EA009771B1 - Полипептид нейбластина, способы его получения и применения - Google Patents
Полипептид нейбластина, способы его получения и применения Download PDFInfo
- Publication number
- EA009771B1 EA009771B1 EA200300852A EA200300852A EA009771B1 EA 009771 B1 EA009771 B1 EA 009771B1 EA 200300852 A EA200300852 A EA 200300852A EA 200300852 A EA200300852 A EA 200300852A EA 009771 B1 EA009771 B1 EA 009771B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- polypeptide
- neublastin
- amino acid
- νβν
- variant
- Prior art date
Links
- 102100026376 Artemin Human genes 0.000 title claims abstract description 228
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 96
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 82
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 79
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 61
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 44
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 82
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 75
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 71
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 60
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 53
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 49
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 38
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 27
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 27
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 26
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 24
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 22
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 21
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 13
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 13
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 13
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 12
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 claims description 12
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 11
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 11
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 7
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 claims description 7
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 6
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 claims description 6
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 6
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 5
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 208000004296 neuralgia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000021722 neuropathic pain Diseases 0.000 claims description 3
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims 2
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 claims 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 2
- 101000785776 Homo sapiens Artemin Proteins 0.000 description 79
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 47
- 239000000306 component Substances 0.000 description 40
- 239000000047 product Substances 0.000 description 38
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 32
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 30
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 19
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 18
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 15
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 15
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 14
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 14
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 12
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 12
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 12
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 10
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 10
- 101100324497 Rattus norvegicus Artn gene Proteins 0.000 description 10
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 8
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 8
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 8
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 8
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 8
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 6
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 6
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 6
- -1 Ό-methionine Chemical compound 0.000 description 6
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 5
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 5
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 5
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 5
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical group SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 108010053229 Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 4
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100324496 Mus musculus Artn gene Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 4
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 4
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical class NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 4
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 4
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Chemical group SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) propanoate Chemical compound CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 102220624923 2-(3-amino-3-carboxypropyl)histidine synthase subunit 1_E8A_mutation Human genes 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical group C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 3
- 102000050671 human ARTN Human genes 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 3
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 3
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 3
- 208000027232 peripheral nervous system disease Diseases 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 3
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 3
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QXZGLTYKKZKGLN-UHFFFAOYSA-N 4-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O QXZGLTYKKZKGLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 2
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 2
- 102100034240 ER membrane protein complex subunit 8 Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000925848 Homo sapiens ER membrane protein complex subunit 8 Proteins 0.000 description 2
- 208000004454 Hyperalgesia Diseases 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102220469221 S-adenosyl-L-methionine-dependent tRNA 4-demethylwyosine synthase TYW1B_E18A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 2
- LFKYBJLFJOOKAE-UHFFFAOYSA-N imidazol-2-ylidenemethanone Chemical compound O=C=C1N=CC=N1 LFKYBJLFJOOKAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 201000005518 mononeuropathy Diseases 0.000 description 2
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 2
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 2
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 230000008736 traumatic injury Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- DYMYLBQTHCJHOQ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) butanoate Chemical compound CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O DYMYLBQTHCJHOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JPNBVWIRDQVGAC-UHFFFAOYSA-N (2-nitrophenyl) hydrogen carbonate Chemical class OC(=O)OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O JPNBVWIRDQVGAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTBWSRPRAGXJJV-UHFFFAOYSA-N 2h-benzotriazole;carbonic acid Chemical class OC(O)=O.C1=CC=C2NN=NC2=C1 BTBWSRPRAGXJJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102100024321 Alkaline phosphatase, placental type Human genes 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 101100170365 Arabidopsis thaliana At5g60805 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100022545 Bone morphogenetic protein 8B Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 208000032131 Diabetic Neuropathies Diseases 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 101000899368 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 8B Proteins 0.000 description 1
- 101000891649 Homo sapiens Transcription elongation factor A protein-like 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035154 Hyperesthesia Diseases 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 1
- QUOGESRFPZDMMT-UHFFFAOYSA-N L-Homoarginine Natural products OC(=O)C(N)CCCCNC(N)=N QUOGESRFPZDMMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QUOGESRFPZDMMT-YFKPBYRVSA-N L-homoarginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCCNC(N)=N QUOGESRFPZDMMT-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000007339 Nerve Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010032605 Nerve Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 102100021584 Neurturin Human genes 0.000 description 1
- 108010015406 Neurturin Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 208000027089 Parkinsonian disease Diseases 0.000 description 1
- 206010034010 Parkinsonism Diseases 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010036105 Polyneuropathy Diseases 0.000 description 1
- 208000037062 Polyps Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000930457 Rattus norvegicus Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101000987001 Rattus norvegicus Tumor protein 63 Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010062237 Renal impairment Diseases 0.000 description 1
- 208000007014 Retinitis pigmentosa Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 102100040250 Transcription elongation factor A protein-like 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 101100187345 Xenopus laevis noto gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 206010053552 allodynia Diseases 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 150000001484 arginines Chemical group 0.000 description 1
- 150000001510 aspartic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000002567 autonomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 238000010504 bond cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 1
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003986 cell retinal photoreceptor Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 208000025434 cerebellar degeneration Diseases 0.000 description 1
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 229920000547 conjugated polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 208000021731 hypoalgesia Diseases 0.000 description 1
- 230000036032 hypoalgesia Effects 0.000 description 1
- 208000034783 hypoesthesia Diseases 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 239000003350 kerosene Substances 0.000 description 1
- 230000005977 kidney dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 101150002475 mae1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000001071 malnutrition Effects 0.000 description 1
- 235000000824 malnutrition Nutrition 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 210000001767 medulla oblongata Anatomy 0.000 description 1
- 206010027175 memory impairment Diseases 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003040 nociceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 208000015380 nutritional deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 210000005034 parasympathetic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 108010031345 placental alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 230000007824 polyneuropathy Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 229920013730 reactive polymer Polymers 0.000 description 1
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 1
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 1
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 210000000273 spinal nerve root Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000002889 sympathetic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 210000000427 trigeminal ganglion Anatomy 0.000 description 1
- 210000003901 trigeminal nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000001170 unmyelinated nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 210000000752 vestibulocochlear nerve Anatomy 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/4756—Neuregulins, i.e. p185erbB2 ligands, glial growth factor, heregulin, ARIA, neu differentiation factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
- A61P29/02—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID] without antiinflammatory effect
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Zoology (AREA)
- Psychology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к новым формам нейбластина, которые проявляют повышенные фармакокинетические свойства и биодоступность in vivo. Указанные новые формы включают вариантные полипептиды нейбластина, конъюгированные с полимерными молекулами. Также изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим указанные полипептиды, к векторам, содержащим нуклеиновые кислоты, и к клеткам-хозяевам, содержащим указанные векторы. Также изобретение относится к способу получения указанных полипептидов и гибридных белков, а также к их применению для получения лекарственного препарата для лечения или профилактики заболевания или расстройства нервной системы.
Description
Область изобретения
Изобретение, в общем, относится к полипептидам и более конкретно к модифицированным нейротрофическим полипептидам и способам применения указанных модифицированных полипептидов.
Предпосылки изобретения
Нейротрофические факторы являются белками природного происхождения, которые повышают жизнеспособность, поддерживают фенотипическую дифференцировку, предотвращают дегенерацию и повышают активность нервных клеток и тканей. Нейротрофические факторы выделяют из нервной ткани и из ненервной ткани, которая иннервирована нервной системой, и подразделяют на функционально и структурно родственные группы, также называемые семействами, суперсемействами или подсемействами. Среди суперсемейств нейротрофических факторов имеются суперсемейства фактора роста фибробластов, нейротрофина и трансформирующего фактора роста β (ТСР-β). Отдельные виды нейротрофических факторов различаются по своей физической структуре, их взаимодействию с родственными им рецепторами и их воздействиям на различные типы нервных клеток. К суперсемейству ТСЕ-β относят лиганды, подобные нейротрофическому фактору, полученному из линии глиальных клеток, (ΌΩΝΕ). которые включают ΟΩΝΕ. персефин (Р8Р) и нейртурин (ΝΤΝ).
Лиганды подсемейства ΟΩΝΕ обладают общей способностью индуцировать передачу сигнала посредством тирозинкиназы рецептора КЕТ. Три указанных лиганда подсемейства СИИР отличаются по их относительным аффиностям в отношении семейства нейротрофических рецепторов, рецепторов СРКа.
Недавно описанным нейротрофическим фактором является «нейбластин» или «ΝΒΝ». Нейбластин относят к подсемейству ΟΩΝΕ. поскольку он имеет общие области гомологии с другими ΟΩΝΕлигандами и по его способности связываться и активировать КЕТ. В отличие от других СЭИЕ-лигандов нейбластин высоко избирателен в отношении комплекса СРКаЗ-рецептор КЕТ. Кроме того, ΝΒΝ содержит уникальные подобласти в своей аминокислотной последовательности.
К сожалению нейбластин подвергается быстрому клиренсу в организме. Указанный быстрый клиренс может препятствовать использованию нейбластина в терапевтических применениях. Таким образом, существует необходимость в идентификации вариантов нейбластина, которые имеют повышенную биодоступность.
Сущность изобретения
Данное изобретение частично основано на открытии новых форм нейбластина, которые проявляют повышенные фармакокинетические свойства и биодоступность ίη νίνο. Указанные новые формы включают вариантные полипептиды нейбластина, конъюгированные с полимерными молекулами.
В одном аспекте отличительным признаком изобретения является вариантный полипептид нейбластина или мутеин полипептида нейбластина, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую одну или несколько аминокислотных замен в положениях зрелого димера нейбластина, экспонируемых в растворитель. Данные замены вводят в нативный полипептид нейбластина один или несколько сайтов, в которых с полипептидом могут быть связаны такие вещества, как имеющие природное происхождение или синтетические полимеры, для того, чтобы увеличить его растворимость и, следовательно, его биодоступность ίη νίνο. Предпочтительно данные вариантные полипептиды содержат аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную аминокислотам 8-113 8ЕС ΙΌ N0: 1. Вариантный полипептид нейбластина включает одну или несколько аминокислотных замен, при которых в положении 14 в аминокислотной последовательности вариантного полипептида находится аминокислота, отличная от аргинина, в положении 39 аминокислотной последовательности вариантного полипептида находится аминокислота, отличная от аргинина, в положении 68 вариантного полипептида находится аминокислота, отличная от аргинина или в положении 95 вариантного полипептида находится аминокислота, отличная от аспарагина, в том случае, когда положения аминокислот пронумерованы в соответствии с полипептидной последовательностью 8ЕС ΙΌ N0: 1.
В используемом в данном описании смысле «нейбластин дикого типа» или «\\1-ΝΒΝ» относится к имеющей природное происхождение или нативной последовательности полипептида нейбластина, такого как нейбластин крысы, мыши или человека (см., например, 8ЕС ΙΌ N0: 2, 3 или 4). Конкретные вариантные полипептиды нейбластина названы в данном описании «ΝΒΝ-ΧιΝιΧ2» или «ΧιΝιΧ2-ΝΒΝ», где Χ1 относится к аминокислоте полипептида нейбластина дикого типа, Ν1 относится к номеру положения аминокислоты Χ1 в последовательности, которое нумеруется в соответствии с 8ЕС ΙΌ Ν0: 1. Х2 относится к аминокислоте, заменяющей аминокислоту дикого типа в указанном пронумерованном положении в последовательности. Таким образом, например, ΝΒΝ-Ν95Κ означает вариантные полипептиды нейбластина, в которых аспарагин в положении 95 заменен лизином.
Вариантный полипептид нейбластина может быть получен в виде мультимерного полипептида. Например, вариантный полипептид нейбластина может быть получен в виде димера, который содержит по меньшей мере один вариантный полипептид нейбластина. В некоторых случаях димер является гомодимером вариантного полипептида нейбластина. В других случаях димер является гетеродимером, который содержит один вариантный полипептид нейбластина и один полипептид нейбластина дикого типа. Другие димеры могут содержать две разные вариантные формы полипептида нейбластина.
- 1 009771
В некоторых вариантах вариантный полипептид нейбластина кроме аминокислот 8-113 содержит аминокислоты 1-7 8ЕС ΙΌ N0: 1.
В предпочтительных вариантах вариантный полипептид нейбластина при димеризации связывает СЕКа3. В дополнительных предпочтительных вариантах вариантный полипептид нейбластина при димеризации стимулирует фосфорилирование тирозина полипептида КЕТ, либо сам по себе, либо в случае связывания с СЕКа3.
В других предпочтительных вариантах вариантный полипептид нейбластина при димеризации повышает жизнеспособность нейрона, например, повышает жизнеспособность чувствительного нейрона.
В других предпочтительных вариантах вариантный полипептид нейбластина при димеризации нормализует патологические изменения нейрона, такого как чувствительный нейрон.
В следующих предпочтительных вариантах вариантный полипептид нейбластина при димеризации повышает жизнеспособность нейрона, например автономного нейрона или допаминэргического нейрона.
В некоторых вариантах вариантный полипептид содержит две, три или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из аминокислоты, отличной от аргинина, в положении 14 аминокислотной последовательности вариантного полипептида, аминокислоты, отличной от аргинина, в положении 39 аминокислотной последовательности вариантного полипептида, аминокислоты, отличной от аргинина, в положении 68 вариантного полипептида и аминокислоты, отличной от аспарагина, в положении 95 вариантного полипептида.
В предпочтительных вариантах аминокислотой в одном или нескольких положениях 14, 39, 68 и 95 является лизин.
Предпочтительно аминокислоты 8-94 и 96-113 вариантного полипептида нейбластина по меньшей мере на 90% идентичны аминокислотам 8-94 и 96-113 8ЕС ΙΌ N0: 1. Более предпочтительно последовательности аминокислот идентичны по меньшей мере на 95%. Наиболее предпочтительно аминокислотная последовательность вариантного полипептида нейбластина содержит аминокислотную последовательность полипептида нейбластина крысы, человека или мыши природного происхождения в положениях аминокислот 8-94 и 96-113 вариантного полипептида нейбластина. Например, аминокислоты 8-94 и 96-113 вариантного полипептида нейбластина могут содержать аминокислотную последовательность аминокислот 8-94 и 96-113 8ЕС ΙΌ N0: 2, 8ЕС ΙΌ ν0: 3 или 8ЕС ΙΌ N0: 4.
Также изобретение относится к слитому белку или полипептиду, который включает в себя вариантный полипептид нейбластина или полипептид нейбластина дикого типа, или белку, который является димером двух слитых белков нейбластина. Слитые белки нейбластина также обладают усиленными фармакокинетическими свойствами и повышенной биодоступностью ίη νίνο.
В другом аспекте изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей вариантный полипептид нейбластина. Нуклеиновая кислота, кодирующая вариантный полипептид нейбластина, предпочтительно приготовлена в векторе, например в экспрессирующем векторе. Нуклеиновая кислота вариантного нейбластина или содержащий ее вектор могут быть предоставлены в клетке. Клетка может представлять собой, например, клетку млекопитающего, клетку гриба, дрожжевую клетку, клетку насекомого или бактериальную клетку. Предпочтительной клеткой млекопитающего является клетка яичника китайского хомячка («клетка СНО»).
Изобретение также относится к способу получения вариантного полипептида нейбластина посредством культивирования клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую вариантный нейбластин, в условиях, обеспечивающих экспрессию вариантного полипептида нейбластина. При желании вариантный полипептид нейбластина затем можно извлечь. Изобретение, кроме того, включает вариантный полипептид нейбластина, продуцируемый клеткой. Сходные нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева и способы получения полипептидов представлены в данном описании для слитых белков (таких как слитые белки нейбластин-сывороточный альбумин) согласно данному изобретению.
Изобретение также относится к композиции, которая содержит полипептид нейбластина или вариантный полипептид нейбластина, связанный с полимером неприродного происхождения. Вариантный полипептид нейбластина в композиции предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную аминокислотам 8-113 8ЕС ΙΌ N0: 1, при условии, что вариантный полипептид нейбластина содержит одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из аминокислоты, отличной от аргинина, в положении 14 аминокислотной последовательности вариантного полипептида, аминокислоты, отличной от аргинина, в положении 39 аминокислотной последовательности вариантного полипептида, аминокислоты, отличной от аргинина, в положении 68 вариантного полипептида и аминокислоты, отличной от аспарагина, в положении 95 вариантного полипептида, при этом положения аминокислот пронумерованы в соответствии с полипептидной последовательностью 8ЕС ΙΌ N0: 1.
В предпочтительных вариантах полимер содержит компонент, представленный полиалкиленгликолем, например полиэтиленгликолевый компонент (ПЭГ).
В предпочтительных вариантах полиалкиленгликолевый компонент связан с аминогруппой полипептида нейбластина или лизином в вариантном полипептиде нейбластина.
- 2 009771
Связывание может осуществляться посредством активированного сложного эфира Νгидроксилсукцинимида (ΝΗ8). Активированный сложный эфир может представлять собой, например, сукцинимидилсукцинат (88-ПЭГ), сукцинимидилбутират (8РВ-ПЭГ) или сукцинимидилпропионат (8ΡΆПЭГ) ПЭГ.
Полиалкиленгликолевый компонент может, например, представлять собой карбоксиметил-ΝΗδ, норлейцин-ΝΗδ, 8С-ПЭГ, трезилат, альдегид, эпоксид, карбонилимидазол или карбонат ΡΝΡ.
В некоторых вариантах полиалкиленгликолевый компонент связан с группой цистеина полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина. Например, связывание может осуществляться с помощью малеимидной группы, винилсульфоновой группы, галогенацетатной группы и тиольной группы.
