NO332150B1 - Polymerkonjugater av neublastin, samt anvendelse derav - Google Patents
Polymerkonjugater av neublastin, samt anvendelse derav Download PDFInfo
- Publication number
- NO332150B1 NO332150B1 NO20033441A NO20033441A NO332150B1 NO 332150 B1 NO332150 B1 NO 332150B1 NO 20033441 A NO20033441 A NO 20033441A NO 20033441 A NO20033441 A NO 20033441A NO 332150 B1 NO332150 B1 NO 332150B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- polypeptide
- nbn
- seq
- neublastin
- amino acid
- Prior art date
Links
- 102100026376 Artemin Human genes 0.000 title description 277
- 101000785776 Homo sapiens Artemin Proteins 0.000 title description 147
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 title description 40
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 77
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 64
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 61
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 55
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 52
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 31
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 23
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 18
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 15
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 14
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 14
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 claims description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 12
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 11
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 11
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 10
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 claims description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 claims description 5
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000004296 neuralgia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000021722 neuropathic pain Diseases 0.000 claims description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 54
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 53
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 53
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 44
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 41
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 40
- 239000000047 product Substances 0.000 description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 description 31
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 24
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 23
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 23
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 22
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 19
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 16
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 16
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 16
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 15
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 14
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 14
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 14
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 14
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 13
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101100324497 Rattus norvegicus Artn gene Proteins 0.000 description 12
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 12
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 12
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 12
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 12
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 11
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 10
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 10
- 101000579425 Homo sapiens Proto-oncogene tyrosine-protein kinase receptor Ret Proteins 0.000 description 10
- 101100293625 Rattus norvegicus Nbn gene Proteins 0.000 description 10
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 10
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 9
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 102100028286 Proto-oncogene tyrosine-protein kinase receptor Ret Human genes 0.000 description 8
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 8
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 8
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 8
- 239000000306 component Substances 0.000 description 8
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 8
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 8
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 8
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 7
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 7
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 6
- 101000945318 Homo sapiens Calponin-1 Proteins 0.000 description 6
- 101000652736 Homo sapiens Transgelin Proteins 0.000 description 6
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical group SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 6
- 102100031013 Transgelin Human genes 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 6
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 6
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- -1 host cells Proteins 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 5
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 5
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 108010053229 Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 4
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 101100324496 Mus musculus Artn gene Proteins 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102100036660 Persephin Human genes 0.000 description 4
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 4
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Chemical group SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical group C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- 108010070453 persephin Proteins 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 4
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 210000001044 sensory neuron Anatomy 0.000 description 4
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- SGNVTRHWJGTNKV-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 11-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)undecanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCCCCCCN1C(=O)C=CC1=O SGNVTRHWJGTNKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- TYKASZBHFXBROF-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)acetate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CN1C(=O)C=CC1=O TYKASZBHFXBROF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JKHVDAUOODACDU-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCN1C(=O)C=CC1=O JKHVDAUOODACDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCN1C(=O)C=CC1=O PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BQWBEDSJTMWJAE-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[(2-iodoacetyl)amino]benzoate Chemical compound C1=CC(NC(=O)CI)=CC=C1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O BQWBEDSJTMWJAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GKSPIZSKQWTXQG-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[1-(pyridin-2-yldisulfanyl)ethyl]benzoate Chemical compound C=1C=C(C(=O)ON2C(CCC2=O)=O)C=CC=1C(C)SSC1=CC=CC=N1 GKSPIZSKQWTXQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PMJWDPGOWBRILU-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl]butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCC(C=C1)=CC=C1N1C(=O)C=CC1=O PMJWDPGOWBRILU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VLARLSIGSPVYHX-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)hexanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCN1C(=O)C=CC1=O VLARLSIGSPVYHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WCMOHMXWOOBVMZ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-[3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)propanoylamino]hexanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCNC(=O)CCN1C(=O)C=CC1=O WCMOHMXWOOBVMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) propanoate Chemical compound CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150077555 Ret gene Proteins 0.000 description 3
- 108700031620 S-acetylthiorphan Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 3
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 102220477417 Uncharacterized protein FLJ30774_R14K_mutation Human genes 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 3
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000050671 human ARTN Human genes 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 3
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 230000032405 negative regulation of neuron apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 3
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 3
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 102220225706 rs1014627144 Human genes 0.000 description 3
- 102220289977 rs141288548 Human genes 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 3
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 3
- ATGUDZODTABURZ-UHFFFAOYSA-N thiolan-2-ylideneazanium;chloride Chemical compound Cl.N=C1CCCS1 ATGUDZODTABURZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 3
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 3
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 208000004454 Hyperalgesia Diseases 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 208000001089 Multiple system atrophy Diseases 0.000 description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 102100021584 Neurturin Human genes 0.000 description 2
- 108010015406 Neurturin Proteins 0.000 description 2
- 108010001648 Proto-Oncogene Proteins c-ret Proteins 0.000 description 2
- 102000000813 Proto-Oncogene Proteins c-ret Human genes 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000002567 autonomic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002453 autonomic neuron Anatomy 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 2
- LFKYBJLFJOOKAE-UHFFFAOYSA-N imidazol-2-ylidenemethanone Chemical compound O=C=C1N=CC=N1 LFKYBJLFJOOKAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 2
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 2
- 208000027232 peripheral nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 201000002212 progressive supranuclear palsy Diseases 0.000 description 2
- PCMORTLOPMLEFB-ONEGZZNKSA-N sinapic acid Chemical compound COC1=CC(\C=C\C(O)=O)=CC(OC)=C1O PCMORTLOPMLEFB-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- DYMYLBQTHCJHOQ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) butanoate Chemical compound CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O DYMYLBQTHCJHOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JPNBVWIRDQVGAC-UHFFFAOYSA-N (2-nitrophenyl) hydrogen carbonate Chemical class OC(=O)OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O JPNBVWIRDQVGAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTBWSRPRAGXJJV-UHFFFAOYSA-N 2h-benzotriazole;carbonic acid Chemical class OC(O)=O.C1=CC=C2NN=NC2=C1 BTBWSRPRAGXJJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PHCJRSXXXCZFPL-UHFFFAOYSA-N 5-[(1,3-dioxo-2-benzofuran-5-yl)sulfanyl]-2-benzofuran-1,3-dione Chemical compound C1=C2C(=O)OC(=O)C2=CC(SC=2C=C3C(=O)OC(C3=CC=2)=O)=C1 PHCJRSXXXCZFPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102100024321 Alkaline phosphatase, placental type Human genes 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 208000000412 Avitaminosis Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UWTATZPHSA-N D-Cysteine Chemical compound SC[C@@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-SCSAIBSYSA-N D-Ornithine Chemical compound NCCC[C@@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 229930028154 D-arginine Natural products 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 208000032131 Diabetic Neuropathies Diseases 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195710 D‐cysteine Natural products 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035154 Hyperesthesia Diseases 0.000 description 1
- 206010021135 Hypovitaminosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 1
- QUOGESRFPZDMMT-UHFFFAOYSA-N L-Homoarginine Natural products OC(=O)C(N)CCCCNC(N)=N QUOGESRFPZDMMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- QUOGESRFPZDMMT-YFKPBYRVSA-N L-homoarginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCCNC(N)=N QUOGESRFPZDMMT-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000007339 Nerve Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010032605 Nerve Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 208000027089 Parkinsonian disease Diseases 0.000 description 1
- 206010034010 Parkinsonism Diseases 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010036105 Polyneuropathy Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000930457 Rattus norvegicus Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100068253 Rattus norvegicus Gdnf gene Proteins 0.000 description 1
- 101100248018 Rattus norvegicus Ret gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000007014 Retinitis pigmentosa Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 208000009106 Shy-Drager Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000011166 aliquoting Methods 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 206010053552 allodynia Diseases 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000000576 arachnoid Anatomy 0.000 description 1
- 150000001510 aspartic acids Chemical class 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 108010064866 biozym Proteins 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000013590 bulk material Substances 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 230000003210 demyelinating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000014155 detection of activity Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 108010003914 endoproteinase Asp-N Proteins 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 208000021731 hypoalgesia Diseases 0.000 description 1
- 230000036032 hypoalgesia Effects 0.000 description 1
- 208000034783 hypoesthesia Diseases 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000001906 matrix-assisted laser desorption--ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 206010027175 memory impairment Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- GRVDJDISBSALJP-UHFFFAOYSA-N methyloxidanyl Chemical group [O]C GRVDJDISBSALJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 201000005518 mononeuropathy Diseases 0.000 description 1
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000003961 neuronal insult Effects 0.000 description 1
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003040 nociceptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000584 nodose ganglion Anatomy 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 235000018343 nutrient deficiency Nutrition 0.000 description 1
- 208000019180 nutritional disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 210000005034 parasympathetic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N phosphotyrosine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(OP(O)(O)=O)C=C1 DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 1
- 230000008560 physiological behavior Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 108010031345 placental alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 230000007824 polyneuropathy Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 210000003994 retinal ganglion cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- PCMORTLOPMLEFB-UHFFFAOYSA-N sinapinic acid Natural products COC1=CC(C=CC(O)=O)=CC(OC)=C1O PCMORTLOPMLEFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M sodium;1-[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)C1CCC(CN2C(C=CC2=O)=O)CC1 VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 1
- 210000003594 spinal ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000031725 susceptibility to spondyloarthropathy Diseases 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002889 sympathetic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000012049 topical pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000008736 traumatic injury Effects 0.000 description 1
- 210000000427 trigeminal ganglion Anatomy 0.000 description 1
- 210000000836 trigeminal nuclei Anatomy 0.000 description 1
- 210000001170 unmyelinated nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 210000000752 vestibulocochlear nerve Anatomy 0.000 description 1
- 208000030401 vitamin deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/4756—Neuregulins, i.e. p185erbB2 ligands, glial growth factor, heregulin, ARIA, neu differentiation factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
- A61P29/02—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID] without antiinflammatory effect
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Zoology (AREA)
- Psychology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
Description
Oppfinnelsen angår neuroblastinpolypeptider med en aminosyresekvens som er minst 90% identisk med aminosyrer 8-113 av SEQ ID NO: 1, hvor polypeptider innbefatter en aminosyre som er forskjellige fra asparagin ved posisjonen som tilsvarer posisjon 95 i SEQ ID NO: 1, hvor aminosyren erstattet ved posisjonen tilsvarende posisjon 95 innfører et sete hvor en polyalkylenglykol kan bli bundet til polypeptidet, som angitt i krav 1, samt fremgangsmåter for fremstilling av slike polypeptider som angitt i krav 11, dimer som angitt i krav 12, konjugat som angitt i krav 13, farmasøytisk sammensetning som angitt i krav 16 og anvendelse som angitt i krav 17 og 18.
Bakgrunn for oppfinnelsen
Neurotrofiske faktorer er naturlig forekommende proteiner som fremmer overlevelse, opprettholdelse av fenotypisk differensiering, og som forhindrer nedbrytning og øker aktiviteten av neuronale celler og vev. Neurotrofiske faktorer blir isolert fra neuralt vev og fra ikke-neuralt vev som er innervert av nervesystemet, og har blitt klassifisert i funksjonelt og strukturelt relaterte grupper, også referert til som familier, superfamilier, eller subfamilier. Blant de neurotrofiske faktor superfamilier er fibroblast vekstfaktoren neurotrofin og transformerende vekstfaktor-p (TGF-p) superfamilier. Individuelle arter av neurotrofiske faktorer blir skjelnet ut fra deres fysiske struktur, deres interaksjon med sine kognate reseptorer, og deres påvirkning på forskjellige typer nerveceller. Klassifisert innen TGF-p-superfamilien er de gliale cellelinje avledede neurotrofisk faktor (GDNF) ligander, som innbefatter GDNF, persefin (PSP) og neurturin (NTN).
Ligandene av GDNF-subfamilien har til felles sin egenskap å indusere signalisering via RET-reseptortyrosinkinasen. Disse tre ligander av GDNF-subfamilien er foskjellige ved deres relative affiniteter for en familie av neurotrofiske reseptorer, GFRa-reseptorene.
En nylig beskrevet neurotrofisk faktor er "neublastin", eller "NBN". Neublastin blir klassifisert innen GDNF-subfamilien fordi den deler homologiområder med andre GDNF-ligander og på grunn av dens egenskap å binde til og aktivere RET. Ulik andre GDNF-ligander, er neublastin høyt selektivt for GFRa3-RET-reseptorkomplekset. I tillegg inneholder NBN enestående subområder i sin aminosyresekvens.
Uheldigvis blir neublastin raskt fjernet fra kroppen. Denne raske nedbrytning kan hindre bruken av neublastin i terapeutiske applikasjoner. Således eksisterer et behov for å identifisere neublastinvarianter som har øket biotilgjengelighet.
Oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse er delvis basert på oppdagelsen av nye former av neublastin som viser økede farmokinetiske og biotilgjengelighetsegenskaper in vivo. Disse nye former innbefatter varianter neublastinpolypeptider konjugert til polymere molekyler.
I ett aspekt angår oppfinnelsen polypeptider som angitt i krav 1, og som er et variant neublastinpolypeptid, eller mutein neublastinpolypeptid, som innbefatter en aminosyresekvens som har en eller flere aminosyresubstitusjoner ved oppløsningsmiddel-eksponerte posisjoner av den ferdigutviklede neublastindimer. Foreliggende substitusjoner introduserer i det native neublastinpolypeptid ett eller flere seter hvorved substanser, så som naturlig forekommende eller syntetiske polymerer, kan bli bundet til polypeptidet for å øke dets oppløselighet, og således dets biotilgjengelighet in vivo. Fortrinnsvis innbefatter foreliggende variante polypeptider en aminosyresekvens som minst er 95 % identisk med aminosyrer 8-113 av SEQ ID NO:l.
Som benyttet her refererer "villtypen neublastin" eller "vt-NBN" til en naturlig forekommende eller nativ neublastinpolypeptidsekvens, så som den fra rotte, mus eller human neublastin (se for eksempel SEQ ID NO: 2, 3 eller 4). Spesifikke variante neublastinpolypeptider blir referert heri som "NBN-X1N1X2" eller "XiNiX2-NBN" hvor Xi refererer til en aminosyre av et villtype neublastinpolypeptid, Ni refererer til den nummeriske posisjon av Xi-aminosyrene i sekvensen, som nummerert i henhold til SEQ ID NO:l. X2refererer til en aminosyre som er skiftet ut for villtype aminosyren ved den indikerte nummeriske posisjon i sekvensen. Således identifiserer for eksempel NBN-N95K de variante neublastinpolypeptider hvori asparaginet ved posisjon 95 er erstattet med et lysin.
