ES2289091T3 - Conjugados polimeros de neublastina y metodos para usar los mismos. - Google Patents

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Paula Ann Borjack-Sjodin
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Abstract

Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a los aminoácidos 8-113 del Nº ID SEC: 1, en donde el polipéptido incluye un aminoácido distinto de asparagina en la posición correspondiente a la posición 95 en el Nº ID SEC: 1, en donde el aminoácido substituido en la posición correspondiente a la posición 95 introduce un sitio en el que un polialquilenglicol puede ligarse al polipéptido.

Description

Conjugados polímeros de neublastina y métodos para usar los mismos.
Campo de la invención
La invención se refiere generalmente a polipéptidos y más particularmente a polipéptidos neurotróficos modificados y a métodos para usar estos polipéptidos modificados.
Antecedentes de la invención
Los factores neurotróficos son proteínas presentes en la naturaleza que promueven la supervivencia, mantienen la diferenciación fenotípica, evitan la degeneración y potencian la actividad de células y tejidos neuronales. Los factores neurotróficos se aíslan de tejido neural y de tejido no neural que está inervado por el sistema nervioso, y se han clasificado en grupos relacionados funcionalmente y estructuralmente, también denominados familias, superfamilias o subfamilias. Ente las superfamilias de factores neurotróficos están las superfamilias de factores de crecimiento de fibroblastos, neurotrofinas y factores de crecimiento transformantes \beta (TGF-\beta). Las especies individuales de factores neurotróficos se distinguen por su estructura física, su interacción con sus receptores cognados y sus efectos sobre diversos tipos de células nerviosas. Clasificados dentro de la superfamilia de TGF-\beta están los ligandos de factor neurotrófico derivado de líneas celulares gliales (GDNF), que incluyen GDNF, persefina (PSP) y neurturina
(NTN).
Los ligandos de la subfamilia de GDNF tienen en común su capacidad para inducir señalización a través de la tirosina quinasa receptora RET. Estos tres ligandos de la subfamilia de GDNF difieren en sus afinidades relativas para una familia de receptores neurotróficos, los receptores GFR\alpha.
Un factor neutrotófico recientemente descrito es la "neublastina" o "NBN". La neublastina se clasifica dentro de la subfamilia de los GDNF debido a que comparte regiones de homología con otros ligandos de GDNF y debido a su capacidad para unirse a, y activar, RET. A diferencia de otros ligandos de GDNF, la neublastina es altamente selectiva para el complejo GFR\alpha3-receptor RET. Además, la NBN contiene subregiones únicas en su secuencia de aminoácidos.
Desgraciadamente, la neublastina es depurada rápidamente por el cuerpo. Esta depuración rápida puede frustrar el uso de neublastina en aplicaciones terapéuticas. Así, existe una necesidad de identificar variantes de neublastina que tengan biodisponibilidad incrementada.
La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de nuevas formas de neublastina que muestran propiedades farmacocinéticas y de biodisponibilidad potenciadas in vivo. Estas nuevas formas incluyen polipéptidos de neublastina variantes conjugados a moléculas polímeras.
En un aspecto, la invención presenta un polipéptido de neublastina variante, o polipéptido de neublastina muteínico, que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una o más substituciones de aminoácidos en posiciones expuestas a disolventes del dímero de neublastina maduro. Las presentes substituciones introducen en el polipéptido de neublastina natural uno o más sitios en los que substancias, tales como polímeros presentes en la naturaleza o sintéticos, pueden ligarse a los polipéptidos a fin de potenciar su solubilidad y, de ahí, su biodisponibilidad, in vivo. Preferiblemente, los presentes polipéptidos variantes incluyen una secuencia de aminoácidos al menos 70% idéntica a los aminoácidos 8-113 del Nº ID SEC: 1. El polipéptido de neublastina variante incluye una o más substituciones de aminoácido en las que un aminoácido distinto de la arginina se presenta en la posición 14 en la secuencia de aminoácidos del polipéptido variante, un aminoácido distinto de la arginina en la posición 39 se presenta en la secuencia de aminoácidos del polipéptido variante, un aminoácido distinto de la arginina en la posición 78 se presenta en el polipéptido variante o un aminoácido distinto de la asparagina en la posición 95 se presenta en el polipéptido variante, cuando las posiciones de los aminoácidos se numeran de acuerdo con la secuencia polipeptídica del
Nº ID SEC: 1.
Según se usa aquí, "neublastina silvestre" o "wt-NBN" se refiere a la secuencia polipeptídica de neublastina presente en la naturaleza o natural, tal como la de neublastina de rata, ratón o ser humano (véanse, por ejemplo, los Nº ID SEC: 2, 3 ó 4). Polipéptidos de neublastina variantes específicos se denominan aquí "NBN-X_{1}N_{1}X_{2}" o "X_{1}N_{1}X_{2}-NBN", en donde X_{1} se refiere a un aminoácido de un polipéptido de neublastina silvestre, N_{1} se refiere a la posición numérica de los aminoácidos X_{1} en la secuencia, que se numera de acuerdo con el Nº ID SEC: 1. X_{2} se refiere a un aminoácido que substituye al aminoácido silvestre en la posición numérica indicada en la secuencia. Así, por ejemplo, NBN-N95K identifica los polipéptidos de neublastina variantes en los que la asparagina en la posición 95 se reemplaza por una lisina.
El polipéptido de neublastina variante puede proporcionarse como un polipéptido multímero. Por ejemplo, el polipéptido de neublastina variante puede proporcionarse como un dímero que incluye al menos un polipéptido de neublastina variante. En algunas modalidades, el dímero es un homodímero de polipéptidos de neublastina variantes. En otras modalidades, el dímero es un heterodímero que incluye un polipéptido de neublastina variante y un polipéptido de neublastina silvestre. Otros dímeros pueden incluir dos formas de polipéptido de neublastina variante diferentes.
En algunas modalidades, el polipéptido de neublastina variante incluye los aminoácidos 1-7 del Nº ID SEC: 1 además de los aminoácidos 8-113.
En modalidades preferidas, el polipéptido de neublastina variante, cuando se dimeriza, se une a GFR\alpha3. En modalidades preferidas adicionales, el polipéptido de neublastina variante, cuando se dimeriza, estimula la fosforilación de tirosina de un polipéptido de RET, bien por sí mismo o bien cuando está unido a GFR\alpha3.
En otras modalidades preferidas más, el polipéptido de neublastina variante, cuando se dimeriza, potencia la supervivencia de neuronas, por ejemplo, potencia la supervivencia de una neurona sensorial.
En otras modalidades preferidas adicionales, el polipéptido de neublastina variante, cuando se dimeriza, normaliza cambios patológicos de una neurona, tal como una neurona sensorial.
En otras modalidades preferidas adicionales, el polipéptido de neublastina variante, cuando se dimeriza, potencia la supervivencia de una neurona, por ejemplo una neurona autónoma o una neurona dopaminérgica.
En algunas modalidades, el polipéptido variante incluyen dos, tres o más de las substituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en un aminoácido distinto de arginina en la posición 14 en la secuencia de aminoácidos del polipéptido variante, un aminoácido distinto de arginina en la posición 39 en la secuencia de aminoácidos del polipéptido variante, un aminoácido distinto de arginina en la posición 68 del polipéptido variante y un aminoácido distinto de asparagina en la posición 95 del polipéptido variante.
En modalidades preferidas, el aminoácido en una o más de las posiciones 14, 39, 68 y 95 es lisina.
Preferiblemente, los aminoácidos 8-94 y 96-113 del polipéptido de neublastina variante son al menos 90% idénticos a los aminoácidos 8-94 y 96-113 del Nº ID SEC: 1. Más preferiblemente, las secuencias de aminoácidos son al menos 95% idénticas a las mismas. Lo más preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina variante incluye la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de neublastina de rata, ser humano o ratón presente en la naturaleza en los aminoácidos 8-94 y 96-113 del polipéptido de neublastina variante. Por ejemplo, los aminoácidos 8-94 y 96-113 del polipéptido de neublastina variante pueden incluir la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 8-94 y 96-113 del Nº ID SEC: 2, el Nº ID SEC: 3 o el Nº ID SEC: 4.
También se proporciona mediante la invención una proteína o un polipéptido de fusión que incluye un polipéptido de neublastina variante o un polipéptido de neublastina silvestre o una proteína que es un dímero de dos proteínas de fusión de neublastina. Las proteínas de fusión de neublastina también tienen propiedades farmacocinéticas y de biodisponibilidad potenciadas in vivo.
En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neublastina variante. El ácido nucleico que codifica el polipéptido de neublastina variante se proporciona preferiblemente en un vector, por ejemplo un vector de expresión. Un ácido nucleico de neublastina variante, o un vector que incluye el mismo, puede proporcionarse en una célula. La célula puede ser, por ejemplo, una célula mamífera, una célula fúngica, una célula de levadura, una célula de insecto o una célula bacteriana. Una célula mamífera preferida es una célula de ovario de hámster chino ("célula CHO").
También se proporciona mediante la invención un método para elaborar un polipéptido de neublastina variante, cultivando una célula que contiene un ácido nucleico que codifica un ácido nucleico de neublastina variante bajo condiciones que permiten la expresión de un polipéptido de neublastina variante. Si se desea, el polipéptido de neublastina variante puede recuperarse a continuación. La invención incluye además el polipéptido de neublastina variante producido por la célula. Ácidos nucleicos, vectores, células huésped y métodos de producción de polipéptidos similares se describen aquí para las proteínas de fusión (tal como las proteínas de fusión de neublastina-albúmina de suero) de esta invención.
También se proporciona mediante la invención una composición que incluye un polipéptido de neublastina o un polipéptido de neublastina variante acoplado a un polímero no presente en la naturaleza. El polipéptido de neublastina variante en la composición incluye preferiblemente una secuencia de aminoácidos al menos 70% idéntica a los aminoácidos 8-113 del Nº ID SEC: 1, con tal de que el polipéptido de neublastina variante incluya una o más de las substituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en un aminoácido distinto de arginina en la posición 14 en la secuencia de aminoácidos del polipéptido variante, un aminoácido distinto de arginina en la posición 39 en la secuencia de aminoácidos del polipéptido variante, un aminoácido distinto de arginina en la posición 68 del polipéptido variante y un aminoácido distinto de asparagina en la posición 95 del polipéptido variante, en donde las posiciones de los aminoácidos se numeran de acuerdo con la secuencia polibpeptídica del Nº ID SEC: 1.
En modalidades preferidas, el polímero comprende un resto de polialquilenglicol, por ejemplo un resto de polietilenglicol (PEG).
En modalidades preferidas, el resto de polialquilenglicol se acopla a un grupo amina del polipéptido de neublastina o una lisina en el polipéptido de neublastina variante.
El acoplamiento puede producirse a través de un éster activo de N-hidroxisuccinimida (NHS). El éster activo puede ser, por ejemplo, PEG-succinato de succinimidilo (SS-PEG), butirato de succinimidilo (SPB-PEG) o propionato de succinimidilo (SPA-PEG).
El resto de polialquilenglicol puede ser, por ejemplo, carbometil-NHS, norleucina-NHS, SC-PEG, tresilato, aldehído, epóxido, carbonilimidazol o carbonato de PNP.
En algunas modalidades, el resto de polialquilenglicol se acopla a un grupo cisteína de un polipéptido de neublastina o un polipéptido de neublastina variante. Por ejemplo, el acoplamiento puede producirse a través de un grupo maleimida, un grupo vinilsulfona, un grupo haloacetato y un grupo tiol.
En algunas modalidades, el polipéptido de neublastina o el polipéptido de neublastina variante en la composición está glicosilado. Cuando el polipéptido o el polipéptido de neublastina variante está glicosilado, el polímero puede acoplarse a un resto de carbohidrato del polipéptido de neublastina o el polipéptido de neublastina variante glicosilado. Por ejemplo, el polímero puede acoplarse al polipéptido de neublastina o el polipéptido de neublastina variante glicosilado después de la oxidación de un grupo hidrazol o un grupo amino del polipéptido de neublastina o el polipéptido de neublastina variante glicosilado, o la oxidación de un grupo reactivo del polímero.
En diversas modalidades, el polipéptido de neublastina o el polipéptido de neublastina variante comprende uno, dos, tres o cuatro restos de PEG.
En modalidades preferidas, el polipéptido de neublastina, el polipéptido de neublastina variante o el conjugado polímero tiene una semivida en suero más prolongada con relación a la semivida del polipéptido o el polipéptido variante en ausencia del polímero.
En modalidades preferidas, el polipéptido de neublastina, el polipéptido de neublastina variante o el conjugado polímero en el complejo tiene una actividad fisiológica seleccionada del grupo que consiste en: unión a GFR\alpha3, activación de RET, normalización de cambios patológicos de una neurona o potenciación de la supervivencia de neuronas.
Por "normalización de cambios patológicos de una neurona" se entiende que el presente conjugado induce un cambio en uno o más de los siguientes parámetros celulares: nivel de expresión de una proteína estructural, un receptor de factor neurotrófico, un canal iónico o un neurotransmisor, o induce un cambio en la morfología celular, en cada caso a fin de restaurar substancialmente tal parámetro hasta el nivel del mismo en una neurona de un fenotipo igual o similar que no está afectada por enfermedad, degeneración, daño o lesión. La normalización de cambios patológicos de una neurona puede verificarse inmunohistológicamente, o determinando cambios en los niveles de productos celulares secretados o liberados, o determinando cambios in vivo en el comportamiento fisiológicamente atribuibles a la función de la neurona o las neuronas afectadas. Por ejemplo, en el caso de cambios patológicos asociados con un síndrome de dolor neuropático, pueden verificarse comportamientos de dolor tales como hiperalgesia, hipoalgesia o alodinia.
Por "mejora de la supervivencia neuronal" se entienden prolongar la supervivencia de una neurona afectada más allá del período de supervivencia observado en una neurona correspondiente afectada por el mismo tipo de enfermedad, trastorno, daño o lesión pero no tratada con el conjugado o la proteína de fusión de neublastina de esta invención.
En algunas modalidades, el polímero se acopla al polipéptido en un sitio de la neublastina que es un extremo N. En algunas modalidades, el polímero se acopla al polipéptido en un sitio en un aminoácido no terminal del polipéptido de neublastina o el polipéptido de neublastina variante.
En modalidades preferidas, el polímero se acopla un aminoácido expuesto a disolvente del polipéptido de neublastina o el polipéptido de neublastina variante.
En modalidades preferidas, el polímero se acopla al polipéptido de neublastina o el polipéptido de neublastina variante en un residuo seleccionado del grupo que consiste en el aminoácido aminoterminal del polipéptido variante, la posición 14 en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina o el polipéptido de neublastina variante, la posición 39 en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina o el polipéptido de neublastina variante, la posición 68 en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina o el polipéptido de neublastina variante y la posición 95 en la secuencia de aminoácidos del polipéptido o el polipéptido variante de neublastina.
También se proporciona mediante la invención una composición farmacéutica que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable que contiene o que tiene dispersado en el mismo un polipéptido de neublastina, un polipéptido de neublastina variante o un conjugado de la presente invención.
En un aspecto adicional, la invención incluye un complejo de polipéptido de neublastina o polipéptido de neublastina variante conjugado, soluble en agua, estable, que comprende un polipéptido de neublastina o un polipéptido de neublastina variante acoplado a un resto de polietilenglicol, en el que el polipéptido de neublastina o el polipéptido de neublastina variante está acoplado al resto de polietilenglicol mediante un enlace lábil. En algunas modalidades, el enlace lábil es segmentable mediante hidrólisis bioquímica, proteolisis o segmentación de sulfhidrilo. En modalidades preferidas, el enlace lábil se segmenta bajo condiciones in vivo.
También se proporciona mediante la invención un método para elaborar un polipéptido de neublastina modificado que tiene actividad prolongada, in vitro o in vivo, con relación a una neublastina silvestre, proporcionando un polipéptido de neublastina o un polipéptido de neublastina variante y acoplando el polipéptido o el polipéptido de neublastina variante modificado a un resto polímero no presente en la naturaleza, formando de ese modo una composición de polímero-polipéptido de neublastina acoplados.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para tratar o prevenir un trastorno del sistema nervioso en un sujeto (tal como un ser humano), administrando a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de neublastina variante, una composición que contiene un polipéptido de neublastina o un polipéptido de neublastina variante acoplado a un polímero, o un complejo que incluye un complejo de polipéptido de neublastina o polipéptido de neublastina variante conjugado, soluble en agua, estable, que comprende un polipéptido de neublastina o un polipéptido de neublastina variante acoplado a un resto de polietilenglicol.
Preferiblemente, el trastorno del sistema nervioso es un trastorno nervioso periférico, tal como una neuropatía periférica o un síndrome de dolor neuropático. Los seres humanos son los sujetos preferidos para el tratamiento.
La administración puede ser, por ejemplo, sistémica u oral.
A no ser que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto normal en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí en la práctica o las pruebas de la invención, métodos y materiales adecuados se describen posteriormente. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas aquí se incorporan mediante referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones, dominará. Además, los materiales, los métodos y los ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser limitativos.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción detallada y las reivindicaciones siguientes.
Descripción detallada de la invención
La invención proporciona nuevos polipéptidos de neublastina variantes que pueden modificarse para potenciar sus propiedades farmacocinéticas y de biodisponibilidad. Polipéptidos de neublastina variantes preferidos tienen secuencias de aminoácidos alteradas que facilitan el acoplamiento a un agente polímero tal como un polímero de polialquilenglicol.
Polipéptidos de Neublastina Variantes
La invención proporciona polipéptidos de neublastina que tienen secuencias de aminoácidos variantes con respecto a una secuencia de polipéptido de neublastina silvestre. Las secuencias de aminoácidos de polipéptidos de neublastina de ser humano y ratón se describen en WO00/01815. Ejemplos de polipéptidos de neublastina variantes de acuerdo con la invención se presentan en la Tabla 1.
Preferiblemente, los residuos alterados en el polipéptido de neublastina variante se eligen para facilitar el acoplamiento a un polímero tal como un polímero de polialquilenglicol en la posición del aminoácido modificado. Sitios preferidos de modificación de un polipéptido de neublastina son aquellos en regiones accesibles al disolvente en el polipéptido de neublastina. Tales sitios pueden elegirse basándose en la inspección de la estructura cristalina del factor neurotrófico relacionado, GDNF, cuya estructura cristalina se describe en Nat Struct. Biol. 4:435-38, 1997. Los sitios también pueden elegirse basándose en la información estructural-funcional proporcionada para proteínas quiméricas de persefina/neublastina. Estas quimeras se describen en J. Biol. Chem. 275:3412-20, 2000. Un listado ejemplar de aminoácidos de neublastina accesibles al disolvente o expuestos superficialmente identificados a través de esta metodología es como la indicada en la Tabla 2.
La invención incluye un polipéptido de neublastina variante que incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos 70% idéntica a los aminoácidos 8-113 del Nº ID SEC: 1, que se muestra en la Tabla 1. En algunas modalidades, una o más de las argininas en la posición 14, la posición 39, la posición 68 o la asparagina en la posición 95, en la secuencia de aminoácidos del polipéptido, se reemplaza por un aminoácido distinto a la arginina o la asparagina. Preferiblemente, el aminoácido de tipo silvestre se reemplaza por lisina o cisteína.
TABLA 1
1
Secuencia de consenso
2
en la que
Xaa_{1} es Gly o Thr
Xaa_{2} es Pro o Arg
Xaa_{3} es Gly o Ser
Xaa_{4} es Ala o Thr
Xaa_{5} es Ala o Thr
Xaa_{6} es Gly o Asp
Xaa_{7} es Arg o Ser
Xaa_{8} es Arg o Ser
Xaa_{9} es Val o Ile
Xaa_{10} es Pro o Gln
Xaa_{11} es Pro o Ser
Xaa_{12} es Val o Ile
Xaa_{13} es Arg o His
La Tabla 2 proporciona una lista de residuos y números en neublastina humana que se espera que estén expuestos superficialmente. Los residuos expuestos superficialmente se determinaron examinando la estructura del dímero de GDNF de rata formado por las cadenas A y B (PDB código 1AGQ) y determinando si un residuo estaba sobre la superficie de la estructura. Esta estructura se comparó a continuación con un alineamiento de secuencias de GDNF y neublastina en Baloh y otros, Neuron, vol 21, pg 1291, 1998, para determinar los residuos apropiados en la neublastina. El esquema de numeración es el mostrado en la Tabla 1.
TABLA 2
\quad
1 Ala n/a
\quad
2 Gly n/a
\quad
3 Gly n/a
\quad
4 Pro n/a
\quad
5 Gly n/a
\quad
6 Ser n/a
\quad
7 Arg n/a
\quad
8 Ala n/a
\quad
9 Arg n/a
\quad
10 Ala n/a
\quad
11 Ala n/a
\quad
12 Gly +
\quad
13 Ala -
\quad
14 Arg +
\quad
15 Gly +
\quad
16 Cys -
\quad
17 Arg +
\quad
18 Leu +
\quad
19 Arg +
\quad
20 Ser +
\quad
21 Gln +
\quad
22 Leu +
\quad
23 Val -
\quad
24 Pro +
\quad
25 Val -
\quad
26 Arg +
\quad
27 Ala +
\quad
28 Leu -
\quad
29 Gly +
\newpage
(Continuación)
\quad
30 Leu +
\quad
31 Gly +
\quad
32 His +
\quad
33 Arg +
\quad
34 Ser -
\quad
35 Asp +
\quad
36 Glu +
\quad
37 Leu +
\quad
38 Val -
\quad
39 Arg +
\quad
40 Phe -
\quad
41 Arg +
\quad
42 Phe +
\quad
43 Cys -
\quad
44 Ser +
\quad
45 Gly +
\quad
46 Ser +
\quad
47 Cys -
\quad
48 Arg +
\quad
49 Arg +
\quad
50 Ala -
\quad
51 Arg +
\quad
52 Ser +
\quad
53 Pro +
\quad
54 His -
\quad
55 Asp -
\quad
56 Leu +
\quad
57 Ser -
\quad
58 Leu -
\quad
59 Ala +
\quad
60 Ser +
\quad
61 Leu -
\quad
62 Leu +
\quad
63 Gly +
\quad
64 Ala +
\newpage
(Continuación)
\quad
65 Gly +
\quad
66 Ala +
\quad
67 Leu -
\quad
68 Arg n/a
\quad
69 Pro n/a
\quad
70 Pro n/a
\quad
71 Pro n/a
\quad
72 Gly +
\quad
73 Ser +
\quad
74 Arg n/a
\quad
75 Pro n/a
\quad
76 Val-
\quad
77 Ser
\quad
78 Gln +
\quad
79 Pro -
\quad
80 Cys -
\quad
81 Cys -
\quad
82 Arg -
\quad
83 Pro -
\quad
84 Thr +
\quad
85 Arg +
\quad
86 Tyr +
\quad
87 Glu +
\quad
88 Ala +
\quad
89 Val +
\quad
90 Ser +
\quad
91 Phe -
\quad
92 Met +
\quad
93 Asp +
\quad
94 Val +
\quad
95 Asn +
\quad
96 Ser +
\quad
97 Thr +
\quad
98 Trp +
\quad
99 Arg +
\newpage
(Continuación)
\quad
100 Thr +
\quad
101 Val -
\quad
102 Asp +
\quad
103 Arg +
\quad
104 Leu -
\quad
105 Ser-
\quad
106 Ala-
\quad
107 Thr +
\quad
108 Ala +
\quad
109 Cys-
\quad
110 Gly +
\quad
111 Cys -
\quad
112 Leu +
\quad
113 Gly
\quad
n/a
n/a indica que los residuos no están presentes en la estructura de GDNF. Esto es debido bien al diseño del constructo, bien a regiones flexibles o bien a insertos en neublastina con relación al GDNF (residuos 68-71).
- indica que los residuos están enterrados y no sobre la superficie o son residuos de cisteína implicados en enlaces de disulfuro. Como esta proteína es un nudo de cisteínas, una gran mayoría de los residuos no están sobre la superficie.
+ indica que este residuo está expuesto superficialmente en la estructura del GDNF, y por lo tanto se presume que está expuesto superficialmente en la neublastina, aunque el bucle que contiene los residuos 66-75 sea visible solo en uno de los monómeros de GDNF (presumiblemente flexible). Este bucle también contiene un inserto de cuatro residuos en la neublastina con relación al GDNF.
Según se usa aquí, "identidad" y "homólogo" u "homología" se usan intercambiablemente y se refieren a la similitud de secuencia entre dos polipéptidos, moléculas o entre dos ácidos nucleicos. Cuando una posición en ambas de las dos secuencias comparadas está ocupada por la misma base o subunidad monómera de aminoácido (por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de DNA está ocupada por adenina, o una posición en cada uno de los polipéptidos está ocupada por una lisina), entonces, las moléculas respectivas son homólogas en esa posición. El porcentaje de homología entre dos secuencias es una función del número de posiciones iguales u homólogas compartidas por las dos secuencias dividido por el número de posiciones comparadas x 10. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias son iguales o son homólogas, entonces las dos secuencias son 60% homólogas. A modo de ejemplo, las secuencias de DNA CTGACT y CAGGTT comparten 50% de homología (3 de las 6 posiciones totales son iguales). Generalmente, se realiza una comparación cuando dos secuencias están alineadas para dar homología máxima. Tal alineamiento puede proporcionarse usando, por ejemplo, el método de Needleman y otros, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970), puesto en práctica convenientemente por programas informáticos tales como el programa Align (DNAstar, Inc.). Secuencias "similares" son aquellas que, cuando están alineadas, comparten residuos de aminoácido idénticos y similares, donde los residuos similares son substituciones conservativas para, o "mutaciones puntuales permitidas" de, residuos de aminoácido correspondientes en una secuencia de referencia alineada. A este respecto, una "substitución conservativa" de un residuo en una secuencia de referencia es una substitución por un residuo que es físicamente o funcionalmente similar al residuo de referencia correspondiente, por ejemplo, que tiene similares tamaño, conformación, carga eléctrica, propiedades químicas, incluyendo la capacidad para formar enlaces covalentes o de hidrógeno, o similares. Así, una secuencia "variante de substitución conservativa" es una que difiere de una secuencia de referencia o una secuencia silvestre en que están presentes una o más substituciones conservativas o mutaciones puntuales permitidas.
En modalidades preferidas, un polipéptido de acuerdo con la invención es 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ó 99% idéntico a los aminoácidos 8-113 del Nº ID SEC: 1. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina variante incluye la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de neublastina de rata, ser humano o ratón presente en la naturaleza en los aminoácidos 1-94 y 96-113 del polipéptido de neublastina variante, por ejemplo, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de los Nº ID SEC: 2, 3 ó 4 en estas posiciones.
Un polipéptido de neublastina variante que difiere en la secuencia de los descritos en el Nº ID SEC: 1-4 puede incluir una o más ambas substituciones de aminoácidos conservativas. Alternativamente, o además, el polipéptido de neublastina variante puede diferir en una o más substituciones de aminoácidos no conservativas, o en deleciones o inserciones. Preferiblemente, las substituciones, inserciones o deleciones no suprimen la actividad biológica de la proteína aislada.
Substituciones conservativas incluyen típicamente la substitución de un aminoácido por otro con características similares, tales como substituciones dentro de los siguientes grupos: valina, alanina y glicina; leucina, valina e isoleucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina y glutamina; serina, cisteína y treonina; lisina y arginina; difenilalanina y tirosina. Los aminoácidos hidrófobos no polares incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Cualquier substitución de un miembro de los grupos polar, básico o ácido mencionados anteriormente por otro miembro del mismo grupo puede considerarse una substitución conservativa.
Otras substituciones pueden ser identificadas fácilmente por operarios de experiencia normal. Por ejemplo, para el aminoácido alanina, puede tomarse una substitución de uno cualquiera de D-alanina, glicina, beta-alanina, L-cisteína y D-cisteína. Para la lisina, una substitución puede ser una cualquiera de D-lisina, arginina, D-arginina, homoarginina, metionina, D-metionina, ornitina o D-ornitina. Generalmente, las substituciones en regiones funcionalmente importantes que puede esperarse que induzcan cambios en las propiedades de polipéptidos aislados son aquellas en las que: (i) un residuo polar, por ejemplo serina o treonina, substituye a (o es substituido por) un residuo hidrófobo, por ejemplo, leucina, isoleucina, fenilalanina o alanina; (ii) un residuo de cisteína substituye a (o es substituido por) cualquier otro residuo; (iii) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisina, arginina o histidina, substituye a (o es substituido por) un residuo que tiene una cadena lateral electronegativa, por ejemplo ácido glutámico o ácido aspártico; o (iv) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo fenilalanina, substituye a (o es substituido por) uno que no tiene tal cadena lateral, por ejemplo glicina. La probabilidad de que una de las substituciones no conservativas precedentes pueda alterar propiedades funcionales de la proteína también se correlaciona con la posición de la substitución con respecto a regiones funcionalmente importantes de la proteína: algunas substituciones no conservativas pueden de acuerdo con esto tener poco o ningún efecto sobre las propiedades biológicas.
También se proporcionan mediante la invención polipéptidos multímeros que incluyen un polipéptido de neublastina variante. Los polipéptidos multímeros se proporcionan preferiblemente como polipéptidos multímeros purificados. Ejemplos de complejos multímeros incluyen, por ejemplo, complejos dímeros. El complejo multímero puede proporcionarse como un complejo heterómero u homómero. Así, el complejo multímero puede ser un complejo heterodímero que incluye un polipéptido de neublastina variante y una neublastina no variante o un complejo heterodímero que incluye dos o más polipéptidos de neublastina variantes.
En algunas modalidades, el polipéptido de neublastina variante se une a GFR\alpha3. Preferiblemente, la unión del polipéptido de neublastina variante estimula la fosforilación de un polipéptido de RET. Para determinar si un polipéptido se une a GFR\alpha3, pueden realizarse ensayos como los descritos en WO00/01815. Por ejemplo, la presencia de neublastina en el medio de sobrenadantes de línea celular CHO puede describirse usando una forma modificada de un ensayo complejo ternario descrito por Sanicola y otros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94: 6238). En este ensayo, la capacidad de moléculas similares a GDNF puede evaluarse con respecto a su capacidad para mediar en la unión entre el dominio extracelular de RET y los diversos correceptores, GFR\alpha1, GFR\alpha2 y GFR\alpha3. Formas solubles de RET y los correceptores se generan como proteínas de fusión. Se han descrito una proteína de fusión entre el dominio extracelular de RET de rata y fosfatasa alcalina placentaria (RET-AP) y una proteína de fusión entre el dominio extracelular de GFR\alpha-1 de rata (descrito en la solicitud publicada WO9744356; 27 de noviembre de 1997, incorporada aquí mediante referencia) y el dominio Fc de IgGI humana (rGFR(\alpha1-Ig) (Sanicola y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 6238).
En algunas modalidades, el polipéptido de neublastina variante potencia la supervivencia de una neurona o normaliza cambios patológicos de una neurona o ambos. Ensayos para determinar si un polipéptido potencia la supervivencia de una neurona o normaliza cambios patológicos de una neurona se describen en, por ejemplo, WO00/01815. Preferiblemente, la neurona es una neurona sensorial, una neurona autónoma o una neurona dopaminérgica.
Síntesis y Aislamiento de Polipéptidos de Neublastina Variantes
Polipéptidos de neublastina variantes pueden aislarse usando métodos conocidos en la técnica. Polipéptidos de neublastina presentes en la naturaleza pueden aislarse de células o fuentes de tejido mediante un esquema de purificación apropiado usando técnicas de purificación de proteínas estándar. Alternativamente, polipéptidos de neublastina variantes pueden sintetizarse químicamente usando técnicas de síntesis de péptidos estándar. La síntesis de secuencias de aminoácidos cortas está bien establecida en la técnica de los péptidos. Véase, por ejemplo, Stewart y otros, Solid Phase Peptide Synthesis (2ª ed., 1984).
En otra modalidad, polipéptidos de neublastina variantes se producen mediante técnicas de DNA recombinante. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de neublastina variante puede insertarse en un vector, por ejemplo, un vector de expresión, y el ácido nucleico puede introducirse en una célula. Células adecuadas incluyen, por ejemplo, células mamíferas (tales como células humanas o células de ovario de hámster chino), células fúngicas, células de levadura, células de insecto y células bacterianas. Cuando se expresan en una célula recombinante, la célula se cultiva preferiblemente bajo condiciones que permiten la expresión de un polipéptido de neublastina variante. El polipéptido de neublastina variante puede recuperarse de una suspensión celular, si se desea. Por "recuperarse" se entiende que el polipéptido variante se retira de los componentes de una célula o medio de cultivo en el que está presente antes del procedimiento de recuperación. El procedimiento de recuperación puede incluir una o más etapas de repliegue o purificación.
Polipéptidos de neublastina variantes pueden construirse usando cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Uno de tales métodos es la mutagénesis dirigida al sitio, en el que un nucleótido específico (o, si se desea un pequeño número de nucleótidos específicos) se cambia para cambiar un solo aminoácido (o, si se desea, un pequeño número de residuos de aminoácido predeterminados) en el polipéptido de neublastina codificado. Los expertos en la técnica apreciarán que la mutagénesis dirigida al sitio es una técnica habitual y ampliamente usada. De hecho, muchos estuches de mutagénesis dirigida al sitio están disponibles comercialmente. Uno de tales estuches es el "Transformer Site Directed Mutagenesis Kit" vendido por Clontech Laboratories (Palo Alto, Calif.).
La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, microbiología, DNA recombinante, química de proteínas e inmunología que están dentro de la experiencia de la especialidad. Tales técnicas se describen en la literatura. Véanse, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición. (Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volúmens I y II (D.N. Glover, ed), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, ed.), 1984; Patente de EE.UU. Nº 4.683.195 (Mullis y otros,); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Haines y S.J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (B.D. Hames y S.J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, ed). Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (13.Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volúmens 154 y 155 (Wu y otros, eds), Academic Press, Nueva York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos, eds.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochernical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer y Walker, eds.), Academic Press, Londres, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volúmenes I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.
Proteínas de fusión de neublastina variante
Si se desea, el polipéptido de neublastina variante puede proporcionarse como una proteína de fusión. Derivados polipeptídicos de fusión de proteínas de la invención también incluyen diversas formas estructurales de la proteína primaria que retienen la actividad biológica. Según se usa aquí, "fusión" se refiere a una conexión covalente colineal de dos o más proteínas o fragmentos de las mismas a través de sus cadenas principales peptídicas individualmente, lo más preferiblemente a través de la expresión genética de una molécula polinucleotídica que codifica esas proteínas en el mismo marco de lectura (es decir, "en el marco"). Se prefiere que las proteínas o los fragmentos de las mismas sean de diferentes fuentes. Así, proteínas de fusión preferidas incluyen una proteína o fragmento de neublastina variante conectado covalentemente a un segundo resto que no es una neublastina variante. Preferiblemente, el segundo resto se deriva de un polipéptido que existe como un monómero, y es suficiente para conferir propiedades de solubilidad y/o biodisponibilidad potenciadas al polipéptido de neublastina.
Por ejemplo, una "fusión de neublastina variante/albúmina de suero humano" es una proteína que comprende un polipéptido de neublastina variante de la invención, o un fragmento del mismo, cuyo extremo N o extremo C está conectado en el marco a un polipéptido de albúmina de suero humano (Véase, Syed y otros, Blood, 1997, 89: 3243 y Yeh y otros, P.N.A.S. USA 1992, 89:1904 y las Patentes de EE.UU. Nº 5.876.969 y 5.302.697). El término "proteína de fusión" incluye adicionalmente una neublastina variante conectada químicamente a través de una molécula mono- o hetero-funcional a un segundo resto que no es una proteína de neublastina variante y se elabora de novo a partir de proteína purificada según se describe posteriormente.
Fusiones de neublastina-albúmina de suero pueden construirse usando métodos conocidos en la especialidad. Puede usarse cualquiera de un número de reticuladores que contienen un grupo reactivo con amino correspondiente y un grupo reactivo con tiol para conectar neublastina a albúmina de suero. Ejemplos de conectores adecuados incluyen reticuladores reactivos con amina que insertan una maleimida reactiva con tiol. Estos incluyen, por ejemplo, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS o GMBS. Otros conectores adecuados insertan un grupo haloacetato reactivo con tiol. Estos incluyen, por ejemplo, SBAP, SIA, SIAB, y los que proporcionan un tiol protegido o no protegido para la reacción con grupos sulfhidrilo para producir una conexión reducible son SPDP, SMPT, SATA o SATP, todos los cuales están disponibles comercialmente (por ejemplo, Pierce Chemicals). Un experto en la especialidad puede prever de forma similar con estrategias alternativas qué conectará el extremo N de la neublastina con albúmina de suero.
También se prevé que un experto en la especialidad pueda generar conjugados con albúmina de suero que no están orientados al extremo N de NBN o al resto tiol en la albúmina de suero. Si se desea, pueden generarse fusiones de NBN-albúmina de suero usando técnicas de ingeniería genética, en donde NBN se fusiona al gen de albúmina de suero en su extremo N, extremo C o en ambos extremos.
\newpage
Se contempla además que cualquier conjugado de NBN que dé como resultado un producto con una semivida prolongada en animales (incluyendo seres humanos) pueda generarse usando una estrategia similar.
Otros derivados de neublastinas variantes incluyen conjugados covalentes o agregados de neublastina variante o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, tales como mediante la síntesis en cultivo recombinante como extremos N o extremos C adicionales. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser una secuencia polipeptídica de señal (o líder) en la región N-terminal de la proteína que dirige cotraduccionalmente o postraduccionalmente la transferencia de la proteína desde su sito de síntesis a su sitio de función dentro o fuera de la membrana o pared celular (por ejemplo, el factor líder alfa de levadura). Proteínas receptoras de neublastina pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación o la identificación de neublastina (por ejemplo, fusiones de histidina/neublastina). Las secuencias de aminoácidos de neublastina también pueden conectarse al péptido Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (Hopp y otros, Biotechnology 6:1204,1988). La última secuencia es altamente antigénica y proporciona un epítopo unido reversiblemente por un anticuerpo monoclonal específico, que permite el ensayo rápido y la purificación fácil de proteína recombinante expresada.
Esta secuencia también se segmenta específicamente mediante enteroquinasa mucosal bovina en el residuo inmediatamente siguiente al apareamiento Asp-Lys.
Polipéptidos de neublastina variantes conjugados a un polímero
Si se desea, puede emplearse una sola molécula de polímero para la conjugación con un polipéptido de neublastina, aunque también se contempla asimismo que más de una molécula de polímero pueda ligarse. Las composiciones de neublastina conjugada de la invención pueden encontrar utilidad en aplicaciones tanto in vivo así como no in vivo. Adicionalmente, se apreciará que el polímero de conjugación puede utilizar cualesquiera otros grupos, restos u otras especies conjugadas, según sea apropiado para la aplicación de uso final. A modo de ejemplo, puede ser útil en algunas aplicaciones unir covalentemente al polímero un resto funcional que imparte resistencia a la degradación UV, o antioxidación, u otras propiedades o características al polímero. Como un ejemplo adicional, puede ser ventajoso en algunas aplicaciones funcionalizar el polímero para hacerlo de carácter reactivo o reticulable, para potenciar diversas propiedades o características del material conjugado global. De acuerdo con esto, el polímero puede contener cualquier funcionalidad, grupos repetitivos, conexiones u otras estructuras constituyentes que no impiden la eficacia de la composición de muteína de neublastina conjugada para su propósito pretendido.
Polímeros ilustrativos que pueden emplearse útilmente para alcanzar estas características deseables se describen aquí más adelante en esquemas de reacción ejemplares. En aplicaciones de péptidos unidos covalentemente, el polímero puede funcionalizarse y a continuación acoplarse a un aminoácido o aminoácidos libres del péptido o los péptidos para formar enlaces lábiles.
En algunas modalidades, el polipéptido de neublastina está conectado al polímero a través de un grupo reactivo terminal del polipéptido. Alternativamente, o además, el polipéptido de neublastina puede conectarse a través del grupo amino de cadena lateral de un residuo de lisina interno, por ejemplo, un residuo de lisina introducido en la secuencia de aminoácidos y un polipéptido de neublastina presente en la naturaleza. Así, las conjugaciones también pueden ramificarse a partir de los grupos reactivos no terminales. El polímero con el grupo o los grupos reactivos se denomina aquí "polímero activado". El grupo reactivo reacciona selectivamente con amino libre u otros grupos reactivos en la proteína.
La ligación puede producirse en el polímero activado en cualquier grupo amino de la neublastina disponible tal como los grupos amino alfa o los grupos amino épsilon de un residuo o residuos de lisina introducidos en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de neublastina o variante del mismo. Grupos carboxílicos libres, grupos carbonilo adecuadamente activados, hidroxilo, guanidilo, imidazol, restos de carbohidrato oxidados y grupos mercapto de la neublastina (si están disponibles) también pueden usarse como sitios de ligación.
Generalmente, se emplean de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 10 moles de polímero activado por mol de proteína, dependiendo de la concentración de proteína. La cantidad final es un equilibrio entre maximizar la extensión de la reacción mientras se minimizan modificaciones no específicas del producto y, al mismo tiempo, definir químicas que mantendrán la actividad óptima, mientras que al mismo tiempo se optimiza, si es posible, la semivida de la proteína. Preferiblemente, se retiene al menos aproximadamente 50% de la actividad biológica de la proteína y, lo más preferiblemente, se retiene cerca de 100%.
Las reacciones pueden tener lugar mediante cualquier método adecuado usado para hacer reaccionar materiales biológicamente activos con polímeros inertes, preferiblemente a aproximadamente pH 5-8, por ejemplo pH 5, 6, 7 u 8, si los grupos reactivos están sobre el grupo amino alfa en el extremo N. Generalmente, el procedimiento implica preparar un polímero activado y posteriormente hacer reaccionar la proteína con el polímero activado para producir la proteína soluble adecuada para la formulación. La reacción de modificación anterior puede realizarse mediante varios métodos, que pueden implicar una o más etapas.
El polímero puede acoplarse al polipéptido de neublastina variante usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad, el resto de polialquilenglicol se acopla a un grupo lisina del polipéptido de neublastina o el polipéptido de neublastina variante. La conexión al grupo lisina puede realizarse con un éster activo de N-hidroxisuccinimida (NHS), tal como PEG-succinato de succinimidilo (SS-PEG) y propionato de succinimidilo (SPA-PEG). Restos polialquilenglicol adecuados incluyen, por ejemplo, carboximetil-NHS, norleucina-NHS, SC-PEG, tresilato, aldehído, epóxido, carbonilimidazol y carbonato de PNP.
Conectores de PEG reactivos con amina adicionales pueden substituir al resto succinimidilo. Estos incluyen, por ejemplo, isotiocianatos, nitrofenilcarbonatos, epóxidos y benzotriazolcarbonatos. Las condiciones se eligen preferiblemente para maximizar la selectividad y la extensión de la reacción. Pueden usarse formas lineales y ramificadas de PEG así como otras formas alquílicas. La longitud del PEG puede variarse. Las formas más comunes varían en tamaño de 2 K-100 K. Aunque los presentes ejemplos dan cuenta de que la pegilación orientada en el extremo N no afecta a las propiedades farmacocinéticas, el hecho de que el material retuviera la función fisiológica indica que la modificación en el sitio o los sitios descritos aquí no es perjudicial. Por consiguiente, al generar formas mutantes de NBN que podrían proporcionar sitios adicionales de ligación a través de inserción de residuos de lisina, se considera aceptable el resultado probable de que estas formas se pegilaran tanto en la lisina como en el extremo N.
Si se desea, los polipéptidos variantes de neublastina pueden contener una etiqueta, por ejemplo una etiqueta que puede liberarse posteriormente mediante proteolisis. Así, el resto de lisina puede modificarse selectivamente haciendo reaccionar en primer lugar una variante con etiqueta de his con un conector de bajo peso molecular tal como el reactivo de Traut (Pierce) que reaccionará tanto con la lisina como en el extremo N, y a continuación liberando la etiqueta de his. El polipéptido contendrá entonces un grupo SH libre que puede modificarse selectivamente con un PEG que contiene un grupo de cabeza reactivo con tiol tal como un grupo maleimida, un grupo vinilsulfona, un grupo haloacetato o un SH libre o protegido.
El reactivo de Traut puede reemplazarse por cualquier conector que establezca un sitio específico para la ligación de PEG. A modo de ejemplo, el reactivo de Traut podría reemplazarse por SPDP, SMPT, SATA o SATP (todos disponibles de Pierce). De forma similar, podría hacerse reaccionar la proteína con un conector reactivo con amina que inserte una maleimida (por ejemplo, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS o GMBS), un grupo haloacetato (SBAP, SIA, SIAB) o un grupo vinilsulfona y hacer reaccionar el producto resultante con un PEG que contenga un SH libre. La única limitación para el tamaño del conector que se emplea es que no pueda bloquear la retirada subsiguiente de la etiqueta N-terminal.
Así, en otras modalidades, el resto de polialquilenglicol está acoplado a un grupo cisteína del polipéptido de neublastina o el polipéptido de neublastina variante. El acoplamiento puede efectuarse usando, por ejemplo, un grupo maleimida, un grupo vinilsulfona, un grupo haloacetato y un grupo tiol.
Uno o más sitios en un polipéptido de neublastina variante pueden acoplarse a un polímero. Por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro o cinco restos de PEG pueden ligarse al polímero. En algunas modalidades, un resto de PEG está ligado en el extremo amino y/o los aminoácidos 14, 39, 68 y 95 de un polipéptido de neublastina numerado como se muestra en la Tabla 1.
En modalidades preferidas, el polipéptido de neublastina variante en la composición tiene una semivida en suero más prolongada con relación a la semivida del polipéptido variante en ausencia del polímero. Alternativamente, o además, el polipéptido de neublastina variante en las composiciones se une a GFR\alpha3, activa RET, normaliza cambios patológicos de una neurona o potencia la supervivencia de una neurona, o realiza una combinación de estas funciones fisiológicas.
En modalidades preferidas, la composición se proporciona como un complejo de polipéptido de neublastina o polipéptido de neublastina variante conjugado, soluble en agua, estable, que comprende un polipéptido de neublastina o un polipéptido de neublastina variante acoplado a un resto de polietilenglicol. Si se desea, el polipéptido de neublastina o el polipéptido de neublastina variante puede estar acoplado al resto de polietilenglicol mediante un enlace lábil. El enlace lábil puede segmentarse en, por ejemplo, hidrólisis, proteolisis o segmentación de sulfhidrilo bioquímicas. Por ejemplo, el enlace puede segmentarse bajo condiciones in vivo (fisiológicas).
Composiciones farmacéuticas que contienen conjugados de neublastina variante-polímero
También se proporciona una composición farmacéutica que incluye un conjugado de neublastina variante-polímero de la presente invención. Una "composición farmacéutica", según se usa aquí, se define por comprender una proteína de neublastina o un conjugado de la invención, dispersado en un vehículo fisiológicamente aceptable, que contiene opcionalmente uno o más de otros ingredientes fisiológicamente compatibles. La composición farmacéutica puede así contener un excipiente tal como agua, uno o más minerales, azúcares, detergentes y uno o más portadores tales como una proteína inerte (por ejemplo, heparina o albúmina).
Los conjugados de polímero-neublastina de la invención pueden administrarse como tales así como en la forma de ésteres, sales y otros derivados fisiológicamente funcionales de los mismos, farmacéuticamente aceptables. En tales formulaciones farmacéuticas y medicamentosas, el conjugado de variante de neublastina se utiliza preferiblemente junto con uno o más portador o portadores farmacéuticamente aceptables y opcionalmente cualesquiera otros ingredientes terapéuticos.
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El portador o los portadores deben ser farmacéuticamente aceptables en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no excesivamente perjudiciales para el receptor de la misma. La neublastina variante se proporciona en una cantidad eficaz para alcanzar un efecto farmacológico o un efecto médicamente beneficioso deseado, según se describe aquí, en una cantidad apropiada para alcanzar la dosis o concentración in vivo biodisponible deseada.
Las formulaciones incluyen las adecuadas para administración parenteral así como no parenteral, y modalidades de administración específicas incluyen la administración oral, rectal, bucal, tópica, nasal, oftálmica, subcutánea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, intratecal, intraarticular, intraarterial, subaracnoide, bronquial, linfática, vaginal e intrauterina. Se prefieren las formulaciones adecuadas para administración en aerosol y parenteral, tanto localmente como sistémicamente.
Cuando la neublastina variante se utiliza en una formulación que comprende una solución líquida, la formulación puede administrarse ventajosamente oralmente, bronquialmente o parenteralmente. Cuando la neublastina se emplea en una formulación de suspensión líquida o como un polvo en una formulación portadora biocompatible, la formulación puede administrarse ventajosamente oralmente, rectalmente o bronquialmente. Alternativamente, puede administrarse nasalmente o bronquialmente, a través de nebulización del polvo en un gas portador, para formar una dispersión gaseosa del polvo que es inspirada por el paciente a partir de un circuito respirador que comprende un dispositivo nebulizador adecuado.
Las formulaciones que comprenden las proteínas de la presente invención pueden presentarse convenientemente en formas de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Tales métodos incluyen generalmente la etapa de asociar el ingrediente o los ingredientes activos con un portador que integra uno o más ingredientes auxiliares.
Típicamente, las formulaciones se preparan asociando uniformemente e íntimamente el ingrediente o los ingredientes activos con un portador líquido, un portador sólido finamente dividido, o ambos, y a continuación, si es necesario, conformando el producto en formas de dosificación de la formulación deseada.
Formulaciones de la presente invención adecuadas para administración oral pueden presentarse como unidades discretas tales como cápsulas, cachets, tabletas o grageas, conteniendo cada una una cantidad predeterminada del ingrediente activo como un polvo o gránulos; o una suspensión en un licor acuoso o un líquido no acuoso, tal como un jarabe, un elixir, una emulsión o una poción.
Formulaciones adecuadas para la administración parenteral comprenden convenientemente una preparación acuosa estéril del conjugado activo, que preferiblemente es isotónica con la sangre del receptor (por ejemplo, solución salina fisiológica). Tales formulaciones pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes u otros sistemas en micropartículas que están diseñados para orientar el compuesto a componentes de la sangre o uno o más órganos. Las formulaciones pueden presentarse en forma de dosis unitaria o dosis múltiples.
Las formulaciones de pulverización nasal comprenden soluciones acuosas purificadas del conjugado activo con agentes conservantes y agentes isotónicos. Tales formulaciones se ajustan preferiblemente hasta un pH y un estado isotónico compatible con las membranas de la mucosa nasal.
Las formulaciones para administración rectal pueden presentarse como un supositorio con un portador adecuado tal como mantequilla de cacao, grasas hidrogenadas o un ácido carboxílico graso hidrogenado. Las formulaciones oftálmicas, tales como gotas oculares, se preparan mediante un método similar a la pulverización nasal, excepto que el pH y los factores isotónicos se ajustan preferiblemente para adaptarse a los del ojo.
Las formulaciones tópicas comprenden los conjugados de la invención disueltos o suspendidos en uno o más medios, tales como aceite mineral, petróleo, alcoholes polihidroxilados u otras bases usadas para formulaciones farmacéuticas tópicas.
Además de los ingredientes mencionados anteriormente, las formulaciones de esta invención pueden incluir además uno o más ingredientes auxiliares seleccionados de diluyentes, tampones, agentes saboreantes, desintegrantes, agentes tensioactivos, espesantes, lubricantes, conservantes (incluyendo antioxidantes) y similares. Las consideraciones previas también se aplican a las proteínas de fusión de neublastina de la invención (por ejemplo, fusiones de neublastina-HSA).
De acuerdo con esto, la presente invención contempla el suministro de proteínas de fusión adecuadas para la estabilización in vitro de un conjugado de neublastina variante en solución, como una aplicación ilustrativa preferida de la invención. Las proteínas de fusión pueden emplearse, por ejemplo, para incrementar la resistencia a la degradación enzimática del polipéptido de neublastina variante y proporcionar un medio para mejorar la vida útil, la estabilidad a temperatura ambiente, y similares. Se entiende que las consideraciones precedentes se aplican también a las proteínas de fusión de neublastina-albúmina de suero (incluyendo las proteínas de fusión de neublastina humana-albúmina de suero humano) de la invención.
Métodos de tratamiento
Los polipéptidos de neublastina variantes, así como las proteínas de fusión o los conjugados de los mismos, pueden usarse para tratar o aliviar un trastorno o enfermedad de un cuerpo animal vivo, preferiblemente de un mamífero, más preferiblemente un primate incluyendo un ser humano, trastorno o enfermedad que es sensible a la actividad de agentes neurotróficos.
Las composiciones de la invención pueden usarse directamente a través de, por ejemplo, composiciones farmacéuticas inyectadas, implantadas o ingeridas para tratar un proceso patológico sensible a los polipéptidos de neublastina. Las composiciones pueden usarse para aliviar un trastorno o enfermedad de un cuerpo animal vivo, incluyendo un ser humano, trastorno o enfermedad que es sensible a la actividad de agentes neurotróficos. El trastorno o la enfermedad puede en particular ser daño del sistema nervioso provocado por trauma, cirugía, isquemia, infección, enfermedades metabólicas, deficiencia nutricional, agentes malignos o tóxicos y procesos genéticos o idiopáticos.
El daño puede haberse producido en particular a neuronas sensoriales o células ganglionales retinales, incluyendo neuronas de los ganglios radicales dorsales de la médula espinal o en cualquiera de los siguientes tejidos: los ganglios geniculados, petrosales y nodosos; el complejo vestibuloacústico del octavo nervio craneal, el polo ventrolateral del lóbulo maxilomandibular del ganglio trigeminal y el núcleo trigeminal mesencefácilo.
En una modalidad preferida del método de la invención, la enfermedad o el trastorno es una enfermedad neurodegenerativa que implica neuronas lesionadas y traumáticas, tales como lesiones traumáticas de nervios periféricos, la médula y/o la médula espinal, daño neuronal isquémico cerebral, neuropatía y especialmente neuropatía periférica, trauma o lesión de nervios periféricos, apoplejía isquémica, lesión cerebral aguda, lesión aguda de la médula espinal, tumores del sistema nervioso, esclerosis múltiple, exposición a neurotoxinas, enfermedades metabólicas tales como diabetes o disfunciones renales y daño provocado por agentes infecciosos, trastornos neurodegenerativos incluyendo enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, síndrome de Parkinson-plus, parálisis supranuclear progresiva (síndrome de Steele-Richardson-Olszewski), atrofia olivopontocerebelar (OPCA), síndrome de Shy-Drager (atrofia de múltiples sistemas), complejo de demencia-parkinsonismo guamanio, esclerosis lateral amiotrófica o cualquier otra enfermedad congénita o neurodegenerativa, y deterioro de la memoria conectado con demencia.
En una modalidad preferida, pueden tratarse neuronas sensoriales y/o del sistema autónomo. En particular, pueden tratarse neuronas nociceptivas y mecanoreceptivas, más particularmente neuronas de la fibra delta y la fibra C. Además, pueden tratarse neuronas simpáticas y parasimpáticas del sistema autónomo.
En otra modalidad preferida, pueden tratarse enfermedades de neuronas motrices tales como esclerosis lateral amiotrófica ("ALS") y atrofia muscular espinal. En otra modalidad preferida más, las moléculas de neublastina de esta invención pueden usarse para potenciar la recuperación de los nervios después de una lesión traumática. Alternativamente, o además, puede usarse en los métodos descritos aquí un canal de guía del nervio con una matriz que contiene polipéptidos de neublastina variante o una fusión o conjugados de polipéptidos de neublastina variante. Tales canales de guía del nervio se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.834.029, incorporada aquí mediante referencia.
En una modalidad preferida, las composiciones descritas aquí (y composiciones farmacéuticas que contienen las mismas) se usan en el tratamiento de neuropatías periféricas. Entre las neuropatías periféricas contempladas para el tratamiento con las moléculas de esta invención están neuropatías inducidas por trauma, por ejemplo las provocadas por lesión física o estado patológico, daño físico al cerebro, daño físico a la médula espinal, apoplejía asociada con daño cerebral y trastornos neurológicos relacionados con la neurodegeneración. También se incluyen aquí las neuropatías secundarias a infección, exposición a toxinas y exposición a fármacos. Además, también se incluyen aquí las neuropatías secundarias a enfermedad sistémica o metabólica. Las composiciones descritas aquí también pueden usarse para tratar neuropatías inducidas por quimioterapia (tales como las provocadas por aporte de agentes quimioterapéuticos, por ejemplo taxol o cisplatino); neuropatías inducidas por toxinas, neuropatías inducidas por fármacos, neuropatías inducidas por deficiencia de vitaminas; neuropatías idiopáticas y neuropatías diabéticas. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 5.496.804 y 5.916.555, cada una incorporada aquí mediante referencia.
Estados adicionales que pueden tratarse usando las composiciones descritas aquí son mononeuropatías, neuropatías mono-múltiples y polineuropatías, incluyendo neuropatías axonales y desmielinizantes, usando las composiciones descritas aquí.
En otra modalidad preferida, las composiciones de la invención (y las composiciones farmacéuticas que contienen las mismas) se usan en el tratamiento de diversos trastornos del ojo, incluyendo pérdida de fotorreceptores de la retina en pacientes afectados de degeneración macular, retinitis pigmentosa, glaucoma y enfermedades similares.
La invención se ilustrará adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplo 1 Biodisponibilidad de neublastina pegilada N-terminal
Se observó que neublastina humana recombinante derivada de células CHO se depuraba rápidamente de la circulación si se administraba intravenosamente en ratas. No se detectaba nada de la proteína en el suero después de la administración subcutánea. Para incrementar la biodisponibilidad de la neublastina, se construyeron formas pegiladas.
Debido a que no estaban presentes lisinas en la secuencia de NBN, las químicas de pegilación específicas para aminas darán como resultado la pegilación de un polipéptido de NBN en su extremo amino. Así, para cada dímero de neublastina, deben ligarse dos restos de PEG. De acuerdo con esto, las formas de PEG se orientaron en primer lugar directamente al extremo N a través de químicas específicas para aminas. Sorprendentemente, la pegilación incluso con dos PEGs de 20 K ligados tenía poco beneficio sobre la semivida, indicando que un mecanismo basado en la ruta de depuración estaba anulando la potenciación en la semivida que se esperaba que se alcanzara mediante pegilación.
Ejemplo 2 Construcción de una muteína N95K de neublastina pegilada
Se examinó a continuación la biodisponibilidad de formas mutantes de NBN pegiladas en residuos de aminoácido internos. Se diseñó una serie de cuatro mutantes que reemplazaban los residuos presentes en la naturaleza en las posiciones 14, 39, 68 y 95 para insertar lisinas en sitios seleccionados de la secuencia. Estas lisinas proporcionarían sitios alternativos para la ligación del PEG. Estos sitios se seleccionaron usando la estructura cristalina de GDNF (Nat. Struct. Biol. 4: 435-8, 1997) como un marco estructural para identificar residuos superficiales y el estudio de mutagénesis de quimeras de persefina/neublastina (J. Biol. Chem. 275: 3412-20, 2000) para identificar regiones funcionalmente importantes de la estructura que debían evitarse.
Dos de las mutaciones (R39 y R68) se orientaron en una región que, basado en la distribución de posibles cargas sobre la superficie, podría representar un sitio de unión a heparina, una propiedad de la proteína que contribuye probablemente a su rápida depuración. Un tercer sitio se orientó en N95, el sitio de glicosilación natural en NBN silvestre. El sitio está naturalmente modificado con una estructura de carbohidratos compleja. Por lo tanto, no se esperaba que la modificación con PEG en este sitio tuviera impacto sobre la función. El cuarto sitio (R14) se seleccionó en una región que no estaba cubierta con ninguna otra de las modificaciones. Un mutante en el que el residuo de asparagina en la posición 95 era reemplazado por una lisina (el "mutante N95K") se eligió para los estudios descritos aquí.
Se construyeron cuatro muteínas de neublastina de rata diferentes que contenían una o más alteraciones en la secuencia silvestre de polipéptido de neublastina de rata. Las muteínas incluyen la muteína N95K simple y las muteínas que contienen substituciones simples en otros sitios de la secuencia de aminoácidos de neublastina de rata: R14K, R68K y R39K. En la nomenclatura "X_{1}N_{1}X_{2}", X_{1} se refiere a un aminoácido y un polipéptido de neublastina silvestre, N_{1} se refiere a la posición numérica de los aminoácidos X_{1} en la secuencia, según se numera de acuerdo con el Nº ID SEC: 1. X_{2} se refiere a un aminoácido que substituye al aminoácido silvestre en la posición numérica indicada en la secuencia.
Para construir la mutación de neublastina N95K de rata, se realizó mutagénesis dirigida al sitio sobre pCMB020, un plásmido que codifica neublastina de rata silvestre. La secuencia de ácido nucleico y de aminoácidos de neublastina de rata silvestre del polipéptido codificado de ese modo se presenta posteriormente:
3
300 
\vskip1.000000\baselineskip
5
La mutagénesis de pCM020 usando los oligonucleótidos KD2-310 y KD3-211 daba como resultado la formación del plásmido pCMB027:
500
En pCMB027, el codón que codifica asparagina en la posición 95 se ha reemplazado por un codón que codifica lisina.
Una muteína de neublastina R14K formada por la substitución de un codón que codifica arginina en la posición 14 por un codón que codifica lisina en la secuencia de codificación de neublastina de pCMB020. Se realizó mutagénesis dirigida al sitio sobre pCMB020 usando los oligonucleótidos KD3-254 y KD3-255:
501
El constructo resultante se denominó pCMB029.
Una muteína de neublastina R68K formada por la substitución de un codón que codifica arginina en la posición 68 por un codón que codifica lisina en la secuencia de codificación de neublastina de pCMB020. Se realizó mutagénesis dirigida al sitio sobre pCMB020 usando los oligonucleótidos KD3-258 y KD3-259:
502
El constructo resultante se denominó pCMB030.
Una muteína de neublastina R39K formada por la substitución de la arginina en el aminoácido 39 por lisina en la secuencia de codificación de neublastina de pCMB020. Se realizó mutagénesis dirigida al sitio de pCMB027 usando los oligonucleótidos KD3-256 y KD3-257:
503
Para la expresión y la purificación, un plásmido que codifica la muteína N95K de NBN de rata se expresó en E. coli como una proteína de fusión etiquetada con His con un sitio de segmentación de enteroquinasa inmediatamente adyacente al inicio de la secuencia de NBN de 113 aminoácidos madura. La E. coli se desarrolló en un fermentador de 500 l y se proporcionó pasta celular congelada. Las células de E. coli se sometieron a lisis en una prensa de Manton Gaulin y la NBN NK de rata se recuperó de la fracción en forma de pella lavada insoluble.
La NBN se extrajo de la pella con hidrocloruro de guanidina, se replegó y la etiqueta de his se retiró con enteroquinasa. El producto se sometió a continuación a cromatografía sobre agarosa Ni NTA (Qiagen) y en una resina de intercambio catiónico Bakerbond WP CBX.
El tratamiento con enteroquinasa de este producto etiquetado con his daba como resultado una segmentación aberrante de la proteína en la arginina 7 en la secuencia madura. El producto des-1-7-NBN resultante era completamente activo en el ELISA de KIRA y estructuralmente indistinguible de la forma madura en su susceptibilidad a desnaturalización inducida por guanidina y por lo tanto se usó para el trabajo subsiguiente.
N95K de NBN de rata se pegiló con un promedio de 3,3 restos de PEG/molécula usando propionato de metoxipoli(etilenglicol)-succinimidilo (SPA-PEG) con una masa molecular de 10.000 Da como el reaccionante. El producto pegilado resultante se sometió a caracterización intensiva incluyendo análisis mediante SDS-PAGE, cromatografía de exclusión por tamaños (SEC), HPLC en fase inversa, espectrometría de masas de desorción/ionización lasérica asistida por matriz (MALDI/MS), mapeo de péptidos, determinación de la actividad del ELISA de KIRA y determinación del contenido de endotoxinas. La pureza del producto de N95K de NBN antes de la pegilación según se medía mediante SDS-PAGE y SEC era mayor que 95%. El producto de N95K de NBN migraba bajo condiciones no reductoras como un dímero, de acuerdo con su estructura predicha. Después de la pegilación, el producto resultante consistía en una serie de aductos modificados que contenían 2 PEGs/5% de moléculas del producto, 3 PEGs/60% de moléculas del producto, 4 PEGs/30% de moléculas del producto y varias formas secundarias de masa superior. En la muestra pegilada no había evidencia de agregados. Los niveles residuales de NBN no modificada en el producto estaban por debajo de los límites de cuantificación. El contenido de endotoxinas del material es habitualmente menor que 1 EU/mg. La actividad específica de la NBN pegilada en el ELSIA de KIRA es 10 nM. El producto pegilado se formuló en 1,1 mg/ml en PBS, pH 6,5. El material, que es similar en potencia a wt-NBN, puede suministrarse como un líquido congelado, que se almacena a -70ºC.
Las muteínas R14K, R29K y R68K se expresaron en E. coli y pueden someterse a los mismos métodos para la purificación, la pegilación y la determinación de la función que se describen anteriormente para la N95K-NBN.
Preparación de NBN pegilada
230 ml de la N95K de NBN de rata replegada (2,6 mg/ml) que se había producido en E. coli y almacenado a 4ºC en fosfato sódico 5 mM, pH 6,5, NaCl 100 mM, se diluyeron con 77 ml de agua, 14,4 ml de HEPES 1M, pH 7,5, y 2,8 g (10 mg/ml finales) de PEG SPA 10.000 Da (Shearwater Polymers, Inc.). La muestra se incubó a temperatura ambiente durante 4 horas en la oscuridad, a continuación se trató con imidazol 5 mM (final), se filtró y se almacenó durante la noche a 4ºC. El producto se generó en dos partidas, una que contenía 130 ml de la masa de N95K de NBN y la otra que contenía 100 ml de la masa. La NBN pegilada se purificó de la mezcla de reacción en Fractogel EMD S0_{3}^{-} (M) (EM Industries). La columna se recorrió a temperatura ambiente. Todos los tampones se prepararon libres de pirógenos. Se añadió cloruro sódico a la mezcla de reacción hasta una concentración final de 87 mM y la muestra se cargó en una columna Fractogel de 45 ml (5 cm de diámetro interno).
La columna se lavó con un volumen de columna de fosfato sódico 5 mM, pH 6,5, NaCl 80 mM, y a continuación con tres partes alícuotas de un volumen de columna de fosfato sódico 5 mM que contenía NaCl 50 mM. La resina se transfirió a una columna de 2,5 cm de diámetro y la NBN pegilada se eluyó de la columna con seis etapas de diez ml que contenían fosfato sódico 5 mM, pH 6,5, NaCl 400 mM, tres etapas que contenían 500 ml de NaCl y seis etapas que contenían NaCl 600 mM. Las fracciones de elución se analizaron con respecto al contenido de proteína mediante absorbancia a 280 nm y a continuación con respecto a la extensión de la modificación mediante SDS-PAGE. Las fracciones seleccionadas se reunieron, se filtraron a través de un filtro de 0,2 \mum y se diluyeron con agua hasta 1,1 mg de NBN de rata pegilada/ml. Después de determinar los niveles de endotoxinas en las partidas individuales, se reunieron y se refiltraron a través de una membrana de 0,2 \mum. El material final se dividió en partes alícuotas y se almacenó a -70ºC.
Espectro UV de NBN NK pegilada purificada
El espectro UV (240-340 nm) de NBN NK pegilada se tomó sobre la muestra neta. La muestra se analizó por triplicado. La muestra pegilada exhibía un máximo de absorbancia a 275-277 nm y un mínimo de absorbancia a 247-249. Este resultado está de acuerdo con lo que se observa en el producto intermedio de masa de NBN no modificada. La concentración de proteína del producto pegilado se estimó a partir del espectro usando un coeficiente de extinción de \Sigma_{280} 0,1% = 0,50. La concentración de proteína de la masa de NBN pegilada es 1,1 mg/ml. No estaba presente turbidez en la muestra según era evidente por la falta de absorbancia a 320 nm.
Caracterización de NBN NK pegilada mediante SDS-PAGE
Partes alícuotas de NBN pegilada que contenían 3, 1,5, 0,75 y 0,3 \mug del producto se sometieron a SDS-PAGE en un gel con gradiente de 4-20% (Owl). El gel se tiñó con azul brillante de Coomassie R-250. Marcadores del peso molecular (GIBCO-BRL) se hicieron pasar en paralelo.
El análisis por SDS-PAGE de NBN NK pegilada bajo condiciones no reductoras revelaba una serie de bandas correspondiente a modificaciones con 2, 3, 4 y más de 4 PEGs/molécula. La banda principal con una masa aparente de 98 kDa contiene 3 PEGs/molécula. En el producto pegilado purificado no se detectó NBN no modificada. La presencia de una mezcla de producto con 2, 3 y 4 PEGs ligados se verificó mediante análisis espectrométrico de masas MALDI. La relación de producto que contiene 2, 3 y 4 PEGs se determinó mediante densitometría y se determinó que era 7, 72 y 30 por ciento del total, respectivamente.
Caracterización de NBN pegilada mediante cromatografía de exclusión por tamaño
NBN pegilada se sometió a cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superose 6 HR1O/30 FPLC analítica usando MES 5 mM, pH 6,5, NaCl 300 mM como la fase móvil. La columna se recorrió a 20 ml/h. Las fracciones de elución se verificaron con respecto a la absorbancia a 280 nm. La NBN pegilada se eluía como un solo pico con un peso molecular aparente de aproximadamente 200 kDa de acuerdo con el volumen hidrodinámico grande de PEG. No se observó evidencia de agregados. NBN libre, que se eluye con una masa molecular aparente de aproximadamente 30 kDa, no se detectó en la preparación.
Análisis de NBN pegilada mediante HPLC en fase inversa
NBN NK pegilada se sometió a HPLC de fase inversa en una columna Vydac C_{4} (5 \mum, 1 x 250 mm). La columna se desarrolló usando un gradiente de 60 nm desde 40 a 60% de B (Tampón A: TFA al 0,1%, Tampón B: acetonitrilo al 75%/TFA al 0,085%). El efluente de la columna se verificó con respecto a la absorbancia a 214 nm y se recogieron fracciones para el análisis subsiguiente. La NBN NK pegilada se fraccionó en sus diversos componentes di-(60,5 mm), tri (63,3 mm) y tetra (67,8 mm) pegilados mediante HPLC en fase inversa en una columna C_{4}. Las intensidades relativas de los picos sugieren que las relaciones de los componentes son 5,4, 60,5 y 30,1%, respectivamente. Las densidades de los picos se verificaron mediante MALDI-MS. No existía evidencia de NBN NK no pegilada (se eluye a 15 mm) en el producto.
Análisis de NBN pegilada mediante espectrometría de masas
NBN NK pegilada se desaló en una Zip Tip C_{4} y se analizó mediante espectrometría de masas en un espectrómetro de masas de desorción/ionización lasérica asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF) Voyager-DE^{TM} STR (PerSeptive Biosystems) usando ácido sinapínico como una matriz. 0,5 \mul de la proteína purificada se mezclaron con 0,5 \mul de matriz sobre la placa elegida. La espectrometría de masas de NBN pegilada revelaba formas simplemente y doblemente cargadas de tres aductos. Las masas observadas de 43803 Da, 54045 Da y 64438 Da están de acuerdo con las modificaciones de 2, 3 y 4 PEGs/molécula.
Análisis de NBN pegilada mediante mapeo peptídico
La especificidad de la reacción de pegilación se evaluó mediante mapeo peptídico. NBN pegilada se separó en componentes di-, tri- y tetra-pegilados, que a continuación se redujeron, se alquilaron y se separaron adicionalmente en sus componentes monocatenarios mediante HPLC en una columna C_{4}. Estos componentes y NBN NK no modificada reducida y alquilada como un control se digirieron con proteinasa Asp-N y los productos de segmentación resultantes se fraccionaron mediante HPLC en fase inversa en una columna Vydac C_{18} (5 \mum, 1 x 250 mm) usando un gradiente de 60 mm desde 0 a 60% de B (Tampón A: TFA al 0,1%, Tampón B: acetonitrilo al 75%/TFA al 0,085%). El efluente de la columna se verificó con respecto a la absorbancia a 214 mm.
La secuencia de NBN de rata contiene cuatro ácidos aspárticos internos y por lo tanto se esperaba que diera un perfil de segmentación simple cuando se digería con endoproteinasa Asp-N. Todos los picos del digesto de Asp-N de NBN NK de rata se han identificado mediante espectrometría de masas y/o secuenciación N-terminal de Edman y así el mapa peptídico puede usarse como una herramienta simple para sondear los sitios de modificación mediante la presencia o ausencia de un pico. La identidad de los diversos picos se resume posteriormente en la Tabla 3.
TABLA 3
6
Puesto que la NBN existe como un homodímero, el producto de NBN NK de rata contiene cuatro sitios potenciales para la pegilación, las dos aminas N-terminales de cada una de las dos cadenas y los dos sitios N95K que se sometieron a ingeniería hasta el constructo. En el mapa peptídico de la cadena así pegilada, solo el pico que contiene el péptido con la mutación NK estaba alterado por la modificación con PEG. Ninguno de los otros picos estaba afectado por la modificación con PEG. Los datos del mapeo indican por lo tanto que el resto de PEG se liga específicamente a este péptido y no a ninguno de los otros péptidos que se rastreaban. El segundo sitio potencial de unión, el extremo N, está en un péptido que solo tiene tres aminoácidos de largo y no es detectado en el mapa peptídico. Se infiere que las ligazones de PEG adicionales están en este sitio. De acuerdo con esa noción, un pequeño porcentaje de la NBN NK de rata no está acoplado y contiene la secuencia de Ala-1 madura. Este péptido se eluye en 30 \mum y es visible en el mapa peptídico a partir del digesto no pegilado, pero está ausente de los digestos de NBN NK pegilados.
Ejemplo 3 Determinación de la potencia de neublastina internamente pegilada en un ELISA de activación de receptores de quinasa (KIRA)
La potencia de NBN de rata pegilada se midió usando activación/fosforilación dependiente de NBN de c-Ret como un informador para la actividad de NBN en un ELISA que era específico para la presencia de RET fosforilado. Células NB41A3-mRL3, una línea celular de neuroblastoma múrido adherente que expresa Ret y GFR\alpha3, se cultivaron en placa a 2 x 10^{5} células por pocillo en placas de 24 pocillos en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), complementado con suero bovino fetal al 10%, y se cultivaron durante 18 h a 37ºC y CO_{2} al 5%.
Las células se lavaron con PBS y se trataron con diluciones en serie de NBN en 0,25 ml de DMEM durante 10 min a 37ºC y CO_{2} al 5%. Cada muestra se retiró por duplicado. Las células se lavaron con 1 ml de PBS y se sometieron a lisis durante 1 h a 4ºC con 0,30 ml de Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, Nonidet P40 al 0,5%, desoxicolato sódico al 0,2%, NaF 50 mM, Na_{3}VO_{4} 0,1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, haciendo girar suavemente las placas. Los lisados se agitaron adicionalmente mediante pipeteo repetido y 0,25 ml de muestras se transfirieron a una placa de ELISA de 96 pocillos que se había revestido con 5 \mug/ml de mAb anti-Ret (AA.GE7.3) en tampón de carbonato 50 mM, pH 9,6, a 4ºC durante 18 h, y se bloquearon a temperatura ambiente durante 1 hora con tampón de bloqueo (Tris HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,1% (TBST) que contenía 1% de suero de ratón normal y 3% de albúmina de suero bovino).
Después de una incubación de 2 h a temperatura ambiente, los pocillos se lavaron 6 veces con TBST. Ret fosforilado se detectó incubando los pocillos a temperatura ambiente durante 2 h con 2 \mug/ml de anticuerpo anti-fosfotirosina 4G10 conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP) en tampón de bloqueo, lavando 6 veces con TBST y midiendo la actividad de HRP a 450 nm con un reactivo de detección colorimétrico. Los valores de absorbancia de los pocillos tratados con lisado o con tampón de lisis se midieron y la señal corregida para el fondo se representó como una función de la concentración de NBN presente en la mezcla de activación. La potencia de NBN pegilada en el ELISA de KIRA era 10 mM, que era indistinguible de la del material de partida de NBN NK. No había efecto de dos ciclos de congelación-descongelación sobre la potencia y después de este tratamiento no había un incremento significativo en la turbidez de la muestra, indicando que las muestras pueden descongelarse con seguridad para el estudio. En estudios independientes que acceden a la actividad de producto con 3 y 4 PEGs de 10 kDa/molécula separadamente, se deter-
minó que el aducto con 3 PEGs era completamente activo, mientras que el producto de 4 PEG tenía actividad reducida.
Ejemplo 4 Estudios Farmacocinéticos de neublastina de rata internamente pegilada en ratas y ratones
Se examinaron las propiedades farmacocinéticas de diversos productos de NBN pegilados y no pegilados en modelos de rata y ratón.
Los datos revelaban que la pegilación de NBN NK de rata con 3,3 PEGs de 10000 Da daba como resultado un efecto significativo sobre la semivida y la biodisponibilidad de la neublastina. Después de una administración IV de 1 mg/kg en ratas Sprague Dawley, los niveles máximos de NBN pegilada de 3000 ng/ml se detectaban después de 7 minutos, y niveles de 700 ng/ml se detectaban después de 24 h, 200 ng/ml después de 48 h y 100 ng/ml después de 72 h. En contraste, para NBN no pegilada, después de una administración IV de 1 mg/kg, se detectaban niveles de 1500 ng/ml después de 7 minutos, pero a continuación los niveles caían rápidamente hasta 70 ng/ml después de 3 h y no eran detectables después de 7 h. Los efectos de la pegilación eran aún más pronunciados en animales tratados con NBN pegilada mediante administración subcutánea.
Después de una administración s.c. de 1 mg/kg, los niveles en circulación de NBN pegilada alcanzaban un máximo de 200 ng/ml, después de 24 h y permanecían a este nivel a lo largo de la duración de los tres días de estudio. En contraste, no se observaba NBN detectable en ningún punto temporal después de la administración de NBN no modificada.
El análisis de las muestras de NBN pegilada se complicaban por la presencia de aductos que contenían 2, 3 y 4 PEGs por molécula, que presentaban cada uno un perfil de PK diferente. En estudios de PK iniciales, se usaron ratones para facilitar el rastreo a través de una variedad de candidatos y rutas de administración. Los estudios en ratones revelaban diferencias drásticas en la biodisponibilidad de los candidatos. Sin embargo, cuando el aducto de 3,3 PEGs de 10 K se evaluaba en ratas, se encontró que estaba menos biodisponible en ratas que en ratones. La diferencia en la biodisponibilidad era particularmente pronunciada después de la administración i.p. Los niveles en ratones alcanzaban 1600 ng/ml después de 7 h y permanecían a 400 ng/ml después de 24 h. En contraste, los niveles en ratas eran constantes a 100 ng/ml durante 4-48 h.
Tanto la neublastina de rata silvestre (wt-NBN) como neublastina con una substitución de Asn por Lys en la posición 95 (NK-NBN) se replegaron y se purificaron hasta >95% para pruebas de eficacia en el modelo de neuropatía de rata diabética STZ. Wt-NBN se formuló para ir directamente a la prueba animal mientras que la NK-NBN se preparó para la pegilación con PEG de 10 kDa-SPA. Para conseguir el objetivo de repliegue y purificación, se desarrolló un método de repliegue que utilizaba cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) que permitía la renaturalización de NBN a partir de cuerpos de inclusión de E. coli en grandes cantidades y con altas concentraciones. Además de SEC, se emplearon etapas de cromatografía en columna tanto de Ni-NTA como de sílice CM para incrementar la pureza de la proteína final. Las proteínas se sometieron a caracterización intensiva incluyendo análisis mediante SDS-PAGE, cromatografía de exclusión por tamaño, ESMS, determinación de la actividad mediante ELISA de KIRA y determinación del contenido de endotoxina. SDS-PAGE y SEC de los productos proteínicos finales indicaban una pureza de más de 95%. El nivel de endotoxinas de cada producto era <0,2 EU/mg. La actividad específica de ambas proteínas en el ELISA de KIRA es aproximadamente 10 nM. Wt-NBN se formuló en 1,0 mg/ml y NK-NBN se formuló en 2,6 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 6,5. La Wt-NBN se dividió en partes alícuotas en tubos de 15 ml y se almacenó congelada a -70ºC mientras que la NK-NBN se sometió a pegilación antes de dividir en partes alícuotas y congelar.
Ejemplo 5 Repliegue de una neublastina silvestre y la proteína de neublastina N95K
Ambas formas de NBN se expresaron en E. coli como sus proteínas de fusión etiquetadas con His con un sitio de segmentación de enteroquinasa inmediatamente adyacente al inicio de la secuencia de 113 aminoácidos madura. Bacterias que expresaban bien wt- (1,8 kg de pellas) o bien NK-NBN (2,5 kg de pellas) se sometieron a lisis en 2 litros de PBS usando una prensa de Gaulin. Después de la centrifugación (10.000 rpm) para formar como pellas los cuerpos de inclusión, los sobrenadantes de cada preparación se descartaron. Las pellas de cuerpos de inclusión se lavaron dos veces con tampón (Tris-HCl 0,02M, pH 8,5, EDTA 0,5 mM), a continuación se lavaron dos veces con el mismo tampón que contenía Triton X-100 (2%, v/v), seguido por dos lavados con tampón adicionales sin detergente. Ambas pellas se solubilizaron usando hidrocloruro de guanidina 6M, Tris 0,1M, pH 8,5, DTT 0,1M y EDTA 1 mM. Para ayudar en el procedimiento de solubilización, cada pella se sometió a homogeneización usando un homogeneizador Polytron seguido por remoción nocturna a temperatura ambiente. Las proteínas solubilizadas se clarificaron mediante centrifugación antes de la cromatografía desnaturalizante a través de Superdex 200 (columna de 5,5 litros equilibrada con glicina 0,05M/H_{3}PO_{4}, pH 3,0 con guanidina-HCl 2M) a 20 ml por minuto.
La NBN desnaturalizada se identificó mediante SDS-PAGE. Las fracciones que contenían bien Wt-NBN o bien NK-NBN se reunieron y se concentraron hasta aproximadamente 250 ml usando un concentrador de células removido Amicon de 2,5 litros. Después de la filtración para retirar cualquier precipitado, la proteína concentrada se sometió a cromatografía de dimensionamiento renaturalizante a través de Superdex 200 equilibrada con Tris-HCl 0,1M, pH 7,8, guanidina-HCl 0,5M, glutationa reducida 8,8 mM y glutationa oxidada 0,22 mM. La columna se desarrolló usando guanidina-HCl 0,5M a 20 ml por minuto. Las fracciones que contenían wt-NBN o NK-NBN renaturalizadas se identificaron mediante SDS-PAGE, se reunieron y se almacenaron a 4ºC hasta que fuera necesario para la retirada de la etiqueta de His.
Concentración de NBN mediante cromatografía en Ni-NTA (TR5919-138)
NBN renaturalizada se almacenó a 4ºC durante al menos 24 horas antes de proceder a la purificación para promover la formación de disulfuro entre los monómeros de NBN. Durante este tiempo, se formaba un precipitado y se retiraba mediante filtración a través de una unidad filtrante PES de 0,2 \mu. Para disminuir la unión no específica, la solución de proteína se llevó hasta imidazol 20 mM antes de cargar en una columna de 100 ml de Ni-NTA (Qiagen) equilibrada con tampón de columna (guanidina 0,5M e imidazol 20 mM) a 50 ml por minuto. Después de la aplicación de proteína, la columna se lavó hasta la línea de base usando el mismo tampón. La NBN se eluyó de la resina usando aproximadamente 300 ml de tampón de elución que contenía guanidina-HCl 0,5M e imidazol 0,4M. Después de la elución, la NBN se dializó durante la noche (usando tubo de diálisis de 10 kDa) a temperatura ambiente contra 10 volúmenes de HCl 5 mM. La diálisis promueve la hidrólisis de substancias contaminantes y disminuye las concentraciones de guanidina-HCl e imidazol hasta 0,05M y 0,04M, respectivamente.
Segmentación de la etiqueta de His mediante lisilendopeptidasa o enteroquinasa
El día siguiente, cualquier precipitado que se formaba durante la diálisis se retiraba mediante filtración. La muestra de proteína se hizo NaCl 0,1M mediante la adición de una reserva 5M para una concentración final de sal, incluyendo el guanidina-HCl restante, de aproximadamente 150 mM. Esta concentración se confirmó usando un medidor de conductividad. Adicionalmente, HEPES 1M, pH 8, se añadió para una concentración final de 25 mM. Para segmentar la etiqueta, se añadió lisilendopeptidasa a wt-NBN y se añadió enteroquinasa a NK-NBN, ambas en una relación de aproximadamente 1:300 de proteasa a NBN. Se usó enteroquinasa en lugar de lilsilendopeptidasa para NK-NBN debido a un sitio de segmentación de proteasa adicional en la proteína mutada en Lys95. Las muestras se removieron a temperatura ambiente durante 2 horas y las digestiones se verificaron mediante SDS-PAGE.
Retirada de la etiqueta de His mediante cromatografía con Ni-NTA
NBN tratada con proteasa se aplicó a una columna de Ni-NTA de 100 ml equilibrada con guanidina-HCl 0,5M e imidazol 20 mM a 50 ml por minuto. La columna se lavó hasta la línea de base con el mismo tampón. Cualquier lavado de proteína procedente de la columna se reunió con la proteína pasante que contenía NBN y la etiqueta de His.
Cromatografía en sílice CM
Después de la cromatografía con Ni-NTA, la proteína se sometió inmediatamente a purificación adicional a través de resina de sílice CM. Una columna de sílice CM de 20 ml equilibrada con tampón de carga (fosfato 5 mM, pH 6,5, NaCl 150 mM) se cargó con NBN a 20 ml por minuto. La columna se lavó con 20 volúmenes de columna de tampón de lavado (fosfato 5 mM, pH 6,5, NaCl 400 mM) y la etapa proteínica se eluyó con tampón de elución que contenía fosfato 5 mM, pH 6,5, pero con NaCl 1M. La proteína eluida se dializó durante la noche contra el fosfato solo para llevar la concentración de sal hasta 100 mM para NK-NBN y 150 mM para wt-NBN. Ambas muestras se filtraron a través de una unidad filtrante PES de 0,2 \mu, se analizaron mediante SDS-PAGE y se almacenaron a 4ºC hasta que fueran necesarias para caracterizaciones adicionales y/o pegilación.
Wt-NBN y NK-NBN se sometieron a análisis del espectro UV para determinar su absorbancia a 280. Usando una microcubeta de cuarzo y utilizando como blanco tampón solo, 100 \mul bien de wt-NBN o bien NK-NBN se exploraron continuamente de 230 a 330 nm usando un espectrofotómetro Beckman. Basándose en este análisis, se determinó que la wt-NBN estaba a una concentración de 1,1 mg/ml y la NK-NBN a 2,6 mg/ml (a 280 nm-E^{0,1%} = 0,5 usado para cada proteína). Se identificó menos de 1% de material precipitado basándose en la absorbancia a 330 nm.
Para determinar la pureza de ambas preparaciones proteínicas, cada muestra (0,5 mg) se sometió a cromatografía de exclusión por tamaño a través de una columna 16/30 Superdex 75. La columna se equilibró con fosfato 5 mM, pH 6,5, que contenía NaCl 400 mM y se desarrolló con un caudal de 1,5 ml por minuto. Basándose en la absorbancia a 280 nm, tanto la wt- como la NK-NBN migraban como un solo pico con un peso molecular esperado (23-24 kDa) y no contenían contaminación de proteína significativa.
Tanto la wt- como la NK-NBN se redujeron en guanidina-HCl 2,5M, Tris 60 mM, pH 8,0, y DTT 16 mM. Las muestras reducidas se desalaron a lo largo de una columna C_{4} corta y se analizaron en línea mediante ESMS usando un instrumento cuadrupolar triple. Los datos brutos de ESMS se desconvolucionaron mediante el programa MaxEnt para generar espectros de masas. Este procedimiento permite que señales cargadas múltiples colapsen en un pico que se corresponde directamente con la masa molecular en kilodaltons (kDa). El espectro de masas desconvolucionado para wt-NBN mostraba que la especie predominante es 12046 kDa, lo que está de acuerdo con el peso molecular predicho de 12046,7 kDa para la forma de 113 aminoácidos de la proteína. Un componente secundario también se observó (12063 kDa), sugiriendo la presencia de un producto de oxidación. Se identificaron tres picos en la muestra de NK-NBN. El componente principal mostraba una masa molecular aparente de 11345 kDa de acuerdo con la masa predicha para la forma de 106 aminoácidos de la proteína. Los otros dos picos tenían masas de 11362 y 12061 kDa, sugiriendo la oxidación de NK-NBN y la presencia de la forma de 113 aminoácidos, respectivamente.
La presencia de las formas de 106 y 113 aminoácidos en las preparaciones de NK-NBN es atribuible a la digestión con enteroquinasa. Esta proteasa de Biozyme es una preparación enzimática natural purificada de mucosa intestinal de ternero y se presenta que contiene una ligera contaminación de tripsina (0,25 ng de tripsina por \mug de enteroquinasa). Por lo tanto, la tripsina puede estar actuando sobre la NK-NBN en la parte carboxiterminal de Arg7 para producir la forma de 106 aminoácidos predominante. Por otra parte, la lisilendopeptidasa usada para segmentar wt-NBN es una actividad de proteasa simple que actúa sobre la parte carboxiterminal del residuo de lisina contenido dentro de la etiqueta de His para producir la forma de NBN de 113 aminoácidos madura. Las formas tanto de 106 como de 113 aminoácidos de NBN son igualmente activas en todos los ensayos probados y se comportan de forma similar en pruebas de estabilidad frente a guanidina-HCl.
La actividad de NBN se determinó mediante su capacidad para estimular la fosforilación de c-Ret en células NB41A3-mRL3 usando el ELISA de KIRA descrito en el Ejemplo 3. Ret fosforilado se detectó incubando (2 horas) el receptor capturado con anticuerpo para fosfotirosina conjugado a HRP (4G10; 0,2 \mug por pocillo). Después de la incubación, los pocillos se lavaron 6 veces con TBST y la actividad de HPR se detectó a 450 nm con un ensayo colorimétrico. Los valores de absorbancia de los pocillos tratados con lisado o con tampón de lisis solo se midieron, se corrigieron para el fondo y los datos se reunieron como una función de la concentración de neublastina presente en la mezcla de activación. Los datos demuestran que la NBN purificada daba como resultado la aparición de RET fosforilado, indicando que la NBN purificada era activa en este ensayo.
Ejemplo 6 Preparación de un conjugado de albúmina de suero-neublastina
Neublastina de rata silvestre en una concentración de 1 mg/ml en PBS se trató con sulfo-SMCC (Pierce) 1 mM y se desaló para retirar el reticulador en exceso. Puesto que la proteína de NBN silvestre contiene solo una amina simple en su extremo N y no tiene grupos sulfhidrilo libres, se esperaba que la reacción con SMCC diera como resultado una modificación específica para el sitio de la NBN con SMCC ligado en su extremo N.
60 \mug del conjugado de NBN-SMCC se incubaron con 120 \mug de albúmina de suero bovino y se analizaron con respecto a la extensión de la reticulación mediante SDS-PAGE. La BSA contiene un solo grupo SH libre y por consiguiente se espera que la reacción con el conjugado de NBN-SMCC dé como resultado la modificación en este sitio a través de la maleimida sobre el SMCC. Bajo estas condiciones, se observaron dos bandas adicionales de peso molecular superior, que están de acuerdo en la masa con la modificación de la NBN con un solo resto de BSA y con dos moléculas de BSA ya que cada molécula de NBN contiene dos extremos N que pueden sufrir reacción, y por consiguiente están de acuerdo con esta noción. Simultáneamente con la formación de estas bandas, había una disminución en la intensidad de las bandas de NBN-SMCC y BSA. Basándose en la intensidad de la banda de NBN restante, la reacción parecía haber llegado hasta 70-80% de terminación.
El producto monosubstituido se purificó de la mezcla de reacción sometiendo el material a cromatografía de intercambio catiónico y cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200 (Pharmacia) esencialmente como se describe para los estudios de pegilación analizados anteriormente. Fracciones de columna de la filtración en gel efectuada se analizaron mediante SDS-PAGE y las que contenían el producto monosubstituido se analizaron con respecto al contenido de proteína mediante absorbancia a 280 nm. Puesto que la masa de BSA es aproximadamente dos veces la de la neublastina, la concentración aparente se dividió por un factor de tres para dar el equivalente de NBN. Esta fracción se sometió a análisis para la función en el ELISA de KIRA. Los valores de IC50 para la NBN tanto silvestre como conjugada a BSA eran 3-6 nM, indicando que la conjugación a la BSA no había comprometido la función.
Aunque estos estudios preliminares se generaron con BSA, las proteínas de albúmina de suero correspondientes de ratas y seres humanos contienen un SH libre. Por consiguiente, puede aplicarse un sistema similar para generar un conjugado de albúmina de suero de rata-NBN de rata para realizar estudios de PK y eficacia en ratas y albúmina de suero humano-NBN humana para realizar pruebas clínicas. De forma similar, el SMCC puede substituirse por cualquiera de un número de reticuladores que contienen un grupo reactivo con amino en un lado y un grupo reactivo con tiol en el otro lado. Ejemplos de reticuladores reactivos con amina que insertan una maleimida reactiva con tiol son AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS o GMBS, que insertan un grupo haloacetato reactivo con tiol son SBAP, SIA y SIAB, y los que proporcionan un tiol protegido o no protegido para la reacción con grupos sulfhidrilo para producir una conexión reducible son SPDP, SMPT, SATA o SATP, todos los cuales están disponibles de Pierce. Tales reticuladores son meramente ejemplares y se anticipan muchas estrategias alternativas para conectar el extremo N de NBN con albúmina de suero. Un experto también podría generar conjugados con albúmina de suero que no están orientados en el extremo N de NBN o en el resto tiol sobre la albúmina de suero. También se espera que sean funcionales las fusiones de NBN-albúmina de suero creadas usando ingeniería genética en las que la NBN está fusionada al gen de albúmina de suero en su extremo N, extremo C o en ambos extremos.
Este método puede extenderse a través de adaptaciones habituales a cualquier conjugado de NBN-albúmina de suero que diera como resultado un producto con un semivida prolongada en animales y por consiguiente en seres humanos.
<110> Biogen, Inc.
\hskip1cm
Sah, Dinah W.Y. 
\hskip1cm
Pepinsky, Blake R 
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Borjack-Sjodin, Paula Ann 
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Miller, Stephan S 
\hskip1cm
Rossomando, Anthony 
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<120> Conjugados Polímeros de Neublastina y Métodos para Usar los Mismos
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<130> 00689-506-061
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<140> No Cedida Todavía
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<141> 2002-01-23
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<150> 60/266,071
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<151> 2001-02-01
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<160> 13
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 111
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia de Consenso
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<220>
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<221> VARIANTE
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<222> (3)
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<223> En donde Xaa es Gly o Thr
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<220>
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<221> VARIANTE
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<222> (4)
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<223> En donde Xaa es Pro o Arg
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<220>
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<221> VARIANTE
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<222> (5)
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<223> En donde Xaa es Gly o Ser
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<220>
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<221> VARIANTE
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<222> (10)
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<223> En donde Xaa es Ala o Thr
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<220>
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<221> VARIANTE
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<222> (11)
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<223> En donde Xaa es Ala o Thr
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<220>
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<221> VARIANTE
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<222> (12)
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<223> En donde Xaa es Gly o Asp
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<220>
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<221> VARIANTE
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<222> (26)
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<223> En donde Xaa es Arg o Ser
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<220>
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<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En donde Xaa es Arg o Ser
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
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<222> (38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En donde Xaa es Val o Ile
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
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<222> (51)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En donde Xaa es Val o Ile
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (53)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En donde Xaa es Pro o Gln
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
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<222> (69)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En donde Xaa es Pro o Ser
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<220>
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<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (76)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En donde Xaa es Val o Ile
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
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<222> (103)
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<223> En donde Xaa es Arg o His
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<210> 2
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 113
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<212> PRT
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<213> Mus musculus 
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<400> 3
10 
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<210> 4
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<211> 113
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<212> PRT
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<213> Rattus norvegicus 
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<400> 4
11 
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<210> 5
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<211> 675
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus 
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 57
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido KD2-310
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<400> 6
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gtatctttca tggacgtaaa gtctacatgg agaaccgtag atcatctatc tgcaacc 
\hfill
57 
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<210> 7
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<211> 57
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido KD3-211
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<400> 7
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ggttgcagat agatgatcta cggttctcca tgtagacttt acgtccatga aagatac 
\hfill
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido KD3-254
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<400> 8
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\hfill
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<210> 9
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<211> 50
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido KD2-255
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<400> 9
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cgacagcctt ttgcatccgt tgcacgagca cgagagctgc gagttccagc 
\hfill
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<210> 10
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido KD3-258
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<400> 10
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ggagccggag cactaaaatc tccccgggat ctagacc 
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37 
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<210> 11
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<211> 38
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido KD3-259
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<400> 11
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ggtctagatc ccgggggaga ttttagtgct ccggctcc 
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38 
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<210> 12
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<211> 32
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido KD3-256
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gacgaattaa ttaagtttcg tttttgttca gg 
\hfill
32 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
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<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido KD3-257
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctgaacaaa aacgaaactt aattaattcg tc 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
LISTADO DE SECUENCIAS 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Biogen, Inc.
\hskip1cm
Sah, Dinah W.Y. 
\hskip1cm
Pepinsky, Blake R 
\hskip1cm
Borjack-sjodin, Paula Ann 
\hskip1cm
Miller, Stephan S 
\hskip1cm
Rossomando, Anthony 
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Conjugados Polímeros de Neublastina y Métodos para Usar los Mismos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 00689-506-061
\vskip0.400000\baselineskip
<140> No Cedida Todavía
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<141> 2002-01-23
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/266,071
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2001-02-01
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia de Consenso
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En donde Xaa es Gly o Thr
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En donde Xaa es Pro o Arg
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En donde Xaa es Gly o Ser
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En donde Xaa es Ala o Thr
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
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<222> (11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En donde Xaa es Ala o Thr
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En donde Xaa es Gly o Asp
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En donde Xaa es Arg o Ser
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En donde Xaa es Arg o Ser
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En donde Xaa es Val o Ile
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (51)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En donde Xaa es Val o Ile
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (53)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En donde Xaa es Pro o Gln
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (69)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En donde Xaa es Pro o Ser
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (76)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En donde Xaa es Val o Ile
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (103)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En donde Xaa es Arg o His
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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15 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 4
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<211> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Rattus norvegicus 
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<211> 675
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<212> DNA
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<213> Rattus norvegicus 
\newpage
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<210> 6
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido KD2-310
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\vskip0.400000\baselineskip
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gtatctttca tggacgtaaa gtctacatgg agaaccgtag atcatctatc tgcaacc 
\hfill
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido KD3-211
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 7
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ggttgcagat agatgatcta cggttctcca tgtagacttt acgtccatga aagatac 
\hfill
57 
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<211> 50
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido KD3-254
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
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gctggaactc gcagctctcg tgctcgtgca acggatgcaa aaggctgtcg 
\hfill
50 
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<210> 9
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<211> 50
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido KD2-255
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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cgacagcctt ttgcatccgt tgcacgagca cgagagctgc gagttccagc 
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido KD3-258
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ggagccggag cactaaaatc tccccgggat ctagacc 
\hfill
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<211> 38
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido KD3-259
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ggtctagatc ccgggggaga ttttagtgct ccggctcc 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido KD3-256
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
gacgaattaa ttaagtttcg tttttgttca gg 
\hfill
32 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
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<211> 32
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido KD3-257
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<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskip
cctgaacaaa aacgaaactt aattaattcg tc 
\hfill
32

Claims (22)

1. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a los aminoácidos 8-113 del Nº ID SEC: 1, en donde el polipéptido incluye un aminoácido distinto de asparagina en la posición correspondiente a la posición 95 en el Nº ID SEC: 1, en donde el aminoácido substituido en la posición correspondiente a la posición 95 introduce un sitio en el que un polialquilenglicol puede ligarse al polipéptido.
2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 95 en el Nº ID SEC: 1 es lisina.
3. El polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el polipéptido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
(a)
aminoácidos 8-94 y 96-113 del Nº ID SEC: 2;
(b)
aminoácidos 8-94 y 96-113 del Nº ID SEC: 3; y
(c)
aminoácidos 8-94 y 96-113 del Nº ID SEC: 4.
4. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende los aminoácidos 1-94 y 96-113 del Nº ID SEC: 2, el Nº ID SEC: 3 o el Nº ID SEC: 4, en donde la asparagina está substituida por lisina en la posición 95.
5. El polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la secuencia de aminoácidos es al menos 95% idéntica a los aminoácidos 8-113 del Nº ID SEC: 1.
6. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho polipéptido, cuando está dimerizado, se caracteriza por al menos una actividad biológica seleccionada del grupo que consiste en:
a.
unión a GFR\alpha3;
b.
estimulación de fosforilación de la tirosina de un polipéptido de RET;
c.
potenciación de la supervivencia neuronal; y
d.
normalización de cambios patológicos en una neurona.
7. Una proteína de fusión que comprende el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes fusionado a un segundo resto.
8. La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el segundo resto es un polipéptido de albúmina de suero humano.
9. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o la proteína de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8.
10. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 9.
11. Una célula huésped que comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 10.
12. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la célula huésped es una célula de ovario de hámster chino.
13. Un método para elaborar el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o la proteína de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8, que comprende
(a)
cultivar la célula huésped de acuerdo con las reivindicaciones 11 ó 12 bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o la proteína de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8, y
(b)
recuperar dicho polipéptido o proteína de fusión.
14. Un dímero que comprende dos polipéptidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o dos proteínas de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8.
15. Un conjugado que comprende el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 conjugado a un polialquilenglicol, en donde el polialquilenglicol está conjugado al polipéptido en el aminoácido substituido en la posición correspondiente a la posición 95 en el Nº ID SEC: 1.
16. Un conjugado que comprende la proteína de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8 conjugada a un polialquilenglicol, en donde el polialquilenglicol está conjugado a la proteína de fusión en el aminoácido substituido en la posición correspondiente a la posición 95 en el Nº ID SEC: 1.
17. El conjugado de acuerdo con las reivindicaciones 15 ó 16, en el que el polialquilenglicol es polietilenglicol.
18. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que el polipéptido está glicosilado.
19. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, la proteína de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8 o el conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 y un vehículo fisiológicamente aceptable.
20. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, la proteína de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8 o el conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, para el uso en terapia.
21. El uso del polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, la proteína de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8 o el conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o un trastorno del sistema nervioso.
22. El uso de acuerdo con la reivindicación 21, en el que la enfermedad o el trastorno es una neuropatía periférica o un síndrome de dolor neuropático.
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