PL211162B1 - Polipeptyd wariantu neublastyny, zawierające go białko fuzyjne i sposób ich wytwarzania oraz dimer, kwas nukleinowy, wektor, komórka gospodarza, koniugat, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie - Google Patents

Polipeptyd wariantu neublastyny, zawierające go białko fuzyjne i sposób ich wytwarzania oraz dimer, kwas nukleinowy, wektor, komórka gospodarza, koniugat, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie

Info

Publication number
PL211162B1
PL211162B1 PL372101A PL37210102A PL211162B1 PL 211162 B1 PL211162 B1 PL 211162B1 PL 372101 A PL372101 A PL 372101A PL 37210102 A PL37210102 A PL 37210102A PL 211162 B1 PL211162 B1 PL 211162B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
polypeptide
neublastin
nbn
seq
fusion protein
Prior art date
Application number
PL372101A
Other languages
English (en)
Other versions
PL372101A1 (pl
Inventor
Dinah W.Y. Sah
R.Blake Pepinsky
Paula Ann Borjack-Sjodin
Stephan S. Miller
Anthony Rossomando
Original Assignee
Biogen Idec Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Idec Inc filed Critical Biogen Idec Inc
Publication of PL372101A1 publication Critical patent/PL372101A1/pl
Publication of PL211162B1 publication Critical patent/PL211162B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/4756—Neuregulins, i.e. p185erbB2 ligands, glial growth factor, heregulin, ARIA, neu differentiation factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A61P29/02—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID] without antiinflammatory effect
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)

Description

Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 372101 (22) Data zgłoszenia: 25.01.2002 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
25.01.2002, PCT/US02/002319 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
08.08.2002, WO02/060929 (11) 211162 (13) B1 (51) Int.Cl.
C07K 14/475 (2006.01) A61K 47/48 (2006.01) A61P 25/00 (2006.01)
Polipeptyd wariantu neublastyny, zawierające go białko fuzyjne i sposób ich (54) wytwarzania oraz dimer, kwas nukleinowy, wektor, komórka gospodarza, koniugat, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie (73) Uprawniony z patentu:
BIOGEN IDEC MA INC., Cambridge, US (30) Pierwszeństwo:
01.02.2001, US, 60/266,071 (43) Zgłoszenie ogłoszono:
11.07.2005 BUP 14/05 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.04.2012 WUP 04/12 (72) Twórca(y) wynalazku:
DINAH W.Y. SAH, Boston, US
R.BLAKE PEPINSKY, Arlington, US
PAULA ANN BORJACK-SJODIN, Waltham, US
STEPHAN S. MILLER, Arlington, US
ANTHONY ROSSOMANDO, Revere, US (74) Pełnomocnik:
rzecz. pat. Magdalena Tagowska
PL 211 162 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd wariantu neublastyny, zawierające go białko fuzyjne i sposób ich wytwarzania oraz dimer, kwas nukleinowy, wektor, komórka gospodarza, koniugat, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie.
Czynniki neurotroficzne są naturalnie występującymi peptydami kierującymi przeżyciem, podtrzymaniem różnicowania fenotypowego, zapobiegającymi degeneracji i zwiększającymi aktywność komórek neuronalnych i tkanek. Czynniki neurotroficzne izolowane są z tkanki nerwowej i z tkanki niebędącej tkanką nerwową, która jest unerwiona przez układ nerwowy i zostały zaklasyfikowane do funkcjonalnie i strukturalnie pokrewnych grup, nazywanych także rodzinami, nadrodzinami lub podrodzinami. Do nadrodzin czynników neurotroficznych należą nadrodzina czynnika wzrostowego fibroblastów, neurotrofiny i transformującego czynnika wzrostowego β (TGF-β, ang. transforming growth factor β). Poszczególne rodzaje czynników neurotroficznych są wyróżniane na podstawie ich struktury fizycznej, ich oddziaływania z odpowiednimi receptorami i ich wpływu na różne rodzaje komórek nerwowych. Do nadrodziny TGF-β zaklasyfikowano ligandy neurotroficznego czynnika pochodzącego z linii komórek glejowych (GDNF, ang. glial cell line derived neurotrophic factor), które obejmują GDNF, persefinę (PSP) i neurturynę (NTN).
Ligandy podrodziny GDNF mają wspólną zdolność indukowania przekazu sygnału za pośrednictwem kinazy tyrozynowej dla receptora RET. Te trzy ligandy podrodziny GDNF różnią się swoim względnym powinowactwem wobec rodziny receptorów neurotroficznych - receptorów GFRa.
Opisanym niedawno czynnikiem neurotroficznym jest „neublastyna lub „NBN. Neublastyna została zaklasyfikowana do podrodziny GDNF, ponieważ posiada regiony homologiczne do innych ligandów GDNF oraz ze względu na zdolność wiązania i aktywowania RET. W przeciwieństwie do innych ligandów GDNF, neublastyna jest wysoce selektywna wobec kompleksu receptora GFRa-RET. Dodatkowo, w swojej sekwencji aminokwasowej, NBN zawiera unikatowe podregiony.
Niestety, neublastyna jest usuwana szybko przez organizm. Taki szybkie usuwanie udaremnia użycie neublastyny w zastosowaniach terapeutycznych. Zatem, istnieje potrzeba ustalenia wariantów neublastyny o podwyższonej dostępności biologicznej.
Streszczenie wynalazku
Niniejszy wynalazek jest po części oparty na ujawnieniu nowych form neublastyny, które wykazują ulepszone właściwości farmakokinetyczne i biodostępności in vivo. Te nowe formy obejmują warianty neublastyny skoniugowane z cząsteczkami polimerowymi.
Niniejszym ujawniono polipeptyd wariantu neublastyny lub polipeptyd muteiny neublastyny, który obejmuje sekwencję aminokwasową o jednej lub większej liczbie podstawień aminokwasowych w pozycjach eksponowanych na rozpuszczalnik w dojrzałym dimerze neublastyny. Niniejsze podstawienia wprowadzają do natywnej neublastyny jedno lub większą liczbę miejsc, w których do polipeptydu można przyłączyć substancje takie jak polimery występujące naturalnie lub polimery syntetyczne, tak aby zwiększyć ich rozpuszczalność, a tym samym dostępność biologiczną in vivo.
Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% identyczną z aminokwasami 8-113 z SEKW. NR ID.: 1, który w pozycji odpowiadającej pozycji 95 w SEKW. NR ID.: 1 zawiera aminokwas inny niż asparagina, przy czym polipeptyd kiedy jest zdimeryzowany wiąże się z GFRa3, a podstawienie aminokwasowe w pozycji odpowiadającej pozycji 95 wprowadza miejsce, w którym glikol polialkilenowy może być przyłączony do polipeptydu. Korzystnie, aminokwasem w pozycji odpowiadającej pozycji 95 w SEKW. NR ID.: 1 jest lizyna.
W użytym tu znaczeniu, „neublastyna typu dzikiego lub „wt-NBN dotyczy występującej naturalnie lub natywnej sekwencji polipeptydowej neublastyny, takiej jak neublastyna szczura, myszy lub człowieka (patrz, np. SEKW. NR ID.: 2, 3 lub 4). Konkretne warianty neublastyny określone są tu jako „NBN-X1N1X2 lub „X1N1X2-NBN, przy czym X1 odnosi się do aminokwasu neublastyny typu dzikiego, N1 określa numer pozycji aminokwasu X1 w sekwencji, zgodnie z numeracją z SEKW. NR ID.: 1. X2 dotyczy aminokwasu podstawionego zamiast aminokwasu typu dzikiego we wskazanej liczbowej pozycji w sekwencji. Zatem, przykładowo, NBN-N95K określa wariant neublastyny, w którym asparagina w pozycji 95 jest zastąpiona lizyną.
Wariant neublastyny może być dostarczony jako polipeptyd multimerowy. Dimer może być homodimerem złożonym z jednego polipeptydu wariantu neublastyny. Dimer może też być heterodimerem złożonym z jednego polipeptydu wariantu neublastyny i jednego polipeptydu neublastyny typu
PL 211 162 B1 dzikiego. Inne dimery mogą zawierać dwie różne formy peptydów wariantu neublastyny. Zatem przedmiotem wynalazku jest także dimer obejmujący dwa polipeptydy według wynalazku.
Wariant neublastyny według wynalazku, wówczas gdy jest dimerem, stymuluje także fosforylację tyrozyny z polipeptydu RET samodzielnie lub w postaci związanej z GFRa3. Ponadto polipeptyd wariantu neublastyny, wówczas gdy jest zdimeryzowany, zwiększa przeżywalność neuronu, np. zwiększa przeżywalność neuronu czuciowego.
Polipeptyd wariantu neublastyny według wynalazku, wówczas gdy jest zdimeryzowany, normalizuje patologiczne zmiany neuronu, np. takiego jak neuron czuciowy.
Polipeptyd wariantu neublastyny, wówczas gdy jest zdimeryzowany, zwiększa także przeżywalność neuronu, np. neuronu autonomicznego lub neuronu dopaminergicznego.
W korzystnej postaci wykonania polipeptyd według wynalazku obejmuje aminokwasy 8-113 lub aminokwasy 1-113 z SEKW. NR ID.: 2, SEKW. NR ID.: 3 lub SEKW. NR ID.: 4, przy czym aminokwas inny niż asparagina jest podstawiony za asparaginę w pozycji 95, a w szczególności aminokwasem podstawionym za asparaginę w pozycji 95 jest lizyna.
W korzystnej postaci wykonania polipeptyd według wynalazku jest co najmniej w 95% identyczny z aminokwasami 8-113 z SEKW. NR ID.: 1 lub aminokwasami 8-113 z SEKW. NR ID.: 2.
Wynalazek dostarcza także białko fuzyjne, które obejmuje polipeptyd wariantu neublastyny według wynalazku połączony z drugim ugrupowaniem. Białka fuzyjne neublastyny posiadają lepszą farmakokinetykę i biodostępność in vivo. Korzystnie drugie ugrupowanie stanowi polipeptyd ludzkiej albuminy surowiczej.
Przedmiotem wynalazku jest także dimer obejmujący dwa białka fuzyjne według wynalazku.
W innym aspekcie wynalazek dostarcza cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd wariantu neublastyny lub białko fuzyjne według wynalazku. Kwas nukleinowy kodujący polipeptyd wariantu neublastyny korzystnie jest dostarczany w wektorze, np. w wektorze ekspresyjnym, który stanowi kolejny aspekt wynalazku. Kwas nukleinowy wariantu neublastyny lub wektor go zawierający można wprowadzić do komórki. Przedmiotem wynalazku jest zatem komórka gospodarza zawierająca wektor według wynalazku. Komórką gospodarza może być np. komórka ssaka, komórka grzyba, komórka drożdży, komórka owada lub komórka bakterii. Korzystną komórką gospodarza jest komórka jajnika chomika chińskiego (komórka „CHO).
Wynalazek dostarcza także sposobu wytwarzania polipeptydu wariantu neublastyny lub białka fuzyjnego według wynalazku poprzez hodowanie komórki według wynalazku w warunkach pozwalających na wytwarzanie polipeptydu wariantu neublastyny lub białka fuzyjnego według wynalazku oraz odzyskiwanie polipeptydu wariantu neublastyny lub białka fuzyjnego.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto koniugat obejmujący polipeptyd lub białko fuzyjne według wynalazku skoniugowane z glikolem polialkilenowym, przy czym glikol polialkilenowy jest skoniugowany z polipeptydem w reszcie aminokwasowej podstawionej w pozycji odpowiadającej pozycji 95 w SEKW. NR ID.:1. Korzystnie glikolem polialkilenowym w koniugacie według wynalazku jest glikol polietylenowy (PEG), a polipeptyd jest glikozylowany.
Ugrupowanie glikolu polialkilenowego może być sprzężone z grupą aminową neublastyny lub lizyną w wariancie neublastyny.
Sprzęganie może być prowadzone z zastosowaniem aktywnego estru N-hydroksysukcynoimidowy (NHS). Aktywnym estrem może być, przykładowo, sukcynoimidylobursztynian PEG (SS-PEG), sukcynoimidylomaślan PEG (SPB) albo sukcynoimidylopropionian PEG (SPA-PEG).
Ugrupowaniem glikolu polialkilenowego może być, przykładowo, karboksymetylo-NHS, norleucyno-NHS, SC-PEG, tresylan, aldehyd, epoksyd, karbonyloimidazol lub węglan PNP.
Ugrupowanie glikolu polialkilenowego może być sprzężone z grupą cysteinową polipeptydu neublastyny lub polipeptydu wariantu neublastyny. Przykładowo, sprzęganie może zachodzić przez grupę maleinoimidową, halogenooctanową, winylosulfonową i tiolową.
Neublastyna lub wariant neublastyny mogą być glikozylowane. Wówczas gdy neublastyna lub wariant neublastyny są glikozylowane polimer może być sprzężony z ugrupowaniem węglowodanowym glikozylowanego polipeptydu neublastyny lub polipeptydu wariantu neublastyny. Przykładowo, polimer może być sprzężony z glikozylowanym polipeptydem neublastyny lub polipeptydem wariantu neublastyny po utlenieniu grupy hydrazolowej lub grupy aminowej glikozylowanego polipeptydu neublastyny lub polipeptydu wariantu neublastyny, lub po utlenieniu grupy reaktywnej polimeru.
Polipeptyd neublastyny lub polipepytd wariantu neublastyny mogą obejmować jedną, dwie, trzy lub cztery reszty PEG.
PL 211 162 B1
Polipeptyd neublastyny, polipeptyd wariantu neublastyny lub koniugat polimeru wykazuje dłuższy okres półtrwania w surowicy w porównaniu z okresem półtrwania polipeptydu lub polipeptydu wariantu polipeptydu w nieobecności polimeru.
Polipeptyd neublastyny, polipeptyd wariantu neublastyny lub koniugat polimerowy w kompleksie posiada aktywność fizjologiczną wybraną z grupy składającej się z wiązania GRFa3, aktywacji RET, normalizacji patologicznych zmian neuronu lub zwiększenia przeżywalności neuronu.
„Normalizacja patologicznych zmian neuronu oznacza, że koniugat indukuje zmianę jednego lub większej liczby następujących parametrów komórkowych: ekspresja poziomu białka strukturalnego, receptora czynnika neutroficznego, kanału jonowego lub neurotransmitera lub indukuje zmiany morfologiczne komórki, w każdym z przypadków w taki sposób, że zasadniczo przywraca dany parametr do poziomu jaki znajduje się w neuronie, tego samego lub podobnego typu, który nie jest zmieniony przez chorobę, degenerację, uraz lub zranienie. Normalizację patologicznych zmian neuronu można monitorować za pomocą immunohistochemii lub poprzez ocenianie zmian na poziomie wydzielania lub wydalania produktów komórkowych, lub poprzez ocenianie zmian zachodzących in vivo w zachowaniu fizjologicznie przypisanemu funkcji zmienionego neuronu(ów). Przykładowo, w przypadku zmian patologicznych związanych z zespołem bólu neuropatycznego można monitorować zachowania bólowe, takie jak przeczulica bólowa, niedoczulica bólowa lub allodynia.
„Zwiększenie przeżywalności neuronu oznacza przedłużenie przeżywalności zmienionego neuronu ponad okres przeżywalności obserwowany w odpowiadającym mu neuronie zmienionym przez ten sam typ choroby, zaburzenie, uraz lub zranienie którego nie poddawano działaniu koniugatu neuroblastyny lub białka fuzyjnego według wynalazku.
Polimer może być sprzężony z polipeptydem w miejscu neublastyny położonym na końcu N lub w miejscu nie położonym na końcowym aminokwasie polipeptydu neublastyny lub polipeptydu wariantu neublastyny.
Korzystnie polimer jest sprzężony z aminokwasem polipeptydu wariantu neublastyny eksponowanym na rozpuszczalnik.
Polimer może być sprzężony z polipeptydem neublastyny lub polipeptydem wariantu neublastyny w reszcie aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z aminokwasu z końca N polipeptydu wariantu, z pozycji 14 sekwencji aminokwasowej polipeptydu neublastyny lub polipeptydu wariantu neublastyny, z pozycji 39 sekwencji aminokwasowej polipeptydu neublastyny lub polipeptydu wariantu neublastyny, z pozycji 68 sekwencji aminokwasowej polipeptydu neublastyny lub polipeptydu wariantu neublastyny i z pozycji 95 sekwencji aminokwasowej polipeptydu neublastyny lub polipeptydu wariantu neublastyny.
Wynalazek dostarcza także kompozycji farmaceutycznej obejmującej fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę zawierającą lub z rozproszonym w niej polipeptydem wariantu neublastyny, białka fuzyjnego lub koniugatu według wynalazku.
Niniejszym opisano także stabilny, rozpuszczalny w wodzie kompleks skoniugowanego polipeptydu neublastyny lub polipeptydu wariantu neublastyny, obejmujący polipeptyd neublastyny lub polipeptyd wariantu neublastyny sprzężony z ugrupowaniem glikolu polietylenowego, przy czym polipeptyd neublastyny lub polipeptyd wariantu neublastyny są sprzęgane z ugrupowaniem glikolu polietylenowego przez labilne wiązanie. Takie labilne wiązanie można rozcinać poprzez hydrolizę biochemiczną, proteolizę lub cięcie sulfhydrylowe. Wiązanie labilne może ulegać cięciu w warunkach in vivo.
Poniżej opisano także sposób wytwarzania polipeptydu zmodyfikowanej neublastyny, która wykazuje przedłużoną aktywność in vitro lub in vivo, w stosunku do neublastyny typu dzikiego, poprzez dostarczenie polipeptydu neublastyny lub polipeptydu wariantu neublastyny i sprzęganie polipeptydu lub polipeptydu zmodyfikowanego wariantu neublastyny z niewystępującym naturalnie ugrupowaniem polimeru, tworząc tym samym kompozycję polimeru sprzężonego z polipeptydem neublastyny.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie polipeptydu, białka fuzyjnego lub koniugatu według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia albo zapobiegania chorobom lub zaburzeniom układu nerwowego, a w szczególności neuropatii obwodowej lub zespołu bólu neuropatycznego.
Poniżej przedstawiono ponadto sposób leczenia lub zapobiegania zaburzeniu układu nerwowego u pacjenta (takiego jak człowiek), przez podawanie potrzebującemu tego pacjentowi terapeutycznie skutecznej ilości polipeptydu wariantu neublastyny, kompozycji zawierającej polipeptyd neublastyny lub polipeptyd wariantu neublastyny sprzężony z polimerem albo stabilnego, rozpuszczalnego w wodzie kompleksu skoniugowanego polipeptydu neublastyny lub polipeptydu wariantu neublastyny,
PL 211 162 B1 obejmującego polipeptyd neublastyny lub polipeptyd wariantu neublastyny sprzężony z ugrupowaniem glikolu polietylenowego. Podawanie może być, przykładowo, do układowe lub domiejscowe.
Użyte tu terminy techniczne i naukowe, o ile nie zostaną inaczej zdefiniowane, posiadają takie samo znaczenie jak powszechnie rozumiane przez specjalistów w dziedzinie, do której należy wynalazek. Wszystkie przytaczane tu publikacje, zgłoszenia patentowe, patenty i inne odnośniki są wprowadzone w całości na drodze odniesienia. Dodatkowo, materiały, metody i przykłady są podane jedynie jako ilustracja i nie mają na celu ograniczenia wynalazku.
Inne cechy i zalety wynalazku będą oczywiste dzięki następującemu szczegółowemu opisowi i zastrzeż eniom.
Szczegółowy opis wynalazku
Wynalazek dostarcza nowe polipeptydy wariantu neublastyny, które można modyfikować w celu ulepszenia właściwości farmakokinetycznych i dostępności biologicznej. Korzystne warianty neublastyny mają zmienione sekwencje aminokwasowe, co ułatwia sprzęganie z czynnikiem polimerowym, takim jak polimer glikolu polialkilenowego.
Warianty neublastyny
Wynalazek dotyczy wariantów sekwencji aminokwasowych, które zostały opisane w odniesieniu do sekwencji neublastyny dzikiego typu. Sekwencje aminokwasowe ludzkiej i mysiej neublastyny ujawniono w WO00/01815. Przykłady polipeptydów wariantów neublastyny przedstawiono w Tabeli 1.
Zmienione reszty w wariantach neublastyny są wybrane w celu ulepszenia sprzęgania polimeru, takiego jak glikol polialkilenowy w miejscu zmodyfikowanego aminokwasu. Korzystnymi miejscami modyfikacji neublastyny są te położone w polipeptydzie neublastyny w regionach dostępnych dla rozpuszczalnika. Miejsca takie można wybrać w oparciu o badanie struktury krystalicznej pokrewnego czynnika neurotroficznego, GDNF, którego strukturę krystaliczną opisano w Nat. Struct. Biol. 4:435-38, 1997. Miejsca można również wybrać na podstawie informacji strukturalno funkcjonalnych dostarczonych dla białek chimerowych persefina/neublastyna. Chimery te opisano w J. Biol. Chem. 275:3412-20, 2000. Przykładową listę zidentyfikowanych w ten sposób, dostępnych dla rozpuszczalnika lub eksponowanych na powierzchni aminokwasów neublastyny przedstawiono w Tabeli 2.
Wynalazek obejmuje polipeptyd wariantu neublastyny, zawierający sekwencję aminokwasową, która jest co najmniej w 90% identyczna z aminokwasami 8-113 z SEKW. NR ID.: 1, przedstawionej w Tabeli 1. W niektórych przypadkach jedna lub większa liczba arginin w pozycji 14, pozycji 39, pozycji 68 lub asparagina w pozycji 95, z sekwencji aminokwasowej polipeptydu, może być zamieniona przez aminokwas inny niż arginina lub asparagina. Korzystnie aminokwas dzikiego typu jest zamieniony przez lizynę lub cysteinę.
Tabela 1.
AGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRF AGTRSSRARTTDARGCRLRSQLVPVSALGLGHSSDEI,IRF >ysz AGTRSSRARATDARGCRLRSQLVPVSALGLGHSSDSLIRF szczur ag---srar---argcrlrsqlvpv-alglgh‘-sdel-xf konsensus
RFCSGSCRRARSPHDLSLASLIjGAGALRPPPGSRP^ySGPC człowiek RFCSGSCRRARSQHDLSLASIłLGAGALRS?PGSRPlSQPC nysz RFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALKSPPGSRPISOPC szczur rfcsgscrrars-hdlslasilgagalr-ppgsrp-sąpc konsensus
CRPTRYEAVSFMDVKSTWRTVDRLS ATACGCLG CRPTRYEAySFMDWSTWRTTDHLSATACGCLG CRPTRYEAVSFMDWSTORTVDHLSATACGCLG c rp t ry e a vs f mdvns twr t vd~ 1 s a t a cg c 1 g człowiek mysz szczur
SEKW. NR ID.:2 SEKW. NP. ID.:3 SEKW. NP ID.:4 konsensus SEKW. NP ID.:1
PL 211 162 B1
Sekwencja najwyższej zgodności:
Ala Gly xaa: Xaa2 Xaa3 Ser Arg Ala Arg Xaa4 Xaa5 Xaa6 Ala Arg Gly Cys
Arg Leu Arg Ser Gin Leu Val Pro Val Xaa3 Ala Leu Gly Leu Gly His Xaa8 Ser
Asp Glu Leu Xaa9 Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Xaal0 His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Xaau Pro Pro Gly Ser Arg Pro Xaai2 Ser Gin Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Xaa13 Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly przy czym:
Xaa1 jest Gly lub Thr
Xaa2 jest Pro lub Arg
Xaa3 jest Gly lub Ser
Xaa4 jest Ala lub Thr
Xaa5 jest Ala lub Thr
Xaa6 jest Gly lub Asp
Xaa7 jest Arg lub Ser
Xaa8 jest Arg lub Ser
Xaa9 jest Val lub Ile
Xaa10 jest Pro lub Gln
Xaa11 jest Pro lub Ser
Xaa12 jest Val lub Ile
Xaa13 jest Arg lub His
Tabela 2 dostarcza listę reszt i numery w ludzkiej neublastynie, co do których spodziewana jest ekspozycja na powierzchni. Reszty eksponowane na powierzchni ustalono poprzez zbadanie dimeru GDNF utworzonego przez łańcuchy A i B (PDB kod 1AGQ) i ustalenie czy reszta znajdowała się na powierzchni tej struktury. Następnie strukturę tę porównywano z przyrównaniem sekwencji GDNF i neublastyny w Baloh i wsp., Neuron, wol. 21, str. 1291, 1998 w celu ustalenia odpowiednich reszt w neublastynie.
Schemat numerowania jest taki jak pokazano w Tabeli 1.
Tabela 2
8 Ala n/a 16 Cys- 70 24ΡΪΟ + 32 His-h 40 Phe -
1 Ala n/a 55 9 Arg n/a 17 Arg + 25 Val- 33 Arg + 41 Arg +
2 Gly n/a 10 Ala n/a 18 Leu + 26 Arg + 80 34 Ser- 42 Phe 4
3 Gl y n/a 11 Ala n/a 65 19 Arg + 27 Ala + 35 Asp-5- 43 Cys -
4 Pro n/a 12 Gly + 20 Ser + 28 Leu - 36 Glu + 90 44 Ser +
5 Gly n/a 13 Ala - 21 Gin + 75 29 Gly + 37 Leu + 45 Gly +
6 Ser n/a 60 14 Arg + 22 Leu + 30 Leu + 38Val- 46 Ser +
7 Arg n/a 15 Gly + 23 Val- 31 Gly + 85 39 Arg + 47 Cys -
PL 211 162 B1
Arg +
Arg F
Ala51 Arg*
52 Ser +
Fro *
His 55 Asp 56 Leu* 10 57 Ser 58 Leu59 Ala *
Ser * i Leu 15 62 Leu +
Gly *
Ala *
Gly*
Ala 4» 20 67 Leu 68 Arg n/a
Pro n/a
Pro n/a
Pro n/a 25 72 Gly*
Ser*
Arg n/a
Pro n/a
Val30 77 Ser78 Gin *
Pro 80 Cys 81 Cys35 82 Arg83 Pro84 Thr *
Arg *
Tyr * 40 87 Glu +
Ala +
Val*
Ser *
Phe 45 92 Met*
Asp * 94Val*
Asn *
Ser* 50 97Thr*
Trp*
Arg *
100 Thr*
101 Val55 102 Asp*
103 Al g *
104 Leu 105 Ser106 Ala60 107Thr +
108 Ala*
109 CysΠ0 Gly* niCys65 112Leu* 113 Gly n/a
PL 211 162 B1 „n/a wskazuje, że reszty nie są obecne w strukturze GDNF. Wynika to z projektu konstruktu, występowania elastycznych regionów lub wstawek w neublastynie w porównaniu z GDNF (reszty 68-71).
„- wskazuje, że reszty są ukryte i nie występują na powierzchni lub są resztami cysteinowymi wymaganymi do tworzenia wiązań dwusiarczkowych. Jeśli białko jest węzłem cysteinowym, większość reszt znajduje się na powierzchni.
„+ wskazuje, że reszta jest eksponowana na powierzchni w strukturze GDNF, a zatem przypuszczalnie jest eksponowana na powierzchni neublastyny, chociaż pętla zawierająca reszty 66-75 jest widoczna tylko w jednym z monomerów GDNF (przypuszczalnie elastycznym). W neublastynie pętla ta, w stosunku do GDNF, zawiera również wstawkę z 4 reszt.
Stosowane tu określenia „identyczność i „homologiczny lub „homologia są używane wymiennie i odnoszą się do podobieństwa sekwencji dwóch polipeptydów, cząsteczek lub dwóch kwasów nukleinowych. Kiedy pozycja w obu porównywanych sekwencjach jest zajmowana przez tę samą zasadową lub aminokwasową podjednostkę monomerową (przykładowo, jeśli pozycja w każdej z dwóch cząsteczek DNA jest zajmowana przez adeninę lub pozycja w każdym z dwóch polipeptydów jest zajmowana przez lizynę) wówczas poszczególne cząsteczki są homologiczne w tej pozycji. Procent homologii pomiędzy dwiema sekwencjami jest funkcją liczby dopasowań lub pozycji homologicznych wspólnych dla obu sekwencji podzielonej przez liczbę porównywanych pozycji x 100. Przykładowo, jeśli 6 z 10 pozycji w dwóch sekwencjach pasuje do siebie lub jest homologicznych to takie dwie sekwencje mają 60% homologii. Przykładowo, sekwencje DNA CTGACT i CAGGTT mają 50% homologii (3 z 6 wszystkich pozycji są pasujące). Ogólnie, porównanie jest przeprowadzone jeśli dwie sekwencje są przyrównane tak, że dają maksymalną homologię. Przyrównanie takie można przeprowadzić przy użyciu, przykładowo, metody według Needlemana i wsp., J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970), realizowanej bez trudności przez programy komputerowe takie jak program Align (DNAstar, Inc.). Sekwencjami „podobnymi są takie sekwencje, które po przyrównaniu mają identyczne lub podobne reszty aminokwasowe, gdzie reszty podobne są konserwatywnymi podstawieniami lub „dozwolonymi mutacjami punktowymi odpowiadających reszt aminokwasowych w przyrównywanej sekwencji odniesienia. Pod tym względem „konserwatywne podstawienie reszty w sekwencji odniesienia jest podstawieniem przez resztę, która jest fizycznie lub funkcjonalnie podobna do odpowiadającej reszty odniesienia, np. posiada podobny rozmiar, kształt, ładunek elektryczny, własności chemiczne, włączając zdolność do tworzenia wiązań kowalencyjnych lub wodorowych lub temu podobne. Zatem, sekwencja będąca „wariantem konserwatywnego podstawienia jest tą, która różni się od sekwencji odniesienia lub sekwencji dzikiego typu, w której jest obecne jedno lub więcej konserwatywnych podstawień lub są obecne dozwolone mutacje punktowe.
W korzystnych wykonaniach, polipeptyd wedł ug wynalazku jest w 90%, 95%, 98% lub 99% identyczny z aminokwasami 8-113 z SEKW. NR ID.: 1. W niektórych wykonaniach sekwencja aminokwasowa wariantu neublastyny zawiera sekwencję aminokwasową naturalnie występującej neublastyny szczurzej, ludzkiej lub mysiej w aminokwasach 1-94 i 96-113 wariantu neublastyny, np. w pozycjach tych polipeptyd posiada sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID.: 2, 3 lub 4.
Wariant neublastyny różniący się sekwencją od tych ujawnionych w SEKW. NR ID.: 1-4 może zawierać jedno lub więcej konserwatywnych podstawień aminokwasowych. Alternatywnie, lub dodatkowo, wariant neublastyny może różnić się jednym lub większą liczbą konserwatywnych podstawień aminokwasowych lub delecjami lub insercjami. Korzystnie, podstawienia, insercje lub delecje nie znoszą biologicznej aktywności izolowanych białek.
Konserwatywne podstawienia zazwyczaj zawierają podstawienie jednego aminokwasu przez inny, o podobnej charakterystyce, jak podstawienia w obrębie następującej grupy: walina, alanina i glicyna; leucyna, walina i izoleucyna; kwas asparaginowy i kwas glutaminowy; asparagina i glutamina; seryna, cysteina i treonina; lizyna i arginina; oraz fenyloalanina i tyrozyna. Niepolarne, hydrofobowe aminokwasy obejmują alaninę, leucynę, izoleucynę, walinę, prolinę, fenyloalaninę, tryptofan i metioninę. Polarne, neutralne aminokwasy obejmują glicynę, serynę, treoninę, cysteinę, tyrozynę, asparaginę i glutaminę. Dodatnio naładowane (zasadowe) aminokwasy obejmują argininę, lizynę i histydynę. Ujemnie naładowane (kwaśne) aminokwasy obejmują kwas asparaginowy i kwas glutaminowy. Specjaliści bez trudu potrafią zidentyfikować inne podstawienia. Przykładowo, podstawienie alaniny może mieć miejsce dowolnym z aminokwasów: D-alanina, glicyna, beta-alanina, L-cysteina i D-cysteina. Lizyna może być wymieniona na dowolny z aminokwasów: D-lizyna, arginina, D-arginina, homo-arginina, metionina, D-metionina, ornityna lub D-ornityna. Ogólnie można oczekiwać, że podstawienia w regionach istotnych dla funkcji mogące indukować zmiany we właściwościach izolowanych polipepPL 211 162 B1 tydów są takimi, w których: (i) reszta polarna, np. seryna lub treonina, jest podstawiona za (przez) resztę hydrofobową, np. leucynę, izoleucynę, fenyloalaninę lub alaninę; (ii) reszta cysteinowa jest podstawiona za (przez) dowolną inną resztę; (iii) reszta posiadająca dodatnio naładowany łańcuch boczny, np. lizyna, arginina lub histydyna, jest podstawiona za (przez) resztę posiadającą ujemnie naładowany łańcuch boczny, np. kwas glutaminowy lub kwas asparaginowy; lub (iv) reszta posiadająca duży łańcuch boczny, np. fenyloalanina, jest podstawiona za (przez) resztę, która nie posiada takiego łańcucha bocznego, np. glicynę. Prawdopodobieństwo, że jedno z powyższych niekonserwatywnych podstawień może zmienić właściwości białka jest także skorelowane z miejscem podstawienia w odniesieniu do regionów istotnych dla funkcji białka: niektóre niekonserwatywne podstawienia mogą przeto posiadać mały lub nie posiadać wpływu na właściwości biologiczne.
Wynalazek dostarcza także polipeptydy multimerowe, które obejmują wariant neublastyny. Polipeptydy multimerowe są korzystnie dostarczane jako oczyszczone polipeptydy multimerowe. Przykłady kompleksów multimerowych obejmują np. kompleksy dimerów. Kompleks multimerowy może być dostarczony jako kompleks heteromerowy lub homomerowy. Zatem, kompleks multimerowy może być kompleksem heterodimerowym, obejmującym jeden wariant neublastyny i neublastynę nie będącą wariantem, lub kompleksem heterodimerowym obejmującym dwa lub więcej wariantów neublastyny.
Polipeptyd wariantu neublastyny według wynalazku wiąże się z GFRa3. Korzystnie, wiązanie wariantu neublastyny stymuluje fosforylację polipeptydu RET. W celu określenia czy polipeptyd wiąże się z GFRa3 można przeprowadzić testy opisane w WO00/01815. Przykładowo, obecność neublastyny w supernatantach pożywek z linią komórkową CHO można opisać przy użyciu zmodyfikowanej formy testu trójskładnikowego kompleksu opisanego przez Sanicola i wsp. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94:6238). W teście tym, można oszacować zdolność cząsteczek typu GDNF do pośredniczenia w wiązaniu pomiędzy zewnątrzkomórkową domeną RET i różnymi ko-receptorami, GFRa1, GFRa2 i GFRa3. Rozpuszczalne formy RET i ko-receptorów są wytwarzane jako białka fuzyjne. Białko fuzyjne pomiędzy zewnątrzkomórkową domeną szczurzego RET i fosfatazą alkaliczną z łożyska (RET-AP) oraz białko fuzyjne pomiędzy zewnątrzkomórkową domeną szczurzego GFRa-1 (ujawnioną w opublikowanym zgłoszeniu WO9744356; 27 listopad 1997) i domeną Fc ludzkiego IgG1 (rGFR(a1-Ig) opisano w Sanicola i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94:6238).
Wariant neublastyny zwiększa przeżycie neuronu, normalizuje zmiany patologiczne neuronu lub prowadzi do obu tych zjawisk. Testy określające czy polipeptyd zwiększa przeżycie neuronu czy normalizuje zmiany patologiczne neuronu opisano w WO00/01815. Korzystnie, neuron jest neuronem czuciowym, neuronem autonomicznym lub neuronem dopaminergicznym.
Synteza i izolacja polipeptydów wariantów neublastyny
Polipeptydy wariantu neublastyny można izolować przy użyciu metod znanych specjalistom. Naturalnie występujące polipeptydy neublastyny można izolować z komórek lub źródeł tkanki za pomocą odpowiedniego schematu oczyszczania przy użyciu standardowych technik oczyszczania białek. Alternatywnie, warianty neublastyny można syntetyzować chemicznie przy użyciu standardowych technik syntezy peptydów. Synteza krótkich sekwencji aminokwasowych jest dobrze opracowana przez specjalistów w tej dziedzinie. Patrz, np. Stewart i wsp., Solid Phase Peptide Synthesis (wyd. 2, 1984).
Warianty neublastyny mogą być wytwarzane za pomocą technik rekombinacji DNA. Przykładowo, cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą wariant neublastyny można wprowadzić do wektora, np. wektora ekspresyjnego, i kwas nukleinowy można wprowadzić do komórki. Stosowne komórki obejmują np. komórki ssacze (takie jak komórki ludzkie lub komórki jajnika chomika chińskiego), komórki grzyba, komórki drożdży, komórki owada lub komórki bakterii. W celu wyrażenia w zrekombinowanej komórce, komórka jest korzystnie hodowana w warunkach umożliwiających wyrażenie wariantu neublastyny. Jeśli jest to pożądane, wariant neublastyny można odzyskać z zawiesiny komórek. „Odzyskać oznacza, że wariant polipeptydu usuwany jest z tych składników komórki lub pożywki hodowlanej, w których jest obecny przed procesem odzyskiwania. Proces odzyskiwania może obejmować jeden lub większą liczbę etapów ponownego fałdowania lub oczyszczania.
Warianty neublastyny można konstruować przy użyciu wielu sposobów znanych specjalistom. Jednym z takich sposobów jest ukierunkowana mutageneza, w której określony nukleotyd (lub jeśli pożądane niewielka liczba określonych nukleotydów) jest zmieniony w celu zmiany pojedynczego aminokwasu (lub jeśli pożądane niewielkiej liczby określonych wcześniej reszt aminokwasowych) w zakodowanym polipeptydzie neublastyny. Specjaliści w dziedzinie wiedzą, że ukierunkowana mutageneza jest rutynową i szeroko stosowaną techniką. Faktycznie, wiele zestawów do ukierunkowanej
PL 211 162 B1 mutagenezy jest dostępnych handlowo. Jednym z takich zestawów jest „Transformer Site Directed
Mutagenesis Kit sprzedawany przez Clontech Laboratories (Palo Alto, Kalifornia).
Zastosowanie w praktyce niniejszego wynalazku będzie wymagało wykorzystania, o ile nie wskazano inaczej, klasycznych technik biologii komórki, hodowli komórkowych, biologii molekularnej, mikrobiologii, rekombinacji DNA, chemii białek i immunologii należących do zakresu umiejętności specjalistów w tej dziedzinie. Techniki te są opisane w literaturze. Patrz, przykładowo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2 (Sambrook, Fritsch i Maniatis, red.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, tom I i II (D.N. Glover, red.), 1985; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, red.), 1984; patent USA nr 4683195 (Mullis i wsp.); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Haines i S.J. Higgins, red.), 1984; Transcription and Translation (B.D. Hames i S.J. Higgins, red.), 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, red.), Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (13.Perbal), 1984; Methods in Enzymology, tom 154 i 155 (Wu i wsp., red.) Academic Press, Nowy Jork; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller i M.P. Calos red.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Meyer i Walker, red.), Academic Press, Londyn, 1987; Handbook of Experiment Immunology, tomy I-IV (D.M. Weir i CC. Blackwell, red.), 1986; Manipulating the Mouse Embrio, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.
Białka fuzyjne z wariantem neublastyny
Jeśli jest to pożądane, wariant neublastyny można dostarczyć jako białko fuzyjne. Pochodne fuzyjne białek według wynalazku obejmują także różne strukturalne formy białka pierwotnego, które zachowują aktywność biologiczną. Użyty tu termin „fuzja odnosi się do współliniowego, kowalencyjnego połączenia dwóch lub większej liczby białek lub ich fragmentów poprzez ich indywidualne szkielety, najkorzystniej poprzez genetyczną ekspresję cząsteczki polinukleotydowej kodującej te białka w tej samej ramce odczytu (tzn. „w ramce). Korzystnie białka lub ich fragmenty pochodzą z różnych źródeł. Zatem, korzystne białka fuzyjne obejmują wariant neublastyny lub jego fragment kowalencyjnie związany z drugim ugrupowaniem, które nie jest wariantem neublastyny. Korzystnie, drugie ugrupowanie pochodzi z polipeptydu, który istnieje jako monomer i jest wystarczający do zwiększenia rozpuszczalności i/lub dostępności biologicznej neublastyny.
Przykładowo, „fuzja wariant neublastyny/ludzka albumina surowicza jest białkiem obejmującym polipeptyd wariantu neublastyny według wynalazku, lub jej fragment, którego koniec N lub koniec C jest połączony w ramce z ludzką albuminą surowiczą (patrz, Syed i wsp., Blood, 1997, 89: 3243 oraz Yeh i wsp. P.N.A.S. USA, 1992, 89-1904) oraz patent US nr 5876969 i 5302697. Termin „białko fuzyjne obejmuje wariant neublastyny chemicznie połączony poprzez mono- lub hetero- funkcjonalną cząsteczkę z drugim ugrupowaniem, które nie jest polipeptydem wariantu neublastyny, przy czym białko fuzyjne jest uzyskiwane de novo z oczyszczonego białka jak opisano poniżej.
Fuzje neublastyna-albumina surowicza można konstruować przy użyciu sposobów dobrze znanych w dziedzinie. Do łączenia neublastyny z albuminą surowiczą można stosować dowolną liczbę czynników sieciujących, które zawierają odpowiednie grupy aminoreaktywne i tioloworeaktywne. Przykłady stosownych łączników obejmują aminoreaktywne czynniki sieciujące, które wprowadzają tioloworeaktywny imid kwasu maleinowego. Obejmują one np. SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS lub GMBS. Inne stosowne łączniki wprowadzają tioloworeaktywną grupę halogenooctanową. Obejmują one np. SBAP, SIA, SLAB, a tymi, które wprowadzają zabezpieczoną i niezabezpieczoną grupę tiolową do reakcji z grupami sulfhydrylowymi w celu wytwarzania możliwego do zredukowania połączenia są SPDP, SMPT, SATA lub SATP, wszystkie dostępne handlowo (np. Pierce Chemicals). Specjalista w dziedzinie może podobnie wyobrazić sobie alternatywne strategie połączenia końca N neublastyny z albuminą surowiczą.
Jest także wyobrażalne, że specjalista w dziedzinie może wytworzyć koniugaty z albuminą surowiczą, które nie stanowią miejsc docelowych na końcu N z NBN lub w grupie tiolowej z albuminy surowiczej. Jeśli pożądane, fuzję NBN-albumina surowicza można wytwarzać przy użyciu technik inżynierii genetycznej, przy czym NBN jest łączone z genem albuminy surowiczej na jej końcu N, końcu C lub na obu końcach.
Dalej uważa się, że dowolny koniugat NBN, dający produkt o przedłużonym okresie półtrwania u zwierząt (w tym ludzi) można wytwarzać przy użyciu podobnej strategii.
Inne pochodne wariantu neublastyny obejmują połączone kowalencyjne lub zagregowane koniugaty wariantu neublastyny lub jej fragmentów z innymi białkami lub polipeptydami, takie jak uzyskane przez syntezę w hodowli rekombinanta, przez dodanie końca N lub C. Przykładowo, koniugoPL 211 162 B1 wany peptyd może być sekwencją peptydu (lidera) sygnałowego w regionie końca N białka, który w czasie translacji lub po translacji kieruje przeniesieniem białka z miejsca jego syntezy do miejsca jego działania wewnątrz lub na zewnątrz błony lub ściany komórkowej (np. lider czynnika alfa u drożdży). Białka receptora neublastyny mogą obejmować peptydy dodawane w celu ułatwienia oczyszczania lub identyfikowania neublastyny (np. fuzje histydyna/neublastyna). Sekwencję aminokwasową neublastyny można także podłączyć do peptydu Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (Hopp i wsp., Biotechnology 6:1204, 1988). Ta ostatnia sekwencja jest silnie antygenowa i dostarcza epitop odwracalnie wiązany przez swoiste przeciwciało monoklonalne, co umożliwia szybkie testowanie i ułatwia oczyszczanie wytworzonego zrekombinowanego białka.
Sekwencja ta jest także specyficznie cięta przez śluzówkową enterokinazę bydlęcą w reszcie bezpośrednio za parą Asp-Lys.
Warianty neublastyny skoniugowane z polimerem
Jeśli jest pożądane, pojedynczą cząsteczkę polimeru można wykorzystać do koniugacji z neublastyną, chociaż rozpatrywane jest też przyłączenie więcej niż jednej cząsteczki polimeru. Kompozycje skoniugowanej neublastyny według wynalazku mogą znaleźć zastosowanie zarówno w zastosowaniach in vivo jak również w innych niż in vivo. Dodatkowo, wiadomo, że koniugujący polimer może wykorzystywać dowolne inne grupy, ugrupowania, czy inne koniugowane postacie, zgodne z ostatecznym zastosowaniem. Przykładowo, w niektórych zastosowaniach może być przydatne kowalencyjne związanie z polimerem funkcjonalnego ugrupowania nadającego polimerowi oporność na degradację UV lub własności przeciwutleniające, czy inne właściwości lub cechy charakterystyczne. Jako dalszy przykład, w niektórych zastosowaniach może być korzystne nadanie funkcji polimerowi w celu uczynienia go reaktywnym lub zdolnym do sieciowania dla polepszenia różnych właściwości lub cech charakterystycznych całego skoniugowanego materiału. Zatem, polimer może charakteryzować się dowolną funkcjonalnością, powtarzającymi się grupami, połączeniami czy innymi strukturami składowymi, które nie wykluczają zakładanej skuteczności kompozycji skoniugowanej muteiny neublastyny.
Przykładowe polimery, które można z łatwością wykorzystać dla osiągnięcia porządnych właściwości są tu opisane poniżej w przykładowych schematach reakcji. W zastosowaniach kowalencyjnie związanych peptydów, polimerowi może zostać nadana funkcja a następnie może być związany z wolnym aminokwasem(ami) peptydu(ów) w celu utworzenia elastycznych wiązań.
Neublastyna jest połączona z polimerem przez końcową grupę reaktywną polipeptydu. Alternatywnie, lub dodatkowo, neublastyna może być połączona poprzez grupę aminową łańcucha bocznego wewnętrznej reszty lizynowej, np. reszty lizynowej wprowadzonej do sekwencji aminokwasowej naturalnie występującej neublastyny. Zatem, koniugaty mogą posiadać także rozgałęzienia w grupach reaktywnych nie położonych na końcu. Polimer z reaktywną grupą(ami) jest tu określany jako „polimer aktywowany. Grupa reaktywna oddziałuje selektywnie z wolnymi grupami aminowymi lub innymi grupami reaktywnymi w białku.
Przyłączenie do aktywowanego polimeru może nastąpić w dowolnej dostępnej grupie aminowej neublastyny, takiej jak grupy aminowe alfa, lub grupy aminowe epsilon reszty lizynowej lub resztach wprowadzonych do sekwencji aminokwasowej neublastyny lub jej wariantu. Jako miejsca przyłączenia można także zastosować wolne grupy karboksylowe, odpowiednio aktywowane grupy karbonylowe, hydroksylowe, guanidylowe, imidazolowe, utlenione ugrupowania cukrów oraz grupy merkapto neublastyny (o ile są dostępne).
Zazwyczaj stosuje się od około 1,0 do około 10 moli aktywowanego polimeru na mol białka, w zależności od stężenia białka. Końcowa ilość wynika z zachowania równowagi pomiędzy maksymalizacją zasięgu reakcji przy jednoczesnej minimalizacji niespecyficznych modyfikacji produktu, w tym samym czasie, określeniem chemii, która podtrzymuje optimum aktywności, optymalizując w tym samym czasie, jeśli to możliwe, okres półtrwania białka. Korzystnie, zachowane jest co najmniej 50% aktywności biologicznej białka a najkorzystniej zachowane jest prawie 100%.
Reakcje można prowadzić dowolną stosowną metodą używaną do reakcji aktywnego materiału biologicznego z nieczynnymi polimerami, korzystnie w pH około 5-8, np. pH 5, 6, 7 lub 8, jeśli grupy reaktywne są w grupie alfa aminowej na końcu N. Zasadniczo proces wymaga wytworzenia aktywowanego polimeru, a następnie reakcji białka z aktywowanym polimerem w celu wytworzenia rozpuszczalnego białka stosownego do preparatu. Wspomniana powyżej reakcja może być przeprowadzona różnymi metodami, które mogą wymagać jednego lub większej liczby etapów.
PL 211 162 B1
Polimer można sprzęgać z wariantem neublastyny przy użyciu sposobów znanych w dziedzinie.
Przykładowo, w jednym wykonaniu, ugrupowanie glikolu polialkilenowego jest sprzężone z grupą lizyny polipeptydu neublastyny lub polipeptydu wariantu neublastyny. Połączenie z grupą lizynową można przeprowadzić przy użyciu aktywnego estru N-hydroksysukcynoimidowego (NHS), takiego jak sukcynoimidylo bursztynian PEG (SS-PEG) oraz sukcynoimidylo propionianu PEG (SPA-PEG). Stosowne ugrupowania glikolu polialkilenowego mogą obejmować, przykładowo, karboksymetylo-NHS, norleucyno-NHS, SC-PEG, tresylan, aldehyd, epoksyd, karbonyloimidazol lub węglan PNP.
Dodatkowe aminoreaktywne łączniki PEG można podstawić za ugrupowanie sukcynoimidylowe.
Obejmują one np. izotiocyjaniany, nitrofenylowęglany, epoksydy i węglany benzotriazolowe. Korzystne warunki są tak dobierane, aby maksymalizować selektywność i zasięg reakcji. Można stosować formy PEG liniowe lub rozgałęzione jak również inne formy alkilowe. Długość cząsteczki PEG może być różna. Najczęstsze formy różnią się wielkością od 2K do 100K. Chociaż obecne przykłady donoszą, że ukierunkowane przyłączenie ugrupowania PEG na końcu N nie wpływa na własności farmakokinetyczne, fakt, że materiał zachowuje funkcję fizjologiczną wskazuje iż modyfikacja w miejscu lub miejscach tu ujawnianych nie jest szkodliwa. W konsekwencji, przy wytwarzaniu zmutowanych form NBN, które mogą dostarczać dodatkowe miejsca przyłączania dzięki wprowadzeniu reszt lizynowych, prawdopodobny wynik, że formy te mogłyby przyłączać ugrupowania PEG zarówno w lizynie jak i na końcu N jest rozważany jako możliwy do przyjęcia.
Jeśli pożądane, polipeptydy wariantu neublastyny mogą zawierać znacznik np. znacznik, który może być później uwalniany przez proteolizę. Zatem, ugrupowanie lizyny może być selektywnie modyfikowane poprzez pierwszą reakcję wariantu ze znacznikiem his z łącznikiem o niskiej masie cząsteczkowej, takim jak odczynnik Trauta (Pierce), który będzie reagował zarówno z lizyną jak i końcem N, a następnie poprzez uwolnienie znacznika his. Polipeptyd będzie zatem zawierał wolną grupę SH, która może być selektywnie modyfikowana za pomocą ugrupowania PEG zawierającej tioloworeaktywną grupę główną, taką jak grupa imidu kwasu maleinowego, grupa winylosulfonowa, grupa halogenoooctanowa lub wolna czy zabezpieczona grupa SH.
Odczynnik Trauta można zastąpić dowolnym łącznikiem, który będzie stanowić o specyficznym miejscu przyłączenia PEG. Przykładowo, odczynnik Trauta można zastąpić przez SPDP, SMPT, SATA lub SATP (wszystkie dostępne z Pierce). Podobnie, można prowadzić reakcję białka z aminoreaktywnym łącznikiem wprowadzającym imid kwasu maleinowego (przykładowo SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS lub GMBS), grupę halogenooctanową (SBAP, SIA, SIAB) lub grupę winylosulfonową i prowadzić reakcję uzyskanego produktu z ugrupowaniem PEG zawierającym wolną grupę SH. Jedynym ograniczeniem wielkości wykorzystywanego łącznika jest takie, że nie może on blokować następującego później usuwania znacznika z końca N.
Zatem, w innych wykonaniach, ugrupowanie glikolu polialkilenowego jest sprzężone z grupą cysteinową neublastyny lub wariantu neublastyny. Sprzężenie może zajść na skutek użycia np. grupy imidu kwasu maleinowego, grupy winylosulfonowej, grupy halogenooctanowej i grupy tiolowej.
Z polimerem można sprzęgnąć jedno lub większą liczbę miejsc z wariantu neublastyny. Przykładowo, do polimeru można przyłączyć jedną, dwie, trzy, cztery lub pięć ugrupowań PEG. W niektórych wykonaniach, ugrupowanie PEG jest przyłączone do końca N i/lub aminokwasów 14, 39, 68 i 95 neublastyny, numerowanych jak pokazano w Tabeli 1.
W korzystnych wykonaniach, wariant neublastyny w kompozycji posiada dłuższy okres półtrwania w surowicy w porównaniu z okresem półtrwania wariantu polipeptydu bez polimeru. Alternatywnie, lub dodatkowo wariant neublastyny w kompozycji wiąże GRFa3, aktywuje RET, normalizuje patologiczne zmiany neuronu lub zwiększa przeżywalności neuronu lub pełni kombinację tych funkcji fizjologicznych.
Niniejszym dostarczana jest kompozycja jako stabilny, rozpuszczalny w wodzie kompleks skoniugowanej neublastyny lub wariantu neublastyny, obejmujący polipeptyd neublastyny lub polipeptyd wariantu neublastyny sprzężone z ugrupowaniem glikolu polietylenowego. Jeśli pożądane, neublastynę lub wariant neublastyny można sprzęgnąć z ugrupowaniem glikolu polietylenowego przez wiązanie labilne. Wiązanie labilne można rozciąć poprzez np. hydrolizę biochemiczną, proteolizę lub cięcie sulfhydrylowe. Przykładowo wiązanie labilne można rozciąć w warunkach in vivo.
Kompozycje farmaceutyczne zawierające koniugaty wariant neublastyny-polimer
Niniejszy wynalazek dostarcza także kompozycję farmaceutyczną zawierającą koniugat wariant neublastyny-polimer. W użytym tu znaczeniu „kompozycja farmaceutyczna jest określona jako obejmująca neublastynę lub koniugat według wynalazku, rozproszone w fizjologicznie dopuszczonym noPL 211 162 B1 śniku, fakultatywnie zawierającym jeden lub więcej innych składników fizjologicznie dopuszczalnych.
Zatem, kompozycja farmaceutyczna może zawierać zaróbkę taką jak woda, jeden lub więcej minerałów, cukry, detergenty i jeden lub więcej nośników takich jak obojętne białko (np. heparyna lub albumina).
Koniugaty polimer-neublastyna według wynalazku mogą być podawane zarówno per se jak i w formie farmaceutycznie dopuszczonych estrów, soli i innych czynnych fizjologicznie pochodnych. W tych preparatach farmaceutycznych i lekach wariant koniugatu neublastyny jest korzystnie wykorzystywany wraz z jednym lub większą liczbą farmaceutycznie dopuszczonych nośników i fakultatywnie z innymi składnikami terapeutycznymi.
Nośnik(-i) musi być dopuszczalny farmaceutycznie w takim znaczeniu, że jest zgodny z innymi składnikami preparatu i nie jest nadmiernie szkodliwy dla przyjmującego. Wariant neublastyny jest dostarczany w ilości skutecznej do uzyskania pożądanego efektu farmakologicznego lub efektu korzystnego leczniczo, jak tu opisano, i w ilości stosownej do osiągnięcia pożądanej dostępności biologicznej in vivo dawki lub stężenia.
Preparaty obejmują te, które są odpowiednie zarówno dla podawania pozajelitowego, jak i jelitowego, a specjalne sposoby podawania obejmują podawanie doustne, doodbytnicze, policzkowe, miejscowe, donosowe, do oczu, podskórne, domięśniowe, dożylne, przezskórne, dooponowe, wewnątrzprzedsionkowe, dotętnicze, podpajęczynówkowe, oskrzelowe, limfatyczne, dopochwowe i wewnątrzmaciczne. Korzystne są preparaty stosowne do podawania w postaci aerozolu i pozajelitowo, zarówno miejscowego jak i układowego.
Kiedy wykorzystywany jest wariant neublastyny w preparacie obejmującym roztwór ciekły, korzystnie preparat może być podawany doustnie, dooskrzelowo, lub pozajelitowo. Kiedy neublastyna jest wykorzystywana w postaci ciekłej zawiesiny lub jako proszek w preparacie zgodnym biologicznie, preparat może być korzystnie podawany doustnie, doodbytniczo lub dooskrzelowo. Alternatywnie może być podawany donosowo lub dooskrzelowo z wykorzystaniem nebulizacji proszku w gazie nośnikowym, w celu wytworzenia układu dyspersyjnego proszku, który jest wdychany przez pacjenta z obwodu oddechowego obejmującego stosowny nebulizator.
Preparaty obejmujące białka według niniejszego wynalazku mogą dogodnie występować w formach jednostkowych dawek i mogą być przygotowywane za pomocą każdej z metod dobrze znanej w dziedzinie farmaceutycznej. Ogólnie metody te obejmują etap połączenia aktywnego składnika(-ów) z nośnikiem, stanowiącym jeden lub więcej składników pomocniczych.
Typowo, preparaty przygotowuje się przez jednolite i jednorodne połączenie aktywnego czynnika(-ów) z płynnym nośnikiem, ostatecznie podzielonym nośnikiem stałym lub dwoma, a następnie jeśli konieczne, ukształtowanie produktu w formy dawek pożądanego preparatu.
Preparaty według niniejszego wynalazku stosowne do podawania doustnego mogą występować w formie oddzielnych dawek takich jak kapsułki, opłatki, tabletki lub pastylki do ssania, każda zawierająca ustaloną ilość aktywnego składnika, w postaci proszku lub granulek; lub zawiesiny w wodnym roztworze lub płynie nie będącym wodą, jak syrop, eliksir, emulsja czy wywar.
Preparaty stosowne do podawania pozajelitowego dogodnie obejmują sterylny preparat wodny aktywnego koniugatu, który korzystnie jest izotoniczny w stosunku do krwi przyjmującego (np. roztwór soli fizjologicznej). Preparaty te mogą zawierać czynniki zawieszające i czynniki zagęszczające lub inne systemy złożone z mikrocząsteczek, zaprojektowane tak aby kierowały składnik do komponentów krwi lub jednego, lub większej liczby narządów. Preparaty mogą występować w postaci dawek jednostkowych lub dawek wielokrotnych.
Donosowe preparaty w sprayu obejmują oczyszczone wodne roztwory aktywnego koniugatu z czynnikami konserwującymi i czynnikami izotonicznymi. Preparaty te są korzystnie dostosowane do pH i stanu izotonicznego zgodnego z błonami śluzowymi nosa.
Preparaty do podawania doodbytniczo mogą występować jako czopki z odpowiednim nośnikiem jak masło kakaowe, utwardzone tłuszcze lub utwardzone kwasy tłuszczowe. Preparaty oczne, takie jak krople do oczu są przygotowywane metodą podobną do otrzymywania sprayu donosowego, z wyjątkiem tego, że pH i czynniki izotoniczne są korzystnie dostosowywane, do tych w oku.
Preparaty do stosowania miejscowego obejmują koniugaty według wynalazku rozpuszczone lub zawieszone w jednym lub w większej liczbie podłoży, takich jak olej mineralny, ropa naftowa, alkohole wielowodorotlenowe lub inne substancje podstawowe używane w preparatach farmaceutycznych do stosowania miejscowego.
PL 211 162 B1
Dodatkowo obok składników wspomnianych wcześniej, preparaty według tego wynalazku mogą dalej obejmować jeden składnik lub więcej dodatkowych składników wybranych z rozcieńczalników, buforów, substancji smakowych, środków rozdrabniających, czynników powierzchniowo czynnych, zagęszczaczy, środków smarujących, środków konserwujących (zawierających przeciwutleniacze) i im podobnych. Powyższe rozważania stosują się także do białek fuzyjnych neublastyny według wynalazku (np. fuzji neublastyna-HSA).
Zgodnie z powyższym, niniejszy wynalazek rozważa dostarczenie odpowiednich białek fuzyjnych w celu stabilizacji in vitro wariantu koniugatu neublastyny w roztworze, jako korzystnie ilustrujące zastosowanie według wynalazku. Białka fuzyjne można przykładowo wykorzystać do podniesienia oporności na degradację enzymatyczną wariantu neublastyny i dostarczenia sposobów wydłużania okresu przechowywania, podniesienia stabilności w temp. pokojowej i im podobnych. Jest zrozumiałe, że powyższe rozważania mają również zastosowanie do białek fuzyjnych neublastyna-albumina surowicza według wynalazku (włączając białka fuzyjne ludzkiej neublastyny-ludzkiej albuminy surowiczej).
Sposoby leczenia
Polipeptydy wariantów neublastyny, tak samo jak białka fuzyjne lub ich koniugaty, można stosować w leczeniu lub łagodzeniu zaburzenia lub choroby żywego ciała zwierzęcia, korzystnie ssaka, bardziej korzystnie naczelnego, w tym człowieka, którego zaburzenie lub choroba odpowiada na aktywność czynników neurotropowych.
Kompozycje według wynalazku można stosować bezpośrednio przez np. wszczepione, implantowane lub połknięte kompozycje farmaceutyczne do leczenia procesów patologicznych odpowiadających na polipeptydy neublastyny. Kompozycje można wykorzystywać do łagodzenia zaburzenia lub choroby żywego ciała zwierzęcia, w tym człowieka, którego zaburzenie lub choroba odpowiada na aktywność czynników neurotropowych. Zaburzenie lub choroba mogą w szczególności być uszkodzeniem układu nerwowego wywołanym urazem, zabiegiem chirurgicznym, niedokrwieniem, zakażeniem, chorobami metabolicznymi, niedoborami żywieniowymi, nowotworem złośliwym lub czynnikami toksycznymi i genetycznymi i procesami idiopatycznymi.
Uszkodzenie może w szczególności występować w neuronach czuciowych lub komórkach siatkówkowego zwoju nerwowego, obejmującego neurony w korzeniach grzbietowych zwojów rdzenia kręgowego lub w każdej z następujących tkanek: zwoje kolankowate, odnoszące się do kości skalistej i guzkowate; kompleks przedsionkowosłuchowego ósmego nerwu czaszkowego; brzusznoboczny biegun szczękowożuchwowego płata zwoju nerwu trójdzielnego i jądro śródmózgowiowe nerwu trójdzielnego.
Choroba lub zaburzenie może być chorobą neurodegeneracyjną, obejmującą organiczne zmiany chorobowe i urazowe neuronu, takie jak urazowe organiczne zmiany chorobowe nerwów obwodowych, rdzenia przedłużonego i/lub rdzenia kręgowego, uszkodzenie niedokrwienne neuronów mózgowych, neuropatia a szczególnie neuropatia obwodowa, uraz lub uszkodzenie nerwu obwodowego, udar niedokrwienny, ostre uszkodzenie mózgu, ostre uszkodzenie rdzenia kręgowego, guzy układu nerwowego, stwardnienie rozsiane, ekspozycja na neurotoksyny, choroby metaboliczne takie jak cukrzyca lub zaburzenia czynności nerek i uszkodzenie wywołane czynnikami zakaźnymi, zaburzenia neurodegeneracyjne obejmujące chorobę Alzheimera, Huntingtona, objawy Parkinson-Plus, progresywne porażenie nadjądrowe (syndrom Steel-Richardson-Olszewskiego), atrofię móżdżku (OPCA), syndrom Shy-Dragera (atrofia licznych systemów), guamajski zespół parkinsonizmu z otępieniem, stwardnienie zanikowe boczne lub każdą inną wrodzoną lub neurodegeneracyjną chorobę i upośledzenie pamięci związane z otępieniem.
Leczeniu można poddawać czuciowe i/lub autonomiczne systemy neuronów. W szczególności leczeniu można poddawać neurony odbierające bodźce urazowe i mechaniczne, konkretniej neurony z włóknem delta i włóknem C. Dodatkowo leczeniu można poddawać neurony współczulne i przywspółczulne układu autonomicznego.
Leczeniu można poddawać choroby neuronów ruchowych takie jak stwardnienie zanikowe boczne („ALS) i zanik rdzenia i mięśni. W jeszcze innym korzystnym wykonaniu, cząsteczki wariantu neublastyny według niniejszego wynalazku można użyć do zwiększenia odzysku nerwów po wystąpieniu uszkodzeń urazowych. Alternatywnie lub dodatkowo, w opisanych tutaj metodach, można zastosować nerwowy kanał prowadzący z macierzą zawierającą warianty neublastyny lub fuzje lub koniugaty wariantów neublastyny. Takie nerwowe kanały prowadzące są ujawnione, np. w opisie patentowym US nr 5834029.
PL 211 162 B1
W korzystnym wykonaniu, ujawnione tu kompozycje (i kompozycje farmaceutyczne je zawierające) są wykorzystywane w leczeniu neuropatii obwodowych. Wśród neuropatii obwodowych rozważanych do leczenia cząsteczkami według niniejszego wynalazku są neuropatie indukowalne urazem np. te wywoływane przez fizyczne uszkodzenia lub chorobę, fizyczne uszkodzenie mózgu, fizyczne uszkodzenie rdzenia kręgowego, niedokrwienie związane z uszkodzeniem mózgu i zaburzenia neurologiczne związane z neurodegeneracją. Również zawarte są tutaj neuropatie wtórne do zakażenia, do ekspozycji na toksyny i leki. Jeszcze dalej zawarte są tu neuropatie wtórne do chorób układowych i metabolicznych. Ujawnione tutaj kompozycje można także wykorzystać do leczenia neuropatii indukowanych chemioterapią (jak te wywołane przez przyjmowanie chemioterapeutyków np. taksolu lub cisplatyny); neuropatii indukowanych toksynami, neuropatii indukowanych lekami, neuropatii indukowanych brakiem witamin; neuropatii idiopatycznych i neuropatii cukrzycowych. Zobacz np. opisy patentowe US nr 5496804 i nr 5916555.
Dodatkowe stany, które można leczyć używając opisanych tutaj kompozycji to mono-neuropatie, mono-rozsiane neuropatie i poli-neuropatie, obejmujące neuropatie aksonalne i demielinizujące.
Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku są wykorzystywane w leczeniu różnych zaburzeń oka, obejmujących utratę fotoreceptora w siatkówce pacjenta dotkniętego degeneracją plamkową, barwnikowym zwyrodnieniem siatkówki, jaskrą i podobnymi chorobami.
Wynalazek będzie dalej zilustrowany za pomocą następujących nie ograniczających go przykładów.
P r z y k ł a d 1
Dostępność biologiczna neublastyny z przyłączonym na końcu N ugrupowaniem PEG
Zaobserwowano, że po dożylnym podaniu szczurom, pochodząca z komórki CHO zrekombinowana ludzka neublastyna ulega szybkiemu klirensowi z układu krążenia. Białka nie wykrywano w surowicy po podaniu podskórnym. W celu zwiększenia dostępności biologicznej neublastyny skonstruowano jej formę z przyłączonym na końcu N ugrupowaniem PEG.
Ponieważ w sekwencji NBN nie występuje lizyna, w wyniku zastosowania chemii amino-specyficznego przyłączania ugrupowania PEG uzyskano przyłączanie ugrupowania PEG na końcu aminowym polipeptydu NBN. W ten sposób do każdego dimeru neublastyny powinny być przyłączane dwa ugrupowania PEG. Zatem, formy PEG były najpierw przyłączane bezpośrednio do końca N za pomocą chemii amino-specyficznej. Zaskakująco, przyłączanie nawet dwóch ugrupowań PEG 20 K przynosiło małą korzyść w odniesieniu do okresu półtrwania, wskazując że mechanizm podstawowej drogi usuwania z organizmu był nadrzędny w stosunku do wydłużenia okresu półtrwania, czego oczekiwano po przyłączeniu ugrupowania PEG.
P r z y k ł a d 2
Konstruowanie muteiny N95K neublastyny z przyłączonym ugrupowaniem PEG
Następnie badano dostępność biologiczną zmutowanych form NBN z ugrupowaniem PEG przyłączonym do wewnętrznych reszt aminokwasowych. Zaprojektowano serie składające się z czterech mutantów z podstawieniami, w naturalnie występujących resztach w pozycjach 14, 39, 68 i 95, do wstawienia lizyn w wybranych miejscach w sekwencji. Lizyny te dostarczają alternatywnych miejsc wiązania ugrupowań PEG. Miejsca te wybrano używając krystalicznej struktury GDNF (Nat. Struct. Biol., 4: 435-8, 1997) jako sieci do rozpoznawania reszt powierzchniowych oraz badań z mutagenezą chimery persefina/neublastyna (J. Biol. Chem., 275: 3412-20, 2000) w celu identyfikacji regionów struktury ważnych funkcjonalnie, które powinny być ominięte.
Dwie z mutacji (R39 i R68) były miejscem docelowym w regionie, który w oparciu o rozkład ładunków dodatnich na powierzchni może reprezentować miejsce wiązania heparyny, własność białka, która prawdopodobnie przyczynia się do jej szybkiego klirensu. Trzecie miejsce było miejscem docelowym w pozycji N95, naturalnego miejsca glikozylacji w dzikim typie NBN. To miejsce jest naturalnie modyfikowane przez strukturę kompleksu węglowodanowego. Dlatego też nie oczekiwano, że modyfikacja ugrupowaniem PEG w tym miejscu wpłynie na funkcję. Czwarte miejsce (R14) wybrano w regionie, który nie był objęty żadną inną modyfikacją. W ujawnionych tutaj badaniach wybrano mutanta, w którym resztę asparaginową w pozycji 95 podstawiono lizyną („mutant N95K).
Skonstruowano cztery inne szczurze muteiny neublastyny, zawierające jedną lub więcej zmian w dzikim typie sekwencji szczurzego polipeptydu neublastyny. Muteiny obejmują pojedynczą muteinę N95K oraz muteiny zawierające pojedyncze podstawienia w innych miejscach aminokwasowej sekwencji szczurzej neublastyny: R14K, R68K, i R39K. W nomenklaturze „X1N1X2, X1 gdzie X1 dotyczy aminokwasu neublastyny dzikiego typu, N1 określa numer pozycji aminokwasu X1 w sekwencji, według
PL 211 162 B1 numeracji z SEKW. NR ID.: 1. X2 dotyczy aminokwasu podstawionego zamiast aminokwasu dzikiego typu we wskazanej pozycji liczbowej z sekwencji.
Aby skonstruować zmutowaną szczurzą neublastynę N95K, przeprowadzano mutagenezę ukierunkowaną w pCMB020, plazmidzie kodującym dziki typ szczurzej neublastyny. Poniżej przedstawiono sekwencję nukleinową i aminokwasową kodującą szczurzą neublastynę dzikiego typu:
ATC-GAACTGG GACTTGGAGA GCCTACTGCA TTGTCCCACT GCCTCCGGCC
TAGGTGGCAA CCAGCCTTGT GGCCAACCCT AGCTGCTCTA GCCCTGCTGA
101 GCAGCGTCAC AGAAGCTTCC CTGGACCCAA TCTCCCGCAG CCCCGCCTCT
151 CGCGATGTTC CCTCGCCGGT CCTGGCGCCC CCAACSCACT ACCTACCTGG
201 GGGACACACC GCACATCTGT GCAGCGAAAG AGCCCTGCGA CCACCGCCGC
251 AGTCTCCTCA GCCCGCACCC CCACCACCGG GTCCCGCGCT CCAGTCTCCT
301 CCCGCTGCGC TCCGCGGGGC ACGCGCGGCG CGTGCAGGAA CCCGCAGCAG
351 CCGCGCACGG GCTACAGATG CGCGCGGCTG CCGCCTGCGC TCACAGCTGG
401 TGCCGCTGAG CGCTCTCGGC CTGGGCCACA GCTCCGACGA GCTGATACGT
451 TTCCGCTTCT GCAC-CGGTTC GTGCCGCCGA GCACGCTCCC CGCACGATCT
501 CAGCCTGGCC AGCCTGCTGG GCGCCGGGGC CCTGCGGTCT CCTCCCGGGT
551 CCCGGCCGAT CAGCCAGCCC TGTTGCCGOC CCACTCGCTA TGAGGCAGTC
601 TCCTTCATGG ACGTGAACAG CACCTGGAGA ACCGTGGACC ATCTCTCCGC
651 CACCGCCTGC GGCTGTCTGG GCTGA SEKST.BR ID.: 5
MEŁGLGEPTA LSHCLRPSWC PALWPTIAAL ALLSSYTEAS ldpmsrspas
RDVPSPVltAP PTDYLPGGHT ABLCSERALR PPPQSPQPAP PPPGPALGSP
101 PAALRGARAA RAGTRSERAR ATDARGCRLR SQLVPVSALG LGHSSDELIR
151 FRECSGSCRR ARSPHDLSLA SLLGAGAŁRS PPGSRPISQP CCRPTRYEAV
201 SMWNSTOR TTOHLSATAC GCLG* seku.mr id.: 4
W wyniku mutagenezy pCM020, z wykorzystaniem starterów KD2-310 i KD3-211, uzyskano plazmid pCMB027:
KD2-310
5’-GTATCTTTCATGGACGTAAAGTCTACATGGAGAACCGTAGATCATCTATCTGCAACC-3’ (SEKW. NR ID.: 6)
KD2-311 ’-GGTTGCAGATAGATGATCTACGGTTCTCCATGTAGACTTTACGTCCATGAAAGATAC-3 ’ (SEKW. NR ID.: 7).
W pCMB027 kodon kodujący asparaginę w pozycji 95 został zamieniony przez kodon kodujący lizynę.
Muteinę neublastyny R14K utworzono przez zamianę kodonu kodującego argininę w pozycji 14 na kodon lizyny w sekwencji kodującej neublastynę z pCMB020. Mutagenezę ukierunkowaną przeprowadzono w pCMB020 stosując oligonukleotydy KD3-254 i KD3-255:
PL 211 162 B1
KD3-254 5’-GCTGGAACTCGCAGCTCTCGTGCTCGTGCAACGGATGCAAAAGGCTGTCG-3’ (SEKW. NR ID.: 8)
KD2-255 5’-CGACAGCCTTTTGCATCCGTTGCACGAGCACGAGAGCTGCGAGTTCCAGC-3’ (SEKW. NR ID.: 9).
Uzyskany konstrukt nazwano pCMB029.
Muteinę neublastyny R68K utworzono przez zamianę kodonu kodującego argininę w pozycji 68 na kodon lizyny w sekwencji kodującej neublastynę z pCMB020. Mutagenezę ukierunkowaną przeprowadzono w pCMB020 stosując oligonukleotydy KD3-258 i KD3-259:
KD3-258 5’-GGAGCCGGAGCACTAAAATCTCCCCGGGATCTAGACC-3’ (SEKW. NR ID.: 10)
KD3-259 5’-GGTCTAGATCCCGGGGGAGATTTTAGTGCTCCGGCTCC-3’ (SEKW. NR ID.: 11).
Uzyskany konstrukt nazwano pCMB030.
Muteinę neublastyny R39K utworzono przez zamianę kodonu kodującego argininę w pozycji 39 na kodon lizyny w sekwencji kodującej neublastynę z pCMB020. Mutagenezę ukierunkowaną przeprowadzono w pCMB027 stosując oligonukleotydy KD3-256 i KD3-257:
KD3-256 5’-GACGAATTAATTAAGTTTCGTTTTTGTTCAGG-3’ (SEKW. NR ID.: 12)
KD3-257 5’-CCTGAACAAAAACGAAACTTAATTAATTCGTC-3’ (SEKW. NR ID.: 13).
Do ekspresji i oczyszczenia, kodowaną przez plazmid szczurzą muteinę NBN N95K wyrażano w E. coli jako białko fuzyjne, wyznakowane znacznikiem His, z miejscem cięcia dla enterokinazy sąsiadującym bezpośrednio z miejscem startu dojrzałej 113 aminokwasowej sekwencji NBN. E. coli hodowano w 500 l fermentorze i dostarczano zamrożoną pastę komórkową. Komórki E. coli lizowano w prasie Manton Gaulin Press i szczurze NBN NK odzyskiwano z nierozpuszczalnej, przepłukanej frakcji osadowej.
NBN ekstrahowano z osadu za pomocą chlorowodorku guanidyny, białko ponownie fałdowano i usuwano znacznik his przy użyciu enterokinazy. Produkt poddawano następnie chromatografii w agarozie Ni NTA (Qiagen) oraz w żywicy kationowo-wymiennej (Bakerbond WP CBX).
W wyniku traktowania produktu znakowanego his enterokinazą uzyskano nieprawidłowe cięcie białka w pozycji 7 argininy w dojrzałej sekwencji. Otrzymany produkt NBN des 1-7 był w pełni aktywny w teście KIRA ELISA oraz strukturalnie nierozróżnialny od dojrzałej formy w jego wrażliwości na denaturację wywoływaną guanidyną i dlatego został wykorzystany do kolejnych prac.
Do szczurzego NBN N95K przyłączano ugrupowania PEG, średnio 3,3 ugrupowania PEG/na cząsteczkę, używając jako substratu reakcji propionianu metoksylopoli(etylenoglikolo)sukcynoimidylowego (SPA-PEG), o masie cząsteczkowej 10000 Da. Uzyskany produkt, z przyłączonymi ugrupowaniami PEG, poddawano rozległej charakteryzacji, obejmującej analizę SDS-PAGE, chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek (SEC), HPLC z odwróconymi fazami, spektrometrię mas z desorpcją/jonizacją indukowaną promieniowaniem laserowym z zastosowaniem matrycy cieczowej (MALD/IMS), mapowanie peptydowe, ocenę aktywności w testach KIRA ELISA i określenie zawartości endotoksyn. Zmierzona przy użyciu SDS-PAGE i SEC, czystość produktu NBN N95K przed przyłączaniem ugrupowań PEG, była większa niż 95%. Produkt NBN N95K migrował w warunkach nieredukcyjnych jako dimer, zgodnie z przewidywaną strukturą. Po przyłączaniu ugrupowań PEG, powstały produkt, składający się z serii zmodyfikowanych związków addytywnych zawierał 5% związków z 2 ugrupowaniami PEG/cząsteczkę, 60% związków z 3 ugrupowaniami PEG/cząsteczkę, 30% związków z 4 ugrupowaniami PEG/cząsteczkę, oraz kilka słabiej reprezentowanych form o wyższej masie. Nie uzyskano dowodów na powstawanie agregatów w próbkach z przyłączanymi ugrupowaniami PEG. Pozostałe poziomy niezmodyfikowanych NBN w produkcie mieściły się poniżej granic oznaczania ilościowego. Zawartość endotoksyn w materiale jest rutynowo mniejsza niż 1 EU/mg. Aktywność specyficzna NBN po przyłączeniu ugrupowań PEG w teście KIRA ELISA wynosi 10 nM. Produkt z przyłączonymi ugrupowaniami PEG przygotowano w stężeniu 1,1 mg/ml w PBS o pH 6,5. Materiał, który ma podobną silę do wt-NBN, może być dostarczany jako zamrożony płyn, który jest przechowywany w temp. -70°C.
PL 211 162 B1
Muteiny R14K, R39K i R68K wyrażano w E. coli i mogą być one poddawane tym samym metodom służącym oczyszczaniu, przyłączaniu ugrupowań PEG i ocenie funkcji, jak to opisano powyżej dla N95K-NBN.
Przygotowanie NBN z przyłączonymi ugrupowaniami PEG
230 ml ponownie fałdowanego szczurzego NBN N95K (2,6 mg/ml), wytworzonego w E. coli i przechowywanego w 4°C w 5 mM fosforanie sodu o pH 6,5, 100 mM NaCl, rozcieńczono 77 ml wody, 14,4 ml 1 M HEPES o pH 7,5 i 2,8 g (ostatecznie 10 mg/ml) PEG SPA 10000 Da (Shearwater Polymers, Inc). Próbkę inkubowano w temp. pokojowej, w ciemności przez 4 godz., następnie traktowano 5 mM imidazolem (końcowe stężenie), filtrowano i przechowywano przez noc w temp. 4°C. Produkt wytworzono w dwóch partiach, jedna zawierała 130 ml, a druga 100 ml NBN N95K. NBN z przyłączonymi ugrupowaniami PEG oczyszczano z mieszaniny reakcyjnej na kolumnie typu Fractogel EMD SO3-(M)(EM Industries). Oczyszczanie na kolumnie prowadzono w temperaturze pokojowej. Wszystkie bufory przygotowywano jako wolne od pirogenów. Do mieszaniny reakcyjnej dodawano chlorowodorek sodu do końcowego stężenia 87 mM i próbkę umieszczano w 45 ml kolumnie typu Fractogel (o wewnętrznej średnicy 5 cm).
Kolumnę przemywano 5 mM fosforanem sodu o pH 6,5, 80 mM NaCl o objętości odpowiadającej jednej objętości kolumny, następnie trzema objętościami kolumny roztworu 5 mM fosforanu sodu zawierającego 50 mM NaCl. Żywicę przenoszono do kolumny o średnicy 2,5 cm, a NBN z przyłączonymi ugrupowaniami PEG wypłukiwano z kolumny sześcioma etapami używając 10 ml roztworu zawierającego 5 mM fosforan sodu o pH 6,5, 400 mM NaCl, trzema etapami zawierającymi 500 mM NaCl i sześcioma etapami zawierającymi 600 mM NaCl. Wypłukane frakcje analizowano pod kątem zawartości białek poprzez badanie absorbancji przy długości fali 280 nm, a następnie pod kątem stopnia modyfikacji wykorzystując SDS-PAGE. Wyodrębnione frakcje zbierano w pule, filtrowano przez filtr o średnicy 0,2 μm i rozcieńczano w wodzie do stężenia 1,1 mg szczurzego NBN z przyłączonymi ugrupowaniami PEG/ml. Po ocenie poziomów endotoksyny w poszczególnych partiach, pulowano je i filtrowano powtórnie przez membranę 0,2 μm. Końcowy materiał porcjowano i przechowywano w temp. -70°C.
Widmo UV oczyszczonego NBN NK z przyłączonymi ugrupowaniami PEG
Widmo UV (przy 240-340 nm) oczyszczonego NBN NK z przyłączonymi ugrupowaniami PEG zarejestrowano dla nierozcieńczonej próbki. Próbkę analizowano trzykrotnie. Próbka z przyłączonymi ugrupowaniami PEG wykazywała maksymalną absorbancję przy 275-277 nm i minimalną absorbancję przy 247-249. Wynik ten jest zgodny z obserwowanym dla niezmodyfikowanej formy pośredniej NBN. Stężenie białka produktu z przyłączonymi ugrupowaniami PEG szacowano na podstawie widma stosując współczynnik ekstynkcji Σ2800,1% = 0,50. Stężenie białka NBN z przyłączonymi ugrupowaniami PEG wynosiło 1,1 mg/ml. Nie obserwowano zmętnienia próbki co uwidaczniało się brakiem absorbancji przy 320 nm.
Charakterystyka NBN z przyłączonymi ugrupowaniami PEG za pomocą SDS-PAGE
Porcje NBN z przyłączonymi ugrupowaniami PEG zawierające 3; 1,5; 0,75 i 0,3 μg produktu poddawano analizie SDS-PAGE w żelu gradientowym 4-20% (Owl). Żel barwiono za pomocą błękitu Coomassie brilliant blue R-250. Równolegle rozdzielano markery masy cząsteczkowej (GIBCO-BRL).
Analiza SDS-PAGE NBN z przyłączonymi ugrupowaniami PEG w warunkach nieredukucyjnych ujawniła serie prążków odpowiadających modyfikacjom 2, 3, 4 i większą liczbą ugrupowań PEG/cząsteczkę. Główny prążek z widoczną masą 98 kDa zawiera 3 ugrupowania PEG/cząsteczkę. W oczyszczonym produkcie z przyłączonymi ugrupowaniami PEG nie wykryto niezmodyfikowanego NBN. Obecność mieszaniny produktów z 2, 3 i 4 przyłączonymi ugrupowaniami PEG potwierdzono za pomocą analizy spektrometrii mas MALDl. Zawartości produktu z 2, 3 i 4 ugrupowaniami PEG określono za pomocą densytometrii i ustalono, że stanowi ona odpowiednio 7, 62 i 30% całkowitego produktu.
Charakterystyka NBN z przyłączonymi ugrupowaniami PEG za pomocą chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek
NBN z przyłączonymi ugrupowaniami PEG poddawano chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek na analitycznej kolumnie FPLC z Superose 6 HR1O/30 przy użyciu 5 mM MES pH 6,5; 300 mM NaCl jako fazy ruchomej. Frakcje elucyjne monitorowano określając ich absorbancję w 280 nm. NBN z przyłączonymi ugrupowaniami PEG wypłukiwano jako pojedynczy pik o odpowiedniej masie cząsteczkowej około 200 kDa zgodny z dużą objętością hydrodynamiczną ugrupowania PEG. Nie uzyskano dowodów na powstawanie agregatów. W preparacie nie wykryto wolnego NBN, który wypłukuje się przy związanej masie cząsteczkowej około 30 kDa.
PL 211 162 B1
Analiza NBN z przyłączonymi ugrupowaniami PEG za pomocą HPLC w odwróconym układzie faz
NBN NK z przyłączonymi ugrupowaniami PEG poddawano w odwróconym układzie faz na kolumnie Vydac C4 (5 μ^ι, 1 x 250 mm). Kolumnę rozwijano przy użyciu 60 mm gradientu od 40 do 60% B (bufor A: 0,1% TFA; bufor B: 75% acetonitryl/0,085% TFA). Wyciek z kolumny monitorowano określając absorbancję przy 214 nm i frakcje zbierano do dalszej analizy. NBN NK z przyłączonymi ugrupowaniami PEG frakcjonowano na różne di (60,5 mm), tri (63,3 mm) i tetra (67,8 mm) komponenty z przyłączonymi ugrupowaniami PEG przy użyciu HPLC w odwróconym układzie faz na kolumnie C4. Względna intensywność pików sugeruje, że ilości komponent wynosiły odpowiednio 5,4; 60,5 i 30,1%. Tożsamość pików potwierdzono przez MALDI-MS. Nie uzyskano dowodów potwierdzających obecność w produkcie NBN NK bez przyłączonych PEG (eluenty 5-15 mm).
Analiza NBN z przyłączonymi ugrupowaniami PEG za pomocą spektrometrii mas
NBN NK z przyłączonymi ugrupowaniami PEG odsolono na C4 Zip Tip i analizowano za pomocą spektrometrii mas na spektrometrze mas Voyager-DE™ STR (PerSeptive Biosystems) czasu przelotu z jonizacją MALDl (MALDI-TOF) z zastosowaniem kwasu sinapinowego jako matrycy. 0,5 μl oczyszczonego białka mieszano z 0,5 μl matrycy na płytce docelowej. Spektrometria mas NBN z przyłączonymi ugrupowaniami PEG ujawniła formy o pojedynczym i podwójnym ładunku trzech związków addytywnych. Obserwowane masy, 43803 Da, 54046 Da i 64438 Da były zgodne z modyfikacjami zawierającymi 2, 3 i 4 ugrupowania PEG/cząsteczkę.
Analiza NBN z przyłączonymi ugrupowaniami PEG za pomocą mapowania peptydowego
Specyficzność reakcji przyłączania ugrupowań PEG oszacowano za pomocą mapowania peptydowego. NBN z przyłączonymi ugrupowaniami PEG rozdzielano na komponenty di, tri i tetra, które poddawano redukcji, alkilowaniu i dalszemu rozdzieleniu na ich jednołańcuchowe komponenty przy użyciu HPLC na kolumnie C4. Komponenty te oraz zredukowane i poddane alkilacji niezmodyfikowane NBN NK, jako kontrolę, trawiono proteinazą Asp-N i uzyskane produkty frakcjonowano przy użyciu HPLC w odwróconym układzie faz na kolumnie Vydac C18 (5 μm, 1 x 250 mm) przy użyciu 60 mm gradientu od 40 do 60% B (bufor A: 0,1% TFA; bufor B: 75% acetonitryl/0,085% TFA). Wyciek z kolumny monitorowano określając absorbancję przy 214 nm.
Szczurza sekwencja NBN zawiera cztery wewnętrzne kwasy asparaginowe i spodziewano się zatem, prostego profilu po trawieniu endoproteinazą Asp-N. Wszystkie piki po trawieniu Asp-N szczurzego NBN zidentyfikowano za pomocą spektrometrii mas i/lub sekwencjonowanie wg. Edmana końca N, a zatem mapę peptydową można użyć jako łatwe narzędzie do testowania miejsc modyfikacji poprzez obecność lub brak piku. Tożsamość różnych pików podsumowano poniżej w Tabeli 3.
Tabela 3
Pik przez czas retencji (mm) Obserwowana średnia masa Teoretyczna średnia masa Przydzielenie Sekwencja aminokwasowa
38,8 1261,1 (M) 1262,4 102-113 DHLSATACGCLG
40,7 1090,9 1092,2 93-101 DVKSTWRTV
44,6 2508,4 2508,9 35-54 DELIRFRFCSGSCRRARSPH
46,0 2437,0 2437,8 12-34 DARGCRLRSQLVPVSALGLGHSS
51,4 3456,7 3456,0 55-86 DLSLAS.....CRPTRY
51,9 4134,4 55-92(oksyd.) DLSLAS CRPTRYEAVSFM
53,2 4136,3* 4120,8 DLSLAS CRPTRYEAYSFM
(M): masa monoizotopowa *: ze względu na utlenienie w MALDl peptydu zawierającego metioninę
Ponieważ NBN występuje w postaci homodimeru, szczurzy produkt NBN NK zawiera cztery potencjalne miejsca dla przyłączania ugrupowań PEG, dwie aminy na końcach N łańcuchów oraz dwa miejsca N95K, które wprowadzono do konstruktów za pomocą inżynierii. Na mapie peptydowej łańcucha z dwiema przyłączonymi ugrupowaniami PEG, jedynie pik zawierający peptyd z mutacją NK był zmieniony przez modyfikację ugrupowaniem PEG. Żaden z innych pików nie był zmieniony poprzez modyfikację ugrupowaniem PEG. Wyniki mapowania wskazują zatem na to, że ugrupowanie PEG jest specyficznie przyłączane do tego peptydu i nie jest przyłączane do żadnego innego badanego peptydu. Drugie potencjalne miejsce przyłączenia, koniec N, znajduje się w peptydzie który posiada długość
PL 211 162 B1 tylko trzech aminokwasów i nie jest wykrywany na mapie peptydowej. Zakłada się, że dodatkowe miejsce przyłączania ugrupowania PEG znajduje się w tym miejscu. Zgodnie z tym zapatrywaniem, niewielki procent szczurzego NBN NK nie jest obcięty i zawiera dojrzałą sekwencję Ala-1. Peptyd ten jest wymywany przy 30 μm i jest widoczny ma mapie peptydowej z trawienia form bez przyłączonych ugrupowań PEG, lecz nie ma go na mapie peptydowej z trawieniami form z przyłączonymi ugrupowaniami PEG.
P r z y k ł a d 3
Szacowanie siły neublastyny z wewnętrznie przyłączonymi ugrupowaniami PEG w teście kinazowej aktywacji receptora (KIRA) ELISA
Siłę szczurzego NBN mierzono przy użyciu zależnej od NBN aktywacji/fosforylacji c-Ret jako reportera dla aktywności NBN w teście ELISA, który był specyficzny wobec obecności ufosforylowanego RET. Komórki NB41A3-mRL3, linia przylegających komórek mysiego nerwiaka niedojrzałego, która wytwarza Ret i GFRa3, wysiewano po 2 x 105 komórek na studzienkę, w 24-studzienkowych płytkach w pożywce Eagle w modyfikacji Dulbecco (DMEM), uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą i hodowano przez 18 godz. w 37°C i 5% CO2.
Komórki płukano PBS i traktowano seryjnymi rozcieńczeniami NBN w 0,25 ml DMEM przez 10 min. w 37°C i przy 5% CO2. Każdą próbkę analizowano w dwóch powtórzeniach. Komórki płukano 1 ml PBS, lizowano przez 1 godz. w 4°C 0,30 ml Tris HCl, pH 8,0; 0,5% Nonidet P40; 0,2% dezoksycholan sodowy, 50 mM NaF; 0,1 mM Na3VO4; 1 mM fluorek fenylometylosulfonylowy z łagodnym kołysaniem płytek. Następnie lizaty mieszano przez powtarzanie pipetowania i 0,25 ml próbki przenoszono do 96-studzienkowych płytek do testu ELISA, które były opłaszczane 5 μg/ml przeciwciała monoklonalnego anty-Ret mAb (AA.GE7.3) w 50 mM buforze węglanowym, pH 9,6 w 4°C przez 18 godz. i blokowano w temp. pokojowej przez 1 godz. buforem do blokowania (20 mM Tris HCl pH 7,5; 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20 (TBST) zawierającym 1% normalną surowicę mysią i 3% bydlęcą albuminę surowiczą).
Po 2 godz. inkubacji w temperaturze pokojowej, studzienki 6-krotnie płukano TBST. Fosforylowany Ret wykrywano przez inkubację studzienek w temperaturze pokojowej przez 2 godz. z 2 g/ml skoniugowanych z peroksydazą chrzanową (HRP) przeciwciał anty-fosfotyrozyna 4G10 w buforze do blokowania, 6-krotnie płukanie TBST oraz pomiar aktywności HRP przy 450 nm z reagentem do wykrywania kolorymetrycznego. Mierzono wartości absorbancji ze studzienek poddawanych działaniu lizatami lub buforem do lizy i wykreślano sygnał z korekta tła w funkcji stężenia NBN obecnego w mieszaninie aktywacyjnej. Siła NBN z przyłączonymi ugrupowaniami PEG wynosiła w teście KIRA ELISA 10 nM, co jest nieodróżnialne od tej dla wyjściowego materiału NBN NK. Nie zaobserwowano wpływu dwóch cykli zamrażania-rozmrażania na siłę białka a po takim traktowaniu nie obserwowano wzrastającego zmętnienia próbki, co wskazuje na to, że próbki można bezpiecznie rozmrażać do badania. W niezależnych badaniach szacujących aktywność produktu z trzema i czterema ugrupowaniami PEG/cząsteczkę, niezależnie, ustalono, że związek addytywny z trzema ugrupowaniami PEG był w pełni aktywny, podczas gdy produkt z czterema ugrupowaniami PEG posiadał zredukowaną aktywność.
P r z y k ł a d 4
Farmakokinetyczne badania szczurzej neublastyny z wewnętrznie przyłączonymi ugrupowaniami PEG u szczurów i myszy
Farmakokinetyczne własności różnych produktów NBN z przyłączonymi ugrupowaniami PEG lub bez badano u szczura i myszy.
Wyniki ujawniły, że przyłączenie 3,3 ugrupowań, 10000 Da PEG do szczurzego NBN NK wpływa znacząco na okres półtrwania i dostępność biologiczną neublastyny. Po dożylnym podaniu 1 mg/kg szczurom Spraque Dawley, poziomy pików NBN z przyłączonymi ugrupowaniami PEG o wartości 3000 ng/ml wykrywano po 7 min., a poziomy 700 ng/ml wykrywano po 24 godz., 200 ng/ml po 48 godz., a 100 ng/ml po 72 godz. Dla kontrastu po dożylnym podaniu 1 mg/kg NBN bez przyłączonych ugrupowań PEG poziomy o wartości 1500 ng/ml wykrywano po 7 min. lecz następnie poziomy szybko spadły do 70 ng/ml po 3 godz. i nie były wykrywane po 7 godz. Wpływ przyłączenia ugrupowań PEG był jeszcze wyraźniejszy u zwierząt, którym NBN z przyłączonymi ugrupowaniami PEG podawano podskórnie.
Po podskórnym podaniu 1 mg/ml poziomy krążącego NBN z przyłączonymi ugrupowaniami PEG osiągały maksimum 200 ng/ml po 24 godz. i pozostawały na tym poziomie przez czas trwania trzydniowych badań. Dla kontrastu, NBN nie wykrywano w żadnym punkcie czasowym po podaniu niezmodyfikowanego NBN.
PL 211 162 B1
Analiza próbek NBN z przyłączonymi ugrupowaniami PEG jest skomplikowana przez obecność związków addytywnych zawierających 2, 3 i 4 ugrupowania PEG/cząsteczkę, z których każdy wykazuje różny profil PK (farmakokinetyczny). We wczesnych badaniach farmakokinetycznych, zastosowano myszy w celu ułatwienia poszukiwania różnych kandydatów i dróg podawania. Badania na myszach ujawniły dramatyczne różnice w dostępności biologicznej kandydatów. Chociaż, kiedy związek addytywny 3,3 10 K PEG szacowano w szczurach, ujawniono, że jest on mniej dostępny biologicznie u szczurów niż u myszy. Ta różnica w dostępności biologicznej była szczególnie wyraźna po podaniu dootrzewnowo. Poziomy u myszy osiągały 1600 ng/ml po 7 min. i pozostawały na poziomie 400 ng/ml po 24 godz. Dla kontrastu, poziomy u szczura wynosiły 100 ng/ml przez 4-48 godz.
Zarówno szczurzą neublastynę dzikiego typu (wt-NBN) jak neublastynę z podstawieniem Asn w Lys, w pozycji 95 (NK-NBN) poddawano ponownemu fałdowaniu i oczyszczano do >95% do testów skuteczności w modelu STZ szczurzej neuropatii cukrzycowej. Wt-NBN przygotowywano do bezpośredniego badania na zwierzętach podczas gdy NK-NBN wytwarzano do przyłączenia ugrupowania PEG z 10 kDA PEG-SPA. W celu osiągnięcia ponownego sfałdowania i oczyszczenia, zastosowano metodę ponownego fałdowania wykorzystującą chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząstek (SEC), która pozwoliła na odzyskanie NBN z ciał inkluzyjnych z E. coli w dużych ilościach i w wysokim stężeniu. Obok SEC, zastosowano etapy chromatografii na kolumnach z Ni-NTA i z krzemionką CM w celu zwiększenia końcowej czystości białka. Białko poddano rozległej charakterystyce, włączając analizę SDS-PAGE, chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząstek, ESMS, szacowanie aktywności testem KIRA ELISA oraz określenie zawartości endotoksyn. SDS-PAGE i SEC końcowych produktów białkowych wykazały czystość białka powyżej 95%. Poziom endotoksyn dla każdego produktu wynosił <0,2 EU/mg. Aktywność specyficzna obu białek w teście KIRA ELISA wynosi około 10 nM. wt-NBN wytwarzano w stężeniu 1,0 mg/ml, a NK-NBN w 2,6 mg/ml w buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS) o pH 6,5. Wt-NBN porcjowano w 15 ml probówki i przechowywano zamrożone w -70°C podczas gdy NK-NBN przed rozporcjowaniem i zamrożeniem poddawano reakcji przyłączania ugrupowań PEG.
P r z y k ł a d 5
Ponowne fałdowanie neublastyny dzikiego typu i muteiny N95K neublastyny
Obie formy NBN wyrażano w E. coli jako białko fuzyjne, wyznakowane znacznikiem His, z miejscem cięcia dla enterokinazy, sąsiadującym bezpośrednio z miejscem startu dojrzałej 113 aminokwasowej sekwencji. Bakterie wytwarzające albo wt-NBN (osad 1,8 kg) lub NK-NBN (osad 2,5 kg) poddawano lizie w 2 l PBS przy użyciu prasy Gaulin press. Po wirowaniu (10000 rpm) w celu osadzenia ciał inkluzyjnych z każdego preparatu zlewano supernatanty. Osady z ciał inkluzyjnych płukano dwukrotnie buforem (0,02 M Tris HCl, pH 8,5; 0,5 mM EDTA), płukano dwukrotnie tym samym buforem zawierającym Triton X-100 (2%), v/v), a następnie dodatkowo płukano buforem bez detergentu. Oba osady rozpuszczano 6 M chlorowodorkiem guanidyny; 0,1 M Tris pH 8,5; 0,1 M DTT i I mM EDTA. W celu wzmocnienia procesu rozpuszczania, każdy osad poddawano homogenizacji przy użyciu homogenizatora politronowego a następnie mieszano przez noc w temp. pokojowej. Rozpuszczone białka klarowano poprzez wirowanie przed chromatografią denaturującą w żywicy Superdex 200 (5,5 l kolumna zrównoważona 0,05 M glicyną/H3PO4, PH 3,0 z 2 M guanidyna-HCl) przy przepływie 20 ml na min.
Zdenaturowane NBN identyfikowano za pomocą SDS-PAGE. Frakcje zawierające wt-NBN lub NK-NBN zbierano w pule i zatężano do około 250 ml przy użyciu 2,5 l naczyń zatężających z mieszadłem firmy Amicon. Po filtracji w celu odrzucenia jakiegokolwiek precypitatu, zatężone białko poddawano procesowi renaturacji przy użyciu chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek na kolumnie z żywicą Superdex 200 zrównoważonej 0,1 M Tris-HCl pH 7,8; 0,5 M guanidyna-HCl; 8,8 mM zredukowany glutation i 0,22 mM utleniony glutation. Kolumnę rozwijano stosując 0,5 M guanidynę-HCl przy przepływie 20 ml na min. Frakcje zawierające zdenaturowane wt-NBN i NK-NBN identyfikowano przez SDS-PAGE, łączono w pule i przechowywano w 4°C do czasu usunięcia znacznika his.
Zatężanie NBN przez chromatografię Ni-NTA (TR5919-138)
Zdenaturowane NBN przechowywano w 4°C przez co najmniej 24 godz. przed przeprowadzeniem oczyszczania w celu pobudzenia wytwarzania mostków dwusiarczkowych pomiędzy monomerami NBN. Po tym czasie, tworzone precypitaty usuwano poprzez filtrację przez 0,2 μ filtry PES. Dla zmniejszenia niespecyficznego wiązania roztwór białka przeniesiono do 20 mM imidazolu przed naniesieniem na 100 ml kolumnę Ni-NTA (Qiagen) zrównoważoną buforem do kolumny (0,5 M guanidyna i 20 mM imidazol) przy przepływie 50 ml na min. Po naniesieniu białka kolumnę płukano do linii zerowej przy użyciu tego samego buforu. NBN wypłukiwano z żywicy przy użyciu około 300 ml buforu
PL 211 162 B1 elucyjnego zawierającego 0,5 M guanidyny-HCl i 0,4 M imidazol. Po wypłukaniu, NBN dializowano przez noc (przy użyciu woreczka dializacyjnego o stałej odcięcia 10 kDa) w temp. pokojowej wobec 10 objętości 5 mM HCl i stężeń imidazolu odpowiednio od 0,05 M do 0,04 M.
Odcinanie znacznika his przez lizyloendopeptydazę lub enterokinazę
Następnego dnia jakikolwiek precypitat utworzony w czasie dializy usuwano przez filtrację. Do próbki białka dodawano 5 M roztwór podstawowy NaCl do stężenia 0,1 M i tak aby końcowe stężenie soli w tym pozostająca guanidyna-HCl wynosiła około 150 mM. Stężenie to potwierdzano przy użyciu konduktometra. Dodatkowo, dodawano 1 M HEPES pH 8 do końcowego stężenia 25 mM. W celu odcięcia znacznika do wt-NBN dodawano lizyloendopeptydazę a do NK-NBN enterokinazę, obie w stosunku około 1:300 proteazy do NBN. Dla NK-NBN stosowano enterokinazę w miejsce lizyloendopeptydazy ze względu na dodatkowe miejsce cięcia dla proteazy w muteinowym białku w Lys95. Próbki mieszano w temp. pokojowej przez 2 godz. i trawienie monitorowano przez SDS-PAGE.
Usuwanie znacznika his przez chromatografię Ni-NTA
NBN traktowany proteazą nanoszono na 100 ml kolumnę Ni-NTA zrównoważoną 0,5 M guanidyną-HCl i 20 mM imidazolem przy przepływie 50 ml na min. Kolumnę płukano tym samym buforem. Każde białko wypłukane z kolumny zbierano w pule wraz z białkiem zawierającym NBN bez znacznika his.
Chromatografia na krzemionce CM
Po chromatografii z Ni-NTA, białko natychmiast poddawano dalszemu oczyszczaniu na żywicy z krzemionki CM. Na 20 ml kolumnę z krzemionką CM zrównoważona buforem do nanoszenia (5 mM fosforan, pH 6,5; 150 mM NaCl) nanoszono NBN przy przepływie 20 ml na min. Kolumnę płukano buforem do płukania (5 mM fosforan, pH 6,5; 400 mM NaCl) o objętości odpowiadającej dwunastu objętościom kolumny a białko wypłukiwano jednym etapem buforem zawierającym 5 mM fosforan, pH 6,5 lecz 1 M NaCl. Wypłukane białko dializowano wobec samego fosforanu dla obniżenia stężenia soli do 100 mM dla NK-NBN i 150 mM dla wt-NBN. Obie próbki filtrowano przez 0,2 μ filtry PES analizowano przez SDS-PAGE i przechowywano w 4°C do czasu dalszej charakterystyki i/lub przyłączania ugrupowań PEG.
Przeprowadzono analizę widma UV dla wt-NBN i NK-NBN w celu oszacowania ich absorbancji przy 280 nm. Stosowano mikro kwarcowe kuwety z samym buforem jako próbą ślepą, 100 μl wt-NBN lub NK-NBN skanowano w sposób ciągły w zakresie 230 do 330 nm w spektrofotometrze firmy Beckman. W oparciu o tę analizę ustalono stężenie wt-NBN na 1,1 mg/ml i NK-NBN na 2,6 mg/ml (dla każdego białka stosowano A280 nm-E0,1%= 0,5). Na podstawie absorbancji przy 330 nm zidentyfikowano poniżej 1% wytrąconego materiału.
Aby oszacować czystości preparatów białkowych każdą próbkę poddano chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząstek na kolumnie 16/30 Superdex 75. Kolumnę zrównoważono 5 mM fosforanem, pH 6,5 zawierającym 400 mM NaCl i rozwijano przy szybkości przepływu 1,5 ml na min. Na podstawie absorbancji przy 280 nm ustalono, że zarówno wt-NBN jak NK-NBN migrują jako pojedynczy pik o spodziewanej masie cząsteczkowej (23-24 kDa) i nie posiadały one jakichkolwiek znaczących zanieczyszczeń.
Zarówno wt-NBN jak NK-NBN były zredukowane w roztworze 2,5 M guanidyna-HCl, 60 mM Tris pH 8,0 i 16 mM DTT. Zredukowane próbki odsolono na krótkiej kolumnie C4 i analizowano bezpośrednio przy użyciu ESMS stosując urządzenie z potrójnym kwadrupolem. Surowe dane dla ESMS były rozwijane przy użyciu programu MaxEnt z wytworzeniem widm mas. Procedura ta pozwala sygnałom o wielokrotnym ładunku zmieścić się w jednym piku, który bezpośrednio odpowiada masie cząsteczkowej w kilodaltonach (kDa). Rozwinięte widmo mas dla wt-NBN pokazało, że dominujący rodzaj wynosi 12046 kDa, co pozostaje w zgodzie z przewidywaną masą cząsteczkową 12046,7 kDa dla 113 aminokwasowej formy białka. Obserwowano także mniej obfity składnik (12063 kDa) sugerujący obecność produktu oksydacji. W próbce z NK-NBN zidentyfikowano trzy piki. Główny składnik wykazywał widoczną masę cząsteczkową 11345 kDa zgodną z masą oczekiwaną dla 106 aminokwasowej formy białka. Dwa pozostałe piki posiadały masy 11362 i 12061 sugerujące, odpowiednio, oksydację NK-NBN i obecność 113 aminokwasowej formy.
Obecność 106 i 113 aminokwasowych form w preparacie NK-NBN przypisywana trawieniu enterokinazą. Użyte białko z firmy Biozym jest preparatem naturalnego enzymu oczyszczonego ze śluzówki jelita cielęcego o którym donoszono o tym, że zawiera niewielkie zanieczyszczenie trypsyną (0,25 ng trypsyny na μg enterokinazy). Zatem trypsyna może działać na NK-NBN na miejsce Arg7 na końcu karboksylowym wytwarzając dominującą 106 aminokwasową formę. Z drugiej strony, lizyloendopeptydaza używana do cięcia wt-NBN ma aktywność pojedynczej proteazy działającej na miejsce
PL 211 162 B1 lizyny zawartej w znaczniku his, położonym na końcu karboksylowym i daje dojrzałą 113 aminokwasową formę NBN. Obie formy 106 i 113 aminokwasowe NBN są równo aktywne we wszystkich testach i podobnie się zachowują w testach stabilnoś ci z guanidyną -HCl.
Aktywność NBN określano na podstawie zdolności do stymulowania fosforylacji c-Ret w komórkach NB41A3-mRL3 przy użyciu testu KIRA ELISA, opisanego w Przykładzie 3. Ufosforylowany Ret wykrywano poprzez inkubację (2 godz.) schwytanego receptora z przeciwciałem fosfotyrozynowym skoniugowanym z HRP (4G10; 0,2 μg na studzienkę). Po inkubacji studzienki płukano 6-krotnie TBST i wykrywano aktywność HRP przy 450 nm w teście kolorymetrycznym. Mierzono wartości absorbancji ze studzienek poddawanych działaniu lizatu lub samego buforu do lizy, korygowano tło i dane przedstawiano na wykresie jako funkcję stężenia neublastyny obecnej w mieszaninie aktywującej. Wyniki pokazują, że oczyszczone NBN wpływa na pojawienie się ufosforylowanego Ret, co wskazuje na to, że oczyszczone NBN było aktywne w tym teście.
P r z y k ł a d 6
Wytwarzanie koniugatu albumina surowicza-neublastyna
Szczurzą neublastynę dzikiego typu w stężeniu 1 mg/ml w PBS poddawano działaniu 1 mM sulfo-SMCC (Pierce) i odsalano w celu usunięcia nadmiaru czynnika sieciującego. Ponieważ białko NBN dzikiego typu zawiera tylko pojedynczą aminę na swoim końcu N i nie posiada wolnych grup sulfhydrylowych, spodziewano się, że reakcja z SMCC będzie dawała specyficzną dla miejsca modyfikację NBN z SMCC przyłączonym do końca N.
μg koniugatu NBN-SMCC inkubowano ze 120 μg bydlęcej albuminy surowiczej i analizowano pod kątem zasięgu wiązania krzyżowego przez SDS-PAGE. BSA zawiera pojedynczą wolną grupę SH i w konsekwencji oczekuje się, że reakcja z koniugatem NBN-SMCC da w tym miejscu modyfikację przez imid kwasu maleinowego w SMCC. W takich warunkach obserwowano dwa dodatkowe prążki o wyższej masie cząsteczkowej, pozostające w zgodzie z masą NBN z modyfikacją pojedynczą cząsteczką BSA i dwiema cząsteczkami BSA, ponieważ każda cząsteczka NBN zawiera dwa końce N podlegające reakcji i w konsekwencji są one zgodne z wyobrażeniem. Równolegle z tworzeniem tych prążków zanikała intensywność prążków z NBN-SMCC i BSA. Na podstawie intensywności pozostałego prążka NBN, wydaje się , że reakcja zachodzi w 70-80%.
Pojedynczo podstawiony produkt oczyszczano z mieszaniny reakcyjnej przez poddanie materiału chromatografii kationowymiennej i chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek na kolumnie z żywicą Superdex 200 (Pharmacia) zasadniczo jak opisano powyżej przy badaniu procesu przyłączania ugrupowań PEG. Frakcje z kolumny po filtracji w żelu analizowano przez SDS-PAGE i te które zawierały pojedynczo podstawiony produkt analizowano pod kątem zawartości białka przez pomiar absorbancji przy 280 nm. Ponieważ masa BSA jest średnio dwukrotnie taka jak neublastyny widoczne stężenie dzielono przez czynnik 3 w celu uzyskania odpowiednika neublastyny. Frakcje te poddawano analizie funkcji w teście KIRA ELISA. Wartości IC50 zarówno dla wt- jak i NBN skoniugowanego z BSA wynosiły 3-6 nM, wskazując na to, że koniugacja z BSA nie ograniczyła funkcji.
Podczas gdy wstępne badania prowadzono z BSA, odpowiednie białka albuminy surowiczej szczurów i ludzi także zawierają wolne grupy SH. W konsekwencji podobne podejście można zastosować do wytwarzania koniugatu szczurza albumina surowicza-szczurze NBN w celu przeprowadzenia badań farmakokinetycznych i skuteczności u szczurów i koniugatu ludzka albumina surowicza-ludzkie NBN w celu przeprowadzenia badań klinicznych. Podobnie SMCC można zastąpić dowolną liczbą czynników sieciujących, które na jednym końcu zawierają grupy aminoreaktywne, a na innym końcu grupy tioloreaktywne. Przykładami aminoreaktywnych czynników sieciujących, które wprowadzają tioloreaktywną grupę imidu kwasu maleinowego są AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS lub GMBS, wprowadzają tioloworeaktywną grupę halogenoooctanową są SBAP, SIA, SLAB, oraz wprowadzają zabezpieczoną i niezabezpieczoną grupę tiolową do reakcji z grupami sulfhydrylowymi w celu wytwarzania ulegającego zredukowaniu połączenia są SPDP, SMPT, SATA lub SATP, z których wszystkie są dostępne handlowo z Pierce. Takie łączniki krzyżowe są jedynie przykładowymi i wiele alternatywnych strategii jest przewidzianych, aby łączyć koniec N NBN z albuminą surowiczą. Specjalista w dziedzinie może wytworzyć koniugaty z albuminą surowiczą, w których koniec N w NBN oraz ugrupowanie tiolowe w albuminie surowiczej nie stanowią miejsc docelowych. Oczekuje się, że funkcjonalne będą także fuzje NBN-albumina surowicza, wytworzone przy użyciu technik inżynierii genetycznej, w których NBN jest w fuzji z genem albuminy surowiczej na jej końcu N, końcu C lub na obu końcach.
PL 211 162 B1
Sposób ten można rozciągnąć na rutynowe adaptacje dowolnego koniugatu NBN-albumina surowicza, dające produkt o przedłużonym okresie półtrwania u zwierząt, a w konsekwencji i u ludzi.
Lista sekwencji <110> Biogen, Inc.
Sah, Dinah W.Y.
Pepinsky, Blake R Balbojack-Sjodin, Paula Ann Miller, Stephan S Rossomando, Anthony <120> Polimerowe koniugaty neublastyny oraz sposoby ich zastosowania <130> 00689-506-061 <140> Jeszcze nie przekazane <141> 2002-01-23 <150> 60/266,071 <151> 2001-02-01 <160> 13 <170> Patentln wer. 2.1 <210> 1 <211> 113 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: Sekwencja najwyższej zgodności <220>
<221> WARIANT <222> (3)
<223> Przy czym Xaa jest Gly albo Thr
<220>
<221> WARIANT
<222> (4)
<223> Przy czym Xaa jest Pro albo Arg
<220>
<221> WARIANT
<222> (5)
<223> Przy czym Xaa j est Gly albo Ser
<220>
<221> WARIANT
<222> (10)
<223> Przy czym Xaa jest Ala albo Thr
<220>
<221> WARIANT
<222> (11)
<223> Przy czym Xaa j est Ala albo Thr
PL 211 162 B1
<220> <221> WARIANT Asp
<222> <223> (12) Przy czym Xaa jest Gly albo
<220> <221> WARIANT
<222> (26)
<223> Przy czym Xaa jest Arg albo Ser
c220> <221> WARIANT
<222> (33)
<223> Przy czym Xaa jest Arg albo Ser
<220> <221> WARIANT
c222> (38)
<223> Przy czym Xaa jest Val albo Ile
<220> <221> WARIANT
<222> (51)
<223> Przy czym Xaa j est Val albo Ile
<220> <221> WARIANT
<222> (53)
<223> Przy czym Xaa jest Pro albo Gin
<220> <221> WARIANT
<222> (69)
<223> Przy czym Xaa jest Pro albo Ser
<220> c221> WARIANT
<222> (76)
<223> Przy czym Xaa j est Val albo Ile
<220> <221> WARIANT
<222> (103)
<223> Przy czym Xaa j est Arg albo His
<400> 1
Ala Gly Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Xaa Xaa Xaa Ala Arg Gly Cys
10 15
Arg Leu Arg Ser Gin Leu Val Pro Val Xaa Ala Leu Gly Leu Gly His 20 25 30
Xaa Ser Asp Glu Leu Xaa Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg 35 40
Ala Arg Ser Xaa His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly
Ala Leu Arg Xaa Pro Pro Gly Ser Arg Pro Xaa Ser Gin Pro Cys Cys Arg 80
PL 211 162 B1
Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp
Arg Thr Val Asp Xaa Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly <210> 2 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys 15 10 15
Arg Leu Arg Ser Gin Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His 20 25 30
Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg 35 40 45
Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala 50 55 60
Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gin Pro Cys 55 70 75 80
Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser 85 90 95
Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu 100 105 110
Gly <210> 3 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3
Ala Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Thr Thr Asp Ala Arg Gly Cys 15 10 15
Arg Leu Arg Ser Gin Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly Leu Gly His 20 25 30
Ser Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg 35 40 45
Arg Ala Arg Ser Gin His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala 50 55 60
Gly Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser Gin Pro Cys 65 70 75 80
Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser
PL 211 162 B1
Thr Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu 100 105 110
Gly <210> 4 <211> 113 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 4
Ala Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Ala Thr Asp Ala Arg Gly Cys 15 10 15
Arg Leu Arg Ser Gin Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly Leu Gly His 20 25 30
Ser Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg 35 40 45
Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala 50 55 60
Gly Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser Gin Pro Cys 65 70 75 80
Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser 85 90 95
Thr Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu 100 105 110
Gly <210> 5 <211> 675 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 5 atggaactgg ccagccttgt ctggacccaa ccaacagact ccaccgccgc cccgctgogc gctacagatg ctgggccaca gcacgctccc cctcccgggt tccttcatgg ggctgtctgg gacttggaga ggccaaccct tgtcccgcag acctacctgg agtctcctca tccgcggggc cgcgcggctg gctccgacga cgcacgatct cccggccgat acgtgaacag gctga gcctactgca agctgctcta ccccgcctct gggaoacacc gcccgcaccc acgcgcggcg ccgcctgcgc gctgatacgt cagcctggcc cagccagccc cacctggaga ttgtcccact gccctgctga cgcgatgttc gcacatctgt ccaccaccgg cgtgcaggaa tcacagctgg ttccgcttct agcctgctgg tgttgccggc accgtggacc gcctccggcc gcagcgtcac cctcgccggt gcagcgaaag gtcocgcgct cccggagcag tgccggtgag gcagcggttc gcgccggggc ccactcgcta atctctccgc taggtggcaa 60 agaagcttcc 120 cctggcgccc 180 agccctgcga 240 ccagtctcct 300 ccgcgcacgg 360 cgctctcggo 420 gtgccgccga 480 cctgcggtct 540 tgaggcagtc 600 caccgcctgc 660
675 <210> 6
PL 211 162 B1 <211> 57 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: KD2-310 Oligonukleotydowa <400> 6 gtatctttca tggacgtaaa gtctacatgg agaaccgtag atcatctatc tgcaacc 57
<210> 7
<211> 57
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220? <223? Opis sekwencji sztucznej Oligonukleotydowa
<400> 7
ggttgcagat agatgatcta cggttctcca tgtagacttt acgtccatga aagatac 57 <210> 8 <211> 50 <212> DNA <213? Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: KD3-254 Oligonukleotydowa <400> 8 gctggaactc gcagctctcg tgctcgtgca acggatgcaa aaggctgtcg 50 <210> 9 <211> 50 <212? DNA <213? Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: KD2-255 Oligonukleotydowa <400> 9 cgacagcctt ttgcatccgt tgcacgagca cgagagctgc gagttccagc <210? 10 <211> 37 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220?
<223? Opis sekwencji sztucznej: KD3-258 Oligonukleotydowa <400> 10
PL 211 162 B1 ggagccggag cactaaaatc tccccgggat ctagacc 37 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: KD3-259 Oligonukleotydowa <400> 11 ggtctagatc ccgggggaga ttttagtgct ccggctcc 38 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: KD3-256 01igonukleotydowa <400> 12 gacgaattaa ttaagtttcg tttttgttca gg 32 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: KD3-257 01igonukleotydowa <400> 13 cctgaacaaa aacgaaactt aattaattcg tc 32
PL 211 162 B1

Claims (23)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową co najmniej w 90% identyczną z aminokwasami 8-113 z SEKW. NR ID.: 1, który w pozycji odpowiadającej pozycji 95 w SEKW. NR ID.: 1 zawiera aminokwas inny niż asparagina, przy czym polipeptyd kiedy jest zdimeryzowany wiąże się z GFRa3, a podstawienie aminokwasowe w pozycji odpowiadającej pozycji 95 wprowadza miejsce, w którym glikol polialkilenowy może być przyłączony do polipeptydu.
  2. 2. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że aminokwasem w pozycji odpowiadającej pozycji 95 w SEKW. NR ID.: 1 jest lizyna.
  3. 3. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że obejmuje aminokwasy 8-113 z SEKW. NR ID.: 2, SEKW. NR ID.: 3 lub SEKW. NR ID.: 4, przy czym aminokwas inny niż asparagina jest podstawiony za asparaginę w pozycji 95.
  4. 4. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje aminokwasy 1-113 z SEKW. NR ID.:2, SEKW. NR ID.:3 lub SEKW. NR ID.:4, przy czym lizyna jest podstawiona za asparaginę w pozycji 95.
  5. 5. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jest co najmniej w 95% identyczny z aminokwasami 8-113 z SEKW. NR ID.: 1.
  6. 6. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jest co najmniej w 95% identyczny z aminokwasami 8-113 z SEKW. NR ID.: 2.
  7. 7. Białko fuzyjne obejmujące polipeptyd określony w jednym z zastrz. 1 do 6 połączony z drugim ugrupowaniem.
  8. 8. Białko fuzyjne według zastrz. 7, znamienne tym, że drugie ugrupowanie jest polipeptydem ludzkiej albuminy surowiczej.
  9. 9. Kwas nukleinowy kodujący polipeptyd określony w jednym z zastrz. 1 do 6 albo białko fuzyjne określone w zastrz. 7 lub 8.
  10. 10. Wektor, znamienny tym, że obejmuje kwas nukleinowy określony w zastrz. 9.
  11. 11. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera wektor określony w zastrz. 10.
  12. 12. Komórka gospodarza według zastrz. 11, znamienna tym, że jest komórką jajnika chomika chińskiego.
  13. 13. Sposób wytwarzania polipeptydu określonego w jednym z zastrz. 1 do 6 albo białka fuzyjnego określonego w zastrz. 7 lub 8, znamienny tym, że obejmuje a) hodowanie komórki gospodarza określonej w zastrz. 11 lub 12 w warunkach pozwalających na ekspresję polipeptydu określonego w jednym z zastrz. 1 do 6 albo białka fuzyjnego określonego w zastrz. 7 lub 8, oraz b) odzyskiwanie tego polipeptydu albo białka fuzyjnego.
  14. 14. Dimer obejmujący dwa polipeptydy określone w jednym z zastrz. 1 do 6 lub dwa białka fuzyjne określone w zastrz. 7 lub 8.
  15. 15. Koniugat obejmujący polipeptyd określony w jednym z zastrz. 1 do 6 skoniugowany z glikolem polialkilenowym, przy czym glikol polialkilenowy jest skoniugowany z polipeptydem w reszcie aminokwasowej podstawionej w pozycji odpowiadającej pozycji 95 w SEKW. NR ID.:1.
  16. 16. Koniugat według zastrz. 15, znamienny tym, że glikolem polialkilenowym jest glikol polietylenowy.
  17. 17. Koniugat według 15 albo 16, znamienny tym, że polipeptyd jest glikozylowany.
  18. 18. Koniugat obejmujący białko fuzyjne określone w zastrz. 7 lub 8 skoniugowane z glikolem polialkilenowym, przy czym glikol polialkilenowy jest skoniugowany z białkiem fuzyjnym w reszcie aminokwasowej podstawionej w pozycji odpowiadającej pozycji 95 w SEKW. NR ID.:1
  19. 19. Koniugat według zastrz. 18, znamienny tym, że glikolem polialkilenowym jest glikol polietylenowy.
  20. 20. Koniugat według zastrz. 18 albo 19, znamienny tym, że polipeptyd jest glikozylowany.
  21. 21. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że obejmuje polipeptyd określony w jednym z zastrz. 1 do 6, białko fuzyjne określone w zastrz. 7 lub 8, lub koniugat określony w jednym z zastrz. 15 do 20 oraz fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę.
  22. 22. Zastosowanie polipeptydu określonego w jednym z zastrz. 1 do 6, białka fuzyjnego określonego w zastrz. 7 lub 8, lub koniugatu określonego w jednym z zastrz. 15 do 20 do wytwarzania leku do leczenia albo zapobiegania chorobom lub zaburzeniom układu nerwowego.
  23. 23. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że choroba albo zaburzenie jest neuropatią obwodową lub zespołem bólu neuropatycznego.
PL372101A 2001-02-01 2002-01-25 Polipeptyd wariantu neublastyny, zawierające go białko fuzyjne i sposób ich wytwarzania oraz dimer, kwas nukleinowy, wektor, komórka gospodarza, koniugat, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie PL211162B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US26607101P 2001-02-01 2001-02-01

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL372101A1 PL372101A1 (pl) 2005-07-11
PL211162B1 true PL211162B1 (pl) 2012-04-30

Family

ID=23013042

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL372101A PL211162B1 (pl) 2001-02-01 2002-01-25 Polipeptyd wariantu neublastyny, zawierające go białko fuzyjne i sposób ich wytwarzania oraz dimer, kwas nukleinowy, wektor, komórka gospodarza, koniugat, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie

Country Status (36)

Country Link
EP (2) EP1862475A1 (pl)
JP (2) JP4259868B2 (pl)
KR (2) KR100960063B1 (pl)
CN (1) CN1500095B (pl)
AR (1) AR035077A1 (pl)
AT (1) ATE365748T1 (pl)
AU (1) AU2002247037B2 (pl)
BG (1) BG66393B1 (pl)
BR (1) BR0206852A (pl)
CA (1) CA2436407C (pl)
CY (1) CY1106886T1 (pl)
CZ (1) CZ20032080A3 (pl)
DE (1) DE60220879T2 (pl)
DK (1) DK1355936T3 (pl)
EA (1) EA009771B1 (pl)
EE (1) EE05537B1 (pl)
ES (1) ES2289091T3 (pl)
GE (1) GEP20063916B (pl)
HK (1) HK1057759A1 (pl)
HU (1) HU228973B1 (pl)
IL (2) IL156941A0 (pl)
IS (1) IS2867B (pl)
MX (1) MXPA03006805A (pl)
MY (1) MY143685A (pl)
NO (1) NO332150B1 (pl)
NZ (1) NZ527863A (pl)
PL (1) PL211162B1 (pl)
PT (1) PT1355936E (pl)
RS (1) RS50857B (pl)
SG (1) SG149685A1 (pl)
SI (1) SI1355936T1 (pl)
SK (1) SK288123B6 (pl)
TR (1) TR200301208T2 (pl)
UA (2) UA100967C2 (pl)
WO (1) WO2002060929A2 (pl)
ZA (1) ZA200305733B (pl)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7442370B2 (en) 2001-02-01 2008-10-28 Biogen Idec Ma Inc. Polymer conjugates of mutated neublastin
WO2002060929A2 (en) * 2001-02-01 2002-08-08 Biogen, Inc. Polymer conjugates of neublastin and methods of using same
US7276580B2 (en) 2001-03-12 2007-10-02 Biogen Idec Ma Inc. Neurotrophic factors
EP1395279B1 (en) * 2001-03-28 2011-10-05 Biogen Idec MA Inc. Use of neublastin polypeptides for treating neuropathic pain
HUE028163T2 (en) * 2002-01-18 2016-11-28 Biogen Ma Inc Polyalkylene polymer compounds and their use
EA008743B1 (ru) * 2003-01-31 2007-08-31 Байоджен Айдек Ма Инк. Полимерные конъюгаты мутантного неубластина
NZ574121A (en) 2003-04-18 2011-06-30 Biogen Idec Inc Polyethylene glycol-conjugated gylcosylated neublastin and uses thereof for treatment of pain
BRPI0411243A (pt) 2003-06-10 2006-07-11 Nsgene As método de produzir um polipeptìdio de neublastina biologicamente ativo, ácido nucléico, vetor de expressão, composição farmacêutica, célula, linha de células de compactação, mamìfero não-humano transgênico, dispositivo de cultura de células implantável, uso do vetor, método de tratar uma doença do sistema nervoso, e, polipetìdio de neublastina
US7598059B2 (en) 2003-10-02 2009-10-06 Biogen Idec Ma Inc. Neublastin expression constructs
NZ553431A (en) 2004-08-19 2010-04-30 Biogen Idec Inc Neublastin variants with decreased heparin binding
CA2577690C (en) * 2004-08-19 2013-08-06 Biogen Idec Ma Inc. Refolding transforming growth factor beta family proteins
TWI501774B (zh) 2006-02-27 2015-10-01 Biogen Idec Inc 神經性病症之治療
US20100056440A1 (en) * 2006-03-01 2010-03-04 Biogen Idec Ma Inc. Compositions and methods for administering gdnf ligand family proteins
JP2010503630A (ja) 2006-09-15 2010-02-04 クレアビリス・セラピューティクス・エスピーエー ＨＭＧＢ１のＢｏｘ−ＡおよびＨＭＧＢ１のＢｏｘ−Ａ変異体のポリマー複合体
EP2142205B1 (en) * 2007-05-01 2014-04-02 Biogen Idec MA Inc. Neublastin peptides for use in increasing vascularisation in tissue with impaired blood flow
PL2773438T5 (pl) * 2011-11-02 2022-01-17 F.Hoffmann-La Roche Ag Chromatografia przeciążenia i elucji
RU2488635C1 (ru) * 2012-03-22 2013-07-27 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития Способ получения рекомбинантного антиангиогенного полипептида

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6472178B1 (en) * 1998-02-27 2002-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding a modified ciliary neurotrophic factor and method of making thereof
US5770577A (en) * 1994-11-14 1998-06-23 Amgen Inc. BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol
US6593133B1 (en) * 1998-07-06 2003-07-15 Nsgene A/S Neurotrophic factors
AU2354600A (en) * 1998-12-09 2000-06-26 Amgen, Inc. Grnf4 a neurotrophic factor
WO2002060929A2 (en) * 2001-02-01 2002-08-08 Biogen, Inc. Polymer conjugates of neublastin and methods of using same

Also Published As

Publication number Publication date
EA200300852A1 (ru) 2004-06-24
NO20033441D0 (no) 2003-08-01
IL156941A (en) 2008-11-03
DK1355936T3 (da) 2007-10-29
EE200300355A (et) 2003-10-15
CA2436407A1 (en) 2002-08-08
EE05537B1 (et) 2012-04-16
SI1355936T1 (sl) 2007-12-31
HK1057759A1 (en) 2004-04-16
EP1355936A2 (en) 2003-10-29
EA009771B1 (ru) 2008-04-28
IS2867B (is) 2014-02-15
MXPA03006805A (es) 2003-11-13
CY1106886T1 (el) 2012-09-26
PL372101A1 (pl) 2005-07-11
GEP20063916B (en) 2006-09-11
EP1862475A1 (en) 2007-12-05
JP2009039135A (ja) 2009-02-26
BG108111A (bg) 2004-12-30
ES2289091T3 (es) 2008-02-01
YU61003A (sh) 2006-05-25
CN1500095B (zh) 2010-06-16
ATE365748T1 (de) 2007-07-15
CZ20032080A3 (cs) 2003-10-15
UA82983C2 (ru) 2008-06-10
SK9712003A3 (en) 2004-01-08
EP1355936B1 (en) 2007-06-27
IS6879A (is) 2003-07-17
WO2002060929A2 (en) 2002-08-08
TR200301208T2 (tr) 2005-05-23
CN1500095A (zh) 2004-05-26
RS50857B (sr) 2010-08-31
KR100960063B1 (ko) 2010-05-31
NO20033441L (no) 2003-10-01
HUP0500637A2 (hu) 2005-09-28
AR035077A1 (es) 2004-04-14
DE60220879T2 (de) 2008-03-06
IL156941A0 (en) 2004-02-08
BG66393B1 (bg) 2013-11-29
UA100967C2 (ru) 2013-02-25
JP4423338B2 (ja) 2010-03-03
SK288123B6 (sk) 2013-09-03
WO2002060929A3 (en) 2003-03-06
AU2002247037B2 (en) 2007-08-16
NO332150B1 (no) 2012-07-09
NZ527863A (en) 2006-09-29
SG149685A1 (en) 2009-02-27
KR20080098662A (ko) 2008-11-11
CA2436407C (en) 2011-08-30
MY143685A (en) 2011-06-30
KR20030074766A (ko) 2003-09-19
PT1355936E (pt) 2007-09-28
HUP0500637A3 (en) 2010-01-28
HU228973B1 (en) 2013-07-29
BR0206852A (pt) 2005-05-03
JP4259868B2 (ja) 2009-04-30
DE60220879D1 (de) 2007-08-09
JP2005503763A (ja) 2005-02-10
ZA200305733B (en) 2005-02-23
KR100872807B1 (ko) 2008-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4423338B2 (ja) ニューブラスチンのポリマー結合体および同様の使用方法。
US8119114B2 (en) Polymer conjugates of mutated neublastin
AU2002247037A1 (en) Polymer conjugates of neublastin and methods of using same
JP2011078434A (ja) 変異ニューブラスチンのポリマー結合体