたはホモダイマーである構築体を含む。ニューブラスチン融合タンパク質は、インビボで増強された薬物動態学的特性と生物学的利用能特性を有し得る。

本発明は、変異ポリペプチド配列を有する、成熟または切断ニューブラスチンポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。提供されたニューブラスチンポリペプチドをコードする核酸分子は、ベクター、例えば、発現ベクターにおいて提供されることが好ましい。変異ニューブラスチン核酸分子またはそれを含むベクターは、細胞において提供され得る。前記細胞は、例えば、哺乳動物細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または細菌細胞であり得る。好ましい哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（「ＣＨＯ細胞」）である。

また、本発明は、ニューブラスチンポリペプチドをコードする核酸を含有する細胞を、ニューブラスチンポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養することにより、ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドを作製する方法も提供する。幾つかの実施形態において、ニューブラスチンは天然部分に結合する。特定の実施形態において、天然部分は、グリコシル部分である。一定の実施形態において、グリコシル化ニューブラスチンは、例えば、ＣＨＯ細胞内に発現する。本発明は、細胞内に発現したニューブラスチンポリペプチドをさらに含む。同様の核酸類、ベクター類、宿主細胞類およびポリペプチド製造法は、本発明の融合タンパク質（ニューブラスチン−血清アルブミン融合タンパク質など）に関して、本明細書に開示されている。

幾つかの実施形態において、細胞内に発現するニューブラスチンポリペプチドを回収し、ポリマーと結合させる。幾つかの実施形態において、前記ポリマーは、ポリアルキレングリコール部分である。特定の実施形態において、前記ポリマーはＰＥＧ部分である。

本発明により、非天然ポリマーに結合した変異ニューブラスチンポリペプチドを含む組成物が、特に提供される。前記ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドが、そのポリマー結合ポリペプチドのアミノ酸配列の１４位におけるアルギニン以外のアミノ酸、そのポリマー結合ポリペプチドのアミノ酸配列の３９位におけるアルギニン以外のアミノ酸、そのポリマー結合ポリペプチドのアミノ酸配列の６８位におけるアルギニン以外のアミノ酸、およびそのポリマー結合ポリペプチドのアミノ酸配列の９５位におけるアスパラギン以外のアミノ酸からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含むという条件で、前記組成物中のニューブラスチンポリペプチドは、配列番号１の８〜１１３のアミノ酸に、少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むことが好ましく、アミノ酸の位置は、配列番号１のポリペプチド配列によって番号付けされている。

本発明は、ＰＥＧ部分に結合したニューブラスチンポリペプチドまたは変異ニューブラスチンポリペプチドを含む安定な水溶性結合ニューブラスチンポリペプチドまたは変異ニューブラスチンポリペプチドの複合体を含み、前記ニューブラスチンポリペプチドまたは変異ニューブラスチンポリペプチドは、不安定な結合によってＰＥＧ部分に結合している。幾つかの実施形態において、前記不安定結合は、生物学的加水分解、タンパク質加水分解、またはスルフヒドリル開裂によって開裂可能である。幾つかの実施形態において、不安定結合は、インビボ条件下で開裂可能である。

また、本発明により、野生型ニューブラスチンに較べて、延長化した血清半減期を有する修飾ニューブラスチンポリペプチドの作製法が提供される。この方法は、ニューブラスチンポリペプチドまたは変異ニューブラスチンポリペプチドを提供し、そのポリペプチドまたは変異ニューブラスチンポリペプチドを、非天然ポリマー部分に結合させることによって、ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチド構成物を形成することを含んだ。

本発明のポリマー結合変異ニューブラスチンポリペプチドは、例えば、そのポリマー結合ポリペプチドのアミノ酸配列の１４位にアルギニン以外のアミノ酸が生じるか、またはそのポリマー結合ポリペプチドのアミノ酸配列の３９位にアルギニン以外のアミノ酸が生じるか、またはそのポリマー結合ポリペプチドのアミノ酸配列の６８位にアルギニン以外のアミノ酸が生じるか、またはそのポリマー結合ポリペプチドのアミノ酸配列の９５位にアスパラギン以外のアミノ酸が生じる、１つ以上のアミノ酸置換を含み、アミノ酸の位置は、配列番号１のポリペプチド配列によって番号付けされている。

（野生型ニューブラスチンポリペプチドおよび変異ニューブラスチンポリペプチドの合成と単離）
ニューブラスチンポリペプチドは、当該分野で公知の方法を用いて単離することができる。天然ニューブラスチンポリペプチドは、標準的なタンパク質精製法を用いて適切な精製方式により、細胞または組織源から単離できる。あるいは、変異ニューブラスチンポリペプチドは、標準的ペプチド合成法を用いて化学的に合成できる。短いアミノ酸配列の合成は、ペプチド業界で十分に確立されている。Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、１９８４年）を参照されたい。

幾つかの実施形態において、変異ニューブラスチンポリペプチドは、組替えＤＮＡ法によって製造される。例えば、変異ニューブラスチンポリペプチドをコードする核酸分子を、ベクター、例えば、発現ベクターに挿入でき、この核酸を細胞内に導入することができる。好適な細胞としては、例えば、哺乳動物細胞（ヒト細胞またはＣＨＯ細胞など）、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または細菌細胞が挙げられる。組替え細胞内で発現させる場合は、前記細胞を、変異ニューブラスチンポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養することが好ましい。所望の場合は、変異ニューブラスチンポリペプチドを細胞懸濁液から回収できる。本明細書に用いられる「回収される」とは、回収処理前に変異ポリペプチドが存在している細胞の成分または培地から変異ニューブラスチンポリペプチドが取り出されることを意味する。前記回収処理は、１つ以上のリフォールディングステップまたは精製ステップを含み得る。

変異ニューブラスチンポリペプチドは、当該分野で公知の幾つかの方法のうちの任意のものを用いて構築できる。そのような方法の１つは、部位特異的変異誘発であり、コードされたニューブラスチンポリペプチドにおける単一アミノ酸（または所望の場合、少数の予め決められたアミノ酸残基）を変化させるために特定のヌクレオチド（または所望の場合、少数の特定ヌクレオチド）を変化させる。部位特異的変異誘発は、ルーチンで広く用いられている方法であることは、当業者により認識されている。事実、多くの部位特異的変異誘発キットが商品として入手できる。そのようなキットの１つは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カリフォルニア州パロアルト所在）により販売されている「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」である。

本発明の実施には、他に指示しない限り、当該分野の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組替えＤＮＡ、タンパク質化学および免疫学の慣例的技法が用いられる。このような技法は文献に記載されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編集）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編集）、１９８５年；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編集）、１９８４年；米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｉｎｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集）、１９８４年；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集）、１９８４年；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ （Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集）Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ社、１９８７年；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６年；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１３．Ｐｅｒｂａｌ）、１９８４年；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５４巻および１５５巻（Ｗｕら編集）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク所在；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編集）、１９８７年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編集）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ロンドン所在、１９８７年；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編集）、１９８６年；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｎｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８６年、を参照されたい。

（ニューブラスチンポリペプチドのポリマー結合）
化学的に修飾されたニューブラスチンポリペプチドは、本開示に基づいて、当業者により調製できる。ニューブラスチンポリペプチドへの結合に好ましい化学的部分は、水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーは、それが結合しているタンパク質が生理的環境などの水性環境に沈殿しないため有利である。前記ポリマーは、治療用製品または組成物の調製にとって製薬上許容できることが好ましい。

所望の場合、ニューブラスチンポリペプチドとの結合に単一のポリマー分子を使用できるが、１つ以上のポリマー分子を同様に結合できる。本発明の結合ニューブラスチン組成物は、インビボならびに非インビボ適用に使用できる。また、前記結合ポリマーは、最終使用適用にとって適切な他の任意の基、部分または他の結合種を使用できることが認識されるであろう。例えば、幾つかの適用においては、耐ＵＶ分解性、または抗酸化、もしくは他の性質または特徴を前記ポリマーに与える機能的部分を、前記ポリマーに共有結合させることが有用であり得る。さらなる一例として、幾つかの適用において、結合物質全体の種々の性質または特徴を高める上で相応しい反応性または架橋結合性を前記ポリマーに与えるために、このポリマーを機能化することが有利であり得る。したがって、前記ポリマーは、その意図された目的に関して、前記結合ニューブラスチン組成物の有効性を妨げない任意の官能基、反復基、結合または他の構成要素の構造体を含有できる。

前記ポリマー／タンパク質結合体が治療に用いられるかどうか、また、もしそうならば、所望の投与量、循環時間、タンパク質分解性に対する耐性および他の考慮事項などの考慮に基づいて、当業者は、所望のポリマーを選択できるであろう。誘導体化の有効性は、所望の形態で（例えば、浸透圧ポンプ、またはより好ましくは、注射または注入により、または経口、経肺または他の送達経路のためにさらに処方物化して）、誘導体を投与し、その有効性を測定することによって確認できる。

好適な水溶性ポリマーとしては、限定はしないが、ＰＥＧ、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー類、カルボキシメチレンセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸類（ホモポリマー類またはランダムコポリマー類）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ＰＥＧ、プロピレングリコールホモポリマー類、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー類、ポリオキシエチル化ポリオール類（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコールおよびそれらの混合物が挙げられる。

前記ポリマーは、任意の好適な分子量でよく、また分枝状でも非分枝状でもよい。

ＰＥＧに関して、好適な平均分子量は、約２ｋＤａと約１００ｋＤａとの間である。このことにより、扱い易さと製造し易さが得られる。ＰＥＧの調製において、ある分子は述べられた分子量より大きく、ある分子は少なくなることを当業者は認識するであろう。したがって、分子量は代表的には、「平均分子量」として記される。所望の治療プロフィル（例えば、所望の持続放出時間；効果が存在する場合は生物活性に及ぼす効果；扱い易さ；抗原性欠如の程度および治療用タンパク質に及ぼすＰＥＧの他の知られた効果）に依存して他の分子量（サイズ）を使用し得る。種々の実施例において、分子量は、約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約４０ｋＤａまたは約１００ｋＤａである。一定の好ましい実施例において、各ＰＥＧ鎖の平均分子量は、約２０ｋＤａである。一定の好ましい実施例において、平均分子量は、約１０ｋＤａである。

このように結合したポリマー分子の数は変化し得、当業者は機能に及ぼすその効果を確認できるであろう。モノ誘導化ができるか、または同一の、もしくは異なった化学的部分を有するジ、トリ、テトラ誘導体または誘導体の何らかの組合せ（例えば、異なる重量のＰＥＧ類などのポリマー）を与え得る。ポリマー分子対タンパク質（またはポリペプチド）分子の比率は変化し、反応混合物におけるそれらの濃度も変化する。一般に、最適比率（過剰の未反応タンパク質またはポリマーが存在しない反応の効率に関して）は、誘導体化の所望の程度（例えば、モノ、ジ、トリなど）、選択されたポリマーの分子量、ポリマーが分枝状か、非分枝状か、および反応条件などの因子によって決定されるであろう。

タンパク質の機能的ドメインまたは抗原性ドメインに及ぼす効果を考慮して、ＰＥＧ分子（または他の化学的部分）をタンパク質に結合させる必要がある。当業者に利用できる多数の結合方法がある。例えば、欧州特許出願公開第０４０１３８４号（Ｇ−ＣＳＦに対するＰＥＧの結合）；Ｍａｌｉｋら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：ｐ．１０２８−１０３５、１９９２年（塩化トレシルを用いるＧＭ−ＣＳＦのＰＥＧ化を報告している）を参照されたい。

例えば、ＰＥＧは、遊離アミノ基またはカルボキシル基などの反応性基を介してアミノ酸残基により共有結合し得る（ＰＥＧ化）。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基としては、リジン残基およびアミノ末端アミノ酸残基が挙げられる。遊離カルボキシルを有するものとしては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられる。ＰＥＧ分子（単数または複数）を結合させるための反応性基として、スルフヒドリル基もまた使用できる。治療目的には、結合はアミノ基、例えば、リジン基のＮ末端においてできる。アミノ末端化学修飾タンパク質を特に望むことができる。

当該組成物の例示としてＰＥＧを用い、種々のＰＥＧ分子（分子量、分枝などによる）、反応混合物におけるＰＥＧ分子対タンパク質（またはペプチド）分子の比率、実施されるＰＥＧ化反応タイプおよび選択されたアミノ末端ＰＥＧ化タンパク質の獲得法から選択できる。アミノ末端ＰＥＧ化調製物の獲得法（すなわち、必要ならば、この部分を他のモノＰＥＧ化部分から分離する）は、ＰＥＧ化タンパク質分子の集団からのアミノ末端ＰＥＧ化物質の生成によるものであり得る。選択的アミノ末端化学修飾は、特定のタンパク質における誘導体化に利用できる種々のタイプの第１級アミノ基の反応性基の差異（リジン対アミノ末端）を利用する還元的アルキル化によって達成できる。適切な反応条件下で、ポリマーを含むカルボニル基を有するアミノ末端におけるタンパク質の実質的に選択的誘導体化が達成される。例えば、タンパク質のリジン残基のイプシロン（ε）−アミノ基と、アミノ末端残基のアルファ（α）−アミノ基のｐＫａの違いを利用できるｐＨで反応を実施することにより、タンパク質のアミノ末端を選択的にＰＥＧ化できる。そのような選択的誘導体化により、タンパク質に対する水溶性ポリマーの結合が制御される。すなわち、タンパク質のアミノ末端において、ポリマーとの結合が優先的に生じ、リジンの側鎖アミノ基などの他の反応性基の修飾はあまり生じない。

還元的アルキル化を用いる水溶性ポリマーは、上記のタイプのものであり得、タンパク質に結合するための単一の反応性アルデヒドを有する必要がある。単一の反応性アルデヒドを含有するＰＥＧプロピオンアルデヒドを使用できる。

本発明は、原核生物または真核生物において発現された、または合成的に作製された変異ニューブラスチンポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、ニューブラスチンはグリコシル化される。幾つかの特定の実施形態において、ニューブラスチンダイマーは、各アミノ末端においてポリマー結合し、各内部Ａｓｎ９５残基においてグリコシル化される。他の実施形態において、変異ニューブラスチンダイマーは、各アミノ末端においてポリマー結合し、内部Ｌｙｓ９５残基の１つまたは両方においてポリマー結合する。

ＰＥＧ化は、任意の好適なＰＥＧ化反応によって実施できる。種々のＰＥＧ化化学は、当該分野に公知である。例えば、Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、３（２）：ｐ．４−１０、１９９２年；欧州特許出願公開第０ １５４ ３１６号；欧州特許出願公開第０ ４０１ ３８４号および本明細書に引用されているＰＥＧ化に関する他の刊行物を参照されたい。ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応により実施できる。

アシル化によるＰＥＧ化は、一般にＰＥＧの活性エステル誘導体を反応させることを伴う。ＰＥＧ化を実施するために、任意の公知の、またはその後に発見された反応性ＰＥＧ分子が使用できる。好ましい活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）にエステル化されたＰＥＧである。本明細書に用いられる「アシル化」としては、限定はしないが、治療用タンパク質とＰＥＧなどの水溶性ポリマーとの間の以下のタイプの結合が挙げられる：アミド、カルバメート、ウレタンなど。Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：ｐ．１３３−１４０、１９９４年を参照されたい。反応条件は、ＰＥＧ化業界で公知の任意のもの、または、その後に開発されたものから選択できるが、修飾されるニューブラスチンタンパク質またはポリペプチドを不活化させると考えられる温度、溶媒およびｐＨなどの条件は避ける必要がある。

アシル化によるＰＥＧ化は一般に、ポリＰＥＧ化ニューブラスチンタンパク質を生じる。接続する結合はアミドであることが好ましい。また、生じる生成物は、実質的にモノ、ジ、またはトリＰＥＧ化のみ（例えば、＞９５％）であることが好ましい。しかし、より高い程度のＰＥＧ化を有する幾つかの種が、使用される特定の反応条件に依存した量で形成され得る。所望の場合、より精製されたＰＥＧ化種が、標準的な精製法、その中でも透析、塩析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィおよび電気泳動などにより、混合物、特に未反応種から分離できる。

アルキル化によるＰＥＧ化は一般に、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体を、還元剤の存在下、ニューブラスチンと反応させることを伴う。また、アルキル化によるＰＥＧ化は、ポリＰＥＧ化ニューブラスチンタンパク質生成物も生じさせ得る。さらに、実質的にニューブラスチンのアミノ末端のα−アミノ基のみのＰＥＧ化に有利に働くように、反応条件を操作することができる。モノＰＥＧ化またはポリＰＥＧ化のいずれの場合においても、ＰＥＧ基は、−ＣＨ_２−ＮＨ−基を介して、タンパク質に結合させることが好ましい。特に−ＣＨ_２−基との関連で、このタイプの結合は、本明細書において、「アルキル」結合と称される。

還元的アルキル化によりモノＰＥＧ化生成物を生成させる誘導体化は、誘導体化に利用できる種々のタイプの第一級アミノ基の異なる反応性（リジン対アミノ末端）を利用する。前記反応は、タンパク質のリジン残基のε−アミノ基とアミノ末端残基のα−アミノ基のｐＫａの差を利用することを可能にするｐＨにおいて実施される。そのような選択的誘導体化により、タンパク質に対するアルデヒドなどの反応性基を含有する水溶性ポリマーの結合が制御される。すなわち、タンパク質のアミノ末端において、ポリマーとの結合が優先的に生じ、リジンの側鎖アミノ基などの他の反応性基の修飾はあまり生じない。

アシル化法およびアルキル化法の両方に使用されるポリマー分子は、上記の水溶性ポリマーの中から選択できる。好ましくは、重合化度が、本法において提供されるように制御できるように、選択されたポリマーは、アシル化には活性エステル、またはアルキル化にはアルデヒドなどの１つの反応性基を有するように修飾される必要がある。反応性ＰＥＧアルデヒドの一例は、水に安定なＰＥＧプロピオンアルデヒドまたはそのモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシもしくはアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号）。前記ポリマーは、分枝状であっても非分枝状であってもよい。アシル化反応のためには、選択されたポリマー（単数または複数）は１つの反応性エステル基を有する必要がある。当該還元的アルキル化のためには、選択されたポリマー（単数または複数）は１つの反応性アルデヒド基を有する必要がある。一般に、水溶性ポリマーは、通常、哺乳動物の組替え発現システムによって、より便利になるため、これらは天然のグリコシル残基からは選択されない。前記ポリマーは、任意の分子量のものでよく、また、分枝状であっても非分枝状であってもよい。

本明細書に使用される水溶性ポリマーの一例は、ＰＥＧである。本明細書に用いられるポリエチレングリコールは、限定はしないが、他のタンパク質を誘導化するために用いられた、例えば、モノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ＰＥＧなどの任意の形態のＰＥＧを含む。

一般に、化学的誘導体化は、生物学的活性物質を活性化ポリマー分子と反応させるために用いられる任意の好適な条件下で実施できる。ＰＥＧ化ニューブラスチンの調製法は、一般に（ａ）ニューブラスチンタンパク質またはポリペプチドをこの分子が、１つ以上のＰＥＧ基と結合する条件下でＰＥＧ（ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と反応させるステップと、（ｂ）反応生成物（単数または複数）を得るステップと、を含む。一般に、アシル化反応のための最適反応条件は、公知のパラメータおよび所望の結果に基づいて、ケースバイケースで決定される。例えば、ＰＥＧ：タンパク質の比率が高いほど、ポリ−ＰＥＧ化生成物のパーセンテージは高くなる。

実質的に均質なモノポリマー／ニューブラスチン集団を生成させる還元的アルキル化は、一般に（ａ）還元的アルキル化の条件下、ニューブラスチンのアミノ末端におけるα−アミノ基の選択的修飾を可能にする上で好適なｐＨで、ニューブラスチンタンパク質またはペプチドを、反応性ＰＥＧと反応させるステップと、（ｂ）反応生成物（単数または複数）を得るステップと、を含む。

実質的に均質なモノポリマー／ニューブラスチン集団のための還元的アルキル化反応の条件は、ニューブラスチンのアミノ末端に対する水溶性ポリマー部分の選択的結合を可能にするものである。このような反応条件は、一般にリジンアミノ基とアミノ末端におけるα−アミノ基のｐＫａの差を提供する（このｐＫａは、アミノ基の５０％がプロトン化し、５０％がプロトン化しないｐＨである）。また前記ｐＨは、ポリマー対使用されるタンパク質の比率にも影響を及ぼす。一般に、ｐＨが低いほどタンパク質に対してより過剰のポリマーが望まれることになる（すなわち、アミノ末端αアミノ基の反応性が低いほど、最適条件を達成するために、より多くのポリマーが必要となる）。ｐＨが高い場合は、ポリマー：タンパク質の比率はそれほど高くする必要はない（すなわち、より反応性の高い基が利用できるほど必要とされるポリマー分子は少ない）。本発明の目的のためのｐＨは一般に、３〜９の範囲、好ましくは３〜６の範囲に入る。

もう１つの重要な考慮すべきことは、ポリマーの分子量である。一般に、ポリマーの分子量が大きいほど、タンパク質に結合できるポリマー分子は少なくなる。同様に、これらのパラメータを最適化する際には、ポリマーの分枝を考慮する必要がある。一般に、分子量が大きいほど（または分枝が多いほど）、ポリマー：タンパク質の比率は高くなる。一般に、本明細書に含まれるＰＥＧ化反応に関して好ましい平均分子量は、約２ｋＤａから約１００ｋＤａである。好ましい平均分子量は、約５ｋＤａから約５０ｋＤａであり、約１０ｋＤａから約２０ｋＤａが特に好ましい。好ましい合計分子量は、約１０ｋＤａから約４０ｋＤａである。

幾つかの実施形態において、ニューブラスチンポリペプチドは、ポリペプチド上の末端反応性基を介して前記ポリマーと結合する。あるいは、またはそれに加えて、ニューブラスチンポリペプチドは、内部リジン残基、例えば、天然ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列に導入されたリジン残基の側鎖アミノ基を介して結合され得る。したがって、結合体は、非末端反応性基からも分枝できる。反応性基（単数または複数）を有するポリマーは、本明細書において「活性化ポリマー」と称される。反応性基は、タンパク質上の反応性基、例えば、遊離アミノと選択的に反応する。

結合は、活性化ポリマーにおいて、リジン残基またはニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列内に導入された残基のアルファアミノ基またはイプシロンアミノ基などの任意の利用できるニューブラスチンアミノ基において生じ得る。ニューブラスチンの遊離カルボキシル基、好適に活性化されたカルボニル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、イミダゾール基、酸化炭化水素部分およびメルカプト基（利用できる場合は）も結合部位として使用できる。

一般に、タンパク質１モル当たり約１．０モルから約１０モルの活性化ポリマーが、タンパク質濃度に依存して使用される。最終的な量は、反応の程度を最大化しつつ生成物の非特異的修飾を最少化し、同時に最適の活性を維持しつつ、同時に可能ならば、タンパク質の半減期を最適化する化学的性質を規定することとのバランスである。タンパク質の生物学的活性の少なくとも約５０％が保持されることが好ましく、ほぼ１００％保持されることが最も好ましい。

前記ポリマーは、当該分野に公知の方法を用いて、ニューブラスチンポリペプチドに結合できる。例えば、一実施形態において、ポリアルキレングリコール部分が、変異ニューブラスチンポリペプチドのリジン基に結合される。リジン基への結合は、ＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（ＳＳ−ＰＥＧ）およびスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ）などのＮ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステルによって実施できる。好適なポリアルキレングリコール部分としては、例えば、カルボキシメチル−ＮＨＳ、ノルロイシン−ＮＨＳ、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレート、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾール、およびＰＮＰカルボネートが挙げられる。

スクシンイミジル部分を、さらにアミン反応性ＰＥＧリンカー類に置換できる。これらとしては、例えば、イソチオシアネート類、ニトロフェニルカーボネート類、エポキシド類、およびベンゾトリアゾールカーボネート類が挙げられる。条件は、選択性および程度または反応を最大化するように選択されることが好ましい。

所望の場合、ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドは、タグ、例えば、後でタンパク質加水分解により遊離できるタグを含有できる。したがって、リジン部分は、先ず、リジンとアミノ末端の両方と反応するトラウト試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）などの低分子量のリンカーによって修飾されたＨｉｓ−タグを反応させ、次にｈｉｓを遊離することによって選択的に修飾できる。次に前記ポリペプチドは、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基または遊離もしくは保護ＳＨを含有するＰＥＧにより選択的に修飾できる遊離ＳＨ基を含有することになる。

トラウト試薬は、ＰＥＧ結合のための特異的部位を設定する任意のリンカーと置換することができる。例えば、トラウト試薬は、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡまたはＳＡＴＰ（全てＰｉｅｒｃｅｋａｒａ入手できる）によって置換し得る。同様に、前記タンパク質をマレイミド基（例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ、またはＧＭＢＳ）、ハロアセテート基（ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）またはビニルスルホン基を挿入するアミン反応性リンカーと反応させ、生じた生成物を、遊離ＳＨを含有するＰＥＧと反応させ得る。使用されるリンカーのサイズに対する唯一の制限は、それが引き続いてのアミノ末端タグの除去を妨害し得ないということである。

したがって、他の実施形態において、ポリアルキレングリコール部分を変異ニューブラスチンポリペプチドのシステイン基と結合させる。結合は、例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基およびチオ基を用いて達成できる。

好ましい実施形態において、前記組成物中のポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドは、前記ポリマー不在下のニューブラスチンポリペプチドの血清半減期に較べて、より長い血清半減期を有する。あるいは、またはそれに加えて、前記組成物中のポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドダイマーは、ＧＦＲαと結合し、ＲＥＴを活性化し、ニューロンの病変を正常化し、ニューロンの生存率を高め、または神経障害性疼痛を寛解し、またはこれらの生理学的機能の組合せを行う。ポリペプチドが、ニューロンの生存率を高めているかどうか、またはニューロンの病変を正常化しているかどうかを決定するためのアッセイは、例えば、国際公開第００／０１８１５号に記載されている。前記ニューロンは、感覚ニューロン、自律ニューロンまたはドーパミン作動性ニューロンであることが好ましい。

好ましい実施形態において、前記組成物は、ＰＥＧ部分に結合したニューブラスチンポリペプチドまたは変異ニューブラスチンポリペプチドを含む安定な水溶性結合ニューブラスチンポリペプチド複合体として提供される。所望の場合、ニューブラスチンポリペプチドまたは変異ニューブラスチンポリペプチドは、不安定な結合によって、ＰＥＧ部分に結合してもよい。前記不安定な結合は、例えば、生化学的加水分解、タンパク質加水分解、またはスルフヒドリル開裂において開裂できる。例えば、前記結合は、インビボ（生理学的）条件下で開裂できる。

溶媒、反応時間、温度などの他の反応パラメータおよび生成物の精製手段は、水溶性ポリマーによるタンパク質の誘導体化に関する出版された情報に基づきケーバイケースで決定できる。

所望の場合、結合にはニューブラスチンポリペプチド１つ当たり１つのポリマー分子を使用することができる。あるいは、１つ以上のポリマー分子を結合できる。本発明の結合ニューブラスチン組成物は、インビボならびに非インビボ適用の両方に利用できる。さらに、ポリマーの結合には、最終使用適用に適切な他の任意の基、部分または他の結合種が利用できることを認識されるであろう。例えば、幾つかの適用においては、耐ＵＶ分解性または抗酸化または他の性質もしくは特徴を前記ポリマーに与える機能的部分を、前記ポリマーに共有結合させることが有用であり得る。さらなる例として、幾つかの適用においては、結合物質全体の種々の性質もしくは特徴を増強させるために、前記ポリマーを相応しい反応性に、または架橋結合性にする目的で前記ポリマーを機能化することが有利であり得る。したがって、前記ポリマーは、結合ニューブラスチン変異タンパク質組成物の意図された目的に関する有効性を妨げない任意の官能基、反復基、結合または他の構成要素構造体を含有し得る。

これらの望ましい特性を得るために、有用に用いることのできる実例となるポリマーは、本明細書中、下記の代表的な反応図式に記載されている。共有結合ペプチドの適用において、前記ポリマーは機能化してから前記ペプチド（単数または複数）の遊離アミノ酸（単数または複数）に結合させて不安定結合を形成できる。

前記反応は、生物活性物質を、不活性ポリマーと反応させるために用いられる任意の好適な方法により、反応性基がアミノ末端のアルファ基上にある場合は、好ましくはｐＨ約５〜８、例えば、ｐＨ５、６、７または８において生じ得る。一般に前記方法は、活性化ポリマーを調製し、その後、前記タンパク質を活性化ポリマーと反応させて、処方物に好適な溶解性タンパク質を生成することを含む。上記の修飾反応は、１つ以上のステップを含み得る幾つかの方法によって実施できる。

ＰＥＧの直鎖状および分枝状形態ならびに他のアルキル形態が使用できる。ＰＥＧの長さは変化し得る。最も一般的な形態は、２Ｋ〜１００ｋＤａのサイズで変化する。本例では、アミノ末端における標的化ＰＥＧ化が薬物動態学的性質に影響を及ぼさないことを報告しているが、前記物質が生理学的機能を保持した事実は、本明細書に開示された単数または複数の部位における修飾が有害ではないことを示している。その結果、リジン残基の挿入によってさらなる結合部位を提供し得るニューブラスチンの変異体の生成において、これらの形態がリジンとアミノ末端両方においてＰＥＧ化される可能性が大きいと考えられる結果が本発明に含まれる。

ニューブラスチンポリペプチド上の１つ以上の部位がポリマーと結合できる。例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのＰＥＧ部分がポリペプチドに結合できる。幾つかの実施形態において、ニューブラスチンポリペプチドのアミノ末端および／または表１および配列番号１に示されたとおり番号付けされたアミノ酸１４、３９、６８および９５において、ＰＥＧ部分が結合する。

有利な実施形態において、前記組成物中のポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドは、前記ポリマー不在下のニューブラスチン野生型または変異ポリペプチドの血清半減期に較べて、より長い血清半減期を有する。あるいは、またはそれに加えて、前記組成物中のポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドは、ＧＦＲα３と結合し、ＲＥＴを活性化し、ニューロンの病変を正常化し、ニューロンの生存率を高め、または神経障害性疼痛を寛解し、またはこれらの生理学的機能の組合せを行う。

幾つかの実施形態において、複合体中の変異ニューブラスチンポリペプチドまたはポリマー結合体は、ニューロン生存を増強するか、または神経障害性疼痛を寛解する、ＧＦＲα３結合、ＲＥＴ活性化、ニューロン病変の正常化からなる群より選択される生理活性を有する。

また、本発明により、ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドを含む多量体ポリペプチドが提供される。多量体ポリペプチドは、精製された多量体ポリペプチドとして提供されることが好ましい。多量体複合体の例としては、例えば、二量体複合体が挙げられる。多量体複合体は、ヘテロマー複合体またはホモマー複合体として提供できる。したがって、多量体複合体は、１つの変異ニューブラスチンポリペプチドと１つの非変異ニューブラスチンを含むヘテロダイマーポリマー結合ポリペプチド複合体であるか、または２つ以上の変異ニューブラスチンポリペプチドを含むヘテロダイマーポリマー結合ポリペプチド複合体であり得る。

