CN102367277A - 突变神经胚素的聚合物偶联物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种二聚体,其包含与聚合物偶联的突变的神经胚素多肽。这些二聚体呈现延长的生物利用率,并且在优选实施方案中,相对于神经胚素的野生形式的延长的生物活性。
Description
本申请是中国申请200480009133.X的分案申请,该母案的国际申请日为2004年02月02日,本分案采用了与该母案一致的发明名称。
相关申请的交叉引用
本申请要求2002年1月25日提交的国际专利申请PCT/US02/02319的优先权,且该专利要求2001年2月1日提交的美国临时专利申请序列号60/266,071的优先权(已弃)。
技术领域
本发明涉及蛋白质化学、分子生物学、神经生物学、神经病学及疼痛治疗(pain management)领域。
技术背景
神经营养因子是天然存在的蛋白质,其调节发育过程中的神经元存活,并调节成熟神经系统的可塑性及结构完整性。神经营养因子可从神经组织和非神经组织中分离出来。最近20年里已发现许多,神经营养因子根据它们的结构和功能这些神经营养因子可归类为超家族、家族、亚家族和个别种类。
神经营养因子超家族包括成纤维细胞生长因子(FGF)超家族、神经营养蛋白超家族及转化生长因子β(TGF-β)超家族。神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)相关的配体是TGF-β超家族内的一种蛋白家族。GDNF相关的配体包括GDNF、persephin(PSP)、neurturin(NTN)及神经胚素(Neublastin)(NBN;已知为artemin或enovin)。GDNF相关的配体家族成员以其七个保守的半胱氨酸残基为一种特征。这些残基形成分子内和分子间的二硫键,并产生二聚化多肽配体的三级及四级结构。这个家族的成员也共享通过多成分受体复合体来诱导信号的能力,所述多成分受体复合体由GFRα家族的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚着的共同受体、GDNF相关的配体亚家族的成员及RET酪氨酸激酶受体组成。
活化的RET引发可至少部分引起GDNF相关配体的下游效应的信号转导级联。因此,RET的活化可代表通过GFRα受体途径影响下游细胞过程而起作用的疗法的一个可取的方面。
神经胚素归类在GDNF家族内,因为它与其它含有七个半胱氨酸基序的GDNF配体(如,在EP02/02691PCT公报US02/02319以及US02/06388描述的)共享同源区,并且因为它具有结合、活化作为GFRα复合体一部分的RET受体的能力。具体来说,神经胚素对与GFRα3-RET受体复合体的结合具有高选择性。在那方面,神经胚素与GDNF相关的配体家族的其他成员相比在其氨基酸序列内含有独特亚区。
目前的数据提示神经胚素在外周和中枢神经系统可具有保护性和再生性的作用,因此它可用作针对神经变性疾病的治疗剂。例如,资料提示神经胚素对所培养的来源于背根神经节和三叉神经节的感觉神经元以及培养的黑质(substantia nigra)多巴胺能神经元可具有促进存活的效应(Baloh等,Neuron 21:1291-1302(1998))。所以看来神经胚素可促进包括感觉神经元和多巴胺能神经元的神经元群体的存活。由于神经元的退化和功能异常与疾病的状态有关,因此这点是重要的。例如,感觉神经元和多巴胺能神经元的病理学分别是外周神经病变和帕金森病的致病基础。
因而,给予神经胚素可用于例如治疗与神经元的退化和功能异常相关的疾病。但是,神经胚素很快被机体清除,这可能影响神经胚素在治疗应用中所需的剂量范式(closing paradigm)。因而需要具有增强的生物利用率的经修饰的神经胚素多肽。因此,本发明的一个目的是识别显示增强的生物利用率的神经胚素的修饰形式。
发明概述
本发明提供了聚合物偶联的、突变的神经胚素二聚体。每一种二聚体含有包含第一氨基末端氨基酸的第一多肽和包含第二氨基末端氨基酸的第二多肽。每一种多肽各自含有:(a)以与SEQ ID NO:1的氨基酸8-113具有至少70%、80%、90%或95%的序列同一性为特征的氨基酸序列;(b)在位置16、43、47、80、81、109及111(按SEQ ID NO:1编号)中的每个位置的半胱氨酸残基;(c)如下氨基酸残基:16位C、18位L、25位V、28位L、29位G、30位L、31位G、36位E、40位F、41位R、42位F、43位C、45位G、47位C、80位C、81位C、82位R、83位P、91位F、93位D、105位S、106位A、109位C及111位C;以及(d)LGLG重复、FRFC基序、QPCCRP基序以及SATACGC基序。这种二聚体包括至少一种氨基酸取代(相对于SEQ ID NO:1),其可提供与聚合物偶联的内部聚合物偶联位点。
本发明也提供聚合物偶联的、突变的神经胚素二聚体,其含有第一多肽和第二多肽,其中每种多肽含有具有1-6个氨基酸取代的、SEQ ID NO:6的氨基酸90-140,如95-120或100-110,每个取代提供了与聚合物偶联的聚合物偶联位点。本发明多肽的具体例子包括NBN113(SEQ ID NO:2)、NBN140(SEQ ID NO:6)、NBN116(SEQ ID NO:7)、NBN112(SEQ ID NO:8)、NBN111(SEQ ID NO:9)、NBN110(SEQ ID NO:10)、NBN109(SEQ ID NO:11)、NBN108(SEQ ID NO:12)、NBN107(SEQ ID NO:13)、NBN106(SEQ IDNO:14)、NBN105(SEQ ID NO:15)、NBN104(SEQ ID NO:16)、NBN103(SEQ IDNO:17)、NBN102(SEQ ID NO:18)、NBN101(SEQ ID NO:19)、NBN100(SEQ IDNO:20)及NBN99(SEQ ID NO:21)。
优选地,二聚体中两个氨基末端氨基酸的至少一个偶联于聚合物。优选的氨基酸取代包括赖氨酸残基取代精氨酸残基(Raa#K;aa#是基于SEQ IDNO:1的氨基酸编号),及赖氨酸残基(Naa#K)或天冬氨酸残基(Naa#D)取代天冬酰胺残基。这种取代的具体例子是R14K、R39K、R68K、N95D及N95K(基于SEQ ID NO:1编号)。特别优选的取代是N95K。
优选地,二聚体上的聚合物的总复合分子量(total combined molecularweight)是20,000-40,000Da。优选地,每种聚合物的平均分子量是2,000-100,000Da;更优选5,000-50,000Da;及最优选大约10,000到20,000Da。所述聚合物可为线性的或分支的。优选地,聚合物是一种聚亚烷基二醇组分,如,聚乙二醇(PEG)组分。在一些实施方案中,至少一种多肽是糖基化的。
在本发明的一些实施方案中,聚合物偶联的二聚体含有第一多肽和第二多肽,其中(a)每一种多肽各自包含SEQ ID NO:1的100到110位氨基酸,(b)每一种多肽包含位于SEQ ID NO:1中的氨基酸95的天冬酰胺-到-赖氨酸的取代,(c)以及该二聚体包含3或4个PEG组分,其中每个PEG组分的分子量大约10,000Da,并且每种PEG组分在氨基末端或95位赖氨酸处偶联。优选的实施方案是含有一对命名为3(4,)×10kDa PEG NBN106-N95K单体的同源二聚体。
本发明包括包含依照本发明的二聚体的药物组合物。在一些实施方案中,该组合物包含两种或更多种不同的依据本发明的二聚体。
本发明包括核酸,如,一种编码用于掺入本发明二聚体的多肽的DNA表达载体。本发明也包括由该核酸转化的宿主细胞。
本发明包括一种治疗哺乳动物神经性疼痛的方法。该方法包括给予哺乳动物治疗有效量的本发明的二聚体。在一些实施方案中,该治疗有效量为从0.1μg/kg到1000μg/kg,从1μg/kg到100μg/kg,或从1μg/kg到30μg/kg。该二聚体的给药可通过各种途径,如,经肌肉内,皮下或静脉内。依据发明的一些方法,该二聚体每周被给予三次。本发明也提供在哺乳动物中活化RET受体的方法。该方法包括给予哺乳动物有效量的所述二聚体。
更具体地,本发明涉及:
1.与聚合物偶联的二聚体,其包含含有第一氨基末端氨基酸的第一多肽以及含有第二氨基末端氨基酸的第二多肽,其中每一种多肽各自包含:
a)以与SEQ ID NO:1的氨基酸8-113具有至少70%的序列同一性为特征的氨基酸序列;
b)当所述多肽与SEQ ID NO:1的编号一致时,在位置16、43、47、80、81、109及111中每一位置的半胱氨酸残基;
c)当与SEQ ID NO:1的编号一致时,如下每一种氨基酸残基:
16位C、18位L、25位V、28位L、29位G、30位L、31位G、36位E、40位F、41位R、42位F、43位C、45位G、47位C、80位C、81位C、82位R、83位P、91位F、93位D、105位S、106位A、109位C及111位C;以及
d)LGLG重复、FRFC基序、QPCCRP基序以及SATACGC基序;
其中至少第一多肽与SEQ ID NO:1相比包含至少一种氨基酸取代、插入或融合,并且其中所述取代、插入或融合提供与聚合物偶联的内部聚合物偶联位点。
2.项1的二聚体,其中该氨基酸序列的特征在于其与SEQ ID NO:1的氨基酸8-113具有至少95%的序列同一性。
3.与聚合物偶联的二聚体,其包含含有第一氨基末端氨基酸的第一多肽以及含有第二氨基末端氨基酸的第二多肽,其中每一种多肽各自包含SEQID NO:6的90到140位氨基酸且其中具有1-6个氨基酸取代,每一种取代提供与聚合物偶联的聚合物偶联位点。
4.项1的二聚体,其中该第一多肽选自由NBN113、NBN140、NBN116、NBN112、NBN111、NBN110、NBN109、NBN108、NBN107、NBN106、NBN105、NBN104、NBN103、NBN102、NBN101、NBN100及NBN99(分别为SEQ ID NO:2,6-21)组成的组中。
5.项1或3的二聚体,其中所述第一氨基末端氨基酸或第二氨基末端氨基酸与聚合物偶联。
6.项5的二聚体,其中所述第一氨基末端氨基酸及第二氨基末端氨基酸与聚合物偶联。
7.项3的二聚体,其中至少一种取代选自下组:
除精氨酸以外的氨基酸,其在所述第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中的位置14;
除精氨酸以外的氨基酸,其在所述第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中的位置39;
除精氨酸以外的氨基酸,其在所述第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中的位置68;以及
除天冬酰胺以外的氨基酸,其在所述第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中的位置95;
其中所述氨基酸位置的编号与SEQ ID NO:1的多肽序列一致。
8.项1的二聚体,其中所述氨基酸取代是赖氨酸取代天冬酰胺。
9.项3的二聚体,其中所述氨基酸取代是赖氨酸取代天冬酰胺。
10.利要求1的二聚体,其中所述氨基酸取代是赖氨酸取代精氨酸。
11.项3的二聚体,其中所述氨基酸取代是赖氨酸取代精氨酸。
12.项1的二聚体,其中所述氨基酸取代是中性或酸性氨基酸取代48、49或51位的精氨酸。
13.项12的二聚体,其中所述中性或酸性氨基酸选自谷氨酸或天冬氨酸。
14.项9的二聚体,其中所述取代在95位。
15.项1的二聚体,其中所述取代是天冬氨酸取代95位天冬酰胺。
16.项1或2的二聚体,其中所述聚合物的平均分子量是约2000Da到约100,000Da。
17.项11的二聚体,其中所述聚合物的平均分子量是约5000Da到约50,000Da。
18.项12的二聚体,其中所述聚合物的平均分子量是约10,000Da到约20,000Da。
19.项1或3的二聚体,其中所述聚合物是线性的。
20.项1或3的二聚体,其中所述聚合物是分支的。
21.项1或3的二聚体,其中所述聚合物基本上由聚亚烷基二醇组分组成。
22.项16的二聚体,其中所述聚亚烷基二醇组分是PEG组分。
23.项1或3的二聚体,其中至少一种多肽是糖基化的。
24.与聚合物偶联的二聚体,其包含第一多肽及第二多肽,其中:(a)每一种多肽各自包含SEQ ID NO:1的100到110个氨基酸,(b)每一种多肽在SEQ ID NO:1中的氨基酸95包含天冬酰胺-到-赖氨酸的取代,(c)且该二聚体包含3或4个PEG组分,其中每个PEG组分的分子量大约10,000Da,且每个PEG组分在氨基末端或在95位赖氨酸处偶联。
25.一种组合物,其包含:
a)NBN106-N95K的同源二聚体,其与分子量大约10,000Da的三个PEG聚合物相偶联;
b)NBN106-N95K的同源二聚体,其与分子量大约10,000Da的四个PEG聚合物相偶联;或
c)至少两种不同的根据项1或3所述的二聚体的混合物。
26.核酸,其编码项1或3的第一多肽。
27.宿主细胞,其由项21的核酸转化。
28.一种治疗哺乳动物中的神经性疼痛的方法,该方法包括给予哺乳动物治疗有效量的项1或3的二聚体。
29.项23的方法,其中所述治疗有效量为从0.01μg/kg到1000μg/kg。
30.项24的方法,其中所述治疗有效量为从1μg/kg到100μg/kg。
31.项25的方法,其中所述治疗有效量为从1μg/kg到30μg/kg。
32.项26的方法,其中所述治疗有效量为从3μg/kg到10μg/kg。
33.项23的方法,其中所述二聚体通过经肌肉内递送或经皮下递送给药。
34.一种在哺乳动物中活化RET受体的方法,该方法包括给予该哺乳动物有效量的项1或3的二聚体。
根据以下的详细说明及权利要求,本发明的其他特点及优点将显而易见。
附图简述
图1是一个散点图,概括了与野生型NBN113相比较,3,(4)×10KPEG化的NBN106-N95K的KIRA ELISA分析数据。
图2是一个散点图,概括了与野生型NBN113比较,3×10K PEG化的NBN106-N95K及4×10K PEG化的NBN106-N95K的KIRA ELISA分析的数据。
图3是一个断续的线图,说明在脊神经结扎的大鼠中,用10μg/kg 3×10K PEG化的NBN106-N95K及4×10K PEG化的NBN106-N95K的混合物(即″3(,4)×10kDa PEG NBN106-N95K)″)可几乎完全逆转已充分确定的触觉异常性疼痛(allodynia)。
图4是一个断续的线图,说明在脊神经结扎的大鼠体内,用10μg/kg 3(,4)×10kDa PEG化的NBN106-N95K可几乎完全逆转已充分确定的热痛觉过敏(thermal hyperalgesia)。
发明详述
除非另作说明,神经胚素氨基酸位置编号的任何引用将参照SEQ IDNO:1说明的编号。
除非另行定义,本文所用所有技术术语和科学术语与本发明所属领域技术人员通常理解的意思相同。尽管与在此描述的相近的或等同的方法及材料可用于实施或测试本发明,合适的方法及材料描述如下。所有公开出版物、专利申请、专利及在此提及的其他参考文献通过引用全部合并在本文中。如有冲突,以本说明书包括定义为准。此外,材料、方法及实施例仅用于说明而非旨在限制。
本文所用“野生型神经胚素多肽”意思是天然存在的神经胚素多肽序列。野生型神经胚素多肽可通过神经胚素的来源进一步定义,例如,人、小鼠或大鼠的神经胚素(见如SEQ ID NO:2、3或4)。共有神经胚素多肽序列提供为SEQ ID NO:1。
本文所用“突变型神经胚素多肽”意思是一种多肽,其含有相对于野生型神经胚素多肽的至少规定的最低水平的序列同一性,其含有相对于野生型神经胚素多肽的至少一种氨基酸取代、插入或融合,并且显示神经胚素活性。(如,国际专利申请号PCT/US02/02319(WO 02/060929)所述)。
本文所用“内部聚合物偶联位点”意思是在突变型神经胚素多肽中的非末端氨基酸残基,该残基提供适于偶联聚合物的侧链。
本文所用“修饰的神经胚素多肽”意思是含有至少一种附着的聚合物的多肽。
本文所用“融合”意思是两种或更多种多肽的共线性(co-linear)、共价连接,所述连接通过所述多肽各自的肽主链、通过同一读码框内编码那些蛋白的多聚核苷酸分子的基因表达而形成。
本文所用“同一性”是指两种多肽、分子间或两种核酸间的序列相似性。当两种被比较的序列的位置为同一碱基或氨基酸单体亚单位所占时(例如,两种DNA分子的每一种中的位置为腺嘌呤所占,或两种多肽的每一种中的位置为赖氨酸所占),每个分子便在那个位置是同源的。两种序列间的“百分比同一性”是一个函数,用两种序列共有的匹配位置数除以被比较的位置数再乘100。例如,如果两种序列中10个位置有6个匹配,那么这两种序列有60%同一性。例如,DNA序列CTGACT及CAGGTT共享50%同一性(共6个位置中有3个匹配)。一般的,当两种序列经比对产生最大同源性时作比较。这种对比可用例如Needleman等J.Mol Biol.48:443-453(1970)用计算机程序诸如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地实现的方法来提供。“相似的”序列是在比对时那些共享同样且相似的氨基酸残基的序列,其中相似的残基是被比对参照序列中的相应氨基酸残基的保守取代残基或“容许的点突变(allowed point mutations)”。在这一点上,参照序列的残基的“保守取代”是由物理上或功能上近似于相应参照残基的残基进行取代,如,这种残基具有相似的大小、形状、电荷、化学性质,包括形成共价键或氢键的能力等等。因此,“保守取代突变的”序列是一种不同于参照序列或野生型序列的序列,其不同之处在于其存在一种或更多种保守取代或容许的点突变。两种序列间的“百分比阳性”是一个函数,用含有两种序列共有的匹配残基或保守取代的位置数除以被比较的位置数再乘100。例如,如果两种序列10个位置中有6个匹配且10个位置中有2个含有保守取代,那么这两种序列有80%阳性同源性。
突变的神经胚素多肽
本发明的突变的神经胚素多肽与野生型神经胚素多肽相比,其保留神经营养活性并且具有提高的生物利用率。例如,在野生型神经胚素活化RET的测定中本发明的突变的神经胚素可活化RET基因产物。一般地,突变的神经胚素多肽将保留以下特点中至少一种但可另外包含至少一种修饰,以使得产生出内部聚合物偶联位点:
(i)当依照SEQ ID NO:1-4编号时,在16,、43、47、80、81、109及111位的七个保守的半胱氨酸残基;
(ii)每一位置都依据SEQ ID NO:1-4编号时,如下氨基酸残基:
16位C、18位L、25位V、28位L、29位G、30位L、31位G、36位E、40位F、41位R、42位F、43位C、45位G、47位C、80位C、81位C、82位R、83位P、91位F、93位D、105位S、106位A、109位C及111位C;
(iii)LGLG重复、FRFC基序、QPCCRP基序及SATACGC基序。
在一些实施方案中,本发明提供一种截短的突变型的神经胚素多肽,其中截短的神经胚素多肽的氨基末端缺少一种或多种成熟的神经胚素多肽的氨基末端氨基酸,但其被突变成具有内部聚合物附着物。优选地,截短的突变型神经胚素多肽在二聚化时可活化RET多肽。在一些实施方案中,突变型神经胚素多肽诱导RET多肽的二聚化。这种诱导可能需要额外的多肽或辅因子,这对于本领域技术人员是显而易见的。
人及鼠神经胚素多肽的氨基酸序列在PCT公开WO00/01815中已公开。本发明的野生型神经胚素多肽的实施例在表1A中给出。神经胚素的共有序列(相对于人、小鼠及大鼠的同一性)在表1B中列出。
在一些实施方案中,表1A粗体显示的精氨酸(Arg或R)或天冬酰胺(Asn或N)残基中至少一种由一种不同的氨基酸残基取代。在一个优选的实施方案中,突变的神经胚素多肽具有赖氨酸(Lys或K)残基,其取代了95位氨基酸的天冬酰胺,由表1A星号标出,称为NBN-N95K。一般地,N95K取代导致改良的可溶性。这利于以高浓度配制。
本发明包括与聚合物偶联的突变型神经胚素多肽,其包含例如与SEQID NO:1(也见表1所示)的氨基酸8-113具有至少70%同一性的氨基酸序列;在一种实施方案中,14位、39位、68位中一种或更多个位置的精氨酸或95位天冬酰胺除精氨酸或天冬酰胺以外的氨基酸所取代。在一种实施方案中,野生型氨基酸由赖氨酸或半胱氨酸取代。
突变型神经胚素多肽中被取代的残基可被选择以便于聚合物如聚亚烷基二醇聚合物在被取代氨基酸处的偶联。修饰的有利位点是神经胚素多肽中溶剂易接近的区域。这些位点可基于相关神经营养因子如GDNF的晶体结构的检测而选择,其晶体结构见Eigenbrot等,Nat.Struct.Biol.4:435-38,1997所述。这些位点也可基于神经胚素的晶体结构而选择,其结晶化及结构测定描述如下。同样,这些位点也可基于为persephin/神经胚素嵌合蛋白提供的结构-功能的信息而选择。这些嵌合体见Baloh等,J.Biol.Chem.275:3412-20,2000所述。通过这种方法学鉴别出的溶剂易接近的或表面暴露的神经胚素氨基酸的实例在表2中列出。
表2列出了预期为表面暴露的人神经胚素中的残基及数目。第一列指的是通过检测由链A及链B形成的大鼠GDNF二聚体(PDB码1AGQ)的结构并测定残基是否在该结构的表面而确定的表面暴露的残基。这种结构再与GDNF及神经胚素的序列对比(Baloh等,Neuron 21:1291-1302,1998)相比较以确定神经胚素中适宜的残基。第二和第三列分别指的是通过检测由链A及链B形成的人神经胚素二聚体的结构而确定的表面暴露的残基。表2的编号方案如表1所示。
n指这些残基不存在于GDNF或神经胚素的结构中。这或是因为构建体设计、可变区或是因为神经胚素中相对于GDNF(残基68-71)的插入物。
-指这些残基是隐蔽的且不在表面,或是参与形成二硫键的半胱氨酸残基。由于这种蛋白是半胱氨酸节(knot),绝大部分残基在表面。
+指该残基在GDNF结构中或神经胚素结构中是表面暴露的,尽管含有66-75残基的环只在一种GDNF单体(推定为柔性的)中可见。此环相对于GDNF在神经胚素中也含有4残基插入物。
在一些实施方案中,神经胚素多肽保留GDNF亚家族及TGFβ超家族的特征性七个保守的Cys残基。
人的全长前原NBN多肽的序列(SEQ ID NO:5)如表3所示。鉴定了神经胚素多肽的三种成熟型。这些类型包括:
(i)在本文命名为NBN140的140AA多肽,其具有的氨基酸序列为SEQID NO:6;
(ii)在本文命名为NBN116的116AA多肽,其具有的氨基酸序列为SEQID NO:7;
(i)在本文命名为NBN113的113AA多肽,其具有的氨基酸序列为SEQ IDNO:2。
表3说明本发明公开的前原神经胚素多肽序列间的关系。行1提供了多肽SEQ ID NO:5,行2提供了多肽SEQ ID NO:6,行3提供了多肽SEQ IDNO:7以及行4提供了多肽SEQ ID NO:2.。七个保守半胱氨酸残基由符号(″*″,″#″,″+″及″|″)指示来标明成熟的二聚化神经胚素配体中形成的分子内(*与*,#与#,及+与+)及分子间(″|″)的二硫键。脱字符号(“^”)指NBN106-N95K中被赖氨酸取代的氨基酸位置95的天冬酰胺残基。
在可选的实施方案中,上述确定的神经胚素多肽的序列在其氨基末端氨基酸序列处被截短。其实例包括:
(iv)本文命名为NBN112的112AA多肽序列,其具有神经胚素多肽羧基末端的112个氨基酸,如SEQ ID NO:6(SEQ ID NO:8)的氨基酸29-140或SEQID NO:1、3或4的氨基酸2-113。
(v)本文命名为NBN111的111AA多肽序列,其具有神经胚素多肽羧基末端的111个氨基酸,如SEQ ID NO:6(SEQ ID NO:9)的氨基酸30-140或SEQID NO:1、3或4的氨基酸3-113。
(vi)本文命名为NBN110的110AA多肽序列,其具有神经胚素多肽羧基末端的110个氨基酸,如SEQ ID NO:6(SEQ ID NO:10)的氨基酸31-140或SEQ ID NO:1、3或4的氨基酸4-113。
(vii)本文命名为NBN109的109AA多肽序列,其具有神经胚素多肽羧基末端的109个氨基酸,如SEQ ID NO:6(SEQ ID NO:11)的氨基酸32-140或SEQ ID NO:1、3或4的氨基酸5-113。
(viii)本文命名为NBN108的108AA多肽序列,其具有神经胚素多肽羧基末端的108个氨基酸,如SEQ ID NO:6(SEQ ID NO:12)的氨基酸33-140或SEQ ID NO:1、3或4的氨基酸6-113。
(ix)本文命名为NBN107的107AA多肽序列,其具有神经胚素多肽羧基末端的107个氨基酸,如SEQ ID NO:6(SEQ ID NO:13)的氨基酸34-140或SEQ ID NO:1、3或4的氨基酸7-113。
(x)本文命名为NBN106或N-7之一的106AA多肽序列,其具有神经胚素多肽羧基末端的106个氨基酸,如SEQ ID NO:6(SEQ ID NO:14)的氨基酸35-140或SEQ ID NO:1、3或4的氨基酸8-113。
(xi)本文命名为NBN105的105AA多肽序列,其具有神经胚素多肽羧基末端的105个氨基酸,如SEQ ID NO:6(SEQ ID NO:15)的氨基酸36-140或SEQ ID NO:1、3或4的氨基酸9-113。
(xii)本文命名为NBN104或N-9之一的104AA多肽序列,其具有神经胚素多肽羧基末端的104个氨基酸,如SEQ ID NO:6(SEQ ID NO:16)的氨基酸37-140或SEQ ID NO:1、3或4的氨基酸10-113。
(xiii)本文命名为NBN103的103AA多肽序列,其具有神经胚素多肽羧基末端的103个氨基酸,如SEQ ID NO:6(SEQ ID NO:17)的氨基酸38-140或SEQ ID NO:1、3或4的氨基酸11-113。
(xiv)本文命名为NBN102的102AA多肽序列,其具有神经胚素多肽羧基末端的102个氨基酸,如SEQ ID NO:6(SEQ ID NO:18)的氨基酸39-140或SEQ ID NO:1、3或4的氨基酸12-113。
(xv)本文命名为NBN101的101AA多肽序列,其具有神经胚素多肽羧基末端的101个氨基酸,如SEQ ID NO:6(SEQ ID NO:19)的氨基酸40-140或SEQ ID NO:1、3或4的氨基酸13-113。
(xvi)本文命名为NBN100的100AA多肽序列,其具有神经胚素多肽羧基末端的100个氨基酸,如SEQ ID NO:6(SEQ ID NO:20)的氨基酸41-140或SEQ ID NO:1、3或4的氨基酸14-113。
(xiii)本文命名为NBN99或N-14之一的99AA多肽序列,其具有神经胚素多肽羧基末端的99个氨基酸,如SEQ ID NO:6(SEQ ID NO:21)的氨基酸42-140或SEQ ID NO:1、3或4的氨基酸15-113。
这些截短的神经胚素多肽的多肽序列从NBN113到NBN99如表4所示。二硫键形成如表3所述。
依据本发明的突变型神经胚素多肽可,如与SEQ ID NO:1的氨基酸8-113具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%的同一性。在一些实施方案中,突变型神经胚素多肽的氨基酸序列包括在突变型神经胚素多肽的氨基酸1-94及96-113的天然存在的大鼠、人或小鼠的神经胚素多肽的氨基酸序列,如,所述多肽在这些位置具有SEQ ID NO:2、3或4的氨基酸序列。
在序列上不同于SEQ ID NO:1-4公开的那些序列的突变型神经胚素多肽可包括一种或更多种保守的氨基酸取代。任选地,或此外,突变型神经胚素多肽可由于一种或更多种非保守氨基酸取代或缺失或插入而不同。优选地,取代、插入或删除不消除分离的蛋白的生物学活性。
保守取代是一种氨基酸被另一种特性相似的氨基酸取代。保守取代包括在以下组内的取代:缬氨酸、丙氨酸及甘氨酸;亮氨酸、缬氨酸及异亮氨酸;天冬氨酸及谷氨酸;天冬酰胺及谷氨酰胺;丝氨酸、半胱氨酸及苏氨酸;赖氨酸及精氨酸;苯丙氨酸及酪氨酸。非极性的疏水的氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸及组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸及谷氨酸。以上提到的极性、碱性或酸性组的一个成员被同组的另一成员的任意取代可被认为是保守取代。
其他取代可为本领域技术人员轻易识别。例如,对于氨基酸丙氨酸的取代,可从D-丙氨酸、甘氨酸、β-丙氨酸、半胱氨酸及D-半胱氨酸之一中选取。对于赖氨酸,可以用D-赖氨酸、精氨酸、D-精氨酸、同型精氨酸、蛋氨酸、D-蛋氨酸、鸟氨酸或D-鸟氨酸中任一取代。一般地,预期可诱导分离的多肽的性质变化的功能上重要的区域中的取代是这样的替代,其中:(i)一种极性残基,如丝氨酸或苏氨酸,取代(或被取代成)疏水残基,如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸;(ii)半胱氨酸残基取代(或被取代成)任何其他残基;(iii)有带正电侧链的残基如赖氨酸、精氨酸或组氨酸,取代(或被取代成)有带负电侧链的残基如谷氨酸或天冬氨酸;或(iv)带有庞大侧链的残基如苯丙氨酸,取代(或被取代成)没有这种侧链的残基如甘氨酸。前述非保守性取代之一可改变该蛋白功能性质的可能性也与取代相对于该蛋白功能重要区的位置有关。一些非保守取代可相应地很少或不影响生物学性质。
在许多情况下,聚合物偶联的突变型神经胚素多肽相对于野生型多肽或在无聚合物时的突变型多肽而言具有更长的血清半衰期。在一些实施方案中,聚合物偶联的突变型神经胚素多肽相对于在无聚合物时的多肽或糖基化的多肽而言具有显著增加的体内效力。
聚合物偶联的神经胚素多肽可作为包括至少一种聚合物偶联的神经胚素多肽的二聚体来提供。在一些实施方案中,此二聚体是聚合物偶联的突变型神经胚素多肽的同源二聚体。在其他的实施方案中,此二聚体是聚合物偶联的突变型截短的神经胚素多肽的同源二聚体。在其他的实施方案中,此二聚体是包括一种聚合物偶联的突变型神经胚素多肽和一种野生型神经胚素多肽的异源二聚体。在其他的实施方案中,此二聚体是包括一种聚合物偶联的突变型神经胚素多肽和一种聚合物偶联的野生型神经胚素多肽的异源二聚体,其中该聚合物偶联在氨基末端,并且该多肽可被截短或可不被截短。其他的二聚体包括可被截短或可不被截短的聚合物偶联的突变型神经胚素多肽类型的异源二聚体或同源二聚体。
本发明提供的是成熟且截短的突变多肽序列,其包括前原NBN多肽的羧基-末端-大多数(carboxy-terminal-most)氨基酸残基,诸如SEQ ID NO:5给出的那些,它们在本文称为NBN#,#代表保存在参照神经胚素多肽的羧基末端残基的数目。生物活性神经胚素二聚体中存在的聚合物偶联的神经胚素多肽可以为蛋白酶裂解反应或化学裂解反应的产物,或可由重组DNA构建体表达,或可被合成。示例性的神经胚素多肽包括,如,NBN140、NBN116及NBN113。本发明另外的神经胚素多肽包括NBN112、NBN111、NBN110、NBN109、NBN108、NBN107、NBN106、NBN105、NBN104、NBN103、NBN102、NBN101、NBN100及NBN99(SEQ ID NO:8-21)。
一种优选的聚合物偶联的神经胚素多肽是偶联与或三个10kDa PEG组分(″3×10kDa PEG NBN106-N95K″)或四个10kDa PEG组分NBN106-N95K(″4×10kDa PEG NBN106-N95K″)相偶联的同源二聚体。同样优选的是偶联于或三个10kDa PEG组分(″3×10kDa PEG NBN106-N95K″)或四个10kDa PEG组分的NBN106-N95K同源二聚体,本文中称为“3(,4)×10kDa PEG NBN106-N95K”。同样优选的是3(,4)×10kDa PEGNBN106-N95K同源二聚体,其中两个氨基末端共价连接于PEG组分,且第三和/或第四PEG组分共价连接于一或两个取代的N95K残基。
在一些实施方案中,聚合物偶联的神经胚素多肽基于SEQ ID NO:1的共有序列。在一些实施方案中,聚合物偶联的神经胚素多肽除了包括SEQ IDNO:1的氨基酸8-113,还包括SEQ ID NO:1的氨基酸1-7。
在一些实施方案中,聚合物偶联的神经胚素多肽在二聚化时,其与GFRα3结合。在一些实施方案中,聚合物偶联的神经胚素多肽在二聚化时,其或单独或在与GFRα3结合的情况下,刺激RET多肽的酪氨酸磷酸化。
在一些实施方案中,聚合物偶联的神经胚素多肽在二聚化时,其增强神经元的存活,如增强感觉神经元的存活。
在一些实施方案中,聚合物偶联的神经胚素多肽在二聚化时,其减轻或逆转神经元诸如感觉神经元的病理改变。
在一些实施方案中,聚合物偶联的神经胚素多肽在二聚化时,其增强神经元如自主神经元或多巴胺能神经元的存活。
在一些实施方案中,聚合物偶联的神经胚素多肽包括一种、两种、三种、四种或更多种氨基酸取代,所述取代选自下组氨基酸的取代:在聚合物偶联的多肽氨基酸序列中14位的、除精氨酸以外的氨基酸,在聚合物偶联的多肽的氨基酸序列中39位的、除精氨酸以外的氨基酸,在聚合物偶联的多肽的氨基酸序列中68位的、除精氨酸以外氨基酸,及在聚合物偶联的多肽的氨基酸序列中95位的、除天冬酰胺以外的氨基酸。在一些实施方案中,14、39、68及95位中的一种或更多位置的氨基酸是赖氨酸。优选地,聚合物偶联的神经胚素多肽的氨基酸8-94及96-113与SEQ ID NO:1的氨基酸8-94及96-113具有至少90%的同一性。更优选地,所述氨基酸序列与其至少95%相同。最优选地,聚合物偶联的神经胚素多肽的氨基酸序列包括在聚合物偶联的神经胚素多肽的氨基酸8-94及96-113位的、天然存在的人、小鼠或大鼠神经胚素多肽的氨基酸序列。例如,聚合物偶联的神经胚素多肽的氨基酸8-94及96-113可包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4的氨基酸8-94及96-113位的氨基酸序列。在上述实施方案,95位氨基酸的优选残基是赖氨酸或半胱氨酸。
本发明包括一种构建体,其为含有聚合物偶联的神经胚素融合蛋白的异源二聚体或同源二聚体,如SEQ ID NO:36的聚组氨酸(His)标记的神经胚素,或神经胚素融合蛋白,其中融合组分是免疫球蛋白(Ig)多肽,血清白蛋白多肽或复制酶来源的多肽。神经胚素融合蛋白可增强体内药物动力学及生物利用率性质。
本发明提供了用突变的多肽序列编码成熟的或截短的神经胚素多肽的核酸分子。该编码给定的神经胚素多肽的核酸分子优选地在载体中如表达载体中给出。突变的神经胚素核苷酸分子,或包括相同核苷酸分子的载体,可在细胞中提供。这种细胞可以是,如,哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或细菌细胞。优选的哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞(“CHO细胞”)。
此外,本发明提供一种制备聚合物偶联的神经胚素多肽的方法,其通过在允许神经胚素多肽表达的条件下,培养含有编码神经胚素多肽的核酸的细胞来进行。在一些实施方案中,神经胚素偶联于天然存在的组分。在具体的实施方案中,天然存在的组分是糖基组分。在一些实施方案中,糖基化的神经胚素在如CHO细胞中表达。本发明进一步包括在细胞中表达的神经胚素多肽。为本文本发明的融合蛋白(诸如神经胚素血清白蛋白融合蛋白),公开了相似的核苷酸、载体、宿主细胞及多肽制备方法。
在一些实施方案中,在细胞中表达的神经胚素多肽可回收并偶联于聚合物。在一些实施方案中,该聚合物是聚亚烷基二醇组分。在具体的实施方案,聚合物是PEG组分。
具体来说,本发明给出一种组合物,其包括偶联于非天然存在的聚合物的突变型神经胚素多肽。该组合物中突变型神经胚素多肽优选地包括与SEQID NO:1的氨基酸8-113至少70%相同的氨基酸序列,条件是该聚合物偶联的神经胚素多肽包括一种或更多种氨基酸取代,所述取代选自以下氨基酸的取代:在聚合物偶联的多肽的氨基酸序列中14位的、除精氨酸以外的氨基酸、在聚合物偶联的多肽的氨基酸序列中39位的、除精氨酸以外的氨基酸、在聚合物偶联的多肽的氨基酸序列中68位的、除精氨酸以外的氨基酸,及在聚合物偶联的多肽的氨基酸序列中95位的、除天冬酰胺以外的氨基酸,其中氨基酸位置的编号与SEQ ID NO:1的多肽序列一致。
本发明包括稳定的、水溶性的偶联的神经胚素多肽,或包含偶联于PEG组分的神经胚素多肽或突变型神经胚素多肽的突变神经胚素多肽复合体,其中神经胚素多肽或突变神经胚素多肽通过不稳定键偶联于PEG组分。在一些实施方案中,这种不稳定键可通过生物化学的水解作用、蛋白水解作用或巯基裂解作用裂解。在一些实施方案中,这种不稳定键在体内条件下是可裂解的。
此外,本发明提供一种制备相对于野生型神经胚素而言血清半衰期延长的修饰型神经胚素多肽的方法。该方法包括提供一种神经胚素多肽或突变型神经胚素多肽,并且使多肽或突变神经胚素多肽偶联于非天然存在的聚合物组分,从而形成偶联的聚合物神经胚素多肽组合物。
本发明的聚合物偶联的突变神经胚素多肽包括一种或更多种氨基酸取代,例如,在聚合物偶联的多肽的氨基酸序列中14位的、除精氨酸以外的氨基酸、在聚合物偶联的多肽的氨基酸序列中39位中存在的、除精氨酸以外的氨基酸、在聚合物偶联的多肽的氨基酸序列中68位存在的、除精氨酸以外的氨基酸,及在聚合物偶联的多肽的氨基酸序列中95位存在的、除天冬酰胺以外的氨基酸,其中氨基酸位置的编号与SEQ ID NO:1多肽序列一致。
野生型及突变型神经胚素多肽的合成及分离
神经胚素多肽可用本领域已知的方法分离。天然存在的神经胚素多肽可通过合适的纯化方案、应用标准的蛋白纯化技术从细胞或组织源分离得到。可选地,突变型神经胚素多肽可用标准的肽合成技术通过化学方法合成。短氨基酸序列的合成在肽领域已确定。见,如,Stewart,等,Solid Phase PeptideSynthesis(2d ed.,1984).。
在一些实施方案中,突变型神经胚素多肽通过重组DNA技术产生。例如,编码突变型神经胚素多肽的核酸分子可插入载体如表达载体中,且该核酸可被插入到细胞中。适合的细胞包括,如哺乳动物细胞(诸如人细胞或CHO细胞)、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞以及细菌细胞。当在重组细胞中表达时,该细胞优选地培养在容许突变型神经胚素多肽表达的条件下。如果需要,突变型神经胚素多肽可从细胞悬液中回收。本文所用“回收”意思是从在回收过程前已存在于细胞或培养基的那些成分中取出突变的多肽。回收过程可包括一种或更多个再折叠或纯化的步骤。
突变型神经胚素多肽可用本领域已知的数种方法的任一种构建。一种这样的方法就是定点诱变,其中在编码的神经胚素多肽中,为了改变单个的氨基酸(或,如果需要,小量预先确定的氨基酸残基),具体的核苷酸被改变(或,如果需要,小量的特定的核苷)。本领域技术人员认为定点诱变是一种常规且广泛使用的技术。事实上,许多定点诱变试剂盒可购得。ClontechLaboratories(Palo Alto,Calif.)出售的“转移物定点诱变试剂盒(TransformerSite Directed Mutagenesis Kit)”就是一种这样的试剂盒。
除非另行说明,本发明的实践将应用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、微生物学、重组DNA、蛋白化学及免疫学的常规技术,其在本领域技术人员技能范围内。这些技术在文献中有描述。见,例如,
Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition.(Sambrook,Fritsch and Maniatis,eds.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989;DNA Cloning,Volumes I and II(D.N.Glover,ed),1985;Oligonucleotide Synthesis,(M.J.Gait,ed.),1984;U.S.Patent No.4,683,195(Mulliset al.,);Nucleic Acid Hybridization(B.D.Haines and S.J.Higgins,eds.),1984;Transcriptionand Translation(B.D.Hames and S.J.Higgins,eds.),1984;Culture of Animal Cells(R.I.Freshney,ed).Alan R.Liss,Inc.,1987;Immobilized Cells and Enzymes,IRL Press,1986;APractical Guide to Molecular Cloning(13.Perbal),1984;Methods in Enzymology,Volumes154 and 155(Wu et al.,eds),Academic Press,New York;Gene Transfer Vectors forMammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos,eds.),1987,Cold Spring Harbor Laboratory;Immunochernical Methods in Cell and Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.),Academic Press,London,1987;Handbook of Experiment Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.),1986;Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring HarborLaboratory Press,1986.
神经胚素多肽的聚合物偶联
化学修饰的神经胚素多肽可基于本发明公开内容由本领域的技术人员制备。优选偶联于神经胚素多肽的化学组分是水溶性的聚合物。水溶性的聚合物是有利的,因为其附着的蛋白在水环境如生理环境下不沉淀。优选地,这种聚合物将在制药学可用于制备治疗性产品或组合物。
尽管也可附着多于一种聚合物分子,如果需要,可使单一的聚合物分子与神经胚素多肽偶联。本发明的偶联的神经胚素组合物可用于体内及非体内应用中。此外,经验证偶联聚合物可利用任何其他的组、组分或其他偶联的种类,并适于最终用途的应用。例如,将赋予聚合物UV抗性、抗氧化或其他性质或特性的功能性组分共价结合到该聚合物上在一些应用中是有用的。作为进一步的实例,使聚合物功能化使得它具有反应性或可交联性的特征来增强整个偶联物质的各种性质或特征在一些应用中是有用的。因此,聚合物可含有不防碍偶联的神经胚素组合物用于其意图目的的效力的任何功能(functionality)、重复基团(repeating group)、连接或其他构成性结构。
本领域技术人员将能够基于对聚合物/蛋白偶联物是否有治疗用途的考虑及如果有治疗用途,所需剂量、循环时间、抵抗蛋白水解的能力及其他考虑而选出所需聚合物。衍生化的效能可通过以所需的形式给予衍生物(如,通过渗透泵,或更优选地,通过注射或输入,或进一步配制为经口服、肺部吸入或其他递送途径)并测定其有效性来确定。
适宜的水溶性聚合物包括,但不限于,PEG、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊烷、聚1,3,6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(或同源聚合物或随机共聚物),及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)PEG、原丙二醇同源聚合物(propropylene glucol homopolymer)、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚乙氧化的多元醇(polyoxyethylated polyol)(如,丙三醇)、聚乙烯醇及其混合物。
该聚合物可以为任何适宜的分子量,可以是分支的或未分支的。
对于PEG,适宜的平均分子量在2KDa及100KDa间。这点为处理和制造提供了方便。本领域的那些技术人员将意识到在PEG制备中,一些分子的分子量可重于所述的分子量,一些分子的分子量则可轻于所述的分子量。因此,分子量通常规定为“平均分子量”。可根据所需治疗谱(如,所需的持续释放时间;对生物活性的影响(如果有的话);处理的便利性;抗原性程度或缺乏以及PEG对治疗蛋白的其他已知影响)来利用其它分子量(大小)。在不同的实施方案中,分子量大约为2kDa、5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、40kDa或100kDa。在一些优选的实施方案中,每条PEG链的平均分子量大约为20KDa。在一些优选的实施方案中,平均分子量大约为10KDa。
这样附着的聚合物分子的数目可改变,本领域的技术人员能够确定其对功能的影响。可进行单衍生化(mono-derivatize),或二-、三-、四-衍生衍生化,或组合的衍生化,所述衍生化利用相同或不同的化学组分(如,聚合物,诸如不同分子量的PEG)。聚合物分子与蛋白(或多肽)分子的比例如它们反应混合物中的浓度那样可改变。一般地,最适宜的比例(就其中没有过多未反应的蛋白或聚合物的反应的功效来说)可由诸如所需的衍生化程度(如,单,二-,三-等等)、所选聚合物的分子量、聚合物是否分支及反应条件等因子来决定。
考虑到对蛋白功能性或抗原性区域的影响,PEG分子(或其他化学组分)应当附着于蛋白。许多附着的方法可为本领域技术人员所用。如见EP 0401384(PEG与G-CSF偶联);Malik等,Exp.Hematol.20:1028-1035,1992(报道了用tresyl chloride的GM-CSF的PEG化)。
例如,PEG可通过氨基酸残基经由反应性基团诸如游离氨基或羧基而共价结合(PEG化)。具有游离氨基的氨基酸残基包括赖氨酸残基及氨基末端氨基酸残基。具有游离羧基的氨基酸残基包括天冬氨酸残基、谷氨酸残基及C末端氨基酸残基。巯基也可用作反应基团用于附着PEG分子。对于治疗目的,可附着在氨基基团,如,N末端或赖氨酸基团。技术人员可具体地期望氨基末端化学修饰的蛋白。
用PEG作为该组合物的例证,技术人员可从多种PEG分子(依据分子量、分支等)中选择反应混合物中PEG分子与蛋白(或多肽)的比例、所实施的PEG化反应的类型,以及获得所选氨基末端PEG化的蛋白的方法。获得氨基末端PEG化制备物(即如果需要从其他单PEG化组分中分离这种组分)的方法可通过从一群PEG化的蛋白分子中纯化氨基末端PEG化的物质来进行。选择性的氨基末端化学修饰可通过还原性烷基化作用来实现,所述还原性烷基化作用利用可用于具体蛋白中的衍生化的不同类型的伯氨基团(赖氨酸对氨基末端)的差异反应性。在适宜的反应条件下,利用含有羧基基团的聚合物,在氨基末端对蛋白基本上选择性的衍生化可实现。例如,通过在容许利用赖氨酸残基的ε氨基基团与该蛋白氨基末端残基的α氨基基团之间的PKa差异的PH值下进行该反应,技术人员可选择性地PEG化该蛋白的氨基末端。通过这样一种选择性的衍生化,水溶性聚合物对蛋白的附着是受控的:与聚合物的偶联主要发生在该蛋白的氨基末端,并且其他反应性基团诸如赖氨酸侧链的氨基基团没有显著的修饰发生。
利用还原性烷基化作用,水溶性的聚合物可以为上述类型,且应具有单一反应性醛以偶联蛋白。可利用PEG丙醛,其含有单一反应性醛。
本发明包括表达于原核生物或真核生物中或利用合成法制备的突变型神经胚素多肽。在一些实施方案中,神经胚素是糖基化的。在一些具体的实施方案,神经胚素二聚体在每一氨基末端处与聚合物偶联且在每一内部Asn95残基处糖基化。在其他的实施方案中,突变型神经胚素二聚体在每一氨基末端处与聚合物偶联且在一或所有两个内部Lys95残基处与聚合物偶联。
PEG化可通过任何适宜的PEG化反应来实现。各种PEG化化学为本领域所知。见,如Focus on Growth Factors,3(2):4-10,1992;EP 0154316;EP 0401384;及在此引用的有关PEG化的其他出版物。PEG化可经由与反应性PEG分子(或反应性水溶性聚合物的类似物)的酰基化反应或烷基化反应来实现。
通过酰基化的PEG化一般包含活性PEG酯衍生物的反应。任何已知的或随后发现的反应性PEG分子可用来实现PEG化。一种优选的活化的PEG酯是酯化为N-羟基琥珀琥珀酰亚胺(NHS)的PEG。本文所用“酰基化”无限地包括在治疗性蛋白及水溶性聚合物诸如PEG间的下述类型的连接:酰胺、氨基甲酸酯(carbamate)、氨甲酸乙酯(urethane)等等。见Bioconjugate Chem.5:133-140,1994。反应条件可从PEG化领域那些已知的任意条件或那些后继发展起来的条件中选出,但应当避免使要修饰的神经胚素蛋白或多肽失活的条件诸如温度、溶解性及PH值。
通过酰基化的PEG化将通常产生多PEG化的神经胚素蛋白产物。优选地,连接键可以是酰胺。同样优选地,所得的产物将基本上只是(例如>95%)单、二-或三-PEG化。然而具有更高程度的PEG化的一些种类可依所用具体反应条件而大量形成。如果需要,更多纯化的PEG化的种类可从混合物中分离出来,具体是未反应的种类,所述分离可通过标准的纯化技术包括透析、盐析、超滤、离子交换层析法、凝胶过滤层析法及电泳等技术来进行。
通过烷基化的PEG化一般地涉及在还原剂存在的条件下,PEG末端醛基衍生物与神经胚素的反应。通过烷基化的PEG化也可以产生多PEG化的神经胚素蛋白产物。另外,技术人员可以将反应条件控制基本在上仅有利于在神经胚素氨基末端的α氨基基团的(即,PEG化的单-PEG化的蛋白)。在单-的PEG化或多-PEG化的任一种情况下,PEG基团优选地通过-CH2-NH-基团附着于该蛋白。具体地对于-CH2-基团,这种类型的键在本文称为“烷基”连接。
经由可产生单-PEG化产物的还原性烷基化作用的衍生化,利用可用于衍生化的不同类型的伯氨基基团(赖氨酸,相对氨基末端)的差异反应性。该反应在这样一种pH进行,所述pH容许利用赖氨酸残基的ε氨基基团与该蛋白氨基末端残基的α氨基基团间PKa的差异。通过这种选择性衍生化,含有反应基团诸如一种醛的水溶性的聚合物与蛋白的连接是受控的:与聚合物的偶联主要发生在该蛋白的氨基末端,并且其他反应基团诸如赖氨酸侧链氨基基团,没有出现明显的修饰发生。
酰基化及烷基化方法两者都用到的聚合物分子可从上述水溶性的聚合物中选出。选出的聚合物优选应被修饰成具有单一反应基团,诸如用于酰基化的活性酯或用于烷基化的醛,使得聚合程度可如本发明该方法中提供的那样受控。一种示例性的反应性PEG醛是PEG丙醛,其为在水中稳定的、或其单-C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(见美国专利5,252,714)。聚合物可以是分支的或不分支的。对于酰基化反应,所选的聚合物应当具有单个反应性酯基团。对于本发明还原性的烷基化作用,所选的聚合物应当具有单个的反应性醛基团。通常,水溶性的聚合物不从天然存在的糖基残基中选出,由于这些聚合物通常可方便地由哺乳动物重组表达系统制备。该聚合物可以为任意分子量、可为分支的或未分支的。
本文所用的常见的水溶性聚合物是PEG。本文所用,聚乙二醇包括任何用于衍生其他蛋白的PEG形式,包括但不限于,如,单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-PEG。
一般地,化学衍生化可在任何适于使生物活性物质与活化的聚合物分子反应的条件下实施。制备PEG化的神经胚素的方法通常包括以下步骤,(a)在适宜条件下使神经胚素蛋白或多肽与PEG(诸如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应,由此该分子结合一种或多个PEG基团,及(b)获得反应产物。一般地,酰基化反应的最佳反应条件将逐例基于已知参数和所需结果来确定。例如,较大的PEG与蛋白的比率,较大的多PEG化产物百分比。
为制备大量的均质单-聚合物/神经胚素群,还原性烷基化作用通常包括两个步骤,(a)在还原性烷基化的条件下,在适于pen-nit选择性修饰神经胚素氨基末端的α氨基基团的PH值条件下,使神经胚素蛋白或多肽与反应性的PEG分子反应;及(b)获得反应产物。
对于基本均质的单一聚合物/神经胚素群,还原性烷基化反应条件是允许水溶性的聚合物组分选择性附着于神经胚素的氨基末端的条件。这种反应条件一般提供赖氨酸氨基基团与氨基末端α氨基基团之间的pKa差异(pKa是只有50%氨基基团被质子化而50%的氨基基团没有被质子化的PH)。PH也影响所用到的聚合物与蛋白的比率。一般地,如果PH值较低,将需要相对于蛋白而言大大过量聚合物(即,氨基末端α氨基基团的反应性越低,获得适宜的条件需要的聚合物越多)。如果PH值更高,聚合物:蛋白的比率不必要同样大(即,更多的反应簇可用时,需要更少的聚合物分子)。为本发明的目的,PH值通常在3-9之间,优选的3-6。
另一重要的考虑是聚合物的分子量。一般地,聚合物的分子量越高,附着于蛋白的聚合物分子越少。相似地,当使这些参数最优化时,应当考虑聚合物的分支。一般地,分子量越高(或分支越多),聚合物:蛋白的比率越高。通常,对于本文包括的PEG化反应,优选的平均分子量是约2kDa到约100kDa。优选的平均分子量是约5kDa到约50kDa,具体优选地约10kDa到约20kDa.。优选的总分子量是约10kDa到约40kDa。
在一些实施方案中,神经胚素多肽通过多肽上的末端反应基团连接于聚合物。可选地或另外,神经胚素多肽可通过内部赖氨酸残基的侧链氨基基团连接,所述内部赖氨酸残基如引入到天然存在的神经胚素多肽的氨基酸序列中的赖氨酸残基,因此,偶联(conjugation)也可从非末端反应性基团中分支。具有反应基团的聚合物本文命名为“活化的聚合物”。反应基团选择性地与蛋白上的反应基团如游离氨基反应。
附着可以发生在活化的聚合物中任何可用的神经胚素氨基基团,诸如赖氨酸残基的α氨基基团或ε氨基基团或引入到神经胚素多肽的氨基酸序列中的残基。神经胚素的游离羧基基团、适宜地活化的羰基基团、羟基、胍基、咪唑、氧化的碳水化合物部分及疏基基团(如果可利用的话)也可用作附着位点。
通常利用约1.0摩尔到10摩尔活化的聚合物每摩尔蛋白,这依据蛋白的浓度而不同。最终量是在使反应程度最大化而使产物非特异修饰最小化之间的平衡,并且同时限定维持最适活性的化学,而且如果可能同时最优化该蛋白的半衰期。优选地,该蛋白至少大约50%的生物活性被保留,最优选地,近100%的生物活性被保留。
聚合物可用本领域已知的方法偶联于神经胚素多肽。例如,在一个实施方案,聚亚烷基二醇组分偶联于突变型神经胚素多肽的赖氨酸基团。赖氨酸基团的连接可用N-羟基琥珀琥珀酰亚胺(NHS)活性酯诸如PEG琥珀琥珀酰亚胺基琥珀酸盐(SS-PEG)及琥珀琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA-PEG)。适宜的聚亚烷基二醇组分包括,如,羧甲基NHS、正亮氨酸-NHS、SC-PEG、tresylate、乙醛(aldehyde)、环氧化物、羰基咪唑及PNP碳酸盐。
其它氨基反应性PEG连接物可代替琥珀琥珀酰亚胺组分。这些包括,如,异硫氰酸酯(isothiocyanate)、硝基苯基碳酸酯(nitrophenylcarbonate)、环氧化物、苯并三唑(benzotriazole)。优选选择的条件使反应的选择性和程度最大化。
如果需要,聚合物偶联的神经胚素多肽可含有标记,如可以随后经蛋白水解而释放的一种标记。因此,赖氨酸组分可通过以下方法选择性地被修饰:首先使His-标记与低分子量连接物诸如Traut′s试剂(Pierce)等反应对其进行修饰(first reacting a His-tag modified with a low molecular wight linker such asTraut’s reagent(Pierce)),所述试剂与赖氨酸和氨基末端两者都反应,然后释放his标记。所述多肽将含有游离SH基团,其被含有硫醇(thiol)反应性头部基团(诸如马来酰亚胺(maleimide)基团、乙烯砜(vinylsulfone)基团、卤代乙酸酯(haloacetate)或游离或被保护的SH的PEG选择性地修饰。
Traut′s试剂可被任何可建立PEG附着特异性位点的连接物取代。例如,Traut′s试剂可被SPDP、SMPT、SATA或SATP(都可从Pierce购买)取代。相似地,技术人员可使蛋白与胺反应性连接物反应,其可插入马来酰亚胺(例如SMCC、AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUS或GMBS)、卤代乙酸酯基团(SBAP、SIA、SIAB)或乙烯砜基团,使产生的产物与含有游离SH的PEG反应。使用的连接物的大小的唯一限制是它不能阻止氨基末端标签随后的移除。
因此,在其他实施方案中,聚亚烷基二醇组分偶联于突变型神经胚素多肽的半胱氨酸基团。偶联可用马来酰亚胺基团、乙烯砜基团、卤代乙酸酯基团以及硫醇基团来实现。
在优选的实施方案中,所述组合物中的聚合物偶联的神经胚素多肽与缺乏聚合物的神经胚素多肽相比具有更长的半衰期。另外,或此外,组合物中的聚合物偶联的神经胚素多肽二聚体可结合GFRα,活化RET,使神经元病理改变正常化,增强神经元的存活,或改善神经性疼痛,或执行这些生理功能的组合。测定多肽是否增强神经元的存活、是否使神经元病理改变正常化的实验在如WO00/01815描述。优选地,所述神经元是感觉神经元,自主神经元或多巴胺能神经元。
在优选的实施方案中,所述组合物被提供为一种稳定的、水溶性的、偶联的神经胚素多肽复合体,其包括偶联于PEG组分的神经胚素多肽或突变型神经胚素多肽。如果需要,神经胚素多肽或突变型神经胚素多肽可通过不稳定键偶联于PEG组分。该不稳定键可被裂解,如在生化水解、蛋白水解或疏基裂解中。例如,在体内(生理)条件下,该键可以被裂解。
其他反应参数,诸如溶剂(solvent)、反应时间、温度等,及产物纯化的手段可逐例基于有关利用水溶性的聚合物的蛋白衍生化的公开信息来确定。
如果需要,可用单个聚合物分子与每个神经胚素多肽偶联。可选地,可以附着一种或一种以上聚合物分子。本发明的偶联的神经胚素组合物可用于体内及非体内应用中。此外,认识到偶联型聚合物(conjugating polymer)可利用任何其他基团、组分或其他偶联的种类,条件是其适于最终的应用。例如,将赋予聚合物UV抗性、抗氧化或其他性质或特性的功能性组分共价结合到该聚合物上在一些应用中是有用的。作为进一步的实例,使聚合物功能化使得它具有反应性或可交联性的特征来增强整个偶联物质的各种性质或特点在一些应用中是有用的。因此,聚合物可含有不防碍偶联的神经胚素组合物用于其意图目的的效力的任何功能、重复基团、连接或其他构成性结构。
可用于获得这些所需特性的示例性聚合物在下面的示例性反应方案中描述。在共价结合的肽的应用中,聚合物可被功能化,然后偶联于这些肽的游离氨基酸以形成不稳定键。
该反应可通过任一适宜的方法进行,所述方法用于使生物活性物质与惰性聚合物反应,如果反应基团在氨基末端的α氨基基团上,优选地在pH 5-8,如pH 5、6、7或8。一般地,这个过程涉及制备活化的聚合物,及其后使蛋白与活化的聚合物反应以产生适于配制的可溶性蛋白。上述修饰反应可通过数种方法实行,所述方法包括一或多步。
线型或分支型PEG以及其他的烷基化形式可用。PEG的长度可变化。大多数常见形式大小为2K-100kDa。虽然本实施例报告在氨基末端的靶向的PEG化不影响药物动力学性质,该物质保留了生理功能的事实提示本文公开的位点的修饰无害(not deleterious)。因而,在产生通过插入赖氨酸残基提供额外的附着位点的神经胚素突变型的过程中,这些形式在赖氨酸及氨基末端都被PEG化的可能结果包含于本发明范围内。
神经胚素多肽的一种或多种位点可偶联于聚合物。例如,一、二、三、四或五个PEG组分可附着于该多肽。在一些实施方案中,PEG组分附着于神经胚素多肽的氨基末端及/或氨基酸14、39、68及95,其中氨基酸编号如表1及SEQ ID NO:1所示。
在有利的实施方案,组合物中聚合物偶联的神经胚素多肽相对于无聚合物时神经胚素多肽野生型或突变型多肽而言具有更长的半衰期。另外,或此外,组合物中聚合物偶联的神经胚素多肽结合GFRα,活化RET,使神经元病理改变正常化,增强神经元的存活,改善神经性疼痛,或执行这些生理功能的组合。
在一些实施方案中,复合体中的突变型神经胚素多肽或聚合物偶联物具有选自下组的一种生理活性:GFRα3结合,RET活化,神经元病理改变正常化,增强神经元的存活,改善神经性疼痛。
本发明也提供了包括聚合物偶联的神经胚素多肽的多聚体多肽。多聚体多肽优选作为纯化的多聚体多肽被提供。多聚体复合体的实施例包括,如二聚体复合体。多聚体复合体可作为异基因或同基因复合体提供。因此,多聚体复合体可以是包括一种突变型神经胚素多肽及一种非突变型神经胚素多肽的异二聚体聚合物偶联的多肽复合体,或包括两种或更多种突变型神经胚素多肽的异二聚体聚合物偶联的多肽复合体。
在一些实施方案中,聚合物偶联的神经胚素多肽可结合GFRα3。优选地,聚合物偶联的神经胚素多肽的结合刺激RET多肽的磷酸化。为测定多肽是否结合GFRα3,可如WO 00/01815所述进行测定。例如,CHO细胞系培养基上清中神经胚素的存在可用Sanicola等.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1997,94:6238)所述的三重(ternary)复合体测定法的修饰形式描述。在这种测定法中,可评估GDNF样分子介导RET细胞外结构域与各种共同受体GFRα1、GFRα2及GFRα3之间的结合的能力。RET的可溶形式及共同受体作为融合蛋白产生。大鼠RET的细胞外结构域与胎盘碱性磷酸酶(RET-AP)的融合蛋白以及大鼠GFRα-1的细胞外结构域(在公开的申请WO9744356;Nov.27,1997中公开)与人IgG1的Fc结构域(rGFR(α1-Ig)的融合蛋白已经被描述(在Sanicola等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997,94:6238中)。
本发明的聚合物优选地是聚亚烷基二醇组分,并且更优选地是PEG组分。在一些实施方案中,多聚体组分的平均分子量在约100Da到约25,000Da;约1000Da到约20,000Da;或约5000Da到约20,000Da。在一些实施方案中,至少一种多聚体组分具有约5000Da的平均分子量;约10,000Da;的平均分子量或约20,000Da.的平均分子量。
聚亚烷基二醇组分的功能基团可以是,如羧甲基NHS、正亮氨酸-NHS、SC-PEG、tresylate、乙醛、环氧化物、羰基咪唑或PNP碳酸酯。通过N-羟基琥珀琥珀酰亚胺(NHS)活性酯发生偶联。这种活性酯可以是,如PEG琥珀琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(SS-PEG)、琥珀琥珀酰亚胺基丁酸酯(SPB-PEG)及琥珀琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA-PEG)。在一些实施方案中,聚亚烷基二醇组分偶联于神经胚素多肽或突变型神经胚素多肽的半胱氨酸基团。例如,经由马来酰亚胺基团、乙烯砜基团、卤代乙酸酯及硫醇发生偶联。在各种实施方案中,所述神经胚素多肽或突变型神经胚素多肽包括一、二、三或四个PEG组分。
在一些实施方案中,所述聚合物在神经胚素的N末端位点偶联于多肽。在一些实施方案中,所述聚合物在神经胚素多肽或突变型神经胚素多肽的非末端氨基酸位点偶联于多肽。在一些实施方案中,所述聚合物偶联于神经胚素多肽或突变型神经胚素多肽的溶剂暴露的氨基酸。
在一些实施方案中,所述聚合物在以下位置偶联于神经胚素多肽或突变型神经胚素多肽:聚合物偶联的多肽的氨基末端氨基酸、神经胚素多肽或突变型神经胚素多肽的氨基酸序列中的位置14、神经胚素多肽或突变型神经胚素多肽的氨基酸序列中的位置39、神经胚素多肽或突变型神经胚素多肽的氨基酸序列中的位置68、神经胚素多肽或突变型神经胚素多肽的氨基酸序列中的位置95。
聚合物偶联的神经胚素融合蛋白
如果需要,聚合物偶联的神经胚素多肽可以作为融合蛋白被提供。本发明的蛋白的融合多肽衍生物也包括各种保留生物活性的一级蛋白的各种结构形式。
聚合物偶联的神经胚素-血清白蛋白融合物可用本领域已知的方法构建。许多含有相应的氨基酸反应性基团与硫醇反应基团的交联体中的任何一种可用于连接神经胚素与血清白蛋白。适宜的连接物的实例包括插入硫醇反应性马来酰亚胺的胺反应性交联剂。这些包括,如SMCC、AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUS或GMBS。其他适宜的连接物插入硫醇反应性-卤代乙酸酯基团。这些包括,如SBAP、SIA、SIAB,那些提供保护的或非保护的硫醇用于与巯基基团反应产生可还原键的是SPDP、SMPT、SATA或SATP,所有的这些物质都可购得(例如Pierce Chemicals)。本领域技术人员可同样预见可连接神经胚素氨基末端与血清白蛋白的可选方案。
也可预见本领域技术人员能产生与血清白蛋白的偶联物,所述血清白蛋白非靶向于神经胚素氨基末端或血清白蛋白上的硫醇组分。如果需要,神经胚素-血清白蛋白融合物可用基因工程技术产生,其中,神经胚素在氨基末端和/或羧基末端与血清白蛋白基因融合。
任何造成产物半衰期延长的神经胚素偶联物,例如,在体内或具体地,在动物(包括人)中可用相似的方案产生。造成产物的体内半衰期延长的神经胚素偶联物的另一个实例是融合伴侣是Ig的神经胚素融合蛋白。
聚合物偶联的神经胚素的其他衍生物包括突变的神经胚素或其片段与其它蛋白或多肽的共价或聚合偶联物,诸如通过作为额外的氨基末端或羧基末端在重组培养物中合成。例如,偶联的多肽可以是蛋白的氨基末端区域的信号(或前导)多肽序列,该蛋白以共翻译或翻译后方式指导该蛋白从合成位点转移到细胞膜或细胞壁内外的功能位点(如,酵母α因子前导链)。神经胚素受体蛋白可包括被加入以便于神经胚素纯化或鉴别的多肽(组氨酸/神经胚素融合物)。神经胚素的氨基酸序列也能连于肽Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DYKDDDDK)(SEQ ID NO:22)(Hopp等,Biotechnology 6:1204(1988))。后者的序列具有高度的抗原性,并提供可逆地与特异性单克隆抗体结合的表位,能使所表达的重组蛋白得以快速测定并便于纯化。
这种序列也可被牛粘膜肠激酶在直接跟于Asp-Lys对后的残基处特异性断裂。
生物活性多肽
本发明的多肽可以任何生物活性的形式提供,包括前原蛋白、原蛋白、成熟蛋白、或糖基化的蛋白、非糖基化的蛋白、磷酸化的蛋白、非磷酸化的蛋白的形式、截短的形式或任何其他翻译后修饰的蛋白。生物活性神经胚素多肽包括一种多肽,例如,当该多肽二聚化时,其单独或有辅因子(诸如GFRα3或RET)存在的条件下可结合RET诱导RET的二聚化及RET的自身磷酸化。
本发明的多肽具体地可以为N-糖基化多肽,该多肽优选地在序列表中指定的N-残基处糖基化。
在一些实施方案中,本发明的多肽具有SEQ ID NO:6给出的氨基酸序列,并在122位有糖基化的天冬酰胺残基;或SEQ ID NO:14给出的氨基酸序列,并在95位具有糖基化的天冬酰胺残基,或当通过如ClustalW计算机软件比对时任何突变型神经胚素多肽中的相似位点。
在一些实施方案中,本发明的多肽具有SEQ ID NO:23给出的氨基酸序列,本文称为NBN113-N95K,其含有取代SEQ ID NO:2的95位天冬酰胺残基的赖氨酸残基;或SEQ ID NO:24给出的氨基酸序列,本文称为NBN106-N95K;或当通过如ClustalW计算机软件比对时任何突变型神经胚素多肽中的相似位点。
本发明也包括突变的神经胚素融合蛋白,诸如在美国专利5,434,131中所述的Ig-融合物,或血清白蛋白融合物。
在一些实施方案中,本发明提供一种多肽,其具有包含一处取代的SEQID NO:1所示的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:1给出的序列有至少大约85%、优选地至少大约90%、更优选地至少大约95%、更优选地至少大约98%及最优选地至少大约99%的同一性的氨基酸序列。
在其他实施方案,本发明提供一种多肽,其具有包含一处取代的SEQ IDNO:2的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:2给出的序列有至少大约85%、优选地至少大约90%、更优选地至少大约95%、更优选地至少大约98%及最优选地至少大约99%的同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,本发明提供一种多肽,其具有包含一处取代的SEQID NO:3的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:3给出的序列有至少大约85%、优选地至少大约90%、更优选地至少大约95%、更优选地至少大约98%及最优选地至少大约99%的同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,本发明提供一种多肽,其具有包含一处取代的SEQID NO:4的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:4给出的序列有至少大约85%、优选地至少大约90%、更优选地至少大约95%、更优选地至少大约98%及最优选地至少大约99%的同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,本发明提供一种多肽,其具有包含一处取代的SEQID NO:5的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:5给出的序列有至少大约85%、优选地至少大约90%、更优选地至少大约95%、更优选地至少大约98%及最优选地至少大约99%的同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,本发明提供一种多肽,其具有包含一处取代的SEQID NO:6的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:6给出的序列有至少大约85%、优选地至少大约90%、更优选地至少大约95%、更优选地至少大约98%及最优选地至少大约99%的同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,本发明提供一种多肽,其具有包含一处取代SEQ IDNO:7的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:7给出的序列有至少大约85%、优选地至少大约90%、更优选地至少大约95%、更优选地至少大约98%及最优选地至少大约99%的同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,本发明提供一种多肽,其具有包含一处取代的SEQID NO:8-21中任一种的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:8-21中任一种的序列具有至少大约85%、优选地至少大约90%、更优选地至少大约95%、更优选地至少大约98%及最优选地至少大约99%的同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,本发明提供一种多肽,其具有包含一处取代的SEQID NO:36氨基酸序列,或与SEQ ID NO:36给出的序列具有至少大约85%、优选地至少大约90%、更优选地至少大约95%、更优选地至少大约98%及最优选地至少大约99%的同一性的氨基酸序列。
在进一步的实施方案,本发明提供一种多肽,其具有包含一处取代的SEQ ID NO:1-21及36中任一种的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:1-21及36给出的序列具有至少大约85%、优选地至少大约90%、更优选地至少大约95%、更优选地至少大约98%及最优选地至少大约99%的同一性的氨基酸序列。
在其他实施方案中,本发明的突变多肽具有GDNF亚家族指纹结构(fingerprint),如,表3及4所示的保守的半胱氨酸残基。
在一些实施方案中,本发明提供一种突变的多肽,其由在高度严格的条件下能与编码SEQ ID NO:1多肽的多核苷酸序列、它的互补链或其亚序列杂交的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中,本发明的突变多肽由与编码SEQ ID NO:1.的多肽的多核苷酸序列具有至少70%的同一性的多核苷酸序列编码。
在一些实施方案中,本发明提供新异的多肽,其由在高度严格的条件下能与编码SEQ ID NO:2多肽的多核苷酸序列、它的互补链或其亚序列杂交的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中,本发明的突变多肽由与编码SEQ IDNO:2.的多肽的多核苷酸序列具有至少70%的同一性的多核苷酸序列编码。
在一些实施方案中,本发明提供突变的多肽,其由在高度严格的条件下能与编码SEQ ID NO:8-21之一的多肽的多核苷酸序列、它的互补链或其亚序列杂交的多核苷酸序列编码。在其他实施方案,本发明的突变多肽由与编码SEQ ID NO:8-21之一的多肽的多核苷酸序列具有至少70%的同一性的多核苷酸序列编码。
在一些实施方案中,本发明提供新异的多肽,其由在高度严格的条件下能与编码SEQ ID NO:36多肽的多核苷酸序列、它的互补链或其亚序列杂交的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中,本发明的突变多肽由与编码SEQID NO:36的多肽的多核苷酸序列具有至少70%的同一性的一种多核苷酸序列编码。
生物学起源
非偶联神经胚素多肽二聚体可以被分离出来,再被偶联于一种或更多种聚合物,以获得本发明的聚合物偶联的神经胚素多肽二聚体。神经胚素多肽二聚体可从哺乳动物细胞中分离出,优选地从人细胞或从鼠源的细胞或从中国仓鼠卵巢来源的细胞分离。
神经营养活性
本发明的修饰的神经胚素多肽,包括截短的神经胚素多肽,可用于神经细胞或神经元细胞的适度的代谢、生长、分化或存活。具体地,修饰的神经胚素多肽可用于治疗或缓解有生命的动物如人类的疾病,所述疾病对神经营养试剂的活性有反应。这些治疗与方法如下详述。
包括神经胚素-聚合物偶联物的制药组分
本发明也提供包括本发明的修饰的神经胚素多肽二聚体的药物组分。
本发明的聚合物-神经胚素偶联物可以以本来的形式给药,也可以以可药用的酯类、盐类及其其它生理功能衍生物的形式给药。在这些药物配方及药剂配方中,聚合物偶联的神经胚素偶联物优选地与一种或多种可药用的载体及任选的任何其它治疗成分一起利用。
载体从与配方中其它成分相容及对其受体不适当地有害的意义上讲必须是可药用的。聚合物偶联的神经胚素以有效获得本文描述的所需药物效应或医学有利的效应的量,以及以适于获得所需生物可用体内剂量或浓度的量提供。
这些配方包括那些不仅适于胃肠外给药也适于非胃肠外给药以及具体的给药方式的配方,所述给药方式包括经口服、经直肠、经颊、局部、经鼻、经眼、经皮下、经肌肉内、经静脉内、经皮、经鞘内、经关节内、经动脉内、经蛛网膜下、经支气管、经淋巴、经阴道、经子宫内给药。适于气溶剂及局部及系统胃肠外给药的配方是优选的。
当聚合物偶联的神经胚素用于包括水溶液的配方中时,这种配方可方便地通过口服、经气管或经胃肠外给药。当聚合物偶联的神经胚素在应用于液体混悬液配方中或以粉末形式用于生物相容的载体配方时,这种配方可方便地通过口服、经直肠或经气管给药。可选地,它可经鼻或经气管给药,其经由载气中粉末的雾化,形成粉末的气体分散相,病人从包括合适的喷雾器装置的呼吸回路中吸入所述粉末。
包括本发明蛋白的配方可方便的以单位剂量的形式给出,以及可通过药剂学领域熟知的任何方法制备。这些方法通常包括将活性成分与构成一种或更多种辅助成分的载体结合这一步。
通常,这些配方通过均匀地密切地将活性成分与液相载体联合和/或与精确分开的固相载体联合,然后如果需要,将产物加工成所需配方的剂量形式制备而得。
本发明适于口服给药的配方可以以离散的单位给出,诸如胶囊、扁囊剂、片剂或锭剂,每一种包括预定量的粉末或颗粒形式活性成分;或以在水溶液或非水溶液诸如浆剂、酏剂、乳剂及饮剂(draught)中的混悬液形式给出。
适于胃肠外给药的配方方便地包括活性偶联物的无菌含水制备物,其优选地与受者的血液等渗(如,生理盐水溶液)。这些配方可包括被设计使得所述化合物针对血液成分或一种或多种器官的混悬剂、增稠剂、或其它微颗粒系统。这些配方可以单位剂量或多剂量形式给出。
鼻喷雾配方包括与防腐剂及等渗剂偶联的活性偶联物的纯化的水溶液。这些配方优选地被调节为与鼻腔粘膜相容的PH值与等渗状态。
直肠给药配方可与合适的载体诸如可可脂、氢化脂肪或氢化脂肪酸一起以栓剂的形式给出。眼部配方诸如滴眼剂可通过与鼻喷雾相似的方法制备,除了PH值与等渗因素优选地被调适到与眼部相配。
局部配方包括溶解或悬浮于一种或更多种介质中的本发明的偶联物,诸如矿物油、石油、多羟基乙醇或用于局部药物配方的其它基质。
除了前述的成分外,本发明的配方可进一步包括从稀释剂、缓冲液、调味剂、崩解剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等等中选出的一种或多种辅助成分。上述考虑也适用于本发明的神经胚素融合蛋白(如,神经胚素-人血清白蛋白融合蛋白)。
相应地,本发明包括提供适宜的融合蛋白,用于体外稳定溶液中的聚合物偶联的神经胚素偶联物,其可作为本发明优选的例证应用。融合蛋白可用于例如增强聚合物偶联的神经胚素多肽对酶降解的抵抗力,以及提供改善保质期、室温稳定性等等的方法。应当明白上述考虑也适用于本发明的神经胚素-血清白蛋白融合蛋白(如,人神经胚素-人血清白蛋白融合蛋白)。
治疗方法
本发明的组合物可用于治疗或缓解哺乳动物灵长类包括人类中的疾病,例如,所述疾病对神经营养剂的活性敏感。
本发明的组合物可经注射、种植或摄入的药物组合物直接用于治疗对神经胚素多肽有反应的病理过程。这些组合物可用于缓解活动物体包括人中的疾病,所述疾病对神经营养剂的活性有反应。该疾病可具体是由创伤、外科手术、局部缺血、感染、代谢疾病、营养缺陷、恶性肿瘤或有毒试剂以及遗传或特发性过程造成的神经系统的破坏。
这种破坏可具体地发生于感觉神经元或视网膜神经节细胞,包括背根神经节或任何下述组织中的神经元:膝状神经节(geniculate)、岩神经节和结状神经节(petrosal and nodosalganglia);第八脑神经的前庭听觉复合物(thevestibuloacoustic complex of the eigthth cranial nerve)、三叉神经节上下颌叶的腹外侧极(the ventrolateral pole of the maxillomandibular lobe of the trigeminalganglion)以及中脑的三叉神经核(the mesencephalic trigeminal nucleus)。
本发明这种方法的一些实施方案中,所述疾病是涉及受损及受创伤的神经元的神经变性疾病,诸如外周神经的创伤性损害、延髓及/或脊髓、大脑缺血性神经元损害、神经病变,具体为外周神经病变、外周神经创伤或损伤、缺血性中风、急性脑损伤、急性脊髓损伤、神经系统肿瘤、多发性硬化、暴露于神经毒素,代谢性疾病诸如糖尿病、肾功能不全以及由传染原引起的损害,神经变性疾病包括阿尔兹海默病(Alzhimer’s disease)、亨廷顿舞蹈病(Huntington’s disease)、帕金森病(Parkinson’s disease)、Parkinson-Plus综合征、进行性核上性麻痹(progressive Supranuclear Palsy)(斯-理-奥综合征(Steele-Richardson-Olszewski syndrome))、橄榄体脑桥小脑萎缩(Olivopontocerebellar Atrophy)(OPCA)、夏-德综合征(Shy-DragerSyndrome)(多系统萎缩症)、Guamanian帕金森痴呆复征(Guammanianparkinsonism dementia complex)、肌萎缩性脊髓侧索硬化(amyotrophic lateralsclerosis)或任何其它先天的或神经变性疾病,及痴呆相关的记忆损害。
在一些实施方案中,能治疗感觉及/或自主系统神经元。具体地,能治疗痛觉感受性(norciceptive)及机械刺激感受性(mechanoreceptive)神经元,更具体地为A-δ纤维、C-纤维、A-β纤维神经元。此外,能治疗自主神经系统的交感及副交感神经元。
在一些实施方案中,能治疗运动神经元疾病诸如肌萎缩性脊髓侧索硬化(″ALS″)及脊髓性肌萎缩。在其它实施方案,本发明的神经胚素分子可用于增强创伤或损伤后的神经恢复。可选地,或此外,利用含有聚合物偶联的神经胚素多肽或突变的神经胚素多肽的融合物或偶联物的基质的神经导向通道(nerve guidance channel)可用于本文描述的方法。这些神经导向通道在如美国专利5,834,029中公开。
在一些实施方案中,本文公开的组合物(及组成相同的药物组合物)用于治疗外周神经病。可用本发明的分子治疗的外周神经病包括创伤诱导的神经病,如那些由物理(physical)损伤或疾病状态、对脑的物理损伤、对脊髓的物理损伤、中风相关的脑损伤、神经变性相关的神经疾病引起的神经病。本文也包括那些继发于感染、毒素暴露及药物暴露的神经病。本文还进一步包括那些继发于系统性或代谢性疾病的神经病。例如,本文公开的组合物也用于治疗化疗诱导的神经病(诸如那些由于化疗药如紫杉醇、顺铂的递送引起的)、毒素诱导的神经病、药物诱导的神经病、维生素缺乏诱导的神经病、特发性神经病、糖尿病性神经病以及疱疹后神经痛。见,如美国专利5,496,804及5,916,555。
根据本发明可以治疗的其它疾病可以是单发神经病变(mono-neuropathy)、单发多路神经病变(mono-multiplex neuropathy)及多发性神经病(poly-neuropathy),包括轴突及脱髓鞘性神经病变。
在一些实施方案中,本发明的组合物(及组成相同的药物组合物)用于眼部各种病症的治疗,包括黄斑变性(macular degeneration)、色素性视网膜炎(tetinitis pigmentosa)、青光眼(glaucoma)及相似的疾病导致的患者的光感受器丢失。
方法及药物组合物
本发明提供治疗神经性疼痛、触觉异常性疼痛、减轻神经病变伴发的疼痛敏感性丧失的方法。本方法利用聚合物偶联的神经胚素多肽二聚体,包括包含生物活性全长的神经胚素多肽或生物活性截短的神经胚素多肽的二聚体。此外,本发明提供包含悬浮的、溶解的或分散在可药用的载体中的聚合物偶联的神经胚素多肽二聚体的药物组合物。
神经性疼痛的治疗
在一个实施方案,本发明包括一种治疗受治疗者中神经性疼痛的方法,其包含给予受治疗者有效量的聚合物偶联的神经胚素多肽二聚体。在一些实施方案中,本发明包括一种治疗受治疗者中神经性疼痛的方法,其包含给予受治疗者药物有效量的聚合物偶联的神经胚素多肽二聚体,其包含截短的野生型或突变型神经胚素多肽,其包括如SEQ ID NO:1、2、6-21及36中至少一种或其突变形式,所述二聚体可或单独给药,或同时给予受试者有效量的神经胚素多肽和有效量的止痛诱导型化合物,该止痛-诱导型化合物选自类鸦片物质(opioid)、抗心律不齐药、局部镇痛药、局部麻醉药、抗惊厥药(anticonvulsant)、抗抑郁药(antidepressant)、皮质激素(corticosteroid)及非甾体抗炎药(NSAIDS)组成的组中。在一个优选实施方案中,止痛诱导型化合物是抗惊厥药。在另外一个优选实施方案中,所述止痛诱导型化合物是加巴喷丁(gabapentin)(1-氨甲基)乙酸环己烷)(1-aminomethyl)cyclohexane acetic acid)或普加巴林(pregabalin)(S-(+)-4-氨基-3-(2-甲基丙基)丁酸)。
本发明的神经胚素多肽及核酸(及包含本文描述的聚合物偶联的神经胚素多肽二聚体的药物组合物)被用于治疗外周神经病相关的疼痛。可根据本发明治疗的外周神经病包括创伤诱导的神经病,如那些由物理(physical)损伤或疾病状态、对脑的物理损伤、对脊髓的物理损伤、中风相关的脑部损伤、神经变性相关的神经疾病引起的神经病。
本发明也提供对以下疾病的治疗:化疗诱导的神经病(诸如那些由于给予化疗药如紫杉醇、顺铂引起的神经病)、毒素诱导的神经病、药物诱导的神经病、病原诱导(如,病毒诱导的)的神经病、维生素缺乏诱导的神经病、特发性神经病、糖尿病性神经病。见如美国专利5,496,804及5,916,555,通过引用将每篇文献并入本文。本发明还进一步用本发明的神经胚素核苷酸及多肽来治疗单发神经病变、单发多路神经病变及多发性神经病,包括轴突及脱髓鞘神经病变。
神经性疼痛可与许多外周神经病相关,包括(a)创伤诱导的神经病,(b)化疗诱导的神经病,(c)毒素诱导的神经病(包括但不限于酒精中毒、维生素B6中毒、六碳中毒(hexacarbon)、胺碘酮(amiodarone)、氯霉素(chloramphenicol)、双硫仑(disulfiram)、异烟肼(isoniazide)、金、锂、metronidazole、醚醇硝唑(misonidazole)、呋喃旦啶(nitrofurantoin)),(d)药物诱导的神经病,包括治疗性药物诱导的神经性疼痛(诸如由抗癌药引起的,所述抗癌药具体地选自紫杉醇(taxol)、泰索帝(taxotere)、顺铂(cisplatin)、噻氨酯哒唑(nocodazole)、长春新碱(vincristine)、长春酰胺(vindestine)及长春碱(vinblastin)组成的组中;以及诸如由抗病毒剂引起的,所述抗病毒剂具体地选自ddI、DDC、d4T、膦甲酸(foscarnet)、氨苯砜(dapsone)、甲硝唑(metronidazole)及异烟肼(isoniazid)组成的组)、(e)维生素缺乏诱导的神经病(包括但不限于维生素B12缺乏、维生素B6缺乏及维生素E缺乏)、(f)特发性神经病、(g)糖尿病性神经病、(h)病原诱导的神经损伤、(i)炎症诱导的神经损伤、(j)神经变性、(k)遗传性神经病(包括但不限于弗里德赖希共济失调(Friedreich’s ataxia)、家族性淀粉样多神经病(familial amyloidpolyneuropathy)、丹吉尔病(Tangier disease)、法布里病(Fabry disease))、(l)代谢性疾病(包括但不限于肾功能不全及甲状腺功能减退)、(m)传染性及病毒性神经病(包括但不限于麻风病、莱姆病(Lyme disease)相关的神经性疼痛,病毒感染相关的神经性疼痛、所述病毒具体选自疱疹病毒(herpes virus)(例如导致疱疹后神经痛的带状疱疹(herpes zoster))、人免疫缺陷病毒(HIV)及乳头瘤病毒组成的组)、(n)自身免疫性神经病(包括但不限于格林-巴利综合征(Guallain-Barre syndrome)、慢性炎性脱髓鞘性多神经病(chronic inflammatoryde-myelinating polyneuropathy)、意义未定的单克隆丙种球蛋白病(monoclonalgammopathy of undetermined significance)以及多发性神经病)、(o)三叉神经痛及陷压综合征(trigeminal neuralgia and entrapment syndrome)(包括但不限于Carpel tunnel)以及(p)其它神经性疼痛综合征,包括创伤后神经痛、假性肢痛(phantom limb pain)、多发性硬化疼痛(multiple sclerosis pain)、复合区域性疼痛综合征(complex regional pain syndrome)(包括但不限于交感反射性营养不良(reflex sympathetic dystrophy)、灼痛(causalgia))、肿瘤相关性疼痛(neoplasia-associated pain)、脉管炎/血管病性神经病变(vasculitic/angoipathicneuropathy)以及坐骨神经痛(sciatica)。神经性疼痛表现为异常性疼痛、痛觉过敏、自发性疼痛或幻痛。
2.触觉异常性疼痛的治疗
术语“触觉异常性疼痛(tactile allodynia)”通常指受试者中由皮肤的正常的无害刺激(如,接触)激发疼痛的疾病。本发明包括治疗受试者触觉异常性疼痛的方法。
在一些实施方案中,治疗触觉异常性疼痛是通过单独给予受试者药物有效量的聚合物偶联的突变型神经胚素多肽二聚体进行的。
在一个相关的实施方案中,本发明包括治疗受试者中触觉异常性疼痛的方法,或者通过给予受试者有效量的聚合物偶联的的神经胚素多肽二聚体,该二聚体包含截短的野生型或突变型神经胚素多肽,其包括如SEQ IDNO:1、2、6-21及36中至少一种或其突变形式,所述二聚体可或单独给药,或同时给予受试者有效量的神经胚素多肽和有效量的止痛诱导型化合物,该化合物选自类鸦片物质、抗心律不齐药、局部镇痛药、局部麻醉药、抗惊厥药(anticonvulsant)、抗抑郁药(antidepressant)、皮质激素(corticosteroid)及非甾体抗炎药(NSAIDS)组成的组。在一个优选实施方案中,所述止痛诱导型化合物是抗惊厥剂。在另外一个优选实施方案,止痛诱导型化合物是加巴喷丁((1-氨甲基)乙酸环己烷)或普加巴林(pregabalin)(S-(+)-4-氨基-3-(2-甲基丙基)丁酸)。
在一些实施方案中,聚合物偶联的突变型神经胚素多肽二聚体与一种治疗剂联合给予,所述治疗剂包括但不限于抗癌药或抗病毒剂。所述抗癌药包括但不限于紫杉醇、泰索帝、顺铂、噻氨酯哒唑、长春新碱、长春酰胺及长春碱。抗病毒剂包括但不限于ddI、DDC、d4T、膦甲酸、氨苯砜、甲硝唑及异烟肼。
3.减轻疼痛敏感性丧失的治疗
本发明包括可减轻患神经病变的受试者的疼痛敏感性丧失的方法。在一个优选实施方案中,所述神经病变是糖尿病性神经病变。在一个优选实施方案中,疼痛敏感性丧失是热疼痛敏感性的丧失。本发明涉及预防性及治疗性治疗。
在预防性治疗中,将所述聚合物偶联的突变型神经胚素多肽二聚体给予患有疼痛敏感性丧失的受试者;这些受试者被预期为具有早期的神经病变的受试者。在这种情况下用神经胚素治疗可用来预防性地治疗有患病风险(at-risk)的受试者。
在治病性治疗中,将所述聚合物偶联的突变型神经胚素多肽二聚体给予患有疼痛敏感性丧失的受试者;这些受试者被预期为具有晚期的神经病变的受试者。在这种情况下,用聚合物偶联的突变型神经胚素多肽二聚体治疗可用于恢复受试者中适宜的疼痛敏感性。
4.病毒感染及病毒相关神经病变的治疗
涉及传染性及病毒性神经病变的预防疗法。预防处理是在病毒感染确定后神经性疼痛发作前。治疗期间,给予聚合物偶联的突变型神经胚素多肽二聚体以预防神经性疼痛的出现,该神经性疼痛包括但不限于麻风病、莱姆病相关的神经性疼痛,病毒感染相关的神经性疼痛、所述病毒具体选自疱疹病毒(例如导致疱疹后神经痛的带状疱疹)、人免疫缺陷病毒(HIV)及乳头瘤病毒组成的组。在一个可选的实施方案中,如果神经性疼痛出现,可给予聚合物偶联的突变型神经胚素多肽二聚体来减轻神经性疼痛的严重程度。
急性病毒感染的症状经常包括皮疹的出现。其它症状包括,例如,身体受影响区中持续性疼痛的发生,这是带状疱疹(shingle)感染的常见并发症。疱疹后神经痛可持续一个月或更长时间,并可以在任何疹样症状消失后数个月出现。
5.疼痛性糖尿病神经病变的治疗
涉及疼痛性糖尿病神经病变的预防疗法。糖尿病神经病变的预防疗法开始于初次诊断糖尿病或糖尿病相关症状的确定后、神经性疼痛发作前。疼痛性糖尿病神经病变的预防疗法也可以开始于确定受试者有患糖尿病或糖尿病相关症状的危险时。治疗期间,给予聚合物偶联的突变型神经胚素多肽二聚体以预防神经性疼痛的出现。在一个可选的实施方案,给予聚合物偶联的突变型神经胚素多肽二聚体可减轻已出现的神经性疼痛的严重程度。
6.神经系统疾病
此外,本发明提供治疗或预防受试者(诸如人)中的神经系统疾病的方法,所述方法通过给予需要的受者其治疗有效量的聚合物偶联的神经胚素多肽,包含神经胚素多肽的组合物或偶联于聚合物的突变型神经胚素多肽,或包括以下物质的复合体:稳定的水溶性偶联的神经胚素多肽,或包含神经胚素多肽或偶联于聚烯烃组分(polyalkylene moiety)诸如PEG的突变型神经胚素多肽的突变型神经胚素多肽复合体。
神经系统疾病可以是外周神经系统疾病,诸如外周神经病或神经性疼痛综合征。人类是优选的治疗受试者。
本发明的聚合物偶联的神经胚素多肽二聚体可用于治疗神经元中的缺陷,无限制地包括受损害的神经元及受外伤的神经元。经受外伤的外周神经元包括但不限于延髓或脊髓的神经。本发明的聚合物偶联的神经胚素多肽二聚体可用于治疗神经变性疾病,如,大脑缺血性神经元损伤;神经病,如,外周神经病、阿尔兹海默病、亨廷顿舞蹈病、帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)。这种神经胚素多肽二聚体可用于治疗被损害的记忆,如痴呆相关的记忆损害。
疾病的其它实例是外周神经系统、延髓或脊髓的疾病及创伤诱导的神经病,化疗诱导的神经病,毒素诱导的神经病,药物诱导的神经病,维生素缺乏诱导的神经病;特发性神经病;以及糖尿病性神经病,与以下疾病相关的神经性疼痛:毒素诱导的神经损害,病原诱导的神经损害,炎症诱导的神经损害或神经变性。本发明的神经胚素多肽二聚体另外可用于治疗神经性疼痛、治疗触觉异常性疼痛、治疗减缓神经病变相关的疼痛敏感性丧失。
7.剂量
上述方法涉及优选系统性地给予受者包括可为截短的或非截短的、聚合物偶联的突变神经胚素多肽二聚体的配方,其剂量为每剂从0.01μg/kg到1000μg/kg受者体重。优选地,所述剂量为每剂1μg/kg到100μg/kg受者体重。更优选地所述剂量为每剂1μg/kg到30μg/kg受者体重,如每剂3μg/kg到10μg/kg受者体重。本发明配方的治疗有效量可以在本领域技术人员无需不适当的试验就可确知的给药方案中给予需要其的受试者。
8.递送
用于上述方法中的多肽二聚体可通过任何合适的递送系统给药,优选地选自经静脉内递送、经肌肉内递送、经肺内递送、经皮下递送及经腹膜内递送,最优选地经由经肌肉内递送、经静脉内递送或经皮下递送。用于上述方法中的神经胚素多肽也可通过经鞘膜内递送给药。
聚合物偶联的神经胚素多肽二聚体的给药可以是,如系统或局部给药。这些配方包括这样的配方,其不仅适于胃肠外给药也适于非胃肠外给药以及具体的给药方式包括口服、经直肠、经颊、局部、经鼻、经眼、经皮下、经肌肉内、经静脉内、经皮、经鞘内、经关节内、经动脉内、经蛛网膜下、经支气管、经淋巴、经阴道、经子宫内给药。适于气溶胶以及局部及系统胃肠外给药的配方也包括在内。优选的配方适于经皮下、经肌肉内或经静脉内给药。
9.方案
在一些实施方案中,本发明的多肽二聚体的给药频率为每星期三次将配方给予受试者、持续两个星期。为了优化治疗效果,聚合物偶联的神经胚素多肽二聚体以不同的给药方案首次给药。单位剂量及方案依赖于包括,如所免疫的哺乳动物的种类、其免疫状态、哺乳动物的体重等因素。通常,组织中的蛋白水平可作为临床试验程序的一部分用合适的筛选试验监测,例如用来测定给定的治疗方案的有效性。
本发明的聚合物偶联的突变型神经胚素多肽二聚体的用药频率在医生的技能和临床判断之内。通常,给药方案是由可确定最佳给药参数的临床试验确定的。然而,医生可根据受试者的年龄、健康状况、体重、性别及医学状况可变化这些给药方案。给药频率也可在神经病的急性治疗与慢性治疗之间变化。此外,用药频率可根据所述治疗是预防性的还是治疗性的而变化。
本发明在下述非限性的实施例中进一步描述。
实施例
实施例1:氨基末端PEG化的神经胚素的生物利用度
如果经静脉给药大鼠,可观察到CHO细胞及大肠杆菌(E.coli)衍生的重组神经胚素可很快从循环中清除。皮下给药后血清中的蛋白低于检测阈值。为提高神经胚素的生物利用度,构建了突变的神经胚素PEG化的形式。
由于神经胚素序列中没有赖氨酸存在,胺特异性PEG化化学将在野生型神经胚素多肽的氨基末端产生PEG化。因此,对每一神经胚素二聚体,应当附着两个PEG组分。相应地,PEG形式通过胺特异性化学首先直接靶向氨基末端。令人惊讶的是,大肠杆菌表达的野生型神经胚素(甚至附着有两种20kDa PEG)的PEG化,对半衰期几乎没有益处,表明基于清除途径的机制超过期望通过PEG化实现的半衰期延长作用。
实施例2:构建PEG化的突变型神经胚素(N95K)
随后检测在内部氨基酸残基PEG化的突变型神经胚素形式的生物利用度。一系列取代了位置14、39、68、及95(按SEQ ID NO:1所示编号)的天然存在的残基的四种突变体被设计用于在所述序列的选定位点插入赖氨酸。这些赖氨酸可为PEG附着提供可选位点。用GDNF的晶体结构(Nat.Struct.Biol.4:435-8,1997)选出这些位点作为框架来鉴别表面残基。Persephin/神经胚素嵌合体诱变研究(J.Biol.Chem.275:3412-20,2000)被用于鉴别应当被避免的结构的功能上重要的区域。
为在大肠杆菌中表达野生型神经胚素基因,同基因(syngene)用GC含量更低且优选的大肠杆菌密码子构建。将所述同基因克隆入两种载体pET19b及pMJB164,后者为pET19b的衍生物。在pET19b中,编码神经胚素的成熟结构域(NBN113)的序列直接融合于起始蛋氨酸。在pMJB164中,神经胚素的成熟结构域融合于组氨酸标记(即10个组氨酸),并通过肠激酶切割位点(SEQ ID NO:35和36)与组氨酸标记分离。起始蛋氨酸在组氨酸标记之前。
表5 标记的野生型神经胚素核苷酸和多肽序列
His-标记的NBN
1 ATG GGC CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAC TCG AGC GGC 45
1 M G H H H H H H H H H H S S G 15
46 CAT ATC GAC GAC GAC GAC AAG GCT GGA GGA CCG GGA TCT CGT GCT 90
16 H I D D D D K A G G P G S R A 30
91 CGT GCA GCA GGA GCA CGT GGC TGT CGT CTG CGT TCT CAA CTA GTG 135
31 R A A G A R G C R L R S Q L V 45
136 CCG GTG CGT GCA CTC GGA CTG GGA CAC CGT TCC GAC GAA CTA GTA 180
46 P V R A L G L G H R S D E L V 60
181 CGT TTT CGT TTT TGT TCA GGA TCT TGT CGT CGT GCA CGT TCT CCG 225
61 R F R F C S G S C R R A R S P 75
226 CAT GAT CTA TCT CTA GCA TCT CTA CTA GGA GCC GGA GCA CTA AGA 270
76 H D L S L A S L L G A G A L R 90
271 CCG CCG CCG GGA TCT AGA CCT GTA TCT CAA CCT TGT TGT AGA CCT 315
91 P P P G S R P V S Q P C C R P 105
316 ACT AGA TAC GAA GCA GTA TCT TTC ATG GAC GTA AAC TCT ACA T3G 360
106 T R Y E A V S F M D V N S T W 120
361 AGA ACC GTA GAT AGA CTA TCT GCA ACC GCA TGT GGC TGT CTA GGA 405
121 R T V D R L S A T A C G C L G 135
406 TGA TAA TAG 414 (SEQ ID NO:35)
136 * * * (SEQ ID NO:36)
突变中有两种(R39及R68)靶向于基于表面正电荷的分布可能代表肝素结合位点的区域。这种位点可能有利于蛋白的快速清除。第三个位点靶向N95,N95为野生型神经胚素中的天然的糖基化位点。该位点天然地被复合糖结构修饰。因此,预期在该位点用PEG修饰不影响功能。第四个位点(R14)在一种不为任何其它修饰覆盖的区域中选出。选取由赖氨酸取代95位天冬酰胺残基的突变体为(″N95K突变体″),用于本文公开的研究。
构建包含大鼠神经胚素多肽的野生型序列中的一种或多种改变的四种不同的突变型大鼠神经胚素。这些突变的神经胚素包含单个氨基酸取代:R14K、R68K、R39K或N95K。表1A以粗体字确定这些示例性的点突变。在″X1N1X2″命名法中,X1指野生型神经胚素多肽的氨基酸,N1指序列中X1氨基酸的位置编号,如依据SEQ ID NO:1编号,X2指取代指定的位置号N1处的野生型氨基酸的氨基酸。
为构建大鼠N95K神经胚素突变,在pCMB020上实施定点诱变,pCMB020为编码野生型大鼠神经胚素的质粒。野生型大鼠神经胚素的核酸及由其编码的多肽的氨基酸序列如下所示:
表6 野生型大鼠NBN序列
1 ATGGAACTGG GACTTGGAGA GCCTACTGCA TTGTCCCACT GCCTCCGGCC
51 TAGGTGGCAA CCAGCCTTGT GGCCAACCCT AGCTGCTCTA GCCCTGCTGA
101 GCAGCGTCAC AGAAGCTTCC CTGGACCCAA TGTCCCGCAG CCCCGCCTCT
151 CGCGATGTTC CCTCGCCGGT CCTGGCGCCC CCAACAGACT ACCTACCTGG
201 GGGACACACC GCACATCTGT GCAGCGAAAG AGCCCTGCGA CCACCGCCGC
251 AGTCTCCTCA GCCCGCACCC CCACCACCGG GTCCCGCGCT CCAGTCTCCT
301 CCCGCTGCGC TCCGCGGGGC ACGCGCGGCG CGTGCAGGAA CCCGGAGCAG
351 CCGCGCACGG GCTACAGATG CGCGCGGCTG CCGCCTGCGC TCACAGCTGG
401 TGCCGGTGAG CGCTCTCGGC CTGGGCCACA GCTCCGACGA GCTGATACGT
451 TTCCGCTTCT GCAGCGGTTC GTGCCGCCGA GCACGCTCCC CGCACGATCT
501 CAGCCTGGCC AGCCTGCTGG GCGCCGGGGC CCTGCGGTCT CCTCCCGGGT
551 CCCGGCCGAT CAGCCAGCCC TGTTGCCGGC CCACTCGCTA TGAGGCAGTC
601 TCCTTCATGG ACGTGAACAG CACCTGGAGA ACCGTGGACC ATCTCTCCGC
651 CACCGCCTGC GGCTGTCTGG GCTGA(SEQ ID NO:25)
1 MELGLGEPTA LSHCLRPRWQ PALWPTLAAL ALLSSVTEAS LDPMSRSPAS
51 RDVPSPVLAP PTDYLPGGHT AHLCSERALR PPPQSPQPAP PPPGPALQSP
101 PAALRGARAA RAGTRSSRAR ATDARGCRLR SQLVPVSALG LGHSSDELIR
151 FRFCSGSCRR ARSPHDLSLA SLLGAGALRS PPGSRPISQP CCRPTRYEAV
201 SFMDVNSTWR TVDHLSATAC GCLG*(SEQ ID NO:26)
用寡核苷酸KD3-210及KD3-211诱变pCM020导致质粒pCMB027的形成。
KD3-210 5′-GTATCTTTCATGGACGTTATGTTCTACATGGAGAACC-3′
(SEQ ID NO:27)
KD3-211
5′-GGTTCTCCATGTAGAACATACGTCCATGAAAGATAC-3′(SEQ ID NO:28)
在pCMB027中,编码95位天冬酰胺的密码子被编码赖氨酸的密码子代替。
A R14K突变的神经胚素通过在pCMB020神经胚素编码序列中用编码赖氨酸的密码子代替编码14位精氨酸的密码子而形成。用寡核苷酸KD3-254及KD3-255在pCMB020进行定点诱变:
KD3-254 5′-GCTCGTGCAACGGATGCAAAAGGCTGTCGTCTGCG-3′
(SEQ ID NO:29)
KD3-255 5′-CGCAGACGACAGCCTTTTGCATCCGTTGCACGAGC-3′
(SEQ ID NO:30)
合成的构建体命名为pCMB029。
R68K突变的神经胚素通过在pCMB020神经胚素编码序列中用编码赖氨酸的密码子代替编码68位精氨酸的密码子而形成。用寡核苷酸KD3-258及KD3-259在pCMB020进行定点诱变:
KD3-258 5′-GGAGCCGGAGCACTAAAATCTCCCCCGGGATCTAGACC-3′(SEQ ID NO:31)
KD3-259 5′-GGTCTAGATCCCGGGGGAGATTTTAGTGCTCCGGCTCC-3′(SEQ ID NO:32)
合成的构建体命名为pCMB030。
R39K突变的神经胚素通过在pCMB020神经胚素编码序列中用赖氨酸代替氨基酸39位的精氨酸而形成。用寡核苷酸KD3-256及KD3-257在pCMB020进行定点诱变:
KD3-256 5′-GACGAATTAATTAAGTTTCGTTTTTGTTCAGG-3′(SEQ ID NO:33)
KD3-257 5′-CCTGAACAAAAACGAAACTTAATTAATTCGTC-3′(SEQ ID NO:34)
大肠杆菌中突变的神经胚素的表达及定性
为表达及纯化,编码大鼠神经胚素N95K多肽的质粒在大肠杆菌中被表达为His标记的融合蛋白,该融合蛋白具有在紧邻成熟的113个氨基酸的神经胚素序列的起始位置的肠激酶切割位点。大肠杆菌在500L发酵罐中生长,并为其提供冻存的细胞糊。大肠杆菌细胞在APV Gaulin细胞压碎器(press)中裂解,大鼠神经胚素N95K从不溶性经洗泡沉淀部分中回收。
N95K突变的神经胚素用盐酸胍从沉淀中提取、再重叠、用肠激酶除去组氨酸标记(见实施例5)。然后使产物在Ni NTA琼脂糖(Qiagen)及BakerbondWP CBX阳离子交换树脂上层析。
组氨酸标记的产物的肠激酶处理导致在成熟序列中精氨酸7位点处对蛋白的异常切割。合成的des 1-7神经胚素产物(NBN106-N95K)在KIRAELISA中可完全活化,在对胍-诱导的变性敏感方面从结构上与成熟型不能区别,因此可用于后继的工作。
大鼠突变型神经胚素NBN106-N95K用分子量10,000Da的甲氧基聚(乙二醇)-琥珀琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA-PEG)作为反应物,以平均每个神经胚素分子3.3PEG组分进行PEG化。对产生的PEG化产物进行多方面的定性,包括通过以下方法进行分析:SDS-PAGE、大小排阻层析法(SEC)、逆相HPLC、基质辅助激光解析/离子化质谱法(matrix-assisted laserdesorption/ionization time-of-flight)(MALD/IMS)、肽链图谱法、KIRA ELISA中的活性评估及内毒素含量的确定。用SDS-PAGE及SEC测定的神经胚素N95K产物在PEG化前的纯度大于95%。神经胚素N95K产物在非还原条件下作为二聚体迁移,与其预测的结构一致。在PEG化后,产生的产物由一系列修饰的加合物组成,这些加合物包含每分子2个PEG、占产物的5%;每分子3个PEG、占产物的60%;每分子4个PEG、占产物的30%及一些更高分子量的较次要的形式。在PEG化的样品中没有聚集物的证据。产物中未修饰的神经胚素的残基水平低于定量的限(limits of quantitation)。该物质中的内毒素含量常规地低于1EU/mg。KIRA ELISA中PEG化的神经胚素的比活性是10nM。该PEG化的产物被配制成1.1mg/mL、PBS中、pH 6.5。这种物质(与野生型神经胚素(NBN113)的效力相似),可以作为贮藏于-70℃的冷冻液体供给。
R14K、R39K及R68K突变型神经胚素多肽在大肠杆菌中表达,并经过与如上对NBN106-N95K神经胚素所述相同的方法进行纯化、PEG化及功能的评定。
PEG化的突变型神经胚素NBN106-N95K的制备
大肠杆菌中产生,并贮藏于4℃、5mM磷酸钠pH 6.5、100mM NaCl中的230mL再折叠的大鼠N95K突变神经胚素(2.6mg/mL)用77mL水、14.4mL 1M HEPES pH7.5及2.8g(终浓度10mg/mL)PEG SPA 10,000Da(Shearwater Polymers,Inc.)稀释。该样品在室温暗处保温4小时,然后用5mM咪唑处理、过滤并于4℃贮藏过夜。这种产物分两批产生,一批含有130MLN95K部分(bulk)而另一批含有100ML所述部分。PEG化的神经胚素在Fractogel EMD S03-(M)(EM Industries)从反应混合物中纯化。这种柱在室温下运行。所有的缓冲液制备为无致热原的。将氯化钠加入反应混合物至终浓度87mM,并将样品上样于45mL pH 6.5,80mM NaCl Fractogel柱(5cm内径)。
用一个柱体积的5mM磷酸钠pH 6.5,80mM NaCl洗柱,然后用三倍单个柱体积的含有50mM NaCl的5mM磷酸钠的等分试样洗柱。将树脂转移入2.5cm直径柱内,用六个10ML含有5mM磷酸钠pH 6.5、400mM NaCl的步骤(six ten mL steps containing 5mM sodium phosphate pH6.5)、三个含有500mL NaCl步骤(three steps containg 500mL NaCl)、和六个含有600mMNaCl的步骤(six steps containing 600mM NaCl)从柱上洗脱PEG化的神经胚素。用280nm的吸光度分析洗脱级分的蛋白含量,再用SDS-PAGE分析修饰的程度。收集所选的级分,用0.2μm的滤级过滤,并用水稀释至1.1mgPEG化的大鼠神经胚素/ML。在单独的批次中测定了内毒素水平后,收集它们并通过0.2μm膜再过滤。终物质被分装并贮藏于-70℃。
纯化的PEG化的突变型神经胚素NBN106-N95K的UV光谱
自纯样品获得PEG化的NBN N95K的UV光谱。对该样品一式三份的分析。PEG化的样本在275-277nm处显示最大的吸光度,247-249nm处显示最小的吸光度。这个结果与观察体中间的结果是一致的。PEG化的产物的蛋白浓度可从光谱中用吸光系数∑2800.1%=0.50估计。PEG化的神经胚素部分的蛋白浓度是1.1mg/mL。样品中不存在混浊,如缺乏320nm处的吸光度所证实。
用SDS-PAGE定性PEG化的突变型神经胚素NBN106-N95K
对含有3、1.5、0.75及0.3μg产物的PEG化神经胚素的等分试样在4-20%梯度凝胶(Owl)上进行SDS-PAGE。该凝胶用考马斯亮蓝R-250染色。分子量标记(GIBCO-BRL)被平行测定。
在非还原条件下,PEG化的突变型神经胚素NBN106-N95K的SDS-PAGE分析显示一系列对应每分子2、3、4及多于4个PEG修饰的条带。表观分子量98kDa的主要条带含有每分子3个PEG。在纯化的PEG化产物中,没有检测到非PEG化的神经胚素。附着有2、3及4个PEG的产物混合物的存在通过MALDI质谱分析可查证。含有2、3及4个PEG的产物的比率可通过密度计量学测定,并且分别被测定为占总量的7%、62%、30%。
用大小排阻层析法(size exclusion chromatography)表征PEG化的突变型神经胚素NBN106-N95K
将PEG化的突变型神经胚素NBN106-N95K置于分析型Superose 6HR1O/30FPLC柱上,用5mM MES pH 6.5,300mM NaCl作为流动相进行大小排阻层析法。以20mL/h走柱。监则洗脱级分在280nm的吸光度。PEG化的突变型神经胚素以单一峰监测洗脱,其表观分子量大约200kDa,与PEG大的流体体积(hydrodynamic volumn)相一致。没有观察到聚集物的迹象。在制备物中没有检测到游离神经胚素,其洗脱后的表观分子量约为30kDa。
用逆相HPLC分析PEG化的突变型神经胚素NBN106-N95K
将PEG化的突变型神经胚素NBN106-N95K置于Vydac C4(5μm 1*250mm)柱进行逆相HPLC。用从40%到60%B(缓冲液A:0.1%TFA、缓冲液B:75%乙腈/0.085%TFA)的60mm梯度展开柱子。监控柱子的流出液在214nm的吸光度,并收集级分用于后续分析。PEG化的NBN106-N95K通过在C4柱上进行逆相HPLC被分级成它的各种二(60.5mm)、三(63.3mm)及四(67.8mm)PEG化组分。峰值的相对强度提示组分的比率分别是5.4%、60.5%及30.1%。峰的鉴定通过MALDI-MS验证。产物中没有非PEG化NBN106-N95K(在5-15mm洗脱)的证据。
用质谱法分析PEG化的突变型神经胚素NBN106-N95K
PEG化的突变型神经胚素NBN106-N95K在C4Zip Tip上脱盐,并在用芥子酸作为基质的Voyager-DE(TM)STR(PerSeptive Biosystems)基质辅助激光解离/离子化飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪上、通过质谱法分析。在目标板上混合0.5μL纯化蛋白和0.5μL基质。PEG化的突变型神经胚素NBN106-N95K的质谱法显示三种加合物的单荷电(singly charged)及双荷电(doubly charged)形式。观察到的43803Da、54046Da及64438Da的分子量与每分子2、3及4个PEG修饰一致。
用肽图谱法(peptide mapping)分析PEG化的突变型神经胚素NBN106-N95K
PEG化反应的特异性用肽图谱法评估。PEG化神经胚素被分成二、三及四PEG化组分,其随后被还原、烷基化并在C4柱上用HPLC进一步分离成它们的单链组分。这些组分与作为对照的还原的、烷基化的、非PEG化NBN106-N95K用Asp-N蛋白酶消化,所得切割产物在Vydac C18(5μm,1*250mm)柱上用从0到60%B(缓冲液A:0.1%TFA,缓冲液B:75%乙腈/0.085%TFA)的60mm梯度通过逆相HPLC分级分离。监控柱流出液在214nm的吸光度。
大鼠神经胚素序列包含五个内部天冬氨酸,由此当用内蛋白酶(endoproteinase)Asp-N消化时,被期望为产生简单的切割剖图谱。大鼠N95K的Asp-N消化的所有峰值已由质谱法及/或Edman氨基末端测序法确定,因此肽图谱可作为一种简单的工具通过峰的存在或缺失检测修饰的位点。各种峰的鉴定在如下表7中总结。
表7
(M)monolostopic质量
*由于MALDI上包含蛋氨酸的肽的氧化。
由于神经胚素天然以同源二聚体的形式存在,大鼠突变的神经胚素NBN106-N95K产物含有四个PEG化的潜在位点,来自每一条链的两个氨基末端胺及改造到该构建体中的两个N95K位点。在二-PEG化的链的肽图谱中,只有含有具N95K突变的肽的峰可被PEG化修饰而改变。其他的峰不受PEG化修饰的影响。绘图数据因此表明PEG组分特异性附着在这种肽而不是任何其他被筛选的肽。第二潜在的附着位点氨基末端在只有三个氨基酸长并且在肽图谱上不能被检测到的肽上。据推断其它PEG附着存在于此位点。与这个概念相一致,大鼠突变神经胚素N95K的小部分是非截短的,并且含有成熟Ala-1序列。这种肽在30μm处被洗脱并且在得自非-PEG化的消化物(digest)的肽图谱中可见,但在PEG化的突变型神经胚素NBN106-N95K消化物中不存在。
实施例3.在激酶受体活化(KIRA)ELISA中评价内部PEG化的突变型神经胚素NBN106-N95K的效力
PEG化的突变型大鼠神经胚素的效力用c-Ret的神经胚素依赖的活化/磷酸化作为神经胚素活性的报道分子、在特异于磷酸化的RET存在的ELISA中测定。将NB41A3-mRL3细胞(表达Ret及GFRα3的贴壁性(adherent)大鼠神经瘤母细胞系)以每孔2*105个细胞铺板于24孔板中的补充了10%胎牛血清Dulbecco′s改良的Eagle培养基(DMEM)中,于37℃、5%CO2的条件下培养18h。
所述细胞用PBS洗涤,再用0.25mL DMEM中的神经胚素的连续稀释液在37℃、5%CO2的条件下处理10min。每个样品进行一式两份的分析。所述细胞用1mL PBS洗涤,4℃、用0.30mL 10mM Tris HCl、pH 8.0,0.5%乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P4),0.2%去氧胆酸钠,50mM NaF,0.1mM Na3VO4,1mM苯甲基磺酰基氟化物(phenylmethylsulfonyl fluoride)在轻摇细胞板的条件下裂解1h。裂解产物进一步通过反复吸液搅动,并将0.25mL样品转移入96孔ELISA板中,所述板已用5μg/mL 50mM pH 9.6碳酸盐缓冲液中的抗Ret mAb(AA.GE7.3)、在4℃包被18h,并用封闭液(20mM Tris HClpH 7.5、150mM NaCl、0.1%吐温20(TBST),其中含有1%正常鼠血清及3%牛血清白蛋白)在室温封闭1h。
室温保温2h后,用TBST洗孔六次。对磷酸化的Ret的检测是通过如下过程进行的:用封闭缓冲液中2g/mL辣根过氧化物酶偶联的抗磷酸酪氨酸(phosphotyrosine)4G10抗体、在室温保温所述孔2h,用TBST洗涤六次,并用显色检测试剂测量HRP在450nm的活性。测定用裂解产物处理或用裂解缓冲液处理的孔的吸光度值,并将背景校正的信号作为存在于活化混合物中的神经胚素的浓度函数作图。KIRA ELISA中PEG化的突变的神经胚素(3(4,)×10kDa PEG NBN106-N95K)的效力与野生型NBN113物质的效力(表8)不能被区别。两次冻融循环对效力没有影响,并且这种处理后样品的混浊度没有显著增加,表明样品可以可靠地被融化用于研究。在分别评估每分子具有三或四个10kDa PEG的产物的活性的研究中,具有三个PEG的加合物测具有完全的活性,而具有四个PEG的产物的效力减低(表8)。这些数据证明(3(4,)×10kDa PEG NBN106-N95K)与3×10kDa PEG NBN106-N95K对Ret活化的程度相同,并具有与非突变型(野生型)神经胚素NBN113相同的剂量依赖性。但是,尽管4×10kDa PEG NBN106-N95K与非突变型(野生型)神经胚素NBN113对Ret活化的程度相同,4×10kDa PEG NBN106-N95K活化Ret的效力大约比非突变型(野生型)神经胚素NBN113的效力低十倍。估计的EC50在表8中给出。
实施例4大鼠及小鼠中内部PEG化的突变型大鼠神经胚素NBN106-N95K的药物动力学研究
在大鼠及小鼠模型中检测各种PEG化及非PEG化的突变型神经胚素产物的药物动力学特性。
数据显示具有3.310000Da PEG的大鼠突变型神经胚素NBN106-N95K的PEG化产生对神经胚素的半衰期及生物利用率有显著影响。在以1mg/kg经静脉注射给药Sprague Dawley大鼠后,3000ng/mL PEG化的突变型神经胚素的峰值水平在7分钟后检测到,700ng/mL的水平在24h后检测到,200ng/mL在48h后检测到,100ng/mL在72h后检测到。非PEG化的突变型神经胚素N95K则相反,其以1mg/kg静脉注射给药后,在7分钟后检测到1500ng/mL的水平,但3h后所述水平就很快降至70ng/mL,7h后不能检测到。PEG化的影响在用PEG化的神经胚素经皮下给药处理的动物中更加显著。
1mg/kg皮下给药后,PEG化的神经胚素24h后在循环中的水平达最大值200ng/mL,并在三天研究期间持续保持这种水平。相反,对于给予非PEG化的突变型神经胚素的情况,在任何时间点没有观察到可检测的神经胚素。
PEG化的N95K样品的分析由于每分子包含2、3及4个PEG的加合物的存在而复杂化,每一种显示不同的PK图谱。在早期PK研究中,小鼠通过多种给药候选物及途径而被用于易化筛选。对小鼠的研究显示,候选物生物利用率有很大差异。然而,当在大鼠中评估3.310kDa PEG加合物时,发现它在大鼠中的生物利用率比小鼠中的生物利用率低。生物利用率的不同在经腹腔给药后更显著。7hr后小鼠中的水平达1600ng/mL,并在24hr后保持在400ng/mL。相反,大鼠中的水平在100ng/mL持续4-48hr。
两种令人吃惊的意外结果在PK研究中出现,所述结果总结于表8∶1)非糖基化的神经胚素的氨基末端氨基酸的PEG化不足以大量(substantially)增加血清暴露(serum exposure);并且2)神经胚素的氨基末端氨基酸的PEG化以及氨基酸95的修饰(PEG化或糖基化)一起足以大量增加血清接触。例如,糖基化的NBN104(CHO)在经皮下给药后没有可检测到的暴露;但是,糖基化的1×20kDa PEG NBN104(CHO)在皮下给药后显示高血清暴露。相似地,2×20kDa PEG NBN113在皮下给药后显示低度到中度的血清暴露;但是,糖基化的2×20kDa PEG NBN104(CHO)在皮下给药后显示高血清暴露。这些结果提示神经胚素的氨基末端氨基酸与聚合物的偶联与以及内部氨基酸(如95位氨基酸)的聚合物偶联或内部氨基酸(如95位)的糖基化在系统给药后导致大量增加的血清暴露。
为在STZ糖尿病大鼠神经病变模型中进行效力实验,野生型大鼠神经胚素及突变型神经胚素N95K都被再折叠并纯化至>95%。野生型神经胚素被配制或直接进行动物实验,而N95K被制备为用于利用10kDa PEG-SPA的PEG化。为实现再折叠及纯化目的,发展利用大小排阻层析法的再折叠方法,其容许来源于大量、高浓度的大肠杆菌包涵体的神经胚素的复性。除SEC外,Ni-NTA及CM二氧化硅柱层析步骤都可用于增加最终的蛋白纯度。这些蛋白经广泛的表征,所述表征包括SDS-PAGE分析、大小排阻层析法、ESMS、通过KIRA ELISA评估活性及内毒素含量测定。最终蛋白产物的SDS-PAGE及SEC提示纯度大于95%。每种产物的内毒素水平<0.2EU/mg。KIRA ELISA中两种蛋白的比活性大约在10nM。野生型神经胚素以1.0mg/ml、N95K以2.6mg/ml在磷酸盐缓冲的生理盐水(PBS)pH6.5配制。野生型神经胚素被分装入15ml试管并冻存于-70℃,而N95K在分装及冻存前要进行PEG化。
实施例5.野生型神经胚素及突变型N95K神经胚素的再折叠及纯化。
两种神经胚素的形式在大肠杆菌中均表达为具有在紧邻成熟113氨基酸序列的起始位置的、有肠激酶切割位点的组氨酸(His)标记的融合蛋白。表达或野生型(1.8kg沉淀)或N95K(2.5kg沉淀)神经胚素的细菌在2升PBS中用APV Gaulin细胞压碎器裂解。离心(10,000rpm)以沉淀包涵体后,弃去每次制备物的上清。包涵体沉淀物用洗涤缓冲液(0.02M Tris-HCl pH 8.5,0.5mM EDTA)洗涤两次,再用含有Triton x-100(2%,v/v)的相同缓冲液洗涤两次,后再用另外两种无洗涤剂的缓冲液冲洗。两种沉淀都用6M盐酸胍、0.1MTris pH 8.5、0.1M DTT及1mM EDTA溶解。为帮助溶解过程,每一种沉淀都用polytron匀浆器匀浆,并在室温搅拌过夜。溶解的蛋白通过离心澄清化后,通过Superdex 200柱(用0.05M pH 3.0的甘氨酸/H3PO4及2M盐酸胍平衡的5.5升柱)以每分钟20ml进行变性层析(denaturing chromatography)。
变性的神经胚素通过SDS-PAGE鉴别。汇集含有或野生型神经胚素或N95K的级分并用Amicon 2.5升搅拌的细胞浓缩器(stirred cell concentrator)浓缩至大约250mL。过滤后除去任何沉淀物,浓缩的蛋白通过用0.1M pH7.8的Tris-HCl、0.5M盐酸胍、8.8mM还原型谷胱甘肽及0.22mM氧化的谷胱甘肽平衡的Superdex 200柱进行复性层析(renaturing chromatography)。用0.5M盐酸胍以每分钟20ml洗柱。含有复性的野生型神经胚素或N95K神经胚素的级分通过SDS-PAGE、汇集并贮藏于4℃直到需要移除His标记。
通过稀释对野生型神经胚素或N95K神经胚素进行再折叠的可选方法
为通过稀释对神经胚素进行再折叠,溶解的蛋白在再折叠缓冲液(0.5M盐酸胍、0.35M L-精氨酸、50mM磷酸钾(pH 7.8)、0.2mM还原型谷胱甘肽、1mM氧化型谷胱甘肽、及0.1%吐温(Tween)-80)中快速稀释至终浓度0.1mg/ml,并在不搅动的条件下在室温保温48h。再折叠的神经胚素再浓缩25倍,加入40mM咪唑,并加样到含有Ni-NTA琼脂糖的层析柱上以进一步浓缩产物并除去宿主细胞蛋白。用10倍柱体积的洗脱缓冲液(40mM,0.5M盐酸胍)洗柱。再用0.2M咪唑及0.5M盐酸胍从树脂洗脱神经胚素。
用Ni-NTA层析法浓缩柱-再折叠的神经胚素
柱-复性的神经胚素在进行纯化前贮藏于4℃至少24小时,以促进神经胚素单体间形成二硫化物。这期间,沉淀形成并通过0.2μ聚醚砜(PES)过滤装置过滤除去。为减少非特异性结合,将蛋白溶液加入20mM咪唑,以每分钟50ml加样于100ml Ni-NTA(Qiagen)柱,该柱用柱缓冲液(0.5M胍及20mM咪唑)平衡。蛋白上柱后,用相同的缓冲液洗柱到基线。用大约300mL含有0.5M盐酸胍及0.4M咪唑的洗脱缓冲液从树脂洗脱神经胚素。洗脱后,神经胚素在室温用10体积5mM HCl透析用10kDa透析管(dialysistubing))过夜。透析促进污染物质的水解,并分别降低盐酸胍和咪唑的浓度至0.05M及0.04M。
用赖氨酰内肽酶或肠激酶切割His标记
第二天,透析过程中形成的任何沉淀过滤除去。下述纯化步骤适用于柱-及稀释-再折叠化的神经胚素产物。通过加入5M母液中的NaCl,使蛋白样品的终末盐浓度为0.1M NaCl,所述终末盐浓度包括剩余的大约150mM的盐酸胍。这种浓度可用电导仪(conductivity meter)证实。另外,加入1M pH 7.8的HEPES至25mM的终浓度。为切去His标记,加入赖氨酰内肽酶到野生型神经胚素中并加入肠激酶到N95K突变型神经胚素中,两者均为蛋白酶∶神经胚素的比率大约为1∶300。对于N95K突变型神经胚素,用肠激酶代替赖氨酰内肽酶,这是由于突变蛋白Lys95有额外的蛋白酶切割位点。所述样品在室温搅动2小时用SDS-PAGE监测消化作用。
通过Ni-NTA色谱仪除去His标记
蛋白酶处理的神经胚素以每分钟50ml加样于100mL Ni-NTA柱,所述柱用0.5M盐酸胍及20mM咪唑平衡。用相同的缓冲液洗柱到基线。从柱洗脱的任何蛋白与含有不带His标记的神经胚素的流出蛋白混合。
CM二氧化硅层析法
Ni-NTA层析后,立即通过CM二氧化硅树脂对蛋白进行进一步的纯化。将神经胚素以每分钟20ml加样于用上样缓冲液(5mM磷酸盐pH 6.5,150mM NaCl)平衡的20mL CM二氧化硅柱上。用20倍柱体积的洗涤缓冲液(5mM磷酸盐pH 6.5,400mM NaCl)洗柱,并且蛋白用含有5mM磷酸盐pH6.5并含有1M NaCl的洗脱缓冲液逐步洗脱(step elution)。洗脱的蛋白用单独的磷酸盐透析过夜,使N95K的盐浓度降至100mM、野生型神经胚素的盐浓度降至150mM。两种样品通过0.2μPES过滤装置过滤,用SDS-PAGE分析,并贮藏于4℃,直到需要进一步定性和/或PEG化时。
对野生型及N95K突变型神经胚素蛋白制备物进行UV光谱分析,以评估其在280nm的吸光度。用微型石英杯(micro quartz)并用单独的缓冲液作空白(blanking against buffer alone),100μl野生型或N95K突变型神经胚素用贝克曼分光光度计(Beckman spectrophotometer)连续地从230到330进行扫描。根据这种分析,野生型神经胚素浓度被测定为1.1mg/ml而且N95K突变型神经胚素的浓度为2.6mg/ml(对于每一种蛋白,为A280nm-E0.1%=0.5)。基于330nm的吸光度,鉴定出少于1%沉淀的物质。
为评估两种蛋白制备物的纯度,通过16/30 Superdex 75柱对每种样品(0.5mg)进行大小排阻层析。该柱用含有400mM NaCl的5mM磷酸盐pH6.5平衡,并以每分钟1.5mL流速展开。基于280nm的吸光度,野生型及N95K突变型神经胚素制备物以预期分子量(23-24kDa)作为单峰迁移,并且它们不含有任何明显的蛋白污染。
野生型及N95K突变型神经胚素蛋白在2.5M盐酸胍,60mM Tris pH8.0及16mM DTT中被还原。被还原的样品经短C4柱脱盐,并通过ESMS用三联四极仪器(triple quadrupole instrument)联机(on-line)分析。ESMS原始数据用MaxEnt程序去卷积化(deconvolute)以产生质谱。这个程序容许三重荷电信号折(collapse)成峰,其直接对应于千道尔顿分子量(kDa)。野生型的去卷积化的质谱显示主要的(predominant)种类是12046Da,与该蛋白113个氨基酸形式的预测分子量12046.7Da相一致。也观察到次要成分(compoent)(12063Da),提示氧化产物的存在。N95K突变型神经胚素蛋白样品中识别了三个峰。主要成分表明表观分子量11345Da,与该蛋白106个氨基酸形式的预测分子量相一致。其他两个峰的分子量为11362及12061Da,分别提示N95K氧化及113个氨基酸形式的存在。
N95K突变型神经胚素蛋白制备物中106及113个氨基酸形式的存在可归因于肠激酶的消化。来自Biozyme的这种蛋白酶是从小牛肠粘膜中纯化而来的天然酶制备物,据报道其含有轻度的胰岛素污染(每μg肠激酶0.25ng胰岛素)。因此,胰岛素可能作用于N95K突变型神经胚素蛋白的羧基端Arg7以产生主要为106个氨基酸的形式。另一方面,用于切割野生型神经胚素的赖氨酰内肽酶是单独的蛋白酶活性,其作用于包含在His标记中的赖氨酸残基的羧基端以产生成熟的113个氨基酸神经胚素形式。神经胚素的106及113个氨基酸的形式在所有试验的测定中活性等同,并在盐酸胍稳定性试验中反应相似。
神经胚素活性通过其刺激c-Ret在NB41A3-mRL3细胞中磷酸化的能力用实施例3中所述的KIRA ELISA来测定。磷酸化的Ret通过保温(2小时)捕获的受体以及HRP-偶联的磷酸酪氨酸抗体(4G10;每孔0.2μg)来检测。保温后,用TBST洗孔六次,并用比色测定法在450nm测定HRP活性。测定单独用裂解物或裂解溶液处理的加样孔中的吸光度值,相对于背景校准,作为活化混合物中存在的神经胚素的浓度的函数对数据作图。这些数据说明纯化的神经胚素多肽导致磷酸化的RET的出现,表明纯化的神经胚素在这种测定法中有活性。
实施例6:血清白蛋白-神经胚素偶联物的制备
PBS中浓度为1mg/ml的野生型大鼠神经胚素用1mM硫代-SMCC(Pierce)处理,并经脱盐以除去过量的交联剂。由于野生型神经胚素蛋白在氨基末端仅含有单个胺而没有游离的巯基基团,预期与SMCC的反应导致对其氨基末端附着有SMCC的神经胚素的位点特异性修饰。
下一步,60μg神经胚素-SMCC偶联物与120μg牛血清白蛋白一起保温,用SDS-PAGE分析交联的程度。BSA含有单个游离SH基团,并因此预期与神经胚素-SMCC偶联物的反应导致通过SMCC上的马来酰亚胺在该位点的修饰。在这些条件下,观察到更高分子量的两种额外的条带,其质量与用单一BSA组分及两种BSA分子(由于每一种神经胚素分子含有两种能进行反应的氨基末端)修饰的神经胚素一致,并由此与这个概念(notion)一致。与这些条带的形成同时存在的是神经胚素-SMCC及BSA条带的强度减小。基于剩余神经胚素条带的强度,该反应呈现出已有70-80%完成。
单置换的(monosubstituted)产物通过在基本上如上述用于PEG化研究的Superdex 200柱(Pharmacia)上,对所述物质进行阳离子交换层析及大小排阻层析而从反应混合物中纯化而来。凝胶过滤所得的柱级分用SDS-PAGE分析,那些含有单置换产物的级分在280nm的吸光度来分析蛋白含量。由于BSA的质量大约两倍于神经胚素,表观浓度除以因子3以产生神经胚素等同物。对这个级分进行上述实验,以分析其在KIRA ELISA中的功能。野生型及BSA偶联的神经胚素两者的IC50值是3-6nM,表明偶联于BSA不损害功能。
这些初步研究虽然用BSA产生,大鼠及人类的相应血清白蛋白蛋白也含有游离的SH。因此相似的方法可应用于产生大鼠血清白蛋白-大鼠神经胚素偶联物实行大鼠体内PK及效力,并用人血清白蛋白-人神经胚素进行临床试验。相似地,SMCC可用在一侧含有氨基反应基团、另一侧含有硫醇反应基团的许多交联剂中的任一种代替。插入硫醇反应性马来酰亚胺的胺反应性交联剂的例子是AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUS或GMBS;插入硫醇反应性的卤代乙酸盐基团的胺反应性交联剂的例子是SBAP、SIA、SIAB;提供保护的或非保护的硫醇用于与巯基基团反应以产生可还原键的胺反应交联剂的例子是SPDP、SMPT、SATA或SATP,所有这些可从Pierce购买。这些交联剂仅仅是示例性的,预期许多可选的方案可连接神经胚素氨基末端与血清白蛋白。熟练的技术人员也能产生非靶向神经胚素氨基末端或血清白蛋白硫醇组分的血清白蛋白偶联物。用基因工程创造的神经胚素预期是功能性的,其中神经胚素与血清白蛋白基因在氨基末端和/或羧基末端融合。
这种方法可通过常规改造而扩大,适应任何神经胚素-血清白蛋白偶联物,其在动物从而人类中产生具有延长半衰期的产物。
实施例7:人类神经胚素的结晶及结构测定
硒蛋氨酸(selenomethionine)标记的神经胚素用标准的程序表达以抑制蛋氨酸的生物合成(Van Duyne,等,1991,Science 252,839-842)。野生型神经胚素及硒蛋氨酸掺入的神经胚素浓缩至17mg/ml、0.8M精氨酸中。蛋白母液浓缩至17mg/ml、0.8M精氨酸中。通过悬滴蒸汽扩散法(hanging-dropvapor diffusion method)(Jancarik,J.& Kim,S.H.,1991,J.Appl.Crystallogr.24,409-411)从1.25M硫酸镁,0.1M MES pH 6.5、在20℃长出晶体。通过微播种法获得可再生性最强的晶体。这些晶体的低温防护是通过每60秒加入5%乙二醇至终浓度1.25M硫酸镁、0.1M MES pH 6.5及30%(v/v)乙二醇,然后快速转移入液氮中冷冻来进行。
晶体每一侧大约100微米,用National Synchrotron Light Source(Upton,N.Y.)在射束(beamline)X4A衍射(diffract)至1.6A。用HKL程序包(Otwinowski(1993 in:Proceeding of the CCP4 Study Weekend:Data Collection andProcessing(Sawer等,Eds.)pp.56-62,Daresbury Laboratory,Warrington))处理数据显示,晶体属于C2空间群,具有1个共价二聚体每个非对称单位及大约细胞维数 及α=γ=90°,β=99°。
晶体结构通过多重同形晶替换(multiple isomorphous replacement)解决。天然神经胚素晶体浸于1mM PtCl44小时,10mM IrCl372小时及10mMIrCl618小时,收集数据并通过HKL组(suit)(Otwinowski等,见上文)处理。两种硒蛋氨酸位点通过同形(isomorphous)及异常(anomalous)差异帕特森图(difference patterson)检测而定位。剩余的位点用SOLVE(4)定位。这些阶段(phase)通过RESOLVE(Terwilliger等,1999,Acta Crystallogr.D.55,849-861)改善称为灵敏值(merit)0.56的图,且所得图谱(map)有充足的质量(sufficientquality)来追踪(trace)神经胚素模型。利用O2D的交替循环的模型构建(Alternating cycles of model building with O2D)(5G J Kleywegt & T A Jones,″O2D-the manual″,software manual,Uppsala,1994)、以及利用mlhl靶用CNX的精制并相对于硒蛋氨酸数据进行改进(refinement with CNX using a mlhltarget and refined against the selenomethionine data)可产生出神经胚素蛋白的完整模型,其中除外89个水分子及6个硫酸根阴离子,也除外氨基末端前13个氨基酸(the first amino-terminal 13 amino acids)。对于最终的R游 离(free)是28.5%且R因子是24.7%,并具有很好的立体化学。
实施例8:硫酸肝素的结合位点及模拟(modeling)
在近似的等边三角形的顶角的三个硫酸酯的簇(a cluster of three sulfateat the vertices of an approximate equilateral triangle)位于神经胚素表面的前螺旋区并可代表硫酸肝素的结合位点。存在三个看上去与这些硫酸根有主要作用的精氨酸残基。精氨酸残基R48共连接三个硫酸酯(#2、#6及#3)。其主链酰胺与硫酸酯#2相互作用,而其侧链胍基与硫酸酯#6及#3形成分叉的氢键。第二精氨酸残基(R49)与硫酸根#2形成氢键,且第三精氨酸残基(R51)与硫酸酯#6形成长氢键。
这些硫酸酯可代表硫酸肝素的结合袋(binding pocket),其如突变成非正电荷残基可减弱硫酸肝素的结合,并在体内给药时可能降低及/或延迟神经胚素分子的清除。硫酸肝素结合于神经胚素的模型可通过用神经胚素晶体结构中存在的硫酸酯与氨基葡聚糖的硫酸根重叠(superimpose)构建而成。在来自复合于硫酸肝素的FGF-1的晶体结构的硫酸肝素中,n及n+2个糖连接的硫酸酯可以以大约(Pellegrini等,(2000)Nature 407,1029-1034)分开。这种测量法与硫酸根与神经胚素结构中3-硫酸酯簇的硫酸酯间的间距非常匹配,硫酸酯#3及#6以分开而且硫酸酯#3及#2以分开。这种间距测量的相符性表明这种R48/R49/R51基序是肝素结合位点的一部分。这提示R48、R49或R51的单点突变为谷氨酸或天冬氨酸或其他非正电荷氨基酸,可能减弱硫酸肝素的结合亲和力而并不减弱神经胚素的受体结合活性,从而在动物并由此至人类中产生具有延长的半衰期的生物活性产物。为验证这种可能性,我们产生了一系列含有突变成谷氨酸的一或多个精氨酸的构建体。突变型神经胚素产物在大肠杆菌中表达、纯化及再折叠,并测验其功能。最终,检测产物的结合肝素的能力及在动物中的药物动力学和药效动力学。
这些位点的一或多个位点可能也提供通过可用K或C代替R并应用上述的方法来实现PEG化的其他位点。
实施例9:PEG化的突变性神经胚素NBN106-N95K对于逆转神经性疼痛的神经结扎动物模型(Nerve Ligation Animal Model)中的触觉及热痛觉过敏的剂量
先前我们已经证明每周三次皮下给予大鼠1mg/kg野生型神经胚素可几乎完全逆转并正常化由脊神经结扎诱导的神经性疼痛行为(触觉异常性疼痛(tactile allodynia)及热痛觉过敏)。然而,每周三次皮下给予这个模型0.03mg/kg野生型神经胚素没有效应,而每周三次皮下给予这个模型0.1mg/kg及0.6mg/kg野生型神经胚素有即刻的效应。
本文,我们描述以说明在Chung L5/L6脊神经结扎(″SNL″)模型中PEG化的N95K神经胚素对触觉异常性疼痛及热痛觉过敏的逆转效应的研究。Sprague-Dawley雄性大鼠(230-380g)分成两组。所有的大鼠接受脊神经结扎。对一组大鼠(n=6)经皮下注射给予载体。对第二组大鼠(n=6,每组)经皮下注射给予PEG化N95K神经胚素((3(4,)×10kDa PEG NBN106-N95K))10μg/kg。(3(4,)×10kDa PEG NBN106-N95K)包含大肠杆菌-衍生的神经胚素蛋白并含有95位Asn至Lys的氨基酸取代,然后被截短(7个氨基酸的氨基末端截短,NBN106),并最终用每个NBN二聚体平均3.3PEG组分进行PEG化,用分子量10,000Da的甲氧聚(乙二醇)琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA-PEG)作为反应剂。这种载体由5mM磷酸盐及150mM氯化钠pH 6.5组成。在手术后(SNL后)第3、5、7、10、12及14天经皮下注射给药。Von Frey(Chaplan等(1994),J.Neurosci.Meth.53:55-63)及Hargreave′s(Hargreaves等(1988),Pain32:77-88)的行为实验分别用于监控触觉及温觉反应。在脊神经结扎前监控这些痛觉反应,建立基线反应,SNL后第2天证实触觉及热痛觉过敏的存在,然后在SNL后第3、5、7、10、12、14及15天进行上述证实。为评估药物处理相对于载体处理的统计学意义,进行1-途径(1-way)变量分析(1-wayANOVA),然后进行Student Neuman Keuls(SNK)检验。
神经性疼痛行为的两种类型(触觉异常性疼痛,热痛觉过敏)在SNL后第二天如预期完全发生。经皮下给予脊神经结扎的大鼠10μg/kg 3(4,)×10kDaPEG N95K-NBN106导致两种类型的神经性疼痛基本上及统计学上的显著逆转。脊神经结扎大鼠内,10μg/kg(3(4,)×10kDa PEG NBN106-N95K)对温度敏感性及触觉异常性疼痛的影响在最初给予PEG化的N95K神经胚素4天后变得在统计学上显著。10μg/kg(3(4,)×10kDa PEG NBN106-N95K)对温度敏感性及异常性疼痛的影响在最初给予PEG化的N95K神经胚素大约4天后达到一个平台期。(3(4,)×10kDa PEG NBN106-N95K)的效应在给药的2-3天间隔期中没有消失。事实上,在给予PEG化的N95K神经胚素的第5天及第7天之间,疼痛行为基本正常化。在另一个试验(数据未显示)中,尽管开始的效应有些低,在第3、5、7、10、12及14天皮下给予3μg/kg(3(4,)×10kDa PEG NBN106-N95K)在SNL模型中导致疼痛行为(触觉及热痛觉过敏)的显著正常化。
这些结果表明在SNL模型中,3(4,)×10kDa PEG NBN106-N95K)对于触觉异常性疼痛及热痛觉过敏疼痛行为的效力比非突变型非糖基化的神经胚素的效力增加了至少100到333倍。3(4,)×10kDa PEG N95K NBN106与非突变非糖基化神经胚素相比增强的药物代谢动力学特性,表明系统地给予神经胚素的效力与神经胚素的血清水平相关。这些结果表明突变型神经胚素的聚合物偶联物可以以大大降低的剂量以及很可能(potentially)降低的剂量频率用于治疗病人的神经性疼痛,这是由于其相对于非偶联的神经胚素而言具有增强的生物利用率。
表8.PEG化的NBN的生物学特征
注释:nd表示不可检测,+表示低-中度暴露,++表示高暴露
注释:所有都是NBN113,除非特别指明
注释:所有都是大肠杆菌来源的,除非指明是CHO
SEQ ID NO: | 序列: |
1 | 共有成熟神经胚素多肽-113aa |
2 | 人成熟 NBN113 |
3 | 小鼠成熟 NBN113 |
4 | 大鼠成熟 NBN113 |
5 | 前原NBN-220aa |
6 | 成熟 NBN140 |
7 | 成熟 NBN116 |
8 | 截短的 NBN112 |
9 | 截短的 NBN111 |
10 | 截短的 NBN110 |
11 | 截短的 NBN109 |
12 | 截短的 NBN108 |
13 | 截短的 NBN107 |
14 | 截短的 NBN106 |
15 | 截短的 NBN105 |
16 | 截短的 NBN104 |
17 | 截短的 NBN103 |
18 | 截短的 NBN102 |
19 | 截短的 NBN101 |
20 | 截短的 NBN100 |
21 | 截短的 NBN99 |
22 | 多肤 DYKDDDDK-8aa |
23 | NBN113-N95K |
24 | NBN106-N95K |
25 | 大鼠野生型 ORF-675nt |
26 | 大鼠野生型前原NBN多肤-224aa |
27 | KD2-310引物 |
28 | KD2-311引物 |
29 | KD3-254引物 |
30 | KD2-255引物 |
31 | KD3-258引物 |
32 | KD3-259引物 |
33 | KD3-256引物 |
34 | KD3-257引物 |
35 | His-标记的NBNORF-414nt |
36 | His-标记的NBN-135aa |
其他实施方案
尽管具体的实施方案已详细地在本文公开,仅是出于示例的目的而通过实施例公开,并不旨在限制所附权利要求的有关范围。具体地,发明者认为,可以在不脱离如权利要求定义的本发明的精神或范围的情况下对本发明进行各种取代、变化和修改。
Claims (4)
1.二聚体,其包含第一神经胚素多肽以及第二神经胚素多肽,其中(a)至少一种多肽是糖基化的,且(b)至少一种多肽在其N-末端与水溶性合成聚合物偶联。
2.权利要求1的二聚体,其中所述水溶性合成聚合物是聚乙二醇(PEG)。
3.权利要求1的二聚体,其中所述第一和第二神经胚素多肽的氨基酸序列是NBN104(SEQ ID NO:16)。
4.权利要求2的二聚体,其中所述第一和第二神经胚素多肽的氨基酸序列是NBN104(SEQ ID NO:16)。
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002060929A2 (en) * | 2001-02-01 | 2002-08-08 | Biogen, Inc. | Polymer conjugates of neublastin and methods of using same |
WO2002078730A2 (en) * | 2001-03-28 | 2002-10-10 | Biogen, Inc. | Use of neublastin polypeptides for treating neuropathic pain |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
HU187037B (en) | 1983-04-19 | 1985-10-28 | Tibor Sinko | Rope-stretching device |
DE3572982D1 (en) | 1984-03-06 | 1989-10-19 | Takeda Chemical Industries Ltd | Chemically modified lymphokine and production thereof |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
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JP3722375B2 (ja) | 1991-06-27 | 2005-11-30 | ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー | Ctla4レセプター、それを含有する融合タンパク質およびそれらの使用 |
CA2092271C (en) | 1993-03-09 | 2009-10-13 | Eddie Reed | Use of g-csf for treating taxol side-effects |
US5834029A (en) | 1994-07-20 | 1998-11-10 | Cytotherapeutics, Inc. | Nerve guidance channel containing bioartificial three-dimensional hydrogel extracellular matrix derivatized with cell adhesive peptide fragment |
US5770577A (en) * | 1994-11-14 | 1998-06-23 | Amgen Inc. | BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol |
DE69736428T2 (de) | 1996-05-08 | 2007-08-30 | Biogen Idec Ma Inc., Cambridge | RET-LIGAND 3 (RetL3), UM NEURALES UND RENALES WACHSTUM ZU STIMULIEREN |
KR100195886B1 (ko) | 1996-11-01 | 1999-06-15 | 김상조 | 당뇨병 치료용 의약조성물 |
WO1999003887A1 (en) * | 1997-07-14 | 1999-01-28 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of growth hormone and related proteins |
US6593133B1 (en) * | 1998-07-06 | 2003-07-15 | Nsgene A/S | Neurotrophic factors |
US20020055467A1 (en) * | 1998-07-06 | 2002-05-09 | Johansen Teit E. | Novel neurotrophic factors |
US6284540B1 (en) * | 1998-09-29 | 2001-09-04 | Washington University | Artemin, a novel neurotrophic factor |
WO2000034475A2 (en) * | 1998-12-09 | 2000-06-15 | Amgen Inc. | Grnf4, a gdnf-related neurotrophic factor |
IL156559A0 (en) * | 2000-12-22 | 2004-01-04 | Genentech Inc | New use of artemin, a member of the gdnf ligand family |
GEP20084464B (en) * | 2003-01-31 | 2008-08-25 | Biogen Idec Inc | Mutated neublastin |
EP1897552B1 (en) * | 2003-04-18 | 2009-06-17 | Biogen Idec MA Inc. | Polymer-conjugated glycosylated neublastin |
-
2004
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-
2014
- 2014-03-13 CY CY20141100203T patent/CY1115085T1/el unknown
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002060929A2 (en) * | 2001-02-01 | 2002-08-08 | Biogen, Inc. | Polymer conjugates of neublastin and methods of using same |
WO2002078730A2 (en) * | 2001-03-28 | 2002-10-10 | Biogen, Inc. | Use of neublastin polypeptides for treating neuropathic pain |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
OLAF KINSTLER等: "Mono-N-terminal poly (ethylene glycol)-protein conjugates", 《ADVANCED DRUG DELIVERY REVIEWS》 * |
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