Det variante neublastinpolypeptid kan bli fremstilt som et multimert polypeptid. For eksempel kan det variante neublastinpolypeptidet bli fremstilt som en dimer som innbefatter minst et variant neublastinpolypeptid. I enkelte utførelsesformer er dimeren en homodimer av variante neublastinpolypeptider. I andre utførelsesformer er dimeren en heterodimer som innbefatter et variant neublastinpolypeptid og et villtype neublastinpolypeptid. Andre dimere kan innbefatter to forskjellige variante neublastinpolypeptidformer.
I foretrukne utførelsesformer binder, når dimerisert, det variante neublastinpolypeptidet GFRa3. I ytterligere foretrukne utførelsesformer stimulerer det variante neublastinpolypeptid, når dimerisert, tyrosinfosforylering av et RET-polypeptid, enten på egen hånd eller når bundet til GFRa3.
I enda ytterligere foretrukne utførelsesformer øker det variante neublastinpolypeptid, når dimerisert, neuronoverlevelse, det vil si øker overlevelse av et sensorisk neuron.
I enda ytterligere foretrukne utførelsesformer normaliserer det variante neublastinpolypeptid, når dimerisert, patologiske endringer av et neuron, så som et sensorisk neuron.
I enda ytterligere foretrukne utførelsesformer øker det variante neublastinpolypeptid, når dimerisert, overlevelse av et neuron for eksempel et autonomt neuron, eller et dopaminergisk neuron.
I foretrukne utførelsesformer er aminosyren ved posisjon 95 lysin.
Fortrinnsvis er aminosyrer 8-94 og 96-113 av det variante neublastinpolypeptid minst 95 % identisk med aminosyrer 8-94 og 96-113 av SEQ ID NO:l. Mest foretrukket innbefatter aminosyresekvensen av det variante neublastinpolypeptid aminosyresekvensen av et naturlig forekommende rotte, humant eller muse neublastinpolypeptid ved aminosyrer 8-94 og 96-113 av det variante neublastinpolypeptid. For eksempel kan aminosyrer 8-94 og 96-113 av det variante neublastinpolypeptid innbefatte aminosyresekvensen av aminosyrer 8-94 og 96-113 av SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 eller SEQ ID NO:4.
I et annet aspekt fremskaffer oppfinnelsen et nukleinsyremolekyl som koder for et variant neublastinpolypeptid som angitt i krav 1. Nukleinsyren som koder for det variante neublastinpolypeptid foreligger fortrinnsvis i en vektor, for eksempel en ekspresjonsvektor. En slik variant neublastin-nukleinsyre, eller en vektor innbefattende samme, kan bli fremskaffet en celle. Cellen kan for eksempel være en pattedyrcelle, soppcelle, gjærcelle, innsektscelle eller bakteriell celle. En foretrukket pattedyrcelle er en kinesisk hamster ovaricelle ("CHO-celle")
Også fremskaffet ved oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å fremstille et variant neublastinpolypeptid ved å dyrke en celle inneholdende en nukleinsyre som koder for en variant neublastin-nukleinsyre under betingelser som tillater ekspresjon av et variant neublastinpolypeptid, og gjenvinne det variante neublastinpolypeptid som angitt i krav 11. Lignende nukleinsyrer, vektorer, vertsceller, og polypeptidfrem-stillingsmetoder er beskrevet heri for fusjonsproteinet (så som neublastinserum albuminfusjonsproteinene) ifølge foreliggende oppfinnelse.
Også fremskaffet ved oppfinnelsen er farmasøytisk sammensetning som innbefatter et neublastinpolypeptid eller variant neublastinpolypeptid som er konjugat til en polyalkylenglykol som angitt i krav 16. Det variante neublastinpolypeptid i sammensetningen innbefatter fortrinnsvis en aminosyresekvens som er minst 95 % identisk med aminosyrer 8-113 av SEQ ID NO:l.
Den aktuelle polymeren er en polyalkylenglykolenhet for eksempel polyetylenglykolenhet (PEG).
I foretrukne utførelsesformer er polyalkylenglykolenheten koblet til en amingruppe av neublastinpolypeptidet, eller et lysin i et variant neublastinpolypeptid.
Kobling kan foregå via en N-hydroksylsuksinimid (NHS) aktiv ester. Den aktive ester kan for eksempel være PEG-suksinimidylsuksinat (SS-PEG), suksinimidylbutyrat (SPB-PEG), eller suksinimidylpropionat (SPA-PEG).
Polyalkylenglykolenheten kan for eksempel være karboksymetyl-NHS, norleucin-NHS, SC-PEG, tresylat, aldehyd, epoksid, karbonylimidazol, eller PNP-karbonat.
I enkelte utførelsesformer er polyalkylenglykolenheten koblet til en cysteingruppe av neublastinpolypeptidet eller det variante neublastinpolypeptid. For eksempel kan kobling inntreffer via en maleimidgruppe, en vinylsulfongruppe, en haloacetatgruppe, og en tiolgruppe.
I enkelte utførelsesformer er neublastinpolypeptidet eller det variante neublastinpolypeptid i sammensetningen glykosylert. Når neublastinpolypeptidet eller det variante polypeptid er glykosylert, kan polymeren bli koblet til en karbohydratenhet av det glykosylerte neublastinpolypeptid eller det variante neublastinpolypeptid. For eksempel kan polymeren bli koblet til det glykosylerte neublastinpolypeptid eller det variante neublastinpolypeptid etter oksidering av en hydrazolgruppe eller en aminogruppe av det glykosylerte neublastinpolypeptid eller det variante neublastinpolypeptid, eller oksidering av en reaktiv gruppe av polymeren.
I forskjellige utførelsesformer omfatter neublastinpolypeptidet eller det variante neublastinpolypeptid en, to, tre eller fire PEG-enheter.
I foretrukne utførelsesformer har neublastinpolypeptidet det variante neublastinpolypeptid eller polymerkonjugatet en lengre serumhalveringstid i forhold til halveringstiden av polypeptidet eller det variante polypeptid ved fravær av polymeren.
I foretrukne utførelsesformer har neublastinpolypeptidet det variante neublastinpolypeptid eller polymerkonjugatet i komplekset en fysiologisk aktivitet valgt fra gruppen omfattende: GFRa3-binding, RET-aktivering, normalisering av patologiske endringer hos et neuron, eller en forsterkende neuronoverlevelse.
Med "normalisering av patologiske endringer hos et neuron" menes at det foreliggende konjugat induserer en endring i en eller flere av de følgende cellulære parametere: ekspresjonsnivå av et strukturelt protein, en neuortrofisk faktorreseptor, en ionekanal, eller en neurotransmitter, eller induserer en endring i cellulær morfologi, i hvert tilfelle for i vesentlig grad å restituere en slik parameter til nivået derav i et neuron av den samme eller lignende fenotype som er upåvirket av sykdom, degenerering, svekkelse eller skade. Normaliseringen av patologiske endringer hos et neuron kan bli overvåket immunohistokjemisk, eller ved å påvise endringer i nivåene av utskilte eller avstøtte produkter, eller ved å påvise in vivo-endringer i fysiologisk oppførelse som kan føres tilbake til funksjon av det/de påvirkede neuron(er). For eksempel i tilfellet med patologiske endringer assosiert med et neuropatisk smertesyndrom kan smerteoppførelser så som hyperalgesia, hypoalgesia eller allodynia bli overvåket.
Med "forsterkning av neuronoverlevelse" menes å utvide overlevelsen av et påvirket neuron forbi overlevelsesperioden observert i et tilsvarende neuron påvirket av samme type sykdom, lidelse, svekkelse eller skade, men som ikke er behandlet med neublastinkonjugatet eller fusjonsproteinet ifølge foreliggende oppfinnelse.
I enkelte utførelsesformer er polymeren koblet til polypeptidet ved et område på neublastinet som er en N-terminal. I enkelte utførelsesformer er polymeren koblet til polypeptidet ved et område i en ikke-terminal aminosyre av neublastinpolypeptidet eller det variante neublastinpolypeptid.
I foretrukne utførelsesformer er polymeren koblet til en oppløsningsmiddel-eksponert aminosyre av neublastinpolypeptidet eller det variante neublastinpolypeptid.
I foretrukne utførelsesformer er polymer koblet til neublastinpolypeptidet eller det variante neublastinpolypeptid ved et residuum valgt fra gruppen omfattende den amino-terminal aminosyre av det variante polypeptid, posisjon 14 i aminosyresekvensen av neublastinpolypeptidet eller det variante neublastinpolypeptid, posisjon 39 i aminosyresekvensen av neublastinpolypeptidet eller det variante neublastinpolypeptid, posisjon 68 i aminosyresekvensen av neublastinpolypeptidet eller det variante neublastinpolypeptid, og posisjon 95 i aminosyresekvensen av neublastinpolypeptidet eller det variante neublastinpolypeptidet.
Også fremskaffet av oppfinnelsen er en farmasøytisk sammensetning omfattende en fysiologisk akseptabel vehikkel inneholdende eller som har dispergert i seg et neublastinpolypeptid, et variant neublastinpolypeptid eller et konjugat ifølge foreliggende oppfinnelse som angitt i krav 16.
I et ytterligere aspekt innbefatter oppfinnelsen et stabilt, vandig oppløselig konjugert neublastinpolypeptid eller variant neublastinpolypeptidkompleks omfattende et neublastinpolypeptid eller et variant neublastinpolypeptid koblet til en polyetylenglykolenhet, hvor neublastinpolypeptidet eller det variante neublastinpolypeptid er koblet til polyetylenglykolenheten via en labil binding. I enkelte utførelsesformer er den labile binding spaltbar ved biokjemisk hydrolyse, proteolyse eller sulfhydryl-spaltning. I foretrukne utførelsesformer er den labile binding spaltbar under in wVo-betingelser.
Foretrukket er nervesystemlidelsen som kan behandles med det aktuelle polypeptidet eller konjugatet, en perifer nervelidelse, så som en perifer neuropati eller et neuropatisk smertesyndrom. Mennesker er foretrukne individer for behandling.
Administrasjon kan for eksempel være systemisk eller lokal.
Med mindre annet er angitt har alle tekniske eller vitenskapelige uttrykk som er benyttet heri den samme betydning som vanlig er forstått av fagpersonen til hvilken foreliggende oppfinnelse tilhører. Selv om fremgangsmåter og materialer lignende eller lik dem beskrevet heri kan bli brukt ved utføring eller testing av oppfinnelsen, er egnede fremgangsmåter og materialer beskrevet nedenfor.
Andre trekk og fordeler ved oppfinnelsen vil være tydelige fra den følgende detaljerte beskrivelse og kravene.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Oppfinnelsen fremskaffer nye variante neublastinpolypeptider som angitt i krav 1 og som kan bli modifisert til å øke deres farmakokinetiske og biotilgjengelighetsegenskaper. Slike foretrukne variante neublastinpolypeptider har endrede aminosyresekvenser som letter kobling til et polymermateriale så som en polyalkylenglykolpolymer.
Variante neublastinpolypeptider
Oppfinnelsen fremskaffer neublastinpolypeptider som har varierende aminosyresekvenser med hensyn til en villtype neublastinpolypeptidsekvens. Aminosyresekvenser av humane og muse neublastinpolypeptider er beskrevet i WO 00/01815. Eksempler på variante neublastinpolypeptider i henhold til oppfinnelsen er angitt i tabell 1.
Fortrinnsvis blir de endrede residuer i det variante neublastinpolypeptid valgt for å lette kobling av en polymer så som en polyalkylenglykolpolymer ved beliggenheten av den modifiserte aminosyre. Foretrukne områder for modifisering av et neublastinpolypeptid er dem ved oppløsningsmiddel tilgjengelige områder i neublastinpolypeptidet. Slike områder kan bli valgt basert på undersøkelse av krysta I Istruktu ren av den relaterte neurotrofiske faktor, GDNF, hvis krystallstruktur er beskrevet i Nat. Struct. Biol. 4:435-38, 1997. Områder kan også bli valgt basert på den strukturelt funksjonelle informasjon som er fremskaffet for persefin/neublastin kimeriske proteiner. Disse kimeraforbindelser er beskrevet i J. Biol. Chem. 275:3412-20, 2000. En eksempelvis opplisting av oppløsningsmiddel tilgjenglige eller overflate eksponerte neublastinaminosyrer identifisert via denne metode er angitt i tabell 2.
Oppfinnelsen innbefatter et variant neublastinpolypeptid som inkluderer en aminosyresekvens som minst er 90 % identisk med aminosyrer 8-113 av SEQ ID NO:l, som er vist i tabell 1. I enkelte utførelsesformer er asparaginet ved posisjon 95, i aminosyresekvensen av polypeptidet, erstattet med en aminosyre som er forskjellig fra arginin eller asparagin. Foretrukket er villtype aminosyren erstattet med lysin eller cystein.
Konsensussekvens:
hvori
Xaaier Gly eller Thr
Xaa2er Pro eller Arg
Xaa3er Gly eller Ser
Xaa4er Ala eller Thr
Xaa5er Ala eller Thr
Xaa6er Gly eller Asp
Xaa7er Arg eller Ser
Xaa8er Arg eller Ser
Xaa9er Val eller Ile
Xaaioer Pro eller Gin
Xaauer Pro eller Ser
Xaai2er Val eller Ile
Xaai3 er Arg eller His
Tabell 2 gir en liste av residuer og tall i humant neublastin som er forventet å være overflateeksponert. Overflateeksponerte residuer ble bestemt ved å undersøke strukturen av rotte GDNF-dimeren dannet av kjeder A og B (PDB-kode 1AGQ) og bestemme hvorvidt et residuum var på overflaten av strukturen. Denne struktur ble så sammenlignet med en sekvenstilpasning av GDNF og neublastin i Baloh et al., Neuron, vol 21, s. 1291, 1998 for å bestemme de riktige residuer i neublastin. Nummeringsskjemaet er det som er vist i tabell 1. n/a angir at residuene ikke er til stede i strukturen av GDNF. Dette er enten på grunn av konstruksjonsutforming, fleksible områder, eller innskudd i neublastin i forhold til GDNF (residuer 68-71). - indikerer at residuer er skjult og ikke på overflaten eller er cysteinresiduer involvert i disulfidbindinger. Ettersom dette protein er en cysteinknute, er en stor del av residuene på overflaten.
+ indikerer at dette residuum er overflateeksponert i GDNF-strukturen, og følgelig er antatt å være overflateeksponert i neublastin, selv om løkken inneholdende residuer 66-75 kun er synlig i en av GDNF-monomerene (antagelig fleksibel). Denne løkke inneholder også et 4-residuum stort innskudd i neublastin i forhold til
GDNF.
