SK288123B6 - Polymer conjugates of neublastin and methods of using same - Google Patents
Polymer conjugates of neublastin and methods of using same Download PDFInfo
- Publication number
- SK288123B6 SK288123B6 SK971-2003A SK9712003A SK288123B6 SK 288123 B6 SK288123 B6 SK 288123B6 SK 9712003 A SK9712003 A SK 9712003A SK 288123 B6 SK288123 B6 SK 288123B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- polypeptide
- neublastin
- nbn
- amino acid
- variant
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 36
- 102100026376 Artemin Human genes 0.000 title abstract description 319
- 101000785776 Homo sapiens Artemin Proteins 0.000 title abstract description 163
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 title description 43
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 95
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 79
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 77
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 76
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 69
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 65
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 51
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 41
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 31
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 23
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 21
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 14
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 claims description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 13
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 11
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 11
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 11
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 10
- 230000006576 neuronal survival Effects 0.000 claims description 8
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 claims description 8
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 claims description 8
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 7
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 5
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 5
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 5
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 208000004296 neuralgia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000021722 neuropathic pain Diseases 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims 1
- 229920001281 polyalkylene Polymers 0.000 claims 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 55
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 54
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 54
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 53
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 38
- 239000000047 product Substances 0.000 description 34
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 29
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 25
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 24
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 21
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 20
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 20
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 18
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 18
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 17
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 17
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 16
- 102000024452 GDNF Human genes 0.000 description 15
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 15
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 15
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 15
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 14
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 14
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 14
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 14
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 13
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 13
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 13
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 12
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 12
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 12
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 12
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 12
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 11
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 10
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 10
- 101100293625 Rattus norvegicus Nbn gene Proteins 0.000 description 10
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 239000000306 component Substances 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- -1 trypropane Chemical compound 0.000 description 9
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 8
- 101100324497 Rattus norvegicus Artn gene Proteins 0.000 description 8
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 8
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 8
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 8
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 8
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 7
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 101000945318 Homo sapiens Calponin-1 Proteins 0.000 description 7
- 101000652736 Homo sapiens Transgelin Proteins 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102100031013 Transgelin Human genes 0.000 description 7
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 7
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 7
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 6
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- SGYSTDWPNPKJPP-GUBZILKMSA-N Arg-Ala-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SGYSTDWPNPKJPP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 5
- LVMUGODRNHFGRA-AVGNSLFASA-N Arg-Leu-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O LVMUGODRNHFGRA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N Gly-Ser-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 5
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 5
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 5
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 5
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 5
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- INXWADWANGLMPJ-JYJNAYRXSA-N Arg-Phe-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 INXWADWANGLMPJ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 4
- VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N Gly-Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 4
- LBDXVCBAJJNJNN-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Cys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O LBDXVCBAJJNJNN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UOAVQQRILDGZEN-SRVKXCTJSA-N His-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O UOAVQQRILDGZEN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010053229 Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 4
- WFDAEEUZPZSMOG-SRVKXCTJSA-N Phe-Cys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WFDAEEUZPZSMOG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- FUMGHWDRRFCKEP-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FUMGHWDRRFCKEP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CO VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 4
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 4
- UNURFMVMXLENAZ-KJEVXHAQSA-N Thr-Arg-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O UNURFMVMXLENAZ-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 4
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 4
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical group C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 4
- 108010000434 glycyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 4
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 description 4
- 108010072637 phenylalanyl-arginyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 210000001044 sensory neuron Anatomy 0.000 description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- SGNVTRHWJGTNKV-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 11-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)undecanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCCCCCCN1C(=O)C=CC1=O SGNVTRHWJGTNKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- TYKASZBHFXBROF-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)acetate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CN1C(=O)C=CC1=O TYKASZBHFXBROF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JKHVDAUOODACDU-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCN1C(=O)C=CC1=O JKHVDAUOODACDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCN1C(=O)C=CC1=O PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GKSPIZSKQWTXQG-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[1-(pyridin-2-yldisulfanyl)ethyl]benzoate Chemical compound C=1C=C(C(=O)ON2C(CCC2=O)=O)C=CC=1C(C)SSC1=CC=CC=N1 GKSPIZSKQWTXQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PMJWDPGOWBRILU-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl]butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCC(C=C1)=CC=C1N1C(=O)C=CC1=O PMJWDPGOWBRILU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VLARLSIGSPVYHX-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)hexanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCN1C(=O)C=CC1=O VLARLSIGSPVYHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WCMOHMXWOOBVMZ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-[3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)propanoylamino]hexanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCNC(=O)CCN1C(=O)C=CC1=O WCMOHMXWOOBVMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N Ala-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CCCN=C(N)N JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- KRHRBKYBJXMYBB-WHFBIAKZSA-N Ala-Cys-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O KRHRBKYBJXMYBB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N Ala-Leu-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- RGTVXXNMOGHRAY-WDSKDSINSA-N Cys-Arg Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N RGTVXXNMOGHRAY-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N L-alanine-L-arginine Natural products CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- VBZOAGIPCULURB-QWRGUYRKSA-N Leu-Gly-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N VBZOAGIPCULURB-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100021584 Neurturin Human genes 0.000 description 3
- 108010001648 Proto-Oncogene Proteins c-ret Proteins 0.000 description 3
- 102000000813 Proto-Oncogene Proteins c-ret Human genes 0.000 description 3
- 101150077555 Ret gene Proteins 0.000 description 3
- 108700031620 S-acetylthiorphan Proteins 0.000 description 3
- JPIDMRXXNMIVKY-VZFHVOOUSA-N Ser-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JPIDMRXXNMIVKY-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 3
- TVPQRPNBYCRRLL-IHRRRGAJSA-N Ser-Phe-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O TVPQRPNBYCRRLL-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZOCJFNXUVSGBQI-HSHDSVGOSA-N Thr-Trp-Arg Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N)O ZOCJFNXUVSGBQI-HSHDSVGOSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 102220477417 Uncharacterized protein FLJ30774_R14K_mutation Human genes 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 description 3
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 3
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 3
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 102220225706 rs1014627144 Human genes 0.000 description 3
- 102220289977 rs141288548 Human genes 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 3
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- ATGUDZODTABURZ-UHFFFAOYSA-N thiolan-2-ylideneazanium;chloride Chemical compound Cl.N=C1CCCS1 ATGUDZODTABURZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BQWBEDSJTMWJAE-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[(2-iodoacetyl)amino]benzoate Chemical compound C1=CC(NC(=O)CI)=CC=C1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O BQWBEDSJTMWJAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) propanoate Chemical compound CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N Ala-Gly Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- OBVSBEYOMDWLRJ-BFHQHQDPSA-N Ala-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N OBVSBEYOMDWLRJ-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 2
- PPPXVIBMLFWNSK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Cys Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)CN=C(N)N PPPXVIBMLFWNSK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- WSXDIZFNQYTUJB-SRVKXCTJSA-N Asp-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O WSXDIZFNQYTUJB-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- VGBSZQSKQRMLHD-MNXVOIDGSA-N Glu-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O VGBSZQSKQRMLHD-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 2
- CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N Gly-Leu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 208000004454 Hyperalgesia Diseases 0.000 description 2
- TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N Ile-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 101100324496 Mus musculus Artn gene Proteins 0.000 description 2
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010015406 Neurturin Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102100036660 Persephin Human genes 0.000 description 2
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 2
- 101000930457 Rattus norvegicus Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- HRNQLKCLPVKZNE-CIUDSAMLSA-N Ser-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HRNQLKCLPVKZNE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- GXXTUIUYTWGPMV-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GXXTUIUYTWGPMV-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- PPCZVWHJWJFTFN-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PPCZVWHJWJFTFN-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 2
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 2
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 2
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 2
- 102000050671 human ARTN Human genes 0.000 description 2
- LFKYBJLFJOOKAE-UHFFFAOYSA-N imidazol-2-ylidenemethanone Chemical group O=C=C1N=CC=N1 LFKYBJLFJOOKAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 2
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 2
- 208000027232 peripheral nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 108010070453 persephin Proteins 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- DYMYLBQTHCJHOQ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) butanoate Chemical compound CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O DYMYLBQTHCJHOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JPNBVWIRDQVGAC-UHFFFAOYSA-N (2-nitrophenyl) hydrogen carbonate Chemical class OC(=O)OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O JPNBVWIRDQVGAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QXZGLTYKKZKGLN-UHFFFAOYSA-N 4-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O QXZGLTYKKZKGLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- TTXMOJWKNRJWQJ-FXQIFTODSA-N Ala-Arg-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CCCN=C(N)N TTXMOJWKNRJWQJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- VGPWRRFOPXVGOH-BYPYZUCNSA-N Ala-Gly-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O VGPWRRFOPXVGOH-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- YHKANGMVQWRMAP-DCAQKATOSA-N Ala-Leu-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YHKANGMVQWRMAP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- YNOCMHZSWJMGBB-GCJQMDKQSA-N Ala-Thr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YNOCMHZSWJMGBB-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- 102100024321 Alkaline phosphatase, placental type Human genes 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- ADPACBMPYWJJCE-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ADPACBMPYWJJCE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XNSKSTRGQIPTSE-ACZMJKKPSA-N Arg-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O XNSKSTRGQIPTSE-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- QJMCHPGWFZZRID-BQBZGAKWSA-N Asn-Lys Chemical group NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O QJMCHPGWFZZRID-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HNXWVVHIGTZTBO-LKXGYXEUSA-N Asn-Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O HNXWVVHIGTZTBO-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- IXIWEFWRKIUMQX-DCAQKATOSA-N Asp-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O IXIWEFWRKIUMQX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- PDECQIHABNQRHN-GUBZILKMSA-N Asp-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O PDECQIHABNQRHN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- LDIKUWLAMDFHPU-FXQIFTODSA-N Cys-Cys-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O LDIKUWLAMDFHPU-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- IZUNQDRIAOLWCN-YUMQZZPRSA-N Cys-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N IZUNQDRIAOLWCN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UWTATZPHSA-N D-Cysteine Chemical compound SC[C@@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 229930028154 D-arginine Natural products 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N D-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 229930182818 D-methionine Natural products 0.000 description 1
- 208000032131 Diabetic Neuropathies Diseases 0.000 description 1
- 229930195710 D‐cysteine Natural products 0.000 description 1
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N Gly-Ala-Gly Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC([O-])=O UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- IXKRSKPKSLXIHN-YUMQZZPRSA-N Gly-Cys-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IXKRSKPKSLXIHN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035154 Hyperesthesia Diseases 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- QUOGESRFPZDMMT-UHFFFAOYSA-N L-Homoarginine Natural products OC(=O)C(N)CCCCNC(N)=N QUOGESRFPZDMMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- QUOGESRFPZDMMT-YFKPBYRVSA-N L-homoarginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCCNC(N)=N QUOGESRFPZDMMT-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 101710192606 Latent membrane protein 2 Proteins 0.000 description 1
- BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DZQMXBALGUHGJT-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DZQMXBALGUHGJT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- FDBTVENULFNTAL-XQQFMLRXSA-N Leu-Val-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N FDBTVENULFNTAL-XQQFMLRXSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N Met-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- FVKRQMQQFGBXHV-QXEWZRGKSA-N Met-Asp-Val Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O FVKRQMQQFGBXHV-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- 208000001089 Multiple system atrophy Diseases 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101150081841 NBN gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000007339 Nerve Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010032605 Nerve Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 101100498071 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cys-17 gene Proteins 0.000 description 1
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010886 Peripheral nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010036105 Polyneuropathy Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- AIZVVCMAFRREQS-GUBZILKMSA-N Pro-Cys-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AIZVVCMAFRREQS-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- LEIKGVHQTKHOLM-IUCAKERBSA-N Pro-Pro-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 LEIKGVHQTKHOLM-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- PKHDJFHFMGQMPS-RCWTZXSCSA-N Pro-Thr-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O PKHDJFHFMGQMPS-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000997959 Rattus norvegicus GDNF family receptor alpha-1 Proteins 0.000 description 1
- 101100068253 Rattus norvegicus Gdnf gene Proteins 0.000 description 1
- 101100248018 Rattus norvegicus Ret gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010038910 Retinitis Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- NRCJWSGXMAPYQX-LPEHRKFASA-N Ser-Arg-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O NRCJWSGXMAPYQX-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- FTVRVZNYIYWJGB-ACZMJKKPSA-N Ser-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FTVRVZNYIYWJGB-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- PPQRSMGDOHLTBE-UWVGGRQHSA-N Ser-Phe Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PPQRSMGDOHLTBE-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- OJFFAQFRCVPHNN-JYBASQMISA-N Ser-Thr-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O OJFFAQFRCVPHNN-JYBASQMISA-N 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 1
- 101710109576 Terminal protein Proteins 0.000 description 1
- YRNBANYVJJBGDI-VZFHVOOUSA-N Thr-Ala-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O YRNBANYVJJBGDI-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- LMMDEZPNUTZJAY-GCJQMDKQSA-N Thr-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O LMMDEZPNUTZJAY-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- LYGKYFKSZTUXGZ-ZDLURKLDSA-N Thr-Cys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O LYGKYFKSZTUXGZ-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- PNHABSVRPFBUJY-UMPQAUOISA-N Trp-Arg-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N)O PNHABSVRPFBUJY-UMPQAUOISA-N 0.000 description 1
- NQJDICVXXIMMMB-XDTLVQLUSA-N Tyr-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NQJDICVXXIMMMB-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 1
- QZKVWWIUSQGWMY-IHRRRGAJSA-N Val-Ser-Phe Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QZKVWWIUSQGWMY-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 108010076324 alanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 206010053552 allodynia Diseases 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 150000001484 arginines Chemical group 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003705 background correction Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- QRUDEWIWKLJBPS-UHFFFAOYSA-N benzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N[N][N]C2=C1 QRUDEWIWKLJBPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012964 benzotriazole Substances 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 125000005587 carbonate group Chemical group 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003986 cell retinal photoreceptor Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003210 demyelinating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000013583 drug formulation Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 108010003914 endoproteinase Asp-N Proteins 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 208000021731 hypoalgesia Diseases 0.000 description 1
- 230000036032 hypoalgesia Effects 0.000 description 1
- 208000034783 hypoesthesia Diseases 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 239000003350 kerosene Substances 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000001906 matrix-assisted laser desorption--ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 206010027175 memory impairment Diseases 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 201000005518 mononeuropathy Diseases 0.000 description 1
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 230000032405 negative regulation of neuron apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 206010061311 nervous system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003040 nociceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 235000018343 nutrient deficiency Nutrition 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 210000005034 parasympathetic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N phosphotyrosine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(OP(O)(O)=O)C=C1 DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008560 physiological behavior Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 108010031345 placental alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 230000007824 polyneuropathy Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 201000002212 progressive supranuclear palsy Diseases 0.000 description 1
- 108010087846 prolyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 229920013730 reactive polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008085 renal dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 210000003994 retinal ganglion cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- PCMORTLOPMLEFB-ONEGZZNKSA-N sinapic acid Chemical compound COC1=CC(\C=C\C(O)=O)=CC(OC)=C1O PCMORTLOPMLEFB-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 1
- PCMORTLOPMLEFB-UHFFFAOYSA-N sinapinic acid Natural products COC1=CC(C=CC(O)=O)=CC(OC)=C1O PCMORTLOPMLEFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M sodium;1-[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)C1CCC(CN2C(C=CC2=O)=O)CC1 VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 1
- 210000003594 spinal ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002889 sympathetic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 239000012049 topical pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000001170 unmyelinated nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 210000000752 vestibulocochlear nerve Anatomy 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- JLQFVGYYVXALAG-CFEVTAHFSA-N yasmin 28 Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1.C([C@]12[C@H]3C[C@H]3[C@H]3[C@H]4[C@@H]([C@]5(CCC(=O)C=C5[C@@H]5C[C@@H]54)C)CC[C@@]31C)CC(=O)O2 JLQFVGYYVXALAG-CFEVTAHFSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/4756—Neuregulins, i.e. p185erbB2 ligands, glial growth factor, heregulin, ARIA, neu differentiation factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
- A61P29/02—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID] without antiinflammatory effect
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Zoology (AREA)
- Psychology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
Abstract
Disclosed is a variant neublastin polypeptide with introduced site for polyalkylene glycol attachments. Further are disclosed: a fusion protein comprising the aforementioned variant neublastin polypeptide; nucleic acid encoding said variant neublastin polypeptide; a vector comprising the nucleic acid; a host cell comprising said vector; a method of making the aforementioned variant neublastin polypeptide; a conjugate of said variant neublastin polypeptide or a fusion protein comprising the same with polyalkylene glycol; a pharmaceutical composition comprising said variant neublastin polypetide, said fusion protein or said conjugate with polyalkylene glycol and their medical use.
Description
Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa všeobecne týka polypeptidov a konkrétne modifikovaných neurotrofických polypeptidov a farmaceutických kompozícií obsahujúcich tieto polypeptidy užitočných na liečenie porúch nervového systému.
Doterajší stav techniky
Neurotrofické faktory sú prirodzene sa vyskytujúce proteíny, ktoré podporujú prežívanie, udržiavanie fenotypovej diferenciácie, predchádzajú degenerácii a zvyšujú aktivitu nervových buniek (neurónov) a tkanív. Neurotrofické faktory boli izolované z nervového tkaniva a z iných typov tkanív, ktoré sú inervované nervovým systémom, a boli klasifikované do funkčne a štrukturálne príbuzných skupín, tiež nazývaných rodiny, superrodiny („superfamilies“) alebo subrodiny („subfamilies“). Medzi superrodiny neurotrofických faktorov patrí superrodina fibroblastového rastového faktora, neurotrofínu a transformujúceho rastového faktora β (TGF-β). Jednotlivé druhy („species“) neurotrofických faktorov sa odlišujú svojou fyzikálnou štruktúrou, interakciami s príslušnými receptormi, ktoré ich rozpoznávajú, a účinkami na rôzne typy nervových buniek. Do superrodiny TGF-3 patria ligandy neurotrofického faktora pochádzajúceho z línie gliových buniek (GDNF), kam patria GDNF, persefin (persephin, PSP) a neurturín (neurturin, NTN).
Ligandy subrodiny GDNF majú spoločnú vlastnosť, a tou je schopnosť indukovať signalizáciu (signálnu dráhu) vedúcu cez receptorovú tyrozínkinázu RET. Uvedené tri ligandy subrodiny GDNF sa líšia v relatívnej afinite k rodine neurotrofických receptorov, receptorov GFRa.
„Neublastín“ alebo „NBN“ je pomerne nedávno opísaný neurotrofický faktor. Neublastín patrí do subrodiny GDNF, pretože obsahuje úseky homológie s inými GDNF ligandmi, a tiež kvôli svojej schopnosti viazať sa na RET a aktivovať ju. Na rozdiel od iných GDNF ligandov je neublastín vysoko selektívny pre komplex GFRa3-RET receptor. NBN okrem toho obsahuje unikátne subúseky v svojej aminokyselinovej sekvencii.
Neublastín sa ale z organizmu rýchlo odstraňuje. Toto rýchle odstránenie môže byť vážnym nedostatkom pri liečebnom využití neublastínu. Preto existuje potreba nájsť varianty neublastínu, ktoré by mali zvýšenú biologickú dostupnosť.
Podstata vynálezu
Predkladaný vynález je založený čiastočne na objave nových foriem neublastínu, ktoré majú zlepšené farmakokinetické vlastnosti a zvýšenú biologickú dostupnosť in vivo. K týmto novým formám patria varianty neublastínového polypeptidu kondenzované (konjugované) s polymémymi molekulami.