幾つかの実施形態において、ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドは、ＧＦＲα３と結合する。ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドの結合は、ＲＥＴポリペプチドのリン酸化を誘導することが好ましい。ポリペプチドがＧＦＲα３と結合しているかどうかを決定するために、国際公開第００／０１８１５号に記載されているとおりアッセイを実施できる。例えば、Ｓａｎｉｃｏｌａら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９７年、９４：ｐ．６２３８）によって記載された三元複合体アッセイの変型を用いてＣＨＯ細胞系上澄み液媒体中のニューブラスチンの存在を表すことができる。このアッセイにおいて、ＧＤＮＦ様分子の能力は、ＲＥＴの細胞外ドメインと種々の補助レセプター、ＧＦＲα１、ＧＦＲα２およびＧＦＲα３との間の結合を媒介するそれらの能力に関して評価することができる。ＲＥＴと補助レセプターの溶解性形態は、融合タンパク質として生成される。ラットＲＥＴの細胞外ドメインと胎盤のアルカリホスファターゼとの間の融合タンパク質（ＲＥＴ−ＡＰ）およびラットＧＦＲα１の細胞外ドメイン（１９９７年１１月２７日、公開出願の国際公開第９７４４３５６号に開示されている）とヒトＩｇＧ１との間の融合タンパク質（ｒＧＦＲ（α１−Ｉｇ）が記載されている（Ｓａｎｉｃｏｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９７年、９４：ｐ．６２３８）。

本発明のポリマーは、ポリアルキレングリコール部分であることが好ましく、ＰＥＧ部分であることがより好ましい。幾つかの実施形態において、ポリマー部分は、約１００Ｄａから約２５，０００Ｄａ；約１０００Ｄａから約２０，０００Ｄａ；または約５０００Ｄａから約２０，０００Ｄａの平均分子量を有する。幾つかの実施形態において、少なくとも１つのポリマー部分が、約５０００Ｄａの平均分子量；約１０，０００Ｄａの平均分子量；または約２０，０００Ｄａの平均分子量を有する。

ポリアルキレングリコール部分上の官能基は、例えば、カルボキシメチル−ＮＨＳ、ノルロイシン−ＮＨＳ、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレート、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾール、またはＰＮＰカルボネートであり得る。結合は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステルを介して生じ得る。前記活性エステルは、例えば、ＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（ＳＳ−ＰＥＧ）、スクシンイミジルブチレート（ＳＰＢ−ＰＥＧ）、またはスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ）であり得る。幾つかの実施形態において、ポリアルキレングリコール部分は、ニューブラスチンポリペプチドまたは変異ニューブラスチンポリペプチドのシステイン基に結合する。例えば、結合は、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基およびチオール基を介して生じ得る。種々の実施形態において、ニューブラスチンポリペプチドまたは変異ニューブラスチンポリペプチドは、１つ、２つ、３つ、または４つのＰＥＧ部分を含む。

幾つかの実施形態において、前記ポリマーは、Ｎ末端であるニューブラスチン上の部位におけるポリペプチドに結合する。幾つかの実施形態において、前記ポリマーは、ニューブラスチンポリペプチドまたは変異ニューブラスチンポリペプチドの非末端アミノ酸の部位におけるポリペプチドと結合する。幾つかの実施形態において、前記ポリマーは、ニューブラスチンポリペプチドまたは変異ニューブラスチンポリペプチドの溶媒曝露アミノ酸に結合する。

幾つかの実施形態において、前記ポリマーは、ポリマー結合ポリペプチドのアミノ末端アミノ酸、ニューブラスチンポリペプチドまたは変異ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列の１４位、ニューブラスチンポリペプチドまたは変異ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列の３９位、ニューブラスチンポリペプチドまたは変異ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列の６８位、およびニューブラスチンポリペプチドまたは変異ポリペプチドのアミノ酸配列の９５位からなる群から選択された残基において、ニューブラスチンポリペプチドまたは変異ニューブラスチンポリペプチドと結合する。

（ポリマー結合ニューブラスチン融合タンパク質）
所望の場合、ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドは、融合タンパク質として提供できる。また、本発明のタンパク質の融合ポリペプチド誘導体は、生物学的活性を保持する主要タンパク質の種々の構造形態を含む。

ポリマー結合ニューブラスチン−血清アルブミン融合体が当該分野で公知の方法を用いて構築できる。ニューブラスチンを血清アルブミンに結合するために、対応するアミノ反応性基およびチオール反応性基を含有する多数の架橋剤のうちのいずれかを用いることができる。好適なリンカーの例としては、チオール反応性−マレイミドを挿入するアミン反応性架橋剤が挙げられる。これには、例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ、またはＧＭＢＳが挙げられる。他の好適なリンカーは、チオール反応性−ハロアセテート基を挿入する。これらには、例えば、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢが挙げられ、また、スルフヒドリル基により反応に保護または非保護チオールを提供し、還元性結合を生じさせるものは、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ、またはＳＡＴＰであり、これら全ては商品として入手可能である（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。当業者は同様に、ニューブラスチンのアミノ末端に血清アルブミンを結合する代替法を予想することができる。

また、当業者は、ニューブラスチンのアミノ末端または血清アルブミンのチオール部分に標的化されていない、血清アルブミンに対する結合体を生成させることができることも予想される。所望の場合、遺伝子工学の方法を用いてニューブラスチンが、そのアミノ末端、カルボキシ末端または両端において、血清アルブミン遺伝子に融合されているニューブラスチン−血清アルブミン融合体を生成させることができる。

同様の方法を用いて、例えば、インビボで、または特に動物（ヒトを含む）において、半減期の延長した生成物をもたらす任意のニューブラスチン結合体を生成させることができる。インビボで半減期の延長した生成物を生じるニューブラスチン結合体の他の例は、融合相手がＩｇであるニューブラスチン融合タンパク質である。

ポリマー結合ニューブラスチンの他の誘導体としては、さらなるアミノ末端またはカルボキシ末端として組替え培養における合成などによる、変異ニューブラスチンまたはその断片と他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合体または凝集結合体が挙げられる。例えば、結合ペプチドは、タンパク質のアミノ末端領域におけるシグナル（またはリーダー）ポリペプチド配列であり得、これは、そのタンパク質の合成位置から細胞膜または細胞壁の内側または外側のその機能位置へのタンパク質移動を、翻訳時に、または翻訳後に指示する（例えば、酵母アルファ因子リーダー）。ニューブラスチンレセプタータンパク質は、ニューブラスチンの精製または同定を助けるために加えられたペプチドを含んでなり得る（例えば、ヒスチジン／ニューブラスチン融合体）。また、ニューブラスチンのアミノ酸配列を、ペプチドＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号２２）と結合させることもできる（Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：ｐ．１２０４（１９８８））。後者の配列は、抗原性が高く、特定のモノクローナル抗体と可逆的に結合したエピトープを提供し、発現組替えタンパク質の迅速なアッセイと容易な精製を可能にする。

また、この配列は、Ａｓｐ−Ｌｙｓ対の直ぐ後の残基において、ウシ粘膜エンテロキナーゼにより特異的に開裂される。

（生物活性ポリペプチド類）
本発明のポリペプチド類は、プレプロタンパク質、プロタンパク質、成熟タンパク質、グリコシル化タンパク質、非グリコシル化タンパク質、リン酸化タンパク質、非リン酸化タンパク質、切断体または任意の他の翻訳後修飾タンパク質の形態など、任意の生物活性形態において提供できる。生物活性ニューブラスチンポリペプチドとしては、例えば、単独でまたは補助因子（ＧＦＲα３またはＲＥＴなど）の存在下で二量化した場合、ＲＥＴに結合し、ＲＥＴの二量化およびＲＥＴの自己リン酸化を誘導するポリペプチドが挙げられる。

本発明のポリペプチド類は、特にＮ−グリコシル化ポリペプチドであり得、このポリペプチドは、配列表に示されたＮ残基においてグリコシル化されていることが好ましい。

幾つかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、１２２位にグリコシル化アスパラギン残基を有する配列番号６で示されたアミノ酸配列；または９５位にグリコシル化アスパラギン残基を有する配列番号１４で示されたアミノ酸配列、または、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷコンピュータソフトウェアにより配列させた任意の変異ニューブラスチンポリペプチドにおける類似位置を有する。

幾つかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号２の９５位にアスパラギン残基の代わりにリジン残基を含有する、本明細書においてＮＢＮ１１３−Ｎ９５Ｋと称される配列番号２３に示されたアミノ酸配列；または本明細書において、ＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋと称される配列番号２４に示されたアミノ酸配列、または、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷコンピュータソフトウェアにより配列させた任意の変異ニューブラスチンポリペプチドにおける類似位置を有する。

また、本発明は、例えば、米国特許第５，４３４，１３１号に記載されたようなＩｇ融合体または血清アルブミン融合体などの変異ニューブラスチン融合タンパク質を含む。

幾つかの実施形態において、本発明は、１つの置換を除いて配列番号１に示されたアミノ酸配列または配列番号１に示された配列に、少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、最も好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。

他の実施形態において、本発明は、１つの置換を除いて配列番号２に示されたアミノ酸配列または配列番号２に示された配列に、少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、最も好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。

幾つかの実施形態において、本発明は、１つの置換を除いて配列番号３に示されたアミノ酸配列または配列番号３に示された配列に、少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、最も好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。

幾つかの実施形態において、本発明は、１つの置換を除いて配列番号４に示されたアミノ酸配列または配列番号４に示された配列に、少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、最も好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。

幾つかの実施形態において、本発明は、１つの置換を除いて配列番号５に示されたアミノ酸配列または配列番号５に示された配列に、少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、最も好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。

幾つかの実施形態において、本発明は、１つの置換を除いて配列番号６に示されたアミノ酸配列または配列番号６に示された配列に、少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、最も好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。

幾つかの実施形態において、本発明は、１つの置換を除いて配列番号７に示されたアミノ酸配列または配列番号７に示された配列に、少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、最も好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。

幾つかの実施形態において、本発明は、１つの置換を除いて配列番号８〜２１に示されたアミノ酸配列または配列番号８〜２１に示された配列に、少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、最も好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。

幾つかの実施形態において、本発明は、１つの置換を除いて配列番号３６に示されたアミノ酸配列または配列番号３６に示された配列に、少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、最も好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。

さらなる実施形態において、本発明は、１つの置換を除いて配列番号１〜２１および３６に示されたアミノ酸配列または配列番号１〜２１および３６に示された配列に、少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、最も好ましくは少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。

他の実施形態において、本発明の変異ポリペプチドは、ＧＤＮＦサブファミリーのフィンガープリント、すなわち、表３および表４に示された保存システインアミノ酸残基を有する。

幾つかの実施形態において、本発明は、配列番号１のポリペプチド、その相補鎖またはそれらのサブ配列をコードするポリヌクレオチド配列により高緊縮条件下、ハイブリダイゼーションできるポリヌクレオチド配列によってコードされる変異ポリペプチドを提供する。幾つかの実施形態において、本発明の変異ポリペプチドは、配列番号１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。

幾つかの実施形態において、本発明は、配列番号２のポリペプチド、その相補鎖またはそれらのサブ配列をコードするポリヌクレオチド配列により高緊縮条件下、ハイブリダイゼーションできるポリヌクレオチド配列によってコードされる新規ポリペプチドを提供する。幾つかの実施形態において、本発明の変異ポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。

幾つかの実施形態において、本発明は、配列番号８〜２１のポリペプチド、その相補鎖またはそれらのサブ配列をコードするポリヌクレオチド配列により高緊縮条件下、ハイブリダイゼーションできるポリヌクレオチド配列によってコードされる変異ポリペプチドを提供する。他の実施形態において、本発明の変異ポリペプチドは、配列番号８〜２１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。

幾つかの実施形態において、本発明は、配列番号３６のポリペプチド、その相補鎖またはそれらのサブ配列をコードするポリヌクレオチド配列により高緊縮条件下、ハイブリダイゼーションできるポリヌクレオチド配列によってコードされる新規ポリペプチドを提供する。幾つかの実施形態において、本発明の変異ポリペプチドは、配列番号３６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。

（生物学的起源）
非結合ニューブラスチンポリペプチドダイマーを単離し、次いで１種以上のポリマーに結合させて、本発明のポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドダイマーを得ることができる。ニューブラスチンポリペプチドダイマーは、哺乳動物細胞から、好ましくはヒト細胞から、またはチャイニーズハムスター卵巣を出所として単離できる。

（神経栄養活性）
切断ニューブラスチンポリペプチドを含む本発明の修飾ニューブラスチンポリペプチドは、神経またはニューロン細胞の代謝、増殖、分化または生存の調節に有用である。特に、修飾ニューブラスチンポリペプチドは、その障害または疾患が神経栄養剤の活性に応答性を有する生存動物、例えば、ヒトの障害または疾患を治療または軽減するために使用される。このような治療および方法は、下記でさらに詳細に記載されている。

（ニューブラスチン−ポリマー結合体を含む薬学的組成物）
本発明の修飾ニューブラスチンポリペプチドダイマーを含んでなる薬学的組成物もまた提供される。

本発明のポリマー−ニューブラスチン結合体は、それ自体で、ならびにそれらの製薬上許容できるエステル、塩および他の生理学的に機能的な誘導体の形態で投与され得る。そのような製薬および医薬処方物においてポリマー結合ニューブラスチンは、１種以上の製薬上許容できるキャリアおよび任意に他の治療用成分と一緒に利用されることが好ましい。

前記キャリア（単数または複数）は、前記処方物の他の成分に適合性であり、そのレシピエントに対して、過度に有害ではないという意味で、製薬上許容されるものでなければならない。前記ポリマー結合ニューブラスチンは、本明細書に記載されたような所望の薬理学的効果または医療上有益な効果を達成するための有効量で、また、所望の生物利用可能なインビボ投与量または濃度を達成するために適切な量で提供される。

前記処方物には、非経口ならびに経口投与に好適なものが含まれ、具体的な投与様式としては、経口投与、経直腸投与、舌下投与、局所投与、経鼻投与、経眼投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経皮投与、髄腔内投与、関節内投与、動脈内投与、くも膜下投与、経気管支投与、経リンパ投与、経膣投与および子宮内投与が挙げられる。局所的、全身的の両方でエアゾール投与および非経口投与に好適な処方物が好ましい。

前記ポリマー結合ニューブラスチンが、液体溶液を含んでなる処方物において利用される場合、その処方物は、経口、経気管支、または非経口で投与できることが有利である。前記ポリマー結合ニューブラスチンが、液体懸濁液処方物において、または生体適合性キャリアの処方物における散剤として使用される場合、その処方物は、経口、経直腸または経気管支で投与できることが有利である。あるいは、それは、キャリアガス中、散剤の噴霧化によって、経鼻または経気管支投与でき、好適なネブライザー装置を含んでなる呼気サーキットから患者によって吸入される散剤のガス状分散を形成する。

本発明のタンパク質を含んでなる処方物は、単位用量形態で簡便に提供でき、製薬業界に周知の任意の方法によって調製できる。このような方法は、一般に有効成分を、１種以上の補助成分を構成するキャリアと組み合わせるステップを含む。

代表的に前記処方物は、有効成分（単数または複数）を液体キャリア、微細分割固体キャリアまたは両方と均一に、また均質に組合せ、次いで必要ならば、その生成物を所望の処方物の用量形態へと形状化することによって調製される。

経口投与に好適な本発明の処方物は、各々が粉末または顆粒として、有効成分の予め決められた量を含んでなるカプセル剤、カシェ剤、錠剤または舐剤などの個別単位として；またはシロップ剤、エリキシル剤、乳剤またはドラフト剤などの、水性液体または非水性液体中懸濁液として提供できる。

非経口投与に好適な処方物は、好ましくは、レシピエントの血液と等張な（例えば、生理食塩水）有効結合体滅菌水性調製液を含んでなることが便利である。このような処方物は、懸濁化剤および増粘剤または前記化合物を、血液成分または１つ以上の器官へ標的化するためにデザインされる他のミクロ微粒子系を含んでもよい。前記処方物は、単位用量形態または多用量形態において提供できる。

経鼻スプレー処方物は、防腐剤および等張化剤と共に有効結合体の精製水溶液を含んでなる。このような処方物は、鼻粘膜に適合性のｐＨおよび等浸透圧状態に調整されることが好ましい。