В некоторых вариантах полипептид нейбластина или вариантный полипептид нейбластина в композиции гликозилирован. В том случае, когда полипептид нейбластина или вариантный полипептид гликозилирован, полимер может быть связан с углеводным компонентом гликозилированного полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина. Например, полимер может быть связан с гликозилированным полипептидом нейбластина или вариантным полипептидом нейбластина после окисления группы гидразола или аминогруппы гликозилированного полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина, или окисления реакционноспособной группы полимера.
В различных вариантах полипептид нейбластина или вариантный полипептид нейбластина содержит один, два, три или четыре ПЭГ-компонента.
В предпочтительных вариантах полипептид нейбластина, вариантный полипептид нейбластина или конъюгат с полимером имеет более продолжительное время полужизни в сыворотке по сравнению со временем полужизни полипептида или вариантного полипептида в отсутствии полимера.
В предпочтительных вариантах полипептид нейбластина, вариантный полипептид нейбластина или конъюгат с полимером в комплексе обладает физиологической активностью, выбранной из группы, состоящей из связывания СЕВаЗ, активации ВЕТ, нормализации патологических изменений нейрона или повышения жизнеспособности нейрона.
Под «нормализацией патологических изменений нейрона» имеют в виду, что данный конъюгат индуцирует изменение одного или нескольких из следующих параметров клетки: уровня экспрессии структурного белка, рецептора нейротрофического фактора, ионного канала или нейромедиатора, или индуцирует изменение морфологии клетки, в каждом случае так, что в значительной степени восстанавливает такой параметр до его уровня в нейроне такого же или сходного фенотипа, который не затронут заболеванием, дегенерацией, инсультом или повреждением. Нормализацию патологических изменений нейрона можно контролировать иммуногистохимически или путем оценки изменений уровней секретируемых или выделяемых клеточных продуктов, или с помощью оценки изменений ίη νίνο в проявлении, физиологически присущем функции пораженного нейрона(нов). Например, в случае патологических изменений, связанных с синдромом невропатической боли, контролируют такие проявления боли, как гиперальгезию, гипоальгезию или аллодинию.
Под «повышенной жизнеспособностью нейрона» имеют в виду продленное выживание пораженного нейрона свыше периода жизнеспособности, наблюдаемого в соответствующем нейроне, пораженном тем же типом заболевания, расстройства, инсульта или повреждения, но не обработанном конъюгатом нейбластина или слитым белком согласно изобретению.
В некоторых вариантах полимер связан с полипептидом в сайте нейбластина, который является Νконцом. В некоторых вариантах полимер связан с полипептидом в сайте в неконцевой аминокислоте полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина.
В предпочтительных вариантах полимер связан с аминокислотой полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина, экспонируемой в растворитель.
В предпочтительных вариантах полимер связан с полипептидом нейбластина или вариантным полипептидом нейбластина у остатка, выбранного из группы, состоящей из аминоконцевой аминокислоты вариантного полипептида, положения 14 в аминокислотной последовательности полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина, положения 39 в аминокислотной последовательности полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина, положения 68 в аминокислотной последовательности полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина и положения 95 в аминокислотной последовательности полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей физиологически приемлемый наполнитель, содержащий или имеющий диспергированный в нем полипептид нейбластина, вариантный полипептид нейбластина или конъюгат согласно данному изобретению.
В следующем аспекте изобретение включает стабильный водорастворимый конъюгированный комплекс полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина, содержащий полипептид нейбластина или вариантный полипептид нейбластина, связанный с полиэтиленгликолевым компонентом, в котором полипептид нейбластина или вариантный полипептид нейбластина связан с полиэтиленгликолевым компонентом с помощью лабильной связи. В некоторых вариантах лабильная связь расщеп
- 3 009771 ляется при биохимическом гидролизе, протеолизе или сульфгидрильном расщеплении. В предпочтительных вариантах лабильная связь расщепляется в условиях ίη νίνο.
Изобретение также относится к способу получения модифицированного полипептида нейбластина, который обладает пролонгированной активностью ίη νίίτο или ίη νίνο по сравнению с нейбластином дикого типа, путем приготовления полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина и связывания полипептида или модифицированного вариантного полипептида нейбластина с полимерным компонентом неприродного происхождения с образованием таким образом композиции полипептида нейбластина, связанного с полимером.
В следующем аспекте изобретение относится к способу лечения или профилактики нарушения нервной системы у субъекта (такого как человек) с помощью введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества вариантного полипептида нейбластина, композиции, содержащей полипептид нейбластина или вариантный полипептид нейбластина, связанный с полимером, или комплекса, который включает в себя стабильный водорастворимый конъюгированный комплекс полипептида нейбластина или вариантного полипептида, содержащий полипептид нейбластина или вариантный полипептид нейбластина, связанный с полиэтиленгликолевым компонентом.
Предпочтительно расстройством нервной системы является расстройство периферической нервной системы, такое как периферическая невропатия или синдром невропатической боли. Предпочтительными субъектами для лечения являются люди.
Введение может быть, например, системным или локальным.
Если не оговорено особо, все технические и научные термины, используемые в данном описании, имеют такое же значение, которое обычно подразумевается специалистом в области, к которой относится данное изобретение. Хотя на практике или при тестировании данного изобретения можно использовать способы и вещества, подобные или эквивалентные приведенным в данном описании, подходящие способы и вещества описаны ниже. Все публикации, заявки на выдачу патентов, патенты и другие источники информации, упоминаемые в данном описании, включены в виде ссылки в полном объеме. В случае конфликтной ситуации данное описание, включая определения, будет проверено. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не рассматриваются как ограничивающие.
Другие отличительные признаки и преимущества изобретения станут понятными из следующего подробного описания и формулы изобретения.
Подробное описание изобретения
Изобретение относится к новым вариантным полипептидам нейбластина, которые могут быть модифицированы для того, чтобы усилить их фармакокинетические свойства и повысить биодоступность. Предпочтительные вариантные полипептиды нейбластина имеют измененные аминокислотные последовательности, которые облегчают связывание с полимерным агентом, таким как полимер полиалкиленгликоля.
Вариантные полипептиды нейбластина
Изобретение относится к полипептидам нейбластина, которые имеют вариантные аминокислотные последовательности по сравнению с последовательностью полипептида нейбластина дикого типа. Аминокислотные последовательности полипептидов нейбластина человека и мыши описаны в \УО 00/01815. Примеры вариантных полипептидов нейбластина согласно изобретению представлены в табл. 1.
Предпочтительно измененные остатки в вариантном полипептиде нейбластина выбраны для обеспечения связывания полимера, такого как полимер полиалкиленгликоля, в положении модифицированной аминокислоты. Предпочтительными сайтами модификации полипептида нейбластина являются сайты в доступных для растворителя областях полипептида нейбластина. Такие сайты можно выбрать на основе просмотра кристаллической структуры родственного нейротрофического фактора, ΟΌΝΕ. кристаллическая структура которого описана в Ναι. 81шсЕ ΒίοΙ. 4: 435-38, 1997. Сайты также можно выбрать на основе структурно-функциональной информации, полученной для химерных белков персефин/нейбластин. Указанные химеры описаны в ί. ΒίοΙ. Сйеш. 275: 3412-20, 2000. Примерный список доступных для растворителя или экспонированных на поверхности аминокислот нейбластина, идентифицированных с помощью указанной методики, указан в табл. 2.
Изобретение включает вариантный полипептид нейбластина, который содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична аминокислотам 8-113 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1, которая показана в табл. 1. В некоторых вариантах один или несколько аргининов в положении 14, положении 39, положении 68 или аспарагин в положении 95 аминокислотной последовательности полипептида заменяют аминокислотой, отличной от аргинина или аспарагина. Предпочтительно аминокислоту дикого типа заменяют лизином или цистеином.
- 4 009771
АбСРСЗКАКААСАКбСКЬКЗаЬУРУКАЬСЬСНРЗОЕЬУКЕ человек
АОТКЗЗКАКТТОАРССКЬРЗОЬУРУЗАЬСЬСНЗбОЕЫКЕ мышь
А6ТВ88ВАРАТ0АЕЮСРЬК8С11_УРУЗА1_С1.(ЗН880Е1-1РЕ крыса консенсус человек
РЕС8С8СКРАК8аН01_81_А8Ы_САСА1_Р8РРС8РР18аРС мышь
ВЕС8С8СРРАК8РН0Ь81_А8Ы(ЗАСА1Р8РРС8КР18аРС крыса
СКРТКУЕАУЗЕМОУЫЗВЛ/КТУОНЬЗАТАСССЬС
0ΚΡΤΚΥΕΑνδΕΜ0νΝ8ΤννΚΤν0ΗΙ-8ΑΤΑ0(301.Θ сгр1гуеаУ5Ттс17П81У¥г17с1-|5а1асдс1д
Консенсусная последовательность
АЬа
СЬу
Хаа! Хаа2 Хаа3 5ег Агд А1а Агд Хаа4
Хаа5
Агд
Ьеи
Азр
СЬи
Таблица 1 консенсус человек (8ЕО Ю N0 : 2) мышь (8ЕО Ю N0 : 3) крыса (8ЕОЮ N0 : 4) консенсус (8Е0 Ю N0 :1)
Хаав АЬа Агд СЬу Суз
Ьеи Хаа9 Агд РЬе Агд РЬе Суз 5ег СЬу 8ег Суз Агд Агд АЬа Агд
Зег
Хааю НЬз Азр Ьеи Зег Ьеи АЬа Зег Ьеи Ьеи СЬу АЬа СЬу АЬа Ьеи Агд
Хаац Рго Рго СЬу Зег Агд Рго Хаац Зег СЬп Рго Суз Суз Агд Рго ТЬг Агд
Туг СЬи АЬа УаЬ Зег РЬе МеЬ Азр УаЬ Азп Зег ТЬг Тгр Агд ТЬг УаЬ Азр
Хаац Ьеи Зег АЬа ТЬг АЬа Суз СЬу Суз Ьеи СЬу где
Хаах является | С1у | или | ТЬг |
является | Рго | или | Агд |
Хаа3 является | С1У | или | 8ег |
Хаа4 является | АЬа | или | ТЬг |
Хаа$ является | АЬа | или | ТЬг |
Хаа6 является | С1у | или | Авр |
Хаа7 является | Агд | или | 5ег |
Хаав является | Агд | или | 5ег |
Хаа9 является | УаЬ | или | Не |
Хаа10 является | Рго | или | СЬп |
ХааГ1 является | Рго | или | Зег |
Хаа1г является | УаЬ | или | ЬЬе |
Хав] з является | Агд | или | ΗΪ3 |
В табл. 2 представлен список остатков и их номера в нейбластине человека, которые предположительно являются экспонируемыми на поверхности. Экспонируемые на поверхности остатки определяли с помощью оценки структуры димера ΟΏΝΤ крысы, образованного цепями А и В (РОВ код 1АСКЭ), и определения того, присутствует ли остаток на поверхности структуры. Затем данную структуру сравнивали с выравниванием последовательностей ΟΏΝΤ и нейбластина в Ва1оР е! а1., №игоп, νοί. 21, р. 1291, 1998, чтобы определить подходящие остатки в нейбластине. Схема нумерации представляет собой схему, показанную в табл. 1.
- 5 009771
Таблица 2
8 А1а н/а | 16 Суз- | |
1 А1а н/а | 9 Агв н/а | 17Агв + |
2 О1у н/а | 10 А1ан/а | 18Ьеи + |
3 С1у н/а | 11 А1а н/а | 19 Аг® + |
4 Рго н/а | 12 О1у «· | 208ег + |
5 О1у н/а | 13А1а- | 21 О1п + |
68ег н/а | 14 Агв + | 22Ьеи + |
7 Αίβ н/а | 15 О1у + | 23Уа1- |
48 Агв + | 106 А1а- | |
49 Ατβ + | 107 ТЬг + | |
50 А1а- | 108 А1а + | |
51 Агв + | 109 Суз- | |
52 8ег + | 110 О1у + | |
53Рго + | 111 Суа- | |
54ΗΪ8- | 112Ьеи + | |
55 Аар - | 113 СМу | |
56 Ьеи + | н/а |
24Рго + | 32ΗΪΪ + | 40 РЬе- |
25Уа1- | ЗЗАГВ + | 41 Агв + |
26 Агв + | 34 8ег- | 42 РЬе + |
27 А1а + | 35 Аар + | 43 Суа- |
28 Ьеи - | 36О1и + | 44 8сг + |
29 О1у + | 37Ьеи + | 45 О1у + |
30 Ьеи + | 38Уа1- | 46 8ег + |
31 О1у + | 39 Агв + | 47 Суз- |
5ег-
Ьеи -
А1а +
8ег +
Ьеи -
Ьеи +
С1у +
А1а +
О1у + 66А1а +
Ьеи-
Αεβ н/а
Рго н/а
Рго н/а
Рго н/а
О1у +
8ег +
Агв н/а
Рго н/а
Уа1 -
8ег-
О1п +
Рго -
Суз -
Суз-
Агв -
Рго-
ΊΠ1Γ +
Агв +
Туг +
О1и +
А1а +
Уа) +
8ег +
РЬе -
МсГ +
Аар + 94Уа1 +
Аап +
8ег + 97Ό1Γ +
Тгр +
Αη> +
100 ТЬг +
101 Уа1 -
102 Аар +
103 Агв +
104 Ьеи-
105 8ег- н/а указывает, что остатки не присутствуют в структуре ΟΌΝΕ. Это происходит либо
- 6 009771 вследствие дизайна конструкции, гибких областей, либо вставок в нейбластине по сравнению с ΟΌΝΤ (остатки 68-71).
- указывает, что остатки скрыты и не расположены на поверхности или являются остатками цистеина, вовлеченными в дисульфидные связи. Так как данный белок является цистеиновым узлом, огромное множество остатков расположено на поверхности.
+ указывает, что данный остаток в структуре ΟΌΝΤ экспонирован на поверхности, и таким образом предположительно экспонирован на поверхности нейбластина, хотя петля, содержащая остатки 66-75, наблюдается только в одном из мономеров ΟΌΝΤ (предположительно гибком). Указанная петля также содержит вставку из 4 остатков в нейбластине по сравнению с ΟΌΝΤ.
В используемом в данном описании смысле термины «идентичность», или «гомологичный», или «гомология» используются взаимозаменяемо и относятся к сходству последовательностей между двумя полипептидами, молекулами или между двумя нуклеиновыми кислотами. В том случае, когда положение в обеих сравниваемых последовательностях занято одним и тем же основанием или мономерной аминокислотной субъединицей (например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином или положение в каждом из двух полипептидов занято лизином), то соответствующие молекулы являются гомологичными по данному положению. Процент гомологии между двумя последовательностями является функцией количества совпадающих или гомологичных положений, имеющихся в двух последовательностях, разделенного на количество сравниваемых положений х 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях совпадают или являются гомологичными, то две последовательности гомологичны на 60%. В качестве примера последовательности ДНК СТСАСТ и САССТТ обладают 50% гомологией (3 из общего количества 6 положений совпадают). Обычно сравнение выполняют в том случае, когда две последовательности выравнивают, чтобы получить максимальную гомологию. Такое выравнивание можно осуществить, используя, например, способ №еб1етап с1 а1., 1. Μοί ΒίοΙ. 48: 443-453 (1970), для удобства выполняемый с помощью компьютерных программ, таких как программа Айдп (ΟΝΑχΙατ. 1пс.). «Сходными» последовательностями являются последовательности, которые при выравнивании имеют идентичные или сходные аминокислотные остатки, где сходные остатки являются консервативными заменами или «допустимыми точечными мутациями» соответствующих аминокислотных остатков в выровненной эталонной последовательности. В этом отношении «консервативная замена» остатка в эталонной последовательности является заменой остатком, который физически или функционально сходен с соответствующим эталонным остатком, например, который имеет сходный размер, форму, электрический заряд, химические свойства, включая способность образовывать ковалентные или водородные связи, или тому подобное. Таким образом, «вариантной последовательностью с консервативными заменами» является последовательность, которая отличается от эталонной последовательности или последовательности дикого типа тем, что в ней присутствует одна или несколько консервативных замен или допустимых точечных мутаций.
В предпочтительных вариантах полипептид согласно изобретению на 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичен аминокислотам 8-113 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1. В некоторых вариантах аминокислотная последовательность вариантного полипептида нейбластина содержит последовательность аминокислот полипептида нейбластина крысы, человека или мыши природного происхождения в положениях аминокислот 1-94 и 96-113 вариантного полипептида нейбластина, например, полипептид имеет аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2, 3 или 4 в указанных положениях.
Вариантный полипептид нейбластина, отличающийся по последовательности от полипептидов, описанных в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1-4, может содержать одну или несколько консервативных аминокислотных замен. Альтернативно или дополнительно вариантный полипептид нейбластина может отличаться одной или несколькими неконсервативными аминокислотными заменами, или делециями, или инсерциями. Предпочтительно замены, инсерции или делеции не нарушают биологическую активность выделенного белка.
Консервативные замены обычно включают замену одной кислоты другой со сходными характеристиками, такие как замены в пределах следующих групп: валин, аланин и глицин; лейцин, валин и изолейцин; аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; аспарагин и глутамин; серин, цистеин и треонин; лизин и аргинин; и фенилаланин и тирозин. Неполярные гидрофобные аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Любую замену одного представителя указанной выше групп полярных, основных или кислых аминокислот другим представителем той же группы можно считать консервативной заменой.
Другие замены легко могут идентифицировать специалисты в данной области. Например, в случае аминокислоты аланина замена может быть выбрана из любой замены Ό-аланином, глицином, бетааланином, Ь-цистеином и Ό-цистеином. В случае лизина заменой может быть любая из аминокислот: Όлизин, аргинин, Ό-аргинин, гомо-аргинин, метионин, Ό-метионин, орнитин или Ό-орнитин. Как правило, заменами в функционально важных областях, которые предположительно могут индуцировать измене
- 7 009771 ния свойств изолированных полипептидов, являются замены, при которых: (ί) полярный остаток, например, серин или треонин, заменяет гидрофобный остаток, например, лейцин, изолейцин, фенилаланин или аланин (или заменяется ими); (ίί) остаток цистеина заменяет любой другой остаток (или заменяется им); (ίίί) остаток, имеющий электроположительную боковую цепь, например, лизин, аргинин или гистидин, заменяет остаток, имеющий электроотрицательную боковую цепь, например, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту (или заменяется ими); или (ίν) остаток, имеющий большую боковую цепь, например, фенилаланин, заменяет остаток, не имеющий такой боковой цепи, например, глицин (или заменяется им). Вероятность того, что одна из вышеуказанных неконсервативных замен может изменить функциональные свойства белка, также коррелирует с положением замены по отношению к функционально важным областям белка, следовательно, некоторые неконсервативные замены могут оказывать небольшое или не оказывать влияния на биологические свойства.
Изобретение также относится к мультимерным полипептидам, которые содержат вариантный полипептид нейбластина. Мультимерные полипептиды предпочтительно готовят в виде очищенных мультимерных полипептидов. Примеры мультимерных комплексов включают, например, димерные комплексы. Мультимерный комплекс можно получить в виде гетеромерного или гомомерного комплекса. Таким образом, мультимерный комплекс может быть гетеродимерным комплексом, включающим один вариантный полипептид нейбластина и один невариантный нейбластин, или гетеродимерным комплексом, включающим два или более вариантных полипептидов нейбластина.
В некоторых вариантах вариантный полипептид нейбластина связывает СЕКа3. Предпочтительно связывание вариантного полипептида нейбластина стимулирует фосфорилирование полипептида КЕТ. Чтобы определить, связывает ли полипептид СЕКа3, можно провести анализ, как описано в \УО 00/01815. Например, присутствие нейбластина в среде в надосадках линии клеток СНО можно описать с использованием модифицированной формы анализа тройного комплекса, описанного 8ашсо1а е! а1. (Ргос. №111. Асаб. 8сЕ И8А, 1997, 94: 6238). В данном анализе можно оценить ΟΌΝΕ-подобные молекулы в отношении их способности опосредовать связывание между внеклеточным доменом КЕТ и различными корецепторами, СЕКа1, СЕКа2 и СЕКаЗ. Растворимые формы КЕТ и корецепторы создают в виде слитых белков. Описан слитый белок между внеклеточным доменом КЕТ крысы и плацентарной щелочной фосфатазой (КЕТ-АР) и слитый белок между внеклеточным доменом СЕКа-1 крысы (описан в опубликованной заявке XVО 9744356; 27 ноября 1997, включенной в данное описание в виде ссылки) и Есдоменом 1дС1 человека (гСЕК (а1-1д) (8ашсо1а е! а1., Ргос. №И. Асаб. 8ст И8А 1997, 94: 6238)).
В некоторых вариантах вариантный полипептид нейбластина повышает жизнеспособность нейрона или нормализует патологические изменения нейрона или и то, и другое. Анализы для определения того, повышает ли полипептид жизнеспособность нейрона или нормализует патологические изменения нейрона, описаны, например, в νθ 00/01815. Предпочтительно нейрон является чувствительным нейроном, автономным нейроном или допаминэргическим нейроном.
Синтез и выделение вариантных полипептидов нейбластина
Вариантные полипептиды нейбластина можно выделить, используя способы, известные в данной области. Полипептиды нейбластина природного происхождения можно выделить из клеток или тканевых источников согласно подходящей схеме очистки с использованием стандартных способов очистки белка. Альтернативно вариантные полипептиды нейбластина можно синтезировать химически, используя стандартные способы синтеза пептидов. Синтез коротких аминокислотных последовательностей хорошо разработан в области пептидов. См., например, 81е^аг1. е! а1., 8ойб Рйазе Рерйбе 8уп1йе515 (2б еб., 1984).
В другом варианте вариантные полипептиды нейбластина получают способами на основе рекомбинантной ДНК. Например, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вариантный полипептид нейбластина, можно встроить в вектор, например, экспрессирующий вектор, и нуклеиновую кислоту можно ввести в клетку. Подходящие клетки включают, например, клетки млекопитающих (такие как клетки человека или клетки яичника китайского хомячка), клетки грибов, дрожжевые клетки, клетки насекомых и бактериальные клетки. При экспрессии в рекомбинантной клетке клетку предпочтительно культивируют в условиях, обеспечивающих экспрессию вариантного полипептида нейбластина. Вариантный полипептид нейбластина при желании можно извлечь из клеточной суспензии. Термин «извлечь» означает, что вариантный полипептид удаляют из тех компонентов клетки или культуральной среды, в которых он присутствует до извлечения. Способ извлечения может включать одну или несколько стадий свертывания белка или очистки.
Вариантные полипептиды нейбластина можно сконструировать, используя любой из нескольких способов, известных в данной области. Одним из таких способов является сайт-специфичный мутагенез, при котором изменяют конкретный нуклеотид (или при желании небольшое количество конкретных нуклеотидов) для того, чтобы изменить одну аминокислоту (или при желании небольшое количество предварительно определенных аминокислотных остатков) в кодируемом полипептиде нейбластина. Специалистам в данной области понятно, что сайт-специфичный мутагенез является обычным и широко используемым способом. В действительности многие наборы для сайт-специфичного мутагенеза коммер
- 8 009771 чески доступны. Одним из таких наборов является «набор для трансформирующего сайт-специфичного мутагенеза», продаваемый С1оШсе11 БаЬогаЮпез (Ра1о А1!о, СайГ.).
При осуществлении данного изобретения на практике, если не оговорено особо, будут использованы обычные способы клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК, химии белков и иммунологии, которые известны специалистам в данной области. Такие способы описаны в литературе. См., например, Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2пб ебйюп. (8атЬгоок, Егйзсй апб Машабз, ебз.), Со1б 8ргйщ НагЬог ЬаЬога!огу Ргезз, 1989; ΌΝΑ С1оп1пд, Уо1итез I апб II (Ό.Ν. С1оуег, еб.), 1985; Ойдопис1еойбе 8уп!йез1з, (М.1. Сай, еб.), 1984; патент США № 4683195 (МиШз е! а1.); МШею Ас1б Нуйпб|/айоп (В. Ό. Нашез апб 8. I. Шддшз, ебз.), 1984; ТгапзспрИоп апб Тгапз1айоп (В. Ό. Натез апб 8. I. Шддшз, ебз.), 1984; СиЙиге оГ Ашта1 Се11з (В. I. РгезИпеу, еб). А1ап В. Ызз, Шс., 1987; йптоЬШхеб Се11з апб Еп/утез, ШЕ Ргезз, 1986; А Ргасбса1 Сшбе !о Мо1еси1аг С1ошпд (13. РегЬа1), 1984; Ме1йобз ш ЕпгутоШду, Уо1итез 154 апб 155 (^и е! а1., ебз), Асабетю Ргезз, Νονν Уогк; Сепе ТгапзГег УесЮгз Гог МаттаИап Се11з (I. Н. Мй1ег апб М. Р. Са1оз, ебз.), 1987, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу; йптипосйе1шса1 МеШобз ш Се11 апб Мо1еси1аг Вю1оду (Мауег апб ^а1кег, ебз.). Асабетю Ргезз, Ьопбоп, 1987; НапбЬоок оГ Ехрептеп! Iттипо1оду, Уо1итез НУ (И. М. \Уей апб С. С. В1аскюе11, ебз.), 1986; Машри1а!шд 1йе Моизе ЕтЬгуо, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Ргезз, 1986.
Вариантные слитые белки нейбластина
При необходимости вариантный полипептид нейбластина можно приготовить в виде слитого белка. Слитые полипептидные производные белков согласно изобретению также содержат различные структурные формы первичного белка, которые сохраняют биологическую активность. В используемом в данном описании смысле «слияние» относится к колинеарной ковалентной связи двух или более белков или их фрагментов между их отдельными пептидными остовами, наиболее предпочтительно посредством генетической экспрессии молекулы полинуклеотида, кодирующей данные белки в одной и той же рамке считывания (т.е. «в рамке»). Предпочтительно, чтобы белки или их фрагменты были из разных источников. Таким образом, предпочтительные слитые белки включают вариантный белок нейбластина или фрагмент, ковалентно связанный со вторым компонентом, который не является вариантным нейбластином. Предпочтительно второй компонент получают из полипептида, который существует в виде мономера и достаточен для того, чтобы придать свойства повышенной растворимости и/или биодоступности полипептиду нейбластина.
Например, «слияние вариантный нейбластин/сывороточный альбумин человека» является белком, содержащим вариантный полипептид нейбластина согласно изобретению или его фрагмент, Ν-конец или С-конец которого связан в рамке с полипептидом сывороточного альбумина человека (см. 8уеб е! а1., В1ооб, 1997, 89: 3243 и Уей е! а1., Р.КА.8. И8А 1992, 89: 1904) и патенты США № 5876969 и 5302697. Термин «слитый белок», кроме того, включает в себя вариантный нейбластин, химически связанный посредством моно- или гетерофункциональной молекулы со вторым компонентом, который не является вариантным белком нейбластина и получен бе поуо из очищенного белка, как описано ниже.
Слияния нейбластин-сывороточный альбумин можно сконструировать с использованием способов, известных в данной области. Любой из ряда перекрестно сшивающих агентов, который содержит соответствующую группу, реагирующую с аминогруппой, или группу, реагирующую с тиолом, можно использовать для связывания нейбластина с сывороточным альбумином. Примеры подходящих линкеров включают перекрестно сшивающие агенты, реакционноспособные по отношению к амину, которые встраивают малеимид, реагирующий с тиолом. Указанные линкеры включают, например, 8МСС, АМА8, ВМР8, МВ8, ЕМС8, 8МРВ, 8МРН, КМН8 или СМВ8. Другие подходящие линкеры встраивают группу галогенацетата, реагирующую с тиолом. Указанные линкеры включают, например, 8ВАР, 8М, 8IΑВ, а линкеры, которые предоставляют защищенный или незащищенный тиол для реакции с сульфгидрильными группами, чтобы получить восстанавливаемую связь, включают 8РИР, 8МРТ, 8АТА или 8АТР, все из которых являются коммерчески доступными (например, Р1егсе Сйе11йса1з). Специалист в данной области может подобным образом представить альтернативные методики, которые позволят связать Νконец нейбластина с сывороточным альбумином.
Также предполагается, что специалист в данной области может создать конъюгаты с сывороточным альбумином, для которых Ν-конец NВN или тиольный компонент сывороточного альбумина не являются мишенью. При желании слияния NВN-сывороточный альбумин можно создать с использованием способов генетической инженерии, при которых NВN сливают с геном сывороточного альбумина на его Νконце, С-конце или на обоих концах.
Кроме того, предполагается, что с использованием сходной методики можно создать любой конъюгат №В^ результатом которого является продукт с пролонгированным временем полужизни у животных (включая человека).
Другие производные вариантных нейбластинов включают ковалентно связанные или агрегированные конъюгаты вариантного нейбластина или его фрагментов с другими белками или полипептидами, например, путем синтеза в рекомбинантной культуре в виде дополнительных Ν-концов или С-концов. Например, конъюгированный пептид может представлять собой сигнальную (или лидерную) полипептидную последовательность в Ν-концевой области белка, которая котрансляционно или посттрансляци
- 9 009771 онно управляет переносом белка от места его синтеза к месту его функционирования с внутренней или наружной стороны клеточной мембраны или стенки (например, лидер альфа-фактора дрожжей). Рецепторные белки нейбластина могут содержать пептиды, добавляемые для облегчения очистки или идентификации нейбластина (например, слияния гистидин/нейбластин). Аминокислотная последовательность нейбластина также может быть связана с пептидом Акр-Туг-Ьук-Акр-Акр-Акр-Акр-Ьук (ΟΥΚΟΌΌΌΚ) (Норр с1 а1., Вю1сс11по1оду 6: 1204, 1988). Последняя последовательность является высоко антигенной и дает эпитоп, обратимо связываемый специфичным моноклональным антителом, обеспечивающий быстрый анализ и простую очистку экспрессированного рекомбинантного белка.
Указанная последовательность также специфично отщепляется энтерокиназой слизистой оболочки быка у остатка, непосредственно следующего за парой Акр-Ьук.
Вариантные полипептиды нейбластина, конъюгированные с полимером
При необходимости можно использовать одну молекулу полимера для конъюгирования с полипептидом нейбластина, хотя также предполагается, что можно также связывать несколько молекул полимера. Композиции конъюгированного нейбластина согласно изобретению можно использовать для применений как ίη νίνο, так и не ίη νίνο. Кроме того, будет понятно, что в конъюгируемом полимере можно использовать любые другие группы, компоненты или другие конъюгированные виды, которые подходят для конечного применения. В качестве примера при некоторых применениях полезным может быть ковалентное связывание с полимером функционального компонента, придающего полимеру устойчивость к деградации УФ или антиоксидантные или другие свойства или характеристики. В качестве следующего примера при некоторых применениях может быть полезной функционализация полимера для того, чтобы сделать его реакционноспособным или в особенности способным к перекрестному сшиванию, чтобы усилить различные свойства или характеристики конъюгированного материала в целом. Таким образом, полимер может содержать любую функциональную группу, повторяющиеся группы, связи или другие составляющие структуры, которые не мешают эффективности композиции конъюгированного мутеина нейбластина при получении планируемого результата.
Иллюстративные полимеры, которые можно успешно использовать для получения указанных требуемых характеристик, приведены в данном описании ниже в типичных схемах реакций. В случае применений ковалентно связанного пептида полимер может быть функционализирован и затем связан со свободной аминокислотой(ами) пептида(дов) с образованием лабильных связей.
В некоторых вариантах полипептид нейбластина связывают с полимером посредством концевой реакционноспособной группы полипептида. Альтернативно или дополнительно полипептид нейбластина можно связать через аминогруппу боковой цепи внутреннего остатка лизина, например, остатка лизина, введенного в аминокислотную последовательность полипептида нейбластина природного происхождения. Таким образом, конъюгаты также могут быть разветвленными от неконцевых реакционноспособных групп. Полимер с реакционноспособной группой(ами) в данном описании называют «активированным полимером». Реакционноспособная группа избирательно реагирует со свободной аминогруппой или другими реакционноспособными группами белка.
Связывание активированного полимера может происходить у любой доступной аминогруппы нейбластина, такой как альфа-аминогруппы или эпсилон-аминогруппы остатка лизина или остатков, введенных в аминокислотную последовательность полипептида нейбластина или его варианта. Свободные карбоксильные группы, соответствующим образом активированные карбонильные группы, гидроксил, гуанидил, имидазол, окисленные углеводные компоненты и меркаптогруппы нейбластина (если они имеются) также можно использовать в качестве мест связывания.
Обычно используют примерно от 1,0 до 10 моль активированного полимера на моль белка в зависимости от концентрации белка. Конечное количество представляет собой баланс между максимизацией степени реакции при минимизации неспецифичных модификаций продукта и в то же время определением химических составов, которые будут поддерживать оптимальную активность, одновременно с оптимизацией, если это возможно, времени полужизни белка. Предпочтительно сохраняется по меньшей мере примерно 50% биологической активности белка и наиболее предпочтительно сохраняется около 100%.
Реакции можно осуществлять любым подходящим способом, используемым для осуществления реакций биологически активных веществ с инертными полимерами, предпочтительно примерно при рН 58, например рН 5, 6, 7 или 8, в том случае, если реакционноспособные группы представляют собой альфа-аминогруппу на Ν-конце. В общем, способ заключается в получении активированного полимера и затем осуществлении реакции белка с активированным полимером, чтобы получить растворимый белок, подходящий для композиции. Указанную выше реакцию модификации можно осуществить несколькими способами, которые могут включать одну или несколько стадий.
Полимер можно связать с вариантным полипептидом нейбластина с использованием способов, известных в данной области. Например, в одном варианте полиалкиленгликолевый компонент связывают с группой лизина полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина. Связывание с группой лизина можно осуществить с использованием активированного сложного эфира Νгидроксилсукцинимида (ΝΗ8), такого как сукцинимидилсукцинат (88-РЕС) и сукцинимидилпропионат (8РА-РЕС) ПЭГ. Подходящие полиалкиленгликолевые компоненты включают, например,
- 10 009771 карбоксиметил-ΝΗδ, норлейцин-ΝΗδ, 8С-ПЭГ, трезилат, альдегид, эпоксид, карбонилимидазол и карбонат ΡΝΡ.
Сукцинимидиловый компонент может быть заменен дополнительными реагирующими с амином линкерами ПЭГ. Указанные линкеры включают, например, изотиоцианаты, нитрофенилкарбонаты, эпоксиды и карбонаты бензотриазола. Предпочтительно выбирают условия, чтобы максимизировать избирательность и степень реакции. Можно использовать линейные и разветвленные формы ПЭГ, а также другие формы алкила. Длина ПЭГ может варьировать. Размер наиболее обычных форм варьирует от 2 до 100 кДа. Наряду с тем, что в данных примерах сообщается, что целенаправленное пегилирование на Νконце не влияет на фармакокинетические свойства, тот факт, что вещество сохраняло физиологическую функцию, свидетельствует о том, что модификация в сайте или сайтах, указанных в данном описании, не оказывает отрицательного воздействия. Поэтому при создании мутантных форм ΝΒΝ, которые могут обеспечивать дополнительные сайты связывания, посредством инсерции остатков лизина, считается допустимым, что возможным результатом будет то, что указанные формы могут быть пегилированы как у лизина, так и на Ν-конце.