Jeden aspekt vynálezu sa týka variantu polypeptidu neublastínu alebo muteínu polypeptidu neublastínu, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu s jednou alebo viacerými substitúciami aminokyselín v polohe zrelého diméru neublastínu, ktorá je vystavená rozpúšťadlu. Tieto substitúcie vnášajú do natívneho polypeptidu neublastínu jedno alebo viac miest, na ktoré sa môžu látky, ako napríklad prirodzene sa vyskytujúce alebo syntetické polyméry, naviazať, a tým zvýšiť rozpustnosť polypeptidu a zlepšiť tým biologickú dostupnosť in vivo. Výhodne variant polypeptidu obsahuje aminokyselinovú sekvenciu aspoň na 70 % totožnú so sekvenciou aminokyselín 8-113 zo sekvencie uvedenej tu v zozname sekvencií ako SEQ ID NO: 1. Variant polypeptidu neublastínu obsahuje jednu alebo viac substituovaných aminokyselín, pričom sa aminokyselina iná ako arginín vyskytuje v polohe 14 v aminokyselinovej sekvencií variantu polypeptidu, aminokyselina iná ako arginín sa vyskytuje v polohe 39 v aminokyselinovej sekvencií variantu polypeptidu, aminokyselina iná ako arginín sa vyskytuje v polohe 68 variantu polypeptidu alebo aminokyselina iná ako asparagín sa vyskytuje v polohe 95 variantu polypeptidu, kde sú polohy aminokyselín označené, podľa polypeptidovej sekvencie uvedenej v zozname sekvencií ako SEQ ID NO: 1.
Termín „neublastín divého typu“ alebo skrátene „wt-NBN“, ako sa v tomto texte používa, sa týka prirodzene sa vyskytujúcej alebo natívnej polypeptidovej sekvencie neublastínu, ako je napr. sekvencia neublastínu potkana, myši alebo človeka (pozri napr. SEQ ID NO: 2, 3 alebo 4). Špecifické varianty polypeptidu neublastínu sú označované v tomto texte ako „NBN-X'N’X2“ alebo „X1N1X2-NBN“, kde X1 označuje aminokyselinu divého typu polypeptidu neublastínu, N1 znamená číslo polohy aminokyseliny X1 v sekvencií pri číslovaní podľa sekvencie SEQ ID NO: 1 a X2 označuje aminokyselinu, ktorá nahrádza aminokyselinu divého typu v uvedenej polohe danej sekvencie. Napríklad NBN-N95K znamená variant polypeptidu neublastínu, kde asparagín v polohe 95 je nahradený lyzínom.
Variant polypeptidu neublastínu podľa vynálezu sa môže poskytnúť ako multimémy polypeptid. Napríklad variant polypeptidu neublastínu sa môže poskytnúť ako dimér, ktorý obsahuje aspoň jeden variant poly2
SK 288123 Β6 peptidu neublastínu. V niektorých uskutočneniach je dimérom homodimér variantu polypeptidu neublastínu.
V inom uskutočnení je dimérom heterodimér, ktorý obsahuje jeden variant polypeptidu neublastínu a jeden polypeptid neublastínu divého typu. Ešte ďalšie diméry obsahujú dva rôzne varianty polypeptidu neublastínu.
V inom variante polypeptid neublastínu obsahuje, okrem aminokyselín 8 - 113, ešte aminokyseliny 1 - 7 zo sekvencie SEQ ID NO: 1.
Vo výhodných uskutočneniach variant polypeptidu neublastínu, keď je dimenzovaný, viaže GFRa3. V ďalších výhodných uskutočneniach variant polypeptidu neublastínu, keď je dimenzovaný, stimuluje fosforyláciu tyrozín RET polypeptidu, buď sám, alebo ako viazaný na GFRa3.
V ešte inom výhodnom uskutočnení, keď je dimerizovaný variant polypeptidu neublastínu, zlepšuje prežívanie neurónov, napr. zlepšuje prežívanie senzorických neurónov.
V ešte inom výhodnom uskutočnení, keď je dimerizovaný variant polypeptidu neublastínu, normalizuje patologické zmeny v neuróne, napríklad v senzorickom neuróne.
V ešte ďalšom výhodnom uskutočnení, keď je dimerizovaný variant polypeptidu neublastínu, zlepšuje prežívanie neurónov, napr. autonómnych neurónov alebo dopaminergných neurónov.
V niektorých uskutočneniach variant polypeptidu obsahuje dve, tri alebo viac substituovaných aminokyselín vybraných zo skupiny, ktorú tvoria aminokyselina okrem arginínu v polohe 14 aminokyselinovej sekvencie variantu polypeptidu, aminokyselina okrem arginínu v polohe 39 aminokyselinovej sekvencie variantu polypeptidu, aminokyselina okrem arginínu v polohe 68 variantu polypeptidu a aminokyselina okrem asparagínu v polohe 95 variantu polypeptidu.
Vo výhodnom uskutočnení aminokyselinou v jednej alebo vo viacerých polohách z polôh č. 14, 39, 68 a 95 je lyzín.
Výhodne, aminokyseliny 8 - 94 a 96 - 113 variantu polypeptidu neublastínu sú aspoň na 90 % identické s aminokyselinami 8 - 94 a 96 - 113 zo sekvencie SEQ ID NO: 1. Výhodnejšie sú uvedené aminokyselinové sekvencie aspoň na 95 % identické. Najvýhodnejšie aminokyselinovú sekvencia variantu polypeptidu neublastínu obsahuje aminokyselinovú sekvenciu prirodzene sa vyskytujúcu v sekvencii polypeptidu neublastínu potkana, človeka alebo myši v úsekoch aminokyselín 8 - 94 a 96 - 113 variantu polypeptidu neublastínu. Napríklad aminokyseliny 8 - 94 a 96 - 113 variantu polypeptidu neublastínu môžu obsahovať aminokyselinové sekvencie aminokyselín 8 - 94 a 96 - 113 zo sekvencii SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 alebo SEQ ID NO: 4.
Vynález ďalej poskytuje fúzny proteín alebo polypeptid, ktorý obsahuje variant polypeptidu neublastínu alebo polypeptid neublastínu divého typu, alebo proteín, ktorý je dimérom pozostávajúcim z dvoch neublastínových fúznych proteínov. Neublastínové fúzne proteíny majú zlepšené farmakokinetické vlastnosti a biologickú dostupnosť in vivo.
V ďalšom aspekte predkladaný vynález poskytuje molekulu nukleovej kyseliny kódujúcu variant polypeptidu neublastínu. Nukleová kyselina kódujúca variant polypeptidu neublastínu je výhodne poskytnutá vo vektore, napr. v expresnom vektore. Nukleová kyselina kódujúca variant neublastínu, alebo vektor obsahujúci túto nukleovú kyselinu, môžu byť poskytnuté v bunke. Bunka môže byť napr. cicavčia bunka, bunka húb alebo plesní, bunka kvasiniek, hmyzia bunka alebo bakteriálna bunka. Výhodná cicavčia bunka je bunka vaječníkov čínskeho škrečka („CHO bunka“).
Vynález ďalej poskytuje spôsob prípravy variantu polypeptidu neublastínu spočívajúci v tom, že sa kultivujú bunky obsahujúce nukleovú kyselinu kódujúcu variant neublastínu za podmienok, keď sa exprimuje variant polypeptidu neublastínu. Ak je to nutné, variant polypeptidu neublastínu sa potom môže izolovať. Vynález sa ďalej týka variantu polypeptidu neublastínu produkovaného bunkou, podobne tiež nukleovej kyseliny, vektora, hostiteľskej bunky a spôsobu prípravy polypeptidov opísaných v predkladanej prihláške pre fúzne proteíny (ako je napr. fúzny proteín neublastín-sérový albumín) podľa vynálezu.
Ďalej je predmetom vynálezu kompozícia, ktorá obsahuje polypeptid neublastínu alebo variant polypeptidu neublastínu kondenzovaný s polymérom, ktorý sa v prírode nevyskytuje. Variant polypeptidu neublastínu v kompozícii výhodne obsahuje aminokyselinové sekvencie aspoň na 70 % identické s aminokyselinami 8 až 113 sekvencie SEQ ID NO: 1, za predpokladu, že variant polypeptidu neublastínu obsahuje jeden alebo viac substituovaných aminokyselín vybraných zo skupiny, ktorú tvorí aminokyselina okrem arginínu v polohe 14 v aminokyselinovej sekvencii variantu polypeptidu, aminokyselina okrem arginínu v polohe 39 v aminokyselinovej sekvencii variantu polypeptidu, aminokyselina okrem arginínu v polohe 68 variantu polypeptidu a aminokyselina okrem asparagínu v polohe 95 variantu polypeptidu, keď sú polohy aminokyseliny rátané podľa polypeptidovej sekvencie SEQ ID NO: 1.
Vo výhodnom uskutočnení polymér obsahuje polyalkylénglykolovú skupinu, napr. polyetylénglykolovú skupinu (PEG).
Vo výhodnom uskutočnení je polyalkylénglykolová skupina kondenzovaná s aminoskupinou z polypeptidu neublastínu alebo s lyzínom vo variante polypeptidu neublastínu.
Kondenzácia sa môže uskutočniť prostredníctvom N-hydroxylsukcínimidového (NHS) aktívneho esteru. Aktívny ester môže byť napr. PEG sukcínimidylsukcinát (SS-PEG), sukcínimidylbutyrát (SPB-PEG) alebo
SK 288123 Β6 sukcínimidylpropionát (SPA-PEG).
Polyalkylénglykolová skupina môže byť napr. skupina karboxymetyl-NHS, norleucín-NHS, SC-PEG, trezylátová skupina, aldehydová skupina, epoxidová skupina, karbonylimidazolová skupina alebo PNP karbonátová skupina.
V niektorých uskutočneniach je polyalkylénglykolová skupina kondenzovaná s cysteínom z polypeptidu neublastínu alebo z variantu polypeptidu neublastínu. Kondenzácia sa môže uskutočniť napr. prostredníctvom maleimidovej skupiny, vinylsulfónovej skupiny, haloacetátovej skupiny alebo tiolovej skupiny.
V niektorých uskutočneniach je polypeptid neublastínu alebo variant polypeptidu neublastínu v kompozícii glykozylovaný. Keď je polypeptid neublastín alebo variant polypeptidu glykozylovaný, polymér sa môže kondenzovať k sacharidovej skupine glykozylovaného polypeptidu neublastínu alebo variantu polypeptidu neublastínu. Napríklad polymér sa môže kondenzovať ku glykozylovanému polypeptidu neublastínu alebo variantu polypeptidu neublastínu po oxidácii hydrazolovej skupiny alebo aminoskupiny glykozylovaného polypeptidu neublastínu alebo variantu polypeptidu neublastínu alebo oxidácii reaktívnej skupiny polyméru.
V rôznych uskutočneniach polypeptid neublastínu alebo variant polypeptidu neublastínu obsahuje dve, tri alebo štyri skupiny PEG.
Vo výhodných uskutočneniach polypeptid neublastínu, variant polypeptidu neublastínu alebo polymémy konjugát má dlhší sérový polčas v porovnaní s polčasom polypeptidu alebo variantu polypeptidu bez prítomnosti polyméru.
Vo výhodných uskutočneniach polypeptid neublastínu, variant polypeptidu neublastínu alebo polymémy konjugát v komplexe má fyziologickú aktivitu vybranú zo skupiny aktivít, ktorú tvoria väzba GFRa3, aktivácia RET, normalizácia patologických zmien neurónu alebo zlepšenie prežívania neurónov.
Termín „normalizácia patologických zmien neurónu“ znamená, že konjugát podľa vynálezu indukuje zmenu v jednom alebo vo viacerých z nasledujúcich bunkových parametrov: expresná hladina štrukturálneho proteínu, receptora neurotrofického faktora, iónového kanála alebo neurotransmitera, alebo indukuje zmenu v bunkovej morfológii, v každom prípade tak, aby došlo v podstate k navráteniu tohto parametra na jeho hladinu v neuróne rovnakého alebo podobného fenotypu, ktorý nie je postihnutý ochorením, degeneráciou, napadnutím alebo poranením. Normalizácia patologických zmien neurónu sa môže monitorovať imunohistochemickým spôsobom alebo tým, že sa hodnotia zmeny v hladine sekretovaného produktu alebo tým, že sa zhodnotia in vivo zmeny vo fyziologickom správaní, ktoré sa pripisuje funkcii postihnutých neurónov. Napríklad v prípade patologických zmien asociovaných so syndrómom neuropatickej bolesti sa môže monitorovať bolesť ako napríklad hyperalgézia, hypoalgézia alebo allodynia.
Termín „zlepšenie prežívania neurónov“ znamená predĺženie prežitia postihnutých neurónov v porovnaní s časom prežitia pozorovaným pri zodpovedajúcich neurónoch postihnutých rovnakým typom ochorenia, poškodenia alebo napadnutia, ale neliečených konjugátom neublastínu alebo fúznym proteínom podľa predkladaného vynálezu.
V niektorých uskutočneniach je polymér kondenzovaný na polypeptid v mieste neublastínu, ktoré je N koncom polypeptidu. V iných uskutočneniach je polymér kondenzovaný k polypeptidu v mieste, ktoré nie je koncovou aminokyselinou polypeptidu neublastínu alebo variantu polypeptidu neublastínu.
Vo výhodnom uskutočnení je polymér kondenzovaný na aminokyselinu polypeptidu neublastínu alebo variantu polypeptidu neublastínu, kde je táto aminokyselina vystavená rozpúšťadlu.
Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je polymér kondenzovaný na polypeptid neublastínu alebo variant polypeptidu neublastínu na zvyšku, ktorý je vybraný zo skupiny, ktorú tvorí aminokyselina aminokonca variantu polypeptidu, aminokyselina v polohe 14 v aminokyselinovej sekvencií polypeptidu neublastínu alebo variantu polypeptidu neublastínu, v polohe 39 v aminokyselinovej sekvencií polypeptidu neublastínu alebo variantu polypeptidu neublastínu, v polohe 68 v aminokyselinovej sekvencií polypeptidu neublastínu alebo variantu polypeptidu neublastínu a v polohe 95 v aminokyselinovej sekvencií polypeptidu neublastínu alebo variantu polypeptidu.
Predkladaný vynález ďalej poskytuje farmaceutickú kompozíciu obsahujúcu fyziologicky prijateľné vehikulum obsahujúce prípadne dispergovaný polypeptid neublastínu alebo variant polypeptidu neublastínu, alebo konjugát podľa predkladaného vynálezu.
V ďalšom aspekte predkladaný vynález poskytuje stabilný, vo vode rozpustný komplex kondenzovaného polypeptidu neublastínu alebo variant polypeptidu neublastínu obsahujúci polypeptid neublastín, alebo variant polypeptidu neublastínu kondenzovaný s polyetylénglykolovou skupinou, kde polypeptid neublastín alebo variant polypeptidu neublastínu je kondenzovaný s polyetylénglykolovou skupinou prostredníctvom labilnej väzby. V niektorých uskutočneniach je labilná väzba štiepiteľná biochemickou hydrolýzou, proteolýzou alebo sulfhydrylovým štiepením. Vo výhodnom uskutočnení je labilná väzba štiepiteľná v in vivo podmienkach.
Vynález ďalej poskytuje spôsob prípravy modifikovaného polypeptidu neublastínu, ktorý má predĺženú aktivitu, a to in vitro alebo in vivo, vzhľadom na neublastín divého typu, spočívajúci v tom, že sa pripraví polypeptid neublastínu alebo variant polypeptidu neublastínu a tento polypeptid alebo modifikovaný variant po4 lypeptidu neublastínu sa kondenzuje s polymérom, ktorý sa v prírode prirodzene nevyskytuje, čím sa pripraví kondenzovaná polymérová kompozícia polypeptidu neublastínu.
V ďalšom aspekte sa predkladaný vynález týka liečenia alebo prevencie ochorenia nervového systému u pacienta (napr. človeka), ktoré spočíva v tom, že sa pacientovi, ktorý takúto liečbu potrebuje, podáva terapeuticky účinné množstvo variantu polypeptidu neublastínu, kompozícia obsahujúca polypeptid neublastínu alebo variant polypeptidu neublastínu kondenzovaný k polyméru alebo komplex, ktorý obsahuje stabilný, vo vode rozpustný komplex kondenzovaného polypeptidu neublastínu alebo variant polypeptidu neublastínu, obsahujúci polypeptid neublastínu alebo variant polypeptidu neublastínu kondenzovaný na polyetylénglykolovú skupinu.
Výhodne ochorením nervového systému je ochorenie periférnych nervov, ako je napríklad periférna neuropatia alebo syndróm neuropatickej bolesti. Ľudia sú výhodnými pacientmi.
Podávanie podľa vynálezu môže byť napr. systémové alebo lokálne.
Ak nie je uvedené inak, všetky technické a vedecké termíny použité v tomto texte majú rovnaký význam, ako je význam všeobecne chápaný odborníkom v odbore, do ktorého patrí predkladaný vynález. Aj keď spôsoby a látky podobné alebo ekvivalentné tým, ktoré sú priamo opísané v tomto texte, sa môžu použiť pri realizácii alebo testovaní vynálezu, príklady vhodných spôsobov a látok sú opísané neskôr. Všetky publikácie, patentové prihlášky, patenty a iné odkazy uvedené v tomto texte sú v plnom znení zahrnuté formou odkazu. V prípade konfliktu je rozhodujúci predkladaný opis a v ňom uvedené definície. Navyše všetky uvedené materiály, spôsoby a menovite príklady majú iba ilustratívnu funkciu a nijako neobmedzujú rozsah predkladaného vynálezu.
Ďalšie vlastnosti a výhody vynálezu budú zjavné z nasledujúceho podrobného opisu a pripojených nárokov.
Vynález poskytuje nové varianty polypeptidu neublastínu, ktoré sa môžu modifikovať tak, aby sa zlepšili ich farmakokinetické vlastnosti a biologická dostupnosť. Výhodné varianty polypeptidu neublastínu obsahujú substituované aminokyselinové sekvencie, ktoré uľahčujú kondenzáciu s polymémym činidlom, ako je napríklad polyalkylénglykolový polymér.
Varianty polypeptidu neublastínu
Vynález poskytuje polypeptidy neublastínu, ktoré majú variantné aminokyselinové sekvencie vzhľadom na sekvenciu polypeptidu neublastínu divého typu. Aminokyselinové sekvencie ľudského a myšieho polypeptidu neublastínu sú opísané v publikácii WO00/01815. Príklady variantu polypeptidu neublastínu podľa vynálezu sú uvedené v tabuľke 1.
Výhodne sú zmenené zvyšky vo variante polypeptidu neublastínu zvolené tak, aby sa uľahčila kondenzácia polyméru, ako je napríklad polyalkylénglykolový polymér, v mieste modifikovanej aminokyseliny. Výhodné miesta modifikácie polypeptidu neublastínu sú v úsekoch polypeptidu neublastínu, ktoré sú prístupné rozpúšťadlu. Tieto miesta sa môžu vybrať na základe určenia kryštalickej štruktúry príbuzného neurotrofického faktora, GDNF, ktorého kryštalická štruktúra bola opísaná v Nat. Struct. Biol. 4: 435 - 38, 1997. Vhodné miesta sa môžu tiež vybrať na základe štruktúmo-funkčných informácií získaných výskumom chimémych proteínov persefín/neublastín. Tieto chiméry sú opísané v J. Biol. Chem. 275: 3412 - 20, 2000. Zoznam aminokyselín identifikovaných touto metódou, vystavených rozpúšťadlu alebo exponovaných na povrchu neublastínu, je uvedený v tabuľke 2.