直腸投与用処方物は、カカオバター、水素化脂肪、または水素化脂肪カルボン酸などの好適なキャリアと共に坐剤として提供できる。点眼剤などの眼科処方物は、ｐＨおよび等張性因子が眼のｐＨおよび等張性因子に調整されることが好ましいこと以外は、鼻用スプレーに対するものと同様な方法によって調製される。

局所用処方物は、鉱油、石油、ポリヒドロキシアルコール類または局所用製薬処方物に使用される他の塩基などの１種以上の媒体中に溶解または懸濁させた本発明の結合体を含んでなる。

前述の成分に加えて、本発明の処方物は、希釈剤、緩衝剤、芳香剤、崩壊剤、表面活性剤、増粘剤、潤滑剤、防腐剤（抗酸化剤を含む）などから選択された１種以上の補助成分をさらに含んでもよい。前述の考慮事項は、本発明のニューブラスチン融合タンパク質（例えば、ニューブラスチン−ヒト血清アルブミン融合タンパク質）にも適用される。

したがって、本発明は、本発明の好ましい例示的適用として、溶液中のポリマー結合ニューブラスチン結合体のインビトロ安定化のために好適な融合タンパク質の供給を含む。融合タンパク質は、例えば、ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドの酵素的分解に対する耐性を増大させるために使用でき、使用期限の改善、室温安定性などの手段を提供する。前述の考慮事項は、本発明のニューブラスチン−血清アルブミン融合タンパク質（ヒトニューブラスチン−ヒト血清アルブミン融合タンパク質など）にも適用されることが認識される。

（処置方法）
本発明の組成物は、哺乳動物、例えば、ヒトを含む霊長類における神経栄養剤の活性に応答性である障害または疾患を治療または軽減するために使用できる。

本発明の組成物は、ニューブラスチンポリペプチドに応答性である病理学的過程を治療するために、例えば、注射、注入または摂取された薬学的組成物によって、直接使用できる。前記組成物は、ヒトを含む生存動物の身体の神経栄養剤の活性に応答性である障害または疾患を軽減するために使用できる。前記障害または疾患は、特に外傷、外科手術、虚血、感染、代謝性疾患、栄養欠乏、悪性剤または毒性剤および遺伝的または特発性過程によって生じた神経系の損傷であり得る。

前記損傷は、特に感覚ニューロンまたは後根神経節におけるニューロンなどの網膜神経節細胞または以下の組織のいずれかにおいて生じたものであり得る：膝神経節、錐体神経節および下神経節；第８脳神経の前庭聴覚複合体；三叉神経節の上下顎葉の腹外側極；および三叉神経中脳路核。

本発明の方法の幾つかの実施形態において、前記疾患または障害は、末梢神経延髄および／または脊髄の外傷性損傷、脳虚血ニューロン損傷、神経障害および特に末梢神経障害、末梢神経外傷または傷害、虚血発作、急性脳傷害、急性脊髄傷害、神経系腫瘍、多発性硬化、神経毒への曝露、糖尿病または腎機能不全などの代謝性疾患および感染物質による損傷、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、パーキンソンプラス症候群、進行性核上不随（スチール−リチャードソン−オルゼウスキー症候群）、オリーブ橋小脳萎縮（ＯＰＣＡ）、シャイ−ドレーガー症候群（多系萎縮）、グアマニアンパーキンソン症候群認知症複合体、筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患、または任意の他の先天性または神経変性疾患および認知症に関連した記憶障害などの損傷ニューロンおよび外傷ニューロンを含む神経変性疾患である。

幾つかの実施形態において、感覚系および／または自律系ニューロンを治療することができる。特に侵害受容性および機械受容性ニューロンを治療でき、より具体的には、Ａ−デルタ線維、Ｃ−線維およびＡ−ベータ線維ニューロンを治療できる。さらに、自律系の交感および副交感ニューロンを治療できる。

幾つかの実施形態において、筋萎縮性側索硬化症（「ＡＬＳ」）および脊髄筋萎縮症を治療できる。他の実施形態において、本発明のニューブラスチン分子は、外傷性傷害後の神経回復を高めるために使用できる。あるいは、またはそれに加えて、ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドまたは変異ニューブラスチンポリペプチドの融合体または結合体を含有するマトリックスを有する神経誘導チャネルが、本明細書に記載された方法において使用できる。そのような神経誘導チャネルは、例えば、米国特許第５，８３４，０２９号に開示されている。

幾つかの実施形態において、本明細書に開示された組成物（および同じものを含んでなる薬学的組成物）は、末梢神経障害の治療に使用される。本発明の分子による治療に含まれる末梢神経障害の中でも、外傷誘導神経障害、例えば、物理的傷害または疾患状態、脳に対する物理的損傷、脊髄に対する物理的損傷、脳損傷に関連した脳卒中および神経変性に関連した神経系疾患により生じた神経障害がある。また、本明細書には、感染、毒素曝露および薬物曝露に副次的な神経障害が含まれる。さらに本明細書には、全身性または代謝性疾患に副次的な神経障害が含まれる。例えば、本明細書に開示された組成物は、化学療法誘導神経障害（化学療法剤、例えばタキソールまたはシスプラチンの送達により生じたもの）；毒素誘導神経障害、薬物誘導神経障害；ビタミン欠乏神経障害；特発性神経障害；糖尿病性神経障害；およびヘルペス後坐骨神経痛を治療するためにも使用できる。例えば、米国特許第５，４９６，８０４号および米国特許第５，９１６，５５５号を参照されたい。

本発明により治療することのできるさらなる病態は、軸索神経障害および脱髄性神経障害などの単神経障害、単一多発性神経障害および多発性神経障害である。

幾つかの実施形態において、本発明の組成物（および同じものを含んでなる薬学的組成物）は、黄班変性、網膜色素変性、緑内障、および同様の疾患の罹患患者の網膜における光レセプター喪失など、眼の種々の障害の治療に使用される。

（方法および薬学的組成物）
本発明は、神経障害性疼痛を治療し、触覚異痛症を治療し、神経障害を伴う痛感度の喪失を減少させる方法を提供する。本法では、生物活性完全長ニューブラスチンポリペプチド類または生物活性切断ニューブラスチンポリペプチド類を含む、ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドダイマー類を使用する。さらに、本発明は、製薬上許容できるキャリア中に懸濁、溶解、または分散されたポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドダイマーを提供する。

（１．神経障害性疼痛の治療）
一実施形態において、本発明は、ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドダイマーの有効量を対象に投与することを含んでなる対象における神経障害性疼痛を処置する方法を含む。幾つかの実施形態において、本発明は、例えば、配列番号１、２、６〜２１および３６のいずれか１つまたはその変異体を含む、野生型、切断または変異ニューブラスチンポリペプチドを含んでなるポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドダイマーの有効量を、単独で対象に投与することを含んでなるか、またはオピオイド、抗不整脈薬、局所鎮痛薬、局所麻酔薬、抗痙攣薬、抗うつ薬、コルチコステロイドおよび非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）からなる群より選択される鎮痛誘導化合物の有効量もまた対象に投与することにより、対象における神経障害性疼痛を治療する方法を含む。好ましい実施形態において、鎮痛誘導化合物は、抗痙攣薬である。他の好ましい実施形態において、鎮痛誘導化合物は、ガバペンチン（（１−アミノメチル）シクロヘキサン酢酸）またはプレガバリン（Ｓ−（＋）−４−アミノ−３−（２−メチルプロピル）ブタン酸）である。

本発明のニューブラスチンポリペプチド類および核酸類（および本明細書に記載されたポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドダイマーを含んでなる薬学的組成物）は、末梢神経障害に伴う疼痛の処置に使用される。本発明により治療できる末梢神経障害の中では、外傷誘導性神経障害、例えば、物理的傷害または疾患状態、脳に対する物理的損傷、脊髄に対する物理的損傷、脳損傷に伴う脳卒中、および神経変性に関連する神経系障害により生ずるものがある。

本発明はまた、化学療法誘導神経障害（化学療法剤、例えば、タキソールまたはシスプラチンの送達により生ずるものなど）；毒素誘導神経障害、薬物誘導神経障害、病原体誘導神経障害（例えば、ウィルス誘導）、ビタミン欠乏誘導神経障害、特発性神経障害；および糖尿病性神経障害の治療を提供する。各々が参照として本明細書に組み込まれている、例えば、米国特許第５，４９６，８０４号および米国特許第５，９１６，５５５号を参照されたい。本発明はさらにまた、本発明のニューブラスチンヌクレオチド類およびポリペプチド類を用いて、軸索神経障害および脱髄性神経障害などの単神経障害、単一多発性単神経障害、および多発性神経障害の治療に使用できる。

神経障害性疼痛は、（ａ）外傷誘導性神経障害、（ｂ）化学療法誘導神経障害，（ｃ）毒素誘導神経障害（限定はしないが、アルコール中毒症、ビタミンＢ６中毒、六炭素中毒、アミオダロン、クロラムフェニコール、ジスルフィラム、イソニアジド、金、リチウム、メトロニダゾール、ミソニダゾール、ニトロフラントインにより誘導された神経障害など）、（ｄ）治療薬誘導神経障害などの薬物誘導神経障害（抗癌剤、特にタキソール、タキソテール、シスプラチン、ノコダゾール、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビンブラスチンにより生ずるものなど；および抗ウィルス剤、特にｄｄＩ、ＤＤＣ、ｄ４Ｔ、ホスカルネット、ダプソン、メトロニダゾール、およびイソニアジドのからなる群より選択される抗ウィルス剤により生ずるものなど）、（ｅ）ビタミン欠乏誘導神経障害（限定はしないが、ビタミンＢ１２欠乏症、ビタミンＢ６欠乏症、ビタミンＢ１２欠乏症、およびビタミンＥ欠乏症など）、（ｆ）特発性神経障害、（ｇ）糖尿病性神経障害、（ｈ）病原体誘導神経損傷、（ｉ）炎症誘導神経損傷、（ｊ）神経変性、（ｋ）遺伝性神経障害（限定はしないが、フリートライヒ運動失調、家族性アミロイド多発性神経障害、タンジアー病、ファブリー病など）、（ｌ）代謝障害（限定はしないが、腎不全および甲状腺機能不全など）、（ｍ）感染性およびウィルス性神経障害（限定はしないが、ハンセン病、ライム病に伴う神経障害性疼痛、ウィルス、特にヘルペスウィルス（例えば、ヘルペス後神経痛に導き得る帯状ヘルペス）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、およびパピローマウィルスからなる群より選択されるウィルス感染に伴う神経障害性疼痛など）、（ｎ）自己免疫神経障害（限定はしないが、ギヤン−バレー症候群、慢性炎症性脱髄性神経障害、未決定の重要な単一クローン性免疫グロブリン症および多発性単神経障害）、（ｏ）三叉神経痛およびエントラップメント症候群（限定はしないが、心皮トンネルなど）、および（ｐ）外傷後神経痛、幻肢痛、多発性硬化症痛、複合領域痛症候群（限定はしないが、灼熱痛、カウザルギー）、腫瘍形成関連痛、血管炎症／血管障害の神経障害、および坐骨神経痛などの他の神経障害性疼痛症候群、などの多数の末梢神経障害と関連し得る。神経障害性疼痛は、異痛症、痛覚過敏症、自発痛または幻肢痛として現れる。

（２．触覚異痛症の治療）
用語の「触覚異痛症」とは、疼痛が、通常は無害性である皮膚の刺激（例えば、接触）により誘発される対象における状態を代表的に言う。本発明は、対象における触覚異痛症を治療する方法を含む。

幾つかの実施形態において、触覚異痛症は、ポリマー結合変異ニューブラスチンポリペプチドダイマー単独の治療有効量を対象に投与することによって治療される。

ある関連実施形態において、本発明は、例えば配列番号１、２、６〜２１および３６の少なくとも１つまたはその変異体を含む、切断野生型または変異ニューブラスチンポリペプチドを含むポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドダイマーの有効量を、対象に投与するか、またはオピオイド、抗不整脈薬、局所鎮痛薬、局所麻酔薬、抗痙攣薬、抗うつ薬、コルチコステロイドおよびＮＳＡＩＤＳからなる群より選択される鎮痛誘導化合物の有効量と共にニューブラスチンポリペプチドダイマーの有効量を対象に投与することにより、対象における触覚異痛症を治療する方法を含む。他の好ましい実施形態において、鎮痛誘導化合物は、ガバペンチン（（１−アミノメチル）シクロヘキサン酢酸）またはプレガバリン（Ｓ−（＋）−４−アミノ−３−（２−メチルプロピル）ブタン酸）である。

幾つかの実施形態において、ポリマー結合変異ニューブラスチンポリペプチドダイマーは、限定はしないが、抗癌剤または抗ウィルス剤などの治療剤と組み合わせて投与される。抗癌剤としては、限定はしないが、タキソール、タキソテール、シスプラチン、ノコダゾール、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビンブラスチンが挙げられる。抗ウィルス剤としては、限定はしないが、ｄｄＩ、ＤＤＣ、ｄ４Ｔ、ホスカルネット、ダプソン、メトロニダゾール、およびイソニアジドが挙げられる。

（３．痛感度喪失を減少させる処置）
他の実施形態において、本発明は、神経障害を患っている対象において痛感度の喪失を減少させるため方法を含む。好ましい実施形態において、神経障害は、糖尿病性神経障害である。好ましい実施形態において、痛感度の喪失は、熱的痛感度の喪失である。本発明は、予防的処置および治療的処置の両方を考慮している。

予防的処置において、ポリマー結合変異ニューブラスチンポリペプチドダイマーを、痛感度の喪失を発現する危険性のある対象に投与するが；このような対象は、早期の神経障害対象であることが予想されるであろう。このような状況下でのニューブラスチンによる処置は、危険性のある患者を予防的に処置するために役立つであろう。

治療的処置において、ポリマー結合変異ニューブラスチンポリペプチドダイマーを、神経障害罹患の結果、痛感度の喪失を経験している対象に投与するが；このような対象は、後期の神経障害対象であることが予想されるであろう。このような状況下でのポリマー結合変異ニューブラスチンポリペプチドダイマーによる処置は、対象において適切な痛感度を救うために役立つであろう。

（４．ウィルス感染およびウィルス関連神経障害の処置）
感染性およびウィルス神経障害の予防処置が考慮されている。予防処置は、ウィルス感染の決定後でかつ神経障害性疼痛の発生前に適用される。処置時に、ポリマー結合変異ニューブラスチンポリペプチドダイマーを、限定はしないが、ハンセン病、ライム病に伴う神経障害性疼痛、ウィルス、特にヘルペスウィルス（より具体的には、ヘルペス後神経痛に至り得る帯状ヘルペスウィルス）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、およびパピローマウィルスからなる群より選択されるウィルスによる感染に伴う神経障害性疼痛などの神経障害性疼痛の発現を防止するために投与する。代わりの実施形態において、ポリマー結合変異ニューブラスチンポリペプチドダイマーを、発現するはずの重度の神経障害性疼痛を軽減するために投与する。

急性ウィルス感染の症状としては、発疹の発現が挙げられる。他の症状としては、例えば、帯状ヘルペス感染の一般的な合併症（帯状疱疹）である、身体の患部における持続性痛の発生が挙げられる。ヘルペス後の神経痛は、１ヵ月以上続き、何らかの発疹様症状の消失数ヵ月後に発現し得る。

（５．有痛性の糖尿病性神経障害の処置）
有痛性の糖尿病性神経障害の予防処置が考慮されている。糖尿病性神経障害の予防処置は、糖尿病または糖尿病関連症状の最初の診断決定後で、かつ神経障害性疼痛前に開始することになろう。有痛性の糖尿病性神経障害の予防処置はまた、対象が、糖尿病または糖尿病関連症状を発現する危険性があると決定した際に開始し得る。処置時に、ポリマー結合変異ニューブラスチンポリペプチドダイマーを、神経障害性疼痛の発現を防止するために投与する。代わりの実施形態において、ポリマー結合変異ニューブラスチンポリペプチドダイマーを、既に発現した重度の神経障害性疼痛を軽減するために投与する。

（６．神経系障害）
さらなる態様において、本発明は、ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドの治療有効量を、それを必要とする対象に投与することにより、対象（ヒトを含む）における神経系障害を治療するか、または防止する方法を提供し、組成物は、ニューブラスチンポリペプチドまたはポリマーに結合した変異ニューブラスチンポリペプチド、または安定な水溶性結合ニューブラスチンポリペプチドを含む複合体、またはニューブラスチンポリペプチド、または、例えば、ＰＥＧなどのポリアルキレン部分に結合した変異ニューブラスチンポリペプチドを含んでなる変異ニューブラスチンポリペプチド複合体を含有する。

神経系障害は、末梢神経障害または神経障害性疼痛症候群などの末梢神経系障害であり得る。治療に関しては、ヒトが好ましい対象である。

本発明のポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドダイマーは、限定はしないが損傷ニューロンおよび外傷ニューロンなど、ニューロンにおける欠陥を処置するために有用である。外傷を経験した末梢神経としては、限定はしないが、延髄または脊髄の神経が挙げられる。本発明のポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドダイマーは、神経変性疾患、例えば脳虚血ニューロン損傷；神経障害、例えば末梢神経障害、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療に有用である。このようなニューブラスチンポリペプチドダイマーは、記憶障害、例えば認知症関連の記憶障害の治療に使用できる。

病態または疾患のさらなる例は、末梢神経系、延髄、または脊髄の疾患、ならびに外傷誘導神経障害、化学療法誘導神経障害、毒素誘導神経障害、薬物誘導神経障害、ビタミン欠乏誘導神経障害；特発性神経障害；および糖尿病性神経障害、毒素誘導神経損傷に伴う神経障害性疼痛、病原体誘導神経損傷、炎症誘導神経損傷、または神経変性である。本発明のニューブラスチンポリペプチドダイマーは、神経障害性疼痛の処置、触覚異痛症の処置および神経障害に伴う痛感度の喪失を減少させる処置にさらに有用である。

（７．投与量）
先の方法では、切断されていても、いなくてもよいポリマー結合変異ニューブラスチンポリペプチドダイマーを含んでなる処方物を対象に、一用量当たり０．０１μｇ／ｋｇ対象体重から１０００μｇ／ｋｇ対象体重の投与量で、好ましくは全身的に投与することが考慮されている。この投与量は、一用量当たり１μｇ／ｋｇ対象体重から１００μｇ／ｋｇ対象体重であることが好ましい。この投与量は、一用量当たり１μｇ／ｋｇ対象体重から３０μｇ／ｋｇ対象体重、例えば、一用量当たり３μｇ／ｋｇ対象体重から１０μｇ／ｋｇ対象体重であることがより好ましい。本発明の処方物の治療有効量は、過度の実験なしで、当業者により確認可能な投与計画でそれを必要とする対象に投与できる。

（８．送達）
先の方法で用いられるポリペプチドダイマーは、任意の好適な送達システム、好ましくは、静脈内送達、筋肉内送達、肺内送達、皮下送達、および腹腔内送達により、最も好ましくは、筋肉内送達、静脈内送達、または皮下送達により投与できる。先の方法で用いられるニューブラスチンポリペプチドは、くも膜下腔内送達により投与することもできる。

ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチドダイマーの投与は、例えば、全身的または局所的であり得る。処方物には、非経口投与並びに経口投与に好適なものが含まれ、具体的な投与様式としては、経口投与、経直腸投与、舌下投与、局所投与、経鼻投与、経眼投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経皮投与、髄腔内投与、関節内投与、動脈内投与、くも膜下投与、気管支投与、経リンパ管投与、経膣投与、および子宮内投与が挙げられる。局所的および全身的の両方でエアゾール投与および非経口投与に好適な処方物が含まれる。好ましい処方物は、皮下投与、筋肉内投与、または静脈内投与に好適である。

（８．投与計画）
幾つかの実施形態において、本発明のポリペプチドダイマーに関する投与回数は、処方物を１週３回、２週間対象への投与を提供する。治療有効性を最適化するために、ポリマー結合変異ニューブラスチンポリペプチドダイマーを、先ず異なる投与計画で投与する。単位投与量および投与計画は、例えば、免疫化哺乳動物種、その免疫状態、哺乳動物の体重などの因子に依存する。代表的には、組織内のタンパク質レベルが、例えば、所与の処置投与計画の有効性を決定するために、臨床試験法の一部として適切なスクリーニングアッセイを用いてモニターされる。

本発明のポリマー結合変異ニューブラスチンポリペプチドダイマーに関する投与回数は、当業者および医師の臨床判定の範囲内にある。代表的には、投与計画は、最適な投与パラメータを確立し得る臨床試験により確立される。しかしながら、開業医は、対象の年齢、健康状態、体重、性別および医療状態によってこのような投与計画を変えてもよい。投与回数はまた、神経障害に関する急性処置および慢性処置の間で変わり得る。さらに、投与回数は、この処置が予防的か、または治療的であるかによって変わり得る。

本発明を、以下の非限定的実施例においてさらに説明する。

（実施例１：アミノ末端ＰＥＧ化ニューブラスチンの生物学的利用能）
ＣＨＯ細胞−と大腸菌誘導組替えニューブラスチン類は、ラットにおいて静脈内に投与された場合、循環から急速に除去されることが認められた。タンパク質は、皮下投与後の血清中に検出の閾値以下であった。ニューブラスチンの生物学的利用能を増加させるために、変異ニューブラスチンのＰＥＧ化形態を構築した。

リジンは、ニューブラスチン配列に生じないので、アミン特異的ＰＥＧ化化学により、野生型ニューブラスチンポリペプチドのＰＥＧ化がその末端にもたらされる。したがって、各ニューブラスチンダイマーに関して、２つのＰＥＧ部分が結合するはずである。したがって、ＰＥＧ形態は、アミン特異的化学により先ずアミノ末端に対して直接標的化された。驚くべきことに、大腸菌発現野生型ニューブラスチンのＰＥＧ化は、２つの２０ｋＤａ ＰＥＧを結合しても、半減期に対して殆ど利益を有さず、ベースクリアランス経路に基づく機構が、ＰＥＧ化により達成されると予想された半減期の増大を打ち消していることが示された。

（実施例２：ＰＥＧ化変異ニューブラスチン（Ｎ９５Ｋ）の構築）
次に、内部アミノ酸残基においてＰＥＧ化された変異ニューブラスチン形態の生物学的利用能を調べた。配列番号１に示されるとおり番号付けされた場合、１４位、３９位、６８位、および９５位の天然残基を置き換える一連の４種の変異体は、配列内の選択部位にリジンを挿入するようにデザインされた。これらのリジンは、ＰＥＧ結合のための代わりの部位を提供とすると思われる。これらの部位は、表面残基を同定するために骨組みとしてＧＤＮＦ（Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．４：ｐ．４３５−８、１９９７年）の結晶構造を用いて選択された。回避すべき構造の機能的に重要な領域を同定するためにペルセフィン／ニューブラスチンキメラ変異誘発性試験（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：ｐ．３４１２−２０、２０００年）が用いられた。

大腸菌における野生型ニューブラスチン遺伝子を発現させるために、同質遺伝子を、より低いＧＣ含量と好ましい大腸菌コドンにより構築した。これらの同質遺伝子は、２つのベクター、ｐＥＴ１９ｂおよびｐＥＴ１９ｂの誘導体であるｐＭＪＢ１６４にクローン化された。ｐＥＴ１９ｂにおいて、ニューブラスチン（ＮＢＮ１１３）の成熟ドメインをコードする配列を、開始メチオニンに直接融合される。ｐＭＪＢ１６４において、ニューブラスチンの成熟ドメインを、ヒスチジンタグ（すなわち、１０のヒスチジン）に融合し、エンテロキナーゼ開裂部位（配列番号３５および３６）によりヒスチジンタグから分離する。開始メチオニンは、ヒスチジンタグに先行する。

（表５．Ｈｉｓタグ化野生型ニューブラスチンヌクレオチドおよびポリペプチド配列）

２種の変異体（Ｒ３９およびＲ６８）は、表面上の正電荷の分布に基づいて、ヘパリン結合となり得る領域に標的化された。この部位は、タンパク質の急速なクリアランスに寄与している可能性が高い。第３の部位は、野生型ニューブラスチンにおけるＮ９５の天然グリコシル化部位において標的にされた。この部位は複雑な炭水化物構造により自然に修飾される。したがって、この部位においてＰＥＧによる修飾が、機能に影響を与えることは予想されなかった。第４の部位（Ｒ１４）は、他のいずれの修飾によっても覆われなかった領域において選択された。９５位のアスパラギン残基がリジン（「Ｎ９５Ｋ変異体」）で置換された変異体は、本明細書に開示された試験用に選択された。

ラットニューブラスチンポリペプチドの野生型配列において１つ以上の変更を含んでなる４種の変異ラットニューブラスチンを構築した。これらの変異ニューブラスチンは、１つのアミノ酸置換：Ｒ１４Ｋ；Ｒ６８Ｋ；Ｒ３９Ｋ；またはＮ９５Ｋを含んだ。表１Ａは、これらの代表的点変異を太字で識別している。「Ｘ_１Ｎ_１Ｘ_２」の命名において、Ｘ_１は、野生型ニューブラスチンポリペプチドアミノ酸を表し、Ｎ_１は、配列番号１に従って番号付けされる配列におけるＸ_１アミノ酸の位置数字を表し、Ｘ_２は、示されたＮ_１の位置数字における野生型アミノ酸の代わりに置換されたアミノ酸を表す。

ラットＮ９５Ｋニューブラスチン変異を構築するために、部位特異的変異誘発を、野生型ラットニューブラスチンをコードするプラスミドであるｐＣＭＢ０２０上で実施した。この野生型ラットニューブラスチン核酸およびそれによってコードされたポリペプチドのアミノ酸配列は、下記に示している：
（表６．野生型ラットＮＢＮ配列）

オリゴヌクレオチドＫＤ３−２１０およびＫＤ３−２１１を用いるｐＣＭ０２０の変異誘発により、プラスミドｐＣＭＢ０２７の形成がもたらされた：

ｐＣＭＢ０２７において、９５位にアスパラギンをコードするコドンは、リジンをコードするコドンにより置き換えられた。

Ｒ１４Ｋ変異ニューブラスチンは、ｐＣＭＢ０２０の配列をコードするニューブラスチンにおいて、リジンをコードするコドンによる１４位におけるアルギニンをコードするコドンの置換によって形成された。ｐＣＭＢ０２０の部位特異的変異誘発は、オリゴヌクレオチドＫＤ３−２５４およびＫＤ３−２５５を用いて実施された：

生じた構築体は、ｐＣＭＢ０２９と命名された。

Ｒ６８Ｋ変異ニューブラスチンは、ｐＣＭＢ０２０の配列をコードするニューブラスチンにおいて、リジンをコードするコドンによる６８位におけるアルギニンをコードするコドンの置換によって形成された。部位特異的変異誘発は、オリゴヌクレオチドＫＤ３−２５８およびＫＤ３−２５９を用いてｐＣＭＢ０２０に実施された：

生じた構築体は、ｐＣＭＢ０３０と命名された。

Ｒ３９Ｋ変異ニューブラスチンは、ｐＣＭＢ０２０の配列をコードするニューブラスチンにおいて、リジンによるアミノ酸３９におけるアルギニンの置換によって形成された。ｐＣＭＢ０２０の部位特異的変異誘発は、オリゴヌクレオチドＫＤ３−２５６およびＫＤ３−２５７を用いて実施された：

（大腸菌における変異ニューブラスチンの発現および特性決定）
発現および精製に関して、ラットニューブラスチンＮ９５Ｋポリペプチドをコードするプラスミドは、成熟１１３アミノ酸ニューブラスチン配列の開始に直接隣接したエンテロキナーゼ開裂部位によりＨｉｓ−タグ化融合タンパク質として大腸菌に発現された。大腸菌は、５００Ｌ発酵槽中で増殖され、凍結細胞ペーストが提供された。大腸菌細胞を、ＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ Ｐｒｅｓｓ中、溶菌し、ラットニューブラスチンＮ９５Ｋを、不溶性洗浄ペレットフラクションから回収した。

Ｎ９５Ｋ変異ニューブラスチンは、塩酸グアニジンにより前記ペレットから抽出され、リフォールディングされ、エンテロキナーゼによりＨｉｓ−タグを除去された（実施例５を参照）。次に産生物を、Ｎｉ ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）上およびＢａｋｅｒｂｏｎｄ ＷＰ ＣＢＸカチオン交換樹脂上のクロマトグラフィに供した。

Ｈｉｓタグ化産生物のエンテロキナーゼ処理により、成熟配列においてアルギニン７におけるタンパク質の異常開裂が生じた。生じた１〜７のニューブラスチン産生物（ＮＢＮ１０６〜Ｎ９５Ｋ）は、ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡにおいて十分に活性であり、グアニン誘導変性に対するその感受性において成熟形態と構造的に識別不能であり、したがって、その後の研究に用いられた。

ラット変性ニューブラスチンＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋは、反応物として１０，０００Ｄａの分子質量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ）を用いて、ニューブラスチン１分子当たり平均３．３ＰＥＧ部分でＰＥＧ化された。生じたＰＥＧ化生成物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析、ゲルろ過クロマトグラフィ（ＳＥＣ）、逆相ＨＰＬＣ、マトリックスアシストレーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤ／ＩＭＳ）、ペプチドマッピング、ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡにおける活性評価、およびエンドトキシン含量の決定など、広範囲の特性決定に供された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣにより測定されたＰＥＧ化前のニューブラスチンＮ９５Ｋ産生物の純度は、９５％超であった。ダイマーとして非還元条件下で移動したニューブラスチンＮ９５Ｋ産生物は、その予想構造と一致した。ＰＥＧ化後、生じた生成物は、生成物の５％である１分子当たり２つのＰＥＧ、生成物の６０％である１分子当たり３つのＰＥＧ、生成物の３０％である１分子当たり４つのＰＥＧ、およびより高質量の幾つかの微量体を含んでなる一連の修飾付加体から構成された。ＰＥＧ化サンプルにおいて、凝集物の証拠はなかった。生成物における未修飾ニューブラスチンの残存濃度は、定量化限界以下であった。材料のうちのエンドトキシン含量は、規定どおりに１ＥＵ／ｍｇ未満である。ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡにおけるＰＥＧ化ニューブラスチンの比活性は、１０ｎＭである。ＰＥＧ化生成物を、ＰＢＳ ｐＨ６．５中、１．１ｍｇ／ｍＬで処方物化した。野生型ニューブラスチン（ＮＢＮ１１３）と効力が同様であるこの物質は、−７０℃で保存される凍結液体として供給できる。

Ｒ１４Ｋ、Ｒ３９Ｋ、Ｒ６８Ｋ変異ニューブラスチンポリペプチド類は、大腸菌において発現され、精製、ＰＥＧ化およびＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋニューブラスチンに関する上記の機能評価と同一の方法に供することができる。

（ＰＥＧ化変異ニューブラスチンＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋの調製）
大腸菌で産生され、５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ中、４℃で保存された２３０ｍＬのリフォールディングされたラットＮ９５Ｋ変異ニューブラスチン（２．６ｍｇ／ｍＬ）を、７７ｍＬの水、１４．４ｍＬの１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、および２．８ｇ（最終１０ｍｇ／ｍＬ）のＰＥＧ ＳＰＡ １０，０００Ｄａ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社）で希釈した。このサンプルを、暗所での室温で４時間温置してから、５ｍＭイミダゾール（最終）で処理し、ろ過し、４℃で一晩保存した。２つのバッチで生成物を生じさせ、１つは１３０ｍＬのＮ９５Ｋバルクを含有し、他は、１００ｍＬの前記バルクを含有した。ＰＥＧ化ニューブラスチンを、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＯ_３ ⁻（Ｍ）（ＥＭ産業）上で反応混合物から精製した。カラムは室温で操作した。緩衝液の全てはパイロジェンなしで調製した。塩化ナトリウムは、８７ｍＭの最終濃度で反応混合物に加え、サンプルを４５ｍＬＦｒａｃｔｏｇｅｌカラム（５ｃｍ内径）上に充填した。

カラムを、５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５、８０ｍＭ ＮａＣｌの１本のカラム容量で洗浄し、次いで５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する５ｍＭリン酸ナトリウムの１本のカラム容量一定分割量で３回洗浄した。前記樹脂を、２．５ｃｍ直径のカラムに移し、ＰＥＧ化ニューブラスチンを、５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５、４００ｍＭ ＮａＣｌを含有する１０ｍＬを６段階で、５００ｍＭ ＮａＣｌを含有する３段階で、６００ｍＭ ＮａＣｌを含有する６段階でカラムから溶出させた。溶出フラクションを、２８０ｎｍにおける吸光度によりタンパク質含量を分析し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥによる修飾の程度を分析した。選択されたフラクションを集め、０．２μｍフィルタを通してろ過し、水で希釈して１．１ｍｇＰＥＧ化ラットニューブラスチン／ｍＬとした。個々のバッチ中のエンドトキシン濃度を評価した後、それらを集め、０．２μｍ膜を通して再ろ過した。最終物質を一定分割し、−７０℃で保存した。

（精製ＰＥＧ化変異ニューブラスチンＮＢＮ１０６−Ｎ９５ＫのＵＶスペクトル）
ＰＥＧ化ＮＢＮ Ｎ９５ＫのＵＶスペクトル（２４０〜３４０ｎｍ）をニートサンプルで取った。このサンプルを三通り分析した。ＰＥＧ化サンプルは、最大吸光度を２７５〜２７７ｎｍに、最小吸光度を２４７〜２４９ｎｍにおいて示した。この結果は、バルク中間体に観測されるものと一致する。ＰＥＧ化生成物のタンパク質濃度は、Σ_２８０ ^０．１％＝０．５０の吸光係数を用いてスペクトルから推定した。ＰＥＧ化ニューブラスチンバルクのタンパク質濃度は、１．１ｍｇ／ｍＬである。３２０ｎｍにおける吸光度の欠如により明らかなように証拠から濁りは存在しなかった。

（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＰＥＧ化変異ニューブラスチンＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋの特性決定）
生成物の３μｇ、１．５μｇ、０．７５μｇ、および０．３μｇを含有するＰＥＧ化ニューブラスチンの一定分割量を、４〜２０％勾配ゲル（Ｏｗｌ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ明青色Ｒ−２５０で染色した。分子量マーカー（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を平行に作動させた。

非還元条件下でＰＥＧ化変異ニューブラスチンＮＢＮ１０６−Ｎ９５ＫのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、１分子当たり２つ、３つ、４つ、および４つ以上のＰＥＧによる修飾に相当する一連のバンドを明らかにした。９８ｋＤａの明確な質量を有する主要バンドは、１分子当たり３つのＰＥＧを含有する。２つ、３つ、および４つのＰＥＧを結合した生成物の混合物の存在は、ＭＡＬＤＩ質量分光分析により証明された。２つ、３つ、および４つのＰＥＧを含有する生成物の比率は、デンシトメトリーにより決定され、それぞれ、全量の７パーセント、６２パーセント、および３０パーセントであることが決定された。

（ゲルろ過クロマトグラフィによるＰＥＧ化変異ニューブラスチンＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋの特性決定）
ＰＥＧ化変異ニューブラスチンＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋを、移動相として５ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．５、３００ｍＭ ＮａＣｌを用いて分析用Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ＨＲ１０／３０ＦＰＬＣカラム上でゲルろ過クロマトグラフィに供した。カラムを２０ｍＬ／時間で操作した。溶出液を２８０ｎｍにおける吸光度でモニターした。ＰＥＧ化変異ニューブラスチンは、ＰＥＧの流体力学的大容量と一致する約２００ｋＤａの明白な分子量を有する単一ピークとして溶出した。凝集物の証拠は見られなかった。約３０ｋＤａの明白な分子量で溶出する遊離のニューブラスチンは、調製物中に検出されなかった。

（逆相ＨＰＬＣによるＰＥＧ化変異ニューブラスチンＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋの分析）
ＰＥＧ化変異ニューブラスチンＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋを、Ｖｙｄａｃ Ｃ_４（５μｍ、１ｘ２５０ｍｍ）カラム上の逆相ＨＰＬＣに供した。カラムを、４０％から６０％Ｂ（緩衝液Ａ：０．１％ＴＦＡ、緩衝液Ｂ：７５％アセトニトリル／０．０８５％ＴＦＡ）の勾配で６０ｍｍを用いて展開した。カラム溶出液を、２１４ｎｍにおける吸光度に関してモニターし、その後の分析のためにフラクションを採取した。ＰＥＧ化ＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋを、Ｃ_４カラム上の逆相ＨＰＬＣによりその種々のジ（６０．５ｍｍ）、トリ（６３．３ｍｍ）、およびテトラ（６７．８ｍｍ）ＰＥＧ化成分に分画した。ピークの相対強度は、成分比率が、それぞれ５．４％、６０．５％、および３０．１％であることを示唆している。ピークの正体は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより証明された。生成物において非ＰＥＧ化ＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋ（５〜１５ｍｍでの溶出液）の証拠はなかった。

（質量分析によるＰＥＧ化変異ニューブラスチンＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋの分析）
ＰＥＧ化変異ニューブラスチンＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋは、Ｃ_４Ｚｉｐ Ｔｉｐ上で脱塩し、マトリックスとしてシナピン酸を用いて、Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ（商標）ＳＴＲ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）マトリックスアシストレーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）上の質量分析により分析した。０．５μＬの精製タンパク質を、標的プレート上で０．５μＬのマトリックスと混合した。ＰＥＧ化変異ニューブラスチンＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋの質量分析により、これらの付加物の単一および二重荷電形態を明らかにした。４３８０３Ｄａ、５４０４６Ｄａ、６４４３８Ｄａの観測質量は、１分子当たり２つ、３つ、および４つのＰＥＧの修飾体と一致している。

（ペプチドマッピングによるＰＥＧ化変異ニューブラスチンＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋの分析）
ＰＥＧ化反応の特異性は、ペプチドマッピングにより評価された。ＰＥＧ化ニューブラスチンを、ジ、トリ、およびテトラＰＥＧ化成分に分離し、次にこれらを、還元し、アルキル化し、さらにＣ_４カラム上のＨＰＬＣにより、これらの１本鎖成分に分離した。これらの成分および対照として還元的アルキル化非ＰＥＧ化ＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋを、Ａｓｐ−Ｎプロテイナーゼで消化し、生じた開裂生成物を、０％から６０％Ｂ（緩衝液Ａ：０．１％ＴＦＡ、緩衝液Ｂ：７５％アセトニトリル／０．０８５％ＴＦＡ）の勾配で６０ｍｍを用いて、Ｖｙｄａｃ Ｃ_４（５μｍ、１ｘ２５０ｍｍ）カラム上の逆相ＨＰＬＣカラムにより分画した。カラム溶出液を、２１４ｎｍの吸光度においてモニターした。

ラットニューブラスチン配列は、５つの内部アスパラギン酸を含有し、したがって、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎで消化すると、単純開裂プロフィルを生ずることが予想された。ラットＮ９５ＫのＡｓｐ−Ｎ消化物からのピークは全て、質量分析および／またはＥｄｍａｎアミノ末端配列決定により同定されており、したがってペプチドマップは、ピークの有無により修飾部位を探るための簡単な手段として使用できる。種々のピークの同定は、下記の表７に要約されている。

（表７)

（Ｍ）：モノロストピック（ｍｏｎｏｌｏｓｔｏｐｉｃ）質量
^＊：ＭＡＬＤＩ上のペプチドを含有するメチオニンの酸化による。

ニューブラスチンは、ホモダイマーとして天然に存在するので、ラット変異ニューブラスチンＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋ生成物は、ＰＥＧ化のために４つの潜在的部位、すなわち鎖の各々からの２つのアミノ末端アミンおよび構築体に工学的に入れられている２つのＮ９５Ｋ部位を含有する。ジ−ＰＥＧ化鎖のペプチドマップにおいて、Ｎ９５Ｋ変異のペプチドを含有するピ−クだけが、ＰＥＧ修飾により変更された。他のピークは、ＰＥＧ修飾により影響を受けなかった。したがって、パッピングデータは、ＰＥＧ部分が、このペプチドに特異的に結合し、スクリーンされた他のペプチドのいずれにも結合しないことを示している。結合の第２の潜在部位であるアミノ末端は、３つだけのアミノ酸長であり、ペプチドマップに検出されないペプチド上にある。さらなるＰＥＧ結合は、この部位にあることが推測される。この考えと一致して、小さなパーセンテージのラット変異ニューブラスチンＮ９５Ｋは、切断されず、成熟Ａｌａ−１配列を含有する。このペプチドは、３０μｍで溶出し、非ＰＥＧ化消化物のペプチドマップにおいて認識できるが、ＰＥＧ化変異ニューブラスチンＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋ消化物のものに存在しない。

（実施例３：キナーゼレセプター活性化（ＫＩＲＡ）ＥＬＩＳＡにおける内部ＰＥＧ化変異ニューブラスチンＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋの効力評価）
ＰＥＧ化変異ラットニューブラスチンの効力は、リン酸化ＲＥＴの存在に特異的であるＥＬＩＳＡにおいてニューブラスチン活性に係るレポーターとしてのｃ−Ｒｅｔのニューブラスチン依存活性／リン酸化を用いて測定した。ＲｅｔおよびＧＦＲα３を発現する接着性マウス神経芽細胞腫細胞系であるＮＢ４１Ａ３−ｍＲＬ３細胞を、１０％ウシ胎仔血清で補足されたＤｕｌｂｅｃｃｏ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、２４ウェルプレート内に１ウェル当たり２ｘ１０^５細胞を入れ、５％ＣＯ_２中の３７℃で１８時間培養した。

細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２５ｍＬのＤＭＥＭ中、ニューブラスチンの連続希釈により５％ＣＯ_２中の３７℃で１０分間処理した。各サンプルを、二通り分析した。細胞を１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、プレートを緩やかに振りながら、０．３ｍＬの１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、０．２％デオキシコール酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＦ、０．１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルにより４℃で１時間溶菌した。溶菌液を反復ピペット操作によりさらに攪拌し、０．２５ｍＬのサンプルを、５０ｍＭ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６中、５μｇ／ｍＬの抗Ｒｅｔ ｍＡｂ（ＡＡ．ＧＥ７．３）により、４℃で１８時間被覆させた９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに移し、ブロック緩衝液（２０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％正常マウス血清および３％ウシ血清アルブミンを含有する０．１％ツイーン−２０（ＴＢＳＴ））により室温で１時間ブロックした。

室温で２時間温置後、ウェルをＴＢＳＴで６回洗浄した。リン酸化Ｒｅｔは、ブロック緩衝液中、２μｇ／ｍＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−結合抗ホスホチロシン４Ｇ１０抗体と共にウェルを室温で２時間温置し、ＴＢＳＴで６回洗浄し、比色検出試剤により４５０ｎｍでのＨＲＰ活性を測定することにより検出した。溶菌液または溶菌緩衝液で処理されたウェルからの吸光度値を測定し、バックグラウンド補正シグナルを、活性混合物に存在するニューブラスチンの濃度関数としてプロットした。ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡ中のＰＥＧ化変異ニューブラスチン（３（，４）Ｘ１０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋ）の効力は、野生型ＮＢＮ１１３物質のものと区別できなかった（表８）。効力に関して２つの凍結−解凍サイクルの影響はなく、この処理後、サンプルの濁りにおいて有意な増加はなく、前記サンプルは、試験のために安全に解凍できることを示した。別個に、１分子当たり３つおよび４つの１０ｋＤａＰＥＧの生成物活性を評価する独立した試験において、３つのＰＥＧとの付加体は、十分に活性であるが、一方、４つのＰＥＧ生成物は、効力が減少したことが測定された（表８）。これらのデータは、３（，４）Ｘ１０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋおよび３Ｘ１０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋが、非変異（野生型）ニューブラスチン、ＮＢＮ１１３と同様の程度に、また同一の用量依存性でＲｅｔを活性化することを証明している。しかしながら、４Ｘ１０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋは、非変異（野生型）ニューブラスチン、ＮＢＮ１１３と同様の程度でＲｅｔを活性化するが、４Ｘ１０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋは、Ｒｅｔの活性化において非変異（野生型）ニューブラスチン、ＮＢＮ１１３よりもほぼ１０倍効力が低い。推定ＥＣ５０は、表８に提供している。

（実施例４：ラットおよびマウスにおける内部ＰＥＧ化変異ラットニューブラスチンＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋの薬物動態試験）
ラットおよびマウスモデルにおける種々のＰＥＧ化および非ＰＥＧ化変異ニューブラスチン生成物の薬物動態特性を調べた（結果の要約に関しては表８を参照）。

データは、３．３の１００００Ｄａ ＰＥＧを有するラット変異ニューブラスチンＮＢＮ１０６−Ｎ９５ＫのＰＥＧ化が、ニューブラスチンの半減期および生物学的利用能に有意な効果をもたらしたことを明らかにした。Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおける１ｍｇ／ｋｇＩＶ投与後、３０００ｎｇ／ｍＬのＰＥＧ化変異ニューブラスチンのピークレベルは、７分後に検出され、７００ｎｇ／ｍＬのレベルは２４時間後、２００ｎｇ／ｍＬのレベルは４８時間後、１００ｎｇ／ｍＬのレベルは７２時間後に検出された。非ＰＥＧ化変異ニューブラスチンＮ５９Ｋに関する対照において、１ｍｇ／ｋｇＩＶ投与後、１５００ｎｇ／ｍＬのレベルは、７分後に検出されたが、その後、このレベルは、３時間後、７０ｎｇ／ｍＬに急速に低下し、７時間後には検出できなかった。ＰＥＧ化の効果は、皮下投与によるＰＥＧ化ニューブラスチンで処置された動物においてさらにより明白である。

１ｍｇ／ｋｇ皮下投与後、ＰＥＧ化ニューブラスチンの循環レベルは、２４時間後に最大２００ｎｇ／ｍＬに達し、３日間の試験期間中このレベルにとどまった。対照としての非ＰＥＧ化変異ニューブラスチンの投与後では、どの時点においても検出可能なニューブラスチンは認められなかった。

ＰＥＧ化Ｎ９５Ｋサンプルの分析は、各々が異なるＰＫプロフィルを示す１分子当たり２つ、４つおよび４つのＰＥＧを含んでなる付加体の存在により複雑になる。初期のＰＫ試験においては、種々の候補物および投与経路によるスクリーニングを促進するためにマウスが用いられた。このマウス試験により、候補物の生物学的利用能において劇的な相違が明らかとなった。しかしながら、３．３の１０ｋＤａ ＰＥＧ付加体が、ラットで評価された場合、ラットではマウスよりも生物学的利用能が低いことが分かった。生物学的利用能におけるこの相違は、腹腔内投与後に特に明白である。マウスにおけるレベルは、７時間後に１６００ｎｇ／ｍＬに達し、２４時間後には４００ｎｇ／ｍＬにとどまった。対照的に、ラットのレベルは、４〜４８時間において１００ｎｇ／ｍＬの一定であった。

２つの驚くべきかつ予想外の結果は、表８に要約されたＰＫ試験から明らかとなった：１）非グリコシル化ニューブラスチンのアミノ末端アミノ酸のＰＥＧ化は、血清曝露を実質的に増加させるには十分ではなかった；また、２）アミノ酸９５の修飾（例えば、ＰＥＧ化またはグリコシル化）と共にニューブラスチンのアミノ末端アミノ酸（単数または複数）のＰＥＧ化をすると、血清曝露を実質的に増加させる上で十分であった。例えば、グリコシル化ＮＢＮ１０４（ＣＨＯ）は、皮下投与後には検出可能な曝露を得なかったが；グリコシル化１Ｘ２０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０４（ＣＨＯ）は、皮下投与後に高血清曝露を得た。同様に、２Ｘ２０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１１３は、皮下投与後に低血清曝露から中等度血清曝露を得たが；グリコシル化２Ｘ２０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０４（ＣＨＯ）は、皮下投与後に高血清曝露を得た。これらの結果は、内部アミノ酸（例えば、９５位における）のポリマー結合または内部アミノ酸（例えば、９５位における）のグリコシル化のいずれかと共にニューブラスチンのアミノ末端アミノ酸（単数または複数）のポリマー結合することが、全身投与後の血清曝露を実質的に増加させることを示した。

野生型ラットニューブラスチンおよび変異ニューブラスチンＮ９５Ｋの両方をリフォールディングし、ＳＴＺ糖尿病ラット神経障害モデルにおける効力試験用に９５％超に精製した。野生型ニューブラスチンは、直接動物試験を行うために処方物化し、一方、Ｎ９５Ｋは、１０ｋＤａ ＰＥＧ−ＳＰＡとのＰＥＧ化のために調製された。リフォールディングおよび精製目標を成就するために、大量かつ高濃度で大腸菌封入体からニューブラスチンの復元を可能にさせるゲルろ過クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を利用するリフォールディング法が開発された。ＳＥＣに加えて、Ｎｉ−ＮＴＡおよびＣＭシリカカラムクロマトグラフィ両方のステップを、最終タンパク質精製を増加させるために使用した。このタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析、ゲルろ過クロマトグラフィ、ＥＳＭＳ、ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡによる活性評価、およびエンドトキシン含量の決定など、広範囲の特性決定に供した。最終タンパク質精製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣは、９５％超の純度を示した。各生成物のエンドトキシンレベルは、＜０．２ＥＵ／ｍｇであった。ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡにおける両タンパク質の比活性は、ほぼ１０ｎＭである。野生型ニューブラスチンは、１．０ｍｇ／ｍｌで処方物化し、Ｎ９５Ｋは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ６．５中、２．６ｍｇ／ｍｌで処方物化した。野生型ニューブラスチンは、１５ｍｌチューブに一定分割し、−７０℃で凍結保存し、一方、Ｎ９５Ｋは、ＰＥＧ化に供してから、一定分割し、凍結した。

（実施例５：野生型ニューブラスチンおよび変異Ｎ９５Ｋニューブラスチンのリフォールディングおよび精製）
両ニューブラスチン体は、成熟１１３アミノ酸配列の開始に直接隣接したエンテロキナーゼ開裂部位によりＨｉｓ−タグ化融合タンパク質として大腸菌に発現された。野生型（１．８ｋｇペレット）またはＮ９５Ｋ（２．５ｋｇペレット）のいずれかを発現する細菌を、ＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ Ｐｒｅｓｓを用いて２リットルのＰＢＳ中、溶菌に供した。封入体ペレットへと遠心分離（１０，０００ｒｐｍ）した後、各調製物からの上澄み液を捨てた。封入体ペレットを、洗浄用緩衝液（０．０２ＭトリスＨＣｌ ｐＨ８．５、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）で２回洗浄してから、トリトンＸ−１００（２％、ｖ／ｖ）を含有する同じ緩衝液で２回洗浄し、次いで界面活性剤なしの緩衝液でさらに２回洗浄した。両ペレットを、６Ｍ塩酸グアニジン、０．１ＭトリスｐＨ８．５、０．１Ｍ ＤＴＴ、および１ｍＭ ＥＤＴＡを用いて溶解させた。溶解過程を促進させるために、各ペレットを、ポリトロンホモジナイザを用いる均質化に供し、次いで室温で一晩攪拌した。溶解したタンパク質を、遠心分離により透明にしてから、１分につき２０ｍｌでＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（２Ｍグアニジン−ＨＣｌと共に０．０５Ｍグリシン／Ｈ_３ＰＯ_４ ｐＨ３．０で平衡化された５．５リットルカラム）を通すクロマトグラフィで変性させた。

変性ニューブラスチンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認された。野生型ニューブラスチンおよびＮ９５Ｋのいずれかを含有するフラクションを集め、Ａｍｉｃｏｎ２．５リットル攪拌セル濃縮器を用いて凡そ２５０ｍＬに濃縮した。沈殿物を除くためにろ過後、濃縮タンパク質を、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．８、０．５Ｍグアニジン−ＨＣｌ、８．８ｍＭ還元グルタチオンおよび０．２２ｍＭ酸化グルタチオンで平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００を通す復元サイジングクロマトグラフィに供した。前記カラムを、１分につき２０ｍｌで０．５Ｍグアニジン−ＨＣｌを用いて展開した。復元野生型ニューブラスチンまたはＮ９５Ｋニューブラスチンを含有するフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、集めて、Ｈｉｓタグ除去が必要になるまで４℃に保存した。

（希釈により野生型ニューブラスチンおよび変異Ｎ９５Ｋニューブラスチンをリフォールディングする別の方法）
希釈によりニューブラスチンをリフォールディングするために、溶解タンパク質を、０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度でリフォールディング用緩衝液（０．５Ｍグアニジン−ＨＣｌ、０．３５Ｍ Ｌ−アルギニン、５０ｎＭリン酸カリウム（ｐＨ７．８）、０．２ｍＭ還元グルタチオンおよび１ｍＭ酸化グルタチオン、および０．１％ツイーン−８０）で迅速に希釈し、攪拌せずに室温で４８時間温置した。次にリフォールディングされたニューブラスチンを２５倍に濃縮し、４０ｍＭイミダゾールに加え、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースを含有するクロマトグラフィカラムに適用して、生成物をさらに濃縮し、宿主細胞タンパク質を除去した。カラムを洗浄用緩衝液（４０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍグアニジン−ＨＣｌ）のカラム容量で１０回洗浄した。次いでニューブラスチンを、０．２Ｍイミダゾールおよび０．５Ｍグアニジン−ＨＣｌを有する樹脂から溶出させた。

（Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィによるカラム−リフォールディングされたニューブラスチンの濃縮）
カラム復元ニューブラスチンを４℃で少なくとも２４時間保存してから、ニューブラスチンモノマー間でジスルフィド形成を促進するために精製を続行した。この時期に形成された沈殿を、０．２μポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルタ単位を通すろ過により除去した。非特異的結合を減少させるために、タンパク質溶液を２０ｍＭイミダゾールに加えてから、カラム緩衝液（０．５Ｍグアニジンおよび２０ｍＭイミダゾール）で平衡化された１００ｍｌＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）カラム上に１分当たり５０ｍｌで充填した。タンパク質適用後、カラムを、同じ緩衝液を用いてベースラインまで洗浄した。ニューブラスチンを、０．５Ｍグアニジン−ＨＣｌおよび０．４Ｍイミダゾールを含有する凡そ３００ｍＬの溶出緩衝液を用いて樹脂から溶出した。溶出後、ニューブラスチンを、１０倍容量の５ｍＭ ＨＣｌに対して室温で（１０ｋＤａ透析チューブを用いて）一晩透析した。透析により、汚染物質の加水分解が促進され、グアニジン−ＨＣｌおよびイミダゾール濃度は、それぞれ０．０５Ｍおよび０．０４Ｍに減少する。

（リシルエンドペプチダーゼまたはエンテロキナーゼによるＨｉｓタグの開裂）
翌日、透析時に形成されたいずれの沈殿物もろ過により除去した。次の精製ステップを、カラムおよび希釈リフォールディングされたニューブラスチン生成物の両方に適用する。タンパク質サンプルは、凡そ１５０ｍＭの残留グアニジン−ＨＣｌを含む最終塩濃度のため、５ＭストックからＮａＣｌの添加により０．１Ｍ ＮａＣｌに作製された。この濃度は、導電率計を用いて確認された。さらに、１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．８を、２５ｍＭの最終濃度のために加えた。Ｈｉｓタグを開裂させるために、リシルエンドペプチダーゼを、野生型ニューブラスチンに、エンテロキナーゼを、Ｎ９５Ｋ変異ニューブラスチンに、両方ともニューブラスチンに対するプロテアーゼが凡そ１：３００の比率で加えた。Ｌｙｓ９５における変異タンパク質のさらなるプロテアーゼ開裂部位のため、Ｎ９５Ｋ変異ニューブラスチンには、リシルエンドペプチダーゼの代わりにエンテロキナーゼが用いられた。サンプルを、室温で２時間攪拌し、消化はＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニターされた。

（Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィによるＨｉｓタグの除去）
プロテアーゼ処理ニューブラスチンを、０．５Ｍグアニジンおよび２０ｍＭイミダゾールで平衡化された１００ｍｌＮｉ−ＮＴＡカラム上に１分当たり５０ｍｌで適用した。カラムを、同じ緩衝液を用いてベースラインまで洗浄した。カラム洗浄のタンパク質を、Ｈｉｓタグなしのニューブラスチンを含有する流液タンパク質により集めた。

（ＣＭシリカクロマトグラフィ）
Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィ後、タンパク質を直ちにＣＭシリカ樹脂を通すさらなる精製に供した。充填用緩衝液（５ｍＭリン酸ｐＨ６．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化された２０ｍＬ ＣＭシリカカラムを、１分当たり２０ｍＬでニューブラスチンを充填した。カラムを、洗浄用緩衝液（５ｍＭリン酸塩ｐＨ６．５、４００ｍＭＮａＣｌ）の２０倍カラム容量で洗浄し、タンパク質ステップを、５ｍＭリン酸塩ｐＨ６．５であるが１Ｍ ＮａＣｌを含有する溶出緩衝液で溶出した。溶出タンパク質をリン酸塩単独に対して透析し、Ｎ９５Ｋに関しては１００ｍＭまで、野生型ニューブラスチンに関しては１５０ｍＭまで塩濃度を下げた。両サンプルを、０．２μＰＥＳフィルタ単位を通してろ過し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、さらなる特性決定および／またはＰＥＧ化が必要になるまで４℃で保存した。

野生型およびＮ９５Ｋ変異ニューブラスチンタンパク質調製物を、２８０での吸光度を評価するためにＵＶスペクトル分析に供した。ミクロ石英セルを用いて、また緩衝液単独に対するブランキングにより、１００μｌの野生型またはＮ９５Ｋ変異ニューブラスチンを、Ｂｅｃｋｍａｎ分光光度計を用いて２３０ｎｍから３３０ｎｍで連続的に走査した。この分析に基づいて、野生型ニューブラスチンは、１．１ｍｇ／ｍｌの濃度であり、Ｎ９５Ｋ変異ニューブラスチンは，２．６ｍｇ／ｍｌの濃度（各タンパク質に関してＡ２８０ｎｍ−Ｅ^０．１％＝０．５が用いられた）であることが決定された。１％未満の沈殿物質は、３３０ｎｍでの吸光度に基づいて確認された。

両タンパク質調製物の純度を評価するために、各サンプル（０．５ｍｇ）を、１６／３０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラムを通すゲルろ過クロマトグラフィに供した。カラムを、４００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５ｍＭリン酸塩ｐＨ６．５で平衡化し、１分当たり１．５ｍＬの流速で展開した。２８０ｎｍでの吸光度に基づいて、野生型およびＮ９５Ｋ変異ニューブラスチン調製物の両方は、予想分子量（２３〜２４ｋＤａ）での単一ピークとして移動し、有意なタンパク質混入物を含有しなかった。

野生型およびＮ９５Ｋ変異ニューブラスチンタンパク質の両方を、２．５Ｍグアニジン−ＨＣｌ、６０ｍＭトリスｐＨ８．０および１６ｍＭ ＤＴＴ中で還元した。短Ｃ_４カラム上で脱塩し、三重四極機器を用いるＥＳＭＳによりオンライン分析した。ＥＳＭＳ生データは、ＭａｘＥｎｔプログラムにより逆応答させ、質量スペクトルを生成した。この手法は、複数荷電シグナルが、キロドルトン（ｋＤａ）での分子量に直接対応する１本のピークに崩壊することを可能にする。野生型に関する逆応答質量スペクトルは、主要種が、タンパク質の１１３アミノ酸体に対する予測分子量の１２０４６．７Ｄａに一致する１２０４６Ｄａであることを示した。少量成分もまた認められ、（１２０６３Ｄａ）酸化生成物の存在を示唆した。３本のピークが、Ｎ９５Ｋ変異ニューブラスチンタンパク質サンプルにおいて同定された。主要成分は、タンパク質の１０６アミノ酸体に対する予測質量に一致して１１３４５Ｄａの明白な分子質量を立証した。他の２本のピークは、１１３６２Ｄａおよび１２０６１Ｄａの質量を有し、それぞれＮ９５Ｋ酸化体および１１３アミノ酸体の存在を示唆した。

Ｎ９５Ｋ変異ニューブラスチンタンパク質調製物における１０６および１１３アミノ酸体の存在は、エンテロキナーゼによる消化に帰することができる。Ｂｉｏｚｙｍｅからのこのプロテアーゼは、ウシ腸管粘膜から精製された天然の酵素調製物であり、僅かなトリプシン混入物（１μｇエンテロキナーゼ当たり０．２５ｎｇ）を含有していることが報告されている。したがって、Ａｒｇ７のカルボキシ末端側のＮ９５Ｋ変異ニューブラスチンタンパク質に作用し、主として１０６アミノ酸体を生成し得る。一方、野生型ニューブラスチンを開裂するために用いられるリシルエンドペプチダーゼは、Ｈｉｓタグ内に含まれるリジン残基のカルボキシ末端側に作用する単一のプロテアーゼ活性であって、成熟１１３アミノ酸ニューブラスチン体を生成する。ニューブラスチンの１０６および１１３アミノ酸体の両方は、試験された全てのアッセイにおいて活性が等しく、グアニジン−ＨＣｌ安定性試験において同様に挙動する。

ニューブラスチン活性は、実施例３に記載されたＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡを用い、ＮＢ４１Ａ３−ｍＲＬ３細胞においてｃ−Ｒｅｔリン酸化を刺激する能力により決定された。リン酸化Ｒｅｔは、捕捉レセプターをＨＲＰ−結合ホスホチロシン抗体（４Ｇ１０；１ウェル当たり０．２μｇ）と共に温置する（２時間）ことにより検出された。温置後、ウェルをＴＢＳＴで６回洗浄し、ＨＲＰ活性を比色アッセイにより４５０ｎｍで検出した。溶菌液または溶菌緩衝液単独で処理されたウェルの吸光度値を測定し、バックグラウンドを補正し、データを、活性混合物に存在するニューブラスチンの濃度関数としてプロットした。このデータにより、精製ニューブラスチンポリペプチド類は、リン酸化ＲＥＴの発現をもたらすことが立証され、精製ニューブラスチンはこのアッセイで活性であることが示された。

（実施例６：血清アルブミン−ニューブラスチン結合体の調製）
ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌの濃度での野生型ラットニューブラスチンを、１ｍＭスルホ−ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ）で処理し、過剰の交差リンカーを除去するために脱塩した。野生型ニューブラスチンタンパク質は、そのアミン末端に単一アミンのみを含有し、遊離スルフヒドリル基が無いことから、ＳＭＣＣとの反応は、ニューブラスチンとそのアミノ末端に結合されたＳＭＣＣとの部位特異的修飾を生じることが予想された。

次に、６０μｇのニューブラスチン−ＳＭＣＣ結合体を、１２０μｇのウシ血清アルブミンと温置し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる架橋の程度を分析した。ＢＳＡは、単一遊離ＳＨ基を含有し、その結果、ニューブラスチン−ＳＭＣＣ結合体との反応は、ＳＭＣＣ上のマレイミドを介してこの部位での修飾を生じることが予想される。これらの条件下で、高分子量のさらに２本のバンドが観測され、各ニューブラスチン分子が、反応を受けることができる２つのアミノ末端を含有することから、２本のバンドは、単一ＢＳＡ部分および２つのＢＳＡ分子とによるニューブラスチンの修飾による質量と一致し、その結果、この考えに一致する。これらのバンドの形成と同時に、ニューブラスチン−ＳＭＣＣバンドとＢＳＡバンドの強度が減少した。残存するニューブラスチンバンドの強度に基づいて、この反応は、７０〜８０％完了していると思われた。

モノ置換生成物を、上記に検討されたＰＥＧ化試験に本質的に記載されたカチオン交換クロマトグラフィおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上のゲルろ過クロマトグラフィに物質を供することにより、反応混合物から精製した。ゲルろ過操作からのカラムフラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、モノ置換生成物を含有するものは、２８０ｎｍでの吸光度によりタンパク質含量を分析した。ＢＳＡの質量が、ニューブラスチンの凡そ２倍であることから、明白な濃度を、３の因子で割ってニューブラスチン等価物を得た。このフラクションを、ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡにおける機能解析に供した。ｗｔ結合ニューブラスチンおよびＢＳＡ結合ニューブラスチン両方に関するＩＣ５０値は、３〜６ｎＭであり、ＢＳＡに対する結合により、機能を損なわれなかったことを示した。

これらの予備的試験は、ＢＳＡにより生じたが、ラットおよびヒトからの対応する血清アルブミンタンパク質もまた遊離のＳＨを含有する。その結果、同様のアプローチを、ラットにおけるＰＫおよび効力試験を実施するためには、ラット血清アルブミン−ラットニューブラスチン結合体、ならびに臨床試験を実施するためには、ヒト血清アルブミン−ヒトニューブラスチンを生成するために適用できる。同様にＳＭＣＣは、一端にアミノ反応性基および他端にチオール反応性基を含有する任意の数の交差リンカーと置換できる。チオール反応性マレイミドを挿入するアミン反応性交差リンカーの例は、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ、またはＧＭＢＳであり、チオール反応性ハロアセテート基を挿入するアミン反応性交差リンカーの例は、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢであり、還元性結合を生成するためのスルフヒドリル基との反応のため保護または非保護チオールを提供するアミン反応性交差リンカーの例は、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ、またはＳＡＴＰであり、これら全ては、Ｐｉｅｒｃｅから入手できる。このような交差リンカーは、単に代表的なものであり、ニューブラスチンのアミノ末端を血清アルブミンと結合させるための多くの代替法が予想される。当業技術者はまた、ニューブラスチンのアミノ末端に、または血清アルブミン上のチオール部分に標的化されない血清アルブミンに対する結合体を生成させ得るであろう。ニューブラスチンが、アミノ末端、カルボキシ末端、または両端に血清アルブミン遺伝子に融合された、遺伝子工学を用いて創製されたニューブラスチン−血清アルブミン融合体もまた機能性であると予想される。

この方法は、動物およびその結果、ヒトにおける半減期が延長された生成物をもたらすと思われる任意のニューブラスチン−血清アルブミン結合体に、ルーチン適合により拡張できる。

（実施例７：ヒトニューブラスチンの結晶化および構造決定）
セレノメチオニン標識ニューブラスチンを、メチオニン生合成を阻害する標準法を用いて発現した（Ｖａｎ Ｄｕｙｎｅら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２、ｐ．８３９−８４２）。野生型ニューブラスチンおよびセレノメチオニン取り込みニューブラスチンの両方を、０．８Ｍアルギニン中、１７ｍｇ／ｍｌに濃縮した。結晶は、１．２５Ｍ硫酸マグネシウム、０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．５から２０℃で懸滴蒸気拡散法（Ｊａｎｃａｒｉｋ、Ｊ．＆Ｋｉｍ，Ｓ．Ｈ．、１９９１年、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２４、ｐ．４０９−４１１）により増殖させた。結晶は、最終濃度１．２５Ｍ硫酸マグネシウム、０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．５、および３０％（ｖ／ｖ）エチレングリコールまで、６０秒毎に５％エチレングリコールの添加により凍結保護してから、液体窒素に素早く移すことにより凍結させた。

各側に凡そ１００ミクロンの結晶を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（ニューヨーク州アップトン所在）のビームラインＸ４Ａにおける１．６Ａに回折した。ＨＫＬプログラムパッケージによるデータ処理（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ（１９９３）のＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＣＣＰ４ Ｓｔｕｄｙ Ｗｅｅｋｅｎｄ：Ｄａｔａ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（Ｓａｗｅｒら編集）ｐ．５６−６２、Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ）により、結晶が、１非対称単位当たり１共有結合ダイマーを有するＣ２スペースグループに属し、セル寸法は、凡そａ＝１１５Å、ｂ＝３３Å、ｃ＝５５Åであり、α＝γ＝９０°、β＝９９°である。

結晶構造は、多重同型置換法により解決した。天然ニューブラスチンの結晶を、１ｍＭ ＰｔＣｌ_４に４時間、１０ｍＭ ＩｒＣｌ_３に７２時間、および１０ｍＭ ＩｒＣｌ_６に１８時間浸漬し、データを採取し、ＨＫＬの一組（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉら、上記）により処理した。２つのセレノメチオニン部位が、同型および異常相違パターソンの検定により位置決めされた。残りの部位は、ＳＯＬＶＥ（４）を用いて位置決めされた。相は、ＲＥＳＯＬＶＥ（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒら、１９９９年、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．５５、ｐ．８４９−８６１）により、０．５６の最小感度に改善し、生じたマップは、ニューブラスチンモデルを追跡する上で十分に良質であった。Ｏ２Ｄによるモデル構築の交互サイクル（５Ｇ Ｊ Ｋｌｅｙｗｅｇｔ ＆ Ｔ Ａ Ｊｏｎｅｓ、「Ｏ２Ｄ−ｔｈｅ ｍａｎｕａｌ」、ソフトウェアマニュアル、Ｕｐｐｓａｌａ、１９９４年）およびｍｌｈｌ標的を用いるＣＮＸによる改良およびセレノメチオニンデータに対する改良により、第１のアミノ末端１３のアミノ酸ならびに８９の水分子および６つの硫酸アニオンを除いては、ニューブラスチンタンパク質の完全モデルをもたらした。最終のＲ_フリーは、２８．５％であり、Ｒ−因子は、良好な立体化学を有して２４．７％から２．０Åである。

（実施例８：硫酸ヘパリンの硫酸結合部位およびモデル構築）
ニューブラスチン表面の前ヘリックス領域にほぼ正三角形の頂点に３つの硫酸クラスターが配置され、硫酸ヘパリンに対する結合部位となり得る。これらの硫酸との重要な相互作用を有すると思われる３つのアルギニン残基がある。アルギニン残基Ｒ４８は、３つの硫酸全て（＃２、＃６、および＃３）と一緒に結合している。主鎖アミドは、＃２硫酸と相互作用するが、一方、その側鎖のグアニジウム基は、＃６硫酸および＃３硫酸と二又水素結合を形成している。第２のアルギニン残基（Ｒ４９）は、＃２硫酸と水素結合を形成し、第３のアルギニン残基（Ｒ５１）は、＃６硫酸に長い水素結合を形成している。

これらの硫酸は、硫酸ヘパリンに対する結合ポケットとなることができ、非正電荷残基に変異した場合、硫酸ヘパリン結合を減じ得ると考えられ、また、インビボ投与の際にニューブラスチン分子のクリアランスを減少させるか、および／または遅延させる可能性がある。ニューブラスチンに結合した硫酸ヘパリンのモデルは、グリコサミノグリカンの硫酸をニューブラスチン結晶構造の既存の硫酸と重ね合わせることにより構築できる。硫酸ヘパリンに複合化されたＦＧＦ−１の結晶構造から硫酸ヘパリンにおけるｎおよびｎ＋２糖類結合硫酸は、凡そ８．５Å分離している（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０７、ｐ．１０２９−１０３４）。この測定値は、ニューブラスチン構造における３−硫酸クラスターの硫酸間の距離と密接に一致する：＃３硫酸および＃６硫酸は、８．８Å分離しており、＃３硫酸および＃２硫酸は、８．１Å分離している。この距離測定値の一致は、このＲ４８／Ｒ４９／Ｒ５１モチーフが、ヘパリン結合部位の一部であることを示すことができた。このことにより、グルタメートまたはアスパルテート、または任意の他の非正電荷アミノ酸に対するＲ４８、Ｒ４９またはＲ５１の単一部位変異が、ニューブラスチンのレセプター結合活性を減じることなく硫酸ヘパリン結合親和性を減じ得、それによって動物、その結果、ヒトにおける半減期の延長した生物活性生成物をもたらすことを示唆している。この可能性を試験するために、我々は、グルタミン酸に変異した１つ以上のアルギニンを含有する一連の構築体を生成している。変異ニューブラスチン生成物は、大腸菌に発現され、精製およびリフォールディングされ、機能性に関して試験される。最後に前記生成物を、ヘパリンを結合する能力および動物における薬物動態および薬力学に関して試験する。

１つ以上のこれらの部位はまた、ＲをＫまたはＣに置き換えて、上記の方法を適用することによって達成できるＰＥＧ化に関する他の部位を提供し得ると考えられる。

（実施例９：神経障害性疼痛の神経結紮動物モデルにおける触覚および熱痛覚過敏症の反転に対するＰｅｇ化変異ニューブラスチンＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋの用量決定）
１週につき３回皮下投与された１ｍｇ／ｋｇ野生型ニューブラスチンは、ラットにおける脊髄神経結紮により誘導された神経障害性疼痛挙動（触覚異痛症および熱痛覚過敏症）のほぼ完全な反転および正常化をもたらしたが、一方、１週につき３回皮下投与された０．０３ｍｇ／ｋｇ野生型ニューブラスチンは、この動物モデルにおいて効果がなく、１週につき３回皮下投与された０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．６ｍｇ／ｋｇ野生型ニューブラスチンは、中間の効果があることを我々は先に示した。

ここに我々は、Ｃｈｕｎｇ Ｌ５／Ｌ６脊髄神経結紮（「ＳＮＬ」）モデルにおける触覚異痛症および熱痛覚過敏症に対するｐｅｇ化Ｎ９５Ｋニューブラスチンの反転効果を扱う試験を記載する。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙオスラット（２３０〜２８０ｇ）を２群に分けた。ラット全ては脊髄神経結紮を受けた。ラットの１群（ｎ＝６）に、皮下注射により媒体を投与した。ラットの第２群（１群当たりｎ＝６）に、１０μｇ／ｋｇで皮下注射によりｐｅｇ化Ｎ９５Ｋニューブラスチン（３，（４）Ｘ１０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋ）を投与した。３，（４）Ｘ１０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋは、大腸菌由来であり、９５位にＡｓｎからＬｙｓへのアミノ酸置換を含有するニューブラスチンタンパク質を含んでなり、次に切断（７つのアミノ酸のアミノ末端切断；ＮＢＮ１０６）し、最後に反応物として１０，０００Ｄａの分子質量を有するメトキシルポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ）を用いて、ｐｅｇ化した。媒体は、ｐＨ６．５の５ｍＭリン酸および１５０ｍＭ塩化ナトリウムから構成された。皮下注射は、術後（ＳＮＬ後）３日目、５日目、７日目、１０日目、１２日目および１４日目に投与した。Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ（Ｃｈａｐｌａｎら、（１９９４）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｒｔｈ．５３：ｐ．５５−６３）およびＨａｒｇｒｅａｖｅ（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓら、（１９８８）、Ｐａｉｎ．３２：ｐ．７７−８８）の挙動試験が、それぞれ触覚および熱応答性をモニターするために用いられた。これらの疼痛応答性は、ベースライン応答性を確立するために脊髄神経結紮前にモニターし、触覚および熱痛覚過敏症の存在を確認するためにＳＮＬ後２日目に、次いでＳＮＬ後３日目、５日目、７日目、１０日目、１２日目および１４日目にモニターした。媒体処置に比して薬物処置の統計的有意性を評価するために、一方向分散解析（一方向ＡＮＯＶＡ）を実施して、ポスト−ｈｏｃ Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｎｅｕｍａｎ Ｋｅｕｌｓ（ＳＮＫ）検定を行った。

両タイプの神経障害性疼痛挙動（触覚異痛症、および熱痛覚過敏症）は、予想どおりＳＮＬ後２日目に完全に発現した。１０μｇ／ｋｇの３，（４）Ｘ１０ｋＤａ ＰＥＧ Ｎ９５Ｋ−ＮＢＮ１０６の皮下投与により、脊髄神経結紮ラットにおける両タイプの神経障害性疼痛の実質的および統計的に有意な反転に至った。脊髄神経結紮ラットにおいて、熱過敏性および触覚異痛症に対する１０μｇ／ｋｇの３，（４）Ｘ１０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋの効果は、ｐｅｇ化Ｎ９５Ｋニューブラスチンの投与開始後４日目に初めて統計的に有意となった。熱過敏性および触覚異痛症に対する１０μｇ／ｋｇの３，（４）Ｘ１０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋの効果は、ｐｅｇ化Ｎ９５Ｋニューブラスチンの投与開始後４日目にほぼプラトーに達した。３，（４）Ｘ１０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋの効果は、投与間の２日から３日の休止期間で減少しなかった。実際、５日目および７日目におけるｐｅｇ化Ｎ９５Ｋニューブラスチンの投与の間に疼痛挙動の実質的な正常化があった。他の実験（データは示さず）において、３日目、５日目、７日目、１０日目、１２日目および１４日目に３μｇ／ｋｇの３，（４）Ｘ１０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋの皮下投与により、効果の発現はいくらか遅かったが、ＳＮＬモデルにおける疼痛挙動（触覚および熱痛覚過敏症）の有意な正常化に至った。

これらの結果は、３，（４）Ｘ１０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０６−Ｎ９５Ｋが、ＳＮＬモデルにおける触覚異痛症および熱痛覚過敏症疼痛挙動に対して非変異非グリコシル化ニューブラスチンよりも少なくとも１００倍から３３３倍の効力増加を有していることを証明した。非変異非グリコシル化ニューブラスチンと比較して３，（４）Ｘ１０ｋＤａ ＰＥＧ Ｎ９５Ｋ ＮＢＮ１０６の薬物動態特性の増強により、全身投与のニューブラスチンの効力が、ニューブラスチンの血清レベルに相関していることが示された。これらの結果により、変異ニューブラスチンのポリマー結合体は、非結合ニューブラスチンと比較して生物学的利用の増強のため、用量を大幅に減少させ、また可能性として投与回数を減少させて患者の神経障害性疼痛を治療するために使用できることが立証された。

（表８．ＰＥＧ化ＮＢＮの生物学的特性決定）

注：ｎｄは、検出できないことを示し、＋は、低暴露から中等度曝露を示し、＋＋は、高曝露を示す
注：他に指定されない限り、全てＮＢＮ１１３である
注：ＣＨＯが示されない限り、全て大腸菌由来である

（他の実施形態）
具体的な実施形態を、本明細書において詳細に開示したが、これは、説明目的の例としてのみ行われており、以下にある添付の請求項の範囲に関して限定する意図はない。特に、種々の置換、変更、および修飾は、請求項により定義されている本発明の精神と範囲から逸脱することなく本発明になされ得ることが、発明者により考慮されている。

Claims (4)

1. 配列番号１のアミノ酸８−１１３に少なくとも９０％同一であり、かつ４８位のアルギニン、４９位のアルギニン、または５１位のアルギニンのうちの１以上の、グルタミン酸残基による置換を含む、ニューブラスチンポリペプチドであって、該ポリペプチドは、神経栄養性活性を示す、ポリペプチド。
2. 前記４８位のアルギニン残基がグルタミン酸で置換される、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 前記４９位のアルギニン残基がグルタミン酸で置換される、請求項１に記載のポリペプチド。
4. 前記５１位のアルギニン残基がグルタミン酸で置換される、請求項１に記載のポリペプチド。