При необходимости вариантные полипептиды нейбластина могут содержать метку, например метку, которую впоследствии можно высвободить с помощью протеолиза. Таким образом, представленный лизином компонент можно избирательно модифицировать сначала в результате реакции варианта, содержащего й18-метку, с линкером с низкой молекулярной массой, таким как реагент Траута (Р1егсе), который будет реагировать как с лизином, так и с Ν-концом, и затем высвобождая йщ-метку. Затем полипептид будет содержать свободную δΗ-группу, которую можно избирательно модифицировать ПЭГ, содержащим реагирующую с тиолом головную группу, такую как группа малеимида, винилсульфоновая группа, галогенацетатная группа или свободная или защищенная группа 8Η.
Реагент Траута можно заменить любым линкером, который будет обеспечивать специфичный сайт для связывания ПЭГ. В качестве примера реагент Траута можно заменить 8ΡΌΡ, 8МРТ, 8ΆΤΆ или 8ΆΤΡ (все доступны из Ρ^е^се). Подобным образом можно осуществлять реакцию белка с реакционноспособным по отношению к амину линкером, который встраивает малеимид (например, 8МСС, АМА8, ΒΜΡ8, ΜΒ8, ЕМС8, 8ΜΡΒ, 8ΜΡΗ, КМИ8 или 6ΜΒ8), галогенацетатную группу (8ΒΑΡ, 81А, 8ΙΑΒ) или винилсульфоновую группу, и осуществлять реакцию полученного в результате продукта с ПЭГ, который содержит свободную 8Η. Единственным ограничением размера линкера, который используют, состоит в том, чтобы он не мог блокировать последующее удаление Ν-концевой метки.
Таким образом, в других вариантах полиалкиленгликолевый компонент связывают с группой цистеина полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина. Связывание можно осуществить, например, с использованием малеимидной группы, винилсульфоновой группы, галогенацетатной группы и тиольной группы.
С полимером может быть связан один или несколько сайтов вариантного полипептида нейбластина. Например, с полимером могут быть связаны один, два, три, четыре или пять ПЭГ-компонентов. В некоторых вариантах ПЭГ-компонент связывают с аминоконцом и/или аминокислотами 14, 39, 68 и 95 полипептида нейбластина, пронумерованными, как описано в табл. 1.
В предпочтительных вариантах вариантный полипептид нейбластина в композиции имеет более продолжительное время полужизни в сыворотке по сравнению со временем полужизни вариантного полипептида в отсутствие полимера. Альтернативно или дополнительно вариантный полипептид нейбластина в композиции связывает СЕКо.3, активирует КЕТ, нормализует патологические изменения нейрона или повышает жизнеспособность нейрона или выполняет комбинацию указанных физиологических функций.
В предпочтительных вариантах композицию готовят в виде стабильного водорастворимого конъюгированного комплекса полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина, содержащего полипептид нейбластина или вариантный полипептид нейбластина, связанный с полиэтиленгликолевым компонентом. При желании полипептид нейбластина или вариантный полипептид нейбластина можно связать с полиэтиленгликолевым компонентом с помощью лабильной связи. Лабильную связь можно расщепить, например, при биохимическом гидролизе, протеолизе или сульфгидрильном расщеплении. Например, связь можно расщепить в условиях ίη νίνο (физиологических условиях).
Фармацевтические композиции, содержащие конъюгаты вариантный нейбластин-полимер
Также представлена фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат вариантный нейбластинполимер согласно данному изобретению. «Фармацевтическую композицию» в используемом в данном описании смысле определяют как композицию, содержащую белок или конъюгат нейбластина согласно изобретению, диспергированный в физиологически приемлемом наполнителе, необязательно содержащую один или несколько других физиологически совместимых ингредиентов. Таким образом, фармацевтическая композиция может содержать эксципиент, такой как вода, одно или несколько неорганических веществ, сахаров, детергентов и один или несколько носителей, таких как инертный белок (например, гепарин или альбумин).
Конъюгаты полимер-нейбластин согласно изобретению можно вводить как таковые, а также в форме их фармацевтически приемлемых сложных эфиров, солей и других физиологически функциональных
- 11 009771 производных. В таких фармацевтических и лекарственных композициях конъюгат вариантного нейбластина предпочтительно используют вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и необязательно любыми другими терапевтическими ингредиентами.
Носитель(ли) должен быть фармацевтически приемлемым в смысле совместимости с другими ингредиентами композиции и не быть чрезмерно опасным для реципиента. Вариантный нейбластин вводят в количестве, эффективном для достижения требуемого фармакологического действия или полезного лекарственного эффекта, которые описаны в данном изобретении, и в количестве, подходящем для достижения требуемой биодоступной дозы или концентрации ίη νίνο.
Композиции включают композиции, подходящие для парентерального, а также для непарентерального введения, и конкретные способы введения включают пероральное, ректальное, трансбуккальное, местное, назальное, глазное, подкожное, внутримышечное, внутривенное, трансдермальное, интратекальное, внутрисуставное, внутриартериальное, подарахноидальное, бронхиальное, лимфатическое, вагинальное и внутриматочное введение. Предпочтительны композиции, подходящие для аэрозольного и парентерального введения как локально, так и системно.
В том случае, когда вариантный нейбластин используют в композиции, содержащей жидкий раствор, композицию преимущественно можно вводить перорально, бронхиально или парентерально. В случае использования нейбластина в жидкой суспензионной композиции или в виде порошка в биосовместимой композиции носителя, композицию преимущественно можно вводить перорально, ректально или бронхиально. Альтернативно ее можно вводить назально или бронхиально с помощью распыления порошка в газе-носителе, чтобы образовать газообразную дисперсию порошка, который вдыхается пациентом из дыхательного контура, содержащего подходящее устройство для распыления.
Композиции, содержащие белки согласно данному изобретению, удобно могут быть представлены в дозированных лекарственных формах и могут быть приготовлены любым из способов, хорошо известных в области фармации. Такие способы, как правило, включают стадию введения активного ингредиента(тов) в ассоциацию с носителем, в состав которого входит один или несколько дополнительных ингредиентов.
Обычно композиции готовят путем получения однородной и тесной ассоциации активного ингредиента(тов) и жидкого носителя, тонко диспергированного твердого носителя или обоих носителей и затем при необходимости формованием продукта в виде дозированных форм требуемой композиции.
Композиции согласно данному изобретению, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в виде дискретных единиц, таких как капсулы, облатки, таблетки или лепешки, каждая из которых содержит предварительно определенное количество активного ингредиента в виде порошка или гранул; или в виде суспензии в водном растворе или неводном растворе, такой как сироп, эликсир, эмульсия или дозируемое жидкое лекарство.
Композиции, подходящие для парентерального введения, для удобства содержат стерильный водный препарат активного конъюгата, который предпочтительно является изотоничным крови реципиента (например, физиологический раствор соли). Такие композиции могут содержать суспендирующие агенты и загустители или другие системы микрочастиц, которые разработаны для целенаправленной доставки соединения к компонентам крови или одному или нескольким органам. Композиции могут быть представлены в форме однократной дозы или форме многократных доз.
Композиции назального спрея содержат очищенные водные растворы активного конъюгата с консервантами и агентами для изотоничности. Такие композиции предпочтительно доводят до рН и изотоничного состояния, совместимого с мембранами слизистой оболочки носа.
Композиции для ректального введения могут быть представлены в виде суппозитория с подходящим носителем, таким как масло какао, гидрогенизированные жиры или гидрогенизированная жирная карбоновая кислота. Глазные композиции, такие как глазные капли, готовят способом, подобным способу получения назального спрея, за исключением того, что рН и факторы для изоточности предпочтительно доводят так, чтобы они подходили для глаза.
Местные композиции содержат конъюгаты согласно изобретению, растворенные или суспендированные в одной или нескольких средах, таких как минеральное масло, керосин, многоатомные спирты или другие основы, используемые для местных фармацевтических композиций.
Кроме указанных выше ингредиентов композиции согласно данному изобретению могут дополнительно содержать один или несколько вспомогательных ингредиентов, выбранных из разбавителей, буферов, корригентов, дезинтегрирующих агентов, поверхностно-активных веществ, загустителей, скользящих веществ, консервантов (включая антиоксиданты) и тому подобного. Указанные выше рассуждения также применимы к слитым белкам нейбластина согласно изобретению (например, слияние нейбластинН8А).
Таким образом, данное изобретение охватывает получение подходящих слитых белков для стабилизации конъюгата вариантного нейбластина в растворе ίη νίίτο в качестве предпочтительного иллюстративного применения изобретения. Слитые белки можно использовать, например, для того, чтобы повысить устойчивость вариантного полипептида нейбластина к деградации ферментами и предоставить способы повышения срока хранения, стабильности при комнатной температуре и тому подобного. Понятно,
- 12 009771 что указанные выше рассуждения также применимы к слитым белкам нейбластин-сывороточный альбумин (включая слитые белки нейбластин человека-сывороточный альбумин человека) согласно изобретению.
Способы лечения
Вариантные полипептиды нейбластина, а также их слитые белки или конъюгаты можно использовать для лечения или ослабления расстройства или заболевания в организме существующих животных, предпочтительно млекопитающего, более предпочтительно примата, включая человека, когда указанное расстройство или заболевание поддается влиянию активности нейротрофических агентов.
Композиции согласно изобретению можно использовать непосредственно, например, посредством инъецируемых, имплантируемых или проглатываемых фармацевтических композиций для лечения патологического процесса, отвечающего на полипептиды нейбластина. Композиции можно использовать для ослабления расстройства или заболевания в организме существующих животных, включая человека, когда расстройство или заболевание поддается воздействию активности нейротрофических агентов. Расстройством или заболеванием, в частности, может быть повреждение нервной системы, вызванное травмой, хирургической операцией, ишемией, инфекцией, метаболическими заболеваниями, недостаточностью питания, злокачественным новообразованием или токсичными агентами, и генетическими или идиопатическими процессами.
Повреждение, в частности, может произойти в чувствительных нейронах или клетках ретинального ганглия, включая нейроны в ганглиях дорзальных корешков спинного мозга, или в любой из следующих тканей: ганглий коленца, внечерепной ганглий и узловатый ганглий; преддверно-улитковый комплекс восьмого черепно-мозгового нерва; вентролатеральный полюс верхнечелюстной-нижнечелюстной доли тройничного ганглия; и мезэнцефалическое ядро тройничного нерва.
В предпочтительном варианте способа согласно изобретению заболеванием или расстройством является нейродегенеративное заболевание, в которое вовлечены поврежденные и травмированные нейроны, а именно травматические повреждения периферических нервов, продолговатого мозга и/или спинного мозга, повреждение нейронов при церебральной ишемии, невропатия и в особенности периферическая невропатия, травма или повреждение периферического нерва, ишемический инсульт, острое повреждение головного мозга, острое повреждение спинного мозга, опухоли нервной системы, множественный склероз, воздействие нейротоксинов, метаболические заболевания, такие как диабет или дисфункция почек, и повреждение, вызванное инфекционными агентами, нейродегенеративные расстройства, включающие болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона, синдромы с проявлениями болезни Паркинсона, прогрессирующий супрануклеарный паралич (синдром Стила-РичардсонаОльшевского), оливо-понто-церебеллярную дегенерацию (ОПЦД), синдром Шая-Дрейджера (множественная системная атрофия), комплекс деменция-паркинсонизм (Гуам-тип), боковой амиотрофический склероз, или любое другое врожденное или нейродегенеративное заболевание, и ухудшение памяти, связанное с деменцией.
В предпочтительном варианте можно лечить чувствительные нейроны и/или нейроны автономных систем. В частности, можно лечить ноцицептивные и механорецептивные нейроны, более конкретно нейроны с дельта-волокнами и С-волокнами. Кроме того, можно лечить симпатические и парасимпатические нейроны автономной системы.
В другом предпочтительном варианте можно лечить заболевания мотонейронов, такие как боковой амиотрофический склероз («БАС») и спинальная амиотрофия. В еще одном предпочтительном варианте молекулы нейбластина согласно данному изобретению можно использовать для ускорения восстановления нервов после травматического поражения. Альтернативно или дополнительно в приведенных в данном описании способах можно использовать канал управления нервом с помощью матрикса, содержащего вариантные полипептиды нейбластина или слияние или конъюгаты вариантных полипептидов нейбластина. Такие каналы управления нервами заявлены, например, в патенте США № 5834029, включенном в данное описание в виде ссылки.
В предпочтительном варианте указанные в данном описании композиции (и фармацевтические композиции, которые их содержат) используют для лечения периферических невропатий. Среди периферических невропатий, которые предполагается лечить молекулами согласно данному изобретению, находятся индуцированные травмами невропатий, например, такие, которые вызваны физическим повреждением или патологическим состоянием, физическое повреждение головного мозга, физическое повреждение спинного мозга, инсульт, связанный с повреждением головного мозга, и неврологические нарушения, связанные с нейродегенерацией. Также включены в данное изобретение невропатии, являющиеся вторичными после инфекции, воздействия токсина и воздействия лекарственного средства. Кроме того, в данное изобретение включены невропатии, являющиеся вторичными после системного или метаболического заболевания. Заявленные в данном описании композиции также можно использовать для лечения невропатий, индуцированных химиотерапией (таких как невропатии, вызванные поступлением хемотерапевтических средств, например, таксола или цисплатина); невропатий, индуцированных токсинами, невропатий, индуцированных лекарственными средствами, невропатий, индуцированных недостатком
- 13 009771 витаминов; идиопатических невропатий и диабетических невропатий. См., например, патенты США 5496804 и 5916555, каждый из которых включен здесь в виде ссылки.
Дополнительными состояниями, которые можно лечить с использованием приведенных в данном описании композиций, являются мононевропатии, множественные мононевропатии и полиневропатии, включая аксональную и димиелинизирующую невропатии, с использованием указанных в данном описании композиций.
В другом предпочтительном варианте композиции согласно изобретению (и фармацевтические композиции, которые их содержат) используют для лечения различных заболеваний глаза, включая разрушение фоторецепторов сетчатки у пациентов, страдающих дегенерацией желтого пятна, пигментным ретинитом, глаукомой и сходными заболеваниями.
Изобретение будет далее иллюстрировано следующими неограничивающими примерами.
Пример 1. Биодоступность пегилированного на Ν-конце нейбластина.
Обнаружили, что полученный в клетках СНО рекомбинантный нейбластин человека подвергается быстрому клиренсу из циркуляции в случае внутривенного введения крысам. После подкожного введения не выявляли белка в сыворотке. Чтобы повысить биодоступность нейбластина конструировали пегилированные формы.
Поскольку в последовательности ΝΒΝ не встречаются лизины, то результатом специфичных в отношении амина химических реакций пегилирования будет пегилирование полипептида ΝΒΝ по его аминоконцу. Следовательно, для каждого димера нейбластина необходимо связать два ПЭГ-компонента. Таким образом, сначала непосредственной мишенью ПЭГ-форм был Ν-конец за счет специфичных по отношению к амину химических реакций. Неожиданно даже пегилирование двумя связанными ПЭГ с М.м. 20 кДа было мало полезным в отношении времени полужизни, что свидетельствует о том, что механизм, лежащий в основе пути клиренса, доминировал над увеличением времени полужизни, которое ожидали при пегилировании.
Пример 2. Конструирование пегилированного мутеина нейбластина Ν95Κ.
Затем определяли биодоступность мутантных форм ΝΒΝ, пегилированных по внутренним аминокислотным остаткам. Конструировали серию из четырех мутантов с заменами остатков природного происхождения в положениях 14, 39, 68 и 95, чтобы встроить лизин в выбранные места в последовательности. Указанные лизины могли бы обеспечивать альтернативные сайты для связывания ПЭГ. Указанные сайты выбирали с использованием кристаллической структуры СЭЖ (Ναι. 81гис1. ΒίοΙ. 4: 435-8, 1997) в качестве основы для идентификации поверхностных остатков и мутагенного исследования химеры персефин/нейбластин (1. ΒίοΙ. Сйсш. 275: 3412-20, 2000), чтобы идентифицировать функционально важные области структуры, которые не следует затрагивать.
Две мутации (К39 и К68) были целенаправленно введены в область, которая на основании распределения положительных зарядов на поверхности может представлять собой сайт связывания гепарина, свойство белка, которое вероятно вносит вклад в его быстрый клиренс. Третий сайт был целенаправленно введен в Ν95, сайт естественного гликозилирования ΝΒΝ дикого типа. Данный сайт модифицируется в естественных условиях сложной углеводной структурой. Таким образом, ожидалось, что ПЭГмодификация в указанном сайте не нарушит функцию. Четвертый сайт (К14) выбрали в области, которая не содержит каких-либо других модификаций. Для указанных в данном описании исследований выбрали мутант, в котором остаток аспарагина в положении 95 заменяли лизином («мутант Ν95Κ»).
Конструировали четыре различных мутеина нейбластина крысы, содержащих одно или несколько изменений в последовательности полипептида нейбластина крысы дикого типа. Мутеины включают мутеин Ν95Κ с одним изменением и мутеины, содержащие единичные замены в других сайтах аминокислотной последовательности нейбластина крысы: К14К; К68К и К39К. В номенклатуре «ΧιΝιΧ2» Х1 относится к аминокислоте полипептида нейбластина дикого типа, Ν1 относится к номеру положения аминокислоты Х1 в последовательности, которая пронумерована согласно 8ЕО ΙΌ N0: 1. Х2 относится к аминокислоте, замещающей аминокислоту дикого типа в указанном пронумерованном положении последовательности.