Vynález zahŕňa variant polypeptidu neublastínu, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu aspoň na 70 % identickú s aminokyselinami 8 - 113 zo sekvencie SEQ ID NO: 1, ktorá je uvedená v tabuľke 1. V niektorých uskutočneniach je jeden alebo viac z arginínov v polohe 14, polohe 39, polohe 68, alebo asparagín v polohe 95, v aminokyselinovej sekvencií polypeptidu nahradený inou aminokyselinou s výnimkou arginínu alebo asparagínu. Výhodne je aminokyselina divého typu nahradená lyzínom alebo cysteínom.
Tabuľka 1
AGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRF človek
AGTRSSRARTTDARGCRLRSQLVPVSALGLGHSSDELIRF myš
AGTRSSRARATDARGCRLRSQLVPVSALGLGHSSDELIRF potkan ag—srar—argcrlrsqlvpv-alglgh-sdel-rf kanonická sekvencia
RFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPC človek
RFCSGSCRRARSQHDLSLASLLGAGALRSPPGSRPISQPC myš
RFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRSPPGSRPISQPC potkan rfcsgscrrars-hdlslasllgagalr-ppgsrp-sqpc kanonická sekvencia
CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDHLSATACGCLG CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDHLSATACGCLG crptryeavsfmdvnstwrtvd-lsatacgclg človek (SEQ ID NO:2) myš (SEQ ID NO:3) potkan (SEQ ID NO:4) kanonická sekvencia (SEQ ID NO:1)
Kanonická (consensus) sekvencia:
Ala Gly Xaai Xaa2 Xaa3 Ser Arg Ala Arg Xaa4 Xaa5 Xaa6 Ala Arg Gly Cys
Arg Leu Arg Ser Gin Leu Val Pro Val Xaa7 Ala Leu Gly Leu Gly His Xaa8 Ser
Asp Glu Leu Xaag Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg
Ser Xaaio His Aap Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg
Xaa,i Pro Pro Gly Ser Arg Pro Xaa12 Ser Gin Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg
Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp
Xaan Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly kde
Xaa! je Gly alebo Thr
Xaa2 je Pro alebo Arg
Xaa3 je Gly alebo Ser
Xaa4 je Ala alebo Thr
Xaa5 je Ala alebo Thr
Xaae je Gly alebo Asp
Xaa7 je Arg alebo Ser
Xaa8 je Arg alebo Ser
Xaas je Val alebo íle
Xaan je Pro alebo Gin
Xaan je Pro alebo Ser
Xaa12 je Val alebo íle
Xaa)3 je Arg alebo His
Tabuľka 2 poskytuje zoznam zvyškov a čísel polôh ľudského neublastínu, ktoré sú podľa očakávania exponované na povrchu. Povrchovo exponované zvyšky sa určili tým, že sa skúmala štruktúra potkanieho GDNF diméru tvoreného reťazcom A a B (PDB kód 1AGQ) a určilo sa, či bol zvyšok na povrchu štruktúry. Táto štruktúra sa potom porovnala s priradením sekvencii GDNF a neublastínu podľa publikácie Baloh et al., Neurón, 121, 1291, 1998, aby sa determinovali zodpovedajúce zvyšky v neublastíne. Schéma číslovania je rovnaká, ako je uvedené v tabuľke 1.
Tabuľka 2
Ala n/a
Gly n/a
Gly n/a
Pro n/a
Gly n/a
Ser n/a
Arg n/a
Ala n/a
Arg n/a
Ala n/a
Ala n/a
Gly +
Ala14 Arg +
Gly +
Cys17 Arg +
Leu +
Arg+
Ser +
Gln +
Leu +
Val 24 Pro +
Val 26 Arg +
Ala +
Leu 29 Gly +
Leu +
Gly +
His +
Arg +
Ser35 Asp +
Glu +
Leu +
Val 39 Arg +
Phe41 Arg +
Phe +
Cys 44 Ser +
Gly +
Ser +
Cys48 Arg +
Arg +
Ala 51 Arg +
Ser +
Pro +
His 55 Asp 56 Leu +
Ser58 Leu59 Ala +
Ser +
Leu62 Leu +
Gly +
Ala +
Gly +
Ala +
Leu 70 Pro n/a
Arg n/a
Pro n/a
Pro n/a
Gly +
Ser +
Arg n/a
Pro n/a
Val 77 Ser78 Gin +
Pro80 Cys 81 Cys82 Arg 83 Pro 84 Thr +
Arg +
Tyr +
Glu +
Ala +
Val +
Ser +
Phe92 Met +
Asp +
Val +
Asn +
Ser +
Thr +
Trp +
Arg +
100 Thr +
101 Val 102 Asp +
103 Arg +
104 Leu105 Ser106 Ala107 Thr +
109 Cys 110 Gly +
111 Cys 112 Leu +
113 Gly n/a
SK 288123 Β6 n/a ukazuje, že zvyšky nie sú prítomné v štruktúre GDNF. To je buď z dôvodu návrhu konštruktu, flexibility úseku, alebo inzertov v neublastíne v porovnaní s GDNF (zvyšky 68-71).
- ukazuje zvyšky, ktoré sú ponorené a neležia na povrchu, alebo sú to cysteínové zvyšky zapojené do disulfidickej väzby. Keďže je tento proteín „cysteínový uzol“, veľká časť zvyškov je na povrchu.
+ ukazuje, že tieto zvyšky sú na povrchu v štruktúre GDNF, a preto sa predpokladá, že zodpovedajúce zvyšky v neublastíne sú tiež exponované na povrchu, aj keď slučka obsahujúca zvyšky 66 - 75 je viditeľná iba v jednom z GDNF monomérov (pravdepodobne flexibilná). Táto slučka tiež obsahuje 4 zvyšky ako inzerty v neublastíne v porovnaní s GDNF.
Termíny „identita“ a „homológia“ alebo prípadne „identický“ a „homologický“, ako sa v tomto texte používajú, sú zameniteľné a týkajú sa sekvenčnej podobnosti dvoch polypeptidových molekúl alebo dvoch nukleových kyselín. Keď je poloha v obidvoch porovnávaných sekvenciách obsadená rovnakou bázou alebo aminokyselinovou monomémou podjednotkou (napríklad ak je tá istá poloha v každej z dvoch DNA molekúl obsadená adenínom alebo tá istá poloha v každom z dvoch polypeptidov je obsadená lyzínom), potom sú príslušné molekuly homologické v danej polohe. Homológia medzi dvoma sekvenciami vyjadrená v percentách je fúnkciou počtu zodpovedajúcich alebo homologických polôh spoločných pre obidve sekvencie deleného celkovým počtom porovnávaných polôh x 100. Napríklad ak z 10 polôh v dvoch sekvenciách je 6 zhodných alebo homologických, potom tieto dve sekvencie sú na 60 % homologické. Napríklad DNA sekvencie CTGACT a CAGGTT majú 50 % homológiu (3 z celkom 6 polôh si zodpovedajú). Všeobecne porovnávanie (priradenie) sekvencii sa uskutočňuje s cieľom dosiahnutia maximálnej homológie. Takéto porovnanie sa môže uskutočniť napríklad s použitím spôsobu podľa Needleman et al., J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970), ktorý sa môže realizovať jednoducho počítačovým programom, ako je napr. program Align (DNASTAR, Inc.). „Podobné“ sekvencie sú tie sekvencie, ktoré pri porovnaní majú identické a podobné aminokyselinové zvyšky, keď podobné zvyšky predstavujú konzervatívne substitúcie pre „povolené bodové mutácie“ zodpovedajúcich aminokyselinových zvyškov v porovnaní s referenčnou sekvenciou. V tomto zmysle „konzervatívna substitúcia“ zvyšku v referenčnej sekvencii je substitúcia zvyškom, ktorý je fyzicky alebo fúnkčné podobný zodpovedajúcemu referenčnému zvyšku, napr. ktorý má podobnú veľkosť, tvar, elektrický náboj, chemické vlastnosti, vrátane schopnosti vytvárať kovalentné alebo vodíkové väzby a pod. Teda „konzervatívne substituovaný variant“ sekvencie je taká sekvencia, ktorá sa líši od referenčnej sekvencie alebo sekvencie divého typu tým, že je tu prítomná jedna alebo viac konzervatívnych substitúcií alebo povolených génových mutácií.
Vo výhodnom uskutočnení je polypeptid podľa vynálezu na 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % alebo 99 % identický s úsekom aminokyselín 8 - 113 zo sekvencie SEQ ID NO: 1. V niektorých uskutočneniach aminokyselinová sekvencia variantu polypeptidu neublastínu zahrnuje prirodzene sa vyskytujúce aminokyselinové sekvencie potkanieho, ľudského alebo myšieho polypeptidu neublastínu v úseku aminokyselín 1 - 94 a 96 -113 variantu polypeptidu neublastínu, napr. polypeptid má aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2, 3 alebo 4 v týchto uvedených polohách.
Variant polypeptidu neublastínu, ktorý sa líši sekvenčne od sekvencii uvedených ako sekvencie SEQ ID NO: 1 až 4 môže obsahovať jednu alebo viac konzervatívnych substitúcií aminokyselín. Alternatívne, alebo okrem toho, sa variant polypeptidu neublastínu môže líšiť v jednej alebo viacerých nekonzervatívnych aminokyselinových substitúciách alebo deléciach, alebo inzerciách. Výhodne, substitúcia, inzercia alebo delécia nenarušujú biologickú aktivitu izolovanej bielkoviny. Konzervatívne substitúcie typicky zahrnujú substitúcie jednej aminokyseliny za inú aminokyselinu s podobnými vlastnosťami, napríklad substitúcie v rámci nasledujúcich skupín: valín, alanín a glycín, leucín, valín a izoleucín, kyselina asparágová a kyselina glutámová, asparagín a glutamát, serín, cysteín a treonín, lyzín a arginín, a fenylalanín a tyrozín.
K nepolámym hydrofóbnym aminokyselinám patrí alanín, leucín, izoleucín, valín, prolín, fenylalanín, tryprofán a metionín. Poláme neutrálne aminokyseliny zahŕňajú glycín, serín, treonín, cysteín, tyrozín, asparagín a glutamín. Pozitívne nabité (bázické) aminokyseliny zahŕňajú arginín, lyzín a histidín. Záporne nabité (kyslé) aminokyseliny zahŕňajú kyselinu asparágovú a kyselinu glutámovú. Ktorákoľvek substitúcia jedného člena uvedenej polárnej, bázickej alebo kyslej skupiny iným členom z rovnakej skupiny je považovaná za konzervatívnu substitúciu.
Ďalšie substitúcie môžu byť odborníkom ľahko identifikované. Napríklad pre aminokyselinu alanín sa vhodná substitúcia môže vybrať z ktorejkoľvek z nasledujúcich aminokyselín: D-alanín, glycín, beta-alanín, L-cysteín a D-cysteín. Lyzín sa môže nahradiť ktoroukoľvek z aminokyselín: D-lyzín, arginín, D-arginín, homo-arginín, metionín, D-metionín, omitín alebo D-omitín. Všeobecne substitúcie vo fúnkčné dôležitom úseku, pri ktorých sa môže očakávať indukcia zmeny vo vlastnostiach izolovaného polypeptidu, sú tie, kde: (i) polárny zvyšok, napr. serín alebo treonín, je nahradený alebo nahradí hydrofóbny zvyšok, napr. leucín, izoleucín, fenylalanín alebo alanín, (ii) cysteínový zvyšok je nahradený alebo nahradí ktorýkoľvek iný zvyšok, (iii) s elektropozitívnym bočným reťazcom, napr. lyzín, arginín alebo histidín, je nahradený alebo nahradí zvyšok s elektronegatívnym bočným reťazcom, napr. kyselina glutámová alebo kyselina asparágová, alebo (iv) zvyšok s objemným bočným reťazcom, napr. fenylalanín, je nahradený alebo nahradí zvyšok, ktorý nemá takýto bočný reťazec, napr. glycín. Pravdepodobnosť, že jedna z predchádzajúcich nekonzervatívnych substitúcií môže zmeniť funkčné vlastnosti proteinu, je tiež vo vzťahu k polohe substitúcie vzhľadom na funkčne dôležité úseky proteinu: niektoré nekonzervatívne substitúcie môžu mať teda malý alebo nulový vplyv na biologické vlastnosti.
Predkladaný vynález ďalej poskytuje multiméme polypeptidy, ktoré obsahujú variant polypeptidu neublastínu. Multiméme polypeptidy sú výhodne poskytnuté ako purifikované multiméme polypeptidy. K príkladom multimémych komplexov patria napr. diméme komplexy. Multiméme komplexy sa môžu poskytnúť ako heteroméme alebo ako homoméme komplexy. Takže multimémy komplex môže byť heterodimémy komplex obsahujúci jeden variant polypeptidu neublastínu a jeden nonvariantný neublastín alebo heterodimémy komplex obsahujúci dva alebo viac variantov polypeptidu neublastínu.
V niektorých uskutočneniach vynálezu sa variant polypeptidu neublastínu viaže na GFRa3. Výhodne, väzba variantu polypeptidu neublastínu stimuluje fosforyláciu RET polypeptidu. Aby sa určilo to, či sa polypeptid viaže na GFRa3, môžu sa uskutočniť testy, ako boli opísané v publikácii W000/01815. Napríklad prítomnosť neublastínu v supematante média CHO bunkovej línie sa môže zistiť s použitím modifikovaného testu ternámych komplexov podľa Sanicola et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94: 6238). V tomto teste sa hodnotí schopnosť GDNF-podobných molekúl sprostredkovať väzbu medzi extracelulámou doménou RET a rôznymi koreceptormi, GFRal, GFRAa2 a GFRAa3. Rozpustné formy RET a ko-receptory sú generované ako fúzne proteiny. Fúzny protein medzi extracelulámou doménou potkanej RET a placentálnou alkalickou fosfatázou z (RET-AP) a fúzny protein medzi extracelulámou doménou potkanieho GFRa-1 (opísaný v publikácii W097/44356, 27. novembra 1997, v tomto texte zahrnutá formou odkazu) a Fc doménou ľudského IgGl (rGFR(al-IS) už sú opísané (Sanicola et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 6238).
V niektorých uskutočneniach variant polypeptidu neublastínu zlepšuje prežívanie neurónov alebo normalizuje patologické zmeny v neurónoch, alebo oboje. Testy na stanovenie toho, či polypeptid zlepší prežitie neurónu alebo normalizuje patologické zmeny neurónu, sú opísané napr. v publikácii W000/01815. Výhodne neurón je senzorický neurón, autonómny neurón alebo dopaminergný neurón.
Syntéza a izolácia variantu polypeptidu neublastínu
Varianty polypeptidu neublastínu sa môžu izolovať metódami, ktoré sú odborníkom známe. Prirodzene sa vyskytujúci polypeptid neublastín sa môže izolovať z bunkových alebo tkanivových zdrojov vhodným purifikačným postupom, s využitím štandardných postupov purifikácie proteinov. Alternatívne, varianty polypeptidu neublastínu sa môžu syntetizovať chemicky s využitím štandardných postupov syntézy peptidov. Syntéza krátkych aminokyselinových sekvencii je v odbore dobre známa, pozri napr. Stewart et al., Solid Phase Peptid Synthesis (2d ed., 1984).
V ďalšom uskutočnení je variant polypeptidu neublastínu pripravený technikou rekombinantnej DNA. Napríklad molekula nukleovej kyseliny kódujúcej variant polypeptidu neublastínu sa môže vložiť do vektora, napr. do expresného vektora, a nukleová kyselina je takto vnesená do bunky. Vhodné bunky zahŕňajú napr. cicavčie bunky (ako napríklad ľudské bunky alebo bunky vaječníkov Čínskeho škrečka), hubové bunky, kvasinkové bunky, hmyzie bunky a bakteriálne bunky. Keď sa variant exprimuje v rekombinantnej bunke, bunka je výhodne kultivovaná v podmienkach vhodných na expresiu variantu polypeptidu neublastínu. Variant polypeptidu neublastínu sa môže potom získať/izolovať z bunkovej suspenzie, ak je to nutné. „Získať“ alebo „izolovať“ v tomto prípade znamená, že variant polypeptidu je izolovaný od tých súčastí buniek alebo kultivačného média, ktoré boli v preparáte prítomné pred izolačným postupom. Izolačný postup môže zahŕňať jeden alebo viac krokov purifikácie alebo znovuposkladania molekuly proteinu („refolding“).
Varianty polypeptidu neublastínu sa môžu konštruovať s využitím ktorýchkoľvek metód známych v odbore. Jedným takýmto spôsobom je miestne cielená mutagenéza, keď sa špecifický nukleotid (alebo, ak je to nutné, malý počet špecifických nukleotidov) zamení, aby došlo k zmene jednej aminokyseliny (alebo, ak je to potrebné, malého počtu dopredu určených aminokyselinových zvyškov) v kódovanom polypeptide neublastínu. Miestne cielená mutagenéza je široko používaná metóda a pre odborníka je rutinným postupom. K dispozícii je tiež mnoho komerčne dostupných súprav pre miestne cielenú mutagenézu. Jedna takáto súprava je súprava „Transformer Site Directed Mutagenesis“ od firmy Clontech Laboratory (Palo Alto, Calif.).
Pri realizácii predkladaného vynálezu sa používajú, pokiaľ nie je špecificky uvedené inak, zvyčajné metódy bunkovej biológie, tkanivových kultúr, molekulárnej biológie, mikrobiológie, rekombinantnej DNA, proteínovej chémie a imunológie, ktoré sú odborníkom známe. Takéto metódy sú dostatočne opísané v odbornej literatúre (pozri napríklad Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition; Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volumes I and II, (D.N. Glover, ed), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M. J. Gait, ed.), 1984; U. S. Patent No. 4,683,195 (Mullis et al.,); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Haines and S. J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (B. D. Hames and S. J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells W. Freshney, ed). Alan R. Liss, in., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, 1RL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (13. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155 (Wu et al., eds), Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos, eds.), 1987, Cold Spring Harbor
SK 288123 Β6
Laboratory; Immunochemical Methods in Celí and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.), Academic Press, London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.
Fúzne proteíny s variantom neublastínu
Ak je to žiaduce, variant polypeptidu neublastínu sa môže poskytnúť vo forme fúzneho proteínu. Fúzne polypeptidy derivované z proteínov podľa vynálezu tiež zahŕňajú rôzne štrukturálne formy primárneho proteínu, ktorý si zachováva svoju biologickú aktivitu. Termín „fúzia“, ako sa v tomto texte používa, sa týka kolineámej, kovalentnej väzby dvoch alebo viacerých proteínov alebo ich fragmentov prostredníctvom ich individuálnych peptidových „kostier“, najvýhodnejšie pomocou génovej expresie polynukleotidovej molekuly kódujúcej príslušné proteíny v zhodnom čítacom rámci („in frame“). Je výhodné, keď proteíny alebo ich fragmenty sú z rôznych zdrojov. Výhodné fúzne proteíny zahŕňajú variant proteínu neublastínu alebo jeho fragment kovalentne spojený s druhou skupinou, ktorá nie je variantom neublastínu. Výhodne druhá skupina pochádza z polypeptidu, ktorý existuje ako monomér a ktorý je dostatočný na to, aby polypeptidu neublastínu poskytol zvýšenú rozpustnosť a/alebo biologickú dostupnosť.
Napríklad fúzia „variant neublastínu/ľudský sérový albumín“ je protein obsahujúci variant polypeptidu neublastínu podľa vynálezu alebo jeho fragment, ktorého N-koniec a C-koniec je spojený v zhodnom čítacom rámci s polypeptidom ľudského sérového albumínu (pozri Syeda et al, Blood, 1997, 89: 3243 a Yeh et al., P. N. A. S. USA 1992, 89: 1904) a US Patenty č. 5 876 969 a 5 302 697. Termín „fuzny protein“ navyše obsahuje variant neublastínu chemicky spojený prostredníctvom mono- alebo heterofúnkčnej molekuly s druhou skupinou, ktorá nie je variantom proteínu neublastínu, a je vytvorený de novo z purifikovaného proteínu, ako je opísané ďalej.
Fúzie neublastín-sérový albumín sa môžu konštruovať s využitím metód, ktoré sú odborníkom známe. Ktorékoľvek z mnohých sieťovacích činidiel („cross-linkers“) obsahujúcich zodpovedajúce amín-reaktívne a tiol-reaktívne skupiny, sa môže použiť na naviazanie neublastínu na sérový albumín. Príklady vhodných sieťovacích činidiel (linkerov) zahŕňajú amín-reaktívne činidlá, ktoré vnášajú tiol-reaktívnu maleimidovú skupinu. Patria sem napr. SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS alebo GMBS. Iné vhodné linkery vnášajú tiol-reaktívnu haloacetátovú skupinu. K týmto patria napr. SBAP, SIA, SIAB. Činidlá, ktoré poskytujú chránenú alebo nechránenú tiolovú skupinu pre reakcie so sulfhydrylovou skupinou na vytvorenie redukovateľnej väzby, sú napr. SPDP, SMPT, SATA alebo SATP, pričom všetky činidlá sú komerčne dostupné (napr. od firmy Pierce Chemicals). Odborník si môže ľahko navrhnúť alternatívnu stratégiu na spojenie N-konca neublastínu so sérovým albumínom.
Dá sa tiež ľahko predstaviť si, že odborník môže pripraviť konjugáty so sérovým albumínom, ktoré nie sú zacielené na N-koniec NBN alebo na tiolové skupiny sérového albumínu. Ak je to nutné, fúzia NBN-sérový albumín sa môže pripraviť s využitím techniky génového inžinierstva, keď NBN je fúzovaný s génom pre sérový albumín na svojom N-konci, C-konci alebo na obidvoch koncoch.
Je možné predpokladať, že podobnou stratégiou sa môže pripraviť akýkoľvek NBN konjugát, ktorý sa vyznačuje predĺženým biologickým polčasom pri zvieratách (aj u ľudí).
Ďalšie deriváty variantu neublastínu zahŕňajú kovalentné alebo agregované konjugáty variantu neublastínu alebo jeho fragmentu s inými proteínmi alebo polypeptidmi, ako napríklad syntézou v rekombinantnej kultúre ako dodatočné N-konce alebo C-konce. Napríklad kondenzovaný peptid môže byť signálny (alebo vedúci) polypeptid sekvencie v N-koncovom úseku proteínu, ktorý kotranslačne alebo posttranslačne riadi prenos proteínu z miesta jeho syntézy na miesto vnútri alebo mimo bunkovej membrány alebo steny (napr. vedúca sekvencia alfa-faktora pri kvasinkách). Receptorové proteíny neublastínu môžu obsahovať peptidy pridané na uľahčenie purifikácie alebo identifikáciu z neublastínu (napr. fúzia histidín/neublastín). Aminokyselinová sekvencia neublastínu sa môže tiež spojiť s peptidom Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (Hopp et al., Biotechnology 6: 1204, 1988.) Uvedená sekvencia je veľmi antigénna a poskytuje epitop reverzibilne sa viažuci na špecifickú monoklonálnu protilátku, umožňujúcu rýchly test a ľahkú purifikáciu exprimovaného rekombinantného proteínu.
Táto sekvencia je navyše špecificky štiepená bovinnou mukotickou enterokinázou vo zvyšku bezprostredne nasledujúcom po páre Asp-Lys.
Variant polypeptidu neublastínu kondenzovaný na polymér
Ak je to potrebné, jedna polyméma molekula sa môže použiť na kondenzáciu s polypeptidom neublastínu, ale do úvahy prichádza aj kondenzácia viac ako s jednou molekulou polyméru. Kondenzované neublastínové kompozície podľa vynálezu majú použitie tak v in vitro ako aj v in vivo aplikáciách. Ďalej je zrejmé, že kondenzovaný polymér môže využiť akékoľvek iné skupiny alebo inú kondenzovanú molekulu, v závislosti od účelu aplikácie. Napríklad pri niektorých aplikáciách môže byť užitočné kovalentne naviazať k polyméru funkčné skupiny poskytujúce rezistenciu proti degradácii UV žiarením, alebo antioxidačné vlastnosti, alebo ešte ďalšie vlastnosti alebo charakteristiky polyméru. Ako ďalší príklad môže byť výhodné v niektorých ap9
SK 288123 Β6 likáciách funkcionalizovať polymér tak, aby získal reaktívny alebo zosieťovateľný charakter, aby sa tak zosilnili rôzne vlastnosti výslednej kondenzovanej zlúčeniny (konjugátu). Teda polymér môže obsahovať akékoľvek funkčné skupiny, opakujúce sa skupiny, väzbové skupiny alebo iné konštitutívne štruktúry, ktoré nezabraňujú biologickej účinnosti kondenzovaného neublastínového muteínu na zamýšľané použitie.
V príkladoch a reakčných schémach sú na ilustráciu uvedené niektoré polyméry, ktoré sa môžu použiť na dosiahnutie požadovaných vlastností. Pri aplikáciách s kovalentne naviazaným peptidom sa môže polymér funkcionalizovať a potom kondenzovať k voľnej aminoskupine (aminoskupinám) peptidu (peptidov) za vzniku labilnej väzby.
V niektorých uskutočneniach vynálezu je polypeptid neublastín naviazaný k polyméru prostredníctvom koncovej reaktívnej skupiny na polypeptide. Inak, alebo ešte navyše, polypeptid neublastín sa môže naviazať cez aminoskupinu bočného reťazca interného lyzínového zvyšku, napr. lyzínového zvyšku vneseného do aminokyselinovej sekvencie prirodzene sa vyskytujúceho polypeptidu neublastínu. Takže kondenzácia môže byť tiež rozvetvená z inej ako koncovej reaktívnej skupiny. Polymér s reaktívnou skupinou (skupinami) sa nazýva v tomto texte „aktivovaný polymér“. Reaktívna skupina selektívne reaguje s voľnou aminoskupinou alebo inou reaktívnou skupinou proteínu.
Naviazanie sa môže vyskytovať v aktivovanom polyméri na akejkoľvek dostupnej aminoskupine neublastínu, ako je napr. alfa-aminoskupina alebo epsilon-aminoskupina lyzínového zvyšku alebo zvyškov zavedených do aminokyselinovej sekvencie polypeptidu neublastínu, alebo jeho variantu. Ako miesta pripojenia môžu tiež slúžiť voľné karboxylové skupiny, vhodne aktivované karbonylové skupiny, hydroxylové skupiny, guanidylové skupiny, imidazolové skupiny, oxidované cukomé skupiny a merkapto skupiny neublastínu (ak sú prístupné).
Všeobecne sa použije približne 1,0 až 10 mol aktivovaného polyméru na 1 mol proteínu, v závislosti od koncentrácie proteínu. Konečné množstvo je rovnováhou medzi maximalizáciou rozsahu reakcie a súčasne minimalizáciou nešpecifických modifikácií produktu a, súčasne, definovaním takého chemického postupu, ktorý bude udržiavať optimálnu aktivitu, pri súčasnej optimalizácii, ak je možné, polčasu proteínu. Výhodne sa zachová približne aspoň 50 % biologickej aktivity proteínu, a najvýhodnejšie sa zachová takmer 100 % biologickej aktivity proteínu.
Reakcia sa môže uskutočňovať ktorýmkoľvek vhodným spôsobom známym pre reakcie biologicky účinných látok s inertnými polymérmi, výhodne pri pH približne 5 až 8, napr. pH 5, 6, 7 alebo 8, ak reaktívne skupiny sú na alfa-aminoskupinách N-konca. Všeobecne postup zahŕňa prípravu aktivovaného polyméru a potom reakciu proteínu s aktivovaným polymérom za vzniku rozpustného proteínu vhodného na formuláciu. Skôr uvedené modifikačné reakcie sa môžu uskutočniť niekoľkými rôznymi spôsobmi, ktoré môžu zahrnovať jeden alebo viac krokov.
Polymér sa môže kondenzovať na variant polypeptidu neublastínu s použitím metód, ktoré sú odborníkom známe. Napríklad v jednom uskutočnení, polyalkylénglykolová skupina je kondenzovaná na lyzínovú skupinu polypeptidu neublastínu alebo variantu polypeptidu neublastínu. Naviazanie na lyzín sa môže uskutočniť s aktívnym esterom N-hydroxylsukcínimidu (NHS), napríklad PEG-sukcínimidylsukcinátom (SS-PEG) a sukcínimidylpropionátom (SPA-PEG). Vhodné polyalkylénglykolové skupiny zahŕňajú napr. skupinu karboxymetyl-NHS, norleucín-NHS, SC-PEG, trezylátovú skupinu, aldehydovú skupinu, epoxidovú skupinu, karbonylimidazolovú skupinu a PNP-karbonátovú skupinu.
Sukcínimidylová skupina sa môže nahradiť ďalšími amín-reaktívnymi PEG linkermi. Patria k nim napr. izotiokyanáty, nitrofenylkarbonáty, epoxidy a karbonáty benzotriazolu. Podmienky sú výhodne zvolené tak, aby sa maximalizovala selektivita a rozsah reakcie. Môžu sa použiť lineárne a rozvetvené formy PEG, a tiež ostatné alkylové formy. Dĺžka PEG môže byť rôzna. Najbežnejšie formy majú veľkosť 2K až 100K. Opísané príklady ukazujú, že cielená pegylácia (pegylation) N-konca neovplyvňuje farmakokinetické vlastnosti, a skutočnosť, že si látka uchováva svoje fyziologické funkcie, ukazuje, že modifikácia miesta alebo miest opísaných v predkladanej prihláške nemajú škodlivý vplyv. Teda pri vytváraní mutantných foriem NEN, ktoré by mohli poskytovať ďalšie miesta pre pripojenie tým, že sa vkladajú lyzínové zvyšky, je považovaná za prijateľnú pravdepodobnosť, že tieto formy by boli pegylované tak na lyzíne ako aj na N-konci.
Ak je to nutné, variant polypeptidu neublastínu môže obsahovať „prívesok“ („tag“), napr. značku, ktorá sa môže následne uvoľniť proteolýzou. Takže lyzínové skupiny môžu byť selektívne modifikované prvou reakciou variantu s his-značkou („his-tag“) s linkerom s nízkou molekulovou hmotnosťou, ako je napr. Trautove činidlo (Pierce), ktoré reaguje tak s lyzínom ako aj s N-koncom, a potom uvoľnením his-značky. Polypeptid bude potom obsahovať voľnú SH skupinu, ktorá sa môže selektívne modifikovať s hlavnou tiolreaktívnou skupinou obsahujúcou PEG, ako je napr. maleimidová skupina, vinylsulfónová skupina, haloacetátová skupina alebo voľná, alebo chránená skupina SH.
Trautove činidlo sa môže nahradiť akýmkoľvek linkerom, ktorý pripraví špecifické miesto na pripojenie PEG. Napríklad Trautove činidlo sa môže nahradiť SPDP, SMPT, SATA alebo SATP (všetky dostupné od firmy Pierce). Podobne môže reagovať protein s amín-reaktívnym linkerom, ktorý vnáša maleimidovú skupinu (napríklad SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS alebo GMBS), haloacetátovú skupinu (SBAP, SIA, SIABA) alebo vinyl-sulfónovú skupinu, a výsledný produkt reaguje s PEG, ktorý obsahuje voľnú skupinu SH. Jediným limitom veľkosti použitého linkera je to, aby neblokoval následné odstránenie N-koncovej značky.
V inom uskutočnení je polyalkylénglykolová skupina kondenzovaná k cysteínovej skupine polypeptidu neublastínu alebo variant polypeptidu neublastínu. Kondenzácia sa môže uskutočniť napr. s využitím maleimidovej skupiny, vinylsulfónovej skupiny, haloacetátovej skupiny a tiolovej skupiny.
Jedno alebo viac miest vo variante polypeptidu neublastínu sa môže kondenzovať k polyméru. Napríklad jedna, dve, tri, štyri alebo päť PEG skupín sa môže pripojiť k polyméru. V niektorých uskutočneniach je PEG skupina pripojená na aminokoniec a/alebo na aminokyseliny 14, 39, 68 a 95 polypeptidu neublastínu, pri číslovaní polôh podľa tabuľky 1.
Vo výhodnom uskutočnení má variant polypeptidu neublastínu v prípravku dlhší sérový polčas vzhľadom na polčas variantu polypeptidu bez prítomnosti polyméru. Alternatívne, alebo navyše, variant polypeptidu neublastínu v prípravku sa viaže na GFRa3, aktivuje RET, normalizuje patologické zmeny neurónov alebo zlepšuje prežitie neurónov, alebo prejavuje kombináciu týchto fyziologických funkcií.
Vo výhodnom uskutočnení je prípravok poskytnutý ako stabilný, vo vode rozpustný komplex kondenzovaného polypeptidu neublastínu alebo variantu polypeptidu neublastínu obsahujúci polypeptid neublastín alebo variant polypeptidu neublastínu kondenzovaný k polyetylénglykolovej skupine. Ak je to nutné, polypeptid neublastínu alebo variant polypeptidu neublastínu sa môže kondenzovať k polyetylénglykolovej skupine labilnou väzbou. Labilná väzba sa môže štiepiť napr. biochemickou hydrolýzou, proteolýzou alebo sulfhydrylovým štiepením. Napríklad väzba sa môže štiepiť v in vivo (fyziologických) podmienkach.
Farmaceutické kompozície obsahujúce variant neublastínu kondenzovaný s polymérom
Predkladaný vynález poskytuje ďalej farmaceutickú kompozíciu obsahujúcu variant neublastínu kondenzovaný s polymérom. „Farmaceutická kompozícia“ je podľa predkladaného opisu definovaná ako kompozícia obsahujúca proteín neublastínu podľa vynálezu alebo jeho kondenzovanú formu (konjugát), dispergované vo fyziologicky prijateľnom vehikule, voliteľne obsahujúca jednu alebo viac ďalších fyziologicky kompatibilných zložiek. Farmaceutická kompozícia teda môže obsahovať excipienty, ako je napr. voda, jeden alebo viac minerálov, sacharidov, detergentov a jeden alebo viac nosičov, ako je napr. inertný proteín (napr. heparín alebo albumín).
Konjugáty polymér-neublastín podľa vynálezu sa môžu podávať samotné (per se), a tiež vo forme farmaceutický prijateľných esterov, solí a iných fyziologicky funkčných derivátov. V takýchto farmaceutických a liekových formuláciách je použitý konjugát variantu neublastínu výhodne spoločne s jedným alebo viacerými farmaceutický prijateľnými nosičmi a voliteľne s akoukoľvek ďalšou terapeutickou zložkou.
Nosič (nosiče) musí byť farmaceutický prijateľný nosič v tom zmysle, že musí byť kompatibilný s ostatnými zložkami formulácie a nesmie mať škodlivé účinky pre príjemcu. Variant neublastínu je poskytnutý v množstve, ktoré je účinné na dosiahnutie požadovaného farmakologického účinku alebo lekársky prospešného účinku, ako bude ďalej opísané v tomto texte, a v množstve vhodnom na dosiahnutie požadovanej biologicky dostupnej dávky alebo koncentrácie in vivo.
Formulácie podľa vynálezu zahŕňajú formulácie vhodné na parenterálne, a tiež iné ako parenterálne podávanie, a špecifické spôsoby podávania zahŕňajú perorálne, rektálne, bukálne, topické, nazálne, očné, subkutánne, intramuskuláme, intravenózne, transdermálne, intratekálne, intraartikuláme, intraarteriálne, subarachnoidálne, bronchiálne, lymfatické, vaginálne a intramatemicové podávanie. Výhodné sú formulácie vhodné na aerosólové a parenterálne podávanie, tak lokálne ako aj systémové.
Keď sa použije variant neublastínu vo formulácii obsahujúcej kvapalný roztok, formulácia sa môže výhodne podávať perorálne, bronchiálne alebo parenterálne. Keď sa neublastín použije v kvapalnej suspenznej formulácii alebo sa formuluje ako prášok v biologicky kompatibilnom nosiči, formulácia sa môže výhodne podávať perorálne, rektálne alebo bronchiálne. Inak sa môže podávať nazálne alebo bronchiálne, prostredníctvom nebulizácie prášku v nosičovom plyne za vzniku plynnej disperzie prášku, ktorú pacient vdychuje z dýchacieho okruhu obsahujúceho vhodné nebulizačné zariadenie.
Formulácie obsahujúce proteíny podľa predkladaného vynálezu sa môžu výhodne prezentovať v jednotkových liekových formách a môžu sa pripraviť akoukoľvek metódou dobre známou v odbore farmácie. Takéto metódy všeobecne zahŕňajú krok zmiešania účinnej zložky alebo zložiek s nosičom, ktorý predstavuje jednu alebo viac druhotných zložiek.
Typicky sa formulácia pripravuje uniformným a dokonalým zmiešaním účinnej zložky s tekutým nosičom alebo jemne mletým tuhým nosičom, alebo s obidvoma, a potom, ak je to nutné, formuláciou produktu do požadovanej liekovej formy.
Formulácie podľa predkladaného vynálezu vhodné na perorálne podávanie sa môžu prezentovať ako jednotkové liekové formy, napríklad tobolky, oplátky s práškom, tablety alebo pastilky, keď každá z nich obsahuje dopredu určené množstvo účinnej zložky vo forme prášku alebo granulátu, alebo suspenzie vo vodnej alebo nevodnej kvapaline, ako je napríklad sirup, elixír, emulzia alebo nálev.
SK 288123 Β6
Formulácie vhodné na parenterálne podávanie vhodne zahŕňajú sterilný vodný prípravok účinného konjugátu, ktorý je výhodne izotonický s krvou príjemcu (napr. fyziologický roztok). Takáto formulácia môže zahŕňať suspendujúce činidlá a zahusťovadlá alebo iné mikročasticové systémy, ktoré sú skonštruované s cieľom smerovať zlúčeninu na zložky krvi alebo do jedného, či viac orgánov. Formulácie môžu byť prezentované v jednodávkovej liekovej forme alebo viacdávkovej liekovej forme.
Nazálny sprej obsahuje purifikovaný vodný roztok účinného konjugátu s konzervačnými a izotonickými činidlami. Takéto formulácie majú výhodne upravené pH a izotonický stav tak, aby boli kompatibilné s nazálnou sliznicou.
Formulácie na rektálne podávanie sa môžu prezentovať ako čapík s vhodným nosičom, ako je napr. kakaové maslo, hydrogenáciou stužené tuky alebo mastné karboxylové kyseliny.
Očné formulácie, ako sú napríklad očné kvapky, sa pripravujú podobným spôsobom ako formulácie pre nazálny sprej, s výnimkou toho, že pH a izotonické faktory sú výhodne upravené pre oko.
Topické formulácie obsahujú konjugáty podľa vynálezu rozpustené alebo suspendované v jednom alebo viacerých médiách, ako je napríklad minerálny olej, petrolej, polyhydroxyalkoholy alebo iná báza vhodná pre topické farmaceutické formulácie.
Okrem skôr uvedených zložiek formulácie podľa predkladaného vynálezu môžu obsahovať jednu alebo viac ďalších zložiek vybraných zo skupiny obsahujúcej riedidlá, pufre, aromatizačné činidlá, rozvoľňovadlá, povrchovo aktívne látky, zahusťovadlá, lubrikanty, konzervačné činidlá (obsahujúce antioxidanty) a pod. Všetko skôr uvedené platí tiež pre fuzne proteíny neublastínu podľa vynálezu (napr. fúzia neublastín-HSA).
Teda predkladaná prihláška poskytuje vhodný fuzny proteín na in vitro stabilizáciu konjugátu variantu neublastínu v roztoku, ako jedno výhodné ilustračné uskutočnenie vynálezu. Fúzne proteíny sa môžu použiť napríklad na zvýšenie rezistencie proti enzýmovému rozkladu variantu polypeptidu neublastínu, a poskytujú tak prostriedok na zlepšenie skladovateľnosti, stability pri skladovaní pri teplote miestnosti a pod. Je jasné, že to isté platí tiež pre fúzne proteíny neublastín-sérový albumín (vrátane fuznych proteínov ľudský neublastín-ľudský sérový albumín) podľa vynálezu.
Liečenie
Varianty polypeptidu neublastínu, a tiež ich fuzne proteíny alebo konjugáty, sa môžu použiť na liečenie alebo zmiernenie ochorení žijúceho organizmu zvieraťa, výhodne cicavca, výhodnejšie primáta vrátane človeka, ktorého ochorenie alebo patologický stav reaguje na aktivitu neurotrofického činidla.
Kompozície podľa vynálezu sa môžu použiť priamo, napr. prostredníctvom injekcie, implantátu alebo požitím farmaceutických kompozícii, na liečenie patologického stavu vnímavého k polypeptidu neublastínu. Kompozície podľa vynálezu sa môžu použiť na zmiernenie patologického stavu alebo ochorenia žijúceho organizmu zvieraťa, vrátane človeka, ktorého ochorenie alebo patologický stav reaguje na aktivitu neurotrofického činidla. Patologický stav alebo ochorenie môže byť konkrétne poškodenie nervového systému spôsobené traumou, chirurgickým výkonom, ischémiou, infekciou, metabolickou poruchou, nedostatkom živín, malignitou alebo toxickými činidlami a genetickou alebo idiopatickou príčinou.
Poškodenie sa môže konkrétne vyskytnúť na senzorických neurónoch alebo gangliových bunkách sietnice, vrátane neurónov v dorzálnom koreňovom gangliu spinálnej miechy alebo v ktoromkoľvek z nasledujúcich tkanív: gangliá kolienka, skalné a dolné gangliá, vestibuloakustický komplex ôsmeho kraniálneho nervu, ventrolaterálny zväzok maxilomandibulámeho laloku trojklanného ganglia a mezencefalické trojklanné jadro.
Vo výhodnom uskutočnení spôsobu podľa vynálezu je ochorenie alebo chorobný stav neurodegeneratívne ochorenie zahŕňajúce lézie a traumy neurónov, ako sú traumatické lézie periférnych nervov, meduly a/alebo miechy, ischemické poškodenie cerebrálnych neurónov, neuropatia a osobitne periférna neuropatia, trauma alebo poškodenie periférnych nervov, ischemická mŕtvica, akútne poškodenie mozgu, akútne poškodenie miechy, nádory nervového systému, sclerosis multiplex, následky pôsobenia neurotoxínov, metabolických porúch, ako napr. diabetu alebo renálnej dysfunkcie, a poškodenie spôsobené infekčnými agens, neurodegeneratívne ochorenie vrátane Alzheimerovej choroby, Huntingtonovej choroby, Parkinsonovej choroby, Parkinson-Plus syndrómu, progresívne supranukleáme ochrnutie (Syndróme Steele-Richardson-Olszewski), olivopontocerebeláma atrofia (OPCA), Shy-Dragerov syndróm (viacnásobná systémová atrofia), Guamanianov komplex parkinsonickej demencie, amyotrofická laterálna skleróza alebo akékoľvek iné vrodené alebo neurodegeneratívne ochorenie a poškodenie pamäti súvisiace s demenciou.
Vo výhodnom uskutočnení sa môžu liečiť neuróny zmyslového a/alebo autonómneho systému. Konkrétne napríklad sa môžu liečiť nociceptívne a mechanoreceptívne neuróny, konkrétnejšie neuróny delta-vlákna a C-vlákna. Okrem toho sa môžu liečiť sympatické a parasympatické neuróny autonómneho systému.
Ďalšie výhodné uskutočnenie vynálezu sa týka liečenia motorických neurónov pri ochorení, ako je napríklad amyotrofická laterálna skleróza („ALS“) a spinálna svalová atrofia. V ešte ďalšom výhodnom uskutočnení sa môžu použiť molekuly neublastínu podľa predkladaného vynálezu na zlepšenie zotavenia nervov po traumatickom stave. Inak, alebo navyše k skôr uvedenému, nervový vodivý kanál s matricou obsahujúcou variant polypeptidu neublastínu alebo fuzované alebo konjugované varianty polypeptidu neublastínu sa môžu
SK 288123 Β6 použiť v spôsoboch opísaných v predkladanej prihláške. Takéto nervové vodivé kanály sú opísané napr. v US Patente č. 5 834 029, ktorý je tu zahrnutý formou odkazu.
Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sú kompozície opísané v tomto texte (a farmaceutické kompozície, ktoré ich obsahujú) použité na liečenie periférnych neuropatií. Medzi periférne neuropatie, ktoré pripadajú na liečenie molekulami podľa tohto vynálezu, patria neuropatia indukovaná traumou, neuropatia spôsobená fyzikálnym poškodením alebo patologickým stavom, fyzickým poškodením mozgu, fyzickým poškodením miechy, mŕtvica asociovaná s poškodením mozgu a neurologické patologické stavy asociované s neurodegeneráciou. Tiež sú tu zahrnuté neuropatie nasledujúce po infekcii, pôsobení toxínu alebo pôsobení lieku. Ďalej sú tu zahrnuté tie neuropatie, ktoré sú druhotné pri systémovom alebo metabolickom ochorení.
Kompozície opísané v predkladanej prihláške sa môžu tiež použiť na liečenie neuropatií indukovaných chemoterapiou (napr. spôsobených aplikáciou chemoterapeutických látok, napr. taxolu alebo cisplatiny), neuropatie indukovanej toxínmi, neuropatie indukovanej liečivami, neuropatie indukovanej nedostatkom vitamínov, idiopatickej neuropatie a diabetickej neuropatie (pozri napr. US Patenty 5 496 804 a 5 916 555, z ktorých je každý v tomto texte zahrnutý formou odkazu).
Ďalšie stavy, ktoré sa môžu liečiť s použitím kompozícií opísaných v predkladanej prihláške, sú mononeuropatie, monomultiplex neuropatie a polyneuropatie vrátane axonálnej a demyelinizačnej neuropatie.
V ďalšom výhodnom uskutočnení sa kompozície podľa vynálezu (a farmaceutické kompozície, ktoré ich obsahujú) používajú na liečenie rôznych porúch v oku, vrátane straty fotoreceptorov na sietnici u pacientov postihnutých makulámou degeneráciou, retinitídy pigmentosa, glaukómu a podobných ochorení.
Vynález je ešte ďalej podrobnejšie znázornený a vysvetlený pomocou nasledujúcich ilustratívnych príkladov, ktoré nijako neobmedzujú rozsah vynálezu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Biologická dostupnosť neublastínu pegylovaného na N-konci
Pozorovalo sa, že ľudský rekombinantný neublastín získaný produkciou z CHO buniek sa rýchlo odstraňoval z obehu, ak sa podával potkanom intravenózne. Po subkutánnom podaní sa nedetegoval v sére žiadny proteín. Na zvýšenie biologickej dostupnosti neublastínu sa skonštruovali pegylované formy.
Pretože sa v sekvencii NBN nevyskytoval žiadny lyzín, amínšpecifický pegylačný chemický postup poskytol pegyláciu NBN polypeptidu na jeho aminokonci. Takže na každý neublastínový dimér mali byť pripojené dve PEG skupiny. V súlade s tým sa PEG formy najskôr priamo cielili na N-koniec prostredníctvom amínšpecifického chemického postupu. Prekvapivo mala pegylácia dokonca s dvoma naviazanými 20K PEG malý účinok na predĺženie biologického polčasu, čo ukazuje na to, že mechanizmus, na ktorom je založená dráha klírensu (clearance), prevážil nad zvýšením polčasu, ktoré sa malo dosiahnuť pegyláciou.
Príklad 2
Konštrukcia pegylovaného muteínu neublastínu N95K
Ďalej sa skúmala biologická dostupnosť pegylovanej formy NBN mutovanej v internom aminokyselinovom zvyšku. Skonštruovala sa séria štyroch substitučných mutantov so substitúciami prirodzene sa vyskytujúcich aminokyselín v polohách 14, 39, 68 a 95 tak, že do uvedených polôh v sekvencii sa vložil lyzín. Tieto lyzíny potom poskytli alternatívne miesta na naviazanie PEG. Uvedené miesta sa vybrali s využitím kryštalickej štruktúry GDNF (Nat. Struct. Biol. 4: 435-8, 1997) ako podkladu na stanovenie zvyškov vyskytujúcich sa na povrchu, a na základe výskumu mutagenézy chiméry persefm/neublastín (J. Biol. Chem. 275: 3412-20, 2000), ktorý umožnil poznanie funkčne dôležitých úsekov štruktúry, ktorým je treba sa vyhnúť.
Dve mutácie (R39 a R68) sa urobili v úseku, ktorý by na základe distribúcie pozitívneho náboja na povrchu mohol predstavovať heparínové väzbové miesto, čo je vlastnosť proteínu, ktorá by mohla pravdepodobne prispievať k rýchlemu klírens. Tretie miesto sa cielilo na N95, prirodzené miesto glykozylácie pri NBN divého typu. Toto miesto je prirodzene modifikované komplexnou sacharidovou štruktúrou. Preto sa očakávalo, že modifikácia PEG tohto miesta nebude mať žiadny dopad na funkciu. Štvrté miesto (R14) sa vybralo v úseku, ktorý nebol pokrytý žiadnou inou modifikáciou. Mutant, kde sa asparagínový zvyšok v polohe 95 nahradil lyzínom („mutant N95K“), sa zvolil na skúmanie opisované v nasledujúcich príkladoch.
Skonštruovali sa štyri rôzne muteíny potkanieho neublastínu obsahujúce jednu alebo viac zmien v sekvencii potkanieho polypeptidu neublastínu divého typu. Bol to muteín N95K a muteíny obsahujúce jednoduché substitúcie v ďalších miestach aminokyselinovej sekvencie potkanieho neublastínu: R14K, R68K a R39K. Podľa „X'N'X2“ názvoslovie X1 označuje aminokyselinu divého typu polypeptidu neublastínu, N1 označuje numericky polohu aminokyseliny X1 v sekvencii, a to podľa sekvencie SEQ IĎ NO: 1. X2 označuje aminokyselinu, ktorou je substituovaná pôvodná aminokyselina divého typu v označenej polohe sekvencie.
Na konštrukciu mutanta potkanieho neublastínu N95K sa uskutočnila miestne cielená mutagenéza na
SK 288123 Β6 pCMB020, plazmide kódujúcom potkaní neublastín divého typu. Sekvencia nukleovej kyseliny kódujúcej potkaní neublastín a aminokyselinová sekvencia kódovaného polypeptidu sú uvedené neskôr:
ATGGAACTGG GACTTGGAGA GCCTACTGCA TTGTCCCACT GCCTCCGGCC
TAGGTGGCAA CCAGCCTTGT GGCCAACCCT AGCTGCTCTA GCCCTGCTGA
101 GCAGCGTCAC AGAAGCTTCC CTGGACCCAA TGTCCCGCAG CCCCGCCTCT
151 CGCGATGTTC CCTCGCCGGT CCTGGCGCCC CCAACAGACT ACCTACCTGG
201 GGGACACACC GCACATCTGT GCAGCGAAAG AGCCCTGCGA CCACCGCCGC
251 AGTCTCCTCA GCCCGCACCC CCACCACCGG GTCCCGCGCT CCAGTCTCCT
301 CCCGCTGCGC TCCGCGGGGC ACGCGCGGCG CGTGCAGGAA CCCGGAGCAG
351 CCGCGCACGG GCTACAGATG CGCGCGGCTG CCGCCTGCGC TCACAGCTGG
401 TGCCGGTGAG CGCTCTCGGC CTGGGCCACA GCTCCGACGA GCTGATACGT
451 TTCCGCTTCT GCAGCGGTTC GTGCCGCCGA GCACGCTCCC CGCACGATCT
501 CAGCCTGGCC AGCCTGCTGG GCGCCGGGGC CCTGCGGTCT CCTCCCGGGT
551 CCCGGCCGAT CAGCCAGCCC TGTTGCCGGC CCACTCGCTA TGAGGCAGTC
601 TCCTTCATGG ACGTGAACAG CACCTGGAGA ACCGTGGACC ATCTCTCCGC
651 CACCGCCTGC GGCTGTCTGG GCTGA (SEQ XD NO:5)
MELGLGEPTA LSHCLRPRWQ PALWPTLAAL ALLSSVTEAS LDPMSRSPAS
RDVPSPVLAP PTDYLPGGHT AHLCSERALR PPPQSPQPAP PPPGPALQSP
101 PAALRGARAA RAGTRSSRAR ATDARGCRLR SQLVPVSALG LGHSSDELIR
151 FRFCSGSCKR ARSPHDLSLA SLLGAGALRS PPGSRPISQP CCRPTRYEAV
201 SPMDVNSTWR TVDHLSATAC GCLG* (SEQ XD NO: 4 )
Mutagenéza pCM020 s použitím oligonukleotidov KD2-310 a KD3-211 viedla k vytvoreniu plazmidu pCMB027:
KD2-310 5'-GTATCTTTCATGGACGTAAAGTCTACATGGAGAACCGTAGATCATCTATCTGCAACC-3' {SEQIDNO:6)
KD2-311 5'-GGTTGCAGATAGATGATCTACGGTTCTCCATGTAGACTTTACGTCCATGAAAGATAC-3'(SEQ ID NO:7)
V pCMB027 bol kodón kódujúci asparagín v polohe 95 nahradený kodónom kódujúcim lyzín.
Muteín neublastínu R14K sa vytvoril nahradením kodónu kódujúceho arginín v polohe 14 kodónom kódujúcim lyzín v kódujúcej sekvencií neublastínu z pCMB020. Miestne cielená mutagenéza sa uskutočnila na pCMB020 s použitím oligonukleotidov KD3-254 a KD3-255:
KD3-254 5'-GCTGGAACTCGCAGCTCTCGTGCTCGTGCAACGGATGCAAAAGGCTGTCG-3' (SEQ ID NO:8)
KD2-255 5'-CGACAGCCTTTTGCATCCGTTGCACGAGCACGAGAGCTGCGAGTTCCAGC-3' (SEQ ID NO:9)
Výsledný konštrukt sa nazval pCMB029.
Muteín neublastínu R68K. sa vytvoril nahradením kodónu kódujúceho arginín v polohe 68 kodónom kódujúcim lyzín v kódujúcej sekvencií neublastínu z pCMB020. Miestne cielená mutagenéza sa uskutočnila na pCMB020 s použitím oligonukleotidov KD3-258 a KD3-259:
KD3-258 5'-GGAGCCGGAGCACTAAAATCTCCCCGGGATCTAGACC-3' (SEQ ID NO: 10)
KD3-259 5'-GGTCTAGATCCCGGGGGAGATTTTAGTGCTCCGGCTCC-3' (SEQ ID NO: 11) Výsledný konštrukt sa nazval pCMB030.
Muteín neublastínu R39K. sa vytvoril nahradením arginínu v aminokyselinovej polohe 39 lyzínom v kódujúcej sekvencíi neublastínu z pCMB020. Miestne cielená mutagenéza pCMB027 sa uskutočnila s použitím oligonukleotidov KD3-256 a KD3-257:
KD3-256 5'-GACGAATTAATTAAGTTTCGTTTTTGTTCAGG-3' (SEQ ID NO: 12)
KD3-257 5-CCTGAACAAAAACGAAACTTAATTAATTCGTC-3' (SEQ ID NO: 13)
Na expresiu a purifikáciu sa plazmid kódujúci muteín potkanieho NBN N95K exprimoval v E. coli ako His-značený („His-tag-ged“) fúzny proteín s enterokinázovým štiepnym miestom bezprostredne susediacim s počiatkom 113 aminokyselinovej sekvencie zrelého NBN. E. coli sa kultivovali v 500 1 fermentore a získala sa tak zmrazená bunková hmota (pasta). Bunky E. coli sa lyžovali v lise Manton Gaulin a z premytej nerozpustnej usadenej frakcie sa izoloval potkaní NBN NK.
NBN sa extrahoval z peletu guanidínhydrochloridom, poskladal sa (refolded) a his-značka sa odstránila enterokinázou. Produkt sa čistil chromatograficky na Ni NTA agaróze (Qiagen) a na katiónovej výmennej živici Bakerbond WP CBX.
Pôsobenie enterokinázy na His-značený produkt spôsobilo aberantné štiepenie proteínu v polohe arginínu 7 zrelej sekvencie. Výsledný produkt desl-7 NBN bol úplne aktívny pri testovaní v KIRA ELISA a štruktu14 rálne bol nerozoznateľný od zrelej formy, pokiaľ ide o citlivosť ku guanidínom indukovanej denaturácii, a preto sa použil aj pre nasledujúce skúšky.
Potkaní NBN N95K sa pegyloval v priemere 3,3 PEG skupinami na 1 molekulu s použitím činidla metoxylpoly(etylénglykol)sukcínimidylpropionátu (SPA-PEG) s molekulovou hmotnosťou 10 000 Da. Výsledný pegylovaný produkt sa podrobne charakterizoval, vrátane analýz, ako sú: SDS-PAGE, vylučovacia chromatografia podľa veľkosti (SEC), HPLC na reverznej fáze, laserová desorpcia pomocou matrice/ionizačná hmotnostná spektrometria (MALD/IMS), peptidové mapovanie, hodnotenie aktivity v KIRA ELISA a stanovenie obsahu endotoxínu.
Čistota produktu NBN N95K pred pegyláciou meraná pomocou SDS-PAGE a SEC bola vyššia ako 95 %. Produkt NBN N95K sa pohyboval v neredukujúcich podmienkach ako dimér, v súlade s predpovedanou štruktúrou. Po pegylácii výsledný produkt pozostával zo série modifikovaných adičných zlúčenín obsahujúcich v 5 % produktu 2 PEG/molekulu, v 60 % produktu 3 PEG/molekulu, v 30 % produktu 4 PEG/molekulu a niekoľko menej zastúpených foriem s vyššou hmotnosťou. V pegylovanej vzorke sa agregáty nezistili. Reziduálna hladina nemodifikovaného NBN v produkte bola pod hranicou kvantifikačnej metódy. Obsah endotoxínu v získanom materiáli bol rutinne menej ako 1 EU/mg. Špecifická aktivita pegylovaného NBN stanovená testom KIRA ELISA je 10 nM. Pegylovaný produkt sa formuloval v PBS pH 6,5 na koncentráciu 1,1 mg/ml. Látka, ktorá je podobná účinnosťou wt-NBN, sa môže dodávať ako zmrazená kvapalina a skladuje sa pri -70 °C.
Muteíny R14K, R39K a R68K sa exprimovali v E. coli a rovnakými metódami, ako boli opísané skôr pre N95K-NBN, sa purifikovali, pegylovali a testovali ich funkcie.
Príprava pegylovaného NBN
230 ml renaturovaného („refolded“) potkanieho NBN N95K (2,6 mg/ml), ktorý sa pripravil v E. coli a uložil pri 4 °C v pufri: 5 mM fosforečnan sodný pH 6,5, 100 mM NaCl, sa nariedilo so 77 ml vody, 14,4 ml IMA HEPES pH 7,5 a 2,8 g (10 mg/ml výsledná koncentrácia) PEG SPA 10000 Da (od firmy Shearwater Polymers, Inc.). Vzorka sa inkubovala pri teplote miestnosti 4 hodiny v tme, potom sa opracovala s 5 mM imidazolom (výsledná koncentrácia), filtrovala a uložila cez noc pri 4 °C. Produkt sa tvoril v dvoch súboroch, jeden obsahoval 130 ml NBN N95K hrubého produktu a druhý obsahoval 100 ml hrubého produktu. Pegylovaný NBN sa purifikoval z reakčnej zmesi pomocou Fractogel EMD SO3' (AQ (EM Industries). Kolóna sa udržiavala pri teplote miestnosti. Všetky pufre sa pripravili bez pyrogénov („pyrogen free“). Do reakčnej zmesi sa pridal chlorid sodný do konečnej koncentrácie 87 mM a vzorka sa naniesla na 45 ml kolónu Fractogel (vnútorný priemer 5 cm).
Kolóna sa premyla jedným objemom pufra: 5 mM fosforečnan sodný pH 6,5, 80 mM NaCl, potom tromi objemovými alikvótami objemu kolóny pufra: 5 mM fosforečnan sodný s 50 mM NaCl. Živica sa potom preniesla do kolóny s priemerom 2,5 cm a pegylovaný NBN sa eluoval z kolóny v šiestich krokoch po 10 ml s 5 mM fosforečnanom sodným pH 6,5, 400 mM NaCl, troch krokoch obsahujúcich 500 mM NaCl a šiestich krokoch obsahujúcich 600 mM NaCl. V eluovaných frakciách sa analyzoval obsah proteínu meraním absorbancie pri 280 nm a potom na rozsah modifikácií pomocou SDS-PAGE. Vybrané frakcie sa spojili, filtrovali cez 0,2 μιη filter a nariedili vodou na 1,1 mg/ml pegylovaného potkanieho NBN. Po vyhodnotení hladiny endotoxínu v jednotlivých súboroch sa frakcie spojili a znova filtrovali cez 0,2 pm membránu. Výsledný materiál sa rozdelil do alikvót a uložil pri -70 °C.
UV spektrum purifikovaného pegylovaného NBN NK
LIV spektrum (240 - 340 nm) pegylovaného NBN NK sa zmeralo v čistej vzorke. Vzorka sa analyzovala v troch opakovaniach. Pegylovaná vzorka mala maximum absorbancie pri 275 - 277 nm a minimum absorbancie pri 247 - 249 nm. Tento výsledok je v zhode s tým, čo sa pozorovalo pri nemodifikovanom hrubom medziprodukte NBN. Koncentrácia proteínu v preparáte pegylovaného produktu sa odhadla zo spektra s použitím extinkčného koeficientu Σ28ο0,1 % = 0,50. Koncentrácia proteínu vo vzorke pegylovaného NBN bola 1,1 mg/ml. Žiadna turbidita sa vo vzorke nepozorovala, ako to dokazuje deficit absorbancie pri 320 nm.
Charakterizácia pegylovaného NBN NK pomocou SDS-PAGE
Alikvóty z preparátu pegylovaného NBN obsahujúce 3, 1,5, 0,75 a 0,3 pg produktu sa analyzovali s SDS-PAGE v gradientovom géli 4 - 20 % (Owl). Gél sa zafarbil s Coomassie brilliant blue R-250. Paralelne sa na tom istom géli rozdelil štandard molekulovej hmotnosti (GIBCO-BRL).
SDS-PAGE analýza pegylovaného NBN NK v neredukujúcich podmienkach odhalila sériu pásov zodpovedajúcich modifikáciám s 2, 3, 4 a viac ako 4 PEG na 1 molekulu. Hlavný pás so zjavnou hmotnosťou 98 kDa obsahoval 3 PEG/molekulu. V purifikovanom pegylovanom produkte sa nemodifikovaný NBN nedetegoval. Prítomnosť zmesi produktov s 2, 3 a 4 naviazanými PEG sa overila MALDI hmotnostnou spektrometrickou analýzou. Podiel produktov obsahujúcich 2, 3 a 4 PEG sa v danom poradí určil pomocou denzitometrie na 7, 62 a 30 % z celkového preparátu.
SK 288123 Β6
Charakterizácia pegylovaného NBN vylučovacou chromatografiou
Pegylovaný NBN sa analyzoval vylučovacou chromatografiou („size exclusion chromatography“) na analytickej kolóne Superose 6 HR10/30 FPLC s použitím mobilnej fázy: 5 mM MES pH 6,5, 300 mM NaCl. Prietok kolóny bol 20 ml/hod. Eluované frakcie sa monitorovali meraním absorbancie pri 280 nm. Pegylovaný NBN eluovaný ako jediný pík so zjavnou molekulovou hmotnosťou približne 200 kDa bol v súlade s veľkým hydrodynamickým objemom PEG. Nepozorovali sa žiadne dôkazy výskytu agregátov. V preparáte bol zaznamenaný voľný NBN, ktorý sa eluoval so zjavnou molekulovou hmotnosťou približne 30 kDa.
Analýza pegylovaného NBN pomocou HPLC s reverznou fázou
Pegylovaný NBN NK sa analyzoval na HPLC kolóne s reverznou fázou Vydac C4 (5 pm, 1 x 250 mm).
Kolóna sa vyvolala s použitím 60 mm gradientu 40 až 60 % pufra B (Pufor A: 0,1 % TFA, Pufor B: 75 % acetonitril/O, 085 % TFA). Pufer sa po prietoku kolónou monitoroval absorbanciou pri 214 nm a odoberali sa frakcie pre následné analýzy. Pegylovaný NBN NK sa frakcionoval na di- (60,5 mm), tri- (63,3 mm) a tetra(67,8 mm) pegylované komponenty s použitím HPLC s reverznou fázou na kolóne C4. Relatívne intenzity píkov ukazujú, že pomery uvedených zložiek sú 5,4, 60,5 a 30,1 %, v danom poradí. Identity píkov sa overili pomocou MALDI-MS. V produkte sa nenašiel žiadny dôkaz prítomnosti nepegylovaného NBN NK (eluáty v 5 až 15 mm).
Analýza pegylovaného NBN hmotnostnou spektrometriou
Pegylovaný NBN NK sa odsolil pomocou špičky Ca Zip Tip a potom sa analyzoval hmotnostnou spektrometriou na spektrometri Voyager-DE™ STR (PerSeptive Biosystems) pre analýzu MALDI-TOF („matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight“) s použitím kyseliny sinapinovej ako matrice. 0,5 μΐ purifikovaného proteínu sa zmiešalo s 0,5 μΐ matrice na cieľovej doštičke. Hmotnostná spektrometria pegylovaného NBN ukázala jednoducho a dvojito nabité formy troch adičných zlúčenín. Pozorované hmotnosti 43 803 Da, 54 046 Da a 64 438 Da sú v súlade s modifikáciami typu 2, 3 a 4 PEG/molekulu.
Analýza pegylovaného NBN peptidovým mapovaním
Špecifita pegylačnej reakcie sa vyhodnotila pomocou peptidového mapovania. Pegylovaný NBN sa rozdelil na di-, tri- a tetra- pegylované komponenty, ktoré sa potom redukovali, alkylovali a ďalej delili na jednotlivé zložky pomocou HPLC na kolóne C4. Tieto zložky, spoločne s redukovaným a alkylovaným nemodifikovaným NBN NK ako kontrolnou vzorkou, sa štiepili Asp-N proteinázou a výsledné štiepne produkty sa frakcionovali s HPLC s reverznou fázou na kolóne VydaC]8 (5 pm, 1 x 250 mm) s použitím 60 mm gradientu 0 až 60 % B (Pufor A: 0,1 % TFA, Pufor B: 75 % acetonitril, 0,085 % TFA). Pufor, ktorý pretiekol kolónou, sa monitoroval meraním absorbancie pri 214 nm.
Sekvencia potkanieho NBN obsahuje štyri interné zvyšky kyseliny asparágovej a preto sa očakával jednoduchý profil po štiepení endoproteinázou Asp-N. Všetky piky potkanieho NBN NK sa po štiepení Asp-N identifikovali hmotnostnou spektrometriou a/alebo Edmanovým N-koncovým sekvenovaním, a tak sa mohla peptidová mapa použiť ako jednoduchý nástroj na zisťovanie miest modifikácie na základe prítomnosti alebo neprítomnosti piku. Totožnosť rôznych píkov je prehľadne uvedená v nasledujúcej tabuľke 3.
Tabuľka 3
Pík podľa retenčného času (mm) | Priemerná hodnota pozorovanej hmotnosti | Priemerná hodnota teoretickej hmotnosti | Priradenie | Amínokyselinová sekvencia |
38,8 | 1261,1 (M) | 1262,4 | 102- 113 | DHLSATACGCLG |
40,7 | 1090,9 | 1092,2 | 93 - 101 | DVKSMRTV |
44,6 | 2508,4 | 2508,9 | 35-54 | DELJRPRFCSGSCRRARSPH |
46,0 | 2437,0 | 2437,8 | 12-34 | DARGCRLRSQLVPVSALGLGHSS |
51,4 | 3456,7 | 3456,0 | 55-86 | DLSLAS...CRPIRY |
51,9 | 4134,4 | 55 - 92 (oxid) | DLSLAS CRPTRYEAVSFM | |
53,2 | 4136,3* | 4120,8 | 55-92 | DLSLAS CRPTRYEAVS FM |
(M): monolostop. hmota *:z dôvodu oxidácie peptidu obsahujúceho metionín v MALDI
Pretože NBN existuje ako homodimér, potkaní produkt NBN NK obsahuje štyri potenciálne miesta pre pegyláciu, dva M-koncové amíny z každého reťazca a dve miesta N95K, ktoré boli do konštruktu vnesené genetickou manipuláciou. V peptidovej mape dipegylovaného reťazca sa zmenil PEG modifikáciou iba pík, ktorý obsahuje peptid s NK mutáciou. Žiadny z ďalších píkov nebol zasiahnutý PEG modifikáciou. Mapové dáta preto ukazujú, že skupina PEG je špecificky pripojená práve k tomuto peptidu, a nie k niektorému inému
SK 288123 Β6 peptidu z peptidov, ktoré prešli skríningom. Druhé potenciálne miesto pripojenia, a to N-koniec, je na peptide, ktorý je dlhý iba tri aminokyseliny a nebol detegovaný v peptidovej mape. Z toho vyplýva, že sú tu ďalšie PEG väzbové miesta. V súlade s tým je skutočnosť, že malé percento potkanieho NBN NK nie je skrátené a obsahuje zrelú Ala-1 sekvenciu. Tento peptid sa eluoval v 30 pm a je viditeľný v peptidovej mape zo štiepenia nepegylovaného produktu, ale chýba v mape zo štiepenia pegylovaného NBN NK.
Príklad 3
Hodnotenie funkčnosti interne pegylovaného neublastínu v aktivácii kinázového receptora (KIRA) ELISA
Funkčnosť pegylovaného potkanieho NBN sa merala s použitím od NBN závislej aktivácie/fosforylácie c-Ret ako reportérového génu pre NBN aktivitu v ELISA teste, ktorý bol špecifický na prítomnosť fosforylovanej formy RET. Bunky NB41A3-MRL, adherentná myšia neuroblastómová bunková línia, ktorá exprimuje Ret a GFRa3, sa vysiali na 24 jamkové doštičky v množstve 2 x 105 buniek na jamku, v Dulbecco modifikovanom Eagle médiu (DMEM), doplnenom 10 % fetálnym hovädzím sérom, a kultivovali sa 18 h pri 37 °C a 5 % CO2.
Bunky sa potom premyli s PBS a opracovali sériovým riedením NBN v 0,25 ml DMEM 10 minút pri 37 °C a 5 % CO2. Každá vzorka sa analyzovala v dvoch opakovaniach. Bunky sa premyli s 1 ml PBS a lyžovali 1 h pri 4 °C s 0,30 ml pufra: 10 mM Tris HCI, pH 8,0, 0,5 % Nonidet P40, 0,2 % deoxycholát sodný, 50 mM NaF, 0,1 mM Na3V04, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, za mierneho trepania doštičiek. Lyzáty sa ďalej premiešali opakovaným pipetovaním a 0,25 ml vzorky sa prenieslo na 96-jamkovú ELISA doštičku, ktorá bola potiahnutá s 5 mg/ml anti-Ret monoklonálnej protilátky (mAb) (AA.GE7.3) v 50 mM uhličitanovom pufri, pH 9,6 pri 4 °C 18 h, a blokovala sa pri teplote miestnosti jednu hodinu blokovacím pufrom (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCI, 0,1 % Tween-20 (TBST) obsahujúci 1 % normálne myšie sérum a 3 % hovädzí sérový albumín).
Po 2 hodinách inkubácie pri teplote miestnosti sa jamky premyli šesťkrát s TBST. Fosforylovaný Ret sa detegoval tým, že sa inkubovali jamky pri teplote miestnosti 2 hodiny s 2 mg/ml konjugátu chrenovej peroxidázy (HRP) s protilátkou anti-fosfotyrozín 4G10 v blokovacom pufri, premyli šesťkrát s TBST a aktivita HRP sa merala pri 450 nm kolorometrickým detekčným činidlom. Zmerali sa hodnoty absorbancie jamiek opracovaných lyzátom alebo s lyzačným pufrom a získaný signál korigovaný na hodnotu pozadia sa vyniesol do grafu ako funkcia koncentrácie NBN prítomnej v aktivačnej zmesi. Funkčnosť pegylovaného NBN v teste KIRA ELISA bola 10 nM, pričom táto hodnota je nerozoznateľná od východiskovej NBN NK. Nebol evidentný žiadny účinok dvoch cyklov mrznutia-topenia na funkčnosť, a po tomto opracovaní nedošlo k žiadnemu významnému zvýšeniu turbidity vzorky, čo ukazuje, že vzorky sa pre túto štúdiu môžu bezpečne rozmrazovať. V nezávislej štúdii, kde sa samostatne hodnotila aktivita produktu s tromi a štyrmi 10 kDa PEG/molekulu, sa zistilo, že adičná zlúčenina s tromi PEG je plne funkčná, zatiaľ čo produkt so štyrmi PEG mal zníženú aktivitu.
Príklad 4
Farmakokinetické štúdie interne pegylovaného potkanieho neublastínu pri potkanoch a myšiach
Farmakokinetické vlastnosti rôznych pegylovaných a nepegylovaných NBN produktov sa skúmali na modeli potkana a myši.
Dáta ukázali, že pegylovaný potkaní NBN NK s 3,3 x 10 000 Da PEG prejavoval významný účinok na biologický polčas a biologickú dostupnosť neublastínu. Po i. v. podaní 1 mg/kg potkanom Sprague Dawley bol vrchol hladiny 3000 ng/ml pegylovaného NBN detegovaný po 7 minútach, hladiny 700 ng/ml po 2,4 hodinách, 200 ng/ml po 48 hodinách a 100 ng/ml po 72 hodinách. Na rozdiel od toho pre nepegylovaný NBN po i. v. podaní 1 mg/kg vrchol hladiny 1500 ng/ml sa detegoval po 7 minútach, ale potom hladiny rýchlo klesli až na 70 ng/ml po 3 hodinách, a po 7 hodinách sa nedetegoval žiadny pík. Účinky pegylácie sa ešte viac prejavili u zvierat, ktorým sa pegylovaný NBN podával subkutánnym spôsobom.
Po s. c. podaní 1 mg/kg hladina pegylovaného NBN v obehu dosiahla maximum 200 ng/ml po 24 hodinách a zostala na tejto hladine po celý čas trojdennej štúdie. Na rozdiel od toho, žiadna detegovateľná hladina NBN sa nepozorovala ani v jednom časovom bode po podaní nemodifikovaného NBN.
Analýza vzoriek pegylovaného NBN bola komplikovaná pre prítomnosť adičných zlúčenín obsahujúcich 2, 3 a 4 PEG na molekulu, pretože každá má odlišný PK profil. V skorých PK štúdiách sa použili myši na uľahčenie skríningu celého radu kandidátnych zlúčenín a spôsobov podávania. Štúdia na myšiach odhalila dramatické rozdiely v biologickej dostupnosti kandidátnych zlúčenín. Ale, keď sa pri potkanoch vyhodnotila adičná zlúčenina 3,3 10 K PEG, zistilo sa, že má nižšiu biologickú dostupnosť pri potkanoch ako pri myšiach. Tento rozdiel v biologickej dostupnosti sa konkrétne vyjadril po i. p. podávaní. Hladiny pri myšiach dosiahli 1600 ng/ml po 7 hodinách a zostali na 400 ng/ml po 24 hodinách. Na rozdiel od toho hladiny potkana boli konštantné na 100 ng/ml počas 4 až 48 hodín.
Potkaní neublastín divého typu (wt-NBN) a neublastín s Asn-Lys substitúciou v polohe 95 (NK-NBN) sa poskladali („refolded“) a purifikovali na čistotu >95 % pre testy aktivity na modeli STZ diabetickej neuropa17
SK 288123 Β6 tie potkana. Wt-NBN sa formuloval priamo pre testovanie na zvieratách, zatiaľ čo NK-NBN sa pripravil pre pegyláciu s 10 kDa PEG-SPA. Na poskladanie a purifikáciu sa vyvinula metóda, ktorá využíva vylučovaciu chromatografiu (SEC), ktorá vo veľkom množstve a do vysokej koncentrácie umožnila renaturáciu NBN z inklúznych teliesok E. coli. Okrem SEC sa na zvýšenie čistoty proteínu použili kroky kolónovej chromatografie na Ni-NTA a CM kremičitanovej kolóne. Proteiny sa potom rozsiahlo charakterizovali, vrátane analýzy SDS-PAGE, vylučovacej chromatografie, ESMS, hodnotenia aktivity v KIRA ELISA a stanovenia obsahu endotoxínu. SDS-PAGE a SEC koncových proteínov ukázali čistotu vyššiu ako 95 %. Endotoxínová hladina každého produktu bola <0,2 EU/mg. Špecifická aktivita obidvoch proteínov v KIRA ELISA bola približne 10 nM. Wt-NBN sa formuloval na 1,0 mg/ml a NK-NBN sa formuloval na 2,6 mg/ml vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátmi (PBS) pH 6,5. wt-NBN sa rozdelil na alikvóty do 15 ml skúmaviek a uložil pri -70 °C, zatiaľ čo NK-NBN sa pegyloval, a potom sa alikvóty zmrazili.
Príklad 5
Poskladanie („refolding“) neublastínu divého typu a muteínu N95K neublastínu
Obidve formy NBN sa exprimovali v E. coli ako fúzne proteiny označené s His („His-tagged“) s enterokinázovým štiepnym miestom bezprostredne susediacim so začiatkom zrelej 113 aminokyselinovej sekvencie. Baktérie exprimujúce buď Wt- (1,8 kg pelet), alebo NK-NBN (2,5 kg pelet) sa lyžovali v 2 litroch PBS s použitím Gaulinovho lisu. Po usadení inklúznych teliesok centrifúgáciou (10 000 rpm) sa odstránili supematanty z každého preparátu. Pelety inklúznych teliesok sa premyli dvakrát v pufri (0,02 M Tris-HCI pH 8,5, 0,5 mM EDTA), potom sa premyli dvakrát v rovnakom pufri obsahujúcom Triton X-100 (2 %, objem/objem), a potom nasledovali 2 premytia pufrom bez detergentu. Obidva pelety sa solubilizovali s použitím 6 M guanidínhydrochloridu, 0,1 M Tris pH 8,5, 0,1 M DTT a 1 mM EDTA. Na uľahčenie solubilizácie sa každý pelet homogenizoval s použitím polytronového homogenizátora, a potom nasledovalo miešanie cez noc pri teplote miestnosti. Solubilizované proteiny sa prečistili centrifúgáciou pred denaturačnou chromatografiou na Superdex 200 (5,5 1 kolóna ekvilibrovaná s 0,05 M glycín/H3PO4 pH 3,0 s 2 M guanidín-HCl) pri prietoku 20 ml/minútu.
Denaturovaný NBN sa identifikoval pomocou SDS-PAGE. Frakcie obsahujúce buď Wt-NBN, alebo NK-NBN sa spojili a koncentrovali približne do 250 ml s použitím miešacieho bunkového koncentrátora Amicon s objemom 2,5-litra. Po odstránení precipitátu filtráciou sa koncentrovaný protein opracoval renaturačnou chromatografiou cez Superdex 200 ekvilibrovaný 0,1 M Tris-HCI pH 7,8, 0,5 M guanidín-HCl, 8,8 mM redukovaný glutatión a 0,22 mM oxidovaný glutatión. Kolóna sa eluovala s použitím 0,5 M guanidín-HCl pri prietoku 20 ml/minútu. Frakcie obsahujúce renaturovaný wt-NBN alebo NK-NBN sa identifikovali pomocou SDS-PAGE, spojili a uložili pri 4 °C do okamihu potreby na odstránenie značky His.
Koncentrácia NBN chromatografiou Ni-NTA (TR5919-138)
Renaturovaný NBN sa uložil pri 4 °C minimálne 24 hodín pred procesom purifikácie, aby sa podporilo vytvorenie disulfidických väzieb medzi monomérmi NBN. Počas tohto sa vytvoril precipitát, ktorý sa odstránil filtráciou cez 0,2 μ PES filtračnú jednotku. Na oslabenie nešpecifickej väzby sa roztok proteínu preniesol do 20 mM imidazolu pred nanesením na 100 ml Ni-NTA (Qiagen) kolónu ekvilibrovanú kolónovým pufrom (0,5 M guanidín a 20 mM imidazol) pri prietoku 50 ml/minútu. Po nanesení proteínu sa kolóna premyla na základnú hodnotu s použitím rovnakého pufra. NBN sa eluoval zo živice s použitím približne 300 ml elučného pufra obsahujúceho 0,5 M guanidín-HCl a 0,4 M imidazol. Po elúcii sa NBN dialyzoval cez noc (s použitím 10 kDa dialyzačného čreva) pri teplote miestnosti proti desiatim objemom 5 mM HC1. Dialýza podporovala hydrolýzu kontaminujúcich látok a znížila koncentrácie guanidín-HCl a imidazolu na 0,05 M a 0,04 M.
Štiepenie značky His s lyzylendopeptidázou alebo enterokinázou
Nasledujúci deň sa akýkoľvek precipitát vytvorený počas dialýzy odstránil filtráciou. Proteínová vzorka sa nastavila na 0,1 M NaCl pridaním 5 M zásobného roztoku, pričom konečná koncentrácia soli zahŕňala zostávajúci guanidín-HCl približne vo výške 150 mM. Táto koncentrácia sa potvrdila meraním vodivosti. Ďalej sa pridal 1 M HEPES pH 8 do konečnej koncentrácie 25 mM. Na odštiepenie značky His sa k wt-NBN pridala lyzylendopeptidáza a enterokináza, obidve približne v pomere 1 : 300 proteáza : NBN. Enterokináza sa použila namiesto lyzylendopeptidázy pre NK-NBN kvôli ďalšiemu proteázovému štiepnemu miestu v mutovanom proteíne Lys95. Vzorky sa miešali pri teplote miestnosti 2 hodiny a štiepenie sa monitorovalo pomocou SDS-PAGE.
Odstránenie značky His Ni-NTA chromatografiou
Proteázou opracovaný NBN sa naniesol na 100 ml Ni-NTA kolónu ekvilibrovanú s 0,5 M guanidín-HCl a 20 mM imidazolom pri 50 ml/minútu. Kolóna sa premyla na základnú hodnotu s rovnakým pufrom. Všetky proteiny získané po premytí kolóny sa spojili s proteínom pretečeným kolónou obsahujúcim NBN bez His značky.
Chromatografia na CM oxide kremičitom
Po Ni-NTA chromatografii sa proteín ihneď ďalej purifikoval cez CM oxid kremičitý. 20 ml kolóna s CM oxidom kremičitým ekvilibrovaná nanášacím pufrom (5 mM fosfát pH 6,5, 150 mM NaCl) sa naplnila s NBN pri 20 ml/minútu. Kolóna sa premyla dvadsiatimi objemami kolóny premývacím pufrom (5 mM fosfát pH 6,5, 400 mM NaCl) a proteín sa postupne eluoval elučným pufrom obsahujúcim 5 mM fosfát pH 6,5, ale s 1 M NaCl. Eluovaný proteín sa dialyzoval cez noc oproti fosfátu samotnému, aby sa znížila koncentrácia soli na 100 mM pre NK-NBN a 150 mM pre wt-NBN. Obidve vzorky sa filtrovali cez 0,2 pm PES filtračnou jednotkou, analyzovali pomocou SDS-PAGE a uložili pri 4 °C, až kým sa ďalej charakterizovali a/alebo pegylovali.
Wt-NBN a NK-NBN sa podrobili UV spektrálnej analýze na vyhodnotenie ich absorbancie pri 280 nm. S použitím kremennej mikrokyvety a proti samotnému pufŕu sa kontinuálne meralo 100 μΐ buď wt-NBN, alebo NK-NBN v rozsahu 230 až 330 nm s použitím spektrofotometra Beckman. Na základe tejto analýzy sa stanovila koncentrácia Wt-NBN na 1,1 mg/ml a NK-NBN na 2,6 mg/ml (A280 nm-E0,1 % = 0,5 sa použilo pre každý proteín). Meraním absorbancie pri 330 nm sa zistilo menej ako 1 % precipitovanej látky.
Na hodnotenie čistoty obidvoch proteínových preparátov sa každá vzorka (0,5 mg) podrobila vylučovacej chromatografii cez kolónu 16/30/Superdex 75. Kolóna sa ekvilibrovala 5 mM fosfátom pH 6,5 obsahujúcim 400 mM NaCl a eluovala pri prietoku 1,5 ml/minútu. Na základe absorbancie pri 280 nm, obidva proteíny, wt- aj NK-NBN, sa pohybovali ako jednoduchý pík s očakávanou molekulovou hmotnosťou (23 - 24 kDa) a neobsahovali žiadne významné proteínové kontaminácie.
Tak wt-NBN ako aj NK-NBN boli redukované v 2,5 M guanidín-HCl, 60 mM Tris pH 8,0 a 16 mM DTT. Redukované vzorky sa odsoľovali cez krátku C4 kolónu a analyzovali on-line ESMS s použitím trojitého štvorpólového zariadenia. Hrubé ESMS údaje sa ďalej spracovali programom MaxEnt, aby sa vytvorilo hmotnostné spektrum. Tento postup umožňuje spracovať viackrát získaný signál do jedného piku, ktorý priamo zodpovedá molekulovej hmotnosti v kilodaltonoch (kDa). Hmotnostné spektrum po dekonvolúcii pre wt-NBN ukazovalo ako prevládajúci druh molekulu 12046 kDa, čo je v zhode s predpokladanou molekulovou hmotnosťou 12046,7 kDa pre formu proteínu obsahujúceho 113 aminokyselín. Tiež sa pozorovala minoritná zložka (12063 kDa) pravdepodobne v dôsledku prítomnosti oxidačného produktu. Vo vzorke NK-NBN sa identifikovali tri piky. Hlavná zložka mala zjavnú molekulovú hmotnosť 11345 kDa v zhode s predpovedanou hmotnosťou pre formu proteínu obsahujúceho 106 aminokyselín. Ďalšie dva piky mali hmotnosť 11362 a 12061 kDa, zrejme v dôsledku prítomnosti NK-NBN oxidačného produktu a prítomnosti formy so 113 aminokyselinami, v danom poradí.
Prítomnosť formy štiepenia enterokinázou
Táto proteáza od firmy Biozyme je prírodný enzýmový preparát purifikovaný z teľacej črevnej sliznice a publikovalo sa, že obsahuje slabú kontamináciu trypsínom (0,25 ng trypsínu na 1 pg enterokinázy). Preto môže trypsín pôsobiť na karboxykoncovom Arg7 v NK-NBN za vzniku prevládajúcej formy so 106 aminokyselinami. Na druhej strane, lyzylendopeptidáza použitá na štiepenie Wt-NBN má jednoduchú proteázovú aktivita pôsobiacu na lyzínovom zvyšku karboxykonca obsahujúceho značku His za vzniku zrelej formy proteínu NBN obsahujúceho 113 aminokyselín. Obidve formy NBN, teda so 106 a 113 aminokyselinami, sú rovnako účinné vo všetkých testoch a správajú sa podobne v guanidín-HCl skúške na stabilitu.
NBN aktivita sa určila podľa schopností stimulovať c-Ret fosforyláciu v NB41A3-MRL3 bunkách s použitím ÍRA ELISA testu opísaného v príklade 3. Fosforylovaný Ret sa detegoval tým, že sa inkuboval (2 hodiny) zachytený receptor s fosfotyrozínovou protilátkou konjugovanou s HRP (4G10, 0,2 pg na jamku). Po inkubácii sa jamky premyli šesťkrát TBST a HRP aktivita sa detegovala pri 450 nm kolorimetrickým testom. Merali sa hodnoty absorbancie jamky opracovanej lyzátom alebo lyzačným pufrom samotným, uskutočnila sa korekcia na pozadí a dáta sa vyniesli do grafu ako funkcia koncentrácie neublastínu prítomného v aktivačnej zmesi. Dáta ukázali, že purifikovaný NBN spôsobil vznik fosforylovaného RET, čo ukazuje, že purifikovaný NBN bol v tomto teste aktívny.
Príklad 6
Príprava konjugátu „sérový albumín-neublastín“
Potkaní neublastín divého typu s koncentráciou 1 mg/ml v PBS sa opracoval s 1 mM sulfo-SMCC (Pierce) a odsolil, aby sa odstránil nadbytok sieťovacieho činidla. Pretože NBN proteín divého typu obsahuje iba jednoduchý amín na svojom N-konci a žiadnu voľnú sulfhydrylovú skupinu, reakcia so SMCC podľa očakávania poskytla miestne špecifickú modifikáciu NBN so SMCC naviazaným na N-koniec.
pg NBN-SMCC konjugátu sa inkubovalo so 120 pg hovädzieho sérového albumínu a analyzoval sa rozsah zosieťovania pomocou SDS-PAGE. BSA obsahuje jednu voľnú SH skupinu a teda reakcia s NBN SMCC konjugátom podľa očakávania poskytla modifikáciu tohto miesta prostredníctvom maleimidu na SMCC. Za týchto podmienok sa pozorovali dva ďalšie pásy s vyššou molekulovou hmotnosťou, ktoré súhlasili s hmotnosťou modifikovaného NBN s naviazanou jednou molekulou BSA a s dvoma molekulami BSA,
SK 288123 Β6 pretože každá NBN molekula obsahuje dva N-konce, ktoré môžu reagovať, a sú teda v zhode s očakávaním. Súčasne so vznikom týchto pásov nastal pokles v intenzite NBN-SMCC a BSA pásov. Na základe intenzity zvyšného NBN pásu reakcia prebehla na 70 až 80 %.
Monosubstituovaný produkt sa purifikoval z reakčnej zmesi tým, že reakčná zmes sa podrobila katiónovej výmennej chromatografii a vylučovacej chromatografii na kolóne Superdex 200 (Pharmacia) v podstate rovnako, ako je opísané pre pegylačnú štúdiu opísanú skôr. Frakcie z kolóny po gélovej filtrácii sa analyzovali na SDS-PAGE a frakcie obsahujúce monosubstituovaný produkt sa analyzovali na obsah proteínu meraním absorbancie pri 280 nm. Pretože hmotnosť BSA je približne dvakrát vyššia ako hmotnosť neublastínu, nameraná koncentrácia sa delila 3, aby sa získal NBN ekvivalent. Táto frakcia sa tiež testovala v KIRA ELISA teste na funkčnosť. IC50 hodnoty tak pre wt- ako aj pre BSA konjugovaný NBN boli 3 až 6 nM, čo ukázalo, že konjugácia s BSA sa neprejavila zhoršením funkcie.
Zatiaľ čo tieto predbežné štúdie sa uskutočnili s BSA, zodpovedajúce sérové albumínové proteíny potkana a človeka obsahujú voľné SH skupiny. Takže podobný prístup sa môže použiť na vytvorenie konjugátu sérový albumín potkana-NBN potkana, na uskutočnenie štúdie PK a štúdie účinnosti pri potkanoch a ľudský sérový albumín-ľudský NBN na uskutočnenie klinických skúšok. Podobne sa môže SMCC nahradiť ktorýmkoľvek z mnohých sieťovacích činidiel (cross-linkerov), ktoré obsahujú aminoreaktívnu skupinu na jednej strane a tiolreaktívnu skupinu na druhej strane. Príkladom aminoreaktívneho „cross-linkera“, ktorý vkladá tiolreaktívny maleimid je AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS alebo GMBS, príkladom crosslinkera, ktorý vkladá tiolreaktívnu haloacetátovú skupinu je SBAP, SIA, SIAB, a príkladom crosslinkera, ktorý poskytuje chránenú alebo nechránenú tiolovú skupinu pre reakciu so sulfhydrylovou skupinou za vzniku redukovateľnej väzby je SPDP, SMPT, SATA alebo SATP, pričom všetky sú komerčne dostupné od firmy Pierce. Tieto cross-linkery sú iba príklady a existuje rad alternatívnych stratégií na spojenie N-konca NBN so sérovým albumínom. Odborník by tiež mohol vytvoriť konjugáty so sérovým albumínom, ktorý nie je cielený na N-koniec NBN alebo na tiolovú skupinu sérového albumínu. Fúzie NBN-sérový albumín vytvorené metódami genetického inžinierstva, kde gén NBN je fuzovaný s génom sérového albumínu na N-konci, C-konci alebo na obidvoch koncoch, by mohli byť tiež funkčné.
Spôsob podľa vynálezu sa môže rozšíriť rutinnými adaptáciami na akýkoľvek konjugát NBN-sérový albumín, ktorý by poskytol produkt s predĺženým polčasom pri zvieratách, a teda aj u ľudí.
Zoznam sekvencii <110> Biogen, Inc.
Sah, Dinah W. Y.
Pepinsky, Blake R Borjack-Sjodin, Paula Ann Miller, Stephan S Rossomando, Anthony <120> Polymér Conjugates of Neublastin and Methods of Using Samé <130> 00689-506-061 <140> Not Yet Assigned <141> 2002-01-23 <150> 60/266,071 <151> 2001-02-01 <160> 13 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 113 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Kanonická sekvencia <220>
<221> VARIANT <222> (3) <223> Kde Xaa je Gly alebo Thr <220>
<221> VARIANT <222> (4) <223> Kde Xaa je Pro alebo Arg <220>
<221> VARIANT
SK 288123 Β6 <222> (5) <223> Kde Xaa je Gly alebo Ser <220>
<221> VARIANT <222> (10) <223> Kde Xaa je Ala alebo Thr <220>
<221> VARIANT <222>(11) <223> Kde Xaa je Ala alebo Thr <220>
<221> VARIANT <222> (12) <223> Kde Xaa je Gly alebo Asp <220>
<221 > VARIANT <222> (26) <223> Kde Xaa je Arg alebo Ser <220>
<221 > VARIANT <222> (33) <223> Kde Xaa je Arg alebo Ser <220>
<221> VARIANT <222> (38) <223> Kde Xaa je Val alebo íle <220>
<221> VARIANT <222> (51) <223> Kde Xaa je Val alebo íle <220>
<221> VARIANT <222> (53) <223> Kde Xaa je Pro alebo Gin <220>
<221> VARIANT <222> (69) <223> Kde Xaa je Pro alebo Ser <220>
<221> VARIANT <222> (76) <223> Kde Xaa je Val alebo íle <220>
<221> VARIANT <222> (103) <223> Kde Xaa je Arg alebo His <400> 1
Ala | Gly | Xaa | Xaa | Xaa | Ser | Arg | Ala | Arg | Xaa | Xaa | Xaa | Ala | Arg | Gly | Cys | |
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||||
Arg | Leu | Arg | Ser | Gin | Leu | Val | Pro | Val | Xaa | Ala | Leu | Gly | Leu | Gly | His | |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
Xaa | Ser | Asp | Glu | Leu | Xaa | Arg | Phe | Arg | Phe | Cys | Ser | Gly | Ser | Cys | Arg | Arg |
35 | 4 | 0 | 45 | |||||||||||||
Ala | Arg | Ser | Xaa | His | Asp | Leu | Ser | Leu | Ala | Ser | Leu | Leu | Gly | Ala | Gly | |
50 | 5 | 5 | 6 | 0 | ||||||||||||
Ala | Leu | Arg | Xaa | Pro | Pro | Gly | Ser | Arg | Pro | Xaa | Ser | Gin | Pro | Cys | Cys | Arg |
65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
Pro | Thr | Arg | Tyr | Glu | Ala | Val | Ser | Phe | Met | Asp | Val | Asn | Ser | Thr | Trp | |
85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
Arg | Thr | Val | Asp | Xaa | Leu | Ser | Ala | Thr | Ala | Cys | Gly | Cys | Leu | Gly | ||
100 | 105 | 110 |
<210>2 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Ala | Gly | Gly | Pro | Gly | Ser | Arg | Ala | Arg | Al a | Ala | Gly | Ala | Arg | Gly | Cys |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Arg | Leu | Arg | Ser | Gin | Leu | Val | Pro | Val | Arg | Ala | Leu | Gly | Leu | Gly | His |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Arg | Ser | Asp | Glu | Leu | Val | Arg | Phe | Arg | Phe | Cys | Ser | Gly | Ser | Cys | Arg |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Arg | Ala | Arg | Ser | Pro | His | Asp | Leu | Ser | Leu | Ala | Ser | Leu | Leu | Gly | Ala |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Gly | Ala | Leu | Arg | Pro | Pro | Pro | Gly | Ser | Arg | Pro | Val | Ser | Gin | Pro | Cys |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Cys | Arg | Pro | Thr | Arg | Tyr | Glu | Ala | Val | Ser | Phe | Met | Asp | Val | Asn | Ser |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Thr | Trp | Arg | Thr | Val | Asp | Arg | Leu | Ser | Ala | Thr | Ala | Cys | Gly | Cys | Leu |
100 105 110
Gly <210> 3 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus
<400>3 | |||||||||||||||
Ala | Gly | Thr | Arg | Ser | Ser | Arg | Ala | Arg | Thr | Thr | Asp | Ala | Arg | Gly | Cys |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Arg | Leu | Arg | Ser | Gin | Leu | Val | Pro | Val | Ser | Ala | Leu | Gly | Leu | Gly | His |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Ser | Ser | Asp | Glu | Leu | íle | Arg | Phe | Arg | Phe | Cys | Ser | Gly | Ser | Cys | Arg |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Arg | Ala | Arg | Ser | Gin | His | Asp | Leu | Ser | Leu | Ala | Ser | Leu | Leu | Gly | Ala |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Gly | Ala | Leu | Arg | Ser | Pro | Pro | Gly | Ser | Arg | Pro | íle | Ser | Gin | Pro | Cys |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Cys | Arg | Pro | Thr | Arg | Tyr | Glu | Ala | Val | Ser | Phe | Met | Asp | Val | Asn | Ser |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Thr | Trp | Arg | Thr | Val | Asp | His | Leu | Ser | Ala | Thr | Ala | Cys | Gly | Cys | Leu |
100 105 110
Gly <210>4 <211> 113 <212> PRT <213> Rattus norvegicus
<400>4 | |||||||||||||||
Ala | Gly | Thr | Arg | Ser | Ser | Arg | Ala | Arg | Ala | Thr | Asp | Ala | Arg | Gly | Cys |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Arg | Leu | Arg | Ser | Gin | Leu | Val | Pro | Val | Ser | Ala | Leu | Gly | Leu | Gly | His |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Ser | Ser | Asp | Glu | Leu | íle | Arg | Phe | Arg | Phe | Cys | Ser | Gly | Ser | Cys | Arg |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Arg | Ala | Arg | Ser | Pro | His | Asp | Leu | Ser | Leu | Ala | Ser | Leu | Leu | Gly | Ala |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Gly | Ala | Leu | Arg | Ser | Pro | Pro | Gly | Ser | Arg | Pro | íle | Ser | Gin | Pro | Cys |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Cys | Arg | Pro | Thr | Arg | Tyr | Glu | Ala | Val | Ser | Phe | Met | Asp | Val | Asn | Ser |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Thr | Trp | Arg | Thr | Val | Asp | His | Leu | Ser | Ala | Thr | Ala | Cys | Gly | Cys | Leu |
100 | 105 | 110 |
Gly <210> 5
SK 288123 Β6 <211>675 <212>DNA <213> Rattus norvegicus <400>5 atggaactgg gacttggaga gcctactgca ttgtcccact gcctccggcc taggtggcaa 60 ccagccttgt ggccaaccct agctgctcta gccctgctga gcagcgtcac agaagcttcc 120 ctggacccaa tgtcccgcag ccccgcctct cgcgatgttc cctcgccggt cctggcgccc 180 ccaacagact acctacctgg gggacacacc gcacatctgt gcagcgaaag agccctgcga 240 ccaccgccgc agtctcctca gcccgcaccc ccaccaccgg gtcccgcgct ccagtctcct 300 cccgctgcgc tccgcggggc acgcgcggcg cgtgcaggaa cccggagcag ccgcgcacgg 360 gctacagatg cgcgcggctg ccgcctgcgc tcacagctgg tgccggtgag cgctctcggc 420 ctgggccaca gctccgacga gctgatacgt ttccgcttct gcagcggttc gtgccgccga 480 gcacgctccc cgcacgatct cagcctggcc agcctgctgg gcgccggggc cctgcggtct 540 cctcccgggt cccggccgat cagccagccc tgttgccggc ccactcgcta tgaggcagtc 600 tccttcatgg acgtgaacag cacctggaga accgtggacc atctctccgc caccgcctgc 660 ggctgtctgg gctga 675 <210>6 <211> 57 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: K.D2-310 Oligonukleotid <400> 6 gtatctttca tggacgtaaa gtctacatgg agaaccgtag atcatctatc tgcaacc 57 <210> 7 <211> 57 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: KD3-211 Oligonukleotid <400> 7 ggttgcagat agatgatcta cggttctcca tgtagacttt acgtccatga aagatac 57 <210> 8 <211>50 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: KD3-254 Oligonukleotid <400>8 gctggaactc gcagctctcg tgctcgtgca acggatgcaa aaggctgtcg 50 <210>9 <211> 50 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: K.D2-255 Oligonukleotid <400> 9 cgacagcctt ttgcatccgt tgcacgagca cgagagctgc gagttccagc 50 <210> 10 <211> 37 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: K.D3-258 Oligonukleotid <400> 10 ggagccggag cactaaaatc tccccgggat ctagacc 37 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Umelá sekvencia
SK 288123 Β6 <220> <223> Opis umelej sekvencie: KD3-259 Oligonukleotid <400> 11 ggtctagatc ccgggggaga ttttagtgct ccggctcc 38 <210> 12 <211> 32 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: KD3-256 Oligonukleotid <400> 12 gacgaattaa ttaagtttcg tttttgttca gg 32 <210> 13 <211> 32 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: KD3-257 Oligonukleotid <400> 13 cctgaacaaa aacgaaactt aattaattcg tc 32
Claims (22)
- PATENTOVÉ NÁROKYL Polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu aspoň na 90 % identickú s aminokyselinami 8 až 113 zo SEQ ID NO: 1, pričom polypeptid obsahuje aminokyselinu inú ako asparagín v polohe zodpovedajúcej polohe 95 v SEQ ID NO: 1, pričom aminokyselina substituovaná v polohe zodpovedajúcej polohe 95 zavádza miesto, na ktoré môže byť pripojený k polypeptidu polyalkylénglykol.
- 2. Polypeptid podľa nároku 1, kde aminokyselinou v polohe zodpovedajúcej polohe 95 v SEQ ID NO: 1 je lyzín.
- 3. Polypeptid podľa nároku 1 alebo 2, pričom polypeptid obsahuje sekvenciu zvolenú zo skupiny pozostávajúcej z (a) aminokyselín 8 - 94 a 96 - 113 zo SEQ ID NO: 2, (b) aminokyselín 8 - 94 a 96 - 113 zo SEQ ID NO: 3 a (c) aminokyselín 8 - 94 a 96 - 113 zo SEQ ID NO: 4.
- 4. Polypeptid podľa nároku 1, obsahujúci aminokyseliny 1 - 94 a 96 - 113 zo SEQ ID NO: 2, zo SEQ ID NO: 3 alebo zo SEQ ID NO: 4, kde v polohe 95 lyzín je nahradený za asparagín.
- 5. Polypeptid podľa nárokov 1 alebo 2, kde aminokyselinová sekvencia je aspoň na 95 % identická s aminokyselinami 8 - 113 zo SEQ ID NO: 1.
- 6. Polypeptid podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, kde uvedený poplypetid, keď je dimenzovaný, sa vyznačuje aspoň jednou biologickou aktivitou zvolenou zo skupiny pozostávajúcej za) viazania sa na GFRa3;b) stimulácie foforylácie tyrozínu RET polypeptidu;c) zlepšenia prežitia neurónov ad) normalizovania patologických zmien v neuróne.
- 7. Fúzny proteín obsahujúci polypeptid podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov nakondenzovaný na druhú skupinu.
- 8. Fúzny proteín podľa nároku 7, kde druhou skupinou je polypetid ľudského sérového albumínu.
- 9. Nukleová kyselina kódujúca polypeptid podľa niektorého z nárokov 1 až 6 alebo fúzny proteín podľa nárokov 7 alebo 8.
- 10. Vektor obsahujúci nukleovú kyselinu podľa nároku 9.
- 11. Hostiteľská bunka obsahujúca vektor podľa nároku 10.
- 12. Hostiteľská bunka podľa nároku 11, ktorou je bunka vaječníkov čínskeho škrečka.
- 13. Spôsob prípravy polypeptidu podľa niektorého z nárokov 1 až 6 alebo fuzneho proteínu podľa nárokov 7 alebo 8, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa (a) kultiváciu hostiteľskej bunky podľa nárokov 11 alebo 12 v podmienkach umožňujúcich expresiu polypeptidu podľa niektorého z nárokov 1 až 6 alebo fúzneho proteínu podľa nárokov 7 alebo 8, a (b) získanie polypeptidu alebo fúzneho proteínu.
- 14. Dimér obsahujúci dva polypeptidy podľa niektorého z nárokov 1 až 6 alebo dva fuzne proteíny podľa nárokov 7 alebo 8.
- 15. Konjugát obsahujúci polypeptid podľa niektorého z nárokov 1 až 6 konjugovaný s polyalkylénglyko24SK 288123 Β6 lom, pričom polyalkylénglykol je konjugovaný s polypetidom na aminokyseline substituovanej v polohe zodpovedajúcej polohe 95 v SEQ ID NO: 1.
- 16. Konjugát obsahujúci fiizny proteín podľa nárokov 7 alebo 8 konjugované s polyalkylénglykolom, pričom polyalkylénglykol je konjugovaný s fuznym proteínom na aminokyseline substituovanej v polohe zod5 povedajúcej polohe 95 v SEQ ID NO: 1.
- 17. Konjugát podľa nárokov 15 alebo 16, kde polyalkylénglykol je polyetylénglykol.
- 18. Konjugát podľa niektorého z nárokov 15 až 17, kde polypeptid je glykozylovaný.
- 19. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje polypeptid podľa niektorého z nárokov 1 až 6, fuzny proteín podľa nárokov 7 alebo 8, alebo konjugát podľa niektorého z nárokov10 15 až 18 a fyziologicky prijateľné vehikulum.
- 20. Polypeptid podľa niektorého z nárokov 1 až 6, fuzny proteín podľa nárokov 7 alebo 8, alebo konjugát podľa niektorého z nárokov 15 až 18 na použitie na liečenie.
- 21. Použitie polypeptidu podľa niektorého z nárokov 1 až 6, fuzneho proteínu podľa nárokov 7 alebo 8, alebo konjugátu podľa niektorého z nárokov 15 až 18 na prípravu liečiva na liečenie alebo prevenciu ochore15 nia alebo poruchy nervového systému.
- 22. Použitie podľa nároku 21, kde ochorením alebo poruchou je periférna neuropatia alebo neuropatický bolestivý syndróm.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US26607101P | 2001-02-01 | 2001-02-01 | |
PCT/US2002/002319 WO2002060929A2 (en) | 2001-02-01 | 2002-01-25 | Polymer conjugates of neublastin and methods of using same |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SK9712003A3 SK9712003A3 (en) | 2004-01-08 |
SK288123B6 true SK288123B6 (sk) | 2013-09-03 |
Family
ID=23013042
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SK971-2003A SK288123B6 (sk) | 2001-02-01 | 2002-01-25 | Polymer conjugates of neublastin and methods of using same |
Country Status (36)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP1862475A1 (sk) |
JP (2) | JP4259868B2 (sk) |
KR (2) | KR100960063B1 (sk) |
CN (1) | CN1500095B (sk) |
AR (1) | AR035077A1 (sk) |
AT (1) | ATE365748T1 (sk) |
AU (1) | AU2002247037B2 (sk) |
BG (1) | BG66393B1 (sk) |
BR (1) | BR0206852A (sk) |
CA (1) | CA2436407C (sk) |
CY (1) | CY1106886T1 (sk) |
CZ (1) | CZ20032080A3 (sk) |
DE (1) | DE60220879T2 (sk) |
DK (1) | DK1355936T3 (sk) |
EA (1) | EA009771B1 (sk) |
EE (1) | EE05537B1 (sk) |
ES (1) | ES2289091T3 (sk) |
GE (1) | GEP20063916B (sk) |
HK (1) | HK1057759A1 (sk) |
HU (1) | HU228973B1 (sk) |
IL (2) | IL156941A0 (sk) |
IS (1) | IS2867B (sk) |
MX (1) | MXPA03006805A (sk) |
MY (1) | MY143685A (sk) |
NO (1) | NO332150B1 (sk) |
NZ (1) | NZ527863A (sk) |
PL (1) | PL211162B1 (sk) |
PT (1) | PT1355936E (sk) |
RS (1) | RS50857B (sk) |
SG (1) | SG149685A1 (sk) |
SI (1) | SI1355936T1 (sk) |
SK (1) | SK288123B6 (sk) |
TR (1) | TR200301208T2 (sk) |
UA (2) | UA100967C2 (sk) |
WO (1) | WO2002060929A2 (sk) |
ZA (1) | ZA200305733B (sk) |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7442370B2 (en) | 2001-02-01 | 2008-10-28 | Biogen Idec Ma Inc. | Polymer conjugates of mutated neublastin |
WO2002060929A2 (en) * | 2001-02-01 | 2002-08-08 | Biogen, Inc. | Polymer conjugates of neublastin and methods of using same |
US7276580B2 (en) | 2001-03-12 | 2007-10-02 | Biogen Idec Ma Inc. | Neurotrophic factors |
EP1395279B1 (en) * | 2001-03-28 | 2011-10-05 | Biogen Idec MA Inc. | Use of neublastin polypeptides for treating neuropathic pain |
HUE028163T2 (en) * | 2002-01-18 | 2016-11-28 | Biogen Ma Inc | Polyalkylene polymer compounds and their use |
EA008743B1 (ru) * | 2003-01-31 | 2007-08-31 | Байоджен Айдек Ма Инк. | Полимерные конъюгаты мутантного неубластина |
NZ574121A (en) | 2003-04-18 | 2011-06-30 | Biogen Idec Inc | Polyethylene glycol-conjugated gylcosylated neublastin and uses thereof for treatment of pain |
BRPI0411243A (pt) | 2003-06-10 | 2006-07-11 | Nsgene As | método de produzir um polipeptìdio de neublastina biologicamente ativo, ácido nucléico, vetor de expressão, composição farmacêutica, célula, linha de células de compactação, mamìfero não-humano transgênico, dispositivo de cultura de células implantável, uso do vetor, método de tratar uma doença do sistema nervoso, e, polipetìdio de neublastina |
US7598059B2 (en) | 2003-10-02 | 2009-10-06 | Biogen Idec Ma Inc. | Neublastin expression constructs |
NZ553431A (en) | 2004-08-19 | 2010-04-30 | Biogen Idec Inc | Neublastin variants with decreased heparin binding |
CA2577690C (en) * | 2004-08-19 | 2013-08-06 | Biogen Idec Ma Inc. | Refolding transforming growth factor beta family proteins |
TWI501774B (zh) | 2006-02-27 | 2015-10-01 | Biogen Idec Inc | 神經性病症之治療 |
US20100056440A1 (en) * | 2006-03-01 | 2010-03-04 | Biogen Idec Ma Inc. | Compositions and methods for administering gdnf ligand family proteins |
JP2010503630A (ja) | 2006-09-15 | 2010-02-04 | クレアビリス・セラピューティクス・エスピーエー | HMGB1のBox−AおよびHMGB1のBox−A変異体のポリマー複合体 |
EP2142205B1 (en) * | 2007-05-01 | 2014-04-02 | Biogen Idec MA Inc. | Neublastin peptides for use in increasing vascularisation in tissue with impaired blood flow |
PL2773438T5 (pl) * | 2011-11-02 | 2022-01-17 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Chromatografia przeciążenia i elucji |
RU2488635C1 (ru) * | 2012-03-22 | 2013-07-27 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития | Способ получения рекомбинантного антиангиогенного полипептида |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6472178B1 (en) * | 1998-02-27 | 2002-10-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acids encoding a modified ciliary neurotrophic factor and method of making thereof |
US5770577A (en) * | 1994-11-14 | 1998-06-23 | Amgen Inc. | BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol |
US6593133B1 (en) * | 1998-07-06 | 2003-07-15 | Nsgene A/S | Neurotrophic factors |
AU2354600A (en) * | 1998-12-09 | 2000-06-26 | Amgen, Inc. | Grnf4 a neurotrophic factor |
WO2002060929A2 (en) * | 2001-02-01 | 2002-08-08 | Biogen, Inc. | Polymer conjugates of neublastin and methods of using same |
-
2002
- 2002-01-25 WO PCT/US2002/002319 patent/WO2002060929A2/en active IP Right Grant
- 2002-01-25 EA EA200300852A patent/EA009771B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-01-25 CN CN028077539A patent/CN1500095B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-25 AT AT02714792T patent/ATE365748T1/de active
- 2002-01-25 MX MXPA03006805A patent/MXPA03006805A/es active IP Right Grant
- 2002-01-25 UA UAA200802148A patent/UA100967C2/ru unknown
- 2002-01-25 EE EEP200300355A patent/EE05537B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2002-01-25 AR ARP020100279A patent/AR035077A1/es not_active Application Discontinuation
- 2002-01-25 SK SK971-2003A patent/SK288123B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2002-01-25 CA CA2436407A patent/CA2436407C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-25 PL PL372101A patent/PL211162B1/pl unknown
- 2002-01-25 SI SI200230580T patent/SI1355936T1/sl unknown
- 2002-01-25 SG SG200504719-6A patent/SG149685A1/en unknown
- 2002-01-25 EP EP07110666A patent/EP1862475A1/en not_active Withdrawn
- 2002-01-25 IL IL15694102A patent/IL156941A0/xx unknown
- 2002-01-25 GE GE5240A patent/GEP20063916B/en unknown
- 2002-01-25 EP EP02714792A patent/EP1355936B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-25 DE DE60220879T patent/DE60220879T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-25 NZ NZ527863A patent/NZ527863A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-01-25 RS YUP-610/03A patent/RS50857B/sr unknown
- 2002-01-25 UA UA2003088104A patent/UA82983C2/ru unknown
- 2002-01-25 DK DK02714792T patent/DK1355936T3/da active
- 2002-01-25 ES ES02714792T patent/ES2289091T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-25 HU HU0500637A patent/HU228973B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2002-01-25 KR KR1020087022638A patent/KR100960063B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-01-25 CZ CZ20032080A patent/CZ20032080A3/cs unknown
- 2002-01-25 PT PT02714792T patent/PT1355936E/pt unknown
- 2002-01-25 KR KR1020037010127A patent/KR100872807B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-01-25 JP JP2002561497A patent/JP4259868B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-25 BR BR0206852-4A patent/BR0206852A/pt not_active Application Discontinuation
- 2002-01-25 TR TR2003/01208T patent/TR200301208T2/xx unknown
- 2002-01-25 AU AU2002247037A patent/AU2002247037B2/en not_active Ceased
- 2002-02-04 MY MYPI20020368A patent/MY143685A/en unknown
-
2003
- 2003-07-15 IL IL156941A patent/IL156941A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-07-17 IS IS6879A patent/IS2867B/is unknown
- 2003-07-24 ZA ZA2003/05733A patent/ZA200305733B/en unknown
- 2003-08-01 NO NO20033441A patent/NO332150B1/no not_active IP Right Cessation
- 2003-08-19 BG BG108111A patent/BG66393B1/bg unknown
- 2003-11-21 HK HK03108539A patent/HK1057759A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-09-21 CY CY20071101225T patent/CY1106886T1/el unknown
-
2008
- 2008-10-28 JP JP2008277469A patent/JP4423338B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4423338B2 (ja) | ニューブラスチンのポリマー結合体および同様の使用方法。 | |
US8119114B2 (en) | Polymer conjugates of mutated neublastin | |
AU2002247037A1 (en) | Polymer conjugates of neublastin and methods of using same | |
JP2011078434A (ja) | 変異ニューブラスチンのポリマー結合体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees |
Effective date: 20160125 |