Som benyttet heri, blir "identitet" og "homolog" eller "homologi" benyttet om hverandre og refererer til sekvenslikheten mellom polypeptider, molekyler eller mellom to nukleinsyrer. Når en posisjon i begge av de to sammenlignede sekvenser er opptatt av samme base eller aminosyremonomer subenhet (for eksempel dersom en posisjon i hver av de to DNA-molekyler er opptatt av adenin, eller en posisjon i hver av de to polypeptider er opptatt av et lysin), så er de respektive molekyler homologe ved denne posisjon. Den prosentvise homologi mellom to sekvenser er en funksjon av antallet sammenfallende eller homologe posisjoner delt av de to sekvenser delt på antallet posisjoner som er sammenlignet x 100. For eksempel dersom 6 av 10 av posisjonene i to sekvenser er like eller homologe, så er de to sekvenser 60 % homologe. Som eksempel deler DNA-sekvensene CTGACT og CAGGTT 50 % homologi (3 av de 6 totale posisjoner er like). Generelt blir en sammenligning foretatt når to sekvenser er samstilt for å gi maksimal homologi. Slikt samstilling kan bli fremskaffet ved å bruke for eksempel metoden til Needleman et al., J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970), implementert passende av dataprogrammer så som Align-programmet (DNAstar, Inc.). "Like" sekvenser er slike som når de samstilles, deler identiske og lignende aminosyreresiduer, hvor lignende residuer er konservative substitusjoner for, eller "tillatte punktmutasjoner" av tilsvarende aminosyreresiduer i en samstilt referansesekvens. I denne forbindelse er en "konservativ substitusjon" av et residuum i en referansesekvens en substitusjon ved et residuum som er fysisk eller funksjonelt likt det tilsvarende referanseresiduum, for eksempel som har en lignende størrelse, form, elektrisk ladning, kjemiske egenskaper, innbefattende egenskapen å danne kovalente eller hydrogenbindinger eller lignende. Således er en "konservativ substitusjonsvariant" sekvens en som er forskjellig fra en referansesekvens eller en villtype sekvens ved at en eller flere konservative substitusjoner eller tillatte punktmutasjoner er til stede.
I foretrukne utførelsesformer er et polypeptid i henhold til oppfinnelsen 90 %, 95 %, 98 % eller 99 % identisk med aminosyrer 8-113 av SEQ ID NO:l. I enkelte utførelsesformer innbefatter aminosyresekvensen av det variante neublastinpolypeptid aminosyresekvensen av et naturlig forekommende rotte, humant eller muse neublastinpolypeptid ved aminosyre 1-94 og 96-113 av det variante neublastinpolypeptid, for eksempel har polypeptidet aminosyresekvensen til SEQ ID NOs: 2, 3, eller 4 ved disse posisjoner.
Et variant neublastinpolypeptid som er forskjellig i sekvens fra dem beskrevet i SEQ ID NOs: 1-4 kan innbefatte en eller flere konservative aminosyresubstitusjoner. Alternativt, eller i tillegg kan det variante neublastinpolypeptid være forskjellig med en eller flere ikke-konservative aminosyresubstitusjoner eller ved delesjoner eller innskudd. Fortrinnsvis fjerner substitusjonene innskuddene eller delesjonene ikke det isolerte protein biologiske aktivitet.
Konservative substitusjoner innbefatter typisk substitusjonen av en aminosyre med en annen med lignende særtrekk så som substitusjoner innenfor de følgende grupper: valin, alanin og glysin; leucin, valin, og isoleucin; asparaginsyre og glutaminsyre; asparagin og glutamin; serin, cystein, og treonin; lysin og arginin; og fenylalanin og tyrosin. De ikke-polare hydrofobe aminosyrer innbefatter alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan og metionin. De polare nøytrale aminosyrer innbefatter glysin, serin, treonin, cystein, tyrosin, asparagin og glutamin. De positivt ladede (basiske) aminosyrer innbefatter arginin, lysin og histidin. De negativt ladede (sure) aminosyrer innbefatter asparaginsyre og glutaminsyre. Enhver substitusjon av et medlem av de ovennevnte polare basiske eller sure grupper med et annet medlem fra samme gruppe kan bli ansett for å være en konservativ substitusjon.
Andre substitusjoner kan lett bli identifisert av den vanlige fagperson. For eksempel for aminosyren alanin, kan en substitusjon bli tatt fra hver av D-alanin, glysin, beta-alanin, L-cystein og D-cystein. For lysin kan en erstatning være enhver av D-lysin, arginin, D-arginin, homo-arginin, metoionin, D-metoionin, ornitin, eller D- ornitin. Generelt er substitusjoner i funksjonelt viktige områder som kan bli ventet å indusere endringer i egenskapene av isolerte polypeptider slike hvor: (1) et polart residuum, for eksempel serin eller treonin, blir erstattet med (eller ved) et hydrofobt residuum, for eksempel leucin, isoleucin, fenylalanin, eller alanin; (ii) et cysteinresiduum blir skiftet ut for (eller med) ethvert annet residuum; (iii) et residuum som har en elektropositiv sidekjede, for eksempel lysin, arginin eller histidin, blir erstattet for (eller med) et residuum som har en elektornegativ sidekjede, for eksempel glutaminsyre eller asparaginsyre; eller (iv) et residuum som har en plasskrevende sidekjede, for eksempel fenylalanin substitueres for (eller med) en som ikke har en slik sidekjede, for eksempel glysin. Sannsynligheten for at en av de foregående ikke-konservative substitusjoner kan endre funksjonelle egenskaper hos proteinet er også korrelert med posisjonen av substitusjonen med hensyn til funksjonelt viktige områder av proteinet: enkelte ikke-konservative substitusjoner kan følgelig ha liten eller ingen effekt på biologiske egenskaper.
Også fremskaffet ved oppfinnelsen er dimere polypeptider som innbefatter et variant neublastinpolypeptid. De dimere polypeptider er fortrinnsvis fremskaffet som rensede dimere polypeptider. Det dimere kompleks kan bli fremskaffet som et heteromert eller homomert kompleks. Således kan det dimere kompleks være et heterodimert kompleks innbefattende et variant neublastinpolypeptid og ett ikke-variant neublastin eller et heterodimert kompleks innbefattende to variante neublastinpolypeptider.
I enkelte utførelsesformer binder det variante neublastinpolypeptid GFRa3. Foretrukket stimulerer binding av det variante neublastinpolypeptid fosforylering av et RET-polypeptid. For å bestemme hvorvidt et polypeptid binder GFRa3 kan assays bli utført som beskrevet i WO00/01815. For eksempel kan tilstedeværelsen av neublastin i media hos CHO-cellelinje supernatanter bli beskrevet ved bruke en modifisert form av et ternært kompleksassay beskrevet av Sanicola et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1997, 94:6238). I dette assay kan stabiliteten av GDNF-lignende molekyler bli vurdert for sin egenskap å forene binding mellom det ekstracellulære domene av RET og de forskjellige ko-reseptorer, GFRal, GFRa2, og GFRa3. Oppløselige former av RET og ko-reseptorene blir dannet som fusjonsproteiner. Et fusjonsprotein mellom det ekstracellulære domene av rotte RET og placental alkalisk fosfatase (RET-AP) og et fusjonsprotein mellom det ekstracellulære domene av rotte GFRal (beskrevet i publisert søknad W09744356; 27.november 1997) og Fc-domenet av human IgGl (rGFR(al-Ig) har blitt beskrevet (Sanicola et al., Pore. Nati. Acad. Sei. USA 1997, 94:6238).
I enkelte utførelsesformer øker det variante neublastinpolypeptid overlevelse hos et neuron, eller normaliserer patologiske endringer hos et neuron eller begge deler. Assays for å bestemme hvorvidt et polypeptid øker overlevelse av et neuron, eller normalisere patologiske endringer hos et neuron er beskrevet i for eksempel WO00/01815. Foretrukket er neuronet et sensorisk neuron, et autonomt neuron eller et dopaminergisk neuron.
Syntese og isolering av variante neublastinpolypeptider
Variante neublastinpolypeptider kan bli isolert ved å bruke metoder som er kjent innen faget. Naturlige forekommende neublastinpolypeptider kan bli isolert fra celler eller vevskilder med et passende opprensningsskjema ved å bruke standard proteinopprensningsteknikker. Alternativt kan variante neublastinpolypeptider bli syntetisert kjemisk ved å bruke standard peptid synteseteknikker. Syntesen av korte aminosyresekvenser er vel etablert innen peptidfaget. Se for eksempel Stewart. et al., Solid Phase Peptide Syntesis (annen utgave, 1984).
I en annen utførelsesform blir variante neublastinpolypeptider fremstilt ved rekombinante DNA-teknikker. Foreksempel kan et nukleinsyremolekyl som koder for et variant neublastinpolypeptid bli satt inn i en vektor, for eksempel en ekspresjonsvektor og nukleinsyren kan bli introdusert i en celle. Passende celler innbefatter for eksempel pattedyrceller (så som humane celler eller kinesisk hamster ovariceller), soppceller, gjærceller, insektceller og bakterieceller. Når uttrykt i en rekombinant celle blir cellen fortrinnsvis dyrket under betingelser som tillater ekspresjon av et variant neublastinpolypeptid. Det variante neublastinpolypeptid kan bli gjenvunnet fra en cellesuspensjon om ønsket. Med "gjenvunnet" menes at det variante polypeptid fjernes fra de komponenter av en celle eller dyrkningsmedium hvori det er til stede før gjenvinningsprosessen. Gjenvinningsprosessen kan innbefatte ett eller flere gjenfoldende eller opprenskende trinn.
Variante neublastinpolypeptider kan bli konstruert ved å bruke enhver av flere metoder som er kjent innen faget. En slik metode er seterettet mutagenese, hvor et spesifikt nukleotid (eller, om ønsket, et lite antall spesifikke nukleotider) endres for å forandre en enkel aminosyre (eller, om ønsket, et lite antall på forhånd bestemte aminosyreresiduer) i det kodede neublastinpolypeptid. Fagpersonen vil forstå at seterettet mutagenese er en rutinemessig og mye brukt teknikk. Faktisk er mange seterettede mutagenesekitt kommersielt tilgjengelige. Et slikt sett er "Transformer Site Directed Mutagenesis Kit" solgt av Clontech Laboratories (Palo Alto, Calif.).
Utførelse av foreliggende oppfinnelse vil benytte, med mindre annet er angitt, konvensjonelle teknikker innen cellebiologi, celledyrkning, molekylærbiologi, mikrobiologi, rekombinant DNA, proteinkjemi, og immunologi, som ligger innenfor kompetanse i fagområdet. Slike teknikker er beskrevet i litteraturen. Se, for eksempel Molecular Cloning: A Laboratory Manual, annen utgave. (Sambrook, Fritsch og Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, volumer I og II (D.N. Glover, ed.), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M. J. Gait, ed.), 1984; U.S. Patent No. 4,683,195 (Mullis et al.,); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Haines og S.J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (B.D. Hames og S.J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, ed). Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (13. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, volumer 154 og 155 (Wu et al., eds.), Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller og M.P. Calos, eds.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochernical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer og Walker, eds.), Academic Press, London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, volumer I-IV (D.M. Weir og CC. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.
Variante neublastinfusjonsproteiner
Om ønsket kan det variante neublastinpolypeptid bli fremskaffet som et fusjonsprotein. Fusjonspolypeptidderivatet av proteiner ifølge oppfinnelsen innbefatter også forskjellige strukturelle former av primærproteinet som opprettholder biologisk aktivitet. Som benyttet heri refererer "fusjon" til en ko-lineær, kovalentbinding av to eller flere proteiner eller fragmenter derav via sine individuelle peptidstammer, mest foretrukket via genetisk ekspresjon av et polynukleotidmolekyl som koder for disse proteiner i samme leseramme (det vil si "i leseramme"). Det er foretrukket at proteinene eller fragmentene derav er fra forskjellige kilder. Således innbefatter foretrukne fusjonsproteiner et variant neublastinprotein eller fragment kovalent bundet til en andre enhet som ikke er et variant neublastin. Fortrinnsvis er den andre enhet avledet fra et polypeptid som eksisterer som en monomer, og er tilstrekkelig til å gi økede oppløselighets-og/eller biotilgjengelighetsegenskaper hos neublastinpolypeptidet.
For eksempel er en "variant neublastin/human serumalbuminfusjon" et protein som omfatter et variant neublastinpolypeptid ifølge oppfinnelsen, eller fragment derav, hvis N-terminal eller C-terminal er bundet i leseramme til et humant serumalbuminpolypeptid (Se Syed et al, Blood, 1997, 89:3243 og Yeh et al., P.N.A.S. USA 1992, 89:1904) samt US patent nr. 5,876,969 og 5,302,697. Uttrykket "fusjonsprotein" innbefatter ytterligere et variant neublastin kjemisk bundet via et mono- eller hetero-funksjonelt molekyl til en andre enhet som ikke er et variant neublastinprotein og er laget de novo fra renset protein som beskrevet nedenfor.
Neublastin-serumalbuminfusjoner kan bli konstruert ved å bruke metoder som er kjent innen faget. Enhver av et antall kryssbinderer kan inneholde en tilsvarende aminoreaktivgruppe og tioreaktivgruppe kan bli brukt til å binde neublastin til serumalbumin. Eksempler på egnede linkerer innbefatter aminreaktive krysslinkerer som setter inn et tiolreaktivt maleimid. Disse innbefatter for eksempel SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS, eller GMBS. Andre passende linkerer setter inn en tiolreaktivt haloacetatgruppe. Disse innbefatter for eksempel SBAP, SIA, SIAB og dette gir et beskyttet eller ikke-beskyttet tiol for reaksjon med sulfhydrylgrupper for å danne en reduserbar binding er SPDP, SMPT, SATA, eller SATP hvor av alle er kommersielt tilgjengelige (for eksempel Pierce Chemicals). Fagpersonen kan på lignende måte tenke seg alternative metoder som vil binde N-terminalen av neublastin til serumalbumin.
Det er også påtenkt at fagpersonen kan danne konjugater til serumalbumin som ikke er målrettet mot N-terminalen av NBN eller ved tiolenheten på serumalbumin. Om ønsket kan NBN-serumalbuminfusjoner bli dannet ved å bruke genetiske mani-puleringsteknikker, hvor NBN blir kondensert til serumalbumingenet ved dets N-terminal, C-terminal eller ved begge ender.
Det er ytterligere påtenkt at ethvert NBN-konjugat som resulterer i et produkt med en forlenget halveringstid i dyr (innbefattende mennesker) kan bli dannet ved å bruke en lignende strategi.
Andre derivater av variante neublastiner innbefatter kovalente eller aggregate konjugater av variant neublastin eller dets fragmenter med andre proteiner eller polypeptider, så som ved syntese i rekombinant kultur som ytterligere N-terminaler, eller C-terminaler. For eksempel kan det konjugerte peptid være en signal(eller leder) polypeptidsekvens ved det N-terminale område av proteinet som ko-translatorisk eller post-translatorisk dirigerer overføring av proteinet fra dets syntesested til dets funksjonssted innen i eller utenfor cellemembranen eller veggen (foreksempel gjæralfafaktorlederen). Neublastinreseptorproteiner kan omfatte peptider tilsatt for å lette opprenskning eller identifikasjon av neublastin (for eksempel histidin/neublastinfusjoner). Aminosyresekvensen av neublastin kan også bli bunnet til peptidet Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (Hopp et al., Biotechnology 6:1204, 1988). Sistnevnte sekvens er svært antigent og gir en epitop som blir reversibelt bundet av et spesifikt monoklonat antistoff, noe som tillater raskt assay og lett opprenskning av uttrykte rekombinante proteiner.
Denne sekvens blir også spesifikt spaltet av bovin mukosal enterokinase ved residuet som fører umiddelbart etter Asp-Lys-paringen.
Variante neublastinpolypeptider konjugert til en polymer
Om ønsket kan et enkelt polymermolekyl bli benyttet for konjugering med et neublastinpolypeptid, selv om det også er påtenkt at flere enn et polymermolekyl også kan bli festet. Konjugerte neublastinsammensetninger ifølge oppfinnelsen kan finne anvendelse både i in vivo så vel som ikke-/n vivo applikasjoner. I tillegg vil det bli forstått at den konjugerende polymer kan benytte enhver annen gruppe, enhet eller annet konjugert materiale, ettersom passende ut fra sluttanvendelsen. Som eksempel kan det være nyttig i enkelte applikasjoner å kovalent binde til polymeren en funksjonell enhet som gir UV-nedbrytningsmotstand, eller antioksidering eller andre egenskaper eller karakteristika til polymeren. Som et ytterligere eksempel kan det være fordelaktig i enkelte applikasjoner å funksjonalisere polymeren for å gjøre den reaktiv eller kryssbindende i karakter, for å øke forskjellige egenskaper eller karakteristika hos det totale konjugerte materiale. Følgelig kan polymeren inneholde enhver funksjonalitet gjentagende grupper, bindinger eller andre konstituente strukturer som ikke utelukker effektiviteten av den konjugerte neublastinmuteinsammensetning for dens påtenkte formål. Illustratoriske polymerer som nyttig kan bli anvendt for å oppnå disse ønskede særtrekk er beskrevet heri nedenfor i eksempelvise reaksjonsskjemaer. I kovalent bundede peptidapplikasjoner, kan polymeren bli funksjonalisert og så koblet til fri aminosyre(er) til peptidet(ene) for å danne labile bindinger.
I enkelte utførelsesformer blir neublastinpolypeptidet bundet til polymeren via en terminal reaktiv gruppe på polypeptidet. Alternativt, eller i tillegg kan neublastinpolypeptidet bli bundet via sidekjedeaminogruppen hos et innvendig lysinresiduum, for eksempel et lysinresiduum innført i aminosyresekvensen hos et naturlig forekommende neublastinpolypeptid. Således kan konjugeringer også være forgrenet fra de ikke-terminale reaktive grupper. Polymeren med den/de reaktive gruppe(r) blir betegnet heri som "aktivert polymer". Den reaktive gruppe reagerer selektivt med fri amino eller andre reaktive grupper på proteinet.
Binding kan forekomme i den aktiverte polymer ved enhver tilgjengelig neublastinaminogruppe så som alfaaminogruppene eller epsiolonaminogruppene av et lysinresiduum eller residuer introdusert i aminosyresekvensen av et neublastinpolypeptid eller variant derav. Fri karboksylgrupper, passende aktiverte karbonylgrupper, hydroksyl, guanidyl, imidazol, oksiderte karbohydratenheter og merkaptogrupper av neublastinet (om tilgjengelige) kan også bli brukt som feste-punkter.
Generelt blir fra omkring 1,0 til omkring 10 mol aktivert polymer per mol protein, avhengig av proteinkonsentrasjon benyttet. Sluttmengden er en balanse mellom å maksimalisere reaksjonsgraden samtidig med å minimalisere ikke-spesifikke modifikasjoner av produktet og, på samme tid, definere sammensetninger som vil opprettholde optimal aktivitet, mens på samme tid, om mulig å optimalisere halveringstiden til proteinet. Fortrinnsvis blir minst omkring 50 % av den biologiske aktivitet av proteinet opprettholdt, og mest foretrukket blir nær 100 % opprettholdt.
Reaksjonene kan finne sted ved enhver passende metode som benyttes for å omsette biologisk aktive materialer med inerte polymerer, fortrinnsvis ved omkring pH 5-8, for eksempel pH 5, 6, 7 eller 8, om de reaktive grupper er på alfaaminogruppen ved N-terminalen. Generelt involverer prosessen å fremstille en aktivert polymer og deretter omsetter proteinet med den aktiverte polymer for å danne det oppløselige protein som er egnet for formulering. Den ovennevnte modifikasjonsreaksjon kan bli utført på flere måter, som kan involvere ett eller flere trinn.
Polymeren kan bli koblet til det variante neublastinpolypeptid ved å bruke fremgangsmåter som er kjent innen faget. For eksempel blir i en utførelsesform polyalkylenglykolenheten koblet til en lysingruppe av neublastinpolypeptidet eller det variante neublastinpolypeptid. Binding til lysingruppen kan bli utført med en N-hydroksylsuksinimid (NHS) aktiv ester så som PEG-suksinimidylsuksinat (SS-PEG) og suksinimidylpropionat (SPA-PEG). Egnede polyalkylenglykolenheter innbefatter for eksempel karboksylmetyl-NHS-norleucin-NHS, SC-PEG, tresylat, aldehyd, epoksid, karbonylimidazol, og PNP-karbonat.
Ytterligere aminreaktive PEG-bindinger kan bli byttet ut med suksinimidylenheten. Disse innbefatter for eksempel isotiocyanater, nitrofeny I karbonater, epoksider, og benzotriazolkarbonater. Forhold blir fortrinnsvis valgt for å maksimalisere selektiviteten og reaksjonsgraden. Lineære og forgrenede former av PEG kan bli brukt så vel som andre alkylformer. Lengden av PEG-materialet kan bli variert. De vanligste former varierer i størrelse fra 2K-100K. Selv om de foreliggende eksempler angir at målrettet pegylering ved N-terminalen ikke påvirker farmakokinetiske egenskaper, indikerer det faktum at materialet opprettholdt fysiologisk funksjon at modifiseringen ved området eller områdene beskrevet heri ikke er skadelig. Følgelig ved fremstilling av mutante former av NBN som kunne gi ytterligere festesteder via innsetning av lysinresiduer, ville det sannsynlige utløp om at disse former ville være pegylert både ved lysinet og ved N-terminalen være betraktet som akseptabelt.
Om ønsket kan neublastin variante polypeptider inneholde en markør, for eksempel en markør som siden kan bli frigjort ved proteolyse. Således kan lysinenheten bli selektivt modifisert ved først å omsette en his-markør variant med en lav molekylvektlinker så som Trauts reagens (Pierce) som vil reagere med både lysinet og N-terminalen, og så frigjøre his-markøren. Polypeptidet vil så inneholde en fri SH-gruppe som selektivt kan bli modifisert med et PEGinneholdende en tiol reaktivhodegruppe så som en maleimidgruppe, en vinylsulfongruppe, en haloacetatgruppe, eller en fri eller beskyttet SH.
Trauts reagens kan bli erstattet med enhver linker som vil danne et spesifikt område for festing av PEG. Som eksempel kunne Trauts reagens ble erstattet med
SPDP, SMPT, SATA eller SATP (alle tilgjengelige fra Pierce). Pa lignende måte kunne man reagere proteinet med en aminreaktiv linker som setter inn et maleimid (for eksempel SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS eller GMBS), en haloacetatgruppe (SBAP, SIA, SIAB), eller en vinylsulfongruppe og reagere det resulterende produkt med et PEG som inneholder en fri SH. Den eneste begrensning på størrelsen av linkeren som blir benyttet, er at den ikke kan blokkere den etterfølgende fjerning av den N-terminale markør.
Således i andre utførelsesformer er polyalkylenglykolenheten koblet til en cysteingruppe av neublastinpolypeptidet eller det variante neublastinpolypeptid. Kobling kan bli utført ved å bruke for eksempel en maleimidgruppe, en vinylsulfongruppe, en haloacetatgruppe, og en tiolgruppe.
Ett eller flere områder på et variant neublastinpolypeptid kan bli koblet til en polymer. For eksempel kan en, to, tre, fire eller fem PEG-enheter bli bundet til polymeren. I enkelte utførelsesformer er en PEG-enhet bundet ved amino-terminalen og/eller aminosyrer 14, 39, 68 og 95 av et neublastinpolypeptid som nummerert som vist i tabell 1.
I foretrukne utførelsesformer har det variante neublastinpolypeptid i sammensetningen en lengre serumhalveringstid i forhold til halveringstiden av det variante polypeptid ved fravær av polymeren. Alternativt, eller i tillegg binder det variante neublastinpolypeptid i sammensetningen GFRa3, aktiverer RET, normaliserer patologiske endringer hos et neuron, eller øker overlevelse av et neuron, eller utfører en kombinasjon av disse fysiologiske funksjoner.
I foretrukne utførelsesformer er sammensetningen fremskaffet som et stabilt, tilstrekkelig oppløselig konjugert neublastinpolypeptid eller variant neublastinpolypeptidkompleks, omfattende et neublastinpolypeptid eller variant neublastinpolypeptid koblet til en polyetylenglykolenhet. Om ønsket kan neublastinpolypeptidet eller det variante neublastinpolypeptid være koblet til polyetylenglykolenheten med en labilbinding. Den labile binding kan bli spaltet i, for eksempel biokjemisk hydrolyse, proteolyse, eller sulfhydrylspalting. For eksempel kan bindingen bli spaltet under in vivo (fysiologiske) betingelser.
Farmasøytiske sammensetninger inneholdende variante neublastin-polymerkonjugater
Også fremskaffet er en farmasøytisk sammensetning innbefattende et variant neublastin-polymerkonjugat ifølge foreliggende oppfinnelse som angitt i krav 16. En "farmasøytisk sammensetning" som benyttet heri er definert som omfattende et neublastinprotein eller konjugat ifølge oppfinnelsen, dispergert i en fysiologisk akseptabel vehikkel, eventuelt inneholdende en eller flere andre fysiologisk kompatible ingredienser. Den farmasøytiske sammensetning kan således inneholde en eksipient så som vann, ett eller flere mineraler, sukkere, detergenter, og ett eller flere bæremateriale så som et inert protein (for eksempel heparin eller albumin).
Polymer-neublastinkonjugatene ifølge oppfinnelsen kan bli administrert som sådan så vel som i form av farmasøytisk akseptable estere, salter og andre fysiologisk funksjonellle derivater derav. I slike farmasøytiske og medikamentelle formuleringer blir det variante neublastinkonjugat fortrinnsvis benyttet sammen med ett eller flere farmasøytisk akseptable bæremateriale(r) og eventuelt enhver annen terapeutisk ingrediens.
Bærematerialet(ene) må være farmasøytisk akseptable i det henseende at de er kompatible med de andre bestanddeler av formuleringen og ikke unødvendig skadelig for mottakeren derav. Det variante neublastin er tilsatt i en mengde som er effektiv for å oppnå en ønsket farmakologisk effekt eller medisinsk gunstig effekt, som beskrevet heri, og i en mengde som er passende for å oppnå den ønskede biotilgjengelige in wVo-dose eller konsentrasjon.
Formuleringen innbefatter slike som er egnet for parenteral som ikke-parenteral administrasjon, og spesifikke administrasjonsmåter innbefatter oral, rektal, bukkal, topisk, nasal, oftalmisk, subkutan, intramuskulær, intravenøs, transdermal, intratekal, intra-artikulær, intra-arteriell, sub-araknoid, bronkial, lymfatisk, vaginal, og intra-uterin administrasjon. Formuleringer som er egnet for aerosole og parenteral administrasjon, både lokalt og systemisk, er foretrukket.
Når det variante neublastin blir benyttet i en formulering omfattende en flytende oppløsning, kan formuleringen fordelaktig bli administrert oralt, bronkialt eller parenteralt. Når neublastinet blir benyttet i en flytende suspensjonsformulering eller som et pulver i en biokompatibel bæreformulering, kan formuleringen fordelaktig administrert oralt, rektalt eller bronkialt. Alternativt kan den bli administrert nasalt eller bronkialt, via nebulisering av pulveret i en bæregass, for å danne en gassformig dispersjon av pulveret som blir inhalert av pasienten fra en inhaleringskrets omfattende en egnet nebulisatoranordning.
Formuleringene omfattende proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan passende bli presentert i enhetsdoseformer og kan bli fremstilt ved enhver av fremgangsmåtene som er vel kjent innen farmasifaget. Slike fremgangsmåter innbefatter generelt trinnet å bringe den/de aktive bestanddel(er) i assosiasjon med bæremateriale som utgjør en eller flere hjelpebestanddeler.
Typisk blir formuleringene fremstilt ved uniformt og grundig å bringe den/de aktive bestanddel(er) i assosiasjon med et flytende bæremateriale, et finfordelt fast bæremateriale, eller begge deler, og så, om nødvendig, forme produktet til doseringsformer av den ønskede formulering.
Formuleringer ifølge foreliggende oppfinnelse som er egnet for oral administrasjon kan bli presentert som diskret enheter så som kapsler, poser, tabletter, eller pastiller, hver inneholdende en forhåndsbestemt mengde av den aktive bestanddel som et pulver eller granuler; eller en suspensjon i en vandig væske eller en ikke-vandig væske, så som en sirup, en eliksir, en emulsjon eller en mikstur.
Formuleringer som er egnet for parenteral administrasjon omfatter passende et sterilt vandig preparat av det aktive konjugat, som fortrinnsvis er isotont med blodet hos mottakeren (for eksempel fysiologisk saltvannoppløsning). Slike formuleringer kan innbefatte suspenderende midler og fortykningsmidler eller andre mikropartikulære systemer som er utformet for å målrette forbindelsen til blodkom-ponenter eller ett eller flere organer. Formuleringene kan bli presentert i enhetsdose eller multidoseform.
Nesesprayformuleringer omfatter rensede vandige oppløsninger av det aktive konjugat med preserveringsmidler og isotone midler. Slike formuleringer blir fortrinnsvis justert til en pH og isotonisk tilstand som er kompatibel med slimhinnemembranene i nesen.
Formuleringer for rektal administrasjon kan bli presentert som et suppositorium med et egnet bæremateriale så som kokossmør, hydrogenerte fettyper, eller hydrogenerte fettkarboksylsyre. Oftalmiske formuleringer så som øyedråper blir fremstilt på en lignende måte som nesesprayen, bortsett fra at pH og de isotone faktorer fortrinnsvis blir justert for å tilsvare dem hos øyet.
Topiske formuleringer omfatter konjugatene ifølge oppfinnelsen oppløst eller suspendert i ett eller flere medier, så som mineralolje, petroleum, polyhydroksyalkoholer, eller andre baser benyttet for topiske farmasøytiske formuleringer.
I tillegg til de tidligere nevnte bestanddeler kan formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse ytterligere innbefatte ett eller flere hjelpeingrediens(er) som er valgt fra fortynningsmidler, buffere, smaksmidler, disintegranter, overflateaktive midler, fortykningsmidler, smøremidler, preservativer (innbefattende antioksidanter), og lignende. De foregående betraktningene gjelder også neublastinfusjonsproteinene ifølge oppfinnelsen (for eksempel neublastin-HSA-fusjoner).
Behandlingsmetoder
De variante neublastinpolypeptider, så vel som fusjonsproteiner, eller konjugater derav, kan bli benyttet for å behandle eller lette en lidelse eller sykdom hos et levende dyr, fortrinnsvis et pattedyr, mer foretrukket en primat innbefattende et menneske, hvilken lidelse eller sykdom er responsiv overfor aktiviteten av neurotrofiske midler.
Sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan bli brukt direkte via, for eksempel injiserte, implanterte eller inntatte farmasøytiske sammensetninger for å behandle en patologisk prosess som reagerer overfor neublastinpolypeptidene. Sammensetningene kan bli benyttet for å lette en lidelse eller sykdom hos et levende dyr, innbefattende et menneske, hvilken lidelse eller sykdom er mottagelig overfor aktiviteten av neurotrofiske midler. Lidelsen eller sykdommen kan spesielt være skade på nervesystemet forårsaket av trauma, kirurgi, iskjemi, infeksjon, metaboliske sykdommer, ernæringssvikt, sykdom eller toksiske midler, og genetiske eller idiopatiske prosesser.
Skaden kan spesielt ha påvirket de sensoriske neuroner eller retinale ganglionceller, innbefattende neuroner i de dorsale rotganglia av ryggmargen eller i ethvert av de følgende vev: genikulatet, petrosal og nodoseganglia; det vestibuloakoustiske kompleks av den åttende kraniale nerve; den ventrolaterale stamme av den maksillomandribulære lobe av det trigeminale ganglion; og den mesensefaliske trigeminale kjerne.
I en foretrukket utførelsesform kan polypeptidet ifølge oppfinnelsen anvendes for fremstilling av medikamenter til behandling av en sykdom i nervesystemet sykdommen eller lidelsen kan være en neurodegenerativ lidelse som involverer lesjonerte eller traumatiske neuroner, så som traumatiske lesjoner på perifere nerver, medulla, og/eller ryggmargen, cerebral iskjemisk neuronal skade, neuropati og spesielt perifere neuropati, perifert nervetrauma eller skade, iskjemisk slag, akutt hjerneskade, akutt ryggmargsskade, tumorer i nervesystemer, multipell skelerose, eksponering for neurotoksiner, metaboliske sykdommer så som diabetisk eller nye dysfunksjoner og skade forårsaket av infeksjonsdyktige midler, neuro-degenerative lidelser innbefattende Alzheimers sykdom, Huntingtons sykdom, Parkinsons sykdom, Parkinson-Plus syndromer, progressiv Supranuklær Palsy (Steele-Richardson-Olszewski Syndrome), Olivopontocerebellær Atropy (OPCA), Shy-Drager syndrom (multiple systematrofi), Guamanian parkinsonisme demenskompleks, amyotrofisk lateral sklerose, eller enhver annen kongenital eller neurodegenerativ sykdom, samt hukommelsessvikt tilknyttet demens.
I en foretrukket utførelsesform kan sensoriske og/eller autonome system neuroner bli behandlet med det fremstilte medikamentet. Spesielt kan nokiseptive og mekanoreseptive neuroner bli behandlet, mer spesielt deltafiber og C-fiberneuroner. I tillegg kan sympatiske og parasympatiske neuroner av det autonome system bli behandlet.
I en annen foretrukket utførelsesform kan motoriske neuronsykdommer så som amyotrofisk lateralisk sklerose ("ALS") og spinal muskularatrofi bli behandlet med det fremstilte medikamentet. I enda en annen utførelsesform kan neublastinmolekylene ifølge foreliggende oppfinnelse bli brukt for å fremstille medikamenter egent for å øke nerveleging etter traumatisk skade. Alternativt, eller i tillegg kan en nervestyringskanal med en matriseinneholdende variante neublastinpolypeptider, eller fusjoner eller konjugater av variante neublastinpolypeptider bli brukt i de heri beskrevne sammensetninger og medikamenter. Slike nervestyringskanaler er for eksempel beskrevet i US patent nr. 5,834,029.
I en foretrukket utførelsesform blir sammensetningene beskrevet heri (samt farmasøytiske sammensetninger inneholdende slike) benyttet ved fremstilling av medikamenter til behandling av perifere neuropatier. Blant de perifere neuropatier som er gjenstand for behandling med molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse er trauma-induserte neuropatier, for eksempel slike forårsaket av fysisk skade eller sykdomstilstand, fysisk skade på hjernen, fysisk skade på ryggmargen, slag assosiert med hjerneskade, samt neurologiske lidelser relatert til neurodegenerering. Også innbefattet heri er slike neuropatier som er sekundær til infeksjon, toksineks-ponering, og medikamenteksponering. Enda ytterligere inkludert heri er slike neuropatier som er sekundære til systemisk eller metabolisk sykdom. De heri beskrevne sammensetninger kan også bli brukt til å behandle kjemoterapi-induserte neuropatier (så som slike forårsaket av avlevering av kjemoterapeutiske midler, for eksempel taksol eller cisplatin); toksin-induserte neuropatier, medikament induserte neuropatier, vitamindefisiens-induserte neuropatier; idiopatiske neuropatier; og diabetiske neuropatier. Se for eksempel amerikanske patenter 5,496,804 og 5,916,555.
Ytterligere tilstander som kan bli behandlet ved å bruke de heri beskrevne sammensetninger er mono-neuropatier, mono-multiplekse neuropatier, og poly-neuropatier, innbefatter aksonale og demyelinerende neuropatier, ved å bruke de heri beskrevne sammensetninger.
I en ytterligere foretrukket utførelsesform blir sammensetningen ifølge oppfinnelsen (og farmasøytiske sammensetninger inneholdende slike) benyttet ved fremstilling av medikamenter til behandling av forskjellige lidelser i øyet, innbefattende fotoreseptortap i retina hos pasienter som er utsatt for makulær degenerering, retinitisk pigmentosa, grå stær og lignende sykdommer.
Oppfinnelsen vil bli ytterligere illustrert i de følgende eksempler.
Eksempel 1 — Biotilgjengelighet av N-terminalt pegylert neublastin
CHO-celle-avledet rekombinant humant neublastin ble observert for raskt å bli fjernet fra sirkulasjonen om administrert intravenøst i rotter. Intet av proteiner ble påvist i serumet etter subkutan administrering. For å øke biotilgjengelighet av neublastin, ble pegylerte former konstruert.
Fordi ingen lysiner opptrer i NBN-sekvensen vil aminspesifikke pegyleringsgrupper resultere i pegylering av et NBN-polypeptid ved dets aminoterminal. Således bør for hver neublastindimer, to PEG-enheter bli bundet. Følgelig ble PEG-former først direkte målrettet til N-terminalen via aminspesifikke grupper. Overraskende hadde pegylering selv med to, 20 K PEG bundet liten gunstig virkning på halveringstiden, noe som indikerer at en mekanismebasert fjerningsvei overtok økningen i halveringstiden som var forventet å bli oppnådd ved pegylering.
Eksempel 2 — Konstruksjon av et pegylert neublastin N95K-mutein
Biotilgjengeligheten av mutante NBN-former pegylert ved interne aminosyreresiduer ble dernest undersøkt. En serie på fire mutanter som erstatter naturlig forekommende residuer ved posisjoner 14, 39, 68 og 95, ble utformet til å sette inn lysiner ved utvalgte seter i sekvensen. Disse lysiner ville gi alternative punkter for PEG-binding. Disse punkter ble valgt ut ved å bruke krystallstrukturen av GDNF (Nat. Struct. Biol. 4:435-8, 1997) som et rammeverk til å identifisere overflateresiduer og persefin/neublastin kimera mutagenese studium (J. Biol. Chem. 275:3412-20, 2000) for å identifisere funksjonelt viktige områder av strukturen som bør bli unngått.
To av mutasjonene (R39 og R68) ble målrettet ved et område som basert på fordelingen av positive ladninger på overflaten kunne representere et herpainbindende sete, en egenskap hos proteinet som sannsynligvis medvirker til dets raske fjerning. Et tredje område ble målrettet ved N95, som er det naturlige glykosyleringssete i villtype NBN. Dette sete er naturlig modifisert med en kompleks karbohydratstruktur. Følgelig var modifisering med PEG ved dette område ikke forventet for å påvirke funksjon. Det fjerde sete (R 14) ble valgt ut i et område som ikke var dekket ved noen andre av modifikasjonene. En mutant hvori asparaginresiduet ved posisjon 95 var erstattet med et lysin ("N95K-mutanten") ble valgt for studiene beskrevet heri.
Fire forskjellige rotteneublastinmuteiner inneholdende en eller flere endringer i villtype-sekvensen av rotteneublastinpolypetidet ble konstruert. Muteinene innbefatter det enkle N95K-mutein, og muteinene inneholdende enkle substitusjoner ved andre områder i aminosyresekvensen av rotteneublastin: R14K; R68K; og R39K. I "XiNiX2"-nomenklaturen refererer Xi til en aminosyre av et villtype neublastinpolypeptid, Ni refererer til den nummeriske posisjon av Xi aminosyren i sekvensen, som nummerert i henhold til SEQ ID NO:l. X2refererer til en aminosyre skiftet ut med villtype aminosyren ved den indikerte nummeriske posisjonen i sekvensen.
For å konstruere N95K rotteneublastinmuteringen ble seterettet mutagenese utført på pCMB020, et plasmid som koder for villtype rotteneublastin. Villtype rotteneublastin nuklein- og aminosyresekvensen av polypeptidet kodet av dette er presentert nedenfor:
Mutagenese av pCM020 ved å bruke oligonukleotider KD2-310 og KD3-211 resulterte i dannelsen av plasmidet pCMB027:
I pCMB027 har kodonet som koder for asparagin ved posisjon 95, blitt erstattet med et kodon som koder for lysin.
Et R14K neublastinmutein dannet ved erstatning av et kodon som koder for arginin ved posisjon 14 med et kodon som koder for lysin i den neublastin kodende sekvens av pCMB020. Seterettet mutagenese ble utført på pCMB020 ved å bruke oligonukleotider KD3-254 og KD3-255:
Den resulterende konstruksjon ble betegnet pCMB029.
Et R68K-neublastinmutein ble dannet ved erstatning av et kodon som koder for arginin ved posisjon 68 med et kodon som koder for lysin i den neublastinkodende sekvens av pCMB020. Seterettet mutagenese ble utført på pCMB020 ved å bruke oligonukleotider KD3-258 og KD3-259:
Den resulterende konstruksjon ble betegnet pCMB030.
Et R39K-neublastinmutein ble dannet ved erstatning av arginin ved aminosyre 39 med lysin i den neublastinkodende sekvens av pCMB020. Seterettet mutagenese av pCMB027 ble utført ved å bruke oligonukleotider KD3-256 og KD3-257:
For ekspresjon og opprenskning ble et plasmid som koder for rotte NBN N95K-muteinet uttrykt i E. coli som et His-merket fusjonsprotein med et enterokinase spaltningspunkt umiddelbart ved siden av starten av den ferdigutvikede 113 aminosyres NBN-sekvens dannet. E. co//'-organsimene ble dyrket i en 500 I fermentator og frosset cellepasta ble dannet. E. co//-cellene ble lysert i en Manton Gaulin Presser og rotte NBN-NK gjenvunnet fra den uløselige vaskede pellet-fraksjon.
NBN-materialet ble ekstrahert fra pelleten med guanidinhydroklorid, gjenfoldet, og his-merkingen fjernet med enterokinase. Produktet ble så utsatt for kromatografi på Ni NTA-agarose (Qiagen) og på Bakerbond WP CBX-kationbytteresin.
Enterokinasebehandling av det his-merkede produkt resulterte i en avvikende spaltning av proteinet ved arginin 7 i den ferdig utviklede sekvens. Det resulterende des 1-7 NBN-produkt var fullstendig aktivt i KIRA ELISA og kunne strukturelt ikke skjelnes fra den ferdigutviklede form i sin tilbøyelighet til guanidin-indusert denaturering, og ble følgelig brukt for etterfølgende arbeid.
Rotte NBN N95K ble pegylert ved et gjennomsnitt på 3,3 PEG-enheter per molekyl ved å bruke metoksylpoly(etylenglykol)-suksinimidylpropionat (SPA-PEG) med en molekylmasse på 10.000 Da som reaktant. Det resulterende pegylerte produkt ble utsatt for utstrakt karakterisering innbefattende analyse med SDS-PAGE, størrelseseksklusjonskromatografi (SEC), reversfase HPLC, matrise assistert laserdestruksjon/ioniserende massespektrometri (MALD/IMS), peptidkartlegging, undersøkelse av aktivitet i KIRA ELISA, og bestemmelse av endotoksininnhold. Renheten av NBN N95K-produktet før pegylering som målt ved SDS-PAGE og SEC var større enn 95 %. NBN N95K-produktet migrerte under ikke-reduserende betingelser som en dimer, noe som er konsistent med dets forutsatte struktur. Etter pegylering bestod det resulterende produkt av en serie av modifiserte addukter inneholdende 2 PEG per molekyl 5 % av produktet, 3 PEG per molekyl 60 % av produktet, 4 PEG per molekyl 30 % av produktet, og flere mindre former av høyere masse. I den pegylerte prøve var det ingen spor av aggregater. Gjenværende nivåer av umodfiserte NBN i produktet var under grensene for mengdebestemmelse. Endotoksininnholdet av materialet er vanligvis mindre enn 1 EU per mg. Den spesifikke aktivitet av det pegylerte NBN i KIRA ELISA er 10 nM. Det pegylerte produkt ble formulert ved 1,1 mg per ml i PBS pH 6,5. Materialet som har lik effekt med wt-NBN, kan bli fremskaffet som en frossen væske, som blir lagret ved -70 °C.
R14K, R39K og R68K muteinene ble uttrykt i E. coli og som kan bli utsatt for samme opprenskningsmetoder, pegylering og bekreftelse av funksjon som beskrevet ovenfor for N95K-NBN.
Fremstilling av pegylerte NBN
230 ml av det gjenfoldede rotte NBN N95K (2,6 mg/ml) som hadde blitt dannet i E. coli og lagret ved 4 °C i 5 mM natriumfosfat pH 6,5, 100 mM NaCI, ble fortynnet
med 77 ml vann, 14,4 ml IM HEPES pH 7,5, og 2,8 g (10 mg/ml sluttelig) PEG SPA 10.000 Da (Shearwater Polymers, Inc.). Prøven ble inkubert ved romtemperatur i 4 timer i mørke, derpå behandlet med 5 mM imidazol (sluttelig), filtrert og lagret over natten ved 4 °C. Produktet ble fremstilt i to porsjoner, en inneholdende 130 ml av NBN N95K-massen og den andre inneholdende 100 ml av massen. Det pegylerte NBN ble renset fra reaksjonsblandingen på Fractogel EMD S03" (M) (EM Industries). Kolonnen ble kjørt ved romtemperatur. Alle bufferer ble fremstilt pyrogenfrie. Natriumklorid ble tilsatt til reaksjonsblandingen til en sluttkonsentrasjon på 87 mM og prøven ble satt på en 45 ml Fractogel-kolonne (5 cm innvendig diameter).
Kolonnen ble vasket med et kolonnevolum av 5 mM natriumfosfat pH 6,5, 80 mM NaCI, derpå med tre ett kolonnevolums alikvoter av 5 mM natriumfosfat inneholdende 50 mM NaCI. Resinet ble overført til en 2,5 cm diameter kolonne og det pegylerte NBN ble eluert fra kolonnen med seks 10 ml trinn inneholdende 5 mM natriumfosfat pH 6,5, 400 mM NaCI, tre trinn inneholdende 500 ml NaCI, og seks trinn inneholdende 600 mM NaCI. Elueringsfraksjoner ble analysert for pro teininnhold ved absorbans ved 280 nm og så for modiflseringsgrad med SDS-PAGE. Utvalgte fraksjoner ble slått sammen, filtrert gjennom et 0,2 pm filter, og fortynnet med vann til 1,1 mg pegylert rotte NBN per ml. Etter undersøkelse av endotoksinnivåer i de individuelle porsjoner, ble de slått sammen og refiltrert gjennom en 0,2 pm membran. Sluttmaterialet ble delt opp i porsjoner og lagret ved -70 °C.
UV-spektrum av renset pegylert NBN NK
UV-spektrumet (240-340 nm) av pegylert NBN NK ble tatt på nettoprøven. Prøven ble analysert i triplikat. Den pegylerte prøve oppviste et absorbansmaksimum ved 275-277 nm og et absorbansminimum ved 247-249. Dette resultat er konsistent med hva som blir observert på de umodifiserte NBN-bulkintermediat. Proteinkonsentrasjonen av det pegylerte produkt ble beregnet fra spektrumet ved å bruke en ekstinksjonskoeffisient på<z>28o<0,1%>= 0,50. Proteinkonsentrasjonen av det pegylerte NBN bulkmateriale er 1,1 mg/ml. Ingen turbiditet var til stede i prøven som vist ved mangel på absorbans ved 320 nm.
Karakterisering av pegylert NBN NK med SDS-PAGE
Porsjoner av pegylert NBN inneholdende 3, 1,5, 0,75, og 0,3 pg av produktet ble utsatt for SDS-PAGE på en 4-20 % gradientgel (Owl). Gelen ble farget med Coomassie brilliant blue R-250. Molekylvektsmarkører (GIBCO-BRL) ble kjørt i parallell.
SDS-PAGE-analyse av pegylert NBN NK under ikke-reduserende betingelser viste en serie bånd som tilsvarte modifikasjoner med 2, 3, 4 og flere enn 4 PEG per molekyl. Hovedbåndet med observert masse på 98 kDa inneholder 3 PEG per molekyl. I det rensede pegylerte produkt ble umodifisert NBN ikke påvist. Tilstedeværelsen av en blanding av produkter med 2, 3 og 4 PEG bundet ble verifisert med MALDI-massespektrometrisk analyse. Mengden av produkt inneholdende 2, 3 og 4 PEG ble bestemt med densitometri og bestemt til å være henholdsvis 7, 62 og 30 prosent av totalen.
Karakterisering av pegylert NBN med størrelseseksklusjonskromatografi
Pegylert NBN ble utsatt for størrelseseksklusjonskromatografi på en analytisk Superose 6 HR10/30 FPLC-kolonne ved å bruke 5 mM MES pH 6,5, 300 mM NaCI som den mobile fase. Kolonnen ble kjørt ved 20 ml per time. Elueringsfraksjoner ble overvåket for absorbans ved 280 nm. Det pegylerte NBN eluerte som en enkelt topp med en observert molekylvekt på omkring 200 kDa noe som er konsistent med det store hydrodynamiske volum av PEG-materialet. Ingen tegn på aggregater ble observert. Fritt NBN som eluerer med en observert molekylmasse på omkring 30 kDa, ble ikke funnet i preparatet.
Analyse av pegylert NBN med reversfase HPLC
Pegylert NBN NK ble utsatt for reversfase HPLC på en Vydac C4(5 pm, 1 x 250 mm) kolonne. Kolonnen ble utviklet ved å bruke en 60 mm gradient fra 40 til 60 % B (Buffer A: 0,1 % TFA, buffer B: 75 % acetonitril/0,085 % TFA). Kolonne-effluenten ble overvåket for absorbans ved 214 nm og fraksjoner samlet opp for etterfølgende analyse. Pegylert NBN NK ble fraksjonert i sine forskjellige di (60,5 mm), tri (63,3 mm) og tetra (67,8 mm) pegylerte komponenter med reversfase HPLC på en C4-kolonne. De relative intensiteter av toppene antyder at forholdene av komponentene er henholdsvis 5,4, 60,5 og 30,1 %. Toppidentisiteter ble bekreftet med MALDI-MS. Det var ingen tegn på ikke-pegylert NBN NK (eluerer ved 5-15 mm) i produktet.
Analyse av pegylert NBN med massespektrometri
Pegylert NBN NK ble avsaltet på en C4Zip Tip og analysert ved massespektrometri på en Voyager-DE™ STR (PerSeptive Biosystems) matriseassistert laserdesorpsjon/ionisering flyvetid (MALDI-TOF) massespektrometer ved å bruke sinapinsyre som en matrise. 0,5 pl av det rensede protein ble blandet med 0,5 pl matrise på målplaten. Massespektrometri av pegylert NBN viste enkle og doble ladede former av tre addukter. De observerte masser på 43.803 Da, 54.046 Da, og 64.438 Da er konsistent med modifikasjoner på 2, 3 og 4 PEG per molekyl.
Analyse av pegylert NBN med peptidkartlegging
Spesfisiteten av pegyleringsreaksjonen ble vurdert ved peptidkartlegging. Pegylert NBN ble avskilt i di, tri og tetra pegylerte komponenter, som så ble redusert, alkylert, og videre separert i sine enkelte kjedekomponenter med HPLC på en C4-kolonne. Disse komponenter og redusert og alkylert umodifisert NBN NK som en kontroll, ble spaltet med Asp-N-proteinase og de resulterende spaltningsprodukter ble fraksjonert med reversfase HPLC på en Vydac Ci8(5 pm, 1 x 250 mm) kolonne ved å bruke en 60 mm gradient fra 0 til 60 % B (Buffer A: 0,1 % TFA, Buffer B: 75 % acetonitril/0,085 % TFA). Kolonne-effluenten ble overvåket for absorbans ved 214 nm.
Rotte NBN-sekvensen inneholder fire innvendige asparaginsyrer og ble følgelig ventet å gi en enkel spaltningsprofil når spaltet med endoproteinase Asp-N. Alle av toppene fra Asp-N-spaltningen av en rotte NBN NK har blitt identifisert med massespektrometri og/eller Edman N-terminalt sekvensering og således kan peptidkartet bli brukt som et enkelt verktøy for å undersøke for modifiseringssetene ved tilstedeværelsen eller fraværet av en topp. Identiteten av de forskjellige topper er oppsummert nedenfor i tabell 3.
Siden NBN eksisterer som en homodimer, inneholder rotte NBN NK-produktet fire potensielle seter for pegylering, de to N-terminale aminer fra hver av kjedene og de to N95K-seter som ble manipulert inn i konstruksjonen. I peptidkartet av den dipegylerte kjede, ble kun den toppen som inneholder peptidet med NK-mutasjonen endret av PEG-modifikasjonen. Ingen av de andre topper ble påvirket av PEG-modifiseringen. Kartleggingsdataene indikerer følgelig at PEG-enheten er spesfikt bundet til dette peptid og ikke til noen av de andre peptider som ble undersøkt. Det andre potensielle bindingssete, N-terminalen, er på et peptid som kun er tre aminosyrer langt og blir ikke påvist i peptidkartet. Det blir antatt at ytterligere PEG-festinger foreligger ved dette sete. Konsistent med denne antagelse er en liten prosentdel av rotte NBN NK ikke avkortet og inneholder den ferdigutviklede Ala-1-sekvens. Dette peptid eluerer ved 30 pm og er synlig i peptidkartet fra den ikke-pegylerte spaltning, men er fraværende fra de pegylerte NBN NK-spaltninger.
Eksempel 3 Undersøkelse av effekten av internt pegylert neublastin i en kinasereseptor aktivering (KIRA) ELISA
Effekten av pegylert rotte NBN ble målt ved å bruke NBN avhengig aktivering/fosforylering av c-Ret som en reporter for NBN-aktivitet i en ELISA som var spesifikk for tilstedeværelsen av fosforylert RET. NB41A3-mRL3-celler, som er en adherent murin neuroblastomacellelinje som uttrykker Ret og GFRa3, ble utsådd ved 2 x IO<5>celler per brønn i 24-brønnersplate i Dulbeccos modifisert eaglemedium (DMEM), supplementert med 10 % fetalt bovinserum, og dyrket i 18 timer ved 37 °C og 5 % C02.
Cellene ble vasket med PBS, og behandlet med serielle fortynninger av NBN i 0,25 ml DMEM i 10 minutter ved 37 °C og 5 % C02. Hver prøve ble analysert i duplikat. Cellene ble vasket med 1 ml PBS, og lysert i 1 time ved 4 °C med 0,30 ml 10 mM Tris HCI, pH 8,0, 0,5 % Nonidet P40, 0,2 % natriumdeoksykolat, 50 mM NaF, 0,1 mM Na3V04, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid med forsiktig bevegelse av platene. Lysatene ble ytterligere beveget ved gjentatt pipettering og 0,25 ml prøve ble overført til en 96-brønners ELISA-plate som hadde blitt belagt med 5 pg/ml anti-Ret mAb (AA. GE7.3) i 50 mM karbonatbuffer, pH 9,6 ved 4 °C i 18 timer, og blokkert ved romtemperatur i en time med blokkeringsbuffer (20 mM Tris HCI pH 7,5, 150 mM NaCI, 0,1 % Tween-20 (TBST) inneholdende 1 % normalt museserum og 3 % bovin serumalbumin).
Etter en 2 timers inkubering ved romtemperatur ble brønnene vasket 6 ganger med TBST. Fosforylert Ret ble påvist ved inkubering av brønnene ved romtemperatur i 2 timer med 2: g/ml av pepperotperoksidase (HRP)-konjugert anti-fosfotyrosin 4G10-antistoff i blokkeringsbuffer, kun vask 6 ganger med TBST, og ved å måle HRP- aktivitet ved 450 nm med et kolorometrisk påvisningsreagens. Absorbansverdiene fra brønnene behandlet med lysat eller med lysisbuffer ble målt og det bakgrunns-korrigerte signal ble nedtegnet som en funksjon av konsentrasjonen av NBN som er til stede i aktiveringsblandingen. Effekten av pegylert NBN i KIRA ELISA var 10 nM, noe som ikke kan skjelnes fra den til NBN NK-utgangsmaterialet. Det var ingen effekt av to fryse-/tørke-sykler på effekten og etter denne behandling var det ingen signifikant økning i turbiditeten av prøven, noe som indikerer at prøvene sikkert kan bli tint opp for undersøkelsen. I uavhengige studier som undersøker aktiviteten av produktet med tre og fire 10 kDa PEG/molekyl separat, ble det bestemt at adduktet med tre PEG var fullstendig aktivt, mens fire PEG-produkter hadde redusert aktivitet.
Eksempel 4 Farmakokinetiske studier av internt pegylert rotteneublastin i rotter og mus
De farmakokinetiske egenskaper av forskjellige pegylerte og ikke-pegylerte NBN-produkter i rotte og musemodeller ble undersøkt.
Dataene viste at pegyleing av rotte NBN NK med 3,3, 10.000 Da PEG resulterte i en vesentlig effet på halveringstiden og biotilgjengeligheten av neublastinet. Etter 1 mg/kg IV-administrasjon i Sprague Dawley-rotter, ble toppnivåer av pegylert NBN på 3.000 ng/ml påvist etter 7 minutter, og nivåer på 700 ng/ml ble påvist etter 24 timer, 200 ng/ml etter 48 timer, og 100 ng/ml etter 72 timer. I motsetning til ikke-pegylert NBN etter 1 mg/kg IV-administrasjon, ble nivåer på 1.500 ng/ml påvist etter 7 minutter, men så falt nivåene rask til 70 ng/ml etter 3 timer og var ikke påvisbare etter 7 timer. Effektene av pegylering var enda mer uttalt i dyr behandlet med pegylert NBN ved subkutan administrasjon.
Etter en 1 mg/kg s.c. administrasjon nådde sirkulerende nivåer av pegylert NBN et maksimum på 200 ng/ml etter 24 timer og forble ved dette nivå over hele lengden av det tre dagers lange studium. I motsetning til dette ble intet påviselig NBN ved noe tidspunkt etter administrasjon av umodiflsert NBN.
Analysen av de pegylerte NBN-prøver kompliseres ved nærvær av addukter inneholdende 2, 3 og 4 PEG per molekyl, noe som vil oppvise en forskjellig PK-profil. I tidlige PK-studier, ble mus brukt for å lette undersøkelse gjennom en mengde kandidater og administrasjonsruter. Disse musestudier viste dramatiske forskjeller i biotilgjengeligheten av kandidatene. Imidlertid når 3,3 10 K PEG-adduktet ble vurdert i rotter, ble det funnet å være mindre biotilgjengelig i rotter enn det var i mus. Forskjellen i biotilgjengelighet var spesielt uttalt etter i.p.-administrasjon. Nivåer i mus nådde 1.600 ng/ml etter 7 timer og forble ved 400 ng/ml etter 24 timer. I motsetning til dette var rottenivåer konstante ved 100 ng/ml i 4 - 48 timer.
Både villtype rotteneublastin (wt-NBN) og neublastin med en Asn-to-Lys substitusjon ved posisjon 95 (NK-NBN) ble gjenfoldet og renset til > 95 % for
effektivitetsforsøk i den STZ-diabetiske rotteneuropatimodell. Wt-NBN ble formulert til å gå direkte inn i dyreforsøket mens NK-NBN ble fremstilt for pegylering med 10 kDa PEG-SPA. For å oppnå gjenfolding og opprenskningsmålet, ble en gjenfoldings-metode som benytter størrelseseksklusjon kromatografi (SEC) utviklet som tillott renatureringen av NBN fra E. coli inklusjonslegemer i store mengder og ved høye konsentrasjoner. I tillegg til SEC, ble både Ni-NTA og CM silika kolonnekromatografitrinn benyttet for å øke protein slutterenheten. Proteinene ble utsatt for utstrakt karakterisering innbefattende analyse med SDS-PAGE, størrelseseksklusjonskromatografi, ESMS, påvisning av aktivitet med KIRA ELISA, og bestemmelse av endotoksin-innhold. SDS-PAGE og SEC av sluttproteinproduktene indikerte en renhet som er større enn 95 %. Endotoksin-nivåene av hvert produkt var < 0,2 EU/mg. Den spesifikke aktivitet av begge proteiner i KIRA ELISA er omtrent 10 nM. Wt-NBN ble formulert ved 1,0 mg/ml og NK-NBN ble formulert ved 2,6 mg/ml i fosfat-bufferet fysiologisk saltvann (PBS) pH 6,5. wt-NBN ble fordelt i 15 ml rør og lagret frosset ved -70 °C mens NK-NBN ble utsatt for pegylering før porsjonsoppdeling og frysing.
Eksempel 5 Gjenfolding av et villtype neublastin og N95K neublastinmuteinet
Begge NBN-foremer ble uttrykt i E. Coli som His-merkede fusjonsproteiner med et enterokinasespaltningssete umiddelbart ved siden av starten av den ferdigutviklede 113 aminosyresekvens. Bakterier som uttrykker enten Wt-(1,8 kg pellet) eller NK-NBN (2,5 kg pellet) ble utsatt for lysis i 2 liter PBS ved å bruke en Gaulin-presser. Etter sentrifugering (10.000 rpm) for å pelletisere inklusjonslegemene ble supernatantene fra hver fremstilling kastet. Inklusjonslegemepelletene ble vasket to ganger med buffer (0,02 M Tris-HCI pH 8,5, 0,5 mM EDTA) derpå vasket to ganger, med samme buffer inneholdende Triton X-100 (2 %, v/v) fulgt av to ytterligere buffervasker uten detergent. Begge pelleter ble solubilisert ved å bruke 6M guanidinhydroklorid, 0,1 M Tris pH 8,5, 0,1 M DTT, og ImM EDTA. For å assistere solubiliseringsprosessen, ble hver pellet utsatt for homogenisering ved å bruke en polytron-homogenisator fulgt av omrøring over natten ved romtemperatur. De solubiserte proteiner ble klargjort med sentrifugering før denaturerende kromatografi gjennom Superdex 200 (5,5 liter kolonne ekvilibrert med 0,05 M glysin/H3P04pH 3,0 med 2M guanidin-HCI) ved 20 ml per minutt.
Denaturert NBN ble identifisert med SDS-PAGE. Fraksjoner inneholdende enten Wt-NBN eller NK-NBN ble slått sammen og konsentrert til omtrent 250 ml ved å bruke en Amicon 2,5 liter omrørt cellekonsentrator. Etter filtrering for å fjerne ethvert presipitat, ble det konsentrerte protein utsatt for renaturerende størrelsesbestemmende kromatografi gjennom Superdex 200 ekvilibrert med 0,1 M Tris-HCI pH 7,8, 0,5 M guanidin-HCI, 8,8 mM redusert glutation og 0,22 mM oksidert glutation. Kolonnen ble utviklet ved å bruke 0,5 M guanidin-HCI ved 20 ml per minutt. Fraksjoner inneholdende renaturert wt-NBN eller NK-NBN ble identifisert med SDS-PAGE, slått sammen, og lagret ved 4 °C inntil ønsket for His-markørfjerning.
Konsentrering av NBN med Ni-NTA-kromatografi (TR5919-138)
Renaturert NBN ble lagre ved 4 °C i minst 24 timer før det ble fortsatt med opprensningen for å fremme disulfiddannelse mellom NBN-monomerene. I løpet av denne tid dannet et presipitat seg og ble fjernet med filtrering gjennom en 0,2 p PES-filterenhet. For å minske ikke-spesifikk binding ble proteinoppløsningen brakt til 20 mM imidazol før påsetning på en 100 ml Ni-NTA (Qiagen)-kolonne ekvilibrert med kolonnebuffer (0,5 M guanidin og 20 mM imidazol) ved 50 ml per minutt. Etter påsetningen av proteinet, ble kolonnen vasket til null-linje ved å bruke samme buffer. NBN ble eluert fra resinet ved å bruke omtrent 300 ml elueringsbuffer inneholdende 0,5 M guanidin-HCI og 0,4M imidazol. Etter eluering ble NBN dialysert over natten (ved å bruke 10 k Da dialyserør) ved romtemperatur mot ti volumdeler 5 mM HCI. Dialyse fremmer hydrolysen av forurensende substanser og minsker guanidin-HCI og imidazolkonsentrasjonene til henholdsvis 0,05 M og 0,04 M.
Spaltning av His-markøren med lysylendopeptidase eller enterokinase
Dagen etter ble ethvert presipitat som dannet seg under dialyse fjernet ved filtrering. Proteinprøven ble laget 0,1 M NaCI ved tilsetning av 5 M stamoppløsning for en saltsluttkonsentrasjon innbefattende den gjenværende guanidin-HCI på omtrent 150 mM. Denne konsentrasjon ble bekreftet ved å bruke en konduktivitetsmåler. I tillegg ble 1 M HEPES pH 8 tilsatt for en sluttkonsentrasjon på 25 mM. For å spalte markøren ble lysylendopeptidase tilsatt til wt-NBN og enterokinase ble tilsatt til NK-NBN, begge ved et omtrentlig 1:300 forhold av protease til NBN. Enterokinase ble benyttet istedenfor lysylendopeptidase for NK-NBN grunnet et ytterligere proteasespaltningssete i det muterte protein ved Lys95. Prøvene ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer og spaltningene overvåket med
SDS-PAGE.
His-markørfjerning med Ni-NTA-kromatografi
Proteasebehandlet NBN ble satt på en 100 ml Ni-NTA-kolonne ekvilibrert med 0,5 M guanidin-HCI og 20 mM imidazol ved 50 ml per minutt. Kolonnen ble vasket til null-linje med samme buffer. Ethvert protein som ble vasket ut av kolonnen ble slått sammen med gjennomstrømningsproteinet inneholdende NBN uten His-markøren.
CM-silikakromatografi
Etter Ni-NTA-kromatografi ble proteinet umiddelbart utsatt for ytterligere opprensning gjennom CM-silikaresin. En 20 ml CM-silikakolonne ekvilibrert med påsettingsbuffer (5 mM fosfat pH 6,5, 150 mM NaCI) ble satt på med NBN ved 20 ml per minutt. Kolonnen ble vasket med 20 kolonnevolumer vaskebuffer (5 mM fosfat pH 6,5, 400 mM NaCI) og proteinet støt-eluert med elueringsbuffer inneholdende 5 mM fosfat pH 6,5, men med 1 M NaCI. Det eluerte protein ble dialy-sen over natten mot fosfatet alene for å bringe saltkonsentrasjonen ned til 100 mM for NK-NBN og 150 mM for wt-NBN. Begge prøver ble filtrert gjennom en 0,2 p PES-filterenhet, analysert med SDS-PAGE, og lagret ved 4 °C inntil benyttet for ytterligere karakteriseringer og/eller pegylering.
Wt-NBN og NK-NBN ble utsatt for UV-spektrumanalyse for å undersøke deres absorbans ved 280 nm. Ved å bruke en mikrokvarts kuvette og blindprøve mot buffer alene, ble 100 pl av enten wt-NBN eller NK-NBN kontinuerlig sveipet fra 230 til 330 nm ved å bruke et Beckman-spektrofotometer. Basert på den analyse ble wt-NBN bestemt til å være en konsentrasjon på 1,1 mg/ml og NK-NBN ved 2,6 mg/ml (A280 nm-E°'<1%>= 0,5 benyttet for hvert protein). Mindre enn 1 % utfelt materiale ble identifisert basert på absorbans ved 330 nm.
For å undersøke renheten av begge proteinpreparater, ble hver prøve (0,5 mg) utsatt for størrelseseksklusjonskromatografi gjennom en 16/30 Superdex 75 kolonne. Kolonnen ble ekvilibrert med 5 mM fosfat pH 6,5 inneholdende 400 mM NaCI og utviklet med en 1,5 ml per minutt strømningshastighet. Basert på absorbansen ved 280 nm migrerte både wt- og NK-NBN som en enkelt topp med en forventet molekylvekt (23-24 kDa), og de inneholdt ikke noen vesentlig proteinforu rensning.
Både wt- og NK-NBN ble redusert i 2,5 M guanidin-HCI, 60 mM Tris pH 8,0 og 16 mM DTT. De reduserte prøver ble avsaltet over en kort C4-kolonne og analysert "on-line" med ESMS ved å bruke et trippel kvadrupol instrument. ESMS-rådataene ble utviklet med MaxEnt-programmet for å danne massespektrum. Denne prosedyre tillater multiple ladede signaler å nedbehandles til en topp som direkte tilsvarer molekylmassen i kilodalton (kDa). Det dekonvoluterte massespektrum for wt-NBN viste at den dominante type er 12.046 kDa, som er i samsvar med den forutsatte molekylvekt på 12.046,7 kDa for 113-aminosyreformen av proteinet. En mindre komponent ble også observert (12.063 kDa), noe som antyder tilstedeværelsen av et oksidasjonsprodukt. Tre topper ble identifisert i NK-NBN-prøven. Hovedkomponenten viste en observert molekylmasse på 11.345 kDa, noe som er i samsvar med den forutsatte masse for 106 aminosyreformen av proteinet. De andre to topper hadde masser på 11.362 og 12.061 kDa, noe som antyder henholdsvis NK-NBN-oksidering og tilstedeværelsen av 113 aminosyreformen.
Tilstedeværelsen av 106 og 113 aminosyreformene i NK-NBN-preparatet kan tillegges spaltning med enterokinase. Denne protease fra Biozym er et naturlig enzym preparat som er renset fra kalvetarmslimhinne og er rapportert å inneholde en lett trypsinforurensning (0,25 ng trypsin per pg enterokinase). Følgelig kan trypsin virke på NK-NBN på den karboksyterminale side av Arg7 for å danne den hovedsakelige 106 aminosyreform. På den annen side er lysylendopeptidase som blir benyttet for å spalte Wt-NBN i en enkelt proteaseaktivitet som virker på den karboksyterminale side av lysinresiduet inneholdt i His-markøren for å danne den ferdigutviklede 113 aminosyres NBN-form. Både 106 og 113 aminosyreformene av NBN er like aktive i alle assays som er utført og oppfører seg likt i guanidin-HCI stabilitetstester.
NBN-aktivitet ble bestemt ved dens egenskap å stimulere c-Ret-fosforylering i NB41A3-mRL3-celler ved å bruke KIRA ELISA metoden beskrvet i eksempel 3. Fosforylert Ret ble påvist ved å inkubere (2 timer) den innfangede reseptor med HRP-konjugert fosfotyrosinantistoff (4G10; 0,2 pg per brønn). Etter inkuberingen ble brønnene vasket seks ganger med TBST, og HRP-aktiviteten påvist ved 450 nm med et kolorimetrisk assay. Absorbansverdiene fra brønner behandlet med lysat eller med lysisbuffer alene ble målt, bakgrunns korrigert, og dataene nedtegnet som en funksjon av konsentrasjonen av neublastin som er til stede i aktiveringsblandingen. Dataene viser at det rensede NBN resulterte i tilsynekomsten av fosforylert RET, noe som indikerer at det rensede NBN var aktivt i dette assay.
Eksempel 6 Fremstilling av et serum albumin-neublastinkonjugat
Villtype rotteneublastin ved en konsentrasjon på 1 mg/ml i PBS ble behandlet med 1 mM sulfo-SMCC (Pierce) og avsaltet for å fjerne overskytende kryssbinder. Siden villtype NBN proteinet inneholder kun et enkelt amin ved sin N-terminal og ingen fri sulfhydrylgrupper, ble reaksjon med SMCC forventet å resultere i setespesifikk modifisering av NBN med SMCC bundet ved dens N-terminal. 60 pg av NBN-SMCC konjugatet ble inkubert med 120 pg av bovin serumalbumin og analysert for graden av kryssbinding med SDS-PAGE. BSA inneholder en enkel fri SH-gruppe og følgelig er reaksjon med NBN-SMCC-konjugat forventet å resultere i modifisering med dette punkt via malieimidet på SMCC. Under disse betingelser ble to ytterligere bånd av høyere molekylvekt observert, noe som er konsistent i masse med modifikasjon av NBN-materialet med en enkel BSA-enhet og med to BSA-molekyler siden hvert NBN-molekyle inneholder to N-terminaler som kan undergå reaksjon, og dette er følgelig i samsvar med denne antagelse. Samtidig med dannelsen av disse bånd var en minskning i intensiteten av NBN-SMCC og BSA-båndene. Basert på intensiteten av det gjenværende NBN-bånd syntes reaksjonen å ha gått til 70-80 % fullstendighet.
Det monosubstituerte produkt ble renset fra reaksjonsblandingen ved å utsette materialet for kationbyttekromatografi og størrelseseksklusjonskromatografi på en
Superdex 200-kolonne (Pharmacia) i hovedsak som beskrevet for pegyleringsstudier diskutert ovenfor. Kolonnefraksjoner fra gelfiltreringsforsøket ble analysert med SDS-PAGE og de som inneholder det monosubstituerte produkt ble analysert for proteininnhold ved absorbans ved 280 nm. Siden massen av BSA er omtrent to ganger den til neublastin, ble den observerte konsentrasjon delt med en faktor på 3 for å gi NBN-ekvivalenten. Denne fraksjon ble utsatt for analysen for funksjon i KIRA ELISA. IC50-verdier for både wt- og BSA-konjugert NBN var 3-6 nM, noe som indikerer at konjugering til BSA-materialet ikke hadde ødelagt funksjonen.
Selv om disse preliminære studier ble dannet med BSA, inneholder de tilsvarende serumalbuminproteiner fra rotter og mennesker også en fri SH. Følgelig kan en lignende metode bli benyttet for å danne et rotteserumalbumin-rotte NBN-konjugat for å utføre PK og effektivitetsstudier i rotter og human serumalbumin-human NBN for å utføre kliniske forsøk. På lignende måte kan SMCC bli skiftet ut med enhver av et antall kryssbinderer som inneholder en aminoreaktivgruppe på den ene side og en tiolreaktivgruppe på den annen side. Eksempler på aminreaktive kryssbinderer som setter inn et tiolreaktivt maleimid er AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS eller GMBS, som setter inn en tioreaktivhaloacetatgruppe er SBAP, SIA, SIAB og som gir et beskyttet eller ikke-beskyttet tiol for reaksjon med sulfhydrylgrupper for å danne en reduserbar binding er SPDA, SMPT, SATA eller SATP hvor av alle er tilgjengelige fra Pierce. Slike kryssbinderer er kun eksempelvise og mange alternative strategier er påtenkt for binding av N-terminalen av NBN med serumalbumin. Fagpersonen kunne også danne konjugater til serumalbumin som ikke er målrettet mot N-terminalen av NBN eller mot tiolenheten på serumalbumin. NBN-serumalbuminfusjoner dannet ved å bruke genetisk manipulering hvor NBN er kondensert til serumalbumingenet ved dets N-terminal, C-terminal eller ved begge ender, er også ventet å være funksjonelle.
Claims (18)
1. Polypeptid omfattende en aminosyresekvens som er minst 90% identisk med aminosyrer 8-113 av SEQ ID NO: 1, hvor polypeptidet innbefatter en aminosyre som er forskjellige fra asparagin ved posisjonen som tilsvarer posisjon 95 i SEQ ID NO: 1, hvor aminosyren erstattet ved posisjonen tilvarende posisjon 95 innfører et sete hvor en polyalkylenglykol kan bli bundet til polypeptidet.
2. Polypeptid ifølge krav 1, hvor aminosyren ved posisjonen som tilsvarer posisjon 95 i SEQ ID NO: 1, er lysin.
3. Polypeptid ifølge krav 1 eller 2, hvor polypeptidet omfatter aminosyrer 8-113 av SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 eller SEQ ID NO: 4, hvor en aminosyre som er forskjellig fra asparagin er byttet ut for asparaginet ved posisjon 95.
4. Polypeptid ifølge krav 1, omfattende aminosyrer 1-113 av SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 eller SEQ ID NO: 4, hvor lysin er skiftet ut med asparagin ved posisjon 95.
5. Polypeptid ifølge krav 1 eller 2, hvor aminosyresekvensen er minst 95% identisk med aminosyrer 8-113 av SEQ ID NO: 1.
6. Polypeptid ifølge krav 1 eller 2, hvor aminosyresekvensen er minst 95% identisk med aminosyrer 8-113 av SEQ ID NO: 2.
7. Nukleinsyre som koder for polypeptidet ifølge ethvert av kravene 1 til 6.
8. Vektor omfattende nukleinsyren ifølge krav 7.
9. Vertscelle omfattende vektoren ifølge krav 8.
10. Vertscelle ifølge krav 9, hvor vertscellen er en kinesisk hamster ovariecelle.
11. Fremgangsmåte ved fremstilling av polypeptidet ifølge ethvert av kravene 1 til 6, omfattende (a) å dyrke vertscellen ifølge krav 9 eller 10 under betingelser som muliggjør ekspresjon av polypeptidet ifølge ethvert av kravene 1 til 6, og (b) gjenvinne nevnte polypeptid.
12. Dimer omfattende to polypeptider ifølge ethvert av kravene 1 til 6.
13. Konjugat omfattende polypeptidet ifølge ethvert av kravene 1 til 6 konjugert til en polyalkylenglykol.
14. Konjugat ifølge krav 13, hvor polyalkylenglykol-materialet er konjugert til et lysinresiduum substituert ved en posisjon som tilsvarer posisjon 95 i SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 eller SEQ ID NO: 4.
15. Konjugat ifølge ethvert av kravene 13 eller 14, hvor polypeptidet eller fusjonsproteinet er glykosylert.
16. Farmasøytisk sammensetning omfattende polypeptidet ifølge ethvert av kravene 1 til 6, eller et konjugat ifølge ethvert av kravene 13 til 15 samt en fysiologisk akseptabel vehikkel.
17. Anvendelse av et polypeptid ifølge ethvert av kravene 1 til 6 eller et konjugat ifølge ethvert av kravene 13 til 15 ved fremstilling av et medikament til behandling eller forebygging av en sykdom eller lidelse hos nervesystemet.
18. Anvendelse ifølge krav 17, hvor sykdommen eller lidelsen er en perifer neuropati eller et neuropatisk smertesyndrom.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US26607101P | 2001-02-01 | 2001-02-01 | |
PCT/US2002/002319 WO2002060929A2 (en) | 2001-02-01 | 2002-01-25 | Polymer conjugates of neublastin and methods of using same |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20033441D0 NO20033441D0 (no) | 2003-08-01 |
NO20033441L NO20033441L (no) | 2003-10-01 |
NO332150B1 true NO332150B1 (no) | 2012-07-09 |
Family
ID=23013042
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20033441A NO332150B1 (no) | 2001-02-01 | 2003-08-01 | Polymerkonjugater av neublastin, samt anvendelse derav |
Country Status (36)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP1862475A1 (no) |
JP (2) | JP4259868B2 (no) |
KR (2) | KR100960063B1 (no) |
CN (1) | CN1500095B (no) |
AR (1) | AR035077A1 (no) |
AT (1) | ATE365748T1 (no) |
AU (1) | AU2002247037B2 (no) |
BG (1) | BG66393B1 (no) |
BR (1) | BR0206852A (no) |
CA (1) | CA2436407C (no) |
CY (1) | CY1106886T1 (no) |
CZ (1) | CZ20032080A3 (no) |
DE (1) | DE60220879T2 (no) |
DK (1) | DK1355936T3 (no) |
EA (1) | EA009771B1 (no) |
EE (1) | EE05537B1 (no) |
ES (1) | ES2289091T3 (no) |
GE (1) | GEP20063916B (no) |
HK (1) | HK1057759A1 (no) |
HU (1) | HU228973B1 (no) |
IL (2) | IL156941A0 (no) |
IS (1) | IS2867B (no) |
MX (1) | MXPA03006805A (no) |
MY (1) | MY143685A (no) |
NO (1) | NO332150B1 (no) |
NZ (1) | NZ527863A (no) |
PL (1) | PL211162B1 (no) |
PT (1) | PT1355936E (no) |
RS (1) | RS50857B (no) |
SG (1) | SG149685A1 (no) |
SI (1) | SI1355936T1 (no) |
SK (1) | SK288123B6 (no) |
TR (1) | TR200301208T2 (no) |
UA (2) | UA100967C2 (no) |
WO (1) | WO2002060929A2 (no) |
ZA (1) | ZA200305733B (no) |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7442370B2 (en) | 2001-02-01 | 2008-10-28 | Biogen Idec Ma Inc. | Polymer conjugates of mutated neublastin |
WO2002060929A2 (en) * | 2001-02-01 | 2002-08-08 | Biogen, Inc. | Polymer conjugates of neublastin and methods of using same |
US7276580B2 (en) | 2001-03-12 | 2007-10-02 | Biogen Idec Ma Inc. | Neurotrophic factors |
EP1395279B1 (en) * | 2001-03-28 | 2011-10-05 | Biogen Idec MA Inc. | Use of neublastin polypeptides for treating neuropathic pain |
HUE028163T2 (en) * | 2002-01-18 | 2016-11-28 | Biogen Ma Inc | Polyalkylene polymer compounds and their use |
EA008743B1 (ru) * | 2003-01-31 | 2007-08-31 | Байоджен Айдек Ма Инк. | Полимерные конъюгаты мутантного неубластина |
NZ574121A (en) | 2003-04-18 | 2011-06-30 | Biogen Idec Inc | Polyethylene glycol-conjugated gylcosylated neublastin and uses thereof for treatment of pain |
BRPI0411243A (pt) | 2003-06-10 | 2006-07-11 | Nsgene As | método de produzir um polipeptìdio de neublastina biologicamente ativo, ácido nucléico, vetor de expressão, composição farmacêutica, célula, linha de células de compactação, mamìfero não-humano transgênico, dispositivo de cultura de células implantável, uso do vetor, método de tratar uma doença do sistema nervoso, e, polipetìdio de neublastina |
US7598059B2 (en) | 2003-10-02 | 2009-10-06 | Biogen Idec Ma Inc. | Neublastin expression constructs |
NZ553431A (en) | 2004-08-19 | 2010-04-30 | Biogen Idec Inc | Neublastin variants with decreased heparin binding |
CA2577690C (en) * | 2004-08-19 | 2013-08-06 | Biogen Idec Ma Inc. | Refolding transforming growth factor beta family proteins |
TWI501774B (zh) | 2006-02-27 | 2015-10-01 | Biogen Idec Inc | 神經性病症之治療 |
US20100056440A1 (en) * | 2006-03-01 | 2010-03-04 | Biogen Idec Ma Inc. | Compositions and methods for administering gdnf ligand family proteins |
JP2010503630A (ja) | 2006-09-15 | 2010-02-04 | クレアビリス・セラピューティクス・エスピーエー | HMGB1のBox−AおよびHMGB1のBox−A変異体のポリマー複合体 |
EP2142205B1 (en) * | 2007-05-01 | 2014-04-02 | Biogen Idec MA Inc. | Neublastin peptides for use in increasing vascularisation in tissue with impaired blood flow |
PL2773438T5 (pl) * | 2011-11-02 | 2022-01-17 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Chromatografia przeciążenia i elucji |
RU2488635C1 (ru) * | 2012-03-22 | 2013-07-27 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития | Способ получения рекомбинантного антиангиогенного полипептида |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5770577A (en) * | 1994-11-14 | 1998-06-23 | Amgen Inc. | BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol |
WO1999043813A1 (en) * | 1998-02-27 | 1999-09-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Modified ciliary neurotrophic factor, method of making and methods of use thereof |
WO2000001815A2 (en) * | 1998-07-06 | 2000-01-13 | Nsgene A/S | Neurotrophic factors |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2354600A (en) * | 1998-12-09 | 2000-06-26 | Amgen, Inc. | Grnf4 a neurotrophic factor |
WO2002060929A2 (en) * | 2001-02-01 | 2002-08-08 | Biogen, Inc. | Polymer conjugates of neublastin and methods of using same |
-
2002
- 2002-01-25 WO PCT/US2002/002319 patent/WO2002060929A2/en active IP Right Grant
- 2002-01-25 EA EA200300852A patent/EA009771B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-01-25 CN CN028077539A patent/CN1500095B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-25 AT AT02714792T patent/ATE365748T1/de active
- 2002-01-25 MX MXPA03006805A patent/MXPA03006805A/es active IP Right Grant
- 2002-01-25 UA UAA200802148A patent/UA100967C2/ru unknown
- 2002-01-25 EE EEP200300355A patent/EE05537B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2002-01-25 AR ARP020100279A patent/AR035077A1/es not_active Application Discontinuation
- 2002-01-25 SK SK971-2003A patent/SK288123B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2002-01-25 CA CA2436407A patent/CA2436407C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-25 PL PL372101A patent/PL211162B1/pl unknown
- 2002-01-25 SI SI200230580T patent/SI1355936T1/sl unknown
- 2002-01-25 SG SG200504719-6A patent/SG149685A1/en unknown
- 2002-01-25 EP EP07110666A patent/EP1862475A1/en not_active Withdrawn
- 2002-01-25 IL IL15694102A patent/IL156941A0/xx unknown
- 2002-01-25 GE GE5240A patent/GEP20063916B/en unknown
- 2002-01-25 EP EP02714792A patent/EP1355936B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-25 DE DE60220879T patent/DE60220879T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-25 NZ NZ527863A patent/NZ527863A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-01-25 RS YUP-610/03A patent/RS50857B/sr unknown
- 2002-01-25 UA UA2003088104A patent/UA82983C2/ru unknown
- 2002-01-25 DK DK02714792T patent/DK1355936T3/da active
- 2002-01-25 ES ES02714792T patent/ES2289091T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-25 HU HU0500637A patent/HU228973B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2002-01-25 KR KR1020087022638A patent/KR100960063B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-01-25 CZ CZ20032080A patent/CZ20032080A3/cs unknown
- 2002-01-25 PT PT02714792T patent/PT1355936E/pt unknown
- 2002-01-25 KR KR1020037010127A patent/KR100872807B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-01-25 JP JP2002561497A patent/JP4259868B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-25 BR BR0206852-4A patent/BR0206852A/pt not_active Application Discontinuation
- 2002-01-25 TR TR2003/01208T patent/TR200301208T2/xx unknown
- 2002-01-25 AU AU2002247037A patent/AU2002247037B2/en not_active Ceased
- 2002-02-04 MY MYPI20020368A patent/MY143685A/en unknown
-
2003
- 2003-07-15 IL IL156941A patent/IL156941A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-07-17 IS IS6879A patent/IS2867B/is unknown
- 2003-07-24 ZA ZA2003/05733A patent/ZA200305733B/en unknown
- 2003-08-01 NO NO20033441A patent/NO332150B1/no not_active IP Right Cessation
- 2003-08-19 BG BG108111A patent/BG66393B1/bg unknown
- 2003-11-21 HK HK03108539A patent/HK1057759A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-09-21 CY CY20071101225T patent/CY1106886T1/el unknown
-
2008
- 2008-10-28 JP JP2008277469A patent/JP4423338B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5770577A (en) * | 1994-11-14 | 1998-06-23 | Amgen Inc. | BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol |
WO1999043813A1 (en) * | 1998-02-27 | 1999-09-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Modified ciliary neurotrophic factor, method of making and methods of use thereof |
WO2000001815A2 (en) * | 1998-07-06 | 2000-01-13 | Nsgene A/S | Neurotrophic factors |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
C. DELGADO et al., The Uses and Properties of PEG-Linked Proteins, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1992, Vol.9 (3,4), side 249-304, Dated: 01.01.0001 * |
K.R. REDDY, Controlled-Release, Pegylation, Liposomal Formulations: New Mechanisms in the Delivery of Injectable Drugs, The Annals of Pharmacotherapy, 2000, Vol. 34, side 915-923, Dated: 01.01.0001 * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8119114B2 (en) | Polymer conjugates of mutated neublastin | |
JP4423338B2 (ja) | ニューブラスチンのポリマー結合体および同様の使用方法。 | |
AU2002247037A1 (en) | Polymer conjugates of neublastin and methods of using same | |
EP2246362B1 (en) | Polymer conjugates of mutated neublastin |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
CHAD | Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften) |
Owner name: BIOGEN MA INC., US |
|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |