DE60220879T2 - Polymer-konjugate von neublastin und methoden für deren verwendung - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung bezieht sich allgemein auf Polypeptide und insbesondere auf modifizierte neurotrophe Polypeptide und Methoden zur Verwendung dieser modifizierten Polypeptide.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Neurotrophe Faktoren sind natürlich vorkommende Proteine, welche bei neuronalen Zellen und Geweben das Überleben fördern, die phänotypische Differenzierung aufrechterhalten, die Degeneration verhindern und die Aktivität verbessern. Neurotrophe Faktoren werden aus neuralem Gewebe und aus nicht-neuralem Gewebe, das durch das Nervensystem innerviert ist, isoliert, und sie werden in funktionell und strukturell verwandte Gruppen klassifiziert, welche auch als Familien, Superfamilien oder Subfamilien bezeichnet werden. Zu den Superfamilien der neurotrophen Faktoren gehören die Fibroblasten-Wachstumsfaktor-, die Neurotrophin- und die transformierende Wachstumsfaktor-β (TGF-β)-Superfamilien. Individuelle Spezies von neurotrophen Faktoren werden aufgrund ihrer physikalischen Struktur, ihrer Wechselwirkung mit ihren verwandten Rezeptoren und ihren Auswirkungen auf verschiedene Typen von Nervenzellen unterschieden. Innerhalb der TGF-β-Superfamilie sind die von der Gliazelllinie abstammenden Liganden von neurotrophen Faktoren (GDNF) klassifiziert, welche GDNF, Persephin (PSP) und Neurturin (NTN) enthalten.
  • Den Liganden der GDNF-Subfamilie gemeinsam ist ihre Fähigkeit zur Induktion von Signalgebung durch die RET-Rezeptor-Tyrosinkinase. Diese drei Liganden der GDNF-Subfamilie unterscheiden sich in ihrer relativen Affinität für eine Familie von neurotrophen Rezeptoren, den GFRα-Rezeptoren.
  • Ein kürzlich beschriebener neurotropher Faktor ist „Neublastin" oder „NBN". Neublastin wird der GDNF-Subfamilie zugeordnet, da es homologe Bereiche zu anderen GDNF-Liganden aufweist und wegen seiner Fähigkeit an RET-Protein zu binden und dieses zu aktivieren. Anders als andere GDNF-Liganden ist Neublastin hoch selektiv für den GFRα3-RET-Rezeptorkomplex. Zusätzlich enthält NBN einzigartige Subbereiche in seiner Aminosäuresequenz.
  • Leider wird Neublastin rasch vom Körper ausgeschieden. Diese rasche Clearance kann die Verwendung von Neublastin in therapeutischen Anwendungen beeinträchtigen. Daher ergibt sich die Notwendigkeit, Varianten von Neublastin zu identifizieren, die eine erhöhte Bioverfügbarkeit besitzen.
  • Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der Erfindung neuer Formen von Neublastin, welche verstärkte Eigenschaften in Bezug auf Pharmakokinetik und Bioverfügbarkeit in vivo zeigen. Diese neuen Formen umfassen Varianten von Neublastin-Polypeptiden konjugiert mit polymeren Molekülen.
  • In einer Ausführungsform stellt die Erfindung eine Variante eines Polypeptids von Neublastin oder ein Mutein-Polypeptid von Neublastin vor, welche(s) eine Aminosäuresequenz des reifen Neublastindimers mit einer oder mehreren Aminosäuresubstitution(en) an Positionen aufweist, die mit Lösungsmittel in Kontakt kommen. Durch die vorliegenden Substitutionen wird/werden in das native Polypeptid von Neublastin eine oder mehrere Stelle(n) eingeführt, an welchen Substanzen, wie beispielsweise natürlich vorkommende oder synthetische Polymere, an dem Polypeptid angebracht werden können, um dessen Löslichkeit und damit dessen Bioverfügbarkeit in vivo zu erhöhen. Vorzugsweise enthalten die vorliegenden Varianten der Polypeptide eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 70 % identisch zu Aminosäuren 8-113 von SEQ ID NO:1 ist. Die Variante des Neublastin-Polypeptids beinhaltet eine oder mehrere Aminosäuresubstitution(en), bei welcher/welchen eine andere Aminosäure als Arginin an Position 14 in der Aminosäuresequenz der Variante des Polypeptids auftritt, eine andere Aminosäure als Arginin an Position 39 in der Aminosäuresequenz der Variante des Polypeptids auftritt, eine andere Aminosäure als Arginin an der Position 68 in der Variante des Polypeptids auftritt oder eine andere Aminosäure als Asparagin an der Position 95 in der Variante des Polypeptids auftritt, wenn die Positionen der Aminosäuren entsprechend der Polypeptidsequenz von SEQ ID NO:1 nummeriert sind.
  • Der Ausdruck „Wildtyp-Neublastin" oder „wt-NBN", wie hierin benutzt, bezieht sich auf eine natürlich vorkommende oder native Neublastin-Polypeptidsequenz, wie beispielsweise diejenige von Ratte, Maus oder humanem Neublastin (siehe z. B. SEQ ID NO: 2, 3 oder 4). Spezifische Varianten von Polypeptiden von Neublastin werden hierin als „NBN-X1N1X2” oder „X1N1X2-NBN" bezeichnet, wobei X1 sich auf eine Aminosäure eines Polypeptids von Wildtyp-Neublastin und N1 sich auf die numerische Position der X1-Aminosäuren in der Sequenz bezieht, wie entsprechend in SEQ ID NO:1 nummeriert. X2 bezieht sich auf eine Aminosäure, die durch die Wildtyp-Aminosäure an der angegebenen numerischen Position in der Sequenz ersetzt wurde. Somit werden zum Beispiel durch NBN-N95K die Varianten des Neublastin-Polypeptids identifiziert, bei welchen das Asparagin an Position 95 durch ein Lysin ersetzt ist.
  • Die Variante des Neublastin-Polypeptids kann als ein multimeres Polypeptid bereitgestellt werden. Zum Beispiel kann die Variante des Polypeptids von Neublastin als ein Dimer bereitgestellt werden, welches mindestens eine Variante des Neublastin-Polypeptids enthält. In manchen Ausführungsformen ist das Dimer ein Homodimer von Varianten des Neublastin-Polypeptids. In anderen Ausführungsformen ist das Dimer ein Heterodimer, welches eine Variante des Neublastin-Polypeptids und ein Polypeptid von Wildtyp-Neublastin aufweist. Andere Dimere können zwei verschiedene Formen von Varianten des Neublastin-Polypeptids aufweisen.
  • In manchen Ausführungsformen enthält die Variante des Polypeptids von Neublastin Aminosäuren 1-7 von SEQ ID NO:1 zusätzlich zu Aminosäuren 8-113.
  • In bevorzugten Ausführungsformen bindet die Variante des Neublastin-Polypeptids, wenn sie dimerisiert ist, GFRα3. In zusätzlichen bevorzugten Ausführungsformen stimuliert die Variante des Polypeptids von Neublastin, wenn sie dimerisiert ist, entweder allein oder an GFRα3 gebunden, die Tyrosinphosphorylierung eines RET-Polypeptids.
  • In noch weiteren bevorzugten Ausführungsformen erhöht die Variante des Polypeptids von Neublastin, wenn sie dimerisiert ist, das Überleben der Neuronen, z. B. erhöht sie das Überleben eines sensorischen Neurons.
  • In noch weiteren bevorzugten Ausführungsformen normalisiert die Variante des Polypeptids von Neublastin, wenn sie dimerisiert ist, pathologische Veränderungen eines Neurons, wie beispielsweise eines sensorischen Neurons.
  • In noch weiteren bevorzugten Ausführungsformen erhöht die Variante des Polypeptids von Neublastin, wenn sie dimerisiert ist, das Überleben eines Neurons, z. B. eines autonomen Neurons oder eines dopaminergen Neurons.
  • In manchen Ausführungsformen beinhaltet die Variante des Polypeptids zwei, drei oder mehrere der Aminosäuresubstitutionen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, welche eine andere Aminosäure als Arginin an Position 14 in der Aminosäuresequenz der Polypeptidvariante, eine andere Aminosäure als Arginin an Position 39 in der Aminosäuresequenz der Polypeptidvariante, eine andere Aminosäure als Arginin an Position 68 der Polypeptidvariante und eine andere Aminosäure als Asparagin an Position 95 der Polypeptidvariante enthält.
  • In bevorzugten Ausführungsformen ist die Aminosäure an einer oder mehreren Positionen, 14, 39, 68 und 95, Lysin.
  • Vorzugsweise sind die Aminosäuren 8-94 und 96-113 der Variante des Neublastin-Polypeptids mindestens zu 90 % identisch zu Aminosäuren 8-94 und 96-113 von SEQ ID NO:1. Insbesondere sind die Aminosäuresequenzen mindestens zu 95 % identisch zu dieser. Idealerweise enthält die Aminosäuresequenz der Variante des Neublastin-Polypeptids die Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Neublastin-Polypeptids von Ratte, Mensch oder Maus an Aminosäuren 8-94 und 96-113 der Variante des Neublastin-Polypeptids. Zum Beispiel können die Aminosäuren 8-94 und 96-113 der Variante des Neublastin-Polypeptids die Aminosäuresequenz von Aminosäuren 8-94 und 96-113 von SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 enthalten.
  • Auch wird durch die Erfindung ein Fusionsprotein oder ein Polypeptid bereitgestellt, welches eine Variante des Neublastin-Polypeptids oder ein Polypeptid von Wildtyp-Neublastin oder ein Protein, welches ein Dimer von zwei Neublastin-Fusionsproteinen ist, enthält. Neublastin-Fusionsproteine weisen auch verbesserte Eigenschaften in Bezug auf Pharmakokinetik und Bioverfügbarkeit in vivo auf.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Nukleinsäuremolekül bereit, welches für eine Variante des Neublastin-Polypeptids kodiert. Die Nukleinsäure, die für die Variante des Neublastin-Polypeptids kodiert, wird vorzugsweise in einem Vektor bereitgestellt, z. B. einem Expressionsvektor. Eine Variante der Nukleinsäure von Neublastin, oder ein Vektor der diese enthält, kann in einer Zelle bereitgestellt werden. Bei der Zelle kann es sich z. B. um eine Säugetierzelle, Pilzzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder Bakterienzelle handeln. Eine bevorzugte Säugetierzelle ist eine Chinesische Hamsterovarzelle („CHO-Zelle").
  • Auch wird durch die Erfindung eine Methode bereitgestellt für die Herstellung einer Variante des Neublastin-Polypeptids durch Kultivierung einer Zelle, welche eine Nukleinsäure enthält, die für eine Variante der Neublastin-Nukleinsäuresequenz unter Bedingungen kodiert, welche die Expression einer Variante des Neublastin-Polypeptids erlauben. Falls gewünscht, kann die Variante des Neublastin-Polypeptids danach zurückgewonnen werden. Die Erfindung umfasst ferner die Variante des Neublastin-Polypeptids, die durch die Zelle hergestellt wird. Es werden hierin ähnliche Methoden zur Herstellung von Nukleinsäuren, Vektoren, Wirtszellen und Polypeptiden für die Fusionsproteine (wie beispielsweise die Neublastin-Serumalbumin-Fusionsproteine) dieser Erfindung offenbart.
  • Auch bereitgestellt durch die Erfindung wird eine Zusammensetzung, welche ein Neublastin-Polypeptid oder eine Variante des Neublastin-Polypeptids enthält, gekoppelt an ein nicht natürlich vorkommendes Polymer. Die Variante des Neublastin-Polypeptids in der Zusammensetzung enthält vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, welche mindestens zu 70 % identisch zu Aminosäuren 8-113 von SEQ ID NO:1 ist, unter der Voraussetzung, dass die Variante des Neublastin-Polypeptids eine oder mehrere Aminosäuresubstitution(en) enthält, welche aus der Gruppe ausgewählt wird/werden, die eine andere Aminosäure als Arginin an Position 14 in der Aminosäuresequenz der Variante des Polypeptids, eine andere Aminosäure als Arginin an Position 39 in der Aminosäuresequenz der Variante des Polypeptids, eine andere Aminosäure als Arginin an Position 68 der Variante des Polypeptids und eine andere Aminosäure als Asparagin an Position 95 der Variante des Polypeptids enthält, wobei die Positionen der Aminosäuren entsprechend der Polypeptidsequenz von SEQ ID NO:1 nummeriert sind.
  • In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Polymer einen Polyalkylenglykolanteil, z. B. einen Polyethylenglykolanteil (PEG).
  • In bevorzugten Ausführungsformen ist der Polyalkylenglykolanteil an eine Amingruppe des Neublastin-Polypeptids oder an ein Lysin in einer Variante des Neublastin-Polypeptids gekoppelt.
  • Die Kopplung kann über einen aktiven Ester von N-hydroxylsuccinimid (NHS) erfolgen. Der aktive Ester kann z. B. PEG Succinimidylsuccinat (SS-PEG), Succinimidylbutyrat (SPB-PEG) oder Succinimidylpropionat (SPA-PEG) sein.
  • Der Polyalkylenglykolanteil kann z. B. Carboxymethyl-NHS, Norleucin-NHS, SC-PEG, Tresylat, Aldehyd, Epoxid, Carbonylimidazol oder PNP-Carbonat sein.
  • In manchen Ausführungsformen ist der Polyalkylenglykolanteil an eine Cysteingruppe des Neublastin-Polypeptids oder einer Variante des Neublastin-Polypeptids gekoppelt. Zum Beispiel kann die Kopplung über eine Maleimidgruppe, eine Vinylsulfongruppe, eine Haloacetatgruppe und eine Thiolgruppe erfolgen.
  • In manchen Ausführungsformen ist das Neublastin-Polypeptid oder die Variante des Neublastin-Polypeptids in der Zusammensetzung glykosyliert. Wenn das Neublastin-Polypeptid oder die Variante des Neublastin-Polypeptids glykosyliert ist, kann das Polymer an einen Kohlenstoffanteil des glykosylierten Neublastin-Polypeptids oder der Variante des Neublastin-Polypeptids gekoppelt sein. Zum Beispiel kann das Polymer an das glykosylierte Neublastin-Polypeptid oder die Variante des Neublastin-Polypeptids gekoppelt sein im Anschluss an Oxidation einer Hydrazolgruppe oder einer Aminogruppe des glykosylierten Neublastin-Polypeptids oder einer Variante des Neublastin-Polypeptids oder durch Oxidation einer reaktiven Gruppe des Polymers.
  • In verschiedenen Ausführungsformen umfasst das Neublastin-Polypeptid oder die Variante des Neublastin-Polypeptids einen, zwei, drei oder vier PEG-Anteil(e).
  • In bevorzugten Ausführungsformen besitzt das Neublastin-Polypeptid, die Variante des Neublastin-Polypeptids oder das Polymerkonjugat eine längere Serumhalbwertszeit in Bezug auf die Halbwertszeit des Polypeptids oder der Variante des Polypeptids, wenn das Polymer fehlt.
  • In bevorzugten Ausführungsformen besitzt das Neublastin-Polypeptid, die Variante des Neublastin-Polypeptids oder das Polymerkonjugat in dem Komplex eine physiologische Aktivität, die aus der Gruppe ausgewählt ist, enthaltend: GFRα3-Bindung, RET-Aktivierung, Normalisierung von pathologischen Veränderungen eines Neurons oder Erhöhung des Überlebens von Neuronen.
  • Der Ausdruck „Normalisierung von pathologischen Veränderungen eines Neurons" bedeutet, dass das vorliegende Konjugat eine Veränderung in einem oder mehreren der folgenden Zellparameter induziert: im Expressionslevel eines Strukturproteins, in einem neurotrophen Faktor-Rezeptor, einem Innenkanal oder einem Neurotransmitter, oder es induziert jeweils eine Veränderung in der Zellmorphologie, sodass im Wesentlichen solche Parameter wieder auf einem entsprechenden Level in einem Neuron mit gleichem oder ähnlichem Phänotyp hergestellt werden, welches nicht durch Krankheit, Degeneration, Insult oder Verletzung beeinträchtigt ist. Die Normalisierung von pathologischen Veränderungen eines Neurons kann immunhistochemisch überwacht werden, oder indem Veränderungen in den Konzentrationen an sezernierten oder abgestoßenen Zellprodukten bewertet werden oder durch Bewertung von Veränderungen im Verhalten in vivo, welches physiologisch auf die Funktion der/des betroffenen Neurons/Neuronen zurückzuführen ist. Zum Beispiel können in dem Fall von pathologischen Veränderungen, die mit einem neuropathischen Schmerzsyndrom assoziiert sind, Schmerzverhalten wie beispielsweise Hyperalgesie, Hypoalgesie oder Allodynie überwacht werden.
  • Der Ausdruck „erhöhen des Überlebens von Neuronen" bedeutet, dass das Überleben eines betroffenen Neurons über den Überlebenszeitraum, der in einem entsprechenden Neuron beobachtet wird, welches durch den gleichen Typ Krankheit, Fehlfunktion, Insult oder Verletzung beeinträchtigt ist, aber nicht mit Neublastin-Konjugat oder Fusionsprotein dieser Erfindung behandelt wird, hinaus verlängert wird.
  • In manchen Ausführungsformen ist das Polymer an das Polypeptid an einer Stelle auf dem Neublastin gekoppelt, welche ein N-Terminus ist. In manchen Ausführungsformen ist das Polymer an das Polypeptid an der Stelle in einer nicht endständigen Aminosäure des Neublastin-Polypeptids oder der Variante des Neublastin-Polypeptids gekoppelt.
  • In bevorzugten Ausführungsformen ist das Polymer an eine Aminosäure des Neublastin-Polypeptids oder der Variante des Neublastin-Polypeptids gekoppelt, die Kontakt zu einem Lösungsmittel hat.
  • In bevorzugten Ausführungsformen ist das Polymer an das Neublastin-Polypeptid oder die Variante des Neublastin-Polypeptids an einen Rest gekoppelt, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus der aminoterminalen Aminosäure der Variante des Polypeptids an Position 14 in der Aminosäuresequenz des Neublastin-Polypeptids oder der Variante des Neublastin-Polypeptids an Position 39 in der Aminosäuresequenz des Neublastin-Polypeptids oder der Variante des Neublastin-Polypeptids an Position 68 in der Aminosäuresequenz des Neublastin-Polypeptids der Variante des Neublastin-Polypeptids und an Position 95 in der Aminosäuresequenz des Neublastin-Polypeptids oder der Variante des Polypeptids besteht.
  • Auch wird durch die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, welche ein physiologisch anerkanntes Vehikel umfasst, das ein Neublastin-Polypeptid, eine Variante des Neublastin-Polypeptids oder ein Konjugat der vorliegenden Erfindung enthält oder in welchem ein Neublastin-Polypeptid, eine Variante des Neublastin-Polypeptids oder ein Konjugat der vorliegenden Erfindung dispergiert ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform enthält die Erfindung ein stabiles, wasserlösliches, konjugiertes Neublastin-Polypeptid oder eine Variante des Neublastin-Polypeptidkomplexes, welches/welcher ein Neublastin-Polypeptid oder eine Variante des Neublastin-Polypeptids gekoppelt an einen Polyethylenglykolanteil umfasst, wobei das Neublastin-Polypeptid oder die Variante des Neublastin-Polypeptids an den Polyethylenglykolanteil über eine labile Bindung gekoppelt ist. In manchen Ausführungsformen ist die labile Bindung unter In-Vivo-Bedingungen durch biochemische Hydrolyse, Proteolyse oder Sulfhydryl-Spaltung spaltbar. In bevorzugten Ausführungsformen ist die labile Bindung unter In-Vivo-Bedingungen spaltbar.
  • Auch wird durch die Erfindung eine Methode bereitgestellt zur Herstellung eines modifizierten Neublastin-Polypeptids, welches eine längere Aktivität, in vitro oder in vivo, in Bezug auf ein Wildtyp-Neublastin zeigt, indem ein Neublastin-Polypeptid oder eine Variante des Neublastin-Polypeptids bereitgestellt wird und das Polypeptid oder die modifizierte Variante des Neublastin-Polypeptids an einen nicht natürlich vorkommenden Polymeranteil gekoppelt wird, wodurch eine Zusammensetzung aus gekoppeltem Polymer-Neublastin-Polypeptid gebildet wird.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine Methode bereit für die Behandlung oder Prävention einer Erkrankung des Nervensystems bei einem Subjekt (wie beispielsweise einem Menschen), indem an ein Subjekt, bei dem dieses erforderlich ist, eine therapeutisch wirksame Menge von einer Variante des Neublastin-Polypeptids, einer Zusammensetzung, die ein Neublastin-Polypeptid oder eine Variante des Neublastin-Polypeptids gekoppelt an ein Polymer enthält, oder einem Komplex, welcher ein stabiles, wasserlösliches, konjugiertes Neublastin-Polypeptid oder eine Variante des Neublastin-Polypeptidkomplexes, welcher ein Neublastin-Polypeptid oder eine Variante des Neublastin-Polypeptids gekoppelt an einen Polyethylenglykolanteil enthält, verabreicht wird.
  • Vorzugsweise handelt es sich bei der Erkrankung des Nervensystems um eine periphere Nervenerkrankung, wie beispielsweise eine periphere Neuropathie oder ein neuropathisches Schmerzsyndrom. Menschen sind bevorzugte Subjekte für die Behandlung.
  • Die Verabreichung kann z. B. systemisch oder lokal erfolgen.
  • Falls nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hierin benutzt werden, die gleiche Bedeutung wie Begriffe, die üblicherweise von einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung zählt, benutzt werden. Obwohl Methoden und Materialien ähnlich oder gleich den hierin beschriebenen bei der praktischen Umsetzung oder dem Testen der Erfindung verwendet werden können, werden unten geeignete Methoden und Materialien beschrieben. Alle Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patente und andere Referenzmaterialien, die hierin erwähnt werden, sind in ihrer Gesamtheit als Referenz beigefügt. Im Fall von Widerspruch gilt die vorliegende Spezifikation, einschließlich der Definitionen. Darüber hinaus dienen die Materialien, Methoden und Beispiele nur Veranschaulichungszwecken und sind nicht dazu gedacht, die Erfindung einzuschränken.
  • Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung und den Ansprüchen offensichtlich.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung stellt neue Varianten des Neublastin-Polypeptids bereit, die modifiziert werden können, um ihre Eigenschaften in Bezug auf Pharmakokinetik und Bioverfügbarkeit zu verbessern. Bevorzugte Varianten des Neublastin-Polypeptids weisen veränderte Aminosäuresequenzen auf, welche die Kopplung an ein Polymeragens, wie beispielsweise ein Polyalkylenglykolpolymer, erleichtern.
  • Varianten des Neublastin-Polypeptids
  • Die Erfindung stellt Neublastin-Polypeptide zur Verfügung, welche Varianten von Aminosäuresequenzen in Bezug auf eine Wildtyp-Neublastin-Polypeptidsequenz aufweisen. Aminosäuresequenzen von humanen und murinen Neublastin-Polypeptiden sind in WO00/01815 offenbart. Beispiele für Varianten des Neublastin-Polypeptids gemäß der Erfindung sind in Tabelle 1 dargestellt.
  • Vorzugsweise werden die veränderten Reste in der Variante des Neublastin-Polypeptids ausgewählt, um das Koppeln eines Polymers wie beispielsweise eines Polyalkylenglykolpolymers an der Stelle der modifizierten Aminosäure zu erleichtern. Bevorzugte Stellen für die Modifikation eines Neublastin-Polypeptids sind diejenigen, die sich in Bereichen in dem Neublastin-Polypeptid befinden, welche für Lösungsmittel zugänglich sind. Solche Stellen können aufgrund von Untersuchung der Kristallstruktur des verwandten neurotrophen Faktors, GDNF, gewählt werden, dessen Kristallstruktur in Nat. Struct. Biol. 4:435-38, 1997 beschrieben ist. Die Stellen können auch basierend auf den strukturfunktionellen Informationen ausgewählt werden, die für Persephin/Neublastinchimäre Proteine zur Verfügung gestellt sind. Diese Chimären sind in J. Biol. Chem. 275:3412-20,2000 beschrieben. Eine exemplarische Liste von für Lösungsmittel zugänglichen oder oberflächenexponierten Neublastin-Aminosäuren, welche durch diese Methode identifiziert sind, ist in Tabelle 2 aufgeführt.
  • Die Erfindung umfasst eine Variante des Neublastin-Polypeptids, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens zu 70 % identisch zu Aminosäuren 8-113 von SEQ ID NO:1 ist, welche in Tabelle 1 gezeigt ist. In manchen Ausführungsformen ist/sind ein Arginin oder mehrere Arginine an Position 14, Position 39, Position 68 oder das Asparagin an Position 95 in der Aminosäuresequenz des Polypeptids durch eine andere Aminosäure als Arginin oder Asparagin ersetzt. Vorzugsweise ist die Wildtyp-Aminosäure durch Lysin oder Cystein ersetzt. Tabelle 1
    Figure 00100001
    human Mensch
    mouse Maus
    rat Ratte
    consensus Konsensus
    Konsensussequenz:
    Figure 00100002
    Figure 00110001
    wobei
    Xaa1 Gly oder Thr ist
    Xaa2 Pro oder Arg ist
    Xaa3 Gly oder Ser ist
    Xaa4 Ala oder Thr ist
    Xaa5 Ala oder Thr ist
    Xaa6 Gly oder Asp ist
    Xaa7 Arg oder Ser ist
    Xaa8 Arg oder Ser ist
    Xaa9 Val oder Ile ist
    Xaa10 Pro oder Gln ist
    Xaa11 Pro oder Ser ist
    Xaa12 Val oder Ile ist
    Xaa13 Arg oder His ist
  • Tabelle 2 stellt eine Liste von Resten und nummerierten Positionen in humanem Neublastin bereit, von denen erwartet wird, dass sie oberflächenexponiert sind. Oberflächenexponierte Reste wurden bestimmt durch Untersuchung der Struktur des GDNF-Dimers der Ratte, welches durch Ketten A und B (PDB Code 1AGQ) gebildet wird, und indem bestimmt wurde, ob ein Rest auf der Oberfläche der Struktur vorhanden war. Diese Struktur wurde dann mit einem Sequenzabgleich von GDNF und Neublastin in Baloh et al., Neuron, Vol. 21, Seite 1291, 1998, verglichen, um die richtigen Reste in Neublastin zu ermitteln. Das Nummerierungsschema ist das in Tabelle 1 gezeigte.
  • Tabelle 2
    • 1 Ala n/a
    • 2 Gly n/a
    • 3 Gly n/a
    • 4 Pro n/a
    • 5 Gly n/a
    • 6 Ser n/a
    • 7 Arg n/a
    • 8 Ala n/a
    • 9 Arg n/a
    • 10 Ala n/a
    • 11 Ala n/a
    • 12 Gly +
    • 13 Ala –
    • 14 Arg +
    • 15 Gly +
    • 16 Cys –
    • 17 Arg +
    • 18 Leu +
    • 19 Arg +
    • 20 Ser +
    • 21 Gln +
    • 22 Leu +
    • 23 Val –
    • 24 Pro +
    • 25 Val –
    • 26 Arg +
    • 27 Ala +
    • 28 Leu –
    • 29 Gly –
    • 30 Leu +
    • 31 Gly +
    • 32 His +
    • 33 Arg +
    • 34 Ser –
    • 35 Asp +
    • 36 Glu +
    • 37 Leu +
    • 38 Val –
    • 39 Arg +
    • 40 Phe –
    • 41 Arg +
    • 42 Phe +
    • 43 Cys –
    • 44 Ser +
    • 45 Gly +
    • 46 Ser +
    • 47 Cys –
    • 48 Arg +
    • 49 Arg +
    • 50 Ala –
    • 51 Arg +
    • 52 Ser +
    • 53 Pro +
    • 54 His –
    • 55 Asp –
    • 56 Leu +
    • 57 Ser –
    • 58 Leu –
    • 59 Ala +
    • 60 Ser +
    • 61 Leu –
    • 62 Leu +
    • 63 Gly +
    • 64 Ala +
    • 65 Gly +
    • 66 Ala +
    • 67 Leu –
    • 68 Arg n/a
    • 69 Pro n/a
    • 70 Pro n/a
    • 71 Pro n/a
    • 72 Gly +
    • 73 Ser +
    • 74 Arg n/a
    • 75 Pro n/a
    • 76 Val –
    • 77 Ser –
    • 78 Gln +
    • 79 Pro
    • 80 Cys –
    • 81 Cys –
    • 82 Arg
    • 83 Pro –
    • 84 Thr +
    • 85 Arg +
    • 86 Tyr +
    • 87 Glu +
    • 88 Ala +
    • 89 Val +
    • 90 Ser +
    • 91 Phe –
    • 92 Met +
    • 93 Asp +
    • 94 Val +
    • 95 Asn +
    • 96 Ser +
    • 97 Thr +
    • 98 Trp +
    • 99 Arg +
    • 100 Thr +
    • 101 Val –
    • 102 Asp +
    • 103 Arg +
    • 104 Leu –
    • 105 Ser –
    • 106 Ala –
    • 107 Thr +
    • 108 Ala +
    • 109 Cys –
    • 110 Gly +
    • 111 Cys –
    • 112 Leu +
    • 113 Gly
    • n/a
    • n/a
    = k.A. (keine Angabe)
    k.A.
    bedeutet, dass die Reste nicht in der Struktur von GDNF vorkommen. Dies ist entweder auf die Konstruktionsbauweise, die flexiblen Bereiche oder auf Inserts in Neublastin in Bezug auf GDNF (Reste 68-71) zurückzuführen.
    –
    bedeutet, dass die Reste verborgen sind und nicht an der Oberfläche liegen, oder es sind Cysteinreste, die durch Disulfidbindungen gebunden sind. Da dieses Protein ein Cysteinknoten ist, befindet sich eine überwiegende Mehrheit der Reste an der Oberfläche.
    +
    bedeutet, dass dieser Rest in der GDNF-Struktur oberflächenexponiert ist und daher angenommen wird, dass er in Neublastin auch oberflächenexponiert ist, obwohl die Schleife, die die Reste 66-75 enthält nur in einem der GDNF-Monomere (vermutlich flexibel) sichtbar ist. Diese Schleife enthält auch ein Insert mit 4 Resten in Neublastin in Bezug zu GDNF.
  • Hierin werden die Begriffe „identisch" und „homolog" oder „Homologie" austauschbar benutzt und beziehen sich auf die Ähnlichkeit der Sequenz zwischen zwei Polypeptiden, Molekülen oder zwischen zwei Nukleinsäuren. Wenn eine Position in beiden der miteinander verglichenen Sequenzen durch die gleiche Base oder die gleiche Aminosäuremonomeruntereinheit (zum Beispiel, wenn eine Position in jedem der beiden DNA-Moleküle durch Adenin besetzt ist, oder eine Position in jedem der beiden Polypeptide durch ein Lysin besetzt ist) besetzt ist, dann sind die jeweiligen Moleküle an dieser Position homolog. Der Prozentsatz an Homologie zwischen zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl von übereinstimmenden oder homologen Positionen, die bei den beiden Sequenzen auftreten, dividiert durch die Anzahl an miteinander verglichenen Positionen × 100. Wenn zum Beispiel 6 von 10 Positionen in zwei Sequenzen übereinstimmen oder homolog sind, dann sind die beiden Sequenzen zu 60 % homolog. Beispielsweise weisen die DNA-Sequenzen CTGACT und CAGGTT eine Homologie (3 von insgesamt 6 Positionen stimmen überein) von 50 % auf. Im Allgemeinen wird ein Vergleich gezogen, wenn zwei Sequenzen abgeglichen werden, um eine maximale Homologie zu erhalten. Solch ein Abgleich (Alignment) kann bereitgestellt werden, indem zum Beispiel die Methode von Needleman et al., J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970) verwendet wird, welche bequem durch Computerprogramme wie beispielsweise das Alignment-Programm (DNAstar, Inc.) implementiert werden kann. „Ähnliche" Sequenzen sind diejenigen, welche, wenn sie miteinander verglichen werden, identische und ähnliche Aminosäurereste aufweisen, wobei ähnliche Reste konservative Substitutionen für oder „erlaubte Punktmutationen" von entsprechenden Aminosäureresten in einer abgeglichenen Referenzsequenz sind. In dieser Hinsicht ist eine „konservative Substitution" eines Rests in einer Referenzsequenz eine Substitution durch einen Rest, der physikalisch oder funktionell ähnlich dem entsprechenden Referenzrest ist, z. B. welcher eine ähnliche Größe, Form, elektrische Ladung, chemische Eigenschaften aufweist, einschließlich der Fähigkeit kovalente oder Wasserstoffbindungen zu bilden oder Ähnliches. Daher ist eine Sequenz mit „konservativer Substitutionsvariante" eine Sequenz, welche von einer Referenzsequenz oder einer Wildtyp-Sequenz abweicht, insofern da eine oder mehrere konservative Substitution(en) oder erlaubte Punktmutation(en) auftreten.
  • In bevorzugten Ausführungsformen ist ein Polypeptid gemäß der Erfindung zu 80 %, 85 %, 90 %, 95%, 98 % oder 99 % identisch zu Aminosäuren 8-113 von SEQ ID NO:1. In manchen Ausführungsformen enthält die Aminosäuresequenz der Variante des Neublastin-Polypeptids die Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Neublastin-Polypeptids von der Ratte, dem Menschen oder der Maus an den Aminosäuren 1-94 und 96-113 der Variante des Neublastin-Polypeptids, z. B. hat das Polypeptid an diesen Positionen die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, 3 oder 4.
  • Eine Variante des Neublastin-Polypeptids, welche in der Sequenz von denjenigen in SEQ ID NO:1-4 abweicht, kann eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen aufweisen. Alternativ oder zusätzlich dazu kann die Variante des Neublastin-Polypeptids sich um eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitution(en), -deletion(en) oder Insertion(en) unterscheiden. Vorzugsweise führen die Substitutionen, Insertionen oder Deletionen nicht zum Verlust der biologischen Aktivität des isolierten Proteins.
  • Konservative Substitutionen umfassen typischerweise die Substitution einer Aminosäure durch eine andere mit ähnlichen Merkmalen wie beispielsweise Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen: Valin, Alanin und Glycin; Leucin, Valin und Isoleucin; Asparaginsäure und Glutaminsäure; Asparagin und Glutamin; Serin, Cystein und Threonin; Lysin und Arginin; und Phenylalanin und Tyrosin. Die nicht polaren hydrophoben Aminosäuren enthalten Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die polaren neutralen Aminosäuren enthalten Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren enthalten Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren enthalten Asparaginsäure und Glutaminsäure. Jede Substitution eines Mitglieds der oben erwähnten polaren, basischen oder sauren Gruppe durch ein anderes Mitglied der gleichen Gruppe kann als eine konservative Substitution bezeichnet werden.
  • Andere Substitutionen können durch den Durchschnittfachmann leicht identifiziert werden. Zum Beispiel kann für die Aminosäure Alanin eine beliebige Substitution unter D-Alanin, Glycin, Beta-Alanin, L-Cystein und D-Cystein gewählt werden. Für Lysin kann ein beliebiger Ersatz unter D-Lysin, Arginin, D-Arginin, Homo-Arginin, Methionin, D-Methionin, Ornithin oder D-Ornithin gewählt werden. Im Allgemeinen handelt es sich bei den Substitutionen in funktionell bedeutenden Bereichen, von denen erwartet wird, dass sie zu Änderungen in den Eigenschaften der isolierten Polypeptide führen, um diejenigen, in welchen: (i) ein polarer Rest, z. B. Serin oder Threonin, anstelle eines hydrophoben Rests, z. B. Leucin, Isoleucin, Phenylalanin oder Alanin eingesetzt (oder gegen diesen ausgetauscht) wird; (ii) ein Cysteinrest anstelle eines beliebigen anderen Rests eingesetzt (oder gegen diesen ausgetauscht) wird; (iii) ein Rest, welcher eine elektropositive Seitenkette aufweist, z. B. Lysin, Arginin oder Histidin, anstelle eines Rests eingesetzt (oder gegen diesen ausgetauscht) wird, der eine elektronegative Seitenkette aufweist, z. B. Glutaminsäure oder Asparaginsäure oder (iv) ein Rest mit einer sperrigen Seitenkette, z. B. Phenylalanin, anstelle eines Rests eingesetzt (oder gegen diesen ausgetauscht) wird, der keine solche Seitenkette besitzt, z. B. Glycin. Die Wahrscheinlichkeit, dass eine der vorausgehenden nicht konservativen Substitutionen die funktionellen Eigenschaften des Proteins verändern kann, steht auch in Zusammenhang mit der Position der Substitution in Bezug auf funktionell bedeutende Bereiche des Proteins: einige nicht konservative Substitutionen können dementsprechend nur eine geringe oder gar keine Wirkung auf die biologischen Eigenschaften ausüben.
  • Auch werden durch die Erfindung multimere Polypeptide bereitgestellt, die eine Variante des Neublastin-Polypeptids enthalten. Die multimeren Polypeptide werden bevorzugt als gereinigte multimere Polypeptide zur Verfügung gestellt. Zu den Beispielen für multimere Komplexe gehören z. B. dimere Komplexe. Der multimere Komplex kann als ein heteromerer oder ein homomerer Komplex bereitgestellt werden. Somit kann der multimere Komplex ein heterodimerer Komplex, der eine Variante des Neublastin-Polypeptids und eine Nicht-Variante von Neublastin enthält, oder ein heterodimerer Komplex sein, welcher zwei oder mehrere Varianten des Neublastin-Polypeptids enthält.
  • In manchen Ausführungsformen bindet die Variante des Neublastin-Polypeptids an GFRα3. Vorzugsweise führt die Bindung der Variante des Neublastin-Polypeptids zur Stimulation der Phosphorylierung eines RET-Polypeptids. Um zu bestimmen, ob ein Polypeptid GFRα3 bindet, kann ein Assay durchgeführt werden, wie in WO00/01815 beschrieben. Zum Beispiel kann das Vorkommen von Neublastin in dem Medium des Überstands der CHO-Zelllinie mithilfe einer abgeänderten Form eines ternären Komplexassays bestimmt werden, der durch Sanicola et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94:6238) beschrieben wird. In diesem Assay kann die Fähigkeit von GDNF-ähnlichen Molekülen auf ihre Fähigkeit hin bewertet werden, die Bindung zwischen der extrazellulären Domäne von RET und den verschiedenen Co-Rezeptoren, GFRα1, GFRα2 und GFRα3 zu vermitteln. Lösliche Formen von RET und den Co-Rezeptoren werden als Fusionsproteine erzeugt. Ein Fusionsprotein zwischen der extrazellulären Domäne von Ratten-RET und alkalischer Phosphatase (RET-AP) aus der Plazenta sowie ein Fusionsprotein zwischen der extrazellulären Domäne von Ratten-GFRα1 (offenbart in der veröffentlichten Patentanmeldung WO9744356 ; 27. November 1997, hierin als Referenz beigefügt) und der Fc-Domäne von humanem IgGI (rGFR(α1-Ig)) wurden beschrieben (Sanicola et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 6238).
  • In manchen Ausführungsformen erhöht die Variante des Neublastin-Polypeptids das Überleben eines Neurons oder normalisiert pathologische Veränderungen eines Neurons oder beides. Assays zur Bestimmung, ob ein Polypeptid das Überleben eines Neurons erhöht oder pathologische Veränderungen eines Neurons normalisiert, sind z. B. in WO00/01815 beschrieben. Vorzugsweise ist das Neuron ein sensorisches Neuron, ein autonomes Neuron oder ein dopaminerges Neuron.
  • Synthese und Isolierung von Varianten des Neublastin-Polypeptids
  • Varianten des Neublastin-Polypeptids können unter Verwendung von Methoden isoliert werden, die auf dem Gebiet bekannt sind. Natürlich vorkommende Neublastin-Polypeptide können aus Zellen oder Geweben durch ein entsprechendes Reinigungsschema mithilfe von standardmäßigen Proteinreinigungstechniken isoliert werden. Alternativ können Varianten des Neublastin-Polypeptids chemisch synthetisiert werden, indem standardmäßige Peptidsynthesetechniken verwendet werden. Die Synthese von kurzen Aminosäuresequenzen ist auf dem Gebiet der Peptide gut eingeführt. Siehe z. B. Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis (2. Auflage 1984).
  • In einer weiteren Ausführungsform werden Varianten des Neublastin-Polypeptids durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt. Zum Beispiel kann ein Nukleinsäuremolekül, das für eine Variante des Neublastin-Polypeptids kodiert, in einen Vektor eingebracht werden, z. B. einen Expressionsvektor, und die Nukleinsäure kann in eine Zelle eingeführt werden. Zu den geeigneten Zellen zählen z. B. Säugetierzellen (wie beispielsweise Humanzellen oder Chinesische Hamsterovarzellen), Pilzzellen, Hefezellen, Insektenzellen und Bakterienzellen. Bei Expression in einer rekombinanten Zelle wird die Zelle vorzugsweise unter Bedingungen kultiviert, die die Expression einer Variante des Neublastin-Polypeptids erlauben. Die Variante des Neublastin-Polypeptids kann falls gewünscht, aus einer Zellsuspension zurückgewonnen werden. Mit „zurückgewinnen" ist gemeint, dass die Variante des Polypeptids von den anderen Bestandteilen einer Zelle oder eines Kulturmediums, in welchem sie vor dem Rückgewinnungsverfahren vorkommt, getrennt wird. Das Rückgewinnungsverfahren kann einen oder mehrere Neufaltungs- oder Reinigungsschritt(e) beinhalten.
  • Varianten des Neublastin-Polypeptids können mithilfe einer von verschiedenen Methoden, die auf dem Gebiet bekannt sind, konstruiert werden. Eine solche Methode ist die ortsspezifische Mutagenese, bei welcher ein bestimmtes Nukleotid (oder, falls gewünscht, eine geringe Anzahl von bestimmten Nukleotiden) verändert wird, um eine einzige Aminosäure (oder, falls gewünscht, eine geringe Anzahl von vorher bestimmten Aminosäureresten) in dem kodierten Neublastin-Polypeptid zu verändern. Dem Fachmann auf dem Gebiet wird bekannt sein, dass ortsspezifische Mutagenese eine routinemäßige und weit verbreitete Technik ist. Tatsächlich sind viele Kits für ortsspezifische Mutagenese kommerziell erhältlich. Ein solches Kit ist das „Transformer Site Directed Mutagenesis Kit", das von Clontech Laboratories (Palo Alto, Calif.) vertrieben wird.
  • Die praktische Umsetzung der vorliegenden Erfindung wird, sofern nicht anders angegeben, konventionelle Techniken der Zellbiologie, Zellkultur, Molekularbiologie, Mikrobiologie, DNA-Rekombination, Proteinchemie und Immunologie umfassen, welche alle auf dem Fachgebiet bekannt sind. Solche Techniken sind in der Literatur beschrieben. Siehe zum Beispiel: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (Sambrock, Fritsch und Maniatis, Herausgeber), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volumes I und II (D.N. Glover, Herausgeber), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, Herausgeber), 1984; US-Patentschrift Nr. 4,683,195 (Mullis et al.,); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Haines and S.J. Higgins, Herausgeber). 1984; Transcription and Translation (B.D. Hames und S.J. Higgins, Herausgeber), 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, Herausgeber), Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (13.Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 und 155 (Wu et al., Herausgeber), Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos, Herausgeber), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer und Walker, Herausgeber), Academic Press, London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir und C.C. Blackwell, Herausgeber), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Habor Laboratory Press, 1986.
  • Varianten des Neublastin-Fusionsproteins
  • Falls gewünscht, kann die Variante des Neublastin-Polypeptids als ein Fusionsprotein bereitgestellt werden. Fusionspolypeptidderivate von Proteinen der Erfindung umfassen auch zahlreiche Strukturformen des primären Proteins, welche die biologische Aktivität bewahren. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Fusion" auf eine co-lineare, kovalente Bindung von zwei oder mehreren Proteinen oder Fragmenten davon über ihre einzelnen Peptidgrundgerüste, idealerweise durch genetische Expression von einem Polynukleotidmolekül, welches für diese Proteine in dem gleichen Leseraster (d.h. „in frame") kodiert. Es wird bevorzugt, dass die Proteine oder Fragmente davon aus verschiedenen Quellen stammen. Daher enthalten bevorzugte Fusionsproteine eine Variante des Neublastin-Polypeptids oder ein Fragment, welche(s) kovalent an einen zweiten Anteil gebunden ist, der keine Variante von Neublastin ist. Vorzugsweise wird der zweite Anteil von einem Polypeptid abgeleitet, welches als Monomer vorliegt und ausreicht, um die Eigenschaften des Neublastin-Polypeptids in Bezug auf Löslichkeit und/oder Bioverfügbarkeit zu erhöhen.
  • Zum Beispiel ist eine „Fusion von Neublastin-Variante/humanem Serumalbumin" ein Protein, welches eine Variante des Neublastin-Polypeptids der Erfindung oder ein Fragment davon umfasst, dessen N-Terminus oder C-Terminus im Rahmen mit einem humanen Serumalbumin-Polypeptid (Siehe Syed et al. Blood, 1997, 89:3243 und Yeh et al., P.N.A.S. USA 1992, 89:1904 und US-Patentschrift Nrn. 5,876,969 und 5,302,697 ) verbunden ist. Der Begriff „Fusionsprotein" beinhaltet zusätzlich eine Variante von Neublastin, die chemisch über ein mono- oder heterofunktionales Molekül mit einem zweiten Anteil verbunden ist, welcher keine Variante des Neublastinproteins ist und de novo aus gereinigtem Protein, wie unten beschrieben, hergestellt wird.
  • Fusionen aus Neublastin-Serumalbumin können mithilfe von Methoden, die auf dem Gebiet bekannt sind, konstruiert werden. Es kann eine beliebige Anzahl von Crosslinkern benutzt werden, die eine entsprechende aminoreaktive Gruppe und eine thiolreaktive Gruppe enthalten, um Neublastin mit Serumalbumin zu verbinden. Zu den Beispielen für geeignete Crosslinker zählen aminreaktive Crosslinker, welche ein thiolreaktives Maleimid einführen. Zu diesen gehören z. B. SMCC, AMAS, BMPS, MBS; EMCS; SMPB; SMPH, KMUS oder GMBS. Andere geeignete Linker führen eine thiolreaktive Haloacetatgruppe ein. Zu diesen gehören z. B. SBAP, SIA, SIAB. Zu denjenigen, welche ein geschütztes oder nicht geschütztes Thiol für die Reaktion mit Sulfhydrylgruppen bereitstellen, um eine reduzierbare Verbindung, herzustellen, gehören SPDP, SMPT, SATA oder SATP;
    alle sind kommerziell erhältlich (z. B. Pierce Chemicals). Für den Fachmann auf dem Gebiet sind ähnliche alternative Strategien vorstellbar, die den N-Terminus von Neublastin mit Serumalbumin verbinden.
  • Es ist ebenso vorstellbar, dass ein Fachmann auf dem Gebiet Konjugate von Serumalbumin erzeugen kann, die nicht an dem N-Terminus von NBN oder an dem Thiolanteil am Serumalbumin angreifen. Falls gewünscht, können NBN-Serumalbuminfusionen mithilfe von gentechnischen Methoden hergestellt werden, wobei NBN mit dem N-Terminus, dem C-Terminus oder an beiden Enden des Serumalbumingens fusioniert wird.
  • Er wird ferner in Betracht gezogen, dass ein beliebiges NBN-Konjugat, welches zu einem Produkt mit einer längeren Halbwertszeit bei Tieren (einschließlich dem Menschen) führt, mithilfe einer ähnlichen Strategie erzeugt werden kann.
  • Andere Derivate von Varianten von Neublastin enthalten kovalente oder aggregierte Konjugate von Varianten von Neublastin oder dessen Fragmenten mit anderen Proteinen oder Polypeptiden, wie beispielsweise durch Synthese in rekombinanter Kultur als zusätzliche N-Termini oder C-Termini. Zum Beispiel kann das konjugierte Peptid eine Signal-Polypeptidsequenz (oder Leader-Polypeptidsequenz) an dem N-terminalen Bereich des Proteins sein, welches co-translational oder post-translational den Transport des Proteins von der Stelle, an der es synthetisiert wurde, zu der Stelle, an der es seine Funktion innerhalb oder außerhalb der Zellmembran oder Zellwand (z. B. Leader des Hefe-Alphafaktors) ausübt, transportiert. Neublastin-Rezeptorproteine können Peptide umfassen, die zugegeben werden, um die Reinigung oder Identifizierung von Neublastin (z. B. Fusion von Histidin/Neublastin) zu erleichtern. Die Aminosäuresequenz von Neublastin kann auch mit dem Peptid Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (Hopp et al., Biotechnology 6:1204, 1988) verbunden sein. Die zuletzt genannte Sequenz ist hoch antigen und stellt ein Epitop bereit, das reversibel durch einen spezifischen monoklonalen Antikörper gebunden ist, was einen schnellen Assay und eine leichte Reinigung des exprimierten rekombinanten Proteins ermöglicht.
  • Diese Sequenz ist auch durch von Schleimhaut sezernierte Rinder-Enterokinase an dem Rest, der direkt auf das Paar Asp–Lys folgt, spezifisch spaltbar.
  • Varianten des Neublastin-Polypeptids, die mit einem Polymer konjugiert sind
  • Falls gewünscht, kann ein einziges Polymermolekül für die Konjugation mit einem Neublastin-Polypeptid eingesetzt werden, obwohl auch in Betracht gezogen wird, dass mehrere Polymermoleküle angebracht werden können. Konjugierte Neublastinzusammensetzungen der Erfindung finden ihre Anwendung sowohl in vivo als auch in Anwendungen, die nicht in vivo, eingesetzt werden. Zusätzlich dazu lasst sich erkennen, dass das konjugierende Polymer beliebige andere Gruppen, Anteile oder andere konjugierte Spezies verwenden kann, wenn diese für die Endnutzung der Anwendung geeignet sind. Beispielsweise kann es bei manchen Anwendungen hilfreich sein, an das Polymer einen funktionellen Anteil kovalent zu binden, um dem Polymer eine Resistenz gegenüber UV-Zerfall, Antioxidationseigenschaften oder andere Eigenschaften oder Merkmale zu verleihen. Als ein weiteres Beispiel kann es in manchen Anwendungen von Vorteil sein, das Polymer zu funktionalisieren, um es reaktiv oder quervernetzbar zu machen, und somit verschiedene Eigenschaften oder Merkmale des gesamten konjugierten Materials zu verstärken. Dementsprechend kann das Polymer beliebige Funktionalität, sich wiederholende Gruppen, Verbindungen oder andere Konstituentenstrukturen enthalten, welche die Effizienz der konjugierten Neublastin-Mutein-Zusammensetzung zu ihrem beabsichtigten Zweck nicht beeinträchtigen.
  • Zur Veranschaulichung sind Polymere, welche hilfreich eingesetzt werden können, um diese wünschenswerten Merkmale zu erreichen, hierin unten stehend in beispielhaften Reaktionschemen beschrieben. In Anwendungen mit kovalent gebundenen Peptiden kann das Polymer funktionalisiert und dann an freie Aminosäure(n) des Peptids/der Peptide gekoppelt werden, um labile Bindungen zu bilden.
  • In manchen Ausführungsformen ist das Neublastin-Polypeptid mit dem Polymer über eine terminale reaktive Gruppe auf dem Polypeptid verbunden. Alternativ oder zusätzlich dazu kann das Neublastin-Polypeptid über die Seitenketten-Aminogruppe eines internen Lysinrests, z. B. über einen Lysinrest, welcher in die Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Neublastin-Polypeptids eingeführt wurde, gebunden sein. Somit können Konjugationen auch ausgehend von den nicht-terminalen reaktiven Gruppen verzweigt sein. Das Polymer mit der reaktiven Gruppe/den reaktiven Gruppen wird hierin als „aktiviertes Polymer" bezeichnet. Die reaktive Gruppe reagiert selektiv mit freien Aminogruppen oder anderen reaktiven Gruppen auf dem Protein.
  • Die Befestigung kann an dem aktivierten Polymer erfolgen an einer beliebig verfügbaren Neublastin-Aminogruppe, wie beispielsweise den Alpha-Aminogruppen oder den Epsilon-Aminogruppen eines Lysinrests oder -resten, die in die Aminosäuresequenz eines Neublastin-Polypeptids oder einer Variante davon eingeführt werden. Freie Carboxylgruppen, geeignete aktivierte Carbonylgruppen, Hydroxyl-, Guanidyl-, Imidazolgruppen, oxidierte Kohlenhydratanteile sowie Mercaptogruppen von Neublastin (falls verfügbar) können ebenfalls als Befestigungsstellen benutzt werden.
  • Im Allgemeinen werden etwa 1,0 bis etwa 10 Mol an aktiviertem Polymer pro Mol Protein in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration eingesetzt. Die letztendliche Menge bildet einen Ausgleich dafür, dass das Ausmaß der Reaktion maximiert wird, während nicht spezifische Modifikationen des Produkts minimiert werden und gleichzeitig die chemischen Verfahren, die zur Aufrechterhaltung der optimalen Aktivität beitragen, definiert werden, und auch, falls möglich, die Halbwertszeit des Proteins optimiert wird. Vorzugsweise werden mindestens etwa 50 % der biologischen Aktivität des Proteins bewahrt und idealerweise werden fast 100 % bewahrt.
  • Die Reaktionen können durch jede beliebige Methode eingeleitet werden, die für die Reaktion von biologisch aktiven Materialien mit inerten Polymeren eingesetzt werden, vorzugsweise bei etwa pH 5-8, z. B. 5, 6, 7 oder 8, falls sich die reaktiven Gruppen auf der Alpha-Aminogruppe an dem N-Terminus befinden. Im Allgemeinen bedingt das Verfahren die Herstellung eines aktivierten Polymers und das anschließende Reagieren lassen des Proteins mit dem aktivierten Polymer, um das lösliche Protein herzustellen, das für die Formulierung geeignet ist. Die oben genannte Modifikationsreaktion kann durch verschiedene Methoden durchgeführt werden, welche einen Schritt oder mehrere Schritte umfassen.
  • Das Polymer kann an die Variante des Neublastin-Polypeptids mithilfe von Methoden gekoppelt werden, die auf dem Gebiet bekannt sind. Zum Beispiel ist der Polyalkylenglykolanteil in einer Ausführungsform an eine Lysingruppe des Neublastin-Polypeptids oder der Variante des Neublastin-Polypeptids gekoppelt. Die Bindung an die Lysingruppe kann mit einem aktiven Ester von N-hydroxylsuccinimid (NHS), wie beispielsweise als PEG Succinimidylsuccinat (SS-PEG) und Succinimidylpropionat (SPA-PEG) erfolgen. Geeignete Polyalkylenglykolanteile beinhalten z. B. Carboxymethyl-NHS, Norleucin-NHS, SC-PEG, Tresylat, Aldehyd, Epoxid, Carbonylimidazol und PNP-Carbonat.
  • Zusätzliche aminreaktive PEG-Linker können anstelle des Succinimidylanteils eingesetzt werden. Zu diesen gehören z. B. Isotihyocyanate, Nitrophenylcarbonate, Epoxide und Benzotriazolcarbonate. Die Bedingungen werden vorzugsweise so gewählt, dass sie die Selektivität und das Ausmaß der Reaktion maximieren. Lineare und verzweigte Formen von PEG können ebenfalls benutzt werden sowie andere Alkylformen. Die Länge von PEG kann variieren. Die häufigsten Formen haben eine unterschiedliche Größe von 2K-100K. Während die vorliegenden Beispiele zeigen, dass die zielgerichtete Pegylierung an dem N-Terminus die pharmakokinetischen Eigenschaften nicht beeinflusst, deutet die Tatsache, dass die physiologische Funktion vom Material aufrechterhalten bleibt, darauf hin, dass eine Modifikation an der Stelle oder an den Stellen, die hierin offenbart ist/sind, nicht nachteilig ist. Bei der Erzeugung von Mutantenformen von NBN, welche zusätzliche Stellen für die Befestigung durch Insertion von Lysinresten bereitstellen könnten, wird folglich das mögliche Ergebnis, dass diese Formen sowohl an dem Lysin als auch an dem N-Terminus pegyliert wären, als annehmbar erachtet.
  • Falls gewünscht, können Varianten des Neublastin-Polypeptids ein Tag enthalten, z. B. ein Tag, das nachfolgend durch Proteolyse freigesetzt werden kann. Somit kann der Lysinanteil selektiv modifiziert werden, indem er zuerst mit einer Variante von His-Tag mit einem Linker mit niedrigem Molekulargewicht, wie beispielsweise Trauts Reagenz (Pierce), welches sowohl mit dem Lysin als auch mit dem N-Terminus reagiert, zur Reaktion gebracht wird und anschließend das His-Tag freigesetzt wird. Das Polypeptid kann dann eine freie SH-Gruppe enthalten, die selektiv mit einem PEG modifiziert werden kann, welches eine thiolreaktive Kopfgruppe, wie beispielsweise eine Maleimid-Gruppe, eine Vinylsulfon-Gruppe, eine Haloacetat-Gruppe oder eine freie oder geschützte SH-Gruppe aufweist.
  • Trauts Reagenz kann durch jeden beliebigen Linker ersetzt werden, der eine spezifische Stelle für die PEG-Befestigung bereitstellt. Zum Beispiel könnte Trauts Reagenz ersetzt werden durch SPDP, SMPT, SATA oder SATP (alle erhältlich von Pierce). Auf ähnliche Weise könnte das Protein mit einem aminreaktiven Linker zur Reaktion gebracht werden, der eine Maleimidgruppe (beispielsweise SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS oder GMBS), eine Haloacetatgruppe (SBAP, SIA, SIAB) oder eine Vinylsulfongruppe einführt, und das Endprodukt dann mit einem PEG, das eine freie SH-Gruppe enthält, zur Reaktion gebracht werden. Die einzige Einschränkung in Bezug auf die Größe des Linkers, der eingesetzt wird, ergibt sich daraus, dass er das nachfolgende Entfernen eines N-terminalen Tags nicht blockieren sollte.
  • Daher ist in anderen Ausführungsformen der Polyalkylenglykolanteil an eine Cysteingruppe von dem Neublastin-Polypeptid oder der Variante des Neublastin-Polypeptids gekoppelt. Die Kopplung kann z. B. mithilfe einer Maleimid-Gruppe, einer Vinylsulfon-Gruppe, einer Haloacetat-Gruppe und einer Thiol-Gruppe bewirkt werden.
  • Eine oder mehrer Stelle(n) auf einer Variante des Neublastin-Polypeptids kann an ein Polymer gekoppelt sein. Zum Beispiel kann/können eine, zwei, drei, vier oder fünf PEG-Anteile an dem Polymer angebracht sein. In manchen Ausführungsformen ist ein PEG-Anteil an dem Amino-Terminus und/oder an Aminosäuren 14, 39, 68 und 95 eines Neublastin-Polypeptids befestigt, welches wie in Tabelle 1 dargestellt, nummeriert ist.
  • In bevorzugten Ausführungsformen besitzt die Variante des Neublastin-Polypeptids in der Zusammensetzung eine längere Serum-Halbwertszeit bezogen auf die Halbwertszeit der Variante des Polypeptids, wenn das Polymer fehlt. Alternativ oder zusätzlich dazu bindet die Variante des Neublastin-Polypeptids in der Zusammensetzung GFRα3, aktiviert RET, normalisiert pathologische Veränderungen eines Neurons oder erhöht das Überleben eines Neurons oder übt eine Kombination dieser physiologischen Funktionen aus.
  • In bevorzugten Ausführungsformen wird die Zusammensetzung in Form eines stabilen, wasserlöslichen, konjugierten Neublastin-Polypeptids oder einer Variante des Neublastin-Polypeptid-Komplexes bereitgestellt, welcher ein Neublastin-Polypeptid oder eine Variante des Neublastin-Polypeptids gekoppelt an einen Polyethylenglykolanteil umfasst. Falls gewünscht, kann das Neublastin-Polypeptid oder eine Variante des Neublastin-Polypeptids über eine labile Bindung an den Polyethylenglykolanteil gekoppelt werden. Die labile Bindung kann z. B. durch biochemische Hydrolyse, Proteolyse oder Sulfhydryl-Spaltung aufgespalten werden. Zum Beispiel kann die Bindung unter Bedingungen in vivo (physiologisch) gespalten werden.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die Varianten von Neublastin-Polymerkonjugaten enthalten
  • Es wird auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die eine Variante des Neublastin-Polymerkonjugats der vorliegenden Erfindung enthält. Der Ausdruck „pharmazeutische Zusammensetzung", wie hierin benutzt, ist definiert als eine Zusammensetzung, welche ein Neublastin-Protein oder Konjugat der Erfindung umfasst, das in einem physiologisch annehmbaren Vehikel dispergiert ist und optional einen oder mehrere andere physiologisch kompatible Inhaltsstoffe umfasst. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann somit einen Hilfsstoff wie beispielsweise Wasser, einen oder mehrere Mineralstoff(e), Zucker, Detergenz(ien) und einen oder mehrere Trägerstoff(e) wie beispielsweise ein inertes Protein (z. B. Heparin oder Albumin) enthalten.
  • Die Konjugate von Polymer-Neublastin der Erfindung können per se auch in der Form von pharmazeutisch annehmbaren Ester, Salzen und anderen physiologisch funktionellen Derivaten davon verabreicht werden. In solchen pharmazeutischen und Medikamentenformulierungen wird die Variante eines Neublastinkonjugats vorzugsweise zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff(en) und optional mit beliebigen anderen therapeutischen Inhaltsstoffen verwendet.
  • Der/die Trägerstoff(e) muss/müssen pharmazeutisch annehmbar sein in dem Sinne, dass sie mit anderen Inhaltsstoffen der Formulierung kompatibel und nicht unangemessen schädlich für den Empfänger dieser Formulierung sind. Die Variante des Neublastins wird in einer Menge, welche wirksam ist, um einen gewünschten pharmazeutischen Effekt oder einen medizinisch vorteilhaften Effekt, wie hierin beschrieben, zu erreichen, und in einer Quantität, welche geeignet ist, um die erwünschte biologisch verfügbare In-Vivo-Dosierung oder -Konzentration zu erzielen, bereitgestellt.
  • Die Formulierungen schließen diejenigen mit ein, welche für parenterale sowie nicht parenterale Verabreichung geeignet sind, und bestimmte Verabreichungsmodalitäten umfassen orale, rektale, bukkale, topische, nasale, ophthalmische, subkutane, intramuskuläre, intravenöse, transdermale, intrathekale, intraartikuläre, intraarterielle, subarachnoidale, bronchiale, lymphatische, vaginale und intrauterine Verabreichungen. Bevorzugt werden Formulierungen, die für Aerosol- und parenterale Verabreichung sowohl lokal als auch systemisch, geeignet sind.
  • Wenn die Variante von Neublastin in einer Formulierung benutzt wird, welche eine flüssige Lösung umfasst, kann die Formulierung vorteilhafterweise oral, bronchial oder parenteral verabreicht werden. Wenn das Neublastin in einer Formulierung mit flüssiger Suspension oder als Pulver in einer Formulierung mit biokompatiblem Trägerstoff eingesetzt wird, kann die Formulierung vorteilhafterweise oral, rektal oder bronchial gegeben werden. Als Alternative kann eine Verabreichung nasal oder bronchial erfolgen über Verneblung des Pulvers in einem Trägergas, um eine gasförmige Dispersion zu bilden, die vom Patienten über einen Atemkreislauf, welcher eine geeignete Vernebelungsvorrichtung umfasst, eingeatmet wird.
  • Die Formulierungen, die die Proteine der vorliegenden Erfindung umfassen, können bequemerweise in Formen von Einheitsdosierungen vorliegen und durch jede beliebige Methode hergestellt werden, die auf dem Gebiet der Pharmazie bekannt ist. Solche Methoden beinhalten im Allgemeinen den Schritt, bei welchem der aktive Inhaltsstoff/die aktiven Inhaltsstoffe mit einem Trägerstoff zusammengeführt wird/werden, welcher sich aus einem zusätzlichen Inhaltsstoff oder mehreren zusätzlichen Inhaltsstoffen zusammensetzt.
  • Typischerweise werden die Formulierungen hergestellt, indem der aktive Inhaltsstoff/die aktiven Inhaltsstoffe auf einheitliche Weise und eng mit einem flüssigen Trägerstoff, einem feinst unterteilten festen Trägerstoff oder mit beiden in Verbindung gebracht wird/werden und dann das Produkt, falls erforderlich, in Dosierungsformen der gewünschten Formulierungen geformt wird.
  • Formulierungen der vorliegenden Erfindung, die für orale Verabreichung geeignet sind, können als einzelne Einheiten, wie beispielsweise als Kapseln, Kapseln aus Stärkemasse, Tabletten oder Lutschtabletten dargeboten werden, wobei jede einzelne Einheit eine vorbestimmte Menge an Wirkstoff in Form eines Pulvers oder Granulats oder als eine Suspension in einer wässrigen Flüssigkeit oder einer nicht wässrigen Flüssigkeit, wie beispielsweise einem Sirup, einem Elixier, einer Emulsion oder einem Auszug enthält.
  • Formulierungen, die für parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen bequemerweise eine sterile wässrige Zubereitungsform an aktivem Konjugat, welche vorzugsweise isotonisch bezogen auf das Empfängerblut (z. B. physiologische Salzlösung) ist. Solche Formulierungen können Suspensionsmittel und Verdickungsmittel oder andere Mikropartikelsysteme enthalten, welche dazu gedacht sind, die Verbindung zu den Blutbestandteilen oder zu einem Organ oder zu mehreren Organen zu transportieren. Die Formulierungen können in Einheitsdosierung oder in Multidosierungsform vorliegen.
  • Nasensprayformulierungen umfassen gereinigte wässrige Lösungen des aktiven Konjugats mit Konservierungsmitteln und isotonischen Agenzien. Solche Formulierungen sind vorzugsweise auf einen pH-Wert und einen isotonischen Status eingestellt, welche mit den Bedingungen der Nasenschleimhaut übereinstimmen.
  • Formulierungen für rektale Verabreichung können als Zäpfchen mit geeignetem Trägerstoff wie beispielsweise Kakaobutter, hydrogenierten Fetten oder Carbonsäuren von hydrogenierten Fetten dargereicht werden. Ophthalmische Formulierungen, wie beispielsweise Augentropfen, werden durch ähnliche Methoden wie Nasenspray hergestellt, mit Ausnahme, dass der pH-Wert und die isotonischen Faktoren vorzugsweise so angepasst sind, dass sie den Bedingungen im Auge entsprechen.
  • Topische Formulierungen umfassen die Konjugate der Erfindung, die in einem Medium oder in mehreren Medien, wie beispielsweise Mineralöl, Erdöl, Polyhydroxyalkoholen oder anderen Basen, welche für topische pharmazeutische Formulierungen verwendet werden, aufgelöst oder suspendiert sind.
  • Zusätzlich zu den zuvor erwähnten Inhaltsstoffen können die Formulierungen dieser Erfindung ferner einen oder mehrere Zusatzstoff(e) enthalten, die unter Verdünnungsmitteln, Puffer, Geschmacksstoffen, Auflösungsmitteln, oberflächenaktiven Agenzien, Verdickungsmitteln, Gleitstoffen, Konservierungsmitteln (einschließlich Antioxidanzien) und Ähnlichen ausgewählt werden. Die vorausgehenden Überlegungen treffen auch auf die Neublastinfusionsproteine der Erfindung (z. B. Neublastin-HSA-Fusionen) zu.
  • Demgemäss wird bei der Erfindung die Bereitstellung von geeigneten Fusionsproteinen für In-Vitro-Stabilisierung einer Variante eines Neublastin-Konjugats in Lösung als eine bevorzugte erläuternde Anwendungsform der Erfindung in Betracht gezogen. Die Fusionsproteine können zum Beispiel eingesetzt werden, um die Resistenz der Variante des Neublastin-Polypeptids gegenüber enzymatischem Abbau zu verstärken und ein Mittel bereitzustellen, um die Haltbarkeit, Stabilität bei Raumtemperatur und Ähnlichem zu verbessern. Es ist selbstverständlich, dass sich die vorhergehenden Überlegungen auch auf die Fusionsproteine von Neublastin-Serumalbumin (einschließlich der Fusionsproteine von Neublastin-humanem Serumprotein) der Erfindung anwenden lassen.
  • Behandlungsmethoden
  • Die Varianten des Neublastin-Polypeptids sowie Fusionsproteine oder Konjugate davon können für die Behandlung oder Verbesserung einer Fehlfunktion oder Krankheit bei einem lebenden Tier, vorzugsweise einem Säugetier, idealerweise einem Primaten einschließlich einem Menschen, angewandt werden, wobei die Fehlfunktion oder Krankheit auf die Aktivität von neurotrophen Agenzien reagiert.
  • Die Zusammensetzungen der Erfindung können direkt z. B. über injizierte, implantierte oder inkorporierte pharmazeutische Zusammensetzungen angewandt werden, um einen pathologischen Vorgang, der auf Neublastin-Polypeptide anspricht, zu therapieren. Die Zusammensetzungen können dazu benutzt werden, eine Fehlfunktion oder Krankheit eines lebenden Tieres, einschließlich eines Menschen, zu verbessern, wobei die Fehlfunktion oder Krankheit auf die Aktivität von neurotrophen Agenzien reagiert. Bei der Fehlfunktion oder Krankheit kann es sich insbesondere um eine Schädigung des Nervensystems verursacht durch Trauma, chirurgischen Eingriff, Ischämie, Infektion, Stoffwechselkrankheiten, Fehlernährung, Malignität oder toxische Agenzien und um genetische oder idiopathische Vorgänge handeln.
  • Die Schädigung kann insbesondere an sensorischen Neuronen oder retinalen Ganglionzellen, einschließlich Neuronen in den dorsalen Wurzelganglien des Rückenmarks oder in einem der folgenden Gewebetypen auftreten: Fazialisganglion, unteres Glossopharyngeusganglion und unteres Vagusganglion, in dem vestibulär-akustischen Komplex des achten Hirnnervs, dem ventrolateralen Pol des maxillomandibulären Lobus des Trigeminalganglions und dem Mittelhirnkern des Trigeminus.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Methode der Erfindung ist die Krankheit oder Fehlfunktion eine neurodegenerative Erkrankung, die läsionierte und traumatisierte Neuronen, wie zum Beispiel traumatische Läsionen von peripheren Nerven, der Medulla und/oder des Rückenmarks betrifft sowie zerebralischämischen neuronalen Schaden, Neuropathie und insbesondere periphere Neuropathie, Trauma und Verletzung von peripheren Nerven, ischämischen Infarkt, akute Hirnverletzung, akute Rückenmarksverletzung, Tumore des Nervensystems, multiple Sklerose, Kontakt mit Neurotoxinen, Stoffwechselkrankheiten, wie beispielsweise Diabetes oder Nierenfunktionsstörungen und Schäden verursacht durch infektiöse Agenzien, neurodegenerative Erkrankungen einschließlich Alzheimer-Krankheit, Huntington-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Parkinson-Plus-Syndrome, progressiver supranukleärer Blickparese (Steele-Richardson-Olszewski-Syndrom), olivopontozerebellare Atrophie (OPCA), Shy-Drager-Syndrom (Multiple-System-Atrophie), Parkinson-Demenz-Komplex von Guam, amyotrophe Lateralsklerose oder andere kongenitale oder neurodegenerative Erkrankungen und Gedächtnisschwäche, die mit Demenz assoziiert ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können sensorische und/oder autonome Neuronen des Systems behandelt werden. Insbesondere können nozizeptive und mechanorezeptive Neuronen, spezieller Deltafasern- und C-Fasern behandelt werden. Zusätzlich können sympathische und parasympathische Neuronen des vegetativen Nervensystems behandelt werden.
  • In weiteren Ausführungsformen können Erkrankungen motorischer Neuronen, wie beispielsweise bei amyotropher Lateralsklerose („ALS") und Spinalmuskelatrophie behandelt werden. In noch einer weiteren Ausführungsform können die Neublastin-Moleküle dieser Erfindung dazu benutzt werden, die Heilung von Nerven nach einer traumatischen Verletzung zu beschleunigen. Alternativ oder zusätzlich dazu kann ein Nervenführungskanal mit einer Matrix, welche Varianten des Neublastin-Polypeptids oder fusionierte oder konjugierte Varianten des Neublastin-Polypeptids enthält, in den hierin beschriebenen Methoden benutzt werden. Solche Nervenführungskanäle werden z. B. in der US-Patentschrift Nr. 5,834,029 offenbart, die hierin als Referenz beigefügt ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die hierin offenbarten Zusammensetzungen (und pharmazeutischen Zusammensetzungen, die diese enthalten) zur Behandlung von peripheren Neuropathien benutzt. Zu den peripheren Neuropathien, die hier für die Therapie mit den Molekülen dieser Erfindung in Betracht kommen, zählen traumainduzierte Neuropathien, z. B. diejenigen, die durch Verletzung oder Krankheitsstadium, Hirnverletzung, Verletzung am Rückenmark, mit Schlaganfall assoziierter Hirnschaden und neurologische Fehlfunktionen, die mit Neurodegeneration in Verbindung stehen. Auch hierin miteingeschlossen sind Neuropathien, die sekundär auf eine Infektion, einen Toxin- und Arzneimittelkontakt folgen. Ferner zählen hierin noch diejenigen Neuropathien dazu, welche sekundär auf systemische Erkrankungen oder Stoffwechselkrankheiten folgen. Die hierin offenbarten Zusammensetzungen können auch zur Behandlung von durch Chemotherapie induzierte Neuropathien (wie zum Beispiel verursacht durch Verabreichung von Chemotherapeutika, z. B. Taxol oder Cisplatin), durch Toxin induzierte Neuropathien, durch Medikamente/Drogen induzierte Neuropathien, durch Vitaminmangel induzierte Neuropathien, idiopathische Neuropathien und diabetische Neuropathien verwendet werden. Siehe z. B. US-Patentschriften 5,496,804 und 5,916,555 , wobei jede hierin als Referenz beigefügt ist.
  • Zusätzliche Zustände, die unter Verwendung der hierin beschriebenen Zusammensetzungen behandelt werden können sind Mono-Neuropathien, Mononeuritis multiplex und Polyneuropathien, einschließlich axonaler und demyelinisierender Neuropathien.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Zusammensetzungen der Erfindung (und pharmazeutischen Zusammensetzungen, die diese enthalten) bei der Behandlung verschiedener Fehlfunktionen am Auge eingesetzt, einschließlich Verlust von Photorezeptoren in der Retina bei Patienten, die an einer Makuladegeneration, Retinitis pigmentosa, Glaukom und ähnlichen Erkrankungen leiden.
  • Die Erfindung wird in den folgenden nicht einschränkenden Beispielen weiter beschrieben.
  • Beispiel 1-Bioverfugbarkeit von N-terminal pegyliertem Neublastin
  • Es wurde beobachtet, dass von einer CHO-Zelle stammendes rekombinantes humanes Neublastin bei Ratten rasch aus dem System ausgeschieden wurde, wenn das Neublastin intravenös verabreicht wurde. Im Serum wurde nachfolgend auf die subkutane Verabreichung kein Protein gefunden. Um die Bioverfügbarkeit von Neublastin zu erhöhen, wurden pegylierte Formen konstruiert.
  • Da in der NBN-Sequenz keine Lysine vorkommen, wird die aminspezifische Pegylierungschemie zur Pegylierung von einem NBN-Polypeptid an deren Aminoterminus führen. Daher sollten für jedes Neublastin-Dimer zwei PEG-Anteile angebracht werden.
  • Demgemäss wurden PEG-Formen zuerst direkt an dem N-Terminus durch aminspezifische Chemie angestrebt. Überraschenderweise brachte selbst die Pegylierung von zwei 20K PEGs keinen Vorteil für die Halbwertszeit, was darauf hindeutet, dass über einen Mechanismus-basierten Ausscheidungsweg die Erhöhung der Halbwertszeit, die mit der Pegylierung zu erreichen erhofft wurde, aufgehoben wurde.
  • Beispiel 2-Konstruktion eines pegylierten Neublastin-N95K-Muteins
  • Die Bioverfügbarkeit von NBN-Mutantformen, die am internen Aminosäurerest pegyliert waren, wurde als Nächstes untersucht. Es wurde eine Reihe von vier Mutanten, die natürlich vorkommende Reste an Positionen 14, 39, 68 und 95 ersetzten, hergestellt, um Lysine an ausgewählten Stellen in der Sequenz einzuführen. Diese Lysine würden alternative Stellen für die PEG-Befestigung bereitstellen. Diese Stellen wurden ausgewählt mithilfe der Kristallstruktur von GDNF (Nat. Struct. Biol. 4: 435-8, 1997) als ein Rahmen, um Oberflächenreste zu identifizieren, und mithilfe der Mutagenesestudie von Persephin/Neublastin-Chimären (J. Biol. Chem. 275: 3412-20, 2000), um funktionell wichtige Bereiche der Struktur zu identifizieren, die vermieden werden sollten.
  • Zwei der Mutationen [R39 und R68] wurden in einem Bereich angestrebt, der basierend auf der Verteilung von positiven Ladungen auf der Oberfläche eine Heparin-Bindungsstelle zeigen könnte, eine Eigenschaft des Proteins, welche möglicherweise zu einer raschen Clearance beiträgt. Eine dritte Stelle wurde an N95, der natürlichen Glykosylierungsstelle in dem Wildtyp-NBN, angestrebt. Diese Stelle ist natürlicherweise modifiziert mit einer komplexen Kohlenhydratstruktur. Daher wurde von einer Modifikation mit PEG an dieser Stelle nicht erwartet, dass sie die Funktion beeinträchtigt. Die vierte Stelle (R14) wurde in einem Bereich ausgewählt, der nicht durch eine der anderen Modifikationen abgedeckt war. Eine Mutante, bei welcher der Asparaginrest an Position 95 mit einem Lysin (der „N95K-Mutante") ersetzt wurde, wurde für die Studien, die hierin offenbart sind, ausgewählt.
  • Vier unterschiedliche Neublastin-Muteine von der Ratte, die eine oder mehrere Veränderung(en) in der Wildtyp-Sequenz des Ratten-Neublastin-Polypeptids enthielten, wurden konstruiert. Die Muteine umfassten das einzelne N95K-Mutein und die Muteine enthielten einzelne Substitutionen an anderen Stellen in der Aminosäuresequenz des Ratten-Neublastin: R14K; R68K und R39K. In der „X1N1X2"-Nomenklatur bezieht sich X1 auf eine Aminosäure von einem Wildtyp-Neublastin-Polypeptid, N1 auf die numerische Position der X1-Aminosäuren in der Sequenz, wie gemäß SEQ ID NO:1 nummeriert. X2 bezieht sich auf eine Aminosäure, die anstelle der Wildtyp-Aminosäure an der angegebenen numerischen Position in der Sequenz eingesetzt wurde.
  • Um die N95K-Neublastin-Mutation von der Ratte zu konstruieren, wurde ortsspezifische Mutagenese an pCMB020 durchgeführt, einem Plasmid, welches für Ratten-Neublastin vom Wildtyp kodiert. Die Ratten-Neublastin-Nukleinsäure und -Aminosäuresequenz des Polypeptids vom Wildtyp, die dadurch kodiert wurden, sind unten dargestellt:
    Figure 00330001
    Figure 00340001
  • Mutagenese von pCM020 unter Verwendung von Oligonukleotiden KD2-310 und KD3-211 führte zur Bildung des Plasmids pCMB027:
    KD2-310 5'-GTATCTTTCATGGACGTAAAGTCTACATGGAGAACCGTAGATCATCTATCTGCAACC-3' (SEQ ID NO:6)
    KD2-311 5'-GGTTGCAGATAGATGATCTACGGTTCTCCATGTAGACTTTACGTCCATGAAAGATAC-3 (SEQ ID NO:7)
  • In pCMB027 wurde das Kodon, welches für Asparagin an Position 95 kodiert, ersetzt durch ein Kodon, welches für Lysin kodiert.
  • Es wurde ein R14K-Neublastin-Mutein gebildet durch Ersetzen eines Kodons, welches für Arginin an Position 14 kodiert, durch ein Kodon, welches für Lysin in der Neublastin-Kodierungssequenz von pCMB020 kodiert. Ortsspezifische Mutagenese wurde an pCMB020 unter Verwendung von Oligonukleotiden KD3-254 und KD3-255 durchgeführt:
    KD3-254 5'-GCTGGAACTCGCAGCTCTCGTGCTCGTGCAACGGATGCAAAAGGCTGTCG-3' (SEQ ID NO:8)
    KD2-255 5'-CGACAGCCTTTTGCATCCGTTGCACGAGCACGAGAGCTGCGAGTTCCAGC-3' (SEQ ID NO:9)
  • Das daraus resultierende Konstrukt wurde als pCMB029 bezeichnet.
  • Es wurde ein R68K-Neublastin-Mutein gebildet durch Ersetzen eines Kodons, welches für Arginin an Position 68 kodiert, durch ein Kodon, welches für Lysin in der Neublastin-Kodierungssequenz von pCMB020 kodiert. Ortsspezifische Mutagenese wurde an pCMB020 unter Verwendung von Oligonukleotiden KD3-258 und KD3-259 durchgeführt:
    KD3-258 5'-GGAGCCGGAGCACTAAAATCTCCCCGGGATCTAGACC-3' (SEQ ID NO:10)
    KD3-259 5'-GGTCTAGATCCCGGGGGAGATTTTAGTGCTCCGGCTCC-3' (SEQ ID NO:11)
  • Das daraus resultierende Konstrukt wurde als pCMB030 bezeichnet.
  • Es wurde ein R39K-Neublastin-Mutein gebildet, indem Arginin an Aminosäure 39 durch Lysin in der Neublastin-Kodierungssequenz von pCMB020 ersetzt wurde. Ortsspezifische Mutagenese wurde an pCMB027 unter Verwendung von Oligonukleotiden KD3-256 und KD3-257 durchgeführt:
    KD3-256 5-GACGAATTAATTAAGTTTCGTTTTTGTTCAGG-3 (SEQ ID NO:12)
    KD3-257 5'-CCTGAACAAAAACGAAACTTAATTAATTCGTC-3' (SEQ ID NO:13)
  • Für Expression und Reinigung wurde ein Plasmid, welches für das NBN-N95K-Mutein der Ratte kodiert, in E. coli als ein His-tagged Fusionsprotein mit einer Enterokinase-Spaltungsstelle, die direkt neben dem Start der reifen 113-Aminosäure-NBN-Sequenz liegt, exprimiert. E. coli wurde in einem 500-l-Fermenter gezüchtet und die eingefrorene Zellpaste bereitgestellt. Die Zellen von E. coli wurden in einer Manton-Gaulin-Presse lysiert und das NBN-NK der Ratte aus der unlöslichen, gewaschenen Pelletfraktion zurückgewonnen.
  • Das NBN wurde aus dem Pellet mit Guanidinhydrochlorid extrahiert, neu gefaltet und das His-Tag mit Enterokinase entfernt. Das Produkt wurde dann einer Chromatographie über Ni-NTA-Agarose (Qiagen) und Bakerbond WP CBX-Kationenaustauscherharz unterzogen.
  • Die Enterokinasebehandlung des His-tagged Produkts führte zu einer abweichenden Spaltung des Proteins an Arginin 7 in der reifen Sequenz. Das entstandene Des-1-7 NBN- Produkt war in dem KIRA ELISA voll aktiv und strukturell von der reifen Form in Bezug auf seine Empfindlichkeit gegenüber guanidininduzierter Denaturierung nicht zu unterscheiden und wurde daher für die nachfolgende Weiterverarbeitung verwendet.
  • NBN-N95K der Ratte wurde durchschnittlich mit 3,3 PEG-Anteilen/Molekül mithilfe von Methoxylpoly(ethylenglykol)-succinimidylpropionat (SPA-PEG) mit einer Molekularmasse von 10.000 Da als dem Reaktant pegyliert. Das entstandene pegylierte Produkt wurde einer umfangreichen Charakterisierung unterzogen einschließlich Analyse durch SDS-PAGE Elektrophorese, Größenausschlusschromatographie (SEC), Reversed-Phase HPLC, matrixunterstützter Laserdesorption/Ionenmobilitätsspektrometrie (MALD/IMS). Peptid-Mapping, Bewertung der Aktivität in dem KIRA ELISA und Bestimmung des Gehalts an Endotoxin. Die Reinheit des Produkts NBN-N95K vor der Pegylierung, die mithilfe von SDS-PAGE und SEC bestimmt wurde, war größer als 95 %. Das Produkt NBN-N95K wanderte unter nicht reduzierten Bedingungen als ein Dimer in Übereinstimmung mit seiner vorhergesagten Struktur. Nach der Pegylierung bestand das entstandene Produkt aus einer Reihe von modifizierten Addukten, die 2 PEGs/Molekül 5 % des Produkts, 3 PEGs/Molekül 60 % des Produkts, 4 PEGs/Molekül 30 % des Produkts enthielten, sowie aus mehreren geringeren Formen mit höherer Masse. In der pegylierten Probe fanden sich keine Hinweise auf Aggregate. Restmengen von nicht modifiziertem NBN in dem Produkt lagen unter den Quantifizierungsgrenzen. Der Gehalt an Endotoxin des Materials liegt routinemäßig unter 1 EU/mg. Die spezifische Aktivität des pegylierten NBN in dem KIRA ELISA beträgt 10 nM. Das pegylierte Produkt wurde mit 1,1 mg/ml in PBS pH 6,5 formuliert. Das Material, welches in seiner Wirksamkeit ähnlich zu wt-NBN ist, kann als eine gefrorene Flüssigkeit geliefert werden, die bei –70°C gelagert wird.
  • Die Muteine R14K, R39K und R68K wurden in E. coli exprimiert. Sie können danach den gleichen Methoden für Reinigung, Pegylierung und Bewertung von Funktion unterzogen werden, wie oben für N95K-NBN beschrieben.
  • Herstellung von pegyliertem NBN
  • 230 ml an neu gefaltetem NBN-N95K der Ratte (2,6 mg/ml), welches in E. coli hergestellt wurde und bei 4 °C in 5 mM Natriumphosphat pH 6,5, 100 mM NaCl gelagert wurde, wurde mit 77 ml Wasser, 14,4 ml an 1M HEPES pH 7,5 und 2,8 g (10 mg/ml Endkonzentration) an PEG SPA 10.000 Da (Shearwater Polymers, Inc) verdünnt. Die Probe wurde bei Raumtemperatur im Dunkeln für 4 Stunden inkubiert, dann mit 5 mM Imidazol (Endkonzentration) behandelt, filtriert und über Nacht bei 4°C aufbewahrt. Das Produkt wurde in zwei Chargen erzeugt, eine enthaltend 130 ml an NBN-N95K Bulk-Produkt und die andere enthaltend 100 ml des Bulk-Produkts. Das pegylierte NBN wurde über Fractogel EMD SO3 (M) (EM Industries) aus der Reaktionsmischung gereinigt. Die Säule wurde bei Raumtemperatur betrieben. Alle Puffer wurden pyrogenfrei hergestellt. Zu der Reaktionsmischung wurde Natriumchlorid bis auf eine Endkonzentration von 87 mM zugegeben, und die Probe wurde auf eine Fractogel-Säule, 45 ml (5 cm Innendurchmesser), geladen.
  • Die Säule wurde mit einem Säulenvolumen von 5 mM Natriumphosphat pH 6,5, 80 mM NaCl und dann mit drei Aliquoten eines Säulenvolumens von 5mM Natriumphosphat, enthaltend 50 mM NaCl gewaschen. Das Harz wurde in eine Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm überführt und das pegylierte NBN über die Säule eluiert mit sechs Schritten zu 10 ml enthaltend 5 mM Natriumphosphat pH 6,5, 400 mM NaCl, drei Schritten enthaltend 500 ml NaCl und sechs Schritten enthaltend 600 mM NaCl. Die Elutionsfraktionen wurden in Bezug auf Proteingehalt durch Absorption bei 280 nm und danach auf das Ausmaß der Modifikation mithilfe von SDS-PAGE Elektrophorese analysiert. Ausgewählte Fraktionen wurden gepoolt, über einen 0,2-μm-Filter filtriert und mit Wasser auf 1,1 mg pegyliertes Ratten-NBN/m1 verdünnt. Nach Bewertung der Endotoxinkonzentrationen in den einzelnen Chargen wurden diese gepoolt und durch eine 0,2 μm-Membran nochmals filtriert. Das Endmaterial wurde aliquotiert und bei –70°C gelagert.
  • UV-Spektrum von gereinigtem pegyliertem NBN-NK
  • Das UV-Spektrum (240-340 nm) von pegyliertem NBN-NK wurde mit der unverdünnten Probe aufgenommen. Die Probe wurde dreifach analysiert. Die pegylierte Probe zeigte ein Absorptionsmaximum bei 275-277 nm und ein Absorptionsminimum bei 247-249 nm. Dieses Ergebnis stimmt mit dem überein, was bei dem nicht modifizierten NBN Bulk-Zwischenprodukt beobachtet wurde. Die Proteinkonzentration des pegylierten Produkts wurde anhand des Spektrums bestimmt mithilfe eines Extinktionskoeffizienten von Σ280 0,1% = 0,50. Die Proteinkonzentration des pegylierten NBN Bulk-Produkts beträgt 1,1 mg/ml. Es gab keine Trübung in der Probe, wie aufgrund der fehlenden Absorption bei 320 nm offensichtlich ist.
  • Charakterisierung von pegyliertem NBN-NK durch SDS-PAGE
  • Aliquote von pegyliertem NBN, welche 3, 1,5, 0,75 und 0,3 μg des Produkts enthielten, wurden einer SDS-PAGE Elektrophorese auf einem Gradientengel von 4-20 % (Ow1) unterzogen. Das Gel wurde mit Coomassie Brilliant Blue R-250 gefärbt. Molekulargewichtsmarker (GIBCO-BRL) wurden parallel dazu mitlaufen gelassen.
  • Die SDS-PAGE-Analyse von pegyliertem NBN-NK unter nicht reduzierten Bedingungen zeigte eine Reihe von Banden, die Modifikationen mit 2, 3, 4 und mehr als 4 PEGs/Molekül entsprachen. Die Hauptbande mit einer offensichtlichen Masse von 98 kDa enthielt 3 PEGs/Molekül. In dem gereinigten, pegylierten Produkt wurde kein nicht modifiziertes NBN nachgewiesen. Das Vorkommen einer Mischung aus Produkten mit 2, 3 und 4 daran befestigten PEGs wurde mithilfe von MALDI Massenspektrometrieanalyse überprüft. Der Anteil an Produkt, welches 2, 3 und 4 PEGs enthielt, wurde mithilfe von Densitometrie bestimmt und auf 7, 62 beziehungsweise 30 Prozent vom Gesamtanteil festgelegt.
  • Charakterisierung von pegyliertem NBN durch Größenausschlusschromatographie
  • Pegyliertes NBN wurde einer Größenauschlusschromatographie auf einer analytischen Superose 6 HR1O/30 FPLC-Säule unter Verwendung von 5 mM MES pH 6,5, 300 mM NaCl als der mobilen Phase unterzogen. Die Säule wurde mit einer Flussrate von 20 ml/h betrieben. Die Elutionsfraktionen wurden auf eine Absorption bei 280 nm analysiert. Das pegylierte NBN eluierte in einem einzigen Peak mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 200 kDa in Übereinstimmung mit dem großen hydrodynamischen Volumen von PEG. Es gab keine Hinweise auf Aggregate. Freies NBN, welches mit einer offensichtlichen Molekularmasse von etwa 30 kDa eluiert, wurde in der Präparation nicht beobachtet.
  • Analyse von pegyliertem NBN mithilfe von Reversed-Phase HPLC
  • Pegyliertes NBN-NK wurde einer Reversed-Phase HPLC auf einer Vydac C4 (5μm, 1 × 250 mm) Säule unterzogen. Die Säule wurde mit einem 60 mm Gradienten von 40 bis 60 % B (Puffer A: 0,1 % TFA, Puffer B: 75 % Acetonitril/0,085 % TFA) betrieben. Der Säuleneffluent wurde auf Absorption bei 214 nm überwacht und die Fraktionen für die nachfolgende Analyse gesammelt. Pegyliertes NBN-NK wurde in verschiedene di- (60,5 mm), tri- (63,3 mm) und tetra- (67,8 mm) pegylierte Bestandteile durch Reversed-Phase HPLC auf einer C4 Säule fraktioniert. Die relative Intensität der Peaks lasst vermuten, dass die Anteile der Bestandteile bei 5,4, 60,5 beziehungsweise 30,1 % liegen. Die Identifizierung der Peaks erfolgte durch Überprüfung mit MALDI-MS. Es gab keinen Hinweis auf nicht Pegyliertes NBN-NK (eluiert bei 5-15 mm) in dem Produkt.
  • Analyse von pegyliertem NBN mithilfe von Massenspektrometrie
  • Pegyliertes NBN-NK wurde über eine C4 Zip Tip Säule entsalzt und mithilfe von Massenspektrometrie auf einem Voyager-DETM STR (PerSeptive Biosystems) matrixunterstützten Laserdesorption/Ionisierungs- und Time-of-Flight (MALDI-TOF) Massenspektrometer unter Verwendung von Sinapinsäure als einer Matrix analysiert. 0,5 μl des gereinigten Proteins wurden mit 0,5 μl der Matrix auf der Zielplatte gemischt. Die Massenspektrometrie von pegyliertem NBN offenbarte einfach und zweifach geladene Formen von drei Addukten. Die beobachteten Massen von 43803 Da, 54046 Da und 64438 Da stimmen mit den Modifizierungen von 2, 3 und 4 PEGs/Molekül überein.
  • Analyse von pegyliertem NBN mithilfe von Peptid-Mapping
  • Die Spezifität der Pegylierungsreaktion wurde mithilfe von Peptid-Mapping bewertet. Pegyliertes NBN wurde in di-, tri-, und tetra-pegylierte Bestandteile getrennt, welche dann reduziert, alkyliert und weiter in ihre einzelnen Kettenbestandteile durch HPLC über eine C4 Säule aufgetrennt wurden. Diese Bestandteile sowie reduziertes und alkyliertes nicht modifiziertes NBN-NK als einer Kontrolle wurden mit Asp-N-Proteinase verdaut und die entstandenen Spaltprodukte durch Reversed-Phase HPLC auf einer Vydac C18 (5 μm, 1 × 250 mm) Säule mit einem 60 mm Gradienten von 0 bis 60 % B (Puffer A: 0,1 % TFA, Puffer B: 75 % Acetonitril/0,085 % TFA) fraktioniert. Der Säuleneffluent wurde auf eine Absorption bei 214 nm überwacht.
  • Die Ratten-NBN-Sequenz enthält vier interne Asparaginsäuren, weshalb zu erwarten war, dass sie ein einfaches Spaltungsprofil ergibt, wenn sie mit Endoproteinase Asp-N verdaut wird. Alle Peaks aus der Asp-N-Verdauung von Ratten-NBN-NK wurden durch Massenspektrometrie identifiziert und/oder durch N-terminale Sequenzierung nach Edman. Daher kann der Peptid-Map als ein einfaches Tool benutzt werden, um die Stellen der Modifikation durch das Auftreten oder Fehlen von einem Peak aufzufinden. Die Identität der verschiedenen Peaks ist unten in Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 3
    Peak nach Retentionszeit (mm) Beobachteter Massendurchschnitt Theoretischer Massendurchschnitt Zuweisung Aminosäuresequenz
    38,8 1261, 1 (M) 1262,4 102-113 DHLSATACGCLG
    40,7 1090,9 1092,2 93-101 DVKSTWRTV
    44,6 2508,4 2508,9 35-54 DELIRFRFCSGSCRRAR SPH
    46,0 2437,0 2437,8 12-34 DARGCRLRSQLVPVSA LGLGHSS
    51,4 3456,7 3456,0 55-86 DLSLAS.....CRPTRY
    51,9 4134,4 55-92 (Oxid) DLSLAS CRPTRYEAVSFM
    53,2 4136,3* 4120,8 55-92 DLSLAS CRPTRYEAVSFM
    (M): monoisotope Masse *: bedingt durch Oxidation von Methionin enthaltendem Peptid bei MALDI
  • Da NBN als ein Homodimer vorliegt, enthält das NBN-NK-Produkt der Ratte vier mögliche Stellen für die Pegylierung, die beiden N-terminalen Amine von jeder der Ketten und die beiden N95K-Stellen, welche in das Konstrukt eingeführt wurden. In dem Peptid-Map der di-pegylierten Kette wurde nur der Peak, welcher das Peptid mit der NK-Mutation enthält, durch die PEG-Modifikation verändert. Keiner der anderen Peaks war von der PEG-Modifikation betroffen. Die Mapping-Daten deuten daher daraufhin, dass der PEG-Anteil spezifisch an diesem Peptid angebracht ist und nicht an einem der anderen Peptide, die gescreent wurden. Die zweite mögliche Stelle zur Anbringung, der N-Terminus, liegt auf einem Peptid, welches nur drei Aminosäuren lang ist und nicht in dem Peptid-Map nachweisbar ist. Es wird angenommen, dass zusätzliche PEG-Befestigungen an dieser Stelle zu finden sind. Übereinstimmend mit dieser Annahme ist ein geringer Prozentsatz des Ratten-NBN-NK nicht trunkiert (verkürzt) und enthält die reife Ala-1-Sequenz. Dieses Peptid wird bei 30 μm eluiert und ist in dem Peptid-Map aus der nicht pegylierten Verdauung sichtbar, fehlt aber in der pegylierten NBN-NK-Verdauung.
  • Beispiel 3. Bewertung der Wirksamkeit von intern pegyliertem Neublastin in einem Kinase-Rezeptor-Aktivierungs-ELISA (KIRA)
  • Die Wirksamkeit von pegyliertem Ratten-NBN wurde mithilfe von NBN-abhängiger Aktivierung/Phosphorylierung von c-RET als einer Anzeige für die NBN-Aktivität in einem ELISA gemessen, welcher spezifisch für das Vorkommen von phosphoryliertem RET war. NB41A3-mRL3-Zellen, eine adhärente murine Neuroblastom-Zelllinie, welche RET und GFRα3 exprimiert, wurden mit 2 × 105 Zellen pro Well in 24-Well-Platten in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum, eingebracht und für 18 h bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert.
  • Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit Reihenverdünnungen von NBN in 0,25 ml an DMEM für 10 min bei 37 °C und 5 % CO2 gewaschen. Jede Probe wurde zweifach analysiert. Die Zellen wurden mit 1 ml an PBS gewaschen und für 1 h bei 4 °C mit 0,30 ml an 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,5 % Nonidet P40, 0,2 % Natriumdeoxycholat, 50 mM NaF, 0,1 mM Na3VO4, 1 mM Phenylmethylsufonylfluorid unter leichtem Schütteln der Platten lysiert. Die Lysate wurden weiter durchmischt durch wiederholtes Pipettieren und 0,25 ml der Probe wurden in eine 96-Well ELISA-Platte, die mit 5 μg/ml an anti-RET mAb (AA.GE7.3) beschichtet war, in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6 bei 4 °C für 18 h überführt und bei Raumtemperatur für eine Stunde mit Blockpuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween-20 (TBST), welcher 1 % normales Mausserum und 3 % Rinderserumalbumin enthielt) geblockt.
  • Nach 2 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Wells 6-mal mit TEST gewaschen. Phosphoryliertes RET wurde nachgewiesen, indem Wells bei Raumtemperatur für 2 h mit 2 :g/ml an Meerretich-Peroxidase (HRP)-konjugiertem Antiphosphotyrosin 4G10-Antikörper in Blockpuffer inkubiert, 6-mal mit TEST gewaschen und die HRP-Aktivität bei 450 nm mit einem Farbnachweisreagenz gemessen wurde. Die Absorptionswerte der Wells, die mit Lysat oder mit Lysepuffer behandelt worden waren, wurden gemessen und das um den Nullabgleich korrigierte Signal als eine Funktion der Konzentration von in der Aktivierungsmischung vorliegendem NBN geplottet. Die Wirksamkeit von pegyliertem NBN in dem KIRA-ELISA betrug 10 nM und unterscheidet sich daher nicht von der Wirksamkeit in dem NBN-NK-Ausgangsmaterial. Die beiden Einfrier-Auftau-Zyklen hatten keinen Effekt auf die Wirksamkeit. Als Folge dieser Behandlung ergab sich kein deutlicher Anstieg in der Trübung der Probe, was darauf hindeutet, dass die Proben problemlos für die Studie aufgetaut werden können. In unabhängigen Studien, bei denen die Aktivität eines Produkts mit drei und vier 10 kDa PEGs/Molekül unabhängig bewertet wurde, wurde festgestellt, dass das Addukt mit drei PEGs voll aktiv war, während das Produkt mit vier PEGs eine reduzierte Aktivität zeigte.
  • Beispiel 4. Pharmakokinetische Studien über intern pegyliertes Ratten-Neublastin an Ratten und Mäusen
  • Es wurden die pharmakokinetischen Eigenschaften von verschiedenen pegylierten und nicht pegylierten NBN-Produkten in Ratten- und Mäusemodellen untersucht.
  • Die Daten zeigten, dass die Pegylierung von Ratten-NBN-NK mit 3,3, 10.000 PEGs eine bedeutende Wirkung auf die Halbwertszeit und die Bioverfügbarkeit von dem Neublastin ausübte. Im Anschluss an eine Verabreichung i.v. von 1 mg/kg an Sprague Dawley Ratten wurden Spitzenkonzentrationen von pegyliertem NBN von 3000 ng/ml nach 7 Minuten nachgewiesen und Konzentrationen von 700 ng/ml nach 24 h, 200 ng/ml nach 48 h und 100 ng/ml nach 72 h. Im Gegensatz dazu wurden für nicht pegyliertes NBN nach einer Verabreichung i.v. von 1 mg/kg Konzentrationen von 1500 ng/ml nach 7 Minuten nachgewiesen, doch dann dann fielen die Konzentrationen sehr rasch auf 70 ng/ml nach 3 h und waren nach 7 h gar nicht mehr nachweisbar. Die Effekte der Pegylierung waren noch deutlicher in Tieren, die mit pegyliertem NBN behandelt wurden, das subkutan verabreicht wurde.
  • Im Anschluss an eine Verbreichung s.c. von 1 mg/kg erreichten die zirkulierenden Konzentrationen von pegyliertem NBN nach 24 h ein Maximum von 200 ng/ml und diese Konzentration wurde für die Dauer der Studie, die sich auf 3 Tage belief, aufrechterhalten. Im Gegensatz dazu wurde zu keinem Zeitpunkt nach der Verabreichung von nicht modifiziertem NBN nachgewiesen.
  • Die Analysen der pegylierten NBN-Proben sind aufgrund des Vorkommens von Addukten, welche 2, 3 und 4 PEGs pro Molekül enthalten und jeweils ein anderes PK-Profil zeigen, kompliziert. In frühen Studien wurden Mäuse benutzt, um das Screening einer Vielzahl von Kandidaten und Verabreichungswegen zu erleichtern. Die Mausstudien zeigten drastische Unterschiede bei der Bioverfügbarkeit der Kandidaten. Als jedoch das 3,3 10K PEG-Addukt in Ratten bewertet wurde, stellte es sich heraus, dass dessen Bioverfügbarkeit in Ratten geringer war als in Mäusen. Dieser Unterschied in der Bioverfügbarkeit wurde insbesondere nachfolgend auf die Verabreichung i.p. deutlich. Die Konzentrationen in Mäusen erreichten 1600 ng/ml nach 7 h und blieben auf 400 ng/ml nach 24 h. Im Gegensatz dazu blieben die Konzentrationen in Ratten für 4-48 h konstant auf 100 ng/ml.
  • Sowohl Ratten-Neublastin vom Wildtyp (wt-NBN) als auch Neublastin mit einer Substitution von Lys anstelle von Asn an Position 95 (NK-NBN) wurden erneut gefaltet und bis auf >95 % für Effizienztest in dem Neuropathiemodell mit STZ-diabetischen Ratten gereinigt. Wt-NBN wurde so formuliert, dass es direkt zum Testen am Tier eingesetzt werden konnte, während NK-NBN für die Pegylierung mit 10 kDa PEG-SPA zubereitet wurde. Um das Neufalten und das Reinigungsziel zu erreichen, wurde eine Neufaltungsmethode mithilfe von Größenausschluschromatographie (SEC) entwickelt, welche die Renaturierung von NBN aus Einschlusskörpern von E. coli in großen Mengen und hohen Konzentrationen ermöglichte. Zusätzlich zur SEC wurden sowohl die Schritte über Ni-NTA- und CM-Silikasäulenchromatographie eingesetzt, um die letztendliche Proteinreinheit zu erhöhen. Die Proteine wurden einer umfassenden Charakterisierung unterzogen einschließlich Analyse durch SDS-PAGE Elektrophorese, Größenausschlusschromatographie, ESMS, Bewertung der Aktivität durch KIRA ELISA und Bestimmung des Endotoxingehalts. SDS-Page und SEC der Proteinendprodukte zeigten eine Reinheit, die größer war als 95 %. Die Endotoxinkonzentration eines jeden Produkts lag bei <0,2 EU/mg. Die spezifische Aktivität beider Proteine in dem KIRA ELISA betrug etwa 10 nM. Wt-NBN wurde mit 1,0 mg/ml und NK-NBN mit 2,6 mg/ml in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) pH 6,5 formuliert. Wt-NBN wurde in 15 ml-Röhrchen aliquotiert und tiefgefroren bei –70°C aufbewahrt, während NK-NBN vor der Aliquotierung und dem Einfrieren einer Pegylierung unterzogen wurde.
  • Beispiel 5. Neufaltung eines Wildtyp-Neublastins und des N95K-Neublastin-Muteins
  • Beide NBN-Formen wurden in E. coli als His-tagged Fusionsproteine mit einer Enterokinase-Spaltungsstelle direkt in der Nähe des Startpunkts der reifen 113-Aminosäuresequenz exprimiert. Bakterien, die entweder wt-(1,8 kg Pellet) oder NK-NBN (2,5 kg Pellet) exprimierten, wurden einer Lyse in 2 Litern PBS mithilfe einer Gaulin-Presse unterzogen. Darauf folgte eine Zentrifugation (10.000 U/min), um die Einschlusskörper zu pelletieren; die Überstände jeder Präparation wurden verworfen. Die Pellets der Einschlusskörper wurden zweimal mit Puffer (0,02 M Tris-HCl pH 8,5, 0,5 mM EDTA) gewaschen, dann zweimal mit dem gleichen Puffer, der Triton X-100 (2 Vol.%) enthielt, gefolgt von zwei zusätzlichen Pufferwaschgängen ohne Detergenz. Beide Pellets wurden mithilfe von 6 M Guanidinhydrochlorid, 0,1 M Tris pH 8,5, 0,1 M DTT und 1 mM EDTA solubilisiert. Um den Solubilisierungsprozess zu unterstützen, wurde jedes Pellet einer Homogenisierung mit einem Polytron-Homogenisator unterzogen und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die solubilisierten Proteine wurden durch Zentrifugation geklärt, bevor sie einer Chromatographie zur Denaturierung über Superdex 200 (5,5-Liter-Säule, äquilibriert mit 0,05 M Glycin/H3PO4 pH 3,0 mit 2 M Guanidin-HCl) mit einer Flussrate von 20 ml pro Minute, unterzogen wurden.
  • Denaturiertes NBN wurde durch SDS-PAGE Elektrophorese identifiziert. Fraktionen, die entweder wt-NBN oder NK-NBN enthielten, wurden gepoolt und auf etwa 250 ml mithilfe eines Amicon 2,5-Liter-Zellkonzentrators mit Rührwerk aufkonzentriert. Nach der Filtration zur Entfernung von Präzipitat wurde das konzentrierte Protein einer Chromatographie über eine Superdex 200 Säule, äquilibriert mit 0,1 M Tris-HCl pH 7,8, 0,5 M Guanidin-HCl, 8,8 mM reduziertem Glutathion und 0,22 mM oxidiertem Glutathion unterzogen, um die Größe des renaturierten Proteins zu bestimmen. Die Säule wurde mit 0,5 M Guanidin-HCl mit einer Flussrate von 20 ml pro Minute betrieben. Fraktionen, die renaturiertes wt-NBN oder NK-NBN enthielten, wurden durch SDS-PAGE identifiziert, gepoolt und bei 4 °C gelagert, bis sie für das Entfernen des His-Tag gebraucht wurden
  • Aufkonzentration von NBN mithilfe von Ni-NTA Chromatographie (TR5919-138).
  • Renaturiertes NBN wurde bei 4 °C für mindestens 24 Stunden aufbewahrt, bevor mit der Reinigung begonnen wurde, um die Disulfidbrückenbildung zwischen den NBN-Monomeren zu fördern. Während dieser Zeit bildete sich ein Präzipitat, welches durch Filtration über eine PES-Filtereinheit 0,2 μ entfernt wurde. Um die nicht spezifische Bindung gering zu halten, wurde die Proteinlösung auf 20 mM Imidazol eingestellt, bevor sie auf eine 100 ml Ni-NTA (Quiagen) Säule, äquilibriert mit Säulenpuffer (0,5 M Guanidin und 20 mM Imidazol) mit 50 ml pro Minute geladen wurde. Im Anschluss an die Proteinaufgabe wurde die Säule mit dem gleichen Puffer gewaschen, bis sich die Basislinie wieder einstellte. NBN wurde aus dem Harz eluiert unter Verwendung von etwa 300 ml Elutionspuffer, der 0,5 M Guanidin-HCl und 0,4 M Imidazol enthielt. Nach der Elution wurde NBN über Nacht bei Raumtemperatur dialysiert (unter Verwendung von 10 kDa Dialyseschläuchen) gegen 10 Volumina an 5 mM HCl. Die Dialyse fördert die Hydrolyse von kontaminierenden Substanzen und verringert die Konzentrationen von Guanidin-HCl und Imidazol auf 0,05 M beziehungsweise auf 0,04 M.
  • Spaltung des His-Tag durch Lysyl-Endopeptidase oder -Enterokinase.
  • Am nächsten Tag wurde Präzipitat, das sich während der Dialyse gebildet hatte, durch Filtration entfernt. Die Proteinprobe wurde durch die Zugabe von 5 M Stocklösung einschließlich des restlichen Guanidin-HCl von etwa 150 mM für das Erreichen einer Endsalzkonzentration auf 0,1 M NaCl eingestellt. Diese Konzentration wurde mittels Konduktivitätsmessung bestätigt. Zusätzlich wurde 1 M HEPES pH 8 zugegeben, um eine Endkonzentration von 25 mM zu erreichen. Um das Tag zu spalten, wurde Lysyl- Endopeptidase zu wt-NBN gegeben und Enterokinase wurde zu NK-NBN gegeben, beide in einem annähernden Verhältnis von Protease zu NBN von 1:300. Enterokinase wurde anstelle von Lysyl-Endopeptidase für NK-NBN eingesetzt, aufgrund einer zusätzlichen Proteinspaltungsstelle in dem mutierten Protein an Lys 95. Die Proben wurden bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt und die Verdauung mittels SDS-PAGE Elektrophorese überwacht.
  • Entfernen des His-Tag durch Ni-NTA Chromatographie
  • Proteasebehandeltes NBN wurde auf eine 100 ml Ni-NTA Säule gegeben und mit 0,5 M Guanidin-HCl und 20 mM Imidazol mit einer Flussrate von 50 ml pro Minute äquilibriert. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen, bis die Basislinie wieder erreicht war. Protein, das aus der Säule ausgewaschen wurde, wurde mit dem durchlaufenden Protein, welches NBN ohne das His-Tag enthielt, gepoolt.
  • CM Silika-Chromatographie
  • Im Anschluss an die Ni-NTA Chromatographie wurde das Protein sofort einer weiteren Reinigung über CM Silikaharz unterzogen. Eine 20 ml CM Silika-Säule, äquilibriert mit Aufgabepuffer (5 mM Phosphat pH 6,5, 150 mM NaCl) wurde mit NBN mit einer Flussrate von 20 ml pro Minute aufgegeben. Die Säule wurde mit zwanzig Säulenvolumina an Waschpuffer (5 mM Phosphat pH 6,5, 400 mM NaCl) gewaschen, und der Proteinschritt eluierte mit Elutionspuffer, der 5 mM Phosphatpuffer pH 6,5 aber auch 1 M NaCl enthielt. Das eluierte Protein wurde über Nacht gegen das Phosphat allein dialysiert, um die Salzkonzentration auf 100 mM für NK-NBN und 150 mM für wt-NBN zu verdünnen. Beide Proben wurden durch eine PES-Filtereinheit 0,2 μ filtriert, über SDS-PAGE analysiert und bei 4°C gelagert, bis sie zur weiteren Charakterisierung und/oder Pegylierung gebraucht wurden.
  • Wt-NBN und NK-NBN wurden UV-Spektrumanalysen unterzogen, um ihre Absorption bei 280 nm zu bewerten. Unter Verwendung einer Mikroquartzküvette und nach Nullabgleich gegen den Puffer allein, wurden entweder 100 μl wt-NBN oder NK-NBN kontinuierlich von 230 bis 330 nm mit einem Beckman Spektrophotometer gescannt.
  • Basierend auf dieser Analyse wurde die Konzentration von wt-NBN mit 1,1 mg/ml und die Konzentration von NK-NBN mit 2,6 mg/ml (A280 nm-E0,1 % = 0,5 eingesetzt für jedes Protein) bestimmt. Weniger als 1 % des präzipitierten Materials wurde ausgehend von einer Absorption bei 330 nm identifiziert.
  • Um die Reinheit beider Proteinpräparationen zu prüfen, wurde jede Probe (0,5 mg) einer Größenausschlusschromatographie über eine 16/30 Superdex 75 Säule unterzogen. Die Säule wurde mit 5 mM Phosphat, pH 6,5, enthaltend 400 mM NaCl, äquilibriert und mit einer Flussrate von 1,5 ml pro Minute betrieben. Basierend auf der Absorption bei 280 nm, wanderten sowohl wt-NBN als auch NK-NBN als ein einziger Peak mit einem erwarteten Molekulargewicht (23-24 kDa); sie enthielten keine bedeutende Proteinkontamination.
  • Sowohl wt-NBN als auch NK-NBN wurde in 2,5 M Guanidin-HCl, 60 mM Tris, pH 8,0 und 16 mM DTT reduziert. Die reduzierten Proben wurden über eine kurze C4 Säule entsalzt und online durch ESMS mithilfe eines Triele-Quadrupol-Massenspektrometers analysiert. Die ESMS-Rohdaten wurden mithilfe des Programms MaxEnt aufgelöst, um Massenspektren zu erzeugen. Dieses Verfahren ermöglicht es, multiple geladene Signale in einem Peak zusammenzufassen, welcher direkt mit der Molekularmasse in Kilodaltons (kDa) übereinstimmt. Das aufgelöste Massenspektrum für wt-NBN zeigte, dass die vorwiegenden Spezies bei 12046 kDa lagen, was mit dem vorhergesagten Molekulargewicht von 12046,7 kDa für die 113-Aminosäureform des Proteins übereinstimmt. Ein kleinerer Bestandteil wurde auch beobachtet (12063 kDa) und ließ das Vorkommen eines Oxidationsprodukts annehmen. Drei Peaks wurden in der Probe von NK-NBN identifiziert. Die Hauptkomponente zeigte eine offensichtliche Molekularmasse von 11345 kDa in Übereinstimmung mit der vorhergesagten Masse für die 106-Aminosäureform des Proteins. Die beiden anderen Peaks hatten eine Masse von 11362 beziehungsweise von 12061 kDa, was NK-NBN-Oxidation beziehungsweise das Vorkommen der 113-Aminosäureform vermuten lässt.
  • Das Vorkommen der 106- und 113-Aminosäureformen in der NK-NBN-Präparation ist auf die Verdauung mit Enterokinase zurückzuführen. Bei dieser Protease von Biozyme handelt es sich um eine natürliche Enzympräparation, die aus der Darmschleimhaut vom Kalb gereinigt wurde und mit einer leichten Trypsinkontamination (0,25 ng Trypsin pro μg Enterokinase) angegeben ist. Daher kann Trypsin möglicherweise auf NK-NBN an der carboxyterminalen Seite von Arg 7 wirken, um die vorherrschende 106-Aminosäureform herzustellen. Andererseits handelt es sich bei der Lysyl-Endopeptidase, die zur Spaltung von wt-NBN benutzt wurde, um die Aktivität einer einzelnen Protease, die an der carboxyterminalen Seite des Lysinrests, welcher innerhalb des His-Tag enthalten ist, wirkt, um die reife 113 Aminosäure-NBN-Form zu bilden. Sowohl die 106- als auch die 113-Aminosäureformen von NBN sind in allen getesteten Assays gleichermaßen aktiv und verhalten sich ähnlich in Stabilitätstests mit Guanidin-HCl.
  • Die NBN-Aktivität wurde bestimmt anhand ihrer Fähigkeit die c-RET-Phosphorylierung in NB41A3-mRL3-Zellen über den KIRA ELISA, der in Beispiel 3 beschrieben ist, zu stimulieren. Phosphoryliertes RET wurde nachgewiesen durch Inkubation (2 Stunden) des aufgefangenen Rezeptors mit HRP-konjugiertem Phosphotyrosinantikörper (4G10, 0,2 μg pro Well). Im Anschluss an die Inkubation wurden die Wells sechsmal mit TEST gewaschen und die HRP-Aktivität bei 450 nm mit einem kolorimetrischen Assay nachgewiesen. Die Absorptionswerte der mit Lysat behandelten Wells oder der mit Lysepuffer allein behandelten Wells wurde gemessen, durch Nullabgleich korrigiert und die Daten als eine Funktion der Konzentration von Neublastin, die in der Aktivierungsmischung vorliegt, geplottet. Die Daten zeigen, dass das gereinigte NBN zum Auftreten von phosphoryliertem RET führte, was darauf hindeutet, dass das gereinigte NBN in diesem Assay aktiv war.
  • Beispiel 6. Herstellung eines Serum-Albumin-Neublastinkonjugats.
  • Ratten-Neublastin vom Wildtyp in einer Konzentration von 1 mg/ml in PBS wurde mit 1mM Sulfo-SMCC (Pierce) behandelt und entsalzt, um überschüssigen Crosslinker zu entfernen. Da das Wildtyp-NBN-Protein nur ein einziges Amin an seinem N-Terminus und keine freie Sulfhydrylgruppen enthält, wurde erwartet, dass die Reaktion mit SMCC zu einer ortsspezifischen Modifikation des NBN mit SMCC, das an seinem N-Terminus angebracht wird, führt.
  • 60 μg des NBN-SMCC-Konjugats wurden mit 120 μg Rinderserumalbumin (BSA) inkubiert und auf das Ausmaß der Quervernetzung mittels SDS-PAGE untersucht. BSA enthält eine einzige freie SH-Gruppe und demzufolge wird erwartet, dass eine Reaktion mit NBN-SMCC-Konjugat zu einer Modifikation an dieser Stelle durch das Maleimid an dem SMCC führt. Unter diesen Bedingungen wurden zwei zusätzliche Banden mit höherem Molekulargewicht beobachtet, welche in Bezug auf die Masse mit der Modifikation des NBN mit einem einzigen BSA-Anteil und mit zwei BSA-Molekülen übereinstimmen, da jedes NBN-Molekül zwei N-Termini aufweist, bei denen eine Reaktion ablaufen kann, was folglich zu der Beobachtung passt. Gleichzeitig mit der Bildung dieser Banden kam es zu einer Abnahme in der Intensität der NBN-SMCC und BSA-Banden. Basierend auf der Intensität der verbleibenden NBN-Bande schien die Reaktion zu 70-80 % vollständig abgelaufen zu sein.
  • Das monosubstituierte Produkt wurde aus der Reaktionsmischung gereinigt, indem das Material einer Kationenaustauscherchromatographie und einer Größenauschlusschromatographie auf einer Superdex 200 Säule (Pharmacia) unterzogen wurde, wie sie im Wesentlichen für die oben besprochenen Pegylierungsstudien beschrieben wurden. Die Säulenfraktionen aus dem Gelfiltrationslauf wurden mittels SDS-PAGE analysiert und diejenigen, die das monosubstituierte Produkt enthielten, wurden auf ihren Proteingehalt hin analysiert mithilfe der Absorption bei 280 nm. Da BSA fast die doppelte Masse wie Neublastin besitzt, wurde die offensichtliche Konzentration dividiert durch einen Faktor von 3, um das NBN-Äquivalent zu erhalten. Diese Fraktion wurde so behandelt, um ihre Funktion in dem KIRA ELISA zu analysieren. IC50-Werte für sowohl das wt- als auch das BSA-konjugierte NBN lagen bei 3-6 nM, was darauf hindeutete, dass die Konjugation mit dem BSA die Funktion nicht beeinträchtigt hat.
  • Diese vorläufigen Studien wurden zwar mit BSA durchgeführt, doch enthalten auch die entsprechenden Serumalbuminproteine von Ratten und vom Menschen eine freie SH-Gruppe. Demzufolge kann eine ähnliche Vorgehensweise angewandt werden, damit ein Ratten-Serumalbumin-Ratten-NBN-Konjugat erzeugt werden kann, um PK- und Wirksamkeitsstudien an Ratten und mit humanem Serumalbumin-humanem Neublastin in klinischen Studien durchzuführen. Ähnlich kann SMCC mit einer beliebigen Anzahl von Crosslinkern substituiert werden, welche eine aminoreaktive Gruppe an einer Seite und eine thiolreaktive Gruppe an der anderen Seite enthalten. Beispiele für aminreaktive Crosslinker, die ein thiolreaktives Maleimid einführen, sind AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS oder GMBS; Beispiele für Crosslinker, die eine thiolreaktive Haloacetatgruppe einführen, sind SBAP, SIA, SIAB und Beispiele für Crosslinker, die ein geschütztes oder nicht geschütztes Thiol für die Reaktion mit Sulfhydrylgruppen bereitstellen, um eine reduzierte Verbindung herzustellen, sind SPDP, SMPT, SATA oder SATP, wobei alle über Pierce erhältlich sind. Solche Crosslinker sind nur als Beispiele aufgeführt, und es werden viele andere Strategien erwartet, um den N-Terminus von NBN mit Serumalbumin zu verbinden. Ein Fachmann auf diesem Gebiet könnte auch Serumalbumin-Konjugate herstellen, bei denen nicht der N-Terminus von NBN oder der Thiolanteil an Serumalbumin das Angriffsziel ist. Von Fusionen von NBN-Serumalbumin, die mithilfe der Gentechnik erzeugt wurden, wobei NBN an das Serumalbumingen an seinem N-Terminus, C-Terminus oder an beiden Enden fusioniert ist, wird erwartet, dass sie funktionell sind.
  • Diese Methode kann durch routinemäßige Anpassungen an jedem beliebigen NBN-Serumalbumin, welches zu einem Produkt mit einer längeren Halbwertszeit bei Tieren und folglich beim Menschen führen würde, erweitert werden.
  • SEQUENZLISTE
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Claims (22)

  1. Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens zu 90% identisch zu Aminosäuren 8-113 der SEQ ID NO:1 ist, wobei das Polypeptid, an der Position entsprechend Position 95 in SEQ ID NO:1, eine Aminosäure anders als Asparagin enthält, wobei die Aminosäure, substituiert an der Position, die der Position 95 entspricht, eine Stelle einführt, an der Polyalkylenglykol an das Polypeptid angebracht werden kann.
  2. Das Polypeptid gemäß Anspruch 1, wobei die Aminosäure an der Position, die Position 95 in SEQ ID NO:1 entspricht, Lysin ist.
  3. Das Polypeptid gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, wobei das Polypeptid eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Aminosäuren 8-94 und 96-113 der SEQ ID NO:2; (b) Aminosäuren 8-94 und 96-113 der SEQ ID NO:3; und (c) Aminosäuren 8-94 und 96-113 der SEQ ID NO:4.
  4. Das Polypeptid gemäß Anspruch 1, umfassend die Aminosäuren 1-94 und 96-113 der SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4, wobei Lysin an Position 95 Asparagin ersetzt.
  5. Das Polypeptid gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, wobei die Aminosäuresequenz mindestens zu 95% identisch zu Aminosäuren 8-113 der SEQ ID NO:1 ist.
  6. Das Polypeptid gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Polypeptid, wenn dimerisiert, durch mindestens eine biologische Aktivität charakterisiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: a. Bindung an GFRα3; b. Stimulierung der Tyrosinphosphorylierung eines RET Polypeptids; c. Erhöhung des Überlebens von Neuronen; und d. Normalisierung pathologischer Veränderungen in einem Neuron.
  7. Fusionsprotein, umfassend das Polypeptid gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, fusioniert an einen zweiten Rest.
  8. Das Fusionsprotein gemäß Anspruch 7, wobei der zweite Rest ein humanes Serumalbumin-Polypeptid ist.
  9. Nukleinsäure, die das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder das Fusionsprotein gemäß den Ansprüchen 7 oder 8 kodiert.
  10. Vektor, umfassend die Nukleinsäure nach Anspruch 9.
  11. Wirtszelle, umfassend den Vektor nach Anspruch 10.
  12. Die Wirtszelle nach Anspruch 11, wobei die Wirtszelle eine Chinesische Hamsterovarzelle ist.
  13. Verfahren zur Herstellung des Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder des Fusionsproteins gemäß den Ansprüchen 7 oder 8, umfassend (a) Kultivierung der Wirtszelle gemäß den Ansprüchen 11 oder 12 unter Bedingungen, die Expression des Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder des Fusionsproteins gemäß den Ansprüchen 7 oder 8 erlauben, und (b) Zurückgewinnung des Polypeptids oder des Fusionsproteins.
  14. Ein Dimer, umfassend zwei Polypeptide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder zwei Fusionsproteine gemäß den Ansprüchen 7 oder 8.
  15. Konjugat, umfassend das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, das an ein Polyalkylenglykol konjugiert ist, wobei das Polyalkylenglykol an das Polypeptid an der Aminosäure konjugiert ist, die an der Position substituiert ist, die der Position 95 der SEQ ID NO:1 entspricht.
  16. Konjugat, umfassend das Fusionsprotein gemäß den Ansprüchen 7 oder 8, das an ein Polyalkylenglykol konjugiert ist, wobei das Polyalkylenglykol an das Fusionsprotein an der Aminosäure konjugiert ist, die an der Position substituiert ist, die der Position 95 der SEQ ID NO:1 entspricht.
  17. Das Konjugat nach den Ansprüchen 15 oder 16, wobei das Polyalkylenglykol Polyethylenglykol ist.
  18. Das Konjugat gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei das Polypeptid glykosyliert ist.
  19. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, das Fusionsprotein gemäß den Ansprüchen 7 oder 8, oder das Konjugat gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18 und ein physiologisch annehmbares Vehikel.
  20. Das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, das Fusionsprotein gemäß den Ansprüchen 7 oder 8, oder das Konjugat gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18 zur Verwendung in der Therapie.
  21. Verwendung des Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, des Fusionsproteins gemäß den Ansprüchen 7 oder 8, oder des Konjugats gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention einer Krankheit oder Fehlfunktion des Nervensystems.
  22. Die Verwendung gemäß Anspruch 21, wobei die Krankheit oder die Fehlfunktion eine periphere Neuropathie oder ein neuropathisches Schmerzsyndrom ist.
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