Чтобы сконструировать мутацию нейбластина Ν95Κ, осуществляли сайт-специфичный мутагенез в рСМВ020, плазмиде, кодирующей нейбластин крысы дикого типа. Нуклеотидная последовательность нейбластина дикого типа и аминокислотная последовательность кодируемого ею полипептида представлены далее.
- 14 009771
АТССААСТСС (ЗАСТТСОАОА СССТАСТССА ТТ6ТСССАСТ ОССТСССЮСС
ТАОСТСССАА ССАОССТТОТ ООССААСССТ АССТОСТСТА ССССТОСТОА
101 ССАССОТСАС АСААССТТСС СТССАСССАА ТСТСССОСАО СССССССТСТ
151 СОССАТСТТС ССТСОССООТ ССТООСОССС ССААСАСАСТ АССТАССТОС
201 ОООАСАСАСС ОСАСАТСТСТ ОСАССОАААС АОСССТОССА ССЛССОССОС
251 АСТСТССТСА ОСССОСАССС ССАССАССОО СТСССОСОСТ ССАСТСТССТ
301 СССССТСССС ТССОСОСССС АСОСОСООСО ССТОСАООАА СССООАОСАО
351 ССССССАССС ОСТАСАОАТС СОСССООСТО СССССТСССС ТСАСАССТОО
401 ТОССОСТОАО С6СТСТС0СС СТСООССАСА ОСТССОАССА ОСТОАТАССТ
451 ТТССССТТСТ ОСАСССОТТС СТССССССОА ССАСССТССС СССАСОАТСТ
501 САОССТСССС АСССТССТСС ссссссоссс сстсссстст сстсссоазт
551 ССССССССАТ САОССАОССС ТОТТОССОСС ССАСТСОСТА Т0А60СА6ТС
601 ТССТТСАТСС АСОТСААСАС САССТООАСА АСССТСОАСС АТСТСТССОС
651 САСССССТСС 0ССТСТСТ6С ОСТСА (ЗЕО ГО N0:5)
МЕЬОЬСЕРТА ЬЗНСЬКРЙИО РАЬНРТЬААЬ АЬЬЗЗУТЕАЗ ЬОРМЯКЗРАЗ
НОУРЗРПДР ΡΤϋΥΙΡΟΟΗΤ АНЪСЗВНАЬК РРР05Р0РАР ΡΡΡΟΡΑΙΛ25Ρ
101 РААЬКОАКАА ВАОТКЗЗКАК АТОАЯОСКШ ЗООУРУЗАЬО ЬСНЗЗОЕЫК
151 РКЕСЗОЗСКК АКЗРНОЬЗЬА ЗЫХЗАОАЬНЗ ΡΡΟ3ΚΡΙ30Ρ ССКРТНУЕАУ
201 ЗГМОУЫЗТИН ТУОНЬЗАТАС ссьа* (ЗЕО ГО N0:4)
Мутагенез рСМ020 с использованием олигонуклеотидов ΚΌ2-310 и ΚΌ3-211 приводил к образованию плазмиды рСМВ027
КО2 - 310 5 ' -СТАТСТТТСАТСОАССТАААСТСТАСАТООАОААССОТАОАТСАТСТАТСТОСААСС 3' (ЗЕО ГО N0:6)
ΚΌ2 - 311 5 ' -СОТТаСАОАТАСЗАТОАТСТАСОСТТСТССАТОТАОАСТТТАСОТССАТОАААСАТАС3' (ЗЕО Ю N0:7)
В рСМВ027 кодон, кодирующий аспарагин в положении 95, заменили кодоном, кодирующим лизин.
Мутеин нейбластина Κ14Κ образовывали заменой кодона, кодирующего аргинин, в положении 14 последовательности рСМВ020, кодирующей нейбластин, кодоном, кодирующим лизин. Сайтспецифичный мутагенез осуществляли в рСМВ020 с использованием олигонуклеотидов ΚΌ3-254 и КОЗ255
КОЗ-254 5 ' -ССТОСААСТСССАССТСТСОТССТССТССААСООАТаСААААаЗСТСТСС-З (ЗЕО Ю N0:8)
КО2-255 5 ' -ССАСАОССТТТТОСАТССОТТаСАСОАОСАСОАОАСЗСТССОАОТТССАОС-З ' (ЗЕО Ю N0:9)
Полученная в результате конструкция названа рСМВ029.
Мутеин нейбластина Κ68Κ образовывали заменой кодона, кодирующего аргинин, в положении 68 последовательности рСМВ020, кодирующей нейбластин, кодоном, кодирующим лизин. Сайтспецифичный мутагенез осуществляли в рСМВ020 с использованием олигонуклеотидов ΚΌ3-258 и ΚΌ3259
КОЗ-258 5 '-ООАОССОСАОСАСТААААТСТССССОООАТСТАОАСС-З ' (8Е0 ГО N0:10)
КОЗ-259 5'-ОСТСТАСАТСССОООСОАСАТТТТАСТОСТССОССТСС-3' (ЗЕО N0:11)
Полученная в результате конструкция названа рСМВ030.
- 15 009771
Мутеин нейбластина Κ39Κ образовывали заменой аргинина лизином в положении аминокислоты 39 последовательности рСМВ020, кодирующей нейбластин. Сайт-специфичный мутагенез рСМВ020 осуществляли с использованием олигонуклеотидов ΚΌ3-256 и ΚΌ3-257
КОЗ-256 5 ’ -САСОААТТААТТААСТТТССТТТТТОТТСАСО-3 ' (ЗЕО Ю N0:12)
КОЗ-257 5 ' -ССТОААСАААААСОАААСТТААТТААТТССТС-3 ' (ЗЕО И N0:13)
Для экспрессии и очистки плазмиду, кодирующую мутеин ΝΒΝ Ν95Κ крысы, экспрессировали в Е. сой в виде меченого Н18 слитого белка с сайтом расщепления энтерокиназой, непосредственно прилежащим к началу последовательности зрелого 113-аминокислотного ΝΒΝ. Е. сой выращивали в ферментере объемом 500 л и готовили замороженную клеточную массу. Клетки Е. сой лизировали в пресс-фильтре Майои Саийи, и ΝΒΝ ΝΚ крыс извлекали из нерастворимой промытой фракции осадка.
ΝΒΝ экстрагировали из осадка гуанидинхлоридом, подвергали свертыванию и Ык-метку удаляли энтерокиназой. Затем продукт подвергали хроматографии на Νί ΝΤΑ-агарозе (Ц1адеп) и на катионообменной смоле АР СВХ ВакегЬопб.
Обработка энтерокиназой Ык-меченого продукта приводила к аберрантному расщеплению белка у аргинина в положении 7 зрелой последовательности. Полученный в результате продукт άе8-1-7-NΒN был полностью активным в ЕЬ18А ΚΙΡΑ и структурно неотличим от зрелой формы по своей чувствительности к индуцированной гуанидином денатурации и поэтому был использован для последующей работы.
ΝΒΝ Ν95Κ крысы пегилировали в среднем 3,3 ПЭГ-компонентов/молекулу, используя в качестве реагента метоксиполи(этиленгликоль)сукцинимидилпропионат (8РА-ПЭГ) с молекулярной массой 10000 Да. Полученный в результате пегилированный продукт всесторонне характеризовали, включая анализ с помощью электрофореза в δΌδ-ПААГ, эксклюзионную хроматографию по размеру (8ЕС), обращенно-фазовую ВЭЖХ, масс-спектрометрию с лазерной десорбцией/ионизацией из матрицы (МАЬП/ГМС), картирование пептидов, оценку активности в ЕЫ8А ΚΙΡΑ и определение содержания эндотоксина. Чистота продукта ΝΒΝ Ν95Κ перед пегилированием, измеренная с помощью δΌδ-ПААГ и 8ЕС, составляла более 95%. Продукт ΝΒΝ Ν95Κ в невосстанавливающих условиях мигрировал в виде димера, что соответствовало его рассчитанной структуре. После пегилирования полученный продукт состоял из серии модифицированных аддуктов, содержащих 2 ПЭГ/молекулу - 5% продукта, 3 ПЭГ/молекулу - 60% продукта, 4 ПЭГ/молекулу - 30% продукта и несколько минорных форм более высокой массы. В пегилированном образце не было признаков агрегатов. Остаточные уровни немодифицированного ΝΒΝ в продукте были ниже пределов количественного измерения. Содержание эндотоксина в материале обычно составляет менее 1 ЕИ/мг. Удельная активность пегилированного ΝΒΝ в ЕЫ8А ΚΙΡΑ составляет 10 нМ. Пегилированный продукт готовили при концентрации 1,1 мг/мл в ΡΒ8, рН 6,5. Материал, который по эффективности подобен ΝΒΝ дикого типа, можно поставлять в виде замороженного раствора, который хранят при -70°С.
Мутеины Р14К. Р39К и Κ.68Κ экспрессировали в Е. сой и их можно подвергать таким же способам очистки, пегилирования и оценки функции, которые описаны выше для Ν95Κ-ΝΒΝ.
Приготовление пегилированного ΝΒΝ
230 мл подвергнутого свертыванию ΝΒΝ Ν95Κ крысы (2,6 мг/мл), который получали в Е. сой и хранили при 4°С в 5 мМ фосфате натрия, рН 6,5, 100 мМ ЫаС1, разбавляли 77 мл воды, 14,4 мл 1 М НЕРЕ8, рН 7,5 и 2,8 г (конечная концентрация 10 мг/мл) ПЭГ 8РА, 10000 Да (811еаг\та1ег Ро1утегк, 1пс.). Образец инкубировали при комнатной температуре в течение 4 ч в темноте, затем обрабатывали 5 мМ имидазола (конечная концентрация), фильтровали и хранили в течение ночи при 4°С. Продукт готовили в двух партиях, одна из которых содержала 130 мл ΝΒΝ Ν95Κ по объему, а другая содержала объем 100 мл. Пегилированный ΝΒΝ очищали от реакционной смеси на колонке Етас1оде1 ЕМО 8О3 - (М) (ЕМ 1пби81пе8). Разгонку на колонке проводили при комнатной температуре. Все буферы готовили апирогенно. К реакционной смеси добавляли хлорид натрия до конечной концентрации 87 мМ и образец наносили на колонку Етас1оде1 объемом 45 мл (внутренний диаметр 5 см).
Колонку промывали одним объемом колонки 5 мМ фосфата натрия, рН 6,5, 80 мМ ЫаС1, затем тремя аликвотами объемом, равным объему колонки, 5 мМ фосфата натрия, содержащего 50 мМ №1С1. Смолу переносили на колонку диаметром 2,5 см и пегилированный ΝΒΝ элюировали с колонки шестью аликвотами объемом по 10 мл, содержащими 5 мМ фосфат натрия, рН 6,5, 400 мМ ЫаС1, тремя аликвотами, содержащими 500 мМ ЫаС1, и шестью аликвотами, содержащими 600 мМ ЫаС1. Элюированные фракции анализировали в отношении содержания белка по оптической плотности при 280 нм и затем в отношении степени модификации с помощью электрофореза в δΌδ-ПААГ. Выбранные фракции объединяли, фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм и разбавляли водой до 1,1 мг пегилированного ΝΒΝ крыс/мл. После оценки уровней эндотоксина в отдельных партиях их объединяли и повторно фильтровали через 0,2 мкм-мембрану. Конечное вещество делили на аликвоты и хранили при -70°С.
УФ-спектр очищенного пегилированного ΝΒΝ ΝΚ
УФ-спектр (240-340 нм) пегилированного ΝΒΝ ΝΚ измеряли на чистом образце. Образец анализировали в трех повторах. Пегилированный образец проявлял максимум поглощения при 275-277 нм и ми
- 16 009771 нимум поглощения при 247-249. Полученный результат согласуется с результатом, наблюдаемым в случае немодифицированного промежуточного соединения основной массы ΝΒΝ. Концентрацию белка пегилированного продукта оценивали на основе спектра, используя коэффициент экстинкции Σ280 0,1%=0,50. Концентрация белка основной массы пегилированного ΝΒΝ составляла 1,1 мг/мл. В образце не было мутности, что очевидно, исходя из отсутствия поглощения при 320 нм.
Характеристика пегилированного ΝΒΝ ΝΚ с помощью электрофореза в δΌδ-ПААГ
Аликвоты пегилированного ΝΒΝ, содержащие 3; 1,5; 0,75 и 0,3 мкг продукта, подвергали анализу в δΌδ-ПААГ в 4-20% градиентном геле (Ον1). Гель красили Кумасси ярко-синим К-250. Параллельно разгоняли маркеры молекулярной массы (С1ВСО-ВКЬ).
Анализ в δΌδ-ПААГ пегилированного ΝΒΝ ΝΚ в невосстанавливающих условиях выявил серию полос, соответствующих модификациям 2, 3, 4 и более 4 ПЭГ/молекулу. Основная полоса с видимой массой 98 кДа содержит 3 ПЭГ/молекулу. В очищенном пегилированном продукте немодифицированный ΝΒΝ не выявляли. Наличие смеси продуктов с 2, 3 и 4 связанными ПЭГ подтверждали с помощью ΜΆΕΌΙ-масс-спектрометрического анализа.
Соотношение продуктов, содержащих 2, 3 и 4 ПЭГ, определяли с помощью денситометрии и установили равным 7, 62 и 30% от суммарного количества, соответственно.
Характеристика пегилированного ΝΒΝ с помощью эксклюзионной хроматографии по размеру
Пегилированный ΝΒΝ подвергали эксклюзионной хроматографии по размеру на аналитической колонке 8ирего§е 6 НК10/30 ЕРЬС с использованием в качестве подвижной фазы 5 мМ ΜΕδ, рН 6,5, 300 мМ №С1. Разгонку на колонке проводили со скоростью 20 мл/ч. Элюированные фракции контролировали в отношении оптической плотности при 280 нм. Пегилированный ΝΒΝ элюировали в виде отдельного пика с видимой молекулярной массой примерно 200 кДа в соответствии с большим гидродинамическим объемом ПЭГ. Не наблюдали признаков агрегатов. Свободный ΝΒΝ, который элюируется с видимой молекулярной массой примерно 30 кДа, в препарате не выявляли.
Анализ пегилированного ΝΒΝ обращенно-фазовой ВЭЖХ
Пегилированный ΝΒΝ ΝΚ подвергали обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Ууйае С4 (5 мкм, 1x250 мм). Колонку обрабатывали, используя 60 мм градиент от 40 до 60% В (буфер А: 0,1% ТФУ, буфер В: 75% ацетонитрил/0,085% ТФУ). Вытекающий из колонки поток контролировали в отношении оптической плотности при 214 нм и собирали фракции для последующего анализа. Пегилированный ΝΒΝ ΝΚ фракционировали на его различные ди- (60,5 мм), три- (63,3 мм) и тетра- (67,8 мм) пегилированные компоненты обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке С4. Относительные интенсивности пиков свидетельствуют, что соотношения компонентов составляют 5,4; 60,5 и 30,1% соответственно. Интенсивности пиков подтверждали с помощью ΜΆΕΌΙ-МС. Не было признаков непегилированного ΝΒΝ ΝΚ (элюируется при 5-15 мм) в продукте.
Анализ пегилированного ΝΒΝ масс-спектрометрией
Пегилированный ΝΒΝ ΝΚ обессоливали на С4 Ζίρ Τίρ и анализировали масс-спектрометрией во времяпролетном масс-спектрометре с лазерной десорбцией/ионизацией из матрицы (ΜΑΕΌΙ-ΤΟΕ) АЬуадег-ΌΕ™ δΤΚ (Регёерйуе Β^ο8у8ΐет8) с использованием в качестве матрицы синапиновой кислоты. 0,5 мкл очищенного белка смешивали с 0,5 мкл матрицы на пластине для мишеней. Масс-спектрометрия пегилированного ΝΒΝ выявила формы трех аддуктов с одним и двумя зарядами. Наблюдаемые массы 43803 Да, 54046 Да и 64438 Да соответствуют модификациям 2, 3 и 4 ПЭГ/молекулу.
Анализ пегилированного ΝΒΝ с помощью картирования пептида
Специфичность реакции пегилирования оценивали с помощью картирования пептидов. Пегилированный ΝΒΝ разделяли на ди-, три- и тетрапегилированные компоненты, которые затем восстанавливали, алкилировали и далее разделяли на их одноцепочечные компоненты с помощью ВЭЖХ на колонке С4. Полученные компоненты и восстановленный и алкилированный немодифицированный ΝΒΝ ΝΚ в качестве контроля расщепляли Άκρ-Ν-протеиназой и полученные в результате продукты расщепления фракционировали обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Ууйае С18 (5 мкм, 1x250 мм), используя 60 ммградиент от 0 до 60% В (буфер А: 0,1% ТФУ, ΒιιΓίοΓ В: 75% ацетонитрил/0,085% ТФУ). Вытекающий из колонки поток контролировали в отношении оптической плотности при 214 нм.
Последовательность ΝΒΝ крыс содержит четыре внутренних аспарагиновых кислоты и поэтому предполагается, что она дает простой профиль расщепления в случае расщепления эндопротеиназой ЛкрΝ. Все пики из продукта расщепления ΝΒΝ ΝΚ крысы эндопротеиназой Лкр-Ν идентифицировали массспектрометрией и/или Ν-концевым секвенированием по Эдману и таким образом пептидную карту можно использовать в качестве простого средства для исследования сайтов модификации по наличию или отсутствию пика. Идентификация различных пиков суммарно показана в табл. 3 ниже.
- 17 009771
Таблица 3
Пик по времени удерживания (мм) | Наблюдаемая масса (среднее) | Теоретическая масса (среднее) | Распределение | Аминокислотная последовательность |
38 8 | 1261 1 (М) | 1262,4 | 102-113 | ОНиАТАСОШЗ |
407 | 10909 | 1092,2 | 93-101 | ονκχηνκτν |
Д6 | 25084 | 2508,9 | 35-54 | ОЕиКРПГС5О5СККАК5РН |
460 | 2437 0 | 2437,8 | 12-34 | ОАЯОСШ-К5ОЕУР75АЬСиЗН58 |
514 | 3456 7 | 3456,0 | 55-86 | ϋΙΛΑ5 СКРТНУ |
519 | 4134 4 | 55-92(окснд) | ПЬЯ-АЗ СКт¥ВАУ5РМ | |
53 2 | 41363· | 4120,8 | 55-92 | ОЬЗЬАЗ СЮТКУЕАУЗРМ |
(М): шопо1оз1ор1с масса *: в результате окисления пептида, содержащего метионин, при МАЬЭ1.
Так как ΝΒΝ существует в виде гомодимера, продукт ΝΒΝ ΝΚ крысы содержит четыре возможных сайта для пегилирования, два Ν-концевых амина из каждой цепи и два сайта Ν95Κ, которые были созданы в конструкции. В пептидной карте дипегилированной цепи только пик, который содержит пептид с мутацией ΝΚ, был изменен ПЭГ-модификацией. ПЭГ-модификация не влияла ни на какие другие пики. Таким образом, данные картирования свидетельствуют о том, что ПЭГ-компонент специфично связан с данным пептидом и не связан ни с какими другими пептидами, которые подвергали скринингу. Второй возможный сайт связывания, Ν-конец, находится на пептиде, который имеет длину только из трех аминокислот и не выявляется в пептидной карте. Предполагается, что дополнительное связывание ПЭГ происходит в данном сайте. Согласно этой точки зрения небольшой процент ΝΒΝ ΝΚ крысы не укорочен и содержит зрелую последовательность А1а-1. Данный пептид элюируется при 30 мкм и виден на пептидной карте непегилированного продукта расщепления, но отсутствует в продуктах расщепления пегилированного ΝΒΝ ΝΚ.
Пример 3. Оценка эффективности внутренне пегилированного нейбластина в ЕЫ8А активации киназного рецептора (К1КА).
Эффективность пегилированного ΝΒΝ крысы измеряли с использованием ΝΒΝ-зависимой активации/фосфорилирования с-КЕТ в качестве репортера активности ΝΒΝ в ЕЫ8А, который был специфичен в отношении присутствия фосфорилированного КЕТ. Клетки ЫБ41А3-шКЬ3 линии адгезивных клеток нейробластомы мышей, которая экспрессирует КЕТ и СЕКа3, высевали при концентрации 2х105 клеток на лунку в 24-луночные планшеты в среду Игла, модифицированную Дульбекко (ЭМЕМ), с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка и культивировали в течение 18 ч при 37°С и 5% СО2.
Клетки промывали РΒ8 и обрабатывали серийными разведениями ΝΒΝ в 0,25 мл ОМЕМ в течение 10 мин при 37°С и 5% СО2. Каждый образец анализировали в двух повторах. Клетки промывали 1 мл РΒ8 и лизировали в течение 1 ч при 4°С с помощью 0,30 мл 10 мМ Трис-НС1, рН 8,0, 0,5% Ыошбе! Р40, 0,2% дезоксихолата натрия, 50 мМ ЫаЕ, 0,1 мМ Ыа3УО4, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида при осторожном покачивании планшетов. Затем лизаты дополнительно перемешивали многократным пипетированием и 0,25 мл образца переносили в 96-луночные планшеты для ЕЫ8А, которые были покрыты 5 мкг/мл анти-КЕТ-мАт (АА.СЕ7.3) в 50 мМ карбонатном буфере, рН 9,6, при 4°С в течение 18 ч, и блокировали при комнатной температуре в течение 1 ч блокирующим буфером (20 мМ Трис-НС1, рН 7,5, 150 мМ ЫаС1, 0,1% Твин-20 (ΈΒδΈ), содержащий 1% нормальной сыворотки мыши и 3% бычьего сывороточного альбумина).
После 2 ч инкубации при комнатной температуре лунки 6 раз промывали ΙΒδΈ Фосфорилированный КЕТ регистрировали, инкубируя лунки при комнатной температуре в течение 2 ч с 2 мкг/мл конъюгированного с пероксидазой хрена (НКР) антитела против фосфотирозина 4С10 в блокирующем буфере, 6 раз промывая ТΒ8Т и измеряя активность НКР при 450 нм с помощью реагента для колориметрической регистрации. Измеряли значения оптической плотности для лунок, обработанных лизатом или лизирующим буфером, и скорректированный относительно фона сигнал наносили на график в виде функции концентрации ΝΒΝ, присутствующего в активационной смеси. Эффективность пегилированного ΝΒΝ в ЕЫ8А К1КА составляла 10 нМ, что не отличается от эффективности исходного вещества ΝΒΝ ΝΚ. Два цикла замораживания-оттаивания не влияли на эффективность, и после указанной обработки не было существенного увеличения мутности образца, что свидетельствует о том, что образцы можно безопасно размораживать для исследования. В независимых исследованиях по оценке активности продукта с тремя и четырьмя 10 кДа-ПЭГ/молекулу отдельно определили, что аддукт с тремя ПЭГ был полностью активным, тогда как продукт с четырьмя ПЭГ имел пониженную активность.
Пример 4. Фармакокинетические исследования внутренне пегилированного нейбластина крысы у крыс и мышей.
Исследовали фармакокинетические свойства различных пегилированных и непегилированных продуктов ΝΒΝ в моделях на крысах и мышах.
- 18 009771
Результаты показали, что пегилирование ΝΒΝ ΝΚ крысы 3,3 ПЭГ, 10000 Да приводило к существенному воздействию на время полужизни и биодоступность нейбластина. После в/в введения 1 мг/кг крысам 8ргадие Эа\у1су. пиковые уровни пегилированного ΝΒΝ, составляющие 3000 нг/мл, регистрировали через 7 мин, и уровни 700 нг/мл регистрировали через 24 ч, 200 нг/мл - через 48 ч и 100 нг/мл - через 72 ч. В отличие от этого, для непегилированного ΝΒΝ после в/в введения 1 мг/кг уровни 1500 нг/мл регистрировали через 7 мин, но затем уровни быстро падали до 70 нг/мл через 3 ч и не регистрировались через 7 ч. Влияние пегилирования было даже более выраженным у животных, обработанных пегилированным ΝΒΝ при подкожном введении.
После п/к введения 1 мг/кг циркулирующие уровни пегилированного ΝΒΝ достигали максимума 200 нг/мл через 24 ч и сохранялись на указанном уровне в течение трех дней исследования. В отличие от этого, не наблюдали регистрируемого ΝΒΝ ни в какой временной точке после введения немодифицированного ΝΒΝ.
Анализы образцов пегилированного ΝΒΝ осложняются присутствием аддуктов, содержащих 2, 3 и 4 ПЭГ на молекулу, каждый из которых будет демонстрировать различный ФК-профиль. В ранних ФКисследованиях использовали мышей, чтобы обеспечить скрининг множества выбранных для исследования веществ и способов введения. Исследования на мышах выявили поразительные различия в биодоступности выбранных веществ. Однако в том случае, когда оценивали аддукт 3,3 ПЭГ 10 кДа у крыс, обнаружили, что он менее биодоступен у крыс, чем у мышей. Указанное различие в биодоступности было особенно выражено после в/б введения. Уровни у мышей достигали 1600 нг/мл через 7 ч и сохранялись на уровне 400 нг/мл через 24 ч. Напротив, уровни у крыс были постоянными при 100 нг/мл в течение 448 ч.
Как нейбластин крыс дикого типа (М-ΝΒΝ), так и нейбластин с заменой Аки на Ьук в положении 95 (ΝΚ-ΝΒΝ) подвергали свертыванию и очищали до > 95% для тестов на эффективность в модели невропатии у диабетических крыс δΤΖ. ΝΒΝ дикого типа готовили в композиции для непосредственного исследования на животном, тогда как ΝΚ-ΝΒΝ готовили для пегилирования ПЭГ-8РА 10 кДа. Для осуществления свертывания и в целях очистки разработали способ свертывания с использованием эксклюзионной хроматографии по размеру (8ЕС), который позволяет проводить ренатурацию ΝΒΝ из телец включения Е. сой в больших количествах и при высоких концентрациях. Для повышения чистоты конечного белка дополнительно к 8ЕС применяли стадии хроматографии как на колонке с Νί-ΝΤΑ, так и на колонке с диоксидом кремния СМ. Белки подвергали всесторонней характеризации, включая анализ с помощью электрофореза в δΌδ-ПААГ, эксклюзионную хроматографию по размеру, Е8М8, оценку активности в ЕБ18А ΚΙΒΑ и определение содержания эндотоксина. 8Э8-ПАЛГ и 8ЕС конечных белковых продуктов показал чистоту более 95%. Уровень эндотоксина в каждом продукте составлял <0,2 ЕИ/мг. Удельная активность обоих белков в ЕБ18А К1ВА составляет примерно 10 нМ. ΝΒΝ дикого типа готовили в концентрации 1,0 мг/мл, а ΝΚ-ΝΒΝ готовили в концентрации 2,6 мг/мл в фосфатно-солевом буфере (ΡΒδ), рН 6,5. ΝΒΝ дикого типа делили на аликвоты в пробирки объемом 15 мл и хранили замороженными при -70°С, тогда как ΝΚ-ΝΒΝ перед разделением на аликвоты и замораживанием подвергали пегилированию.
Пример 5. Свертывание нейбластина дикого типа и мутеина нейбластина Ν95Κ.
Обе формы ΝΒΝ экспрессировали в Е. сой в виде Ηίκ-меченых слитых белков с сайтом расщепления энтерокиназой, непосредственно прилежащим к началу зрелой последовательности из 113 аминокислот. Бактерии, экспрессирующие либо ΝΒΝ дикого типа (1,8 кг осадка), либо ΝΚ-ΝΒΝ (2,5 кг осадка), подвергали лизису в 2 л ΡΒδ, используя пресс Саийп. После центрифугирования (10000 об/мин) для осаждения телец включения из каждого препарата удаляли надосадки. Осадки телец включения два раза промывали буфером (0,02 М Трис-НС1, рН 8,5, 0,5 мМ ЕИТА), затем два раза промывали таким же буфером, содержащим Тритон Х-100 (2%, об./об.), с последующими двумя дополнительными промывками буфером без детергента. Оба осадка солюбилизировали с использованием 6 М гуанидингидрохлорида, 0,1 М Триса, рН 8,5, 0,1 М ДТТ и 1 мМ ЕИТА. Чтобы способствовать процессу солюбилизации каждый осадок подвергали гомогенизации с использованием гомогенизатора Ро1у!гоп с последующим перемешиванием в течение ночи при комнатной температуре. Растворимые белки осветляли центрифугированием перед денатурирующей хроматографией через 8ирегбех 200 (колонка объемом 5,5 л, уравновешенная 0,05 М глицином/Н3РО4, рН 3,0 с 2 М гуанидин-НС1) при скорости 20 мл/мин.
Денатурированный ΝΒΝ идентифицировали в 808-ПААГ. Фракции, содержащие либо ΝΒΝ дикого типа, либо ΝΚ-ΝΒΝ, объединяли и концентрировали примерно до 250 мл, используя концентратор клеток с мешалкой Аткоп объемом 2,5 л. После фильтрования для того, чтобы удалить какой-либо осадок, концентрированный белок подвергали ренатурирующей хроматографии по размеру через 8ирегбех 200, уравновешенный 0,1 М Трис-НС1, рН 7,8, 0,5 М гуанидин-НС1, 8,8 мМ восстановленным глутатионом и 0,22 мМ окисленным глутатионом. Колонку обрабатывали, используя 0,5 М гуанидин-НС1 при скорости 20 мл/мин. Фракции, содержащие ренатурированный ΝΒΝ дикого типа или ΝΚ-ΝΒΝ, идентифицировали в δΌδ-ПААГ, объединяли и хранили при 4°С вплоть до того, как требовалось удалить Н1к-метку.
- 19 009771
Концентрирование ΝΒΝ при Νί-ΝΤΑ-хроматографии (ТК5919-138)
Ренатурированный ΝΒΝ хранили при 4°С по меньшей мере в течение 24 ч до осуществления очистки, чтобы стимулировать дисульфидное образование между мономерами ΝΒΝ. За это время образовывался осадок, и его удаляли фильтрованием через фильтровальную установку 0,2 мк РЕЗ. Чтобы уменьшить неспецифичное связывание, концентрацию имидазола в растворе белка доводили до 20 мМ перед загрузкой на колонку Νί-ΝΤΑ (01ацеп) объемом 100 мл, уравновешенную буфером для колонки (0,5 М гуанидин и 20 мМ имидазол) со скоростью 50 мл/мин. После нанесения белка колонку промывали до установления базовой линии тем же самым буфером. ΝΒΝ элюировали из смолы, используя примерно 300 мл элюируирующего буфера, содержащего 0,5 М гуанидин-НС1 и 0,4 М имидазол. После элюирования ΝΒΝ диализовали в течение ночи (используя диализные трубки на 10 кДа) при комнатной температуре против десяти объемов 5 мМ НС1. Диализ стимулировал гидролиз загрязняющих веществ и снижал концентрации гуанидин-НС1 и имидазола до 0,05 М и 0,04 М, соответственно.
Отщепление Н18-метки лизилэндопептидазой или энтерокиназой
На следующий день любой осадок, который образовывался во время диализа, удаляли фильтрованием. Концентрацию ΝαΟ в образце белка делали равной 0,1 М добавлением 5 М маточного раствора до конечной концентрации соли, при этом он содержал примерно 150 мМ остаточного гуанидин-НС1. Указанную концентрацию подтверждали с использованием измерителя проводимости. Кроме того, добавляли 1 М НЕРЕ8, рН 8, до конечной концентрации 25 мМ. Чтобы отщепить метку, к ΝΒΝ дикого типа добавляли лизилэндопептидазу и к ΝΚ-ΝΒΝ добавляли энтерокиназу, оба фермента примерно при соотношении протеазы к ΝΒΝ 1:300. В случае ΝΚ-ΝΒΝ использовали энтерокиназу вместо лизилэндопептидазы из-за дополнительного сайта расщепления в мутантном белке у Ьу895. Образцы перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и расщепление контролировали с помощью электрофореза в 8Ό8ПААГ.
Удаление Н18-метки Νί-ΝΤΑ-хроматографией
Обработанный протеазой ΝΒΝ наносили на колонку Νί-ΝΤΑ объемом 100 мл, уравновешенную 0,5 М гуанидин-НС1 и 20 мМ имидазолом, со скоростью 50 мл/мин. Колонку промывали до установления базовой линии таким же буфером. Любой белок, вымываемый из колонки, объединяли с протекающим белком, содержащим ΝΒΝ без Н18-метки.
Хроматография на диоксиде кремния СМ
После Νί-ΝΤΑ-хроматографии белок сразу же подвергали дальнейшей очистке пропусканием через смолу на основе диоксида кремния СМ. На колонку с диоксидом кремния объемом 20 мл, уравновешенную буфером для нанесения (5 мМ фосфат, рН 6,5, 150 мМ №1С1). загружали ΝΒΝ со скоростью 20 мл/мин. Колонку промывали двадцатью объемами колонки буфера для промывки (5 мМ фосфат, рН 6,5, 400 мМ №1С1) и белок элюировали элюирующим буфером, содержащим 5 мМ фосфат, рН 6,5, но 1 М №С1. Элюированный белок диализовали в течение ночи против одного фосфата, чтобы понизить концентрацию соли до 100 мМ в случае ΝΚ-ΝΒΝ и 150 мМ в случае ΝΒΝ дикого типа. Оба образца фильтровали через фильтровальную установку 0,2 мк РЕ8, анализировали в 808-ПААГ и хранили при 4°С вплоть до того, как требовалась дальнейшая характеристика и/или пегилирование.
ΝΒΝ дикого типа и ΝΚ-ΝΒΝ подвергали анализу в отношении УФ-спектров, чтобы оценить их поглощение при 280. Используя кварцевую микрокювету и обнуление по сравнению с одним буфером, 100 мкл либо ΝΒΝ дикого типа, либо ΝΚ-ΝΒΝ непрерывно сканировали от 230 до 330 нм, используя спектрофотометр Βесктаη. На основе данного анализа определили, что концентрация ΝΒΝ дикого типа составляла 1,1 мг/мл, а концентрация ΝΚ-ΝΒΝ - 2,6 мг/мл (для каждого белка использовали А280 нм-Е0,1%=0,5). Менее 1 % осажденного вещества идентифицировали на основе поглощения при 330 нм.
Чтобы оценить чистоту обоих препаратов белка, каждый образец (0,5 мг) подвергали эксклюзионной хроматографии по размеру через колонку 16/30 Зирегбех 75. Колонку уравновешивали 5 мМ фосфатом, рН 6,5, содержащим 400 мМ №С1, и обрабатывали при скорости потока 1,5 мл/мин. На основании поглощения при 280 нм и ΝΒΝ дикого типа и ΝΚ-ΝΒΝ мигрировали в виде отдельного пика с ожидаемой молекулярной массой (23-24 кДа) и они не содержали какого-либо существенного загрязнения белка.
И ΝΒΝ дикого типа, и ΝΚ-ΝΒΝ восстанавливали в 2,5 М гуанидин-НС1, 60 мМ Трис, рН 8,0 и 16 мМ ДТТ. Восстановленные образцы обессоливали на короткой колонке С4 и анализировали в оперативном режиме с помощью Е8М8, используя тройной квадрупольный прибор. Исходные данные Е8М8 подвергали развертке с помощью программы МахЕп!, чтобы создать масс-спектр. Данный способ позволяет свести множественные заряженные сигналы в один пик, который прямо соответствует молекулярной массе в килодальтонах (кДа). Развернутый масс-спектр для ΝΒΝ дикого типа показал, что преобладающий вид имеет М. м. 12046 кДа, которая соответствует рассчитанной молекулярной массе 12046,7 кДа для формы белка из 113 аминокислот. Также наблюдали минорный компонент (12063 кДа), свидетельствующий о присутствии продукта окисления. В образце ΝΚ-ΝΒΝ идентифицировали три пика. Основной компонент показал видимую молекулярную массу 11345 кДа в соответствии с рассчитан
- 20 009771 ной массой для формы белка из 106 аминокислот. Два других пика имели массы 11362 и 12061 кДа, что свидетельствовало об окислении ΝΚ-ΝΒΝ и присутствии формы из 113 аминокислот, соответственно.
Присутствие в препарате ΝΚ-ΝΒΝ форм из 106 и 113 аминокислот можно отнести к расщеплению энтерокиназой. Указанная протеаза от Вюхуте является препаратом природного фермента, очищенного из слизистой оболочки кишечника теленка, и по сообщениям содержит небольшую примесь трипсина (0,25 нг трипсина на мкг энтерокиназы). Таким образом, трипсин может действовать на ΝΚ-ΝΒΝ с карбоксиконцевой стороны Агд7, продуцируя преобладающую форму из 106 аминокислот. С другой стороны, лизилэндопептидаза, используемая для расщепления ΝΒΝ дикого типа, обладает единственной протеазной активностью, действуя с карбоксиконцевой стороны остатка лизина, находящегося в области Ηίδ-метки, давая форму зрелого ΝΒΝ из 113 аминокислот. Обе формы ΝΒΝ из 106 и 113 аминокислот одинаково активны во всех исследованных анализах и проявляют сходство в тестах на стабильность в гуанидин-НС1.
Активность ΝΒΝ определяли по его способности стимулировать фосфорилирование с-КЕТ в клетках ΝΒ41А3-1ПВБ3 с использованием ЕЬ18А К1КА, описанного в примере 3. Фосфорилирование КЕТ определяли при инкубации (2 ч) иммобилизованного рецептора с конъюгированным с НКР антителом против фосфотирозина (4С10; 0,2 мкг на лунку). После инкубации лунки шесть раз промывали ТВ8Т и затем активность НКР регистрировали при 450 нм с помощью колориметрического анализа. Измеряли значения оптической плотности для лунок, обработанных лизатом или одним лизирующим буфером, корректировали относительно фона и данные наносили на график в виде функции концентрации нейбластина, присутствующего в активационной смеси. Данные показывают, что очищенный ΝΒΝ приводил к появлению фосфорилированного КЕТ, что свидетельствует о том, что очищенный ΝΒΝ был активным в данном анализе.
Пример 6. Получение конъюгата сывороточный альбумин-нейбластин.
Нейбластин крысы дикого типа в концентрации 1 мг/мл в РВ8 обрабатывали 1 мМ сульфо-8МСС (Р1егсе) и обессоливали, чтобы удалить избыток перекрестно сшивающего агента. Так как белок ΝΒΝ дикого типа содержит только единственный амин на своем Ν-конце и не имеет свободных сульфгидрильных групп, предполагали, что результатом реакции с 8МСС будет сайт-специфичная модификация ΝΒΝ посредством 8МСС, связанным с Ν-концом.
мкг конъюгата ΝΒΝ-ЗМСС инкубировали с 120 мкг бычьего сывороточного альбумина и анализировали в отношении степени перекрестного сшивания в δΌδ-ПААГ. БСА содержит одну свободную δΗ-группу и, следовательно, ожидается, что реакция с конъюгатом ΝΒΝ-ЗМСС приведет к модификации в указанном сайте посредством малеимида на δΜСС. При указанных условиях наблюдали две дополнительные полосы с более высокой молекулярной массой, которые соответствуют по массе модификации ΝΒΝ одним БСА-компонентом и двумя молекулами БСА, так как каждая молекула ΝΒΝ содержит два Νконца, которые могут подвергаться реакции и, следовательно, полосы согласуются с данной точкой зрения. Образованию указанных полос сопутствовало уменьшение интенсивности полос NΒN-δΜСС и БСА. На основании интенсивности остающейся полосы ΝΒΝ, реакция, по-видимому, протекала до завершения на 70-80%.
Однозамещенный продукт очищали от реакционной смеси, подвергая материал катионообменной хроматографии и эксклюзионной хроматографии по размеру на колонке δиρе^άеx 200 (РБагтас1а), по существу, как описано для обсуждаемых выше исследований пегилирования. Фракции с колонки при гель-фильтрации анализировали в δΌδ-ПААГ, и фракции, содержащие однозамещенный продукт, анализировали в отношении содержания белка по оптической плотности при 280 нм. Так как масса БСА примерно в два раза выше массы нейбластина, кажущуюся концентрацию делили на 3, чтобы получить эквивалент ΝΒΝ. Указанную фракцию подвергали анализу в отношении функции в ЕЬКА К1КА. Значения 1С50 и для ΝΒΝ дикого типа, и для БСА-конъюгированного ΝΒΝ составляли 3-6 нМ, свидетельствуя о том, что конъюгация с БСА не мешает функционированию.
Хотя указанные предварительные исследования проводили с БСА, соответствующие белки сывороточного альбумина крыс и человека также содержат свободную группу δΗ. Следовательно, сходный способ можно применять для создания конъюгата сывороточный альбумин крысы-ΝΒΝ крысы для проведения исследований ФК и эффективности у крыс и конъюгата сывороточный альбумин человека-ΝΒΝ человека для проведения клинических испытаний. Подобным образом δΜСС можно заменить любым из ряда перекрестно сшивающих агентов, которые содержат группу, реагирующую с аминогруппой, с одной стороны, и группу, реагирующую с тиолом, с другой стороны. Примерами перекрестно сшивающих агентов, реагирующих с амином, которые встраивают реагирующий с тиолом малеимид, являются ΑΜΑδ, ΒΜРδ, ΜΒδ, ЕΜСδ, δΜРΒ, δΜРΗ, КМ^ или 6ΜΒδ, примерами агентов, которые встраивают реагирующую с тиолом галогенацетатную группу, являются δΒΑР, δ^. δIΑΒ, и примерами агентов, которые предоставляют защищенный или незащищенный тиол для реакции с сульфгидрильными группами с получением восстанавливаемой связи, являются δΕΩ?, δΜРТ, δΑТΑ или δΑТР, которые все доступны из Р1егсе. Такие перекрестно сшивающие агенты являются только примерными, и допустимы многие альтернативные способы связывания Ν-конца ΝΒΝ с сывороточным альбумином. Специалист в данной области также может создать конъюгаты с сывороточным альбумином, мишенью в которых не является
- 21 009771
Ν-конец ΝΒΝ или тиольный компонент сывороточного альбумина. Также предполагается, что функциональными будут слияния ΝΒΝ-сывороточный альбумин, созданные с использованием генетической инженерии, когда ΝΒΝ сливают с геном сывороточного альбумина на Ν-конце, С-конце или на обоих концах.
Данный способ можно распространить посредством обычного адаптирования на любой конъюгат ΝΒΝ-сывороточный альбумин, результатом которого может быть продукт с пролонгированным временем полужизни у животных и, следовательно, у человека.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> В1одеп, 1пс.
5аЬ, ОгпаЬ Η.Υ.
Рерхпвку, В1аке В
ВогД аск-8]о<Нп, Раи1а Апп
М111ег, Зкеркап 8
Новзотапдо, АпЪЬопу <120> Конъюгаты нейбластина с полимерами и способы их применения <130> 00689-506-061 <140> Еще не переуступлена <141> 2002-01-23 <150> 60/266,071 <151> 2001-02-01 <160> 13 <170> Патент, версия 2.1 <210> 1 <211> из <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: консенсусная последовательность <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (3) <223> Где Хаа является О1у или ТЬг <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (4) <22Э> Где Хаа является Рго или Агд <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (5) <223> Где Хаа является 61у или 8ег <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (10) <223> Где Хаа является А1а или ТЬг <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (11) <223 > Где Хаа является А1а или ТЬг
- 22 009771
<220> | |
<221> | ВАРИАНТ |
<222> | (12) |
<223> | Где Хаа является С1у или Азр |
<220> | |
<221> | ВАРИАНТ |
<222> | (26) |
<223> | Где Хаа является Агд или 8ег |
<220> | |
<221> | ВАРИАНТ |
<222> | (33) |
<223> | Где Хаа является Агд или 8ег |
<220> | |
<221> | ВАРИАНТ |
<222> | (38) |
<223 > | Где Хаа является Уа1 или Не |
<220> | |
<221> | ВАРИАНТ |
<222> | (51) |
<223> | Где Хаа является Уа1 или Не |
<220> | |
<221> | ВАРИАНТ |
<222> | (53) |
<223 > Гдб Χαΰ яште!иЯ Рги ИлИ ΟΙιι <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (69) <223 > Где Хаа является Рго или Зег <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (76) <223> где Хаа является Уа1 или Не <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (103) <223> Где Хаа является Агд или ΗΪ5 <400> 1
А1а С1у Хаа Хаа Хаа Зег Агд А1а Агд Хаа Хаа Хаа А1а Ахд О1у Суя 15 1015
Агд Ьеи Ахд 8ег С1п Ьеи Уа1 Рго Уа1 Хаа А1а Ьеи С1у Ьеи О1у Н1в
2530
Хаа Зег Авр О1и Ьеи Хаа Ахд РЬе Агд РЬе Сув Зег О1у вег Суя Агд Ахд 35 4045
А1а Агд Зег Хаа Н1в Авр Ьеи Зег Ьеи А1а Зег Ьеи Ьеи С1у А1а О1у
55 6085
- 23 009771
АБа | Ьеи | Агд | Хаа | Рго | Рго | СБу | Зег | Агд | Рго | Хаа | Зег | О1п | Рго | Суз | Суз |
70 | 75 | 80 | |||||||||||||
Рго | ТЬг | Агд | Туг | б1и | А1а | Уа1 | Зег | РЬе | МеЬ | Авр | Уа1 | Азп | Зег | ТЬг | Тгр |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Агд | ТЬг | Уа1 | Авр | Хаа | Ьеи | Зег | А1а | ТЬг | АБа | Суз | С1у | Суз | Ьеи | О1у |
100 105 110 <210> 2 <211> 113 <212> Белок <213> Ното вар1еп8 <400> 2
А1а СБу С1у Рго <31у Зег Агд | А1а | Агд А1а А1а <31у А1а Агд О1у Сув | |||||||||||||
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Агд | Ьеи | Агд | Зег | (31п | Ьеи | Уа1 | Рго | Уа1 | Агд | А1а | Ьеи | <31у | Ьеи | 61у | ΗΪ5 |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Агд | Зег | Авр | <31и | Ьеи | Уа1 | Агд | РЬе | Агд | РЬе | Сув | Зег | О1у | Зег | Сув | Агд |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Агд | А1а | Агд | Зег | Рго | ΗΪ8 | Авр | Ьеи | Зег | Ьеи | А1а | Зег | Ьеи | Ьеи | <31у | А1а |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
С1у | А1а | Ьеи | Агд | Рго | Рго | Рго | С1у | Зег | Агд | Рго | Уа1 | Зег | С1п | Рго | Сув |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Сув | Агд | Рго | ТЬг | Агд | Туг | <31и | А1а | Уа1 | Зег | РЬе | МеС | Авр | Уа1 | Азп | Зег |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
ТЬг | Тгр | Агд | ТЬг | Уа1 | Азр | Агд | Ьеи | Зег | А1а | ТЬг | АБа | Суз | О1у | Суя | Ьеи |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
С1у |
<210> 3 <211> 113 <212> Белок <213> Миз тизсиБиз | ||||||||||||
<400> 3 А1а О1у ТЬг | Агд | Зег | Зег | Агд | А1а | Агд | ТЬг | ТЬг | Авр | А1а | Агд | <Э1у Сув |
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||
Агд Ьеи Агд | Зег | αΐη | Ьеи | Уа1 | Рго | Уа1 | Зег | А1а | Ьеи | С1у | Ьеи | О1у Н18 |
20 | 25 | 30 | ||||||||||
Зег Зег Авр | С1и | Ьеи | 11е | Агд | РЬе | Агд | РЬе | Сув | Зег | С1у | Зег | Сув Агд |
35 | 40 | 45 |
- 24 009771
Агд | А1а 50 | Агд | Зег | О1п | Нхв | Авр 55 | Ьеи | Зег | Ьеи | А1а | Зег 60 | Ьеи | Ьеи | <31у | А1а |
(31у 65 | А1а | Ьеи | Агд | Зег | Рго 70 | Рго | О1у | Зег | Агд | Рго 75 | Не | Зег | (31п | Рго | Суз 80 |
Суз | Агд | Рго | ТЬг | Агд 35 | Туг | <31и | А1а | Уа1 | зег 90 | РЬе | Меб | Азр | Уа1 | Аяп 95 | Зег |
ТЬг | Тгр | Агд | ТЫ 100 | Уа1 | Азр | Нхв | Ьеи | Зег 105 | А1а | ТЫ | А1а | Сув | О1у 110 | Сув | Ьеи |
С1у |
<210> 4 <211> 113 <212> Белок <213» КаССиз погуедхсиз <400> 4
А1а С1у ТЬг Агд Зег Зег Агд А1а Агд А1а ТЫ Аяр А1а Агд С1у Суз | |||||||||||||||
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Агд | Ьеи | Агд | Зег | О1п | Ьеи | Уа1 | Рго | Уа1 | Зег | А1а | Ьеи | <з1у | Ьеи | С1у | Н1з |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Зег | Зег | Азр | С1и | Ьеи | 11е | Агд | РЬе | Агд | РЬе | Сув | Зег | С1у | Зег | Сув | Агд |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Агд | А1а | Агд | Зег | Рго | Нхз | Азр | Ьеи | Зег | Ьеи | А1а | Зег | Ьеи | Ьеи | С1у | А1а |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
О1у | А1а | Ьеи | Агд | Зег | Рго | Рго | С1у | Зег | Агд. Рго | 11е | Зег | О1п | Рго | Суз | |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Суз | Агд | Рго | ТЬг | Агд | Туг | С1и | А1а | Уа1 | Зег | РЬе | МеЬ | Азр | Уа1 | Азп | Зег |
35 | 90 | 95 | |||||||||||||
ТЬг | Тгр | Агд | ТЬг | Уа1 | Азр | Нхв | Ьеи | Зег | А1а | ТЬг | А1а | Суз | С1у | Суз | Ьеи |
100 | 105 | 110 |
О1у <210» 5 <211> 675 <212> ДНК <213> ВаЫив погхедЬсиз <400» 5 аЬддаасбдд дасЬЪддада дссЬасЬдса СЬдбсссасЬ дссЬссддсс ЬаддСддсаа 60 ссадссЬЪдС ддссаасссб адсЪдсЬЫа дсссСдсЬда дсадсдЬсас адаадсЬЬсс 120 сЬддасссаа ЪдЬсссдсад ссссдссЬсЬ сдсдаСд+Ьс ссЬсдссддь ссбддсдссс 180
- 25 009771 ссаасадасЬ ассЪассСдд дддасасасс дсасабсЬдС дсадсдааад адсссЬдсда 240 ссассдссдс адбсСссЬса дсссдсассс ссассассдд дЬсссдсдсС ссадЬсЬссЬ 300 сссдсЬдсдс Сссдсддддс асдсдсддсд сдкдсаддаа сссддадсад ссдсдсасдд 360 дсбасадабд сдсдсддсбд ссдссьдсдс ЬсасадсЪдд бдссддбдад сдсСсЬсддс 420 сСдддссаса дсЪссдасда дсСдабасдб ЬСссдсЪЬсЪ дсадсддЬЬс дСдссдссда 480 дсасдсЬссс сдсасдаЬсЬ садссЬддсс адссЬдсбдд дсдссддддс сскдсддЬск 540 ссЪсссдддЬ сссддссдаЪ садссадссс ЬдЪЪдссддс ссасЪсдсба ЬдаддсадЪс 600 ЬссСЬсаСдд асдЪдаасад сассЪддада ассдСддасс аСсСсЬссдс сассдсскдс 660 ддссдЬсбдд дсЪда 675 <210> 6 <211> 57 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223* Описание искусственной последовательности: К02-310 Олигонуклеотид <400> 6 дЬаЪсСЫгса Ьддасдбааа дЬсЬасаедд адаассдЪад аЪсаЬсбаЬс Ъдсаасс 57 <210> 7 <211> 57 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: КОЗ-211 Олигонуклеотид <400> 7 ддЬЬдсадаЬ адаЪдаСсСа сддСЬсЬсса ЪдЬадасЬЪЬ асдЬссаЬда аадаЬас 57 <2Ю> 8 <211> 50 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: КОЗ-254
Олигонуклеотид <400> В дсСддаасСс дсадсГсСсд ГдсЪсдЪдса асддаЬдсаа ааддсЪдСсд 50 <210> 9 <211> 50 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: КО2-255
- 26 009771
Ол игонуклеотид <400> 9 сдасадссСС ССдсаСссдС Сдсасдадса сдададсСдс дадЪСссадс 50 <210> 10 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: КОЗ-258
Олигонуклеотид <400» 10 ддадссддад сасеааааСс Сссссдддас ссадасс 37 <210> 11 <211> 38 <212> ДНК <213 > Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: КОЗ-289
Олигонуклеотид <400> 11 ддСсСадаСс ссдддддада ССССадСдсб ссддсСсс 38 <210> 12 <211> 32 <212» ДНК <213» Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: КОЗ-266
Олигонуклеотид <400> 12 дасдааЬСаа СбаадСССсд СССССдЬСса дд 32 <210> 13 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: КОЗ-287 Олигонуклеотид <400> 13 ссСдаасааа аасдааасСС ааССааСЬсд Сс 32
Claims (34)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Полипептид нейбластина, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотам 8-113 8Е0 Ш ΝΟ: 1, имеющий по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из:(a) аминокислоты, отличной от аргинина, в положении 14 8Е0 Ш ΝΟ: 1;(b) аминокислоты, отличной от аргинина, в положении 39 8Е0 Ш ΝΟ: 1;(c) аминокислоты, отличной от аргинина, в положении 68 8Е0 Ш ΝΟ: 1; и (б) аминокислоты, отличной от аспарагина, в положении 95 8Е0 Ш ΝΟ: 1, причем полипептид, если он димеризован, связывается с ОЕКо.3.
- 2. Полипептид по п.1, в котором аминокислота в положении 95 8Е0 Ш ΝΟ: 1 представляет собой аминокислоту, отличную от аспарагина.- 27 009771
- 3. Полипептид по п.1 или 2, в котором аминокислота в положении, соответствующем положению 95 8Е0 ГО ΝΟ: 1, представляет собой лизин.
- 4. Полипептид по любому из предшествующих пунктов, содержащий аминокислоты 8-113 8Е0 ГО ΝΟ: 2, 8Е0 ГО ΝΟ: 3 или 8Е0 ГО ΝΟ: 4, в котором аспарагин в положении 95 заменен на другую аминокислоту.
- 5. Полипептид нейбластина, содержащий аминокислоты 1-113 8ЕО ГО ΝΟ: 2, 8ЕО ГО ΝΟ: 3 или 8ЕО ГО ΝΟ: 4, в котором аспарагин в положении 95 заменен на лизин.
- 6. Полипептид по любому из пп.1-3, где аминокислотная последовательность по меньшей мере на 95% идентична аминокислотам 8-113 8ЕО ГО ΝΟ: 1.
- 7. Полипептид по любому из пп.1-3, где аминокислотная последовательность по меньшей мере на 95% идентична аминокислотам 8-113 8ЕО ГО ΝΟ: 2.
- 8. Гибридный белок, содержащий полипептид по любому из предшествующих пунктов, слитый со вторым компонентом.
- 9. Гибридный белок по п.8, где вторым компонентом является сывороточный альбумин человека.
- 10. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по любому из пп.1-7.
- 11. Нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок по п.8 или 9.
- 12. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.10.
- 13. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.11.
- 14. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.12.
- 15. Клетка-хозяин по п.14, где клеткой-хозяином является клетка яичника китайского хомячка.
- 16. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.13.
- 17. Клетка-хозяин по п.15, где клеткой-хозяином является клетка яичника китайского хомячка.
- 18. Способ получения полипептида по любому из пп.1-7, включающий:(a) культивирование клетки-хозяина по п.14 или 16 в условиях, обеспечивающих экспрессию полипептида по любому из пп.1-7, и (b) выделение указанного полипептида.
- 19. Способ получения гибридного белка по п.8 или 9, включающий:(a) культивирование клетки-хозяина по п.15 или 17 в условиях, обеспечивающих экспрессию гибридного белка по п.8 или 9, и (b) выделение указанного гибридного белка.
- 20. Димер, содержащий два полипептида по любому из пп.1-7.
- 21. Димер, содержащий два слитых белка по любому из пп.8 или 9.
- 22. Конъюгат, содержащий полипептид по любому из пп.1-7 и неприродный полимер.
- 23. Конъюгат, содержащий гибридный белок по любому из пп.8 или 9 и неприродный полимер.
- 24. Конъюгат по п.22 или 23, где полимер представляет собой полиалкиленгликоль.
- 25. Конъюгат по п.24, где полиалкиленгликоль представляет собой полиэтиленгликоль.
- 26. Конъюгат по п.25, где полиалкиленгликоль связан с остатком лизина, введенным в качестве замены в положение 14, 39, 68 или 95 в 8ЕО ГО ΝΟ: 1, 8ЕО ГО ΝΟ: 2, 8ЕО ГО ΝΟ: 3 или 8ЕО ГО ΝΟ: 4 полипептида нейбластина, или с его Ν-концом.
- 27. Конъюгат по любому из пп.22-26, в котором соответствующий полипептид гликозилирован.
- 28. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид по любому из пп.1-7 и физиологически приемлемый носитель.
- 29. Фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок по п.8 или 9 и физиологически приемлемый носитель.
- 30. Фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат по любому из пп.22-27 и физиологически приемлемый носитель.
- 31. Применение полипептида по любому из пп.1-7 для получения лекарственного препарата для лечения или профилактики заболевания или расстройства нервной системы.
- 32. Применение гибридного белка по п.8 или 9 для получения лекарственного препарата для лечения или профилактики заболевания или расстройства нервной системы.
- 33. Применение конъюгата по любому из пп.22-27 для получения лекарственного препарата для лечения или профилактики заболевания или расстройства нервной системы.
- 34. Применение по любому из пп.31-33, где заболеванием или расстройством является периферическая нейропатия или синдром нейропатической боли.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US26607101P | 2001-02-01 | 2001-02-01 | |
PCT/US2002/002319 WO2002060929A2 (en) | 2001-02-01 | 2002-01-25 | Polymer conjugates of neublastin and methods of using same |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA200300852A1 EA200300852A1 (ru) | 2004-06-24 |
EA009771B1 true EA009771B1 (ru) | 2008-04-28 |
Family
ID=23013042
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA200300852A EA009771B1 (ru) | 2001-02-01 | 2002-01-25 | Полипептид нейбластина, способы его получения и применения |
Country Status (36)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP1862475A1 (ru) |
JP (2) | JP4259868B2 (ru) |
KR (2) | KR100960063B1 (ru) |
CN (1) | CN1500095B (ru) |
AR (1) | AR035077A1 (ru) |
AT (1) | ATE365748T1 (ru) |
AU (1) | AU2002247037B2 (ru) |
BG (1) | BG66393B1 (ru) |
BR (1) | BR0206852A (ru) |
CA (1) | CA2436407C (ru) |
CY (1) | CY1106886T1 (ru) |
CZ (1) | CZ20032080A3 (ru) |
DE (1) | DE60220879T2 (ru) |
DK (1) | DK1355936T3 (ru) |
EA (1) | EA009771B1 (ru) |
EE (1) | EE05537B1 (ru) |
ES (1) | ES2289091T3 (ru) |
GE (1) | GEP20063916B (ru) |
HK (1) | HK1057759A1 (ru) |
HU (1) | HU228973B1 (ru) |
IL (2) | IL156941A0 (ru) |
IS (1) | IS2867B (ru) |
MX (1) | MXPA03006805A (ru) |
MY (1) | MY143685A (ru) |
NO (1) | NO332150B1 (ru) |
NZ (1) | NZ527863A (ru) |
PL (1) | PL211162B1 (ru) |
PT (1) | PT1355936E (ru) |
RS (1) | RS50857B (ru) |
SG (1) | SG149685A1 (ru) |
SI (1) | SI1355936T1 (ru) |
SK (1) | SK288123B6 (ru) |
TR (1) | TR200301208T2 (ru) |
UA (2) | UA100967C2 (ru) |
WO (1) | WO2002060929A2 (ru) |
ZA (1) | ZA200305733B (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2488635C1 (ru) * | 2012-03-22 | 2013-07-27 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития | Способ получения рекомбинантного антиангиогенного полипептида |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7442370B2 (en) | 2001-02-01 | 2008-10-28 | Biogen Idec Ma Inc. | Polymer conjugates of mutated neublastin |
WO2002060929A2 (en) * | 2001-02-01 | 2002-08-08 | Biogen, Inc. | Polymer conjugates of neublastin and methods of using same |
US7276580B2 (en) | 2001-03-12 | 2007-10-02 | Biogen Idec Ma Inc. | Neurotrophic factors |
EP1395279B1 (en) * | 2001-03-28 | 2011-10-05 | Biogen Idec MA Inc. | Use of neublastin polypeptides for treating neuropathic pain |
HUE028163T2 (en) * | 2002-01-18 | 2016-11-28 | Biogen Ma Inc | Polyalkylene polymer compounds and their use |
EA008743B1 (ru) * | 2003-01-31 | 2007-08-31 | Байоджен Айдек Ма Инк. | Полимерные конъюгаты мутантного неубластина |
NZ574121A (en) | 2003-04-18 | 2011-06-30 | Biogen Idec Inc | Polyethylene glycol-conjugated gylcosylated neublastin and uses thereof for treatment of pain |
BRPI0411243A (pt) | 2003-06-10 | 2006-07-11 | Nsgene As | método de produzir um polipeptìdio de neublastina biologicamente ativo, ácido nucléico, vetor de expressão, composição farmacêutica, célula, linha de células de compactação, mamìfero não-humano transgênico, dispositivo de cultura de células implantável, uso do vetor, método de tratar uma doença do sistema nervoso, e, polipetìdio de neublastina |
US7598059B2 (en) | 2003-10-02 | 2009-10-06 | Biogen Idec Ma Inc. | Neublastin expression constructs |
NZ553431A (en) | 2004-08-19 | 2010-04-30 | Biogen Idec Inc | Neublastin variants with decreased heparin binding |
CA2577690C (en) * | 2004-08-19 | 2013-08-06 | Biogen Idec Ma Inc. | Refolding transforming growth factor beta family proteins |
TWI501774B (zh) | 2006-02-27 | 2015-10-01 | Biogen Idec Inc | 神經性病症之治療 |
US20100056440A1 (en) * | 2006-03-01 | 2010-03-04 | Biogen Idec Ma Inc. | Compositions and methods for administering gdnf ligand family proteins |
JP2010503630A (ja) | 2006-09-15 | 2010-02-04 | クレアビリス・セラピューティクス・エスピーエー | HMGB1のBox−AおよびHMGB1のBox−A変異体のポリマー複合体 |
EP2142205B1 (en) * | 2007-05-01 | 2014-04-02 | Biogen Idec MA Inc. | Neublastin peptides for use in increasing vascularisation in tissue with impaired blood flow |
PL2773438T5 (pl) * | 2011-11-02 | 2022-01-17 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Chromatografia przeciążenia i elucji |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5770577A (en) * | 1994-11-14 | 1998-06-23 | Amgen Inc. | BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol |
WO1999043813A1 (en) * | 1998-02-27 | 1999-09-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Modified ciliary neurotrophic factor, method of making and methods of use thereof |
WO2000001815A2 (en) * | 1998-07-06 | 2000-01-13 | Nsgene A/S | Neurotrophic factors |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2354600A (en) * | 1998-12-09 | 2000-06-26 | Amgen, Inc. | Grnf4 a neurotrophic factor |
WO2002060929A2 (en) * | 2001-02-01 | 2002-08-08 | Biogen, Inc. | Polymer conjugates of neublastin and methods of using same |
-
2002
- 2002-01-25 WO PCT/US2002/002319 patent/WO2002060929A2/en active IP Right Grant
- 2002-01-25 EA EA200300852A patent/EA009771B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-01-25 CN CN028077539A patent/CN1500095B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-25 AT AT02714792T patent/ATE365748T1/de active
- 2002-01-25 MX MXPA03006805A patent/MXPA03006805A/es active IP Right Grant
- 2002-01-25 UA UAA200802148A patent/UA100967C2/ru unknown
- 2002-01-25 EE EEP200300355A patent/EE05537B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2002-01-25 AR ARP020100279A patent/AR035077A1/es not_active Application Discontinuation
- 2002-01-25 SK SK971-2003A patent/SK288123B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2002-01-25 CA CA2436407A patent/CA2436407C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-25 PL PL372101A patent/PL211162B1/pl unknown
- 2002-01-25 SI SI200230580T patent/SI1355936T1/sl unknown
- 2002-01-25 SG SG200504719-6A patent/SG149685A1/en unknown
- 2002-01-25 EP EP07110666A patent/EP1862475A1/en not_active Withdrawn
- 2002-01-25 IL IL15694102A patent/IL156941A0/xx unknown
- 2002-01-25 GE GE5240A patent/GEP20063916B/en unknown
- 2002-01-25 EP EP02714792A patent/EP1355936B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-25 DE DE60220879T patent/DE60220879T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-25 NZ NZ527863A patent/NZ527863A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-01-25 RS YUP-610/03A patent/RS50857B/sr unknown
- 2002-01-25 UA UA2003088104A patent/UA82983C2/ru unknown
- 2002-01-25 DK DK02714792T patent/DK1355936T3/da active
- 2002-01-25 ES ES02714792T patent/ES2289091T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-25 HU HU0500637A patent/HU228973B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2002-01-25 KR KR1020087022638A patent/KR100960063B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-01-25 CZ CZ20032080A patent/CZ20032080A3/cs unknown
- 2002-01-25 PT PT02714792T patent/PT1355936E/pt unknown
- 2002-01-25 KR KR1020037010127A patent/KR100872807B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-01-25 JP JP2002561497A patent/JP4259868B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-25 BR BR0206852-4A patent/BR0206852A/pt not_active Application Discontinuation
- 2002-01-25 TR TR2003/01208T patent/TR200301208T2/xx unknown
- 2002-01-25 AU AU2002247037A patent/AU2002247037B2/en not_active Ceased
- 2002-02-04 MY MYPI20020368A patent/MY143685A/en unknown
-
2003
- 2003-07-15 IL IL156941A patent/IL156941A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-07-17 IS IS6879A patent/IS2867B/is unknown
- 2003-07-24 ZA ZA2003/05733A patent/ZA200305733B/en unknown
- 2003-08-01 NO NO20033441A patent/NO332150B1/no not_active IP Right Cessation
- 2003-08-19 BG BG108111A patent/BG66393B1/bg unknown
- 2003-11-21 HK HK03108539A patent/HK1057759A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-09-21 CY CY20071101225T patent/CY1106886T1/el unknown
-
2008
- 2008-10-28 JP JP2008277469A patent/JP4423338B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5770577A (en) * | 1994-11-14 | 1998-06-23 | Amgen Inc. | BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol |
WO1999043813A1 (en) * | 1998-02-27 | 1999-09-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Modified ciliary neurotrophic factor, method of making and methods of use thereof |
WO2000001815A2 (en) * | 1998-07-06 | 2000-01-13 | Nsgene A/S | Neurotrophic factors |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
BALOH R.H. ET AL.: "ARTEMIN, A NOVEL MEMBER OF THE GDNF LIGAND FAMILY, SUPPORTS PERIPHERAL AND CENTRAL NEURONS AND SIGNALS THROUGH THE GFRALPHA3 - RET RECEPTOR COMPLEX" NEURON, CAMBRIDGE, MA, US, vol. 21, no. 6, December 1998 (1998-12), pages 1291-1302, XP000857438, cited in the application abstract, figure 1 * |
BALOH ROBERT H. ET AL.: "Functional mapping of receptor specificity domains of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) family ligands and production of GFRalpha1 RET-specific agonists." JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 275, no. 5, 4 February 2000 (2000-02-04), pages 3412-3420, XP002216531, ISSN: 0021-9258, cited in the application the whole document * |
DELGADO C. ET AL.: "THE USES AND PROPERTIES OF PEG-LINKED PROTEINS" CRITICAL REVIEWS IN THERAPEUTIC DRUG CARRIER SYSTEMS, XX, XX, vol. 9, no. 3/4, 1992, pages 249-304, XP002930070, ISSN: 0743-4863, Whole document and in particular abstract, paragraphs C.1 and IV. * |
FRANCIS G.E. ET AL.: "PEGYLATION OF CYTOKINES AND OTHER THERAPEUTIC PROTEINS AND PEPTIDES: THE IMPORTANCE OF BIOLOGICAL OPTIMISATION OF COUPLING TECHNIQUES" INTERNATIONAL JOURNAL OF HEMATOLOGY, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, NL, vol. 68, no. 1, July 1998 (1998-07), pages 1-18, XP000791226, ISSN: 0925-5710, page 2 "1. PEGylation of protein and peptides". * |
REDDY K.R.: "CONTROLLED-RELEASE, PEGYLATION, LIPOSOMAL FORMULATIONS: NEW MECHANISMS IN THE DELIVERY OF INJECTABLE DRUGS" ANNALS OF PHARMACOTHERAPY, XX, XX, vol. 34, no. 7/8, July 2000 (2000-07), pages 915-923, XP001010043, ISSN: 1060-0280, Whole document and in particular, figure 3; table 1 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2488635C1 (ru) * | 2012-03-22 | 2013-07-27 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития | Способ получения рекомбинантного антиангиогенного полипептида |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4423338B2 (ja) | ニューブラスチンのポリマー結合体および同様の使用方法。 | |
US8119114B2 (en) | Polymer conjugates of mutated neublastin | |
AU2002247037A1 (en) | Polymer conjugates of neublastin and methods of using same | |
JP2011078434A (ja) | 変異ニューブラスチンのポリマー結合体 | |
CN113121668A (zh) | PEG修饰的可抑制gp96的多肽、其制备方法及用途 | |
KR20070032000A (ko) | 신규 카르바밀화된 epo 및 그의 제조 방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HC1A | Change in name of an applicant in a eurasian application | ||
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |