PT1594436E - Neublastina mutada - Google Patents

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PT1594436E
PT1594436E PT04707363T PT04707363T PT1594436E PT 1594436 E PT1594436 E PT 1594436E PT 04707363 T PT04707363 T PT 04707363T PT 04707363 T PT04707363 T PT 04707363T PT 1594436 E PT1594436 E PT 1594436E
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neublastin
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seq
polymer
mutated
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PT04707363T
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Anthony Rossomando
Laura Silvian
R Blake Pepinsky
Dinah Wen-Yee Sah
Paula Ann Boriack-Sjodin
Stephan S Miller
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Biogen Idec Inc
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Description

ΕΡ1594436Β1
DESCRIÇÃO
NEUBLASTINA MUTADA
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à química da proteína, à biologia molecular, à neurobiologia, à neurologia e à gestão da dor.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Os factores neurotróficos são proteínas de ocorrência natural que regulam a sobrevivência neuronal durante o desenvolvimento e regulam a plasticidade e a integridade estrutural do sistema nervoso adulto. Os factores neurotróficos podem ser isolados de tecido neural e de tecido não neural. Durante os últimos vinte anos foram descobertos muitos factores neurotróficos. Estes factores neurotróficos podem ser classificados em superfamílias, famílias, subfamílias e espécies individuais no que respeita à sua estrutura e função.
As superfamílias de factores neurotróficos incluem a superfamília de factor de crescimento de fibroblasto (FGF), e a superfamília de neurotrofina e superfamília de factor transformador do crescimento β (TGF-β) . Os ligantes relacionados com o factor neurotrófico derivado da linhagem celular glial (GDNF) são uma família de proteínas dentro da superfamília TGF-β. Os ligantes relacionados com o GDNF incluem o GDNF, a persefina (PSP), a neurturina (NTN) e a neublastina (NBN; conhecida como artemina ou enovina). Os 1 ΕΡ1594436Β1 membros da família de ligandos relacionada com o GDNF são distinguidos, entre outras coisas, pelos seus sete resíduos de cisteína conservados. Estes resíduos formam pontes de dissulfeto intramoleculares e intermoleculares e dão origem à estrutura terciária e quaternária do ligante de polipeptídeo dimerizado. Os membros da família também partilham a capacidade de induzir a sinalização através de um complexo receptor de multicomponente que consiste de um co-receptor ancorado ao glicosilfosfatidilinositol (GPI) da família GFRa, um membro da subfamília de ligantes relacionada ao GDNF, e o receptor de tirosina quinase de RET. 0 RET activado inicia uma cascata de transdução de sinal que é responsável, pelo menos em parte, pelos efeitos a jusante dos ligantes relacionados com o GDNF. Consequentemente, a activação de RET pode representar um aspecto desejável de uma terapia que age através de uma via de receptor de GFRa para afectar os processos celulares a jusante. A neublastina é classificada na família do GDNF porque partilha regiões de homologia com outros ligantes do GDNF, inclusive os sete motivos de cisteína (por exemplo, como descrito em EP02/02691, publicações de PCT US02/02319 e US02/06388), e devido à sua capacidade de activar e de se ligar ao receptor de RET como parte de um complexo de GFRa. Especificamente, a neublastina é altamente selectiva para se ligar ao complexo de receptor GFRa3-RET. Neste aspecto, a neublastina contém sub-regiões únicas na sua sequência de aminoácidos, comparativamente com outros membros da família de ligantes relacionada com o GDNF. 2 ΕΡ1594436Β1
Os dados actuais sugerem que a neublastina pode ter um papel protector e regenerativo nos sistemas nervosos centrais e periféricos e, por consequência, pode ser útil como um agente terapêutico para doenças neurodegenerativas. Por exemplo, os dados sugerem que a neublastina pode ter efeitos promotores de sobrevivência em neurónios sensoriais cultivados de gânglios da raiz dorsal e de gânglios trigeminais, e em neurónios dopaminérgicos negros de substância cultivados (Baloh et al., Neurónio 21: 1291 - 1302 (1998)). Portanto, parece que a neublastina pode promover a sobrevivência de populações neuronais incluindo neurónios dopaminérgicos e sensoriais. Isto é importante porque a degeneração e disfunção dos neurónios foram associados a estados de doença. Por exemplo, as patologias de neurónio dopaminérgico e sensorial sustentam a neuropatia periférica e a doença de Parkinson, respectivamente.
Consequentemente, a administração da neublastina pode ser útil, por exemplo, no tratamento de doenças associadas com disfunção e degeneração neuronal. No entanto, a neublastina é rapidamente excretada pelo corpo, o que pode afectar o paradigma de dosagem de neublastina necessário em aplicações terapêuticas. Assim, existe uma necessidade de polipeptideos de neublastina mutada que demonstram uma biodisponibilidade aumentada. Do mesmo modo, a presente invenção tem como objecto identificar formas mutadas de neublastina que demonstram uma biodisponibilidade aumentada.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção fornece um polipeptideo de neublastina que é pelo menos 80% idêntica aos aminoácidos 8-113 da ID DE SEQ 3 ΕΡ1594436Β1 N°1 e que contém uma substituição de uma ou mais da arginina na posição 48, da arginina na posição 49, ou da arginina na posição 51 com um residuo de ácido glutâmico. A invenção também fornece o polipeptideo, onde o resíduo de arginina na posição 48 é substituído pelo ácido glutâmico. Alternativamente, o polipeptideo é fornecido onde o resíduo de arginina na posição 49 é substituído pelo ácido glutâmico. Também se fornece o polipeptideo, onde o resíduo de arginina na posição 51 é substituído pelo ácido glutâmico.
Também se descrevem dímeros de neublastina mutada, conjugados com o polímero. Cada dímero contém um primeiro polipeptideo compreendendo um primeiro aminoácido amino terminal e um segundo polipeptideo compreendendo um segundo aminoácido amino terminal. Cada polipeptideo contém individualmente: (a) uma sequência de aminoácido caracterizada por pelo menos 70%, 80%, 90%, ou 95% de identidade de sequência com aminoácidos 8 - 113 de ID DE SEQ N° 1; (b) um resíduo de cisteína em cada uma das posições 16, 43, 47, 80, 81, 109 e 111 (numeração de acordo com a ID DE SEQ N° 1); (c) resíduos de aminoácido da seguinte forma: C na posição 16, L na posição 18, V na posição 25, L na posição 28, G na posição 29, L na posição 30, G na posição 31, E na posição 36, F na posição 40, R na posição 41, F na posição 42, C na posição 43, G na posição 45, C na posição 47, C na posição 80, C na posição 81, R na posição 82, P na posição 83, F na posição 91, D na posição 93, S na posição 105, A na posição 106, C na posição 109 e C na posição 111; e (d) uma repetição de LGLG, um motivo de FRFC, um motivo de QPCCRP, e um motivo de SATACGC. O dímero inclui, pelo menos, uma substituição de aminoácido (com relação à ID DE SEQ N° 1) que fornece um sítio de conjugação com polímero interno com o 4 ΕΡ1594436Β1 qual o polímero é conjugado.
Também se descreve na presente invenção um dímero de neublastina mutada, conjugada com o polímero contendo um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, em que cada polipeptídeo contém 90 - 140, por exemplo, 95 - 120 ou 100 -110 aminoácidos da ID de SEQ N° 6 com 1 a 6 substituições de aminoácido, cada substituição fornecendo um sítio de conjugação com polímero com o qual um polímero é conjugado. Os exemplos de polipeptídeos divulgados na presente invenção incluem NBN113 (ID de SEQ N° 2), NBN140 (ID de SEQ N° 6), NBN116 (ID de SEQ N° 7), NBN112 (ID de SEQ N° 8), NBN111 (ID de SEQ N° 9), NBN110 (ID de SEQ N° 10), NBN109 (ID de SEQ N° 11), NBN108 (ID de SEQ N° 12), NBN107 (ID de SEQ N° 13), NBN106 (ID de SEQ N° 14), NBN105 (ID de SEQ N° 15), NBN104 (ID de SEQ N° 16), NBN103 (ID de SEQ N° 17), NBN102 (ID de SEQ N° 18), NBN101 (ID de SEQ N°19), NBN100 (ID de SEQ N° 20) e NBN99 (ID de SEQ N° 21).
Pelo menos um dos dois aminoácidos amino terminal no dímero pode ser conjugado com um polímero. As substituições de aminoácido podem incluir substituição de um resíduo de arginina por um resíduo de lisina (Raa n° K; onde aa n° é o número de aminoácido baseado na ID de SEQ N° 1), e a substituição de um resíduo de asparagina por um resíduo de lisina (Naa n° K) ou um resíduo de aspartato (Naa n° D) . Os exemplos específicos de tal substituição são R14K, R39K, R68K, N95D e N95K (numeração baseada na ID de SEQ N° 1) . A substituição pode ser N95K.
Conforme se descreve na presente invenção, o peso molecular combinado total dos polímeros num dímero pode ser 5 ΕΡ1594436Β1 de 20.000-40.000 Da. O peso molecular médio de cada polímero pode ser de 2.000-100.000 Da; ou 5.000-50.000 Da; ou de cerca de 10.000 a 20.000 Da. O polímero pode ser linear ou ramificado. O polímero pode ser uma porção de polialquileno glicol, por exemplo, uma porção de polietileno glicol (PEG) . Pelo menos um polipeptídeo pode ser glicosilado.
Conforme se descreve na presente invenção, o dímero conjugado com o polímero pode conter um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, em que: (a) cada polipeptídeo individualmente compreende 100 a 110 aminoácidos da ID de SEQ N° 1, (b) cada polipeptídeo compreende uma substituição de asparagina por lisina no aminoácido número 95 na ID de SEQ N° 1, (c) e o dímero compreende 3 ou 4 porções de PEG, em que o peso molecular de cada porção de PEG é de cerca de 10.000 Da, e cada porção de PEG é conjugada com uma terminação amino ou em lisina 95. O dímero conjugado com o polímero pode ser um homodímero contendo um par de monómeros designado 3(,4) x 10 kDa da PEG NBN106-N95K.
Também se descreve nesta invenção uma composição farmacêutica que compreende um dímero conforme descrito nesta invenção. A composição pode conter dois ou mais dímeros distintos conforme se descreve nesta invenção.
Também se descreve nesta invenção um ácido nucleico, por exemplo, um vector de expressão de dna que codifica um polipeptídeo para incorporação num dímero, conforme se descreve nesta invenção. Também se descreve nesta invenção uma célula hospedeira transformada com o ácido nucleico.
Descreve-se nesta invenção uma utilização para o 6 ΕΡ1594436Β1 tratamento da dor neuropática num mamífero. A utilização inclui a administração no mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz do dímero, conforme se descreve nesta invenção. A quantidade terapeuticamente eficaz pode ser de 0,1 \X,qfkq a 1000 \\,q/~kq, de 1 \\,q/~kq a 100 μρ/kg, ou de 1 \X,qfkq a 30 \íq/\q. A administração do dímero pode ser efectuada por várias vias, por exemplo, intramuscular, subcutânea ou intravenosa. Nalgumas utilizações descritas na presente invenção, o dímero é administrado três vezes por semana. Também se descreve nesta invenção uma utilização para a activação do receptor de RET num mamífero com uma quantidade eficaz do dímero.
As características e vantagens da invenção ficarão evidentes a partir das seguintes descrições e reivindicações detalhadas.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Salvo indicação em contrário, qualquer referência a um número de posição de aminoácido de neublastina refere-se à numeração ilustrada na SEQ de ID N° 1.
Salvo indicação em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado do que lhe é normalmente atribuído por alguém versado na técnica na qual se insere esta invenção.
De acordo com a definição utilizada no presente documento, "polipeptídeo de neublastina selvagem" significa uma sequência de polipeptídeo de neublastina de ocorrência natural. Um polipeptídeo de neublastina selvagem pode ser 7 ΕΡ1594436Β1 também ser definido pela fonte da neublastina, por exemplo, neublastina humana, de rato ou de ratazana (ver, por exemplo, ID de SEQ N° 2, 3 ou 4) . Uma sequência de polipeptideo de neublastina de consenso é fornecida como a ID de SEQ N° 1.
De acordo com a definição utilizada no presente documento, "polipeptideo de neublastina mutada" significa um polipeptideo que contém pelo menos um nivel minimo especificado de identidade de sequência relativo a um polipeptideo de neublastina selvagem, que contém pelo menos uma substituição de aminoácido, inserção ou fusão, relativo ao polipeptideo de neublastina selvagem, e exibe actividade de neublastina (por exemplo, como se descreve no Pedido Internacional N° PCT/US02/02319 (WO 02/060929)).
De acordo com a definição utilizada no presente documento, "sitio de conjugação com polímero interno" significa um resíduo de aminoácido não terminal num polipeptideo de neublastina mutada, cujo resíduo fornece uma cadeia lateral adequada para conjugação de um polímero.
De acordo com a definição utilizada no presente documento, "polipeptideo de neublastina modificado" significa um polipeptideo que contém pelo menos um polímero ligado.
De acordo com a definição utilizada no presente documento, "fusão" significa uma ligação covalente, co-linear de dois ou mais polipeptídeos através das suas respectivas cadeias principais de peptídeo através da expressão genética de uma molécula de polinucleotídeo que codifica essas proteínas na mesma estrutura de leitura. 8 ΕΡ1594436Β1
De acordo com a definição utilizada no presente documento, "identidade" refere-se à similaridade de sequência entre dois polipeptideos, moléculas ou entre dois ácidos nucleicos. Quando uma posição em ambas das duas sequências comparadas é ocupada pela mesma base ou subunidade de monómero de aminoácido (por exemplo, se uma posição em cada uma das duas moléculas de DNA é ocupada por adenina ou uma posição em cada um dos dois polipeptideos é ocupada por uma lisina), as respectivas moléculas são homólogas nessa posição. A "identidade de percentaqem" entre duas sequências é uma função do número de posições coincidentes partilhadas pelas duas sequências divididas pelo número de posições comparadas x 100. Por exemplo, se 6 de 10 posições em duas sequências coincidem, as duas sequências têm 60% de identidade. Por exemplo, as sequências de DNA CTGACT e CAGGTT partilham 50% de homologia (3 das 6 posições totais são coincidentes). Geralmente, faz-se uma comparação quando duas sequências são alinhadas para produzir a máxima homologia. Pode conseguir-se tal alinhamento utilizando, por exemplo, o método de Needleman et al., J. Mol Biol. 48: 443 - 453 (1970), implementado de forma conveniente por programas de computador tal como o programa de alinhamento (DNAstar, Inc.). Sequências "similares" são aquelas que, quando alinhadas, partilham residuos de aminoácido idênticos e similares, onde os residuos similares são substituições conservativas ou "mutações pontuais permitidas" de, residuos de aminoácido correspondentes numa sequência de referência alinhada. A este respeito, uma "substituição conservativa" de um resíduo numa sequência de referência é uma substituição por um resíduo que é fisicamente ou funcionalmente similar ao resíduo de referência correspondente, tendo por exemplo dimensão, forma, carga eléctrica, ou propriedades químicas 9 ΕΡ1594436Β1 semelhantes, incluindo a capacidade de formar ligações covalentes ou de hidrogénio, ou propriedades afins. Assim, uma sequência "mutada de substituição conservativa" é aquela que difere de uma sequência de referência ou é uma sequência selvagem na qual uma ou mais substituições conservativas ou mutações pontuais permitidas estão presentes. A "percentagem positiva" entre as duas sequências é uma função do número de posições que contêm resíduos coincidentes ou substituições conservativas partilhadas pelas duas sequências divididas pelo número de posições comparadas x 100. Por exemplo, se 6 das 10 posições em duas sequências são coincidentes e 2 das 10 posições contêm substituições conservativas, então as duas sequências têm 80% de homologia positiva.
Polipeptídeos de Neublastina Mutada
Os polipeptídeos de neublastina mutada descritos no presente documento retêm actividade neurotrófica e têm biodisponibilidade aumentada comparativamente ao polipeptídeo de neublastina selvagem. Por exemplo, as neublastinas mutadas descritas no presente documento activam o produto de gene de RET em ensaios nos quais a neublastina selvagem activa o RET. Descrevem-se os polipeptídeos de neublastina mutada que reterão pelo menos uma das seguintes características, mas compreendem suplementarmente pelo menos uma modificação, de forma a criar um sítio de conjugação com polímero interno: (i) sete resíduos de cisteína conservados nas posições 16, 43, 47, 80, 81, 109 e 111 quando numerados de acordo com a ID de SEQ N° 1 - 4; (ii) resíduos de aminoácido da seguinte forma: 10 ΕΡ1594436Β1 ΕΡ1594436Β1 L na posição 18, L na posição 30, na posição 40, R na posição 43, G na posição 80, na posição 83, na posição 105, e C na posição .e acordo com a : C na posição 16, L na posição 28, G na posição 29, na posição 36, F na posição 42, C na posição 47, C na posição 82, P na posição 93, S C na posição 109 quando numerado c V na posição 25, G na posição31, E na posição 41, F na posição 45, C na posição 81, R F na posição 91, D A na posição 106, 111, cada um deles !D de SEQ N° 1 - 4; (iii) uma repetição de LGLG, um motivo de FRFC, um motivo de QPCCRP, e um motivo de SATACGC.
Descreve-se nesta invenção um polipeptídeo de neublastina mutada truncada, onde a terminação amino do polipeptídeo de neublastina truncada necessita de um ou mais aminoácidos terminais amino de um polipeptídeo de neublastina madura, mas é mutado para possuir uma ligação de polímero interno. O polipeptídeo de neublastina mutada truncada, quando dimerizado, pode activar um polipeptídeo de RET. O polipeptídeo de neublastina mutada pode induzir a dimerização do polipeptídeo de RET. Tal indução pode requerer polipeptídeos ou co-factores adicionais, como seria evidente para um especialista.
As sequências de aminoácidos de polipeptídeos de neublastina humana e de ratos são descritas na publicação de PCT WO00/01815. Os exemplos de polipeptídeos de neublastina selvagem de acordo com a invenção são apresentados na Tabela IA. Apresenta-se uma sequência de consenso de neublastina 11 ΕΡ1594436Β1 (consenso com respeito a humano, rato e ratazana) na Tabela 1B.
Tabela 1A. Polipeptídeos NBN113 maduros Tipo silvestre 1 AGGPGSRAEAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVEF AGTRS SRARTTDARGCRLRSQLVP VS ALGLGHSSDELI P.F AGTRSSRARATDARGCRLRSQLVPVSALGLGHSSDELIRF ii i 111 i i 111 i i 11 1111 ι ι ι η ι 11 ι ι 11 humano rato rato II 1 111 1 1 1111 1 11 1111 1 11 11 1 11 1 1 II ag---srar---argcrlrsqlvpv-alglgh-sdel-rf consenso 41 RFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPOSRPVSQPC RFCSGSCRRARSQHDLSLASLLGAGALRSPPGSRPISQPC RFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRSPPGSRPISQPC ι η η ι μ ι ι ι ι η μ ι ι ι ι ι11ιιli ι ι ι ι ι ι ι ι ι ιιιι humano namundnnno rato 11 1 í1111111111111111j11 j 11II11111 f 11II11 rfcsgscrrars-hdlslasllgagair-ppgsrp-sqpc consenso humano (SEQ ID NO: 2) camundongo {seq id no:3) rato (SEQ ID NO:4)
81 CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG CRPTRYEAVS FMDVNSTWRTVDHLSATACGCLG CRPTRYSAVS FMDVNSTWRTVDHLSATACGCLG llllll!lll!llimill!l millllll crptryeavs fmdvnstwrtvd - Is atacgc lg
Também se descrevem no presente documento polipeptídeos onde pelo menos um dos resíduos de arginina (Arg ou R) ou asparagina (Asn ou N) ilustrados a negrito na Tabela IA é
substituído por um resíduo de aminoácido diferente. O polipeptídeo de neublastina mutada pode ter um resíduo de lisina (Lys ou K) substituído pela asparagina na posição de aminoácido 95, indicada por um asterisco na Tabela IA, e é denominado NBN-N95K. Em geral, a substituição de N95K resulta em solubilidade melhorada. Isto facilita a formulação em concentrações elevadas.
consenso (seq id no:i) * = Asn9S
Tabela 1B. Sequência de Consenso de NBN113
Sequência de consenso (SEQ ID NO: 1) Ala Gly Xaal Xaa2 Xaa3 Ser Arg Ala Arg Xaa4 Xaa5 Xaaó Ala Arg <31y Cys Arg Leu Arg Ser Gin Leu Vai Pro Vai Xaa7 Ala Leu Gly Leu Gly Eis XaaB Ser Asp Glu Leu Xaa9 Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser XaalO His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Xaall Pro Pro Gly Ser Arg Pro Xaa!2 Ser Gin Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Vai Ser Phe Met Asp Vai Asn Ser Thr Trp Arg Thr Vai Asp Xaal3 Leu -Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly em que
Xaat é Gly OU Thr Xaa6 é Gly ou Asp Xaan é Pro ouSer ΕΡ1594436Β1
Xaa2 é Pro OU Arg Xaa7 é Arg OU Ser Xaa32 é Vai OU He Xaa3 é Gly ou Ser Xaa8 é Arg ou Ser Xaa33 é Arg OU His Xaa4 é Ala OU Thr Xaa9 é Vai OU Ile Xaa5 § Ala OU Thr Xaa10 é Pro OU Gin
Também se descreve nesta invenção um polipeptídeo de neublastina mutada conjugada com o polímero que compreende uma sequência de aminoácidos que é, por exemplo, pelo menos 70% idêntica aos aminoácidos 8 - 113 da ID de SEQ N° 1 (também ilustrado Tabela 1), onde uma ou mais das argininas na posição 14, posição 39, posição 68 ou a asparagina na posição 95 podem ser substituídas por um aminoácido diferente de arginina ou asparagina. Na sequência, o aminoácido selvagem pode ser substituído por lisina ou cisteína.
Os resíduos substituídos no polipeptídeo de neublastina mutada podem ser seleccionados para facilitar o acoplamento de um polímero, por exemplo, um polímero de polialquileno glicol, no aminoácido substituído. Os sítios vantajosos de modificação são aqueles em regiões acessíveis solventes no polipeptídeo de neublastina. Tais sítios podem ser seleccionados com base na inspecção da estrutura cristalina do factor neurotrófico relacionado, tal como GDNF, cuja estrutura cristalina é descrita em Eigenbrot et al., Nat. Struct. Biol. 4: 435 - 38, 1997. Os sítios também podem ser seleccionados com base na estrutura cristalina de neublastina, cuja cristalização e determinação da estrutura são descritas abaixo. Os sítios também podem ser seleccionados com base nas informações estruturais-funcionais fornecidas para proteínas quiméricas de persefina/neublastina. Estas quimeras são descritas em Baloh et al., J. Biol. Chem. 275: 3412 - 20.2000. A Tabela 2 apresenta uma listagem de aminoácidos de neublastina expostos 13 ΕΡ1594436Β1 à superfície e acessíveis ao solvente através desta metodologia. A Tabela 2 fornece uma lista de resíduos e números em neublastina humana que se espera que sejam expostos à superfície. A primeira coluna refere-se aos resíduos expostos à superfície determinados pela análise da estrutura do dímero de gdnf de ratazana formada pelas cadeias A e B (PDB código 1AGQ) e determinando se havia um resíduo na superfície da estrutura. Subsequentemente esta estrutura foi comparada a um alinhamento de sequência de GDNF e neublastina em Baloh et al., Neuron 21: 1291 - 1302, 1998 para determinar os resíduos adequados em neublastina. A segunda e terceira colunas, respectivamente, referem-se aos resíduos expostos à superfície determinados pela análise da estrutura do dímero de neublastina humana formados pelas cadeias A e B. O esquema de numeração na Tabela 2 é o ilustrado na Tabela 1.
Tabela 2 1 Ala nnn 21 Gln + - + 41 Aig +++ 61 Leu — 81 Cys - - - 101 Vai - 44 2 Gly η η n 22 Leu +++ 42 Phe + - - 62 Leu +++ 82 Arg - - - 102 Asp 444 3 Gly η η n 23 Vai--- 43 Cys - - - 63 Gly +++ 83 Pro--- 103 Arg 44+ 4 Pro nnn 24 Pro + -r 4.4 Ser - 64 Ala +-H- 84 Thr 4- f · 104 Leu - - - 5 Gly η η n 25 Vai--- 45 Gly + - - 65 Gly -Η 1 85 Arg+++ 105 Ser — 6 Ser η η n 26 Arg+++ 46 Sei + - + 66 AJa+++ 86Tyr+-H- 106 Ala--- 7 Arg nnn 27 Ala + - - 47 Cys — 67 Uu — 87 Glu 4+4 107 Thr 444 8 Ala nnn 28 Leu — 48 Arg +++ 68 Arg n ++ 88 Ala +++ 108 Ala 44 4 9 Arg nnn 29 Gly +++ 49 Arg+++ 69 Pro n + + 89 Vai + - - 109 Cys--- 10 Ala nnn 30 Leu "í ) 50 Ala -++ 70 Pro n — 90 Ser +++ 110 Gly 4 - - 11 Ala nnn 31 Gly+++ 51 Arg+-+ 71 Pron++ 91 Phe — 111 Cys — 12 Gly-*· nn 32 His + - + 52 Ser +++ 72 Gly ++-*- 92 Met +4-4 112 Leu +4+ 13 Ala-nn 33 Aig+++ 53 Pro +++ 73 Ser+++ 93 Asp + - - 113 Gly u - 14 Arg ++ n 34 Ser--- 54 His--- 74 Argn++ 94 Vai +++ 15 Gly + - + 35 Asp 4++ 55 Asp — 75 Pro n — 95 Asn 444 16 Cys — 36 Glu +++ 56 Leu +++ 76 Vai - 4+ 96 Ser 444 17 Arg+++ 37 Leu +++ 57 Ser--- 77 Ser--- 97 Thr 444 18 Leu-H-f 38 Vai — 58 Leu--- 78 Glu +++ 98 Trp 444 19 Arg+-- 39 Arg+++ 59 Ala 4 - - 79 Pro--- 99 Arg 444 20 Ser +++ 40 Phe — 60 Ser + - + 80 Cys — 100 Thr 44+ 14 ΕΡ1594436Β1 n indica que os resíduos não estão presentes nas estruturas de GDNF ou de neublastina. Isto deve-se ao projecto de construção, a regiões flexíveis ou a inserções na neublastina relativas ao GDNF (resíduos 68 - 71) . - indica os resíduos que estão encobertos e à superfície ou são resíduos de cisteína envolvidos em ligações de dissulfeto. Como esta proteína é um nó de cisteína, uma grande maioria dos resíduos encontram-se à superfície. + indica que este resíduo está exposto à superfície na estrutura de GDNF ou na estrutura de neublastina, apesar de que a alça contendo os resíduos 66 - 75 seja visível em apenas um dos monómeros de GDNF (presumivelmente flexível). Esta alça também contém uma inserção de 4 resíduos em neublastina relativa ao GDNF.
Os polipeptídeos de neublastina descritos na presente invenção retêm os sete resíduos de Cis conservados que são característicos da subfamília de GDNF e da super família de TGF-beta. A sequência do polipeptídeo de pré-pró NBN de tamanho natural humano (ID de SEQ N° 5) é demonstrada na Tabela 3. Foram identificadas três formas maduras de polipeptídeos de neublastina . Estas formas incluem: (i) o polipeptídeo 140 AA designado no presente documento como NBN140, que possui a sequência de aminoácido designada como ID de SEQ N° 6; (ii) o polipeptídeo 116 AA designado no presente documento como NBN116, que possui a sequência de aminoácido designada como ID de SEQ N° 7; e 15 ΕΡ1594436Β1 (iii) o polipeptídeo 113 AA designado no presente documeequências imo NBN113, o qual possui a sequência de aminoácido designada como ID de SEQ N° 2; A Tabela 3 ilustra a relação entre as sequências de polipeptídeo de pré-pró neublastina descritas na presente invenção. A linha 1 diz respeito ao polipeptídeo de ID de SEQ N° 5, a linha 2 diz respeito ao o polipeptídeo de ID DE SEQ N° 6, a linha 3 diz respeito ao polipeptídeo de ID de SEQ N° 7 e a linha 4 diz respeito ao polipeptídeo de ID DE SEQ N° 2. Os sete resíduos de cisterna conservados são designados por símbolos "n°", "+" e "|" para indicar as pontes de dissulfeto intramoleculares (* com *, n° com n° e + com +) e intermoleculares ("|") formadas no ligante de neublastina de dimerizado maduro. 0 sinal circunflexo ("Λ") indica o resíduo de asparagina na posição de aminoácido 95 que é substituído por uma lisina em NBN106-N95K. 16 ΕΡ1594436Β1
Tabela 3. seqúências de polipeptídeo NBN 10 20 30 40 50 .||||.1.|| ....1....1....1 PrePro -MELr^C^STLSHCPWPRRÍ»gM>S>^ailiSia 3 3 NBN140 --------------------------------------------------- HBN116 -------------------------------------------------- NBN113 -------------------------------------------------- 60 70 80 90 100 ....!. ...1....1....1....1....1....1....1..-1-...1 PrePro t^vaaiW«i»waarwtf^a;iat>aaaiwiagj\c):i4jcM;W3ak»wc)9J:«3|a| 83 NBK140 Q 3 NBN116 -------------------------------------------------- NBH113 ----------------------------------------------- 110 120 130 140 150 ....1....1....1....1....1....1....1....1....). ...| KBN140 fiBEMBSBS^jSasjWSwSIB^ 53 NBNH6 29 KBK113 -~--ΊμΗ^ΗμΒβΒβ8ΒΒ 26 * 160 170 180 190 200 -. ..1....1...-1...-1....!....1....1....1....1....1 PrePro 183 HBN140 103 NBN116 79 # + 210 220 230 PrePro NBN140 NBN116 NEN113
220 (SEQ ID HO: 5) 140 (SEQ ID NO:6) 116 (SEQ ID HO: 7) 113 (SEQ ID NO: 2 ) A sequência dos polipeptídeos de neublastina acima identificados pode ser truncada na sua sequência de aminoácidos terminal amino. Os exemplos destas que são descritos na presente invenção incluem: (iv) a sequência de polipeptídeos 112AA designada no presente documento como NBN112, que possui os 112 aminoácidos carboxi-terminal de um polipeptideo de neublastina, por exemplo, aminoácidos 29 - 140 de ID de SEQ N° 6 (ID de SEQ N° 8) ou aminoácidos 2 - 113 de ID de SEQ N°s 1, 3 ou 4. 17 ΕΡ1594436Β1 (v) a sequência de polipeptídeos 111AA designada no presente documento como NBNlll, que possui os 111 aminoácidos carboxi-terminal de um polipeptideo de neublastina, por exemplo, aminoácidos 30 - 140 de ID de SEQ N° 6 (ID de SEQ N° 9) ou aminoácidos 3 - 113 de ID de SEQ N°s 1, 3 ou 4. (vi) a sequência de polipeptídeos 110AA designada no presente documento como NBN110, que possui os 110 aminoácidos carboxi-terminal de um polipeptideo de neublastina, por exemplo, aminoácidos 31 - 140 de ID de SEQ N° 6 (ID de SEQ N° 10) ou aminoácidos 4 - 113 de ID de SEQ N° s 1, 3 ou 4. (vii) a sequência de polipeptídeos 109AA designada no presente documento como NBN109, que possui os 109 aminoácidos carboxi-terminal de um polipeptideo de neublastina, por exemplo, aminoácidos 32 - 140 de ID de SEQ N° 6 (ID de SEQ N° 11) ou aminoácidos 5 - 113 de ID de SEQ N°s 1, 3 ou 4. (viii) a sequência de polipeptídeos 108AA designada no presente documento como NBN108, que possui os 108 aminoácidos carboxi-terminal de um polipeptideo de neublastina, por exemplo, aminoácidos 33 - 140 de ID de SEQ N° 6 (ID de SEQ N° 12) ou aminoácidos 6 - 113 de ID de SEQ N°: 1, 3 ou 4. (ix) a sequência de polipeptídeos 107AA designada no presente documento como NBN107, que possui os 107 aminoácidos carboxi-terminal de um polipeptideo de neublastina, por exemplo, aminoácidos 34 - 140 de ID de 18 ΕΡ1594436Β1 SEQ N° 6 (ID de SEQ N° 13) ou aminoácidos 7 - 113 de ID de SEQ. N°s 1, 3 ou 4. (x) a sequência de polipeptídeos 106AA designada no presente documento alternativamente como NBN106 ou N-7, que possui os 106 aminoácidos carboxi-terminal de um polipeptideo de neublastina, por exemplo, aminoácidos 35 - 140 de ID de SEQ N° 6 (ID de SEQ N° 14) ou aminoácidos 8 - 113 de ID DE SEQ N°s 1, 3 ou 4. (xi) a sequência de polipeptídeos 105AA designada no presente documento como NBN105, que possui os 105 aminoácidos carboxi-terminal de um polipeptideo de neublastina, por exemplo, aminoácidos 36 - 140 de ID DE SEQ N° 6 (ID DE SEQ N° 15) ou aminoácidos 9 - 113 de ID DE SEQ N°S 1, 3 OU 4. (xii) a sequência de polipeptídeos 104AA designada no presente documento alternativamente como NBN104 ou N-9, que possui os 104 aminoácidos carboxi-terminal de um polipeptideo de neublastina, por exemplo, aminoácidos 37 - 140 de ID de SEQ N° 6 (ID de SEQ N° 16) ou aminoácidos 10 - 113 de ID de SEQ N°s 1, 3 ou 4. (xiii) a sequência de polipeptídeos 103AA designada no presente documento como NBN103, que possui os 103 aminoácidos carboxi-terminal de um polipeptideo de neublastina, por exemplo, aminoácidos 38 - 140 de ID DE SEQ N° 6 (ID de SEQ N° 17) ou aminoácidos 11 - 113 de ID de SEQ N°s 1, 3 ou 4. (xiv) a sequência de polipeptídeos 102ΔΑ designada no 19 ΕΡ1594436Β1 presente documento como NBN102, que possui os 102 aminoácidos carboxi-terminal de um polipeptídeo de neublastina, por exemplo, aminoácidos 39 - 140 de ID de SEQ N° 6 (ID de SEQ N° 18) ou aminoácidos 12 - 113 de ID de SEQ N°s 1, 3 ou 4. (xv) a sequência de polipeptideos 101ΔΑ designada no presente documento como NBN101, que possui os 101 aminoácidos carboxi-terminal de um polipeptídeo de neublastina, por exemplo, aminoácidos 40 - 140 de ID de SEQ N° 6 (ID de SEQ N° 19) ou aminoácidos 13 - 113 de ID de SEQ N°s 1, 3 ou 4. (xvi) a sequência de polipeptideos 100ΔΑ designada no presente documento como NBN100, que possui os 100 aminoácidos carboxi-terminal de um polipeptídeo de neublastina, por exemplo, aminoácidos 41 - 140 de ID de SEQ N° 6 (ID de SEQ N° 20) ou aminoácidos 14 - 113 de ID de SEQ N° s 1, 3 ou 4. (xvii) a sequência de polipeptideos 99AA designada no presente documento alternativamente como NBN99 ou N-14, que possui os 99 aminoácidos carboxi-terminal de um polipeptídeo de neublastina, por exemplo, aminoácidos 42 - 140 de ID de SEQ N° 6 (ID de SEQ N° 21) ou aminoácidos 15 - 113 de ID de SEQ N°s 1, 3 ou 4.
As sequências de polipeptideos destes polipeptideos de neublastina truncados são demonstradas na Tabela 4 de NBN113 até NBN99. A formação da ponte de dissulfeto está de acordo com a descrição na Tabela 3. 20 ΕΡ1594436Β1
Tabela 4. Alinhamento de Polipeptídeos de Neoblastina Truncados NBN113 NBN112 NBN111 NBN110 NBN109 NBN108 NBN107 KBN106 NBN105 HBN104 NBN103 NBN102 HBN101 NBN100 NBN99
MBK113 NBN112 NBN111 NBNXXO 1IEH109 NBN108 HBNX07 NBN106 KBNXOS ΝΒΒΓ104 HBNX03 HBNX02 NBNXOX NBN100 NBN99
xxo KBH113 HBH112 HBHX1X HEH110 KEMIO? HBN108 HEÍT107 J1BH10S BBK105 NEH104 NBN1C3 NBN102 NBNXOX NBNXOO NBN99
113 112 111 110 109 108 107 XOfi 105 104 103 102 101 100 99 (SEQ ID NO:2) {SEQ ID NO:8) {SEQ ID NO:9) {SEQ ID NO:10) (SEQ ID NO:11) (SEQ ID MO:12) (SEQ ID NO:13) (SEQ ID MO:14) (SEQ ID NO:15) (SEQ ID NO:16) (SEQ ID NO:17) (SEQ ID NO:18) (SEQ ID NO:19) (SEQ ID NO:20) (SEQ ID NO:21) 21 ΕΡ1594436Β1
Um polipeptídeo de neublastina mutada de acordo com a invenção é, pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% idêntico aos aminoácidos 8 - 113 de ID de SEQ N° 1. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido do polipeptídeo de neublastina mutada inclui a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de neublastina de ratazana, ser humano ou rato de ocorrência natural em aminoácidos 1 - 94 e 96 - 113 do polipeptídeo de neublastina mutada, por exemplo, o polipeptídeo tem a sequência de aminoácido de ID de SEQ N°s 2, 3 ou 4 nestas posições.
Um polipeptídeo de neublastina mutada diferindo na sequência dos descritos na ID de SEQ n°s 1-4 pode incluir uma ou mais substituições de aminoácidos conservativas. Em alternativa, ou adicionalmente, o polipeptídeo de neublastina mutada pode diferir por uma ou mais substituições de aminoácido não conservativas ou por deleções ou inserções. As substituições, inserções ou deleções não devem abolir a actividade biológica da proteína isolada.
Uma substituição conservativa é a substituição de um aminoácido por outro com características similares. As substituições conservativas incluem substituições dentro dos seguintes grupos: valina, alanina e glicina; leucina, valina e isoleucina; ácido aspártico e ácido glutâmico; asparagina e glutamina; serina, cisteína e treonina; lisina e arginina; e fenilalanina e tirosina. Os aminoácidos hidrofóbicos não polares incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina. Os aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina. Os aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina e 22 ΕΡ1594436Β1 histidina. Os aminoácidos negativamente carregados (acídicos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. Qualquer substituição de um membro dos grupos polares, básicos ou acidicos supracitados por outro membro do mesmo grupo pode ser considerada uma substituição conservativa.
Outras substituições podem ser identificadas facilmente pelos especialistas. Por exemplo, para a alanina de aminoácido, pode ser obtida uma substituição de qualquer uma das D-alanina, glicina, beta-alanina, cisteina e D-cisteina. Para a lisina, uma substituição pode ser qualquer uma das D-lisina, arginina, D-arginina, homoarginina, metionina, D-metionina, ornitina ou D-ornitina. Geralmente, as substituições em regiões funcionalmente importantes que se possa esperar que induzam alterações nas propriedades de polipeptideos isolados são aquelas em que: (i) um residuo polar, por exemplo, serina ou treonina, é substituído por (ou através de) um resíduo hidrofóbico, por exemplo, leucina, isoleucina, fenilalanina ou alanina; (ii) um resíduo de cisteina é substituído por (ou através de) qualquer outro resíduo; (iii) um resíduo tendo uma cadeia lateral electropositiva, por exemplo, lisina, arginina ou histidina, é substituído por (ou através de) um resíduo tendo uma cadeia lateral electronegativa, por exemplo, ácido glutâmico ou ácido aspártico; ou (iv) um resíduo tendo cadeia lateral volumosa, por exemplo, fenilalanina, é substituído por (ou através de) um não tendo uma tal cadeia lateral, por exemplo, glicina. A probabilidade de que uma das substituições não conservativas anteriores possa alterar as propriedades funcionais da proteína também está correlacionada com a posição da substituição com respeito às regiões funcionalmente importantes da proteína. Algumas regiões não 23 ΕΡ1594436Β1 conservativas podem consequentemente ter pouco ou nenhum efeito sobre as propriedades biológicas.
Em muitos casos, um polipeptídeo de neublastina mutada conjugada com polímero tem uma meia-vida de soro mais longa relativamente à meia-vida do polipeptídeo selvagem ou polipeptídeo mutado na ausência do polímero. 0 polipeptídeo de neublastina mutada conjugada com polímero pode ter uma potência significativamente aumentada in vivo relativamente à potência do polipeptídeo ou polipeptídeo glicosilado na ausência do polímero. 0 polipeptídeo de neublastina conjugada com polímero pode ser fornecido como um dímero que inclui pelo menos um polipeptídeo de neublastina conjugada com polímero. 0 dímero pode ser um homodímero de polipeptídeos de neublastina mutada conjugada com polímero. 0 dímero pode ser um homodímero de polipeptídeos de neublastina truncada mutada conjugada com polímero. 0 dímero pode ser um heterodímero que inclui um polipeptídeo de neublastina mutada conjugada com polímero e um polipeptídeo de neublastina selvagem. 0 dímero pode ser um heterodímero que inclui um polipeptídeo de neublastina mutada conjugada com polímero, e um polipeptídeo de neublastina selvagem conjugada com polímero, onde a conjugação com polímero está na terminação amino, e onde os polipeptídeos podem ou não ser truncados. Outros dímeros podem incluir heterodímeros ou homodímeros de formas de polipeptídeo de neublastina mutada conjugada com polímero que podem ou não ser truncadas.
Na invenção são fornecidas as sequências de polipeptídeo mutadas maduras e truncadas compreendendo a maioria dos 24 ΕΡ1594436Β1 resíduos de aminoácidos carboxi-terminal do polipeptídeo de pré-pró NBN, tal como fornecido na ID de SEQ N° 5, e que são designadas aqui como NBN n°, em que n° representa o número de resíduos carboxi-terminal restante no polipeptídeo de neublastina referenciada. Os polipeptídeos de neublastina conjugada com polímero presentes nos dímeros de neublastina bioactivos podem ser produtos de uma reacção de clivagem de protease ou uma reacção de clivagem química, ou podem ser expressos a partir de construção de DNA recombinante ou podem ser sintetizados. Os polipeptídeos de neublastina de exemplo incluem, por exemplo, NBN140, NBN116 e NBN113. Os polipeptídeos de neublastina adicionais da invenção incluem NBN112, NBNlll, NBN110, NBN109, NBN108, NBN107, NBN106, NBN105, NBN104, NBN103, NBN102, NBN101, NBN100 e NBN99 (ID de SEQ n°s 8-21) .
Também se descreve um polipeptídeo de neublastina conjugada com polímero que é um homodímero de NBN106-N95K conjugado com três porções de PEG de 10 kDa ("NBN106-N95K de PEG de 3x10 kDa") ou com quatro porções de PEG de 10 kDa ("NBN106-N95K de PEG de 4x10 kDa") . Também se descreve uma população mista de homodímeros NBN106-N95K conjugados com três porções de PEG de 10 kDa ou com quatro porções de PEG de 10 kDa, referidas aqui como "NBN106-N95K de PEg de 3(,4)x 10 kDa". Também é preferível um homodímero NBN106-N95K de PEG de 3(,4)xl0 kDa, em que os dois aminoácidos amino terminal são covalentemente ligados às porções de PEG e a terceira e/ou quarta porção de PEG é covalentemente ligada a um ou ambos os resíduo(s) de N95K substituído(s). O polipeptídeo de neublastina conjugada com polímero pode ser baseado na sequência de consenso da ID de SEQ N° 1 e 25 ΕΡ1594436Β1 pode incluir aminoácidos 1 - 7 da ID de SEQ N° 1, além de aminoácidos 8-113. 0 polipeptideo de neublastina conjugada com polímero, quando dimerizado pode ligar-se a GFRa3. 0 polipeptideo de neublastina conjugada com polímero, quando dimerizado pode estimular a fosforilação de tirosina de um polipeptideo de RET, quer por si próprio ou quando ligado a GFR0í3 . 0 polipeptideo de neublastina conjugada com polímero, quando dimerizado pode aumentar a sobrevivência de neurónios, por exemplo, aumenta a sobrevivência de um neurónio sensorial. 0 polipeptideo de neublastina conjugada com polímero, quando dimerizado pode reduzir ou reverter as mudanças patológicas de um neurónio, tal como um neurónio sensorial. 0 polipeptideo de neublastina conjugada com polímero, quando dimerizado pode realçar a sobrevivência de um neurónio, por exemplo, um neurónio autonômico, ou um neurónio dopaminérgico.
Conforme descrito, o polipeptideo de neublastina conjugada com polímero pode incluir uma, duas, três ou mais das substituições de aminoácido seleccionadas do grupo que consiste de um aminoácido excepto a arginina na posição 14 na sequência de aminoácidos do polipeptideo de polímero conjugado, um aminoácido excepto a arginina na posição 39 na sequência de aminoácido do polipeptideo de polímero conjugado, um aminoácido excepto a arginina na posição 68 do polipeptideo de polímero conjugado, e um aminoácido excepto a 26 ΕΡ1594436Β1 asparagina na posição 95 do polipeptídeo de polímero conjugado. 0 aminoácido num ou mais do aminoácido nas posições 14, 39, 68, e 95 pode ser a lisina. Os aminoácidos 8 - 94 e 96 - 113 do polipeptídeo de neublastina conjugada com polímero podem ser, pelo menos, 90% idênticos aos aminoácidos 8 - 94 e 96 - 113 da ID de SEQ N° 1. As sequências de aminoácidos podem ser, pelo menos, 95% idênticas a estas. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de neublastina conjugada com polímero pode incluir a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de neublastina de ratazana, rato ou humano de ocorrência natural em aminoácidos 8 - 94 e 96 - 113 do polipeptídeo de neublastina conjugada com polímero. Por exemplo, aminoácidos 8 - 94 e 96 - 113 do polipeptídeo de neublastina conjugada com polímero podem incluir a sequência de aminoácido de aminoácidos 8 - 94 e 96 - 113 de ID de SEQ N° 1, ID de SEQ N° 2, ID de SEQ N° 3 OU ID de SEQ N° 4. Para os polipeptídeos acima, o resíduo na posição de aminoácido 95 pode ser uma lisina ou uma cisteína.
Descreve-se nesta invenção uma construção que é um heterodímero ou um homodímero contendo proteínas de fusão de neublastina conjugadas com polímero, por exemplo, a neublastina com etiqueta de poli-histidina (His) fornecida na ID de SEQ N° 36, ou uma proteína de fusão de neublastina onde a porção de fusão é um polipeptídeo de imunoglobulina (Ig), polipeptídeo de albumina sérica ou um polipeptídeo derivado de replicase. As proteínas de fusão de neublastina podem ter propriedades de biodisponibilidade e farmacocinéticas realçadas in vivo. A invenção fornece uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de neublastina truncado ou maduro, 27 ΕΡ1594436Β1 com uma sequência de polipeptídeos mutados. A molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptideo de neublastina fornecida é preferencialmente fornecida num vector, por exemplo, num vector de expressão. Uma molécula de ácido nucleico de neublastina mutada, ou um vector incluindo a mesma, pode ser fornecida numa célula. A célula pode ser, por exemplo, uma célula de mamifero, célula fúngica, célula de levedura, célula de insecto, ou célula bacteriana. Uma célula mamifera preferencial é uma célula de ovário de hamster Chinês ("célula de CHO").
Também se descreve nesta invenção um método de formação de um polipeptideo de neublastina conjugada com polímero, cultivando-se uma célula contendo um ácido nucleico codificando um polipeptideo de neublastina em condições que permitem a expressão de um polipeptideo de neublastina. A neublastina pode ser conjugada com uma porção de ocorrência natural. A porção de ocorrência natural pode ser uma porção de glicosila. A neublastina glicosilada pode ser expressa, por exemplo, numa célula de CHO. 0 polipeptideo de neublastina pode ser expresso numa célula. Ácidos nucleicos similares, vectores, células hospedeiras e métodos de produção de polipeptídeos são descritos nesta invenção para as proteínas de fusão (tais como as proteínas de fusão de albumina sérica de neublastina aqui descritas).
Um polipeptideo de neublastina que é expresso numa célula pode ser recuperado e conjugado com um polímero. 0 polímero pode ser uma porção de polialquileno glicol. 0 polímero pode ser uma porção de PEG.
Descreve-se nesta invenção uma composição que inclui um 28 ΕΡ1594436Β1 polipeptídeo de neublastina mutada acoplado a um polímero de ocorrência não natural. 0 polipeptídeo de neublastina mutada na composição pode incluir uma sequência de aminoácido pelo menos 70% idêntica aos aminoácidos 8 - 113 da ID de SEQ N° 1, contanto que o polipeptídeo de neublastina conjugada com polímero inclua uma ou mais das substituições de aminoácido seleccionadas do grupo que consiste num aminoácido excepto a arginina na posição 14 na sequência de aminoácidos do polipeptídeo de polímero conjugado, um aminoácido excepto a arginina na posição 39 na sequência de aminoácidos de polipeptídeo de polímero conjugado, um aminoácido excepto a arginina na posição 68 do polipeptídeo de polímero conjugado, e um aminoácido excepto a asparagina na posição 95 do polipeptídeo de polímero conjugado, em que as posições dos aminoácidos são numeradas de acordo com a sequência de polipeptídeo da id de SEQ N° 1.
Também se descreve nesta invenção um polipeptídeo de neublastina conjugado solúvel aquoso, estável ou um complexo de polipeptídeo de neublastina mutada compreendendo um polipeptídeo de neublastina ou polipeptídeo de neublastina mutada acoplada a uma porção de PEG, em que o polipeptídeo de neublastina ou polipeptídeo de neublastina mutada é acoplado à porção de PEG através de uma ligação lábil. A ligação lábil pode ser clivável por hidrólise bioquímica, proteólise ou clivagem de sulfidrila. A ligação lábil pode ser clivável sob condições in vivo.
Também se descreve nesta invenção um método de formação de um polipeptídeo de neublastina modificada que tem uma meia-vida sérica prolongada relativamente a uma neublastina selvagem. O método inclui fornecer um polipeptídeo de 29 ΕΡ1594436Β1 neublastina ou um polipeptídeo de neublastina mutada, e acoplar o polipeptídeo ou polipeptídeo de neublastina mutada a uma porção de polímero de ocorrência não natural, formando assim uma composição de polipeptídeo de neublastina de polímero acoplado.
Os polipeptídeos de neublastina mutada conjugados de polímero descritos nesta invenção incluem uma ou mais substituições de aminoácido em que, por exemplo, um aminoácido excepto a arginina que ocorre na posição 14 na sequência de aminoácido do polipeptídeo de polímero conjugado, um aminoácido excepto a arginina na posição 39 ocorre na sequência de aminoácido do polipeptídeo de polímero conjugado, um aminoácido excepto a arginina na posição 68 ocorre no polipeptídeo de polímero conjugado, ou um aminoácido excepto a asparagina na posição 95 ocorre no polipeptídeo de polímero conjugado, quando as posições dos aminoácidos são numeradas de acordo com a sequência de polipeptídeo da id de SEQ n° 1. Síntese e Isolamento de Polipeptídeos de Neublastina Mutada e Selvagem
Os polipeptídeos de neublastina podem ser isolados empregando métodos conhecidos na técnica. Os polipeptídeos de neublastina de ocorrência natural podem ser isolados de fontes de tecido ou de células através de um esquema de purificação adequada utilizando técnicas padrão de purificação de proteína. Em alternativa, os polipeptídeos de neublastina mutada podem ser sintetizados quimicamente, utilizando técnicas padrão de síntese de peptídeo. A síntese de sequências de aminoácido curtas é bem estabelecida na 30 ΕΡ1594436Β1 técnica de peptídeo. Veja-se, por exemplo, Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis (2d ed., 1984).
Nalgumas modalidades, os polipeptídeos de neublastina mutada são produzidos através de técnicas de DNA recombinantes. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptideo de neublastina mutada pode ser inserida num vector, por exemplo, num vector de expressão, e o ácido nucleico pode ser introduzido numa célula. As células adequadas incluem, por exemplo, células de mamíferos (tal como, células humanas ou células de CHO), células fúngicas, células de levedura, células de insecto e células bacterianas. Quando expressa numa célula recombinante, a célula é preferivelmente cultivada em condições que permitem a expressão de um polipeptideo de neublastina mutada. O polipeptideo de neublastina mutada pode ser recuperado de uma suspensão de célula, se desejado. De acordo com a definição utilizada no presente documento, "recuperado" significa que o polipeptideo mutado é removido dos componentes de uma célula ou do meio de cultura em que está presente antes do processo de recuperação. 0 processo de recuperação pode incluir uma ou mais etapas de purificação ou redobragem.
Os polipeptídeos de neublastina mutada podem ser construídos empregando quaisquer dos diversos métodos conhecidos na técnica. Um desses métodos é a mutagénese direccionada ao sítio, através da qual se altera um nucleotídeo específico (ou, se desejado, um pequeno número de nucleotídeos específicos) para mudar um único aminoácido (ou, se desejado, um pequeno número de resíduos de aminoácido pré-determinados) no polipeptideo de neublastina codificado. Os técnicos reconhecem que a mutagénese direccionada ao sítio é 31 ΕΡ1594436Β1 uma técnica rotineira e amplamente utilizada. De facto, existem muitos kits de mutagénese direccionada ao sitio disponíveis no comércio. Um desses kits é o "Transformer Site Directed Mutagenesis Kit" vendido pelos Clontech Laboratories (Paio Alto, Calif.). A prática da presente invenção empregará, salvo se indicado em contrário, técnicas convencionais de biologia celular, cultura de célula, biologia molecular, microbiologia, DNA recombinante, química de proteína, e imunologia, que estão ao alcance de qualquer especialista. Tais técnicas estão descritas na literatura. Ver, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição. (Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volumes I e LI (D.N. Glover, ed), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M. J. Gait, ed.), 1984; Patente dos Estados Unidos n° 4.683.195 (Mullis et al.)} Nucleic Acid Hybridization (B. D. Haines e S. J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (B. D. Hames e S. J. Higgins, eds.), 1984 ; Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, ed). Alan R. Liss, Inc. , 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (13.Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 e 155 (Wu et al., eds), Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. Miller e M. P. Calos, eds.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; immunochernical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.), Academic Press, London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes I - IV (D. M. Weir e C. C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986. 32 ΕΡ1594436Β1
Conjugação com Polímero de Polipeptídeos de Neublastina
Polipeptídeos de neublastina quimicamente modificados podem ser preparados por um especialista com base na presente descrição. As porções químicas preferidas para conjugação com um polipeptídeo de neublastina são polímeros solúveis em água. Um polímero solúvel em água é vantajoso porque a proteína à qual é ligado não precipita num ambiente aquoso, tal como um ambiente fisiológico. 0 polímero pode ser farmaceuticamente aceitável para a preparação de um produto ou composição terapêutica.
Se desejado, uma única molécula de polímero pode ser utilizada para conjugação com um polipeptídeo de neublastina, apesar de mais do que uma molécula de polímero possa ser ligada também. As composições de neublastina conjugadas descritas nesta invenção podem ser igualmente úteis em aplicações in vivo como em não in vivo. Além disso, será reconhecido que o polímero de conjugação pode utilizar quaisquer outros grupos, porções, ou outras espécies conjugadas, se tal se revelar apropriado à sua aplicação final. Por exemplo, pode ser útil em algumas aplicações para ligar covalentemente ao polímero uma porção funcional conferindo uma maior resistência à degradação por UV, ou à antioxidação, ou a outras propriedades ou características ao polímero. Citando outro exemplo, pode ser vantajoso em algumas aplicações funcionalizar o polímero para o tornar reactivo ou reticulável, de forma a aumentar várias propriedades ou características do material conjugado total. Do mesmo modo, o polímero pode conter qualquer funcionalidade, grupos de repetição, ligações, ou outras estruturas constituintes que não impedem a eficácia da 33 ΕΡ1594436Β1 composição de neublastina conjugada para o fim a que se destina.
Um especialista é capaz de seleccionar o polímero desejado com base em tais considerações como se o polimero/proteina conjugado se destina a ser utilizado para fins terapêuticos e, se for o caso, a dosagem desejada, o tempo de circulação, a resistência à proteólise, e outras considerações. A eficácia da derivação pode ser verificada administrando-se o derivado, na forma desejada (por exemplo, por bomba osmótica, ou, mais preferivelmente, por injecção ou infusão, ou, também formulado para vias de distribuição orais, pulmonares ou outras), e determinando sua eficácia.
Os polímeros solúveis em água adequados incluem, mas não se limitam a PEG, copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrana, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6- trioxano, copolímero de anidrido etileno/maleico, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios), e dextrana ou poli(n-vinil pirrolidona) PEG, homopolímeros de propileno glicol, copolímeros de óxido de etileno/óxido de polipropileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico, e suas misturas. 0 polímero pode ser de qualquer peso molecular adequado, e pode ser ramificado ou não ramificado.
Para PEG, o peso molecular médio adequado situa-se entre cerca de 2 kDa e cerca de 100 kDa. Este facilita o manuseio e fabricação. Os técnicos concluirão que em preparações de PEG, algumas moléculas pesarão mais e algumas menos do que o peso 34 ΕΡ1594436Β1 molecular estabelecido. Assim, o peso molecular é tipicamente especificado como "peso molecular médio". Podem ser utilizados outros pesos moleculares (dimensões), dependendo do perfil terapêutico desejado (por exemplo, a duração da libertação prolongada desejada; os efeitos, caso os haja, sobre a actividade biológica; a facilidade no manuseamento; o grau ou falta de antigenicidade e outros efeitos conhecidos de PEG numa proteína terapêutica). Em várias modalidades, o peso molecular é cerca de 2 kDa, cerca de 5 kDa, cerca de 10 kDa, cerca de 15 kDa, cerca de 20 kDa, cerca de 25 kDa, cerca de 30 kDa, cerca de 40 kDa ou cerca de 100 kDa. O peso molecular médio de cada cadeia de PEG pode ser de cerca de 20 kDa. O peso molecular médio pode ser de cerca de 10 kDa. O número de moléculas de polímeros ligadas desse modo pode variar, e um especialista será capaz de verificar o efeito sobre a função. Poder-se-á monoderivar, ou fornecer uma combinação di, tri, tetra ou qualquer outra combinação de derivação, com as mesmas ou diferentes porções químicas (por exemplo, polímeros, tais como pesos diferentes de PEGs). A proporção das moléculas de polímero para moléculas de proteína (ou polipeptídeo) varia, tal como variam as suas concentrações na mistura de reacção. Em geral, a taxa ideal (em termos de eficiência de reacção na qual não há polímero ou proteína não reagido em excesso) será determinada por factores tais como o grau desejado de derivação (por exemplo, mono, di, tri, etc.), o peso molecular do polímero selecionado, quer o polímero seja ramificado ou não ramificado, e as condições de reacção.
As moléculas de PEG (ou outras porções químicas) devem ser ligadas à proteína considerando os efeitos sobre os 35 ΕΡ1594436Β1 domínios antigénicos ou funcionais da proteína. Há vários métodos de ligação disponíveis pelos técnicos. Ver, por exemplo, o EP 0 401384 (acoplando o PEG ao G-CSF); Malik et al., Exp. Hematol. 20: 1028 - 1035, 1992 (relatando PEGuilação de GM-CSF utilizando cloreto de tresila).
Por exemplo, o PEG pode ser covalentemente ligado (PEGuilação) através dos resíduos de aminoácido por meio de um grupo reactivo, tal como um amino livre ou grupo de carboxila. Os resíduos de aminoácido tendo o grupo de amino livre incluem resíduos de lisina e o resíduo de aminoácido amino terminal. Os que têm um grupo de carboxila livre incluem resíduos de ácido aspártico, resíduos de ácido glutâmico, e o resíduo de aminoácido de terminal C. Também se podem utilizar grupos de sulfidrila como um grupo reactivo para ligar a(s) molécula (s) PEG. Para fins terapêuticos, a ligação pode estar num grupo amino, por exemplo, no grupo de lisina ou terminal N. Pode desejar-se de forma específica uma proteína quimicamente modificada amino terminal.
Empregando PEG como uma ilustração das presentes composições, alguém pode seleccionar de uma variedade de moléculas de PEG (por peso molecular, ramificação, etc.), a proporção de moléculas de PEG para moléculas de proteína (ou peptídeo) na mistura de reacção, o tipo de reacção de PEGuilação a ser realizada, e o método de obter a proteína PEGuilada terminalmente de amino seleccionada. O método de obter a preparação PEGuilada amino terminal (isto é, separando esta porção de outras porções mono PEGuiladas se necessário) pode ser através da purificação do material PEGuilado amino terminal de uma população de moléculas de proteína PEGuilada. A modificação química amino terminal 36 ΕΡ1594436Β1 selectiva pode ser realizada por alquilação redutiva que explora a reactividade diferencial de tipos diferentes de grupos de amino primários (lisina versus o terminal amino) disponíveis para derivação numa determinada proteína. Com as condições de reacção apropriadas, obtem-se a derivação substancialmente selectiva da proteína no terminal amino com um grupo de carbonilo contendo polímero. Por exemplo, pode-se selectivamente peguilar o terminal amino da proteína realizando-se a reacção num pH que permite beneficiar das diferenças de pKa entre o grupo épsilon (ε)-amino dos resíduos de lisina e os do grupo de alfa (a)-amino do resíduo amino terminal da proteína. Com tal derivação selectiva, controla-se a ligação de um polímero solúvel em água numa proteína: a conjugação com o polímero ocorre predominantemente no terminal amino da proteína e não se regista qualquer modificação significativa dos outros grupos reactivos, tal como os grupos de amino de cadeia lateral de lisina.
Utilizando a alquilação redutiva, o polímero solúvel em água pode ser do tipo acima descrito, e deveria ter um único aldeído reactivo para acoplar à proteína. Pode utilizar-se propionaldeído de PEG, contendo um único aldeído reactivo.
Também se descrevem nesta invenção polipeptídeos de neublastina mutada que podem ser expressos em procariotas e eucariotas ou feitos sinteticamente. A neublastina pode ser glicosilada. 0 dímero de neublastina pode ser conjugado com o polímero em cada terminal amino e glicosilado em cada resíduo interno de Asn95. 0 dímero de neublastina mutada pode ser conjugado com o polímero em cada terminal amino e conjugado com o polímero num ou em ambos resíduos internos de Lis95. 37 ΕΡ1594436Β1 A PEGuilação pode ser realizada por qualquer reacção de PEGuilação adequada. Há várias químicas de PEGuilação conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Focus on Growth Factors, 3 (2): 4 - 10, 1992; EP 0 154 316; EP 0 401 384 ; e as outras publicações citadas aqui que relatam PEGuilação. A PEGuilação pode ser realizada através de uma reacção de acilação ou uma reacção de alquilação com uma molécula de PEG reactiva (ou um polímero reactivo análogo solúvel em água) . A PEGuilação por acilação geralmente envolve fazer reagir um derivado de éster activo de PEG. Pode utilizar-se qualquer molécula de PEG reactiva conhecida ou descoberta posteriormente para realizar a PEGuilação. O éster de PEG activado pode ser PEG esterificado a N-hidroxisuccinimida (NHS). De acordo com a definição utilizada no presente documento, "acilação" inclui sem limitação os seguintes tipos de ligações entre a proteína terapêutica e um polímero solúvel em água tal como PEG: amida, carbamato, uretano, e similares. Ver, Bioconjugate Chem. 5: 133 - 140, 1994. As condições de reação podem ser selecionadas de qualquer uma das conhecidas na técnica de PEGuilação ou nas subsequentemente desenvolvidas, mas deveriam evitar condições tais como temperatura, solvente, e pH que inactivariam o polipeptídeo ou a proteína de neublastina a ser modificada. A PEGuilação por acilação resulta geralmente num produto de proteína de neublastina poli-PEGuilado. Preferivelmente, a ligação de conexão será uma amida. O produto resultante pode ser substancialmente apenas (por exemplo, > 95%) mono, di- ou tri- PEGuilado. No entanto, podem formar-se algumas espécies com níveis mais elevados de PEGuilação em quantidades que dependem das condições de reacção específicas utilizadas. Se 38 ΕΡ1594436Β1 desejado, podem separar-se espécies PEGuiladas mais purificadas das misturadas, especificamente espécies não reagidas, através de técnicas padrão de purificação, incluindo, entre outras, diálise, dessalinização, ultrafiltração, cromatografia de permuta de ião, cromatografia de filtração de gel e electroforese. A PEGuilação por alquilação geralmente envolve reagir um derivado de aldeido de terminal de PEG com neublastina na presença de um agente de redução. A PEGuilação por alquilação pode resultar também em produtos de proteína de neublastina poli-PEGuilada. Além disso, pode manipular-se as condições de reacção para favorecer substancialmente a PEGuilação apenas no grupo de α-amino da terminação amino de neublastina (isto é, uma proteina mono- PEGuilada). No caso da mono- PEGuilação ou da poli- PEGuilação, os grupos de PEG são preferencialmente ligados à proteína por meio de um grupo -CH2-NH, sendo este tipo de ligação aqui referida aqui como uma ligação "alquilo". A derivação através de alquilação redutiva para produzir um produto mono-PEGuilado explora a reactividade diferencial de tipos diferentes de grupos de amino primários (lisina versus o terminal amino) disponível para derivação. A reacção é realizada num pH que permite alguém levar a vantagem das diferenças de pKa entre os grupos de (-amino dos resíduos de lisina e aquelas do grupo de (-amino do resíduo amino terminal da proteina. Por tal derivação selectiva, a ligação de um polimero solúvel em água que contém um grupo reactivo tal como um aldeido a, numa proteina é controlada: a conjugação com o polimero ocorre predominantemente no terminal amino da proteina e não se verifica nenhuma 39 ΕΡ1594436Β1 modificação significativa de outros grupos reactivos, tais como nos grupos de amino de cadeia lateral de lisina.
As moléculas de polímero utilizadas igualmente nas abordagens de acilação e alquilação podem ser seleccionadas nos polímeros solúveis em água conforme acima descritos. O polímero seleccionado deve ser modificado para ter um único grupo reactivo, tal como um éster activo para acilação ou um aldeído para alquilação, de preferência, para que o grau de polimerização possa ser controlado, conforme previsto nos métodos presentes. Um aldeído de PEG reactivo exemplar é o propionaldeído, que é estável em água, ou o mono C1-C10 alcóxi ou os seus derivados de ariloxi (ver Patente Norte-Americana 5.252.714). 0 polímero pode ser ramificado ou não ramificado. Para as reacções de acilação, o(s) polímero(s) selecionado(s) deveria(am) ter um único grupo de éster reactivo. Para a alquilação redutiva presente, o(s) polímero(s) selecionado(s) deveria(m) ter um único grupo de aldeído reactivo. Geralmente, o polímero solúvel em água não é selecionado nos resíduos de glicosila de ocorrência natural, visto que estes são normalmente formados de forma mais conveniente através de sistemas de expressão recombinantes de mamíferos. 0 polímero pode ser ter qualquer peso molecular, e pode ser ramificado ou não ramificado.
Um polímero solúvel em água exemplar é o PEG. 0 polietileno glicol abrange qualquer uma das formas de PEG que foram utilizadas para derivar outras proteínas, incluindo, entre outras, por exemplo, o mono-(C1-C10) alcóxi- ou arilóxi-PEG.
Em termos gerais, a derivação química pode ser realizada 40 ΕΡ1594436Β1 em qualquer condição adequada que é utilizada para fazer reagir uma substância biologicamente activa com uma molécula de polímero activada. Os métodos para preparar uma neublastina PEGuilada incluem normalmente as etapas de (a) reacção de um polipeptídeo ou proteína de neublastina com o PEG (tal como um éster reactivo ou derivado de aldeído de PEG) em condições onde a molécula se liga a um ou mais grupos de PEG, e (b) obtenção do(s) produto(s) de reacção. Em geral, as condições de reacção ideais para as reacções de acilação são determinadas caso a caso, com base nos parâmetros conhecidos e no resultado desejado. Por exemplo, quanto maior for a relação entre o PEG e a proteína, maior a percentagem do produto poli- PEGuilado. A alquilação redutiva para produzir uma população substancialmente homogénea de monopolímero/neublastina geralmente compreende as etapas de: (a) reacção de um polipeptídeo ou proteína de neublastina com uma molécula de PEG reactiva em condições de alquilação redutiva num pH adequado para "pen-nit” modificação selectiva do grupo examino no terminal amino de neublastina; e (b) obtenção do(s) produto(s) de reacção.
Para uma população substancialmente homogénea de monopolímero/neublastina, as condições de reacção de alquilação redutiva são aquelas que permitem a ligação selectiva da porção de polímero solúvel em água ao terminal amino de neublastina. Tais condições de reacção geralmente resultam em diferenças de pKa entre os grupos de amino de lisina e o grupo de α-amino no terminal amino (sendo o pKa o pH no qual 50% dos grupos de amino são protonados e 50% não o são) . O pH também afecta a proporção a utilizar entre o 41 ΕΡ1594436Β1 polímero e a proteína. Em geral, se o pH for mais reduzido, é necessário muito mais polímero para a proteína (isto é, quanto menos reactivo for o grupo α-amino do amino terminal, mais polímeros serão necessários para obter as condições ideais) . Se o pH for mais elevado, a proporção entre o polímero e a proteína não necessita de ser tão grande (isto é, estão disponíveis grupos mais reactivos, portanto são necessárias menos moléculas de polímero). Para fins da presente invenção, o pH geralmente inclui-se na faixa de 3-9, preferencialmente 3-6.
Outro factor importante é o peso molecular do polímero. Em geral, quanto maior o peso molecular do polímero, menos moléculas de polímero podem ser ligadas à proteína. Da mesma forma, a ramificação do polímero deveria ser levada em conta quando estes parâmetros são optimizados. Em termos gerais, quanto mais elevado o peso molecular (ou quanto mais ramificações), maior a relação de polímero:proteína. Em geral, para as reacções de PEGuilação incluídas no presente documento, o peso molecular médio preferencial é de cerca de 2 kDa a cerca de 100 kDa. O peso molecular médio preferencial é de cerca de 5 kDa a cerca de 50 kDa, preferencialmente entre cerca de 10 kDa a cerca de 20 kDa. O peso molecular total preferido é entre cerca de 10 kDa a cerca de 40 kDa. 0 polipeptídeo de neublastina pode ser ligado ao polímero por meio de um grupo reactivo terminal no polipeptídeo. Em alternativa, ou adicionalmente, o polipeptídeo de neublastina pode ser ligado por meio do grupo de amino de cadeia lateral de um resíduo de lisina interno, por exemplo, um resíduo de lisina introduzido na sequência de aminoácido de um polipeptídeo de neublastina de ocorrência 42 ΕΡ1594436Β1 natural. Assim, as conjugações também podem ser ramificadas a partir dos grupos reactivos não terminais. 0 polímero com o(s) grupo (s) reactivo(s) é designado "polímero activado". 0 grupo reactivo reage selectivamente com os grupos reactivos na proteína, como por exemplo o amino livre. A ligação pode ocorrer no polímero activado em qualquer grupo de amino de neublastina disponível, tal como nos grupos alfa amino ou nos grupos epsilon amino de um resíduo de lisina ou resíduos introduzidos na sequência de aminoácido de um polipeptídeo de neublastina. Também podem utilizar-se como sítios de ligação grupos carboxílicos livres, grupos de carbonilo adequadamente activados, hidroxilo, guanidilo, imidazol, porções de carboidrato oxidadas e grupos de mercapto da neublastina (se disponíveis).
Geralmente utiliza-se entre cerca de 1,0 a cerca de 10 moles do polímero activado por mol da proteína, dependendo da concentração de proteína. A quantidade final resulta de um equilíbrio entre maximizar a extensão da reacção ao mesmo tempo que se minimizam as modificações não específicas do produto, definindo também simultaneamente químicas que mantenham a actividade ideal, enquanto optimizam, ao mesmo tempo, se possível, a meia-vida da proteína. Pelo menos cerca de 50% ou aproximadamente 100% da actividade biológica da proteína pode ser retida. O polímero pode ser acoplado ao polipeptídeo de neublastina utilizando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a porção de polialquileno glicol pode ser acoplada a um grupo de lisina do polipeptídeo de neublastina mutada. A ligação ao grupo de lisina pode ser realizada com um éster 43 ΕΡ1594436Β1 activo de N-hidroxilsuccinimida (NHS) tal como o succinato de succinimidila de PEG (SS-PEG) e o propionato de succinimidila (SPA-PEG). Porções de polialquileno glicol adequadas incluem, por exemplo, carboximetil-NHS, norleucina-NHS, SC-PEG, tresilato, aldeído, epóxido, carbonilimidazol, e carbonato de PNP .
Os ligadores de PEG reactivos de amina suplementares podem ser substituídos pela porção de succinimidila. Estes incluem, por exemplo, isotiocianatos, nitrofenilcarbonatos, epóxidos, e carbonatos de benzotriazol. As condições são preferencialmente escolhidas para maximizar a selectividade e extensão ou reacção.
Se desejado, os polipeptídeos de neublastina conjugada com polímero podem conter uma etiqueta que pode subsequentemente ser libertado por proteólise. Desse modo, a porção de lisina pode ser selectivamente modificada fazendo reagir inicialmente uma etiqueta de His modificada com um ligador de baixo peso molecular tal como o reagente de Traut (Pierce) que reagirá com a lisina e o terminal amino, libertando em seguida a etiqueta de His. 0 polipeptídeo conterá então um grupo de SH livre que pode ser selectivamente modificado com um PEG contendo um grupo cabeça reactivo de tiol tal como grupo de maleimida, um grupo de vinilsulfona, um grupo de haloacetato, ou um SH protegido ou livre. 0 reagente de Traut pode ser substituído por qualquer ligador que estabelecerá um sítio específico para ligação ao PEG. Por exemplo, o reagente de Traut pode ser substituído por SPDP, SMPT, SATA, ou SATP (todos disponíveis na Pierce) . 44 ΕΡ1594436Β1
De igual modo, poderia fazer-se reagir a proteína com um ligador reactivo de amina que introduz uma maleimida (por exemplo, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS, OU GMBS), um grupo de haloacetato (SBAP, SIA, SIAB), ou um grupo de vinilsulfona e fazer reagir o produto resultante com um PEG que contenha um SH livre. A única limitação da dimensão do ligador utilizado é que este não pode bloquear a remoção subsequente da etiqueta terminal amino. A porção de polialquileno glicol pode ser acoplada a um grupo de cisteína do polipeptídeo de neublastina mutada. 0 acoplamento pode ser realizado utilizando, por exemplo, um grupo de maleimida, um grupo de vinilsulfona, um grupo de haloacetato, e um grupo de tiol. 0 polipeptídeo de neublastina conjugada com polímero na composição tem uma meia-vida sérica mais longa relativamente à meia-vida do polipeptídeo de neublastina na ausência do polímero. Como alternativa, ou, adicionalmente, o dímero de polipeptídeo de neublastina conjugada com polímero na composição liga o GFRa, activa o RET, normaliza as mudanças patológicas de um neurónio, aumenta a sobrevivência de um neurónio, ou melhora a dor neuropática, ou combina estas funções fisiológicas. Descrevem-se ensaios para determinar se um polipeptídeo realça a sobrevivência de um neurónio, ou normaliza as mudanças patológicas de um neurónio, por exemplo, em WO00/01815. 0 neurónio pode ser um neurónio sensorial, um neurónio autonômico, ou um neurónio dopaminérgico. A composição pode ser um complexo de polipeptídeo de neublastina conjugada estável, solúvel aquoso, compreendendo 45 ΕΡ1594436Β1 um polipeptídeo de neublastina ou polipeptídeo de neublastina mutada acoplado a uma porção de PEG. Se desejado, o polipeptídeo de neublastina ou polipeptídeo de neublastina mutada pode ser acoplado à porção de PEG por uma ligação lábil. A ligação lábil pode ser clivada em, por exemplo, hidrólise bioquímica, proteólise, ou clivagem de sulfidrila. Por exemplo, a ligação pode ser clivada em condições in vivo (fisiológicas).
Outros parâmetros de reacção, tal como solvente, tempos de reacção, temperaturas, etc., e meios de purificação de produtos, podem ser determinados caso a caso, com base nas informações publicadas relativas à derivação de proteínas com polímeros solúveis em água.
Se desejado, pode utilizar-se uma única molécula de polímero para conjugação por polipeptídeos de neublastina. Em alternativa, pode ligar-se mais do que uma molécula de polímero. As composições de neublastina conjugada descritas nesta invenção podem encontrar utilidade em aplicações in vivo bem como em aplicações não in vivo. Além disso, reconhecer-se-á que o polímero de conjugação pode utilizar quaisquer outros grupos, porções, ou outras espécies conjugadas, sempre que se adeqúem ao fim desejado. Por exemplo, pode ser útil em algumas aplicações ligar de forma covalente ao polímero uma porção funcional que confere uma maior resistência de degradação por uv, ou à antioxidação, ou a outras propriedades ou caracteristicas do polímero. Citando outro exemplo, pode ser vantajoso em algumas aplicações funcionalizar o polímero para o tornar reactivo ou reticulável, de forma a aumentar várias propriedades ou caracteristicas do material conjugado total. Do mesmo modo, o 46 ΕΡ1594436Β1 polímero pode conter qualquer funcionalidade, grupos de repetição, ligações ou outras estruturas constituintes que não impeçam a eficácia da composição de muteína de neublastina conjugada para o fim a que se destina.
Descrevem-se abaixo polímeros ilustrativos que podem ser utilizados de forma vantajosa para obter estas características em esquemas de reacção exemplares. Em aplicações de peptídeos covalentemente ligados, o polímero pode ser funcionalizado e em seguida acoplado ao(s) aminoácido(s) livre(s) do(s) peptídeo(s) para formar ligações lábeis.
As reacções podem ocorrer por qualquer método adequado utilizado para fazer reagir materiais biologicamente activos com polímeros inertes, preferencialmente com um pH de cerca de 5 - 8, por exemplo, pH 5, 6, 7, ou 8, se os grupos reactivos estiverem no grupo alfa amino no terminal amino. Geralmente, o processo envolve preparar um polímero activado e consequentemente fazer reagir a proteína com o polímero activado para produzir a proteína solúvel adequada para formulação. A reacção da modificação anterior pode ser realizada por vários métodos, que podem envolver uma ou mais etapas.
Podem ser utilizadas formas lineares e ramificadas de PEG bem como outras formas de alquilo. 0 comprimento de PEG pode ser variado. As formas mais comuns variam em termos de dimensão entre 2K - 100 kDa. Ao mesmo tempo que os presentes exemplos relatam que a PEGuilação direccionada no terminal amino não afecta as propriedades farmocinéticas, o facto de que o material manteve a função fisiológica indica que a 47 ΕΡ1594436Β1 modificação no sitio ou sítios descritos no presente documento não é prejudicial. Consequentemente, ao gerar formas mutantes de neublastina que poderiam fornecer sítios adicionais de ligação através da inserção de resíduos de lisina, seria provável que estas formas fossem PEGuiladas na lisina e no terminal amino.
Um ou mais sítios num polipeptídeo de neublastina podem ser acoplados a um polímero. Por exemplo, uma, duas, três, quatro ou cinco porções de PEG podem ser ligadas ao polipeptídeo. Uma porção de PEG pode ser ligada ao terminal amino e/ou aminoácidos 14, 39, 68, e 95 de um polipeptídeo de neublastina numerado como ilustra a Tabela 1 e a ID de SEQ N° 1. 0 polipeptídeo de neublastina conjugada com polímero na composição pode ter uma meia-vida sérica mais longa relativamente à meia-vida do polipeptídeo mutado ou selvagem de neublastina na ausência do polímero. Em alternativa, ou, adicionalmente, o polipeptídeo de neublastina conjugada com polímero na composição liga GFRa3, activa o RET, normaliza mudanças patológicas de um neurónio, aumenta a sobrevivência de um neurónio, ou melhora a dor neuropática, ou combina estas funções fisiológicas. 0 polipeptídeo de neublastina mutada ou conjugada com polímero no complexo pode ter uma actividade fisiológica seleccionada do grupo que consiste em: ligação de GFRa3, activação de RET, normalização de mudanças patológicas de um neurónio, aumentar a sobrevivência de neurónio, ou melhorar a dor neuropática. 48 ΕΡ1594436Β1
Também se descrevem nesta invenção polipeptídeos multiméricos que incluem um polipeptideo de neublastina conjugada com polímero. Os polipeptídeos multiméricos podem ser polipeptídeos multiméricos purificados. Exemplos de complexos multiméricos incluem, por exemplo, complexos diméricos. 0 complexo multimérico pode ser fornecido como um complexo heteromérico ou homomérico. Desse modo, o complexo multimérico pode ser um complexo de polipeptideo de polímero conjugado heterodimérico que inclui um polipeptideo de neublastina mutada e um de neublastina não mutada ou um complexo de polipeptideo de polímero conjugado heterodimérico incluindo dois ou mais polipeptídeos de neublastina mutada. 0 polipeptideo de neublastina conjugada com polímero pode ligar GFRa3. A ligação do polipeptideo de neublastina conjugada com polímero pode estimular a fosforilação de um polipeptideo de RET. Para determinar se um polipeptideo liga GFR0C3, podem ser realizados ensaios conforme se descreve em WO00/01815. Por exemplo, a presença de neublastina nos meios de sobrenadantes de linhagem de célula de CHO pode ser descrita empregando uma forma modificada de um ensaio de complexo ternário descrito por Sanicola et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1997, 94:6238). Neste ensaio, a capacidade de moléculas similares a GDNF pode ser avaliada quanto à sua capacidade de mediar a ligação entre o domínio extracelular de RET e os vários co-receptores, GFRal, GFR0C2, e GFR(x3. Formas solúveis de RET e os co-receptores são gerados como proteínas de fusão. Uma proteína de fusão entre o domínio extracelular de RET de ratazana e fosfatase alcalina placentária (RET-AP) e uma proteína de fusão entre o domínio extracelular de GFRa-1 de ratazana (descrito no pedido publicado W09744356; 27 de Novembro de 1997) e o domínio Fc 49 ΕΡ1594436Β1 de IgGl humano (rGFR((l-Ig) foram descritas (Sanicola et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1997, 94:6238). O polímero descrito nesta invenção pode ser uma porção de polialquileno glicol, e preferencialmente uma porção de PEG. Uma porção polimérica pode ter um peso molecular médio entre cerca de 100 Da a cerca de 25.000 Da; de cerca de 1000 Da a cerca de 20.000 Da; ou de cerca de 5000 Da a cerca de 20.000 Da. Pelo menos uma porção polimérica pode ter um peso molecular médio de cerca de 5000 Da; um peso molecular médio de cerca de 10.000 Da; ou um peso molecular médio de cerca de 20.000 Da. 0 grupo funcional na porção de polialquileno glicol pode ser, por exemplo, carboximetil-NHS, norleucina-NHS, SC-PEG, tresilato, aldeído, epóxido, carbonilimidazol, ou carbonato de PNP. O acoplamento pode ocorrer por meio de um éster activo de N-hidroxilsuccinimida (NHS). O éster activo pode ser, por exemplo, succinato de succinimidila de PEG (SS-PEG), butirato de succinimidila (SPB-PEG), ou propionato de succinimidila (SPA-PEG). A porção de polialquileno glicol pode ser acoplada num grupo de cisteína do polipeptídeo de neublastina ou polipeptídeo de neublastina mutada. Por exemplo, o acoplamento pode ocorrer por meio de um grupo de maleimida, um grupo de vinilsulfona, um grupo de haloacetato, e um grupo de tiol. O polipeptídeo de neublastina ou polipeptídeo de neublastina mutada pode compreender uma, duas, três, ou quatro porções de PEG. O polímero pode ser acoplado ao polipeptídeo num sítio na neublastina que é um terminal N. O polímero pode ser acoplado ao polipeptídeo num sítio num aminoácido não 50 ΕΡ1594436Β1 terminal do polipeptídeo de neublastina ou polipeptídeo de neublastina mutada. 0 polímero pode ser acoplado a um aminoácido exposto ao solvente do polipeptídeo de neublastina ou polipeptídeo de neublastina mutada. 0 polímero pode ser acoplado ao polipeptídeo de neublastina ou polipeptídeo de neublastina mutada num resíduo seleccionado do grupo que consiste do aminoácido amino terminal do polipeptídeo de polímero conjugado, posição 14 na sequência de aminoácidos do polipeptídeo de neublastina ou polipeptídeo de neublastina mutada, posição 39 na sequência de aminoácidos do polipeptídeo de neublastina ou polipeptídeo de neublastina mutada, posição 68 na sequência de aminoácidos do polipeptídeo de neublastina ou polipeptídeo de neublastina mutada, e posição 95 na sequência de aminoácidos do polipeptídeo de neublastina ou polipeptídeo mutado.
Proteínas de fusão de neublastina conjugada com polímero
Se desejado, o polipeptídeo de neublastina conjugada com polímero pode ser uma proteína de fusão. Os derivados de polipeptídeo de fusão de proteínas descritos nesta invenção também incluem várias formas estruturais da proteína primária que mantêm a actividade biológica.
As fusões de albumina sérica de neublastina conjugada com polímero podem ser construídas utilizando métodos conhecidos na técnica. Qualquer um dos diversos reticuladores que contêm um grupo reactivo amino correspondente e grupo reactivo de tiol pode ser utilizado para ligar a neublastina à albumina sérica. Exemplos de ligadores adequados incluem reticuladores reactivos de amina que inserem uma maleimida 51 ΕΡ1594436Β1 reactiva de tiol. Estes incluem, por exemplo, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS, ou GMBS. Outros ligadores adequados inserem um grupo de haloacetato reactivo de tiol. Estes incluem, por exemplo, SBAP, SIA, SIAB e os que fornecem um tiol protegido ou não protegido para reacção com grupos de sulfidrila para produzir uma ligação reduzível são SPDP, SMPT, SATA, ou SATP, estando todos eles disponíveis no mercado (por exemplo, na Pierce Chemicals). Um técnico pode prever, de forma semelhante estratégias alternativas para ligar o terminal amino da neublastina à albumina sérica.
Um especialista pode gerar conjugados à albumina sérica que não constituem o alvo no terminal amino da neublastina ou na porção de tiol em albumina sérica. Se desejado, as fusões de albumina sérica de neublastina podem ser geradas utilizando técnicas de engenharia genética, em que a neublastina é fundida ao gene de albumina sérica no seu terminal carboxi amino terminal, ou em ambas as extremidades.
Qualquer conjugado por neublastina que resulte num produto com uma meia-vida prolongada, por exemplo, in vivo ou, especificamente, em animais (incluindo seres humanos) pode ser gerado empregando uma estratégia similar. Outro exemplo de um conjugado por neublastina que resulta num produto com uma meia-vida prolongada in vivo é uma proteína de fusão de neublastina onde o par de fusão é um Ig.
Outros derivados de neublastinas conjugadas com polímero incluem conjugados covalentes ou agregados de neublastina mutada nos seus fragmentos com outras proteínas ou polipeptídeos, tal como por síntese em cultura recombinante como terminais amino ou terminais carboxi suplementares. Por 52 ΕΡ1594436Β1 exemplo, o peptídeo conjugado pode ser uma sequência de polipeptídeos de sinal (ou líder) na região amino terminal da proteína que co-translacionalmente ou pós-translacionalmente direcciona a transferência da proteína do seu sítio de síntese para o seu sítio de função dentro ou fora da parede ou membrana de célula (por exemplo, o líder de factor alfa de levedura). As proteínas de receptor de neublastina podem compreender peptídeos adicionados para facilitar a purificação ou identificação de neublastina (por exemplo, fusões de histidina/neublastina). A sequência de aminoácido de neublastina também pode ser ligada ao peptídeo Asp-Tir-Lis-Asp-Asp-Asp-Asp-Lis (DYKDDDDK) (ID de SEQ N° 22) (Hopp et al., Biotechnology 6: 1204 (1988)). A última sequência é altamente antigénica e resulta num epítopo reversivelmente ligado por um anticorpo monoclonal específico, permitindo um ensaio rápido e uma purificação fácil de proteína recombinante expressa.
Esta sequência também é especificamente clivada por enterocinase mucosa bovina no resíduo imediatamente a seguir ao pareamento de Asp-Lis.
Polipeptídeos Bioactivos
Os polipeptídeos da invenção podem ser fornecidos em qualquer forma bioactiva, incluindo a forma de pré-pró-proteínas, pró-proteínas, proteínas maduras, proteínas glicosiladas, proteínas não glicosiladas, proteínas fosforiladas, proteínas não fosforiladas, formas truncadas, ou qualquer outra proteína modificada pós-translacional. Um polipeptídeo de neublastina bioactivo inclui um polipeptídeo que, por exemplo, quando dimerizado, sozinho ou na presença 53 ΕΡ1594436Β1 de um co-factor (tal como GFT0C3, ou RET), liga ao RET, induz a dimerização de RET, e autofosforilação de RET.
Os polipeptideos da invenção podem especificamente ser um polipeptideo N-glicosilado, cujo polipeptideo é preferencialmente glicosilado nos resíduos de N indicados nas listagens de sequências.
Um polipeptideo descrito nesta invenção tem a sequência de aminoácidos apresentada como ID de SEQ N° 6, sustentando um resíduo de asparagina glicosilada na posição 122, ou a sequência de aminoácido apresentada como ID de SEQ N° 14, sustentando um resíduo de asparagina glicosilada na posição 95, ou a posição análoga em qualquer polipeptideo de neublastina mutada quando alinhado, por exemplo, pelo software de computador ClustalW. 0 polipeptideo descrito nesta invenção pode ter a sequência de aminoácidos apresentada como ID de SEQ N° 23, aqui referida como NBN113-N95K, contendo um residuo de lisina substituído pelo resíduo de asparagina na posição 95 de ID de SEQ N° 2; ou a sequência de aminoácidos apresentada como ID de SEQ N° 24, aqui referida como NBN106-N95K; ou a posição análoga em qualquer polipeptideo de neublastina mutada quando alinhado, por exemplo, pelo software de computador ClustalW.
Também são descritas nesta invenção proteínas de fusão de neublastina mutadas, tais como fusões de Ig, como descrito, por exemplo, na Patente Norte-Americana 5.434.131, ou em fusões de albumina sérica.
Um polipeptideo descrito nesta invenção pode ter a 54 ΕΡ1594436Β1 sequência de aminoácidos demonstrada como ID de SEQ N° 1 com a excepção de uma substituição, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade em relação à sequência apresentada como ID de SEQ N° 1.
Um polipeptideo descrito nesta invenção pode ter a sequência de aminoácidos de ID de SEQ N° 2 com a excepção de uma substituição, ou uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade relativamente à sequência apresentada como ID de SEQ N° 2.
Um polipeptideo descrito nesta invenção pode ter a sequência de aminoácidos de ID de SEQ N° 3 com a excepção de uma substituição, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, ou cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade relativamente à sequência apresentada como ID de SEQ N° 3.
Um polipeptideo descrito nesta invenção pode ter a sequência de aminoácidos de ID de SEQ N° 4 com a excepção de uma substituição, ou uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade relativamente à sequência apresentada como ID de SEQ N° 4.
Um polipeptideo descrito nesta invenção pode ter a 55 ΕΡ1594436Β1 sequência de aminoácidos de ID de SEQ N° 5 com a excepção de uma substituição, ou uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade relativamente à sequência apresentada como ID de SEQ N° 5.
Um polipeptideo descrito nesta invenção pode ter a sequência de aminoácidos de ID de SEQ N° 6 com a excepção de uma substituição, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade relativamente à sequência para a sequência apresentada como ID de SEQ N° 6.
Um polipeptideo descrito nesta invenção pode ter a sequência de aminoácidos de ID de SEQ N° 7 com a excepção de uma substituição, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade relativamente à sequência apresentada como ID de SEQ N° 7.
Um polipeptideo descrito nesta invenção pode ter a sequência de aminoácidos de ID de SEQ N°s 8-21 com a excepção de uma substituição, ou uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade relativamente à sequência apresentada como qualquer uma da ID de SEQ N°s 8-21.
Um polipeptideo descrito nesta invenção pode ter a 56 ΕΡ1594436Β1 sequência de aminoácidos de ID de SEQ N° 36 com a excepção de uma substituição, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade relativamente à sequência apresentada como ID de SEQ N° 36.
Um polipeptideo descrito nesta invenção pode ter a sequência de aminoácido de qualquer uma da ID de SEQ N°s 1-21 e 36 com a excepção de uma substituição, ou uma sequência de aminoácidos que tenha pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade relativamente a qualquer uma das sequências apresentadas como SEQ ID NOS: 1 - 21 e 36. O polipeptideo mutado descrito nesta invenção pode sustentar a impressão digital da subfamilia de GDNF, isto é, os resíduos de aminoácido de cisteína conservados designados nas Tabelas 3 e 4.
Descreve-se nesta invenção um polipeptideo mutado codificado por uma sequência de polinucleotídeos capaz de hibridizar sob condições de elevada gravidade com a sequência de polinucleotídeo codificando o polipeptideo de ID de SEQ N° 1, seu filamento complementar, ou uma subsequência deste. O polipeptideo mutado descrito nesta invenção pode ser codificado por uma sequência de polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade relativamente à sequência que codifica o polipeptideo da ID de SEQ N° 1. São descritos nesta invenção novos polipeptídeos 57 ΕΡ1594436Β1 codificados por uma sequência de polinucleotideos capaz de hibridizar em condições de elevada gravidade com a sequência de polinucleotideos codificando o polipeptideo da ID de SEQ N° 2, o seu filamento complementar, ou uma subsequência deste. 0 polipeptideo mutado descrito nesta invenção pode ser codificado por uma sequência de polinucleotideo com pelo menos 70% de identidade relativamente à sequência de polinucleotideo codificando o polipeptideo da ID de SEQ N° 2. São descritos nesta invenção polipeptideos mutados codificados por uma sequência de polinucleotideos capaz de hibridizar em condições de elevada gravidade com a sequência de polinucleotideo codificando o polipeptideo de qualquer uma das ID de SEQ N°s 8-21, o seu filamento complementar, ou uma subsequência deste. O polipeptideo mutado descrito nesta invenção pode ser codificado por uma sequência de polinucleotideos com pelo menos 70% de identidade relativamente à sequência de polinucleotideo codificando o polipeptideo de qualquer uma das ID de SEQ N° 8-21. São descritos nesta invenção novos polipeptideos codificados por uma sequência de polinucleotideo capaz de hibridizar em condições de elevada gravidade com a sequência de polinucleotideos codificando o polipeptideo da ID de SEQ N° 36, o seu filamento complementar, ou uma subsequência deste. O polipeptideo mutado descrito nesta invenção pode ser codificado por uma sequência de polinucleotideo com pelo menos 70% de identidade relativamente à sequência de polinucleotideo codificando o polipeptideo da ID de SEQ N° 36. 58 ΕΡ1594436Β1
Origem Biológica
Um dímero de polipeptídeo de neublastina não conjugada pode ser isolado e em seguida conjugado com um ou mais polímeros para obter um dímero de polipeptídeo de neublastina conjugada com polímero descrito nesta invenção. 0 dímero de polipeptídeo de neublastina pode ser isolado de uma célula de mamífero, preferivelmente de uma célula de humano ou de uma célula de origem de murino ou de uma célula de origem de ovário de hamster Chinês.
Actividade Neurotrófica
Os polipeptídeos de neublastina modificados, incluindo polipeptídeos de neublastina truncados, descritos nesta invenção, são úteis para moderar o metabolismo, crescimento, diferenciação, ou sobrevivência de um nervo ou célula neuronal. Em particular, os polipeptídeos de neublastina modificados são utilizados para tratar ou aliviar um distúrbio ou doença de um animal vivo, por exemplo, um ser humano, cujo distúrbio ou doença reage à actividade de um agente neurotrófico. Tais tratamentos e métodos são descritos em mais detalhes abaixo.
Composições farmacêuticas compreendendo conjugados de polímero de neublastina
Também se fornece uma composição farmacêutica compreendendo um dímero de polipeptídeo de neublastina modificado descrito nesta invenção.
Os conjugados de neublastina de polímero descritos nesta 59 ΕΡ1594436Β1 invenção podem ser administrados per se bem como na forma de ésteres farmaceuticamente aceitáveis, sais e outros seus derivados fisiologicamente funcionais. Em tais formulações farmacêuticas e medicamentosas, o conjugado de neublastina conjugada com polimero pode ser utilizado juntamente com um ou mais veiculos farmaceuticamente aceitáveis e opcionalmente com quaisquer outros ingredientes terapêuticos. 0(s) veiculo(s) deve(m) ser farmaceuticamente aceitável (eis) no sentido de ser(em) compatível(is) com os outros ingredientes da formulação e não indevidamente prejudiciais ao seu destinatário. A neublastina conjugada com polímero é fornecida numa quantidade eficaz para obter um efeito farmacológico desejado ou efeito medicamente benéfico, como descrito aqui, e numa quantidade apropriada para obter a concentração ou dose in vivo biodisponível desejada.
As formulações incluem as adequadas para administração parenteral bem como não parenteral, e modalidades de administração específica incluem administração oral, rectal, bucal, tópica, nasal, oftálmica, subcutânea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, intratecal, intra-articular, intra-arterial, subaracnóide, bronquial, linfática, vaginal e intra-uterina. As formulações podem ser adequadas para administração por aerossol e parenteral, tanto localmente como sistemicamente.
Quando a neublastina conjugada com polímero é utilizada numa formulação compreendendo uma solução líquida, a formulação pode ser administrada, de forma vantajosa, oralmente, bronquialmente ou parenteralmente. Quando a neublastina conjugada com polímero é empregada numa 60 ΕΡ1594436Β1 formulação de suspensão líquida ou em pó numa formulação de veículo biocompatível, a formulação pode ser vantajosamente administrada oral, rectalmente ou bronquialmente. Em alternativa, pode ser administrada nasalmente ou bronquialmente, por meio de nebulização do pó num transportador de gás, para formar uma dispersão gasosa do pó que é inspirado pelo paciente de um circuito de respiração compreendendo um dispositivo nebulizador adequado.
As formulações que compreendem as proteínas descritas nesta invenção podem convenientemente ser apresentadas em formas de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer dos métodos bem conhecidos na técnica de farmácia. Tais métodos geralmente incluem a etapa de trazer o(s) ingrediente (s) activo(s) em associação com um transportador que constitui um ou mais ingredientes suplementares.
Normalmente, as formulações são preparadas trazendo-se uniformemente e intimamente o(s) ingrediente(s) activo(s) em associação com um transportador líquido, um transportador sólido finamente dividido, ou ambos, e em seguida, se necessário, preparando-se o produto em formas de dosagem da formulação desejada.
As formulações descritas nesta invenção adequadas para administração oral podem ser apresentadas como unidades discretas, tais como cápsulas, hóstias, comprimidos ou pastilhas, cada uma delas compreendendo uma quantidade predeterminada do ingrediente activo em pó ou em grânulos; ou uma suspensão num líquido aquoso ou um líquido não aquoso, tal como um xarope, um elixir, uma emulsão ou uma inalação. 61 ΕΡ1594436Β1
As formulações adequadas para administração parenteral compreendem de forma conveniente uma preparação aquosa estéril do conjugado activo, que preferivelmente é isotónica com sangue do destinatário (por exemplo, solução salina fisiológica). Tais formulações podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes ou outros sistemas microparticulados que são designados para atingir o composto em componentes de sangue ou um ou mais órgãos. As formulações podem ser apresentadas em dose unitária ou dose múltipla.
Formulações de spray nasal compreendem soluções aquosas purificadas do conjugado activo com agentes conservantes e agentes isotónicos. Tais formulações podem ser ajustadas para um pH e estado isotónico compatível com as membranas do muco nasal.
As formulações para a administração rectal podem ser apresentadas como um supositório com um transportador adequado tal como manteiga de cacau, gorduras hidrogenadas ou ácido carboxílico gordo hidrogenado. As formulações oftálmicas tal como gotas são preparadas por um método semelhante ao spray nasal, exceptuando o facto de que o pH e factores isotónicos são, de preferência, ajustados para serem compatíveis com os dos olhos.
As formulações tópicas compreendem os conjugados descritos nesta invenção dissolvidos ou suspensos num ou mais meios, tais como óleo mineral, petróleo, alcoóis polihidróxi ou outras bases utilizadas para formulações farmacêuticas tópicas.
Além dos ingredientes anteriormente mencionados, as 62 ΕΡ1594436Β1 formulações podem incluir também um ou mais ingrediente(s) suplementar(es) selecionado(s) de diluentes, tampões, agentes aromatizantes, desintegrantes, surfactantes, espessantes, lubrificantes, conservantes (incluindo antioxidantes), e similares. As considerações anteriores aplicam-se da mesma forma às proteínas de fusão de neublastina descritas nesta invenção (por exemplo, proteínas de fusão de albumina sérica humana de neublastina). São descritas nesta invenção as proteínas de fusão adequadas para estabilização in vitro de um conjugado de neublastina conjugada com polímero em solução. As proteínas de fusão podem ser empregues por exemplo, para aumentar a resistência à degradação enzimática do polipeptídeo de neublastina conjugada com polímero e melhorar a durabilidade, a estabilidade a temperatura ambiente, e similares. Entende-se que as considerações anteriores se aplicam da mesma forma às proteínas de fusão de albumina sérica de neublastina (incluindo as proteínas de fusão de albumina sérica humana de neublastina humana).
Utilizações Medicinais
As composições descritas nesta invenção podem ser utilizadas para tratar ou aliviar um distúrbio ou doença num mamífero, por exemplo, um primata incluindo um ser humano, cujo distúrbio ou doença reage à actividade de agentes neurotróficos.
As composições descritas nesta invenção podem ser utilizadas directamente por meio de, por exemplo, composições farmacêuticas ingeridas, implantadas ou injectadas para 63 ΕΡ1594436Β1 tratar um processo patológico que reage aos polipeptídeos de neublastina. As composições podem ser utilizadas para aliviar um distúrbio ou doença de um corpo de animal vivo, incluindo um ser humano, cujo distúrbio ou doença reage à actividade de agentes neurotróficos. 0 distúrbio ou doença pode nomeadamente corresponder à lesão do sistema nervoso causada por trauma, cirurgia, isquemia, infecção, doenças metabólicas, deficiência nutricional, malignidade ou agentes tóxicos, e processos idiopáticos ou genéticos. A lesão pode ter ocorrido em particular em neurónios sensoriais ou células de gânglio retinal, incluindo neurónios nos gânglios de raiz dorsal ou em qualquer dos seguintes tecidos: os gânglios nodosos, petrosos e geniculados; o complexo vestíbulo-acústico do oitavo nervo craniano, o pólo ventrolateral do lóbulo maxilomandibular do gânglio trigeminal; e o núcleo trigeminal mesencefálico.
Para as utilizações descritas nesta invenção, a doença ou distúrbio é uma doença neurodegenerativa envolvendo neurónios lesionados e traumáticos, tais como lesões traumáticas de nervos periféricos, a medula, e/ou a medula espinhal, lesão neuronal isquémica cerebral, neuropatia e especialmente neuropatia periférica, lesão ou trauma do nervo periférico, acidente vascular cerebral isquémico, lesão cerebral aguda, lesão da medula espinhal aguda, tumores do sistema nervoso, esclerose múltipla, exposição às neurotoxinas, doenças metabólicas tal como diabetes ou disfunções renais e danos causados por agentes infecciosos, distúrbios neurodegenerativos incluindo doença de Alzheimer, doença de Huntington, doença de Parkinson, síndromes de Parkinson-Plus, Paralisia Supranuclear progressiva (Síndrome 64 ΕΡ1594436Β1 de Steele-Richardson-Olszewski), Atrofia Olivopontocerebelar (OPCA), Síndrome de Shy-Drager (atrofia de sistemas múltiplos), complexo de demência parquinsoniana de Guamanian, esclerose lateral amiotrófica, ou qualquer outra doença neurodegenerativa ou congénita, e comprometimento da memória ligado à demência.
Os neurónios do sistema autonômico e/ou sensorial podem ser tratados. Em particular, os neurónios mecanorreceptivos e nociceptivos podem ser tratados, mais especificamente os neurónios de fibra delta A, fibra C e fibra beta A. Além disso, os neurónios parassimpatéticos e simpatéticos do sistema autonômico podem ser tratados.
As doenças de neurónios motores tais como esclerose lateral amiotrófica ("ALS") e atrofia muscular espinhal podem ser tratadas. As moléculas de neublastina desta invenção podem ser utilizadas para melhorar a recuperação do nervo na sequência de uma lesão traumática. Em alternativa, ou, adicionalmente pode ser utilizado um canal de direcção do nervo com uma matriz contendo polipeptideos de neublastina conjugada com polímero, ou fusão ou conjugados de polipeptideos de neublastina mutada nas utilizações descritas neste documento. Tais canais de direcção do nervo são descritos, por exemplo, na Patente Norte-Americana N° 5.834.029.
As composições descritas nesta invenção (e composições farmacêuticas compreendendo as mesmas) podem ser utilizadas no tratamento de neuropatias periféricas. Entre as neuropatias periféricas incluídas para tratamento com as moléculas descritas nesta invenção encontram-se as 65 ΕΡ1594436Β1 neuropatias induzidas por trauma, por exemplo, as causadas por lesão fisica ou estado de doença, lesão fisica no cérebro, lesão fisica na medula espinhal, acidente vascular cerebral associado com lesão cerebral, e distúrbios neurológicos relacionados com neurodegeneração. Também se descrevem nesta invenção as neuropatias secundárias à infecção, exposição a toxinas, e exposição a drogas. São também descritas as neuropatias secundárias à doença sistémica ou metabólica. Por exemplo, as composições aqui descritas podem também ser utilizadas para tratar neuropatias induzidas por quimioterapia (tal como as causadas por libertação de agentes quimioterápicos, por exemplo, taxol ou cisplatina); neuropatias induzidas por toxinas, neuropatias induzidas por drogas, neuropatias induzidas por deficiência de vitamina; neuropatias idiopáticas; neuropatias diabéticas; e neuralgias pós-herpéticas. Ver, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas 5.496.804 e 5.916.555.
Os estados adicionais que podem ser tratados de acordo com as utilizações aqui descritas são as mononeuropatias, neuropatias monomultiplex, e polineuropatias, incluindo neuropatias de desmielinação e axonais.
As composições descritas nesta invenção (e composições farmacêuticas compreendendo as mesmas) podem ser utilizadas no tratamento de vários distúrbios dos olhos, incluindo perda fotorreceptora na retina em pacientes atingidos por degeneração macular, retinite pigmentosa, glaucoma, e doenças similares. 66 ΕΡ1594436Β1
Utilizações e Composições Farmacêuticas
Nesta invenção, são descritas as utilizações para tratar a dor neuropática, para tratar a alodinia táctil, e para reduzir a perda de sensibilidade à dor associada à neuropatia. São utilizados dimeros de polipeptideo de neublastina conjugada com polímero, inclusive dimeros que compreendem polipeptídeos de neublastina de tamanho natural bioactivos ou polipeptídeos de neublastina truncados bioactivos. Além disso, são descritas nesta invenção composições farmacêuticas compreendendo um dímero de polipeptideo de neublastina conjugada com polímero suspenso, dissolvido, ou disperso num transportador farmaceuticamente aceitável. 1. Utilização no Tratamento da Dor Neuropática
Descreve-se nesta invenção uma utilização para tratar a dor neuropática num indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um dímero de polipeptideo de neublastina conjugada com polímero. Também se descreve nesta invenção uma utilização para tratar a dor neuropática num indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um dímero de polipeptideo de neublastina conjugada com polímero compreendendo, por exemplo, polipeptídeos de neublastina selvagens, mutados ou truncados, incluindo, por exemplo, qualquer uma das ID de SEQ N°s 1, 2, 6-21 e 36 ou uma forma mutada dos mesmos, isoladamente, ou administrando também ao indivíduo uma quantidade eficaz de um composto de indução de analgesia seleccionado do grupo consistindo em opióides, antiarrítmicos, analgésicos tópicos, anestésicos locais, 67 ΕΡ1594436Β1 anticonvulsivos, antidepressivos, corticosteróides e drogas anti-inflamatórias não esteroidais (NSAIDS). 0 composto de indução de analgesia pode ser um anticonvulsivo. 0 composto de indução de analgesia pode ser gabapentina (ácido (1-aminometil)cicloexano acético) ou pregabalina (ácido (S— (+) — 4-amino-3-(2-metilpropil) butanóico).
Os polipeptídeos de neublastina e ácidos nucleicos descritos nesta invenção (e composições farmacêuticas compreendendo os dímeros de polipeptideo de neublastina conjugada com polímero aqui descritos) são utilizados no tratamento da dor associada com neuropatias periféricas. Entre as neuropatias periféricas que podem ser tratadas de acordo com esta invenção são neuropatias induzidas por trauma, por exemplo, as causadas por lesão física ou estado de doença, dano físico no cérebro, dano físico na medula espinhal, acidente vascular cerebral associado com dano cerebral, e distúrbios neurológicos relacionados com a neurodegeneração.
Também se descrevem nesta invenção as utilizações nos tratamentos de neuropatias induzidas por quimioterapia (tal como os causados por libertação de agentes quimioterápicos, por exemplo, taxol ou cisplatina); neuropatias induzidas por toxinas, neuropatias induzidas por droga, neuropatias induzidas por patógeno (por exemplo, induzidas por vírus), neuropatias induzidas por deficiência de vitamina; neuropatias idiopáticas; e neuropatias diabéticas. Ver, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas N°s 5.496.804 e 5.916.555. Os nucleotídeos e polipeptídeos de neublastina descritos nesta invenção podem ser utilizados para o tratamento de mononeuropatias, neuropatias mono multiplex, e 68 ΕΡ1594436Β1 polineuropatias, incluindo neuropatias axonais e de desmielinação. A dor neuropática pode ser associada a várias neuropatias periféricas, incluindo: (a) neuropatias induzidas por trauma, (b) neuropatias induzidas por quimioterapia, (c) neuropatias induzidas por toxina (incluindo, mas não se limitando a neuropatias induzidas por alcoolismo, por intoxicação com vitamina B6, intoxicação por hexacarbono, amiodarona, cloranfenicol, dissulfiram, isoniazida, ouro, litio, metronidazol, misonidazol, nitrofurantoína), (d) neuropatias induzidas por droga, incluindo a dor neuropática induzida por droga terapêutica (tal como as causadas por agentes anti-cancerígenos, especificamente os agentes anti-cancerigenos seleccionados do grupo composto por taxol, taxotero, cisplatina, nocodazol, vincristina, vindesina e vimblastina; tais como os causados por agentes anti-virais, especificamente os agentes anti-virais seleccionados do grupo composto por em ddi, DDC, d4T, foscarnet, dapsona, metronidazol, e isoniazid), (e) neuropatias induzidas por deficiência de vitamina (incluindo mas não se limitando à deficiência de vitamina B12, deficiência de vitamina B6, e deficiência de vitamina E), (f) neuropatias idiopáticas, (g) neuropatias diabéticas, (h) dano do nervo induzido por patógeno, (i) dano do nervo induzido por inflamação, (j) neurodegeneração, (k) neuropatia hereditária (incluindo mas não se limitando à ataxia de Friedreich, polineuropatia amilóide familiar, doença de Tangier, doença de Fabry), (1) distúrbios metabólicos (incluindo mas não se limitando a insuficiência renal e hipotireoidismo), (m) neuropatias virais e infecciosas (incluindo, mas não se limitando à dor neuropática associada com lepra, doenças de Lyme, dor 69 ΕΡ1594436Β1 neuropática associada com infecção por um vírus, especificamente um vírus selecionado do grupo consistindo num vírus da herpes (por exemplo, herpes zóster que pode levar à neuralgia pós-herpética), um vírus da imunodeficiência humana (HIV), e um vírus de papiloma), (n) neuropatias auto-imunes (incluindo, mas não se limitando à síndrome de Guillain-Barre, polineuropatia de desmielinação inflamatória crónica, gamopatia monoclonal de significância indeterminada e polineuropatia), (o) neuralgia trigeminal e síndromes de captura (incluindo porém não limitadas a túnel Carpel), e (p) outras síndromes de dor neuropática incluindo neuralgia pós-traumática, dor do membro fantasma, dor de esclerose múltipla, síndromes de dor regional complexas (incluindo, mas não se limitando a distrofia simpatética reflexa, causalgia), dor associada à neoplasia, neuropatia angiopática/vasculítica, e ciática. A dor neuropática pode ser manifestada como alodinia, hiperalgesia, dor espontânea ou dor fantasma. 2. Utilização no tratamento de Alodinia Táctil 0 termo "alodinia táctil" refere-se normalmente ao estado num indivíduo onde a dor resulta do estímulo da pele (por exemplo, pelo toque) que é normalmente inócuo. Descreve-se nesta invenção uma utilização para tratar a alodinia táctil num indivíduo. A alodinia táctil pode ser tratada administrando-se ao indivíduo uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um dímero de polipeptídeo de neublastina mutada conjugada com polímero isoladamente. 70 ΕΡ1594436Β1
Descreve-se nesta invenção uma utilização para tratar a alodinia táctil num indivíduo, administrando-se ao indivíduo ou uma quantidade eficaz de um dimero de polipeptideo de neublastina conjugada com polímero contendo polipeptideos de neublastina mutada ou selvagem truncado, incluindo, por exemplo, pelo menos uma das ID de SEQ N°s 1, 2, 6-21 e 36 ou uma forma mutada das mesmas, ou isoladamente, ou administrando ao indivíduo uma quantidade eficaz de um polipeptideo de neublastina com uma quantidade eficaz de um composto de indução de analgesia selecionado do grupo composto por opióides, antiarritmicos, analgésicos tópicos, anestésicos locais, anticonvulsivos, antidepressivos, corticosteróides e NSAIDS. 0 composto de indução de analgesia pode ser um anticonvulsivo. 0 composto de indução de analgesia pode ser gabapentina (ácido (1-aminometil) cicloexano acético) ou pregabalina (ácido (S-( + )-4-amino-3-(2-metilpropil)butanóico).
Um dimero de polipeptideo de neublastina mutada conjugada com polímero pode ser administrado em associação com um agente terapêutico, incluindo, mas não se limitando a um anti-cancerígeno ou um agente antiviral. Agentes anti-cancerígenos incluem, porém não estão limitados a, taxol, taxotero, cisplatina, nocodazol, vincristina, vindesina e vinblastina. Agentes antivirais incluem, porém não estão limitados a, ddl, DDC, d4T, foscarnet, dapsona, metronidazol, e isoniazida. 3. Utilização no Tratamento para Redução da Perda de Sensibilidade à dor
Descreve-se nesta invenção uma utilização para reduzir a 71 ΕΡ1594436Β1 perda da sensibilidade à dor num indivíduo afectado com uma neuropatia. A neuropatia pode ser neuropatia diabética. A perda da sensibilidade à dor pode ser uma perda na sensibilidade à dor térmica. São considerados ambas as utilizações profiláticas e terapêuticas.
Para utilização no tratamento profilático, é administrado um dimero de polipeptideo de neublastina mutada conjugada com polímero a um indivíduo em risco de perda do desenvolvimento da sensibilidade à dor; espera-se que tais indivíduos sejam indivíduos com uma neuropatia em estágio precoce. A utilização de neublastina para tratamento em tais circunstâncias serviria para tratar os pacientes em risco preventivamente.
Para utilização no tratamento terapêutico, é administrado um dimero de polipeptideo de neublastina mutada conjugada com polímero a um indivíduo que tem sentido perda da sensibilidade à dor em resultado de sofrimento de uma neuropatia; espera-se que tais indivíduos tenham uma neuropatia em estágio avançado. A utilização de um dimero de polipeptideo de neublastina mutada conjugada com polímero para tratamento em tais circunstâncias serviria para resgatar a sensibilidade adequada à dor no indivíduo. 4. Utilização no Tratamento de Infecções Virais e Neuropatias Associadas a Estados Virais
Descreve-se nesta invenção o tratamento profilático de neuropatias virais e infecciosas. 0 tratamento profilático é indicado após a determinação da infecção virai e antes do início da dor neuropática. Administra-se um dimero de 72 ΕΡ1594436Β1 polipeptídeo de neublastina mutada conjugada com polímero para prevenir o aparecimento da dor neuropática incluindo, mas não se limitando à dor neuropática associada à lepra, doença de Lyme, dor neuropática associada à infecção virai, especificamente um vírus seleccionado do grupo consistindo num vírus do herpes (e mais especif icamente por um vírus do herpes zóster, que pode levar à neuralgia pós-herpética) , um vírus da imunodeficiência humana (HIV), e um papiloma vírus). Pode administrar-se um dímero de polipeptídeo de neublastina mutada conjugada com polímero para reduzir a gravidade da dor neuropática, caso esta surja.
Os sintomas de infecção virai aguda incluem frequentemente o aparecimento de uma erupção cutânea. Outros sintomas incluem, por exemplo, o desenvolvimento da dor persistente na área afectada do corpo, que é uma complicação comum de uma infecção por herpes zóster (herpes zoster). A neuralgia pós-herpética pode prolongar-se por um mês ou mais, e pode surgir vários meses após quaisquer sintomas como erupção cutânea terem desaparecido. 5. Utilização no Tratamento de Neuropatia Diabética Dolorosa A utilização de um dímero de polipeptídeo de neublastina mutada conjugada com polímero para uso no tratamento profilático de neuropatia diabética dolorosa é descrito nesta invenção. 0 tratamento profilático de neuropatias diabéticas começaria após a determinação do diagnóstico inicial de diabetes ou de sintomas associados à diabetes e antes do início da dor neuropática. 0 tratamento profilático da neuropatia diabética dolorosa também pode iniciar-se com a determinação de que um indivíduo está em risco de desenvolver 73 ΕΡ1594436Β1 a diabetes ou sintomas associados à diabetes. Durante o tratamento, um dimero de polipeptideo de neublastina mutada conjugada com polímero é administrado para prevenir o aparecimento da dor neuropática. Um dimero de polipeptideo de neublastina mutada conjugada com polímero pode ser administrado para reduzir a gravidade da dor neuropática que já surgiu. 6. Utilização em Distúrbios do Sistema Nervoso
Descreve-se nesta invenção uma utilização para tratar ou prevenir um distúrbio do sistema nervoso num indivíduo (tal como um ser humano), administrando-se a um indivíduo necessitado uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptideo de neublastina conjugada com polímero, uma composição contendo um polipeptideo de neublastina ou polipeptideo de neublastina mutada acoplado a um polímero, ou um complexo que inclui um complexo de polipeptideo de neublastina mutada ou polipeptideo de neublastina conjugado solúvel aquoso estável compreendendo um polipeptideo de neublastina ou polipeptideo de neublastina mutada acoplado a uma porção de polialquileno tal como, por exemplo, o PEG. 0 distúrbio do sistema nervoso pode ser um distúrbio do sistema nervoso periférico, tal como uma neuropatia periférica ou uma síndrome da dor neuropática. Os seres humanos são indivíduos preferenciais para tratamento.
Um dimero de polipeptideo de neublastina conjugada com polímero descrito nesta invenção é útil para tratar um defeito num neurónio, incluindo sem limitação neurónios lesionados e neurónios traumatizados. Os nervos periféricos 74 ΕΡ1594436Β1 que sofrem um trauma incluem, mas não se limitam a nervos da medula ou da medula espinhal. Os dimeros de polipeptideo de neublastina conjugada com polímero da invenção são úteis no tratamento da doença neurodegenerativa, por exemplo, lesão neuronal isquémica cerebral; neuropatia, por exemplo, neuropatia periférica, doença de Alzheimer, doença de Huntington, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica (ALS). Tais dimeros de polipeptideo de neublastina podem ser utilizados no tratamento de perda de memória, por exemplo, perda de memória associado a demência.
Exemplos adicionais de estados ou doenças são distúrbios do sistema nervoso periférico, da medula, ou da medula espinhal, bem como neuropatias induzidas por trauma, neuropatias induzidas por quimioterapia, neuropatias induzidas por toxina, neuropatias induzidas por droga, neuropatias induzidas pela deficiência de vitamina; neuropatias idiopáticas; e neuropatias diabéticas, dor neuropática associada a lesão do nervo induzida por toxina, e lesão de nervo induzida por patógeno, lesão do nervo induzida por inflamação, ou neurodegeneração. Além disso, um dimero de polipeptideo de neublastina da invenção também é útil para tratar a dor neuropática, a alodinia táctil e para reduzir a perda da sensibilidade à dor associada à neuropatia. 7. Dosagem
As utilizações anteriores contemplam a administração a um indivíduo uma formulação que compreende um dimero de polipeptideo de neublastina mutada conjugada com polímero que pode ser ou não truncado numa dosagem de 0,01 \iqfkq a 1000 \\.q/kq do peso do corpo do indivíduo, por dose. A dosagem pode 75 ΕΡ1594436Β1 variar ser de 1 liq/kq a 100 μg/kg do peso do corpo do indivíduo, por dose ou de 1 μρ/kg a 30 [Lg/kg do peso de corpo do indivíduo, por dose, por exemplo, de 3 [ig/kg a 10 μρ/kg do peso de corpo do indivíduo, por dose. Quantidades terapeuticamente eficazes da formulação podem ser administradas em um a um indivíduo necessitado num regime de dosagem determinável por um técnico, sem experimentação indevida. A formulação pode ser administrada sistemicamente. 8. Libertação O dímero de polipeptídeo nas utilizações anteriores pode ser administrado através de qualquer sistema de libertação adequado, e pode incluir libertação intravenosa, libertação intramuscular, libertação intrapulmonar, libertação subcutânea, e libertação intraperitoneal. O polipeptídeo de neublastina nas utilizações anteriores pode também ser administrado por meio de libertação intratecal. A administração de um dímero de polipeptídeo de neublastina conjugada com polímero pode ser, por exemplo, sistémica ou local. As formulações incluem as adequadas para administração parenteral bem como não parenteral, e modalidades de administração específicas incluem administração oral, rectal, bocal, tópica, nasal, oftálmica, subcutânea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, intratecal, intra-articular, intra-arterial, subaracnóide, bronquial, linfática, vaginal, e intra-uterina. São incluídas as formulações adequadas para administração por aerossol e parenteral, ambas local e sistemicamente. As formulações são adequadas para administração subcutânea, intramuscular, ou intravenosa. 76 ΕΡ1594436Β1 9. Regimes A frequência de dosagem para o dímero de polipeptídeo da invenção pode levar à administração ao indivíduo de uma formulação três vezes por semana durante duas semanas. Para optimizar a eficácia terapêutica, administra-se primeiro um dímero de polipeptídeo de neublastina mutada conjugada com polímero é administrado em diferentes regimes de dosagem. A dose unitária e o regime dependem de factores que incluem, por exemplo, as espécies de mamífero imunizado, seu estado de imunização, o peso do corpo do mamífero. Os níveis de proteína no tecido são normalmente controlados através de ensaios de avaliação adequados que fazem parte de um procedimento de teste clínico, por exemplo, para determinar a eficácia de um determinado regime de tratamento. A frequência da dosagem para um dímero de polipeptídeo de neublastina mutada conjugada com polímero desta invenção está ao alcance das capacidades técnicas e opiniões clínicas dos médicos. Normalmente, o regime de administração é estabelecido por experiências clínicas que podem estabelecer parâmetros ideais de administração. No entanto, o médico pode alterar tais regimes de administração de acordo com a idade do indivíduo, saúde, peso, sexo e estado médico. A frequência da dosagem também pode variar entre tratamentos agudos e crónicos para neuropatia. Além disso, a frequência da dosagem pode variar dependendo de se o tratamento é profilático ou terapêutico. A invenção é também ilustrada nos seguintes exemplos não limitadores. 77 ΕΡ1594436Β1
EXEMPLOS
Exemplo 1: Biodisponibilidade de Neublastina PEGuilada de terminal amlno (exemplo Ilustrativo)
Verificou-se que as neublastinas recombinantes derivadas de E. coli e de célula de CHO são rapidamente eliminadas da circulação quando administradas intravenosamente em ratazanas. As proteínas estavam abaixo do limite da detecção no soro após a administração subcutânea. Para aumentar a biodisponibilidade da neublastina, foram construídas formas PEGuiladas de neublastina mutada.
Visto que não se verificam lisinas na sequência de neublastina, as químicas de PEGuilação de amina específica resultarão na PEGuilação de um polipeptídeo de neublastina selvagem no seu terminal amino. Assim, para cada dímero de neublastina, devem ser ligadas duas porções de PEG. Do mesmo modo, atingiram-se as formas de PEG em primeiro lugar directamente no terminal amino através de químicas específicas de amino. Surpreendentemente, a PEGuilação de neublastina selvagem expressa em E. coli, mesmo com a ligação de dois PEGs de 20 kDa, teve pouca influência benéfica na meia-vida, indicando que uma via de libertação baseada num mecanismo estava a anular a melhoria na meia-vida que se esperava alcançar através da PEGuilação.
Exemplo 2: Construção de uma Neublastina Mutada PEGuilada (N95K) (exemplo ilustrativo) A biodisponibilidade das formas de neublastina mutada PEGuilada em resíduos de aminoácido internos foi examinada de 78 ΕΡ1594436Β1 seguida. Uma série de quatro mutantes substituindo os resíduos de ocorrência natural nas posições 14, 39, 68, e 95, quando numerada como mostra na ID de SEQ N°l, foram concebidas para inserir lisinas em sítios seleccionados na sequência. Estas lisinas forneceriam sitios alternativos para a ligação do PEG. Estes sitios foram seleccionados utilizando a estrutura cristalina de GDNF (Nat. Struct. Biol. 4: 435 -8, 1997) como uma estrutura para identificar resíduos de superfície. 0 estudo de mutagénese de quimera de neublastina/persefina (J. Biol. Chem. 275: 3412 - 20, 2000) foi utilizado para identificar regiões funcionalmente importantes da estrutura que deveria ser evitada.
Para expressar o gene de neublastina selvagem em E. colif foram construídos singenes com um teor de GC mais baixo e códons de E. coli preferidos. O singene foi clonado em dois vectores, pETl9b e pMJBl64, um derivado de pETl9b. Em pETl9b, a sequência que codifica o domínio maduro da neublastina (NBN113) é fundida directamente a uma metionina de iniciação. Em pMJBl64, o domínio maduro de neublastina é fundido a uma etiqueta de histidina (isto é, 10 histidinas) e separado da etiqueta de histidina por um sítio de clivagem de enteroquinase (ID de SEQ N°s 35 e 36) . A metionina de iniciação precede a etiqueta de histidina. 79 ΕΡ1594436Β1
Tabela 5. Sequência de Polipeptídeo e Nucleotídeo de Neublastina Selvagem com etiqueta de His. NBN com etiqueta de His 1 ATG GGC CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAC TCG AGC GGC 45 1 M G H H H Η Η H H fí H H S S G 15 46 •CAT ATC GAC GAC GAC GAC AAG GCT GGA GGA CCG GGA TCT CGT GCT 90 16 H I D D D D K A G G P G s R A 30 91 CGT GCA GCA GGA GCA CGT GGC TGT CGT -CTG CGT TCT CAA CTA GTG 135 31 R A A G A R G C R L R S 0 L V 45 136 CCG GTG CGT GCA CTC GGA CTG GGA CAC CGT TCC GAC GAA CTA GTA 180 46 P V R A L G h G H R S D £ L V 60 181 CGT TTT CGT TTT TGT TCA GGA TCT TGT CGT CGT GCA CGT TCT CCG 225 61 R F R F C S G S C R R A R S P 75 226 CAT GAT CTA TCT CTA GCA TCT CTA CTA GGA GCC GGA GCA CTA AGA 270 76 H D L S L A S L L G A G A L R 90 271 CCG CCG CCG GGA TCT AGA CCT GTA TCT CAA CCT TGT TGT AGA CCT 315 91 P P P G s R P V s Q P C C R P 105 316 ACT AGA TAC GAA GCA GTA TCT TTC ATG GAC GTA AAC TCT ACA TGG 360 106 T R Y E A V S F M D V N s T W 120 361 AGA ACC GTA GAT AGA CTA TCT 'GCA ACC GCA TGT GGC TGT CTA GGA 405 121 R T V D R h S A T A C G c 33 G 135 406 TGA TAA TftG 414 (SBC ID NO : 35) 136 * * * <SBQ ΪΟ NO :36)
Duas das mutações (R39 e R68) foram direccionadas a uma região que, baseada na distribuição de cargas positivas na superfície, puderam representar um sitio de ligação de heparina. Este sitio provavelmente contribui para a libertação rápida da proteína. Um terceiro sitio foi direccionado a N95, o sitio de glicosilação natural em neublastina selvagem. Este sitio é modificado naturalmente 80 ΕΡ1594436Β1 com uma estrutura complexa de carbohidrato complexa. Portanto, não se esperava que a modificação com o PEG neste sítio tivesse um impacto na função. 0 quarto sítio (R14) foi selecionado numa região que não estava coberta por qualquer outras das modificações. Escolheu-se um mutante no qual o resíduo de asparagina na posição 95 foi substituído com uma lisina (o "mutante N95K") para os estudos descritos nesta invenção.
Foram construídas quatro neublastinas de ratazana mutadas diferentes compreendendo uma ou mais alterações na sequência selvagem de polipeptídeo de neublastina de ratazana foram construídas. Estas neublastinas mutadas continham substituições de aminoácido simples: R14K; R68K; R39K; ou N95K. A Tabela IA identifica estas mutações pontuais exemplares em negrito. Na nomenclatura "X1N1X2", Xi refere-se a um aminoácido de polipeptídeo de neublastina do tipo selvagem, Nx refere-se à posição numérica dos aminoácidos Xx na sequência, como numerada de acordo com ID de SEQ N°l, e X2 refere-se ao aminoácido substituído para o aminoácido selvagem na posição numérica indicada Nx.
Para construir a mutação de neublastina N95K de ratazana, a mutagénese direccionada ao sítio foi realizada em pCMB020, um plasmídeo codificando neublastina de ratazana selvagem. 0 resultado da sequência de amino ácido e a de ácido nucleico de neublastina de ratazana selvagem do polipeptídeo codificado é apresentada abaixo: 81 ΕΡ1594436Β1 TABELA 6. Sequências de NBN de ratazana selvagem
1 I q 1 GACTTGGAGA GCCTACTGCA TTGTCCCACT GCCTCCGGCC 51 TAGGTGGCAA CCAGCCTTGT GGCCAACCCT AGCTGCTGTA GCCCTGCTGA 101 GCAGCGTCAC AGAAGCTTCC CTGGACCCAA TGTCCCGCAG CCGCGCCTCT 151 CGCGATGTTC CCTCGGCGGT CCTGGCGCCC CCAACAGACT ACCTACCTGG 201 GGGACACACC GCACATCTGT GCAGGGAAAG AGCCCTGCGA GCACCGGGGC 251 AGTCTCCTCA GCCCGCACCC CCACCAOCGG GTCCCGCGCT CCAGTCT-OCT 301 CGCGCTGCGC TCCGCGGGGC ACGCGCGGCG CGTGCAGGAA CCCGGAGCAG 351 CCGCGCACGG GCTÃCAGATG CGCGCGGCTG CCGCCTGCGC TCACAGCTGG 401 TGCCGGTGAG CGCTCTCGGC CTGGGCCACA GCTCCGACGÀ GCTGATACGT 451 TTCCGCTTCT GCAGCGGTTC GTGCCGCCGA GCACGCTCCC CGCACGATCT 501 CAGCCTGGCC AGCCTGGTGG GCGCCGGGGC CCTGCGGTCT CCTCCCGGGT 551 CCCGGCCGAT CAGCCAGCCC TGTTGGCGGC CCACTCGCTA TGAGGCAGTC 601 TOCTTCATGG ACGTGAACAG CACCTGCAGA ACCGTGGACC ATCTCTCCGC A mutagénese de pCM020 utilizando os oligonucleotídeos KD3-210 e KD3-211 resultou na formação do plasmídeo pCMB027: KD3-210 5'-GTATCTTTCATGGACGTTATGTTCTACATGGAGAACC-3' (ID DE SEQ N°27) KD3-211 5'-GGTTCTCCATGTAGAACATACGTCCATGAAAGATAC-3' (ID DE SEQ N°28)
Em pCMB027, o códon codificando a asparagina na posição 95 foi substituído por um códon codificando a lisina.
Formou-se uma neublastina mutada por R14K por substituição de um códon codificando a arginina na posição 14 com um códon codificando a lisina na sequência de codificação de neublastina de pCMB020. Realizou-se a mutagénese direccionada ao sitio em pCMB020 utilizando-se os oligonucleotídeos KD3-254 e KD3-255: 82 ΕΡ1594436Β1 KD3-254 5'-GCTCGTGCAACGGATGCAAAAGGCTGTCGTCTGCG-3' (ID DE SEQ N°29) KD3-255 5'-CGCAGACGACAGCCTTTTGCATCCGTTGCACGAGC-3' (ID DE SEQ N°30) A construção resultante foi denominada pCMB029.
Uma neublastina mutada por R68K foi formada por substituição de um códon codificando arginina na posição 68 com um códon codificando lisina na sequência de codificação de neublastina de pCMB020. Realizou-se a mutagénese direccionada ao sitio em pCMB020 utilizando os oligonucleotídeos KD3-258 e KD3-259: KD3-258 5'-GGAGCCGGAGCACTAAAATCTCCCCCGGGATCTAGACC-3' (ID DE SEQ N°31) KD3-259 5'-GGTCTAGATCCCGGGGGAGATTTTAGTGCTCCGGCTCC-31 (ID DE SEQ N°32) A construção resultante foi denominada pCMB030.
Formou-se uma neublastina mutada por R39K por substituição de arginina no aminoácido 39 com lisina na sequência de codificação de neublastina de pCMB020. Realizou-se a mutagénese direccionada ao sitio de pCMB020 empregando-se os oligonucleotídeos KD3-256 e KD3-257: KD3-256 5'-GACGAATTAATTAAGTTTCGTTTTTGTTCAGG-3' (ID DE SEQ N°33) KD3-257 5'-CCTGAACAAAAACGAAACTTAATTAATTCGTC-3' (ID DE SEQ N°34)
Expressão e Caracterização de Neublastina Mutada em E. coli
Para expressão e purificação, um plasmídeo codificando o polipeptídeo N95K de neublastina de ratazana foi expresso em 83 ΕΡ1594436Β1 E. coli como uma proteína de fusão com etiqueta de His com um sítio de clivagem de enteroquinase imediatamente adjacente ao início da sequência de neublastina de 113 aminoácidos madura. 0 E. coli foi cultivado num fermentador de 500 L e foi fornecida pasta de célula congelada. As células de E. coli foram lisadas numa Prensa APV Gaulin e a neublastina N95K de ratazana recuperada da fracção de sedimentado lavado insolúvel. A neublastina mutada por N95K foi extraída do sedimentado com cloridrato de guanidina, reduplicada, e a etiqueta His removida com enteroquinase (ver Exemplo 5) . O produto foi em seguida submetido à cromatografia em agarose de Ni NTA (Qiagen) e em resina de permuta de catião Bakerbond WP CBX. O tratamento de enteroquinase do produto com etiqueta de His resultou numa clivagem anormal da proteína em arginina 7 na sequência madura. O produto de neublastina 1-7 des resultante (NBN106-N95K) estava totalmente activo no KIRA ELISA e estruturalmente indistinguível da forma madura na sua susceptibilidade à desnaturação induzida por guanidina e por esse motivo foi utilizado para trabalho subsequente. A neublastina NBN106-N95K mutada de ratazana foi PEGuilada a uma média de 3,3 porções de PEG por molécula de neublastina utilizando propionato de metoxilpoli(etileno glicol)-succinimidila (SPA-PEG) com uma massa molecular de 10.000 Da como reagente. O produto PEGuilado foi submetido à caracterização extensiva incluindo análise por SDS-PAGE, cromatografia de exclusão por tamanho (SEC), HPLC de fase reversa, espectrometria de massa de desabsorção/ionização a 84 ΕΡ1594436Β1 laser assistida por matriz (MALD/IMS), mapeamento de peptídeo, avaliação de actividade no KIRA ELISA, e determinação do conteúdo de endotoxina. A pureza do produto de neublastina N95K antes da PEGuilação foi avaliada por SDS-PAGE e SEC foi superior a 95%. 0 produto de neublastina N95K migrou sob condições de não redução como um dímero, consistente com a sua estrutura prevista. Após a PEGuilação, o produto resultante consistiu de uma série de adutos modificados compreendendo 2 PEGs por molécula, que correspondeu a 5% do produto, 3 PEGs por molécula, que correspondeu a 60% do produto, 4 PEGs por molécula, que correspondeu a 30% do produto, e diversas formas menores de maior massa. Na amostra PEGuilada não havia nenhuma prova de agregados. Os niveis residuais de neublastina não modificada no produto estavam abaixo dos limites de quantificação. O conteúdo de endotoxina do material é, em termos normais, inferior a 1 EU/mg. A actividade especifica da neublastina PEGuilada no KIRA ELISA é 10 nM. O produto PEGuilado foi formulado a 1,1 mg/mL em PBS pH 6,5. O material, que é similar em potência à neublastina do tipo selvagem (NBN113), pode ser fornecida como um liquido congelado, que é armazenado a -70°C.
Os polipeptideos de neublastina mutada R14K, R39K, e R68K foram expressos em E. coli e podem ser submetidos aos mesmos métodos para purificação, PEGuilação e avaliação de função tal como descrito acima para a neublastina NBN106-N95K.
Preparação de Neublastina NBN106-N95K Mutada PEGuilada 230 mL da neublastina mutada N95K de ratazana 85 ΕΡ1594436Β1 reduplicada (2,6 mg/mL) que foram produzidos em E. coli e armazenados a 4°C em 5 mM de fosfato de sódio pH 6,5, 100 mM de NaCl foram diluídos com 77 mL de água, 14,4 mL de 1M HEPES pH 7,5, e 2,8 g (10 mg/mL finais) de PEG SPA 10.000 Da (Shearwater Polymers, Inc.). A amostra foi incubada à temperatura ambiente durante 4 horas no escuro, em seguida tratada com 5 mM de imidazol (final), filtrada, e armazenada durante a noite a 4°C. O produto foi gerado em dois lotes, um contendo 130 mL do volume de N95K e o outro contendo 100 mL do volume. A neublastina PEGuilada foi purificada a partir da mistura de reacção em Fractogel EMD S03" (M) (EM Industries). A coluna foi conduzida à temperatura ambiente. Todos os tampões foram preparados livres de pirogénio. Cloreto de sódio foi adicionado à mistura de reacção a uma concentração final de 87 mM e a amostra foi vertida sobre uma coluna Fractogel de 45 mL (diâmetro interno de 5 cm). A coluna foi lavada com um volume de coluna de 5 mM de fosfato de sódio a pH 6,5, 80 mM de NaCl, em seguida com três alíquotas de um volume de coluna de 5 mM de fosfato de sódio contendo 50 mM de NaCl. A resina foi transferida para dentro de uma coluna de 2,5 cm de diâmetro e a neublastina PEGuilada foi eluída da coluna com seis etapas de dez mL contendo 5 mM de fosfato de sódio pH 6, 5, 400 mM de NaCl, três etapas contendo 500 ml de NaCl, e seis etapas contendo 600 mM de NaCl. Foram analisadas fracções de eluição quanto ao conteúdo de proteína pela absorvência a 280 nm e em seguida quanto ao nível de modificação por SDS-PAGE. Reuniram-se fracções seleccionadas, filtradas por meio de um filtro de 0,2 pm, e diluídas com água a 1,1 mg de neublastina de ratazana PEGuilada/mL. Depois de avaliar os níveis de endotoxina nos lotes individuais, elas foram reunidas e refiltradas por meio 86 ΕΡ1594436Β1 de uma membrana de 0,2 ym. O material final foi aliquotado e armazenado a -70°C.
Espectro de UV de Neublastina NBN106-N95K Mutada PEGuilada Purificada O espectro de UV (240 - 340 nm) de NBN N95K PEGuilada foi calculado na amostra pura. A amostra foi analisada em triplicado. A amostra PEGuilada exibiu um máximo de absorvência a 275 - 277 nm e um mínimo de absorvência a 247 -249. Este resultado é compatível com o que é observado no volume intermediário. A concentração de proteína do produto PEGuilado foi estimada a partir do espectro empregando um coeficiente de extinção de Σ28οΟ,1% = 0,50. A concentração de proteína do volume de neublastina PEGuilada é 1,1 mg/mL. Nenhuma turvação estava presente na amostra conforme é evidente pela ausência de absorvência a 320 nm.
Caracterização de Neublastina NBN106-N95K Mutada PEGuilada por SDS-PAGE
Submeteram-se alíquotas de neublastina PEGuilada contendo 3, 1,5, 0,75 e 0,3 yg do produto a SDS-PAGE num gel de gradiente a 4-20% (Owl) . O gel foi manchado com azul brilhante Coomassie R-250. Activaram-se marcadores de peso molecular (GIBCO-BRL) em paralelo. A análise de SDS-PAGE de neublastina NBN106-N95K mutada PEGuilada em condições de não redução revelou uma série de faixas correspondentes a modificações com 2, 3, 4 e mais do que 4 PEGs por molécula. A faixa maior com massa aparente de 98 kDa contém 3 PEGs por molécula. No produto PEGuilado 87 ΕΡ1594436Β1 purificado, não foi detectada neublastina não PEGuilada. A presença de uma mistura de produtos com 2, 3 e 4 PEGs ligados foi verificada por análise espectrométrica de massa MALDI. A relação de produto contendo 2, 3, e 4 PEGs foi determinada por densitometria e determinou-se quer correspondia a 7, 62, e 30 por cento do total, respectivamente.
Caracterização de Neublastina NBN106-N95K Mutada PEGuilada por Cromatografia de Exclusão de Tamanho A neublastina NBN106-N95K mutada PEGuilada foi submetida à cromatografia de exclusão de tamanho numa coluna analítica Superose 6 HR10/30 FPLC utilizando 5 mM de MES pH 6,5, 300 mM de NaCl como a fase móvel. A coluna trabalhou a 20 mL/h. Controlaram-se fracções de eluição para absorvência a 280 nm. A neublastina mutada PEGuilada eluiu como um pico único com um aparente peso molecular de cerca de 200 kDa consistente com o grande volume hidrodinâmico do PEG. Não se observou qualquer evidência de agregados. Não foi detectada na preparação neublastina livre, que elui com uma aparente massa molecular de cerca de 30 kDa, .
Análise de Neublastina NBN106-N95K Mutada PEGuilada por HPLC de Fase Reversa A neublastina NBN106-N95K mutada PEGuilada foi submetida a HPLC de fase reversa numa coluna de C4 Vydac (5 |lm, 1 x 250 mm) . A coluna foi desenvolvida empregando-se um gradiente de 60 mm de 40 a 60% de B (Tampão A: 0,1% de TFA, Tampão B: 75% de acetonitrilo/0, 085% de TFA). O efluente da coluna foi monitorado para absorvência a 214 nm e as fracções recolhidas para análise subsequente. NBN106-N95K PEGuilada foi 88 ΕΡ1594436Β1 fraccionada nos seus vários componentes di (60,5 mm), tri (63,3 mm), e tetra (67,8 mm) PEGuilados por HPLC de fase reversa numa coluna de C4. As intensidades relativas dos picos sugerem que as relações dos componentes são 5,4, 60,5 e 30,1%, respectivamente. As identidades dos picos foram verificadas por MALDI-MS. Não houve nenhuma evidência de NBN106-N95K não PEGuilada (elui a 5-15 mm) no produto.
Análise de Neublastina NBN106-N95K Mutada PEGuilada por Espectrometria de Massa A neublastina NBN106-N95K mutada PEGuilada foi dessalinizada num C4 Zip Tip e analisada por espectrometria de massa num espectrómetro de massa de tempo de escape de desabsorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF) Voyager-DE™ STR (PerSeptive Biosystems) empregando ácido sinapinico como uma matriz. 0,5 μΕ da proteína purificada foi misturado com 0,5 μΕ da matriz na placa alvo. A espectrometria de massa de neublastina NBN106-N95K mutada PEGuilada revelou formas simplesmente e duplamente carregadas de três adutos. As massas observadas de 43803 Da, 54046 Da, e 64438 Da são compatíveis com as modificações de 2, 3 e 4 PEGs por molécula.
Análise de Neublastina NBN106-N95K Mutada PEGuilada por Mapeamento de Peptídeo A especificidade da reacção de PEGuilação foi avaliada por mapeamento de peptídeo. A neublastina PEGuilada foi separada em componentes di, tri, e tetra PEGuilados, os quais foram em seguida reduzidos, alquilados, e de novo separados nos seus componentes de cadeia única por HPLC numa coluna de 89 ΕΡ1594436Β1 C4. Estes componentes e NBN106-N95K não PEGuilada reduzida e alquilada como controle foram digeridos com proteinase Asp-N e os produtos de clivagem resultantes foram fraccionados por HPLC de fase reversa numa coluna de Ci8 Vydac (5 μιη, 1 x 250 mm) empregando-se um gradiente de 60 mm de 0 a 60% de B (Tampão A: 0,1% de TFA, Tampão B: 75% de acetonitrilo/0, 085% de TFA). O efluente da coluna foi monitorado para absorvência a 214 mm. A sequência de neublastina de ratazana contém cinco ácidos aspárticos internos e, consequentemente, esperava-se produzir um perfil de clivagem simples quando digerida com endoproteinase Asp-N. Todos os picos do digesto de Asp-N de N95K de ratazana têm sido identificados por espectrometria de massa e/ou sequenciamento amino terminal de Edman e portanto o mapa de peptideo pode ser utilizado como uma ferramenta simples para sondar quanto aos sítios de modificação pela presença ou ausência de um pico. A identidade dos vários picos é resumida na Tabela 7 seguinte.
Tabela 7
Pico por Tempo de Retenção (mm) Média de Massa Observada Média de Massa Teórica Designação de Resíduo (ID DE SEQ N° 2) Sequência de Aminoácidos 38, 8 1261,1 (M) 1262,4 102-113 DHLSATACGCLG 40, 7 1090,9 1092,2 93-101 DVKSTWRTV 44, 6 2508,4 2508,9 35-54 DELIRFRFCSGSCRRARSPH 46, 0 2437,0 2437,8 12-34 DARGCRLRSQLVPVS ALGIjGHS S 51, 4 3456,7 3456,0 55-86 DLSLAS...CRPTRY 51, 9 4134,4 55-92 (óxido) DLSLAS...CRPTRYEAVSFM 53, 2 4136,3 * 4120,8 55-92 DLSLAS. ..CRPTRYEAVSFf1 90 ΕΡ1594436Β1 (Μ): massa monolostópica *: devido à oxidação do peptideo contendo metionina em MALDI.
Uma vez que a neublastina existe naturalmente como um homodímero, o produto de NBN106-N95K mutada de ratazana contém quatro sítios potenciais para a PEGuilação, as duas aminas do terminal amino de cada uma das cadeias e os dois sítios de N95K que foram planeados na construção. No mapa de peptideo da cadeia di-PEGuilada, apenas o pico que contém o peptideo com a mutação de N95K foi alterado pela modificação de PEG. Nenhum dos outros picos foi afectado pela modificação de PEG. Assim, os dados do mapeamento indicam que a porção de PEG é especificamente ligada a este peptideo e não a qualquer dos outros peptídeos que foram analisados. 0 segundo sítio potencial de ligação, o terminal amino encontra-se num peptideo que tem apenas três aminoácidos de comprimento e não é detectado no mapa de peptideo. Infere-se que ligações de PEG adicionais estão neste sítio. Consistente com esta noção, uma pequena percentagem da neublastina N95K mutada de ratazananão é truncada e contém a sequência de Ala-1 madura. Este peptideo elui a 30 [ira e é visível no mapa de peptideo do digesto não PEGuilado, mas está ausente dos digestos de neublastina NBN106-N95K mutada PEGuilada.
Exemplo 3: Avaliação da Potência de Neublastina NBN106-N95K Mutada PEGuilada Internamente num ELISA de Activação de Receptor de Quinase (KIRA) (Exemplo Ilustrativo)
A potência de neublastina de ratazana mutada PEGuilada foi medida empregando-se activação/fosforilação dependente de neublastina de c-Ret como um repórter para a actividade de neublastina num ELISA específico para a presença de RET 91 ΕΡ1594436Β1 fosforilado. Células de NB4lA3-mRL3, uma linhagem de célula de neuroblastoma de murino aderente que expressa Ret e GFR0C3, foram semeadas a 2 x 105 células por cavidade em placas de 24 cavidades em veículo de águia modificado da Dulbecco (DMEM), suplementado com soro bovino fetal a 10%, e cultivadas durante 18 horas a 37°C e C02 a 5%.
As células foram lavadas com pbs, e tratadas com diluições seriais de neublastina em 0,25 mL de DMEM durante 10 minutos a 37°C e C02 a 5%. Cada amostra foi analisada em duplicata. As células foram lavadas com 1 mL de PBS, e lisadas durante 1 hora a 4°C com 0,30 mL de 10 mM Tris HC1, pH 8,0, Nonidet P40 a 0,5%, desoxicolato de sódio a 0,2%, 50 mM de NaF, 0,1 mM de Na3 V04, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonila com agitação suave das placas. Os lisados foram em seguida agitados por pipetagem repetida e 0,25 mL da amostra foi transferido para uma placa de ELISA de 96 cavidades que foi revestida com 5 μς/ηΛ de mAb anti-Ret (AA.GE7.3) em 50 mM de tampão de carbonato, pH 9,6 a 4°C durante 18 horas, e bloqueada à temperatura ambiente durante uma hora com tampão de bloqueio (20 mM de Tris HC1 pH 7,5, 150 mM de NaCl, Tween-20 a 0,1% (TBST) contendo soro de rato normal a 1% e albumina sérica bovina a 3%).
Após uma incubação de 2 horas à temperatura ambiente, as cavidades foram lavadas 6 vezes com TBST. Ret fosforilado foi detectado por incubação das cavidades à temperatura ambiente durante 2 horas com 2 μρ/ηΛ de anticorpo 4G10 antifosfotirosina conjugado com rábano silvestre peroxidase (HRP) em tampão de bloqueio, lavagem 6 vezes com TBST, e medição da actividade de HRP a 450 nm com um reagente de detecção colorimétrico. Os valores de absorvência das 92 ΕΡ1594436Β1 cavidades tratadas com o lisado ou com tampão de lise foram medidos e o sinal corrigido na base foi plotado como uma função da concentração de neublastina presente na mistura de activação. A potência da neublastina mutada PEGuilada (3(,4) x 10 kDa de NBN106-N95K de PEG) no KIRA ELISA foi indistinguível da do material de NBN113 selvagem (FIG.l e Tabela 8). Não houve nenhum efeito dos dois ciclos de congelamento-descongelamento sobre a potência e na sequência deste tratamento não houve nenhum aumento significante na turvação da amostra, indicando que as amostras podem ser descongeladas de forma segura para o estudo. Em estudos independentes com acesso à actividade do produto com três e quatro PEGs de 10 kDa por molécula separadamente, foi determinado que o aduto com três PEGs foi totalmente activo, enquanto o produto de quatro PEGs tinha reduzido a potência (Tabela 8) . Estes dados demonstram que 3, (4) x 10 kDa de NBN106-N95K de PEG e 3 x 10 kDa de NBN106-N95K de PEG activam Ret a um nível similar e com a mesma dependência da dose que a neublastina não mutada (selvagem), NBN113. Entretanto, embora 4 x 10 kDa de NBN106-N95K de PEG activo de Ret a um nível similar assim como NBN113 não mutada (selvagem), 4 x 10 kDa de NBN106-N95K de PEG é aproximadamente 10 vezes menos potente do que NBN113 não mutada (selvagem) na activação de Ret. A Tabela 8 inclui os EC50's estimados.
Exemplo 4: Estudos Farmacocinéticos de Neublastina NBN106-N95K de Ratazana Mutada PEGuilada Internamente em Ratazanas e Ratos (Exenqplo ilustrativo)
As propriedades farmocinéticas de vários produtos de neublastina mutada PEGuilada e não PEGuilada em modelos de ratazana e rato foram examinadas (ver Tabela 8 para sumário 93 ΕΡ1594436Β1 dos resultados).
Os dados revelaram que a PEGuilação de neublastina NBN106-N95K mutada de ratazana com 3, 3, 10000 Da de PEGs resultou num efeito significativo sobre a meia-vida e biodisponibilidade da neublastina. No seguimento de uma administração IV de 1 mg/kg em ratazanas Sprague Dawley, foram detectados niveis de pico de neublastina mutada PEGuilada de 3000 ng/mL após 7 minutos, e foram detectados niveis de 700 ng/mL após 24 horas, 200 ng/mL após 48 horas, e 100 ng/mL após 72 horas. Contrastando com a neublastina N95K mutada não PEGuilada na sequência de uma administração IV de 1 mg/kg, foram detectados niveis de 1500 ng/mL após 7 minutos, mas niveis desceram rapidamente em seguida para 70 ng/mL após 3 horas e não foram detectáveis após 7 horas. Os efeitos da PEGuilação foram ainda mais pronunciados em animais tratados com neublastina PEGuilada por administração subcutânea.
Na sequência de uma administração s.c. de 1 mg/kg, os niveis circulantes de neublastina PEGuilada alcançaram um máximo de 200 ng/mL após 24 horas e permaneceram neste nivel durante a duração dos três estudos do dia. Contrariamente aos valores anteriores, nenhuma neublastina detectável foi observada em qualquer momento após a administração de neublastina mutada não PEGuilada. A análise das amostras de N95K PEGuilada é dificultada pela presença de adutos compreendendo 2, 3 e 4 PEGs por molécula, cada uma apresentando um perfil de PK diferente. Em estudos de PK anteriores, foram utilizados ratos para facilitar a análise numa variedade de candidatos e vias de 94 ΕΡ1594436Β1 administração. Os estudos com ratos revelaram diferenças dramáticas na biodisponibilidade dos candidatos. No entanto, quando o aduto de 3,3 10 kDa de PEG foi avaliado em ratazanas, constatou-se que era menos biodisponível em ratazanas do que foi em ratos. Esta diferença na biodisponibilidade foi particularmente visível após a administração de i.p.. Os níveis em ratos alcançaram 1600 ng/mL após 7 horas e permaneceram em 400 ng/mL após 24 horas. Contrastantemente, os níveis das ratazanas foram constantes em 100 ng/mL durante 4-48 horas.
Dois resultados surpreendentes e inesperados emergiram dos estudos de PK resumidos na Tabela 8: 1) a PEGuilação dos aminoácidos do terminal amino da neublastina não glicosilada não foi suficiente para aumentar a exposição substancial ao soro; e 2) a PEGuilação do(s) aminoácido(s) do terminal amino da neublastina juntamente com a modificação (por exemplo PEGuilação ou glicosilação) do aminoácido 95 foi suficiente para aumentar substancialmente a exposição ao soro. Por exemplo, NBN104 (CHO) glicosilada não produziu nenhuma exposição detectável após a administração s.c.; no entanto, 1x20 kDa de NBN104 de PEG (CHO) glicosilada produziu alta exposição ao soro após a administração s.c.. Do mesmo modo, 2x20 kDa de NBN113 de PEG produziu exposição ao soro baixa a moderada após a administração s.c.; entretanto, 2x20 kDa de NBN104 de PEG (CHO) glicosilada produziu alta exposição ao soro após a administração s.c.. Estes resultados indicaram que a conjugação com polímero do(s) aminoácido(s) do terminal amino da neublastina, juntamente com a conjugação com polímero de um aminoácido interno (por exemplo na posição 95) ou glicosilação de um aminoácido interno (por exemplo na posição 95) resulta em exposição ao soro substancialmente 95 ΕΡ1594436Β1 aumentada após administraçao sistémica.
Ambas as neublastina de ratazana do tipo selvagem e a neublastina N95K mutada foram reduplicadas e purificadas para >95% quanto aos testes de eficácia no modelo de neuropatia de ratazana diabético STZ. A neublastina do tipo selvagem foi formulada para entrar directamente no teste de animal enquanto a N95K foi preparada para PEGuilação com 10 kDa de PEG-SPA. Para realizar a reduplicação e objectivo de purificação, desenvolveu-se um método de reduplicação utilizando cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) que permitiu a renaturação da neublastina de anticorpos de inclusão de E. coli em grandes quantidades e altas concentrações. Além de SEC, utilizaram-se ambas as etapas de cromatograf ia de coluna de silica de Ni-NTA e CM para aumentar a pureza final da proteína. As proteínas foram submetidas a caracterização extensiva incluindo análise por SDS-PAGE, cromatografia de exclusão por tamanho, ESMS, avaliação de actividade pelo KIRA ELISA, e determinação do conteúdo de endotoxina. SDS-PAGE e SEC dos produtos de proteína finais indicaram uma pureza superior a 95%. O nível de endotoxina de cada produto foi de <0,2 EU/mg. A actividade específica de ambas as proteínas no KIRA ELISA é de aproximadamente 10 nM. A neublastina do tipo selvagem foi formulada a 1,0 mg/mL e N95K foi formulada a 2,6 mg/mL em
solução salina tamponada por fosfato (PBS) pH 6,5. A neublastina do tipo selvagem foi aliquotada em tubos de 15 mL e armazenada congelada a -70°C enquanto ο N95K foi submetido a PEGuilação antes da aliquotagem e congelamento.
Exemplo 5: Reduplicação e Purificação de uma Neublastina do tipo selvagem e da Neublastina N95K Mutada (Exemplo 96 ΕΡ1594436Β1
Ilustrativo)
Ambas as formas de neublastina foram expressas em E. coli como proteínas de fusão com etiqueta de Histidina (His) com um sítio de clivagem de enteroquinase imediatamente adjacente ao início da sequência de 113 aminoácidos madura. Bactérias expressando neublastina do tipo selvagem (1,8 kg de pélete) ou N95K (2,5 kg de pélete) foram submetidas a lise em 2 litros de PBS utilizando uma Prensa APV Gaulin. Na sequência da centrifugação (10.000 rpm) para peletizar os corpos de inclusão, os sobrenadantes de cada preparação foram descartados. Os péletes do corpo de inclusão foram lavados duas vezes com tampão de lavagem (0,02 M de Tris-HCl a pH 8,5, 0,5 mM de EDTA) e em seguida lavados duas vezes com o mesmo tampão contendo Triton X-100 (2%, volume/ volume), seguido por duas lavagens de tampão adicionais sem detergente. Ambos os péletes foram solubilizados empregando-se 6M de cloridrato de guanidina, 0,1 M de Tris pH 8,5, 0,1 M de DTT, e 1 mM de EDTA. Para ajudar no processo de solubilização, cada pélete foi submetido à homogeneização utilizando um homogeneizador Polytron seguido por agitação durante a noite à temperatura ambiente. As proteínas solubilizadas foram clarificadas por centrifugação antes da cromatografia de desnaturação através de Superdex 200 (coluna de 5,5 litros com 0,05 M de glicina/H3P04 a pH 3,0 com 2M de Guanidina-HCl) a 20 mL por minuto. A neublastina desnaturada foi identificada por SDS-PAGE. Fracções contendo ou neublastina do tipo selvagem ou N95K foram reunidas e concentradas em aproximadamente 250 mL utilizando um concentrador de célula agitado de 2,5 litros Amicon. Após a filtragem para remover qualquer precipitado, a 97 ΕΡ1594436Β1 proteína concentrada foi submetida à cromatografia de dimensionamento de renaturação por meio de Superdex 200 equilibrada com 0,1 M de Tris-HCl a pH 7,8, 0,5M de guanidina-HCl, 8,8 mM de glutationa reduzida e 0,22 mM de glutationa oxidada. A coluna foi desenvolvida utilizando 0,5 M de guanidina-HCl a 20 mL por minuto. Fracções contendo neublastina selvagem renaturada ou neublastina N95K foram identificadas por meio de SDS-PAGE, reunidas, e armazenadas a 4°C até o necessário para remoção de etiqueta de His. Método Alternativo de Reduplicação de Neublastina de selvagem e Neublastina N95K Mutada por meio de Diluição
Para reduplicar a neublastina por diluição, uma proteína solubilizada foi rapidamente diluída em tampão de reduplicação (0,5 M de guanidina-HCl, 0,35 M de L-Arginina, 50 mM de fosfato de potássio (pH 7,8), 0,2 mM de glutationa reduzida, 1 mM de glutationa oxidada, e 0,1% de Tween-80) a uma concentração final de 0,1 mg/mL e incubada à temperatura ambiente durante 48 horas sem agitação. A neublastina reduplicada foi em seguida concentrada a 25 vezes, levada a 40 mM de imidazol, e aplicada a uma coluna de cromatografia contendo agarose de Ni-NTA para também concentrar o produto e eliminar proteínas de célula hospedeira. A coluna foi lavada com 10 vezes o volume da coluna com tampão de lavagem (40 mM de imidazol, 0,5 M de guanidina-HCl). A neublastina foi em seguida eluída da resina com 0,2 M de Imidazol e 0,5 M de guanidina-HCl. 98 ΕΡ1594436Β1
Concentração de Neublastina Reduplicada por Coluna por meio de Cromatografia de Ni-NTA A neublastina renaturada por coluna foi armazenada a 4°C durante 24 horas antes de efectuar a purificação para promover a formação de dissulfeto entre os monómeros de neublastina. Durante este período, formou-se um precipitado e foi removido pela filtragem por meio de uma unidade de filtro de 0,2 μ de sulfona de poliéster (PES) . Para diminuir a ligação não específica, a solução de proteína foi levada a 20 mM de imidazol antes do carregamento numa coluna de Ni-NTA (Qiagen) de 100 ml equilibrada com tampão de coluna (0,5 M de guanidina e 20 mM de imidazol) a 50 mL por minuto. Após a aplicação de proteína, a coluna foi lavada até a linha de base empregando o mesmo tampão. A neublastina foi eluída da resina empregando aproximadamente 300 mL de tampão de eluição contendo 0,5 M de guanidina-HCl e 0,4 M de imidazol. Após aa eluição, a neublastina foi dialisada durante a noite (utilizando tubagem de diálise de 10 kDa) à temperatura ambiente contra dez volumes de 5 mM de HC1. A diálise promove a hidrólise de substâncias contaminantes e diminui as concentrações de guanidina-HCl e imidazol para 0,05 M e 0,04 M, respectivamente.
Clivagem do Rótulo com etiqueta de His por meio de Lisil Endopeptidase ou Enteroquinase
No dia seguinte, qualquer precipitado que se tenha formado durante a diálise foi removido por meio de filtragem. As etapas de purificação seguintes aplicam-se a ambos os produtos de neublastina reduplicada por diluição e por coluna. A amostra de proteína foi feita a 0,1 M de NaCl por 99 ΕΡ1594436Β1 meio da adição de NaCl de uma matéria-prima a 5M para uma concentração de sal final incluindo a guanidina-HCl restante de aproximadamente 150 mM. Esta concentração foi confirmada utilizando um medidor de condutividade. Além disso, foi adicionado 1 M de HEPES a pH 7,8 para uma concentração final de 25 mM. Para clivar o rótulo etiqueta His, foi adicionada lisil endopeptidase à neublastina de tipo selvagem e enteroquinase foi adicionada à neublastina mutada N95K, arribas numa taxa de aproximadamente 1:300 de protease para neublastina. Utilizou-se enteroquinase em vez de lisil endopeptidase para a neublastina mutada N95K devido a um sítio de clivagem de protease adicional na proteína mutada em Lys95. As amostras foram agitadas à temperatura ambiente durante 2 horas e as digestões monitoradas por meio de SDS-PAGE .
Remoção do Rótulo etiqueta de His por meio de Cromatografia de Ni-NTA A neublastina tratada por protease foi aplicada a uma coluna de Ni-NTA de lOOmL equilibrada com 0,5 M de guanidina-HCl e 20 mM de imidazol a 50 mL por minuto. A coluna foi lavada até à linha de base com o mesmo tampão. Qualquer proteína tirada por lavagem da coluna foi reunida com o fluxo de neublastina contendo proteína sem a etiqueta His.
Cromatografia de Sílica de CM
Após a cromatografia de Ni-NTA, a proteína foi imediatamente submetida à purificação adicional por meio de resina de sílica de CM. Uma coluna de sílica de CM de 20 mL equilibrada com tampão de carregamento (5 mM de fosfato a pH 100 ΕΡ1594436Β1 6,5, 150 mM de NaCl) foi carregada com neublastina a 20 mL por minuto. A coluna foi lavada com vinte volumes da coluna de tampão de lavagem (5 mM de fosfato a pH 6, 5, 400 mM de NaCl) e a etapa de proteina eluida com tampão de eluição contendo 5 mM de fosfato a pH 6,5 mas sem 1 M de NaCl. A proteina eluida foi dialisada durante a noite contra o fosfato sozinho para levar à concentração de sal até 100 mM para N95K e 150 mM para neublastina de tipo selvagem. Ambas as amostras foram filtradas por meio de uma unidade de filtro de 0,2 μ de PES, analisadas por meio de SDS-PAGE, e armazenadas a 4°C até o necessário para caracterizações adicionais e/ou PEGuilação.
As preparações de proteina de neublastina mutada N95K e do tipo selvagem foram submetidas à análise de espectro de UV para avaliar as suas absorvências a 280. Utilizando apenas uma cubeta de micro-quartzo e intervalo junto ao tampão, 100 pL de ou neublastina mutada N95K ou do tipo selvagem foram continuamente examinados de 230 a 330 nm utilizando um espectrofotómetro de Beckman. Com base nesta análise, verificou-se que a neublastina de tipo selvagem estava a uma concentração de 1,1 mg/mL e a neublastina mutada N95K a 2,6 mg/mL (foi utilizado A280 ηΐΐΐ-Ε0,1ΐ=0,5 para cada proteína). Menos do que 1% de material precipitado foi identificado com base na absorvência a 330 nm.
Para avaliar a pureza de ambas as preparações de proteína, cada amostra (0,5 mg) foi submetida à cromatografia de exclusão por tamanho por meio de uma coluna 16/30 Superdex 75. A coluna foi equilibrada com 5 mM de fosfato a pH 6,5 contendo 4400 mM de NaCl e desenvolvida com uma taxa de fluxo de 1,5 mL por minuto. Com base na absorvência a 280 nm, ambas 101 ΕΡ1594436Β1 as preparações de neublastina mutada N95K e do tipo selvagem migraram como um pico único com um peso molecular esperado (23-24 kDa), e não continham qualquer contaminação de proteina significante.
Ambas as proteínas de neublastina mutada N95K e do tipo selvagem foram reduzidas em 2,5 M de guanidina-HCl, 60 mM de Tris a pH 8,0 e 16 mM de DTT. As amostras reduzidas foram dessalinizadas sobre uma coluna de C4 pequena e analisadas em linha por meio de ESMS utilizando um instrumento quádruplo triplo. Os dados naturais de ESMS foram decifrados através do programa MaxEnt para gerar espectros de massa. Este procedimento permite que sinais com múltiplas cargas colapsem num pico que corresponde directamente à massa molecular em quiloDáltons (kDa). O espectro de massa decifrado para o tipo selvagem mostrou que a espécie predominante é 12046 Da, o que está de acordo com o peso molecular previsto de 12046, 7 Da para a forma de 113 aminoácidos da proteina. Um componente menos importante foi também observado (12063 Da) sugerindo a presença de um produto de oxidação. Três picos foram identificados na amostra de proteína de neublastina mutada N95K. O componente principal demonstrou uma massa molecular aparente de 11345 Da de acordo com a massa predita para a forma de 106 aminoácidos da proteina. Os outros dois picos tinham massas de 11362 a 12061 Da, sugerindo oxidação de N95K e a presença da forma de 113 aminoácidos, respectivamente. A presença das formas de 106 e 113 aminoácidos na preparação de proteina de neublastina mutada N95K é atribuível à digestão com enteroquinase. Esta protease proveniente de Biozyme é uma preparação de enzima natural purificada a partir da mucosa intestinal de bezerro e sabe-se 102 ΕΡ1594436Β1 que contém uma ligeira contaminação de tripsina (0,25 ng de tripsina por pg de enteroquinase). Por esse motivo, a tripsina pode estar a agir sobre a proteína de neublastina mutada N95K no lado do terminal carbóxi de Arg7 para produzir a forma de 106 aminoácidos predominante. Por outro lado, a lisil endopeptidase empregada para clivar neublastina de selvagem é uma actividade de protease simples a agir no lado do terminal carbóxi do resíduo de lisina contido dentro da etiqueta His para produzir a forma de neublastina de 113 aminoácidos madura. Ambas as formas de 106 e 113 aminoácidos de neublastina são igualmente activas em todos os ensaios testados e comportam-se similarmente em testes de estabilidade de guanidina-HCl. A actividade de neublastina foi determinada por sua capacidade para estimular a fosforilação de c-Ret em células de NB4lA3-mRL3 empregando o KIRA ELISA descrito no Exemplo 3. O Ret fosforilado foi detectado por meio de incubação (2 horas) do receptor capturado com anticorpo de fosfotirosina conjugada a HRP (4G10; 0,2 pg por cavidade). Após a incubação, as cavidades foram lavadas seis vezes com TBST, e a actividade de HRP detectada a 450 nm com um ensaio colorimétrico. Os valores de absorvência das cavidades tratadas com lisado ou apenas com tampão de lise foram medidos, corrigidos na base, e os dados registados como uma função da concentração da neublastina presente na mistura de activação. Os dados demonstram que os polipeptídeos de neublastina purificados resultaram no aparecimento de RET fosforilado, indicando que a neublastina purificada estava activa neste ensaio. 103 ΕΡ1594436Β1
Exemplo 6: Preparação de um Conjugado de Albumina Sérica de Neublastina (Exemplo Ilustrativo) A neublastina de ratazana de tipo selvagem a uma concentração de 1 mg/mL em PBS foi tratada com 1 mM de sulfo-SMCC (Pierce) e dessalinizada para remover o reticulador em excesso. Uma vez gue a proteína de neublastina de selvagem contém apenas uma única amina no seu terminal amino e nenhum grupo de sulfidrila livre, esperou-se que a reacção com SMCC que resultasse numa modificação específica de sítio da neublastina com SMCC ligado ao seu terminal amino.
Em seguida, 60 pg do conjugado de neublastina-SMCC foram incubados com 120 pg da albumina sérica bovino e analisados pela extensão de reticulação por meio de SDS-page. O BSA contém um único grupo de SH livre e consequentemente esperou- se que a reacção com o conjugado de neublastina-SMCC resultasse em modificação neste sítio por meio da maleimida no SMCC. Nestas condições, foram observadas duas faixas adicionais de peso molecular elevado, que são consistentes em massa com a modificação da neublastina com uma única porção de BSA e com duas moléculas de BSA, visto que cada molécula de neublastina contém dois terminais amino que podem sofrer reacção, e consequentemente estão de acordo com esta ideia. Concorrente com a formação destas faixas, houve uma diminuição na intensidade das faixas de BSA e neublastina-SMCC. Com base na intensidade da faixa de neublastina restante, a reacção mostrou ter transcorrido até a conclusão de 70 a 80%. O produto monossubstituído foi purificado da mistura de reacção por meio de submissão do material à cromatografia de 104 ΕΡ1594436Β1 permuta de catião e cromatografia de exclusão por tamanho numa coluna Superdex 200 (Pharmacia) essencialmente como descrito nos estudos de PEGuilação acima referidos. As fracções de coluna do curso da filtragem de gel foram analisadas por meio de SDS-PAGE e as que continham o produto monossubstituido foram analisadas por conteúdo de proteína por meio de absorvência a 280 nm. Uma vez que a massa de BSA é aproximadamente duas vezes a da neublastina, a concentração aparente foi dividida por um factor de 3 para produzir a neublastina equivalente. Esta fracção foi submetida a esta análise com relação a função no KIRA ELISA. Os valores de IC50 para ambas as neublastinas conjugadas a BSA e do tipo selvagem foram de 3 a 6 nM, indicando que a conjugação ao BSA não tinha comprometido a função.
Enquanto estes estudos preliminares foram gerados com BSA, as proteínas de albumina sérica correspondentes de ratazanas e seres humanos também contêm uma SH livre. Consequentemente, pode aplicar-se uma abordagem semelhante para gerar um conjugado de neublastina albumina sérica de ratazana para realização de estudos de PK e eficácia em ratazanas e albumina sérica humana - neublastina humana para realização de testes clínicos. Do mesmo modo, o SMCC pode ser substituído por qualquer um de vários reticuladores que contêm um grupo reactivo de amino num lado e um grupo reactivo de tiol no outro lado. Exemplos de reticuladores reactivos de amina que inserem uma maleimida reactiva a tiol são AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS, ou GMBS, que inserem um grupo de haloacetato reactivo a tiol são SBAP, SIA, SIAB e que fornecem um tiol protegido ou não protegido para reacção com grupos de sulfidrila para produzir uma ligação redutível são SPDP, SMPT, SATA, ou SATP, estando 105 ΕΡ1594436Β1 todos disponíveis na Pierce. Tais reticuladores são meramente exemplares e podem considerar-se muitas estratégias alternativas quanto à ligação do terminal amino de neublastina com albumina sérica. Um técnico também pode gerar conjugados para albumina sérica que não são direccionados ao terminal amino de neublastina ou à porção de tiol na albumina sérica. Também se espera que sejam funcionais criações de fusões de albumina sérica de neublastina utilizando engenharia genética onde a neublastina é fundida ao gene de albumina sérica no seu terminal amino, terminal carboxi, ou em ambas as terminações.
Este método pode ser alargado através de adaptações de rotina para qualquer conjugado de albumina sérica de neublastina que resultariam num produto com uma meia-vida prolongada em animais e consequentemente em seres humanos.
Exemplo 7: Cristalização e Determinação da Estrutura de Neublastina Humana A neublastina rotulada de selenometionina foi expressa utilizando um procedimento padrão para inibir a biosíntese da metionina (Van Duyne, et al., 1991, Science 252, 839 - 842). Tanto a neublastina de tipo selvagem e neublastina incorporada por selenometionina foram concentradas a 17 mg/mL em 0,8 M de arginina. A matéria-prima de proteína foi concentrada a 17 mg/mL em 0,8 M de arginina. Os cristais foram cultivados pelo método de difusão de vapor de gota pendente (Jancarik, J. & Kim, S.H., 1991, J. Appl. Crystallogr. 24, 409 - 411) através de 1,25 M de sulfato de magnésio, 0,1 M de MES a pH 6,5 a 20°C. A maioria dos cristais reproduzíveis foram obtidos pela micro semeadura. Os 106 ΕΡ1594436Β1 cristais foram crioprotegidos pela adição de etileno glicol a 5% cada 60 segundos a uma concentração final de 1,25 M de sulfato de magnésio, 0,1 M de MES a pH 6,5, e etileno glicol a 30% (v /v) e em seguida congelados por transferência rápida em azoto líquido.
Os cristais de aproximadamente 100 microns em cada lado difractaram a 1,6A na linha de feixe de luz X4A na National Synchrotron Light Source (Upton, NY). O processamento de dados com o programa HKL (Otwiniowski (1993) em: Proceeding of the CCP4 Study Weekend: Data Collection and Processing (Sawer et al., Eds.) pp. 56 - 62, Daresbury Laboratory, Warrington) revelou que os cristais pertencem a um grupo espacial de C2 com 1 dimero covalente por unidade assimétrica e dimensões de células aproximadas a=115 Â, b=33 Â, c=55 Á e α=γ=90°, β=99°. A estrutura de cristal foi dissolvida por meio de substituições isomorfas múltiplas. Os cristais de neublastina natural foram embebidos em 1 mM de PtCl4 durante 4 horas, 10 mM de IrCl3 durante 72 horas, e 10 mM de IrClô durante 18 horas e os dados recolhidos e processados por meio do conjunto de HKL (Otwinowski et al., supra). Os dois sitios de selenometionina foram localizados por meio de inspecção de padrões de diferença isomorfa e anómala. Os sitios restantes foram localizados empregando SOLVE(4). As fases foram melhoradas através de RESOLVE (Terwilliger et al., 1999, Acta Crystallogr. D. 55, 849 - 861) para uma expressão de valor de 0,56 e os mapas resultantes foram de suficiente qualidade para seguir o modelo de neublastina. Ciclos alternados de construção de modelo com 02D (5 G J Kleywegt & T A Jones, "02D - the manual", software manual, Uppsala, 1994) e 107 ΕΡ1594436Β1 refinamento com CNX empregando um alvo mlhl e refinados contra os dados de selenometionina resultaram num modelo completo da proteína de neublastina, excluindo os primeiros 13 aminoácidos do terminal amino, assim como 89 moléculas de água e 6 aniões de sulfato. 0 Ruvre final é 28,5% e o R-factor é 24,7% a 2,0Â com boa estereoquimica.
Exemplo 8: Sítios de Ligação de Sulfato e Modelagem de Sulfato de Heparina^
Um agrupamento de três sulfatos nos vértices de um triângulo equilateral aproximado localiza-se na região de pré-hélice da superfície de neublastina e pode representar um sítio de ligação para sulfato de heparina. Há três resíduos de arginina que parecem ter interacções fundamentais com estes sulfatos. 0 resíduo de arginina R48 liga todos os três sulfatos (n° 2, n° 6, e n° 3) . A sua amida de cadeia principal interage com sulfato n° 2, enquanto o seu grupo de guanidínio de cadeia lateral forma uma ligação de hidrogénio bifurcada com sulfatos n° 6 e n° 3. Um segundo resíduo de arginina (R49) forma uma ligação de hidrogénio com sulfato n° 2 e um terceiro resíduo de arginina (R51) forma uma ligação de hidrogénio longa no sulfato n° 6.
Estes sulfatos podem representar cavidades de ligação para sulfato de heparina, as quais, se mutadas para resíduos com cargas não positivas, podem reduzir a ligação de sulfato de heparina e possivelmente diminuir e/ou atrasar a eliminação da molécula de neublastina na administração in vivo. Um modelo de ligação de sulfato de heparina para neublastina pode ser construído superimpondo os sulfatos do glicosaminoglicano aos sulfatos existentes da estrutura de 108 ΕΡ1594436Β1 cristal de neublastina. Os sulfatos ligados por n e n+2 sacarideos em sulfatos de heparina da estrutura de cristal de FGF-1 complexado ao sulfato de heparina são separados por aproximadamente 8,5 À (Pellegrini et al., (2000) Nature 407, 1029 - 1034) . Esta medição é praticamente igual à distância entre os sulfatos do agrupamento de 3-sulfato na estrutura de neublastina; sulfatos n° 3 e n° 6 são separados por 8,8 Â e sulfatos n° 3 e n° 2 são separados por 8,1 À. Esta correspondência de medição de distância pode indicar que este motivo R48/R49/R51 é parte de um sitio de ligação de heparina. Isto sugere que mutações únicas de sitio de R48, R4 9 ou R51 para glutamato ou aspartato, ou qualquer outro aminoácido não positivo, poderiam reduzir a afinidade de ligação de sulfato de heparina sem redução da actividade de ligação de receptor de neublastina, resultando assim num produto biologicamente activo que tem uma meia-vida prolongada em animais e, consequentemente, em seres humanos. Para testar esta possibilidade, gera-se uma série de constructos que contêm uma ou mais argininas mutadas para ácidos glutâmicos. Os produtos de neublastina mutada serão expressos em E. coli, purificados e reduplicados, e testados por função. Finalmente, os produtos serão testados pela capacidade para se ligar à heparina e pelas farmacocinéticas e farmacodinâmicas em animais.
Um ou mais destes sítios podem também fornecer outros sítios por PEGuilação que se pode realizar substituindo R por K ou C e aplicando os métodos acima descritos. 109 ΕΡ1594436Β1
Exemplo 9: Dosagem de Neublastina NBN106-N95K Mutada PEGuilada em Reversão de Hiperalgesia Táctil e Térmica em Modelo Animal de Ligação de Nervo de Dor Neuropática (Exemplo Ilustrativo) Já se demonstrou que 1 mg/kg de neublastina de tipo selvagem, administrada s.c. 3 vezes por semana, resulta numa reversão quase completa e normalização de comportamento da dor neuropática (alodinia táctil e hiperalgesia térmica) induzida por meio de ligação de nervo espinhal na ratazana, enquanto que 0,03 mg/kg de neublastina de tipo selvagem, administrada s.c. 3 vezes por semana não teve nenhum efeito e 0,1 mg/kg e 0,6 mg/kg de neublastina de tipo selvagem, administrada s.c. 3 vezes por semana tem efeitos intermédios neste modelo.
Descrevemos neste documento estudos para abordar o efeito de reversão da neublastina N95K PEGuilada na alodinia táctil e hiperalgesia térmica no modelo de ligação de nervo espinhal ("SNL") de Chung L5/L6. As ratazanas macho de Sprague-Dawley (230 - 380g) foram divididas em dois grupos. Todas as ratazanas receberam a ligação de nervo espinhal. Foi administrado a um grupo de ratazanas (n=6) o veiculo por meio de injecção subcutânea. Administrou-se a um segundo grupo de ratazanas (n=6 por grupo) neublastina N95K PEGuilada (3, (4) X 10 kDa de NBN106-N95K de PEG) através de injecção subcutânea a 10 pg/kg. 3, (4) X 10 kDa de NBN106-N95K de PEG compreendia proteína de neublastina que era derivada de E. coli e continha uma substituição de aminoácido de Asn a Lys na posição 95, depois truncada (truncação amino terminal de 7 aminoácidos; NBN106), e finalmente PEGuilada com uma média de 3,3 porções de PEG por dímero de NBN, utilizando propionato 110 ΕΡ1594436Β1 de metoxilpoli(etileno glicol)-succinimidila (SPA-PEG) com uma massa molecular de 10.000 Da como reagente. O veículo consistia em 5 mM de fosfato e 150 mM de cloreto de sódio a pH 6,5. As injecções subcutâneas foram administradas nos dias 3, 5, 7, 10, 12, e 14 após a operação (pós-SNL). Os testes comportamentais de Von Frey (Chaplan et al. (1994), J. Neurose!. Meth. 53: 55 - 63) e de Hargreave (Hargreaves et al. (1988), Pain. 32: 77 - 88) foram utilizados para controlar respostas tácteis e térmicas, respectivamente. Estas respostas à dor foram controladas antes da ligação de nervo espinhal para estabelecer respostas de linha de base, no dia 2 pós-SNL para verificar a presença de hiperalgesia táctil e térmica, e em seguida nos dias 3, 5, 7, 10, 12, 14 e 15 pós-SNL. Para avaliar a relevância estatística do tratamento de droga relativo ao tratamento do veículo, realizou-se uma análise unidireccional de variação (ANOVA unidireccional) seguida por um teste de Student Neuman Keuls pós-hoc (SNK).
Os resultados são descritos nas FIGS. 3-4 como médias ± de erros padrão do meio. Ambos os tipos de comportamento de dor neuropática (alodinia táctil demonstrada na FIGS. 3 e hiperalgesia térmica mostrada na FIGS. 4) desenvolveram-se totalmente até ao dia 2 pós-SNL, tal como era esperado. A administração subcutânea de 10 pg/kg de 3(,4) X 10 kDa de N95K-NBN106 de PEG (conforme denotado por setas descendentes nas FIGS. 3 e 4) levou à reversão substancial e estatisticamente significativa de ambos os tipos de dor neuropática (táctil na FIG. 3 e térmica na FIG. 4) em ratazanas com ligação de nervo espinhal. Nas ratazanas com ligação de nervo espinhal, o efeito de 10 pg/kg de 3 (,4) X 10 kDa de NBN106-N95K de PEG na sensibilidade térmica e alodinia 111 ΕΡ1594436Β1 táctil tornou-se estatisticamente significante 4 dias após a iniciação de administração de neublastina N95K PEGuilada. O efeito de 10 pg/kg de 3(,4) X 10 kDa de NBN106-N95K de PEG na sensibilidade térmica e alodinia táctil alcançou um nível aproximadamente 4 dias após a iniciação da administração de neublastina N95K PEGuilada. Os efeitos de 3(,4) X 10 kDa de NBN106-N95K de PEG não diminuem durante o intervalo do dia 2 a 3 entre as administrações. De facto, houve normalização substancial de comportamentos de dor entre as administrações de neublastina N95K PEGuilada nos dias 5 e 7. Noutra experiência (dados não revelados), a administração subcutânea de 3 pg/kg de 3 (, 4) X 10 kDa de NBN106-N95K de PEG nos dias 3, 5, 7, 10, 12, e 14 levou a uma normalização significativa de comportamentos de dor (hiperalgesia táctil e térmica) no modelo de SNL, apesar de o início do efeito ter sido um pouco lento.
Estes resultados demonstraram que 3 (, 4) X 10 kDa de NBN106-N95K de PEG tem uma potência aumentada de pelo menos 100 a 333 vezes sobre a neublastina não glicosilada não-mutada em comportamentos de dor de alodinia táctil e hiperalgesia térmica no modelo de SNL. As propriedades farmacocinéticas realçadas de 3 (, 4) X 10 kDa de NBN106 N95K de PEG comparadas com a neublastina não glicosilada não mutada indicam que a eficácia da neublastina sistemicamente administrada correlaciona-se com níveis de soro de neublastina. Estes resultados demonstraram que conjugados de polímero de neublastina mutada podem ser utilizados para tratar a dor neuropática em pacientes com doses muito reduzidas, e que se pode potencialmente reduzir a frequência de dosagem, devido à sua biodisponibilidade aumentada comparativamente com a neublastina não conjugada. 112 ΕΡ1594436Β1
Tabela δ. Caracterização Biológica de NBN PEGuilada
Forma de NBN Aminoácido s PEGuilados Amino ácido Glico- silado Exposição em Ratos após Administração s . c . KIRA: -ED50 KIRA: ~eficácia máxima vs WT NBN Nd 0,4-1,2 nM 100% NBN104 (CHO) 95, 95 Nd 0,7 nM 90% 2x5 kDa 1,1 Nd 0,2 nM 105% PEG-NBN 4x5 kDa PEg 1,1,95,95 Nd 1 nM 80% NBN106-N95K 2 x 10 kDa 1,1 Nd 0,2 nM 72% PEG-NBN 1 x 20 kDa 1 Nd 0,2 nM 83% Ramificada PEGN-NBN 1 x 20 kDa 1 95, 95 + + 0,3 nM 110% PEG-NBN104 (CHO) 2 x 10 kDa 1,1,95 + + 0,7 nM 115% PEG-WT/N95K- NBN106 3 x 10 kDa PEG LO t—1 t—1 + + 0,8 nM 100% NBN106-N95K 3 (, 4) x 10 kDa 1,1,95 (,95) + + 1,6 nM 90% PEG NBN106-N95K 4 x 10 kDa PEG 1,1,95,95 + + 11 nM >80% NBN106-N95K 2 x 20 kDa 1,1 + 0, 6 nM 80% 113 ΕΡ1594436Β1
Forma de NBN Aminoácido s PEGuilados Amino ácido Glico- silado Exposição em Ratos após Administração s.c. KIRA: -ED50 KIRA: ~eficácia máxima vs WT PEG-NBN 2 x 20 kDa 1, 95 ++ Inativa Inativa PEG ramificado NBN106-N95K 2 x 20 kDa 1,1 95, 95 ++ 1 nM 105% PEG-NBN104 (CHO)
Nota: nd significa não detectável, + indica exposição baixa- moderada, ++ indica exposição alta
Nota: todas são NBN113, salvo indicação em contrário
Nota: todas são derivados de E. coli , a não ser se indique CHO. ID de SEQ N° Sequência 1 Polipeptídeo de neublastina madura de consenso 2 Humano adulto NBN113 3 Rato adulto NBN113 4 Ratazana adulta NBN113 5 PreproNBN - 220 aa 6 NBN140 madura 7 NBN116 madura 8 NBN112 truncada 9 NBN111 truncada 10 NBN110 truncada 11 NBN109 truncada 12 NBN108 truncada 13 NBN107 truncada 14 NBN106 truncada 15 NBN105 truncada 114 ΕΡ1594436Β1 ID de SEQ N° Sequência 16 NBN104 truncada 17 NBN103 truncada 18 NBN102 truncada 19 NBN101 truncada 20 NBN100 truncada 21 NBN99 truncada 22 Polipeptídeo DYKDDDDK - 8 aa 23 NBN113-N95K 24 NBN106-N95K 25 ORF tipo selvagem de ratazana - 675 nt 26 Polipeptídeo de peproNBN tipo selvagem de ratazana 27 Iniciador de KD2-310 28 Iniciador de KD2-311 29 Iniciador de KD3-254 30 Iniciador de KD2-255 31 Iniciador de KD3-258 32 Iniciador de KD3-259 33 Iniciador de KD3-256 34 Iniciador de KD3-257 35 Etiqueta de His NBN ORF - 414 nt 36 Etiqueta de His NBN - 135 aa
Outras Modalidades
Embora modalidades apenas para limitar o seguem. tenham sido descritas aqui detalhadamente específicas, o objectivo era o de exemplificar fins ilustrativos, e não tem por objectivo âmbito das reivindicações em anexo, as quais
Lisboa, 22 de Novembro de 2010 115

Claims (4)

  1. ΕΡ1594436Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Polipeptídeo Neublastina que é pelo menos 80% idêntico aos aminoácidos 8-113 de SEQ id NO: 1 e que contem uma substituição de uma ou mais da arginina na posição 48, da arginina na posição 49, ou da arginina na posição 51 com um resíduo de ácido glutâmico.
  2. 2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, no qual o resíduo de arginina na posição 48 é substituído por ácido glutâmico.
  3. 3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, no qual o resíduo de arginina na posição 49 é substituído por ácido glutâmico.
  4. 4. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, no qual o resíduo de arginina na posição 51 é substituído por ácido glutâmico. Lisboa, 22 de Novembro de 2010